Молекулярно-биологический и иммунологический анализ вирусспецифических белков и надмолекулярных структур вируса клещевого энцефалита

Ляпустин, Виктор Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-биологический и иммунологический анализ вирусспецифических белков и надмолекулярных структур вируса клещевого энцефалита
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологический и иммунологический анализ вирусспецифических белков и надмолекулярных структур вируса клещевого энцефалита"

РГ6 од

И МЛ'!"{ |^аТЯСКАЙ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВЕРУШИ ЭНЦЕФАЛИТОВ

На правах рукописи УДК 578.833.26

лялустш Виктор Николаевич

мапекударно-виолопиескш и шмунояшческий анализ вирусаввдйичЕашх БЕЛКОВ И НДДМШГЗШШРКЫХ СТКЛГО? шрус& клицзвого эще®АЛШ!а

(03.00.06 - вирусология)

диссертация на соисканий ученой степени доктора биологических наук в форие научного доклада

ШСКВА 1993

Раоота выполнена в лаборатории ырлеяулярной биологии вирусов Институте полиоакелкта и зируоных энцефалитов Российской АМН.

-член-»орреспоцдент РАМН, доктор медицинских наук, профессор З.А.Ласкевкч

доктор биологических наук, профессор А.А.Кущ

доктор медицинских нвук, профессор

М. С.Воробьева

доктор медицинских наук, профессор Л.Б.ЗльОерт

Ведущая организация: Государственный НИИ стандартизации и контроля ыедицяяских и биологических препаратов кн. Л.А.Тарасездча МЗ РФ

Защите состоится "2-5« ^ 0 ^ 1993 г_ ^/0 0 р часов на заседании специализированного совета Д.001.27.01 при Институту полиомиелита и вирусьто. энцефалитов Российской АМН. но адресу: 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией иокно ознакомиться в ЗнОлиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской А№. Научный доклад разослан алр еп я 1993 г.

Научный копсулътшт:

Официальный оппоненты:

Ученый секретарь Специализированного совета, кендидат биологические наук

(О.А.Медведкина)

стр.

опцая характеристика работы 2

результаты и их обсуждение 6

1. изучение синтеза и имунохшиеских свойств

ш1русспецш1ческих белков вируса клещевого энцефалита б

I. I. .'Идентификация синтеза вирусных белков

в культуре клеток 8

1.2. Закономерности синтеза белков в бесклеточных

системах, программируемых вирконной РНК 12

1.3. Сравнительный анализ электрофоретической подвижности вирусспецифичесгаи белков флавивирусов 16

1.4. КмыунохиАслеские свойства

вирусспецифических белков 18

1.5. Заключение 20

2. анализ антигенных структур ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО энцефалита 22

2.1. Способы выявления и Ю!ыуно21йслеские свойства вириошгого и невирнонного антигенов 24

2.2. Закономерности осаздення .антигепов полнэтиленгликолеы • 27

2.3. Седиментавдонпые п хронатографяческне характеристики антигенных препаратов E:ipyca клещевого энцефалита 30

2.4. Исследование состава вирионного

и нев1грионного антигенов 32

2.5. Электронношшросхопичеишй анализ

антигенных структур 35

2.6. Оценка ныиунолотгееских свойств

препаратов невирнонного антигена 36

2.7. Заключение 41

3. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ вируса клещевого энцефалита

С ЧУВСТВИТЕЛЬНЫМ! КЛЕТКАШ 42

3.1. Репродущш вируса клещевого энцефалита

в культурах клеток шекопитавщих 42

3.2. Изменчивость вируса при пассировании через

иксодовых глещей и мелких млекопитающих 45

3.3. Заключение 47

4. прикладные аспекты исследовании 49

4.1. Использование встречного шшунозлектрофореза

для диагностики клещевого энцефалнтз 4P

4.2. Применение ракетного шшуно-злектрофореза для анализа Еирусгшх препаратов, инактивированных форыалинон 50

4.3. Использование оарьерного электрофореза

для очистки вирусных препаратов 51

4.4. Заключение 53

ВЫВОДЫ 54

список работ, опубликованных по материалам доклада 56

ОБЩАЯ ХАРЖГЕРйС'ГЕКА РАБОТЫ

Развитие исследований флавивирусов в значительной степени связано с прккйнениеи новых научных методов, благодаря которым была получена существенная информация о природе флаЕивирусов. Возникло новое направление в исследовании флавивирусных инфекций, заключающееся в изучении репродукции флазивирусов к свойств флавивирусных структур с помощью ыолекулярно-оиологических, биохимических, биофизические, ишунохизшчэсккх и геино-инаенерных методов с целью усовершенствования методов борьбы с этой группой тякелых иифекцион-ш заболеваний.

В данной работе представлены результаты экспериментальных иссле-■ довашй по указанному направлению изучения флавивирусных инфекцяй.

Актуальность пройлели.

Вирус КЭ1 ■ явтяется широко распространенный инфекционным агентом, принадлегаиии к подгруппе флавиьирусов, переносите: клещами. Эта подгруппа антигенно значительно отличается от других флавивирусов, большая часть которых переносится другими членистоногими - комарами. Если в отношении вируса КЭ к началу восьмидесятых годов публикаций ыолекулярно-биологиче ского характера ' практически не было, то в отношеиш других флавивирусов информация была достаточной, чтобы определить ряд направлений исследований, • актуальных в оСщебиодогическом плаке л ва&ных для решения вопросов диагностики н профилактики этой группы Елфе^-циЯ.

Одним из направлений являлось изучение вирусспецифических синтезов в зараженных клетках. Быга установлено, что в ходе флави-

- В дальнейшем использованы следующие сокращения:

Вирусы: ЕЛ - келтой лихорадки; SH - Звпадаьй Нил; КЛБ - кеоса-нурской лесной .болезни; КЭ - клетевого анцыфалита; ОГЛ - Омской геморрагической лихорадки; ШЭО - шотландского энцефаломиелита овбц; Э.ЧМ - энцефалита долины Муррей; ЭСЛ - энцефалита Сан-Луи; Я5 -японского энцефалите.

Антигены: ВЛ - вириошшй антиген; МСГА - иедленноседименти-рунций антиген; НА - незишюнкый ("растворимый") антиген.

Яммунохнмичестае и серологические и-ето.ш: БИЭФ, РИЭ£> и СИЭФ -встречшй, ракетный и слитный иммуноглектрофорезц; И5М - иммунофер-ментный метод; РДПЛ, РСК к PITA - реакции диффузионной преципитации в егаре, связывания комплемента и торыогешш геыагглютинации.

Культуры клеток: КПЗМ - почек зеленой мартышки; ПЭС - почек эмбриона свиньи; ФЗК - фибробластов эмбрионов кур.

Реактивы: ДСН - додецилсульфат натаял; ПЭГ - полизтиленглнколь 6000; ЦГИ - даклогексюшд.

Другие обозначения: ГА-активность - геиагглютинирующая активность; Ш - индекс инвазизности; ИР - индекс резистентности; ПАТ -полиакриламидный гель; 3HÍ - электрофоретичесхая подвижность.

вирусной инфекции синтезируется несколько. антигенов, обладаяцих различающимися иммунохгаическими свойствами (Qureshi, Trent, 1973; см. RusBe.i et ai, 1S8G). Свойства вирионов, как. одного из антигенов флазивирусов, были изучены довольно подробно, тогда как в отношении других антигенов имелись фрагментарны*», зачастую противоречащие друг другу данные. Другая проблема касалась вопросов трансляции такой крупной матрицы, как геном флавивирусов (около 4 мегадаль-тон). Имелись свидетельства образования структурного белка М путем процэосинга из более крупного полкпептида N72 (ргеМ) (Shapiro et . ai, 1973; Eoltela et al, 1975). 3 отношении других белков флавк-Еирусов не было получено данных, свидетельствующих о протеолити-чеснок образовании их из более крупных полипептидов (Wright, ffestaway; Wright et al, 1977). Данные о биосинтезе балков фяави-вирусов были интерпретированы как свидетельстве независимой инициации синтеза кавдого бежа (Westarcay, 1977), что противоречило общепринятым взглядам о способе трансляции эукариотических мРНК. Для-разрешения этого противоречия 'был проведено изучение трансляции РНК вируса КЭ в бесклеточшх системах.

Известно, что фяаишпрусы размнонагтся в организме глногих животных - млекопитающих, птиц, членистоногих.. Инфекция -моеэт развиваться в трех формах - острой; хронической и пэрсистцрувщей. В литературе лм&ются данные, свидетэльствувдие о том, что развитие фяавивируснсй инфекции по тому или шопу ■ типу могвт быть обусловлено синтезом определенных вирусных структур (Ьее, Sohloemer, 1981; Brinton, 1986; Poidteger et al., 1991). В СВЯЗИ С этим актуальной задачей представлялось изучение на модели вируса КЭ факторов, определяющих характер протекания инфекции.

Цель и задачи исследования.

Цель представляемой работы состояла в получении новой информации о молекулярно-биологиадских и антигенных свойствах вируссгоци-фических белков и надмолекулярных структур вирусе КЭ, а также об особенностях взаимодействия Еируса с чувствительными клетками^.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Осуществить идентификации белков вируса КЭ.

2. Изучить особенности синтеза вирусспвшфячесхих бэдйов.

3. Провести анализ антигенных свойств вирусспецифическгх белков;

4. Изучить молекулярно-бкологическиэ, физико-химические и • икмунохимические свойства антигенных структур вируса КЭз

5. Ka основании полученной информации о свойсгъах белков и антиге-нних структур вируса КЭ провести анализ особенностей взаимодействия вируса с чувствительными клетками'.

Научная новизна. Идентифицирован полный набор ЕярусспвциОичес-ких белков вируса НЭ, сацгэзирущихся'в культурах клеток - ы vivo. Впервые проведено изучение динамики синтеза вирусспецифических белков флавявируса ь течение единичного цикла размножения. Показано, что время интенсивного синтеза белков зависит от множественности инфекция. Выявлено, что белок NS32 образуется из Солое крупного по-лптептида р79 (ргеКЗЗ). Показано» что, помимо белков Е, KS1 и ргеМ, гликопротевдами являются также Оелхи NS5, HS3 и ргеМЗЗ. Показана высокая иммунохимическая активность белков N55, NS3, NS1, Е и 0.

Впервые изучена трансляция РНК флавивируса в бвсклеточних системах - in vitro. Показано, что t¿ vitra эффективно транслируется 5'-концевая область генома, кодирующая структурные бе.лки, и осуществляется слабая экспрессия последующей области генома. Изучена последовательность образования зрелых структурных белков вируса КЭ из полипептида-предшественника и показано, что его лроцессинг осуществляется при'участий клеточных протоаз, связанных с мембранами.

• Проведен сравнительный элеюгрофоретичесчий анализ вирусспеця--фических белков фиавивирусов. Показано, что оелок preKS3 является типичным для вирусов, антигенной группы КЭ, но нэ для других: флави-вирусов. Показано, что вирусы комплекса КЭ гомогенны по ЗФП белков MS5 и N53 и отличаются по этому признаку от исследованных фдавиви-русов других антигенных групп и вируса Повзссан.

Проведено сравнительное изучение антигенных структур вируса КЭ. Показано, что НА вируса КЭ представляет собой момбрансвязанную надмолекулярную структуру, кардинально отличавшуюся от вирионов по диффузионным, алэктрофорв-гическим, морфологическим, физико-химическим и им^унохимическим характеристикам. Выявлено, что иммуноэлект-рофоретические свойства вирионов определяются белком Е- Показано, что основными антигенными компонентами НА являются дамерные и муль-

Обозлачениэ вирусспецифических белков дано согласно номенклатуре, общепринятой после публикации r.ioe et al.(i9S5), в которой использовано обозначение неструктурных белков, как NSn. где п - место в шеполохенш белков на геноме, начиная с 5'-конца, и структурных белков, как Е, С и М, вместо использованного ранее обозначения неструктурных белков, как Fin, и структурных белков, как Vn, где п место - белка в ряду невкрионных к вирионных белков, расположенных в последовательности возрастания их мол. масс (Shapiro et al., 1971).

гаыерные формы белка N51, часть которых существенно деградировала. Показано, что мелкие кольцеобразные структуры, отождествлявшиеся ранее с МСГА фдавивирусов, антигенно сходны не с вирионами,. а с НА, и являются одной из форм НА. ПроЕэдена сравнительная оценка иммунологических свойств ВА и НА. Показано, что НА обладает существенно моныпими протективными свойствами, чем ВА, и не оказывает усиливающего эффекта ва протвшивную активность при добавлении к препаратам ВА. Выявлено, что кммуногенная активность Н4 в отличие от ВА не уменьшается после обработки формалином.

Впервые отмечено, что острое и хроническое течение инфекции вирусом КЭ в культурах клеток млекопитающих сопровождается-различием в физико-химических свойствах вирионов и в соотношении их инфекционных и антигенных свойств.

Выявлена высокая степень изменчивости вируса КЭ при пассировании через инсодовых клещей я мелких млекопитающих, что объясняется различием селективных свойств указанных систем хозяев.

Практическая ценность работ. Проведенные исследования явились .основой для решения ряда прикладных задач. Разработана оригинальная модификация ВИЭФ, с помощью которой мошо определять количество вирионного антигена и антител к нему. Показано, что метод иммуно-электрофэрэза может быть использован для анализа антигенного состава образцов вакцины и для характеристики технологических процессов получения вакцины против КЭ. Своеобразие поведения антигенов вируса КЭ в примененной икмуноэлектрофоретичэской системе использовано для разработки метода барьерного электрофореза, который позволяет быстро получать чистые образцы вирионов и препарата НА, полностью освобожденные от примеси ВА вируса КЭ.

Апробация работ. Материалы работы были доложены на XXI Всесоюзной' конференции по электронной шкроскогаш (Сумы, 1982), Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней (Тюмень, 1984), Всесоюзной конференции - XX научной сессии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (Москва, 1985), межннститутской научной конференции, посвященной 80-летию. Томского НИИ вакцин и сывороток (Томск, 1986), Всесоюзном симгогиумв "Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита" (Иркутск, 1990), XVI конференции Европейских, биохимических обществ (Москва, 1984), Международных симпозиумах "Биология клещевого энцефалита"- (Новосибирск, 1987) и "Арбовирусы и арбовирусные инфекции" (Москва, 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖШИЕ

t. ИЗУЧЕНИЕ СИНТЕЗА И 'ЛМГ^НОХКМИЧЕСКИХ СЗОЙСТВ ВИРУССШЕЦИФ^ЕСКИХ БЕЛКОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО Э1ШАЛИТА

К началу проведения исследований з литературе имелись сведения и синтезе и свойств« вирусспецифяческих белков ряда флавивирусов, но отсутствовала информация о биосинтеае белков флавивирусов антигенной подгруппы вируса КЗ. Получение такой информации было необходимо для изучения на новом уровне антигенов вируса КЭ.

Основные характеристики единичного цикла размножения флавивирусов (Кандекин, SH, денгэ-2, ЭСЛ, ЯЭ и Уганда S) изучены как •в культурах клетск позвоночных, так и в культурах клеток комаров (Stoll&r et al., 1967; Trent ot al., 1S69; Shapiro et al., 1971; Fukui, 1973; Weetavrey, 1973; Wen£ler et al., 1978; Hg, Wsetaway,

1979). Латентный период составляет около 13 часов, а зрэмя выхода основной массы инфекционных вирусных частиц равно 23-27 часам. Для вируса КЗ закономерности образования инфекционных частиц в клетках позвоночных (Анджапаридзе, Богомолова, 1962; Авакян и др., 1933; Heinz, Kunz, 1977), а такяе в организме клеща (Чуюшш, Куренков,

1980), такие se, как и для флсвкшрусов, переносимых коиарами. Синтез вирусспецгярических РНК флавивирусов, в том числе и вируса КО, наиболее акшвш осуществляется в период 12-20 часов после заражения (Соловьев к др., 1971, Stollar et al., 19S7; Trent et al., 19R9; Fukui, 1973; Eoulton, ft'estaway, 1977). Единственная вярусспецифическая РШ, функционирующая кгк матричная, идентична вирионной РНК (Boulton, Wectaway, 1977; Naeve, Trent, 1978; Vfenßler et al., 1578; Despres et al., 19ЭЬ). Вириош флавивирусов содержат три белка: гжкопротеид Е, нуклэокзпеидный белок С и мембранный

. белок Ы. Выло показано, что часть вираонов содержит вместо белка Н, более кр:ч1ный белок, являющийся гликопротеидом (Shapiro et al., 1933), и, как в дальнейшем било определено, представляющий собой Предшественник бежа M (Wright, Westaway, 1977; Rioe et al., 19S5).

Особенностью синтеза вирусспецифических белков флавивирусов в зараженных клетках является слабое подавление синтеза клеточных, белков. Поэтому для идентификации виру¿специфического белкового синтеза применялась обработка клеток либо ЦГИ с последующей ■отмывкой (Shapiro st al.,' 1971; Trent, Qureshi, 1977), либо гипертоническими концентрациями NaCl (Westaway et al., 1977). В результате в клетках, зараженных флавивирусами, выявлен синтез на менее 8-10 вирусспецифических белков. Отменена высокая стэпонь

гликозилирования, помимо белков Е и ргеМ, белка HS1 (Shapiro et al., 1S7£: Bnath, Wright, 1935).

В результате изучения синтеза вирусспецифических белков флавивирусов был получен ряд данных, свидетельствующих о возможности независимой инициации трансляции ряда белков (Shapiro et al., 1973; WeBtaway et al., 1973; Vfestaway, 1977; WeBtawpy, Shew. 1S77; Wastaway et al, 1984).

В дальнейшем, благодаря применении генно-инженерных методов, получена существенно новая информация о структура РНК флавивирусов ' к расположении вирусспецифических белков на геноме. Анализ первичной структуры генома флавивирусов не подтвердил возможности внут- • рснней независимой инициации трансляции флавивирусного генома. Было показано (Rioe et al, 1985; Caetle et al., 1985, 1986; Wengler et al., 1985), что РНК флавивирусов содержит одну открытую рамку считывания флавивярусннх белков и последовательности, кодирувдие белки, располагаются на генома в следующем порядке: 5'- С - ргеМ - Б - NS1 - JÏS2q - U52b - KS3 - NS4a -- NS4b - NS5 -3'.

Определение нуклеотидных последовательностей генома флавивирусов способствовало поиску в РНК флавивирусов структур, существенных для инициации трансляции. В РНК флавивирусов найдены AUG-кодоны, предшествующие нуклеотидным последовательностям, кодирующим белки NS£a, "32b, iîs4b и us5, в ближайшем окружении которых локализованы последовательности ACU(C)COTGU, которые комплементарны 3'-концевым участкам рибосомальных РНК (Ooia et al., 1988). Кроме того, последовательности нуклеотидов, окружаюцаицие эти AUG-кодоны, сходны с теми последовательностями, которые имеются около AUG-кодонов, с которых осуществляется предпочтительная инициация трансляции на . мРНК эуквриот (KozaJc, 1983). Эти соображения нв исключают возможности внутренней независимой инициации трансляции белков флавивирусов, но данных, свидетельствующих о реализации такого способа синтеза белков флавивирусов, не-получено.

В то же время не имеется данных, свидетельствующих об образовании в клетках, зараженных флавивирусами, гигантского голипептида-предшественника, включающего в себя все вирусспецифические белки, что обусловлено, по всей видимости, котрансляционным процесоингом образующейся в ходе трансляции полшюптидной цепи. Создание определенных специальных условий в течение вирусной инфекции позволяэт выявить высокомолекулярные белки, более протяженные, чем самый крупный белок флавивирусов - белок N35 (Cleaves, 1985; Crawford, Wright, 1987; Osden. Poirier, 1985). Благодаря использовании поли-

длональных антйсивороток к ряда шрусспбцифическкх бзлков ь опытах in vivo было покадзно, что: а) белки С, prêta и £ не обнаруживаются в составе голяпэдтада-предластвеЕЧИка: б) белок NS1 процессору6т из полЕлелзида-прзддествешика, содержащего также и белок ¡J3£a; в; белок NS2b образуется Оез какого-либо промежуточного предшественника; г) об пасть белков NS3--5 процессирует с образованием значительного числа полипептидов-предоственников (ОЬслЬегь et ai., 1990). Разрезание образующейся полипелтидаой цопи осуществляется, в основном, посредством вирусной протеазы HS3, функциональная активность кототсй предсказана на основа анализа первичных белковых, последовательностей (Bazan, Fletteriok, 1989; Goroalenya et &1., • 1969) и в дальнейшем подтверждена экспериментально iFalgout et al., 1991; Wengler et al., 1991; Cahour et ai., 1932).

1.1. Идентификация синт&за вирусных белков в культуре клеток.

Основным штаммом вирусе КЗ, использованным наш для изучения синтеза вирусспешгфических белков вируса КЗ.' был штамм Софьин, основной культурой - перевиваемые клетки ПЭС, в которых развиваотся острая вирусняя.инфекция с разрушением монослоя клеюк. Вирус ЙЭ, как и другие флавквирусы, незначительно подавляет синтез клеточных Силков. Обработка к^ьток антиномицином D незначительно подаьллот синтез- клоточных оялгоь и способствуе'; при stow более интенсивному включению мзтки я вирусспецифичеcraie белки [1, £4]?. При этих условиях ряд В11русидацифических белксв - p93(NS5), р79, p€9(iJS3), р53(Е), р21, р13. р13 и р12, хорошо выявляется при электрофорезе в Ю% к 15» ПАТ (рис. 1 ).

Обнаружено, что в хечэгше первых 5 часов послэ инфэкшш не происходит сколько-шбудь заметного скнтэзэ Еирусспецифичеоких белков [17]. В период 5-В часов синтезируются в заметных количествах белки HS5, NS3 и Е. Эти и другие -вирусспецкфическиэ бэлки дай заражении клеток с высокой мнегарт-венноотью инфекции (100 БОЕ/клвтка) наиболее активно синтезируется в период 8-14 часов после инокуляции, то есть в конце латентного периода и во время выхода порвых вновь образованных инфекционных частиц из клеток. В дальнейшем, то есть во время активного выхода инфекционных частиц из клетки, синтез вирусспецифическкх белков уменьшается. Синтез вирусспевдфичэских белков при заражении клеток с более низкой множественностью иьфек-

3 - здесь и да нее ь квадратных скобках указан номер работы из списка публикаций по иатеряалам доклада, в которой представлена Солээ подробная информация о проЕеденных исслэдовшшях.

ш ^4 БОЕ/клетка; существенно отличается. Период наиболее актпвно-10 синтеза вирусспецифических белков сдвигается до 14-23 часов.

Для интерпретации различий синтеза вирусспецифических белков вируса КЭ Ери разных ^шфкцирующих дозах важны данные Trent et al. (1969), которые показали, что количество первично инфицированных вирусом ЭСЛ клеток составляет около 90S при любой множественности з&рпкения в границах 5-90 БОЕ/клетка. Испольаовапный автора;ли метод определения инфекционных центров не позволял определяй, количества инфекционных частиц, провисающих в отдельную клетку при разных

рЗЗ —• I es

рта. рбЗ-

i N ; « с» -

рЯ-jSU 8 м S ЕЬ*

- л Q I

p Ък ■

„ Я»

ft»

Н&5(РИЬ» СЭ СЭ

t.I'I — . »3

p24 —;

pB—,

psa—

.HI

Рис.

О —

B H 5 S~7 1. Анализ в 15% (А.) и 10«

preNS3 (pTSh

г ' ©

NS3(p6Sb

h w

E (р5Ъ)— <; HS1 (pVft-j*

0» i

li. &

8'-

а г з v

(Б) ПАГ белков, синтезирующихся. в

заракенных вирусом КЭ (дорожки 1, 3, 5) и незараженнкх

(дорою® 2, 4, 6) клетках ПЭС [24].

На дорокках 1-4 представлены белки, синтезируищеся в клетках, обработанных актиномицином D (Бмкг/мл), на дорожках 5,6 - -белки,' синтезирующиеся в клетках при дополнительной обработке ЦГИ (50 мкг/мл) с последующей отмывкой и Nad (избыток 190 Ш). Клетки ин-

35а-метиошшом (2-6) с 32 по 3S представляет белки препарата

Енрионов, меченых при использовании

кусировали с часы" после

14С инфекции.

Дорожа

и 7

С-гйдролизата хлореллы.

инфицирующих дозах, к степени развитая патологических процессов в клетке в зависимости от инфицирующей дозы, тогда как елзктрсфорети-ческий анализ белков позволяет еыявить различие течения инфекции в зависимости от заражающей доза.

По всей видимости, при высокой множественности инфекции в клетку проникает Оолыаое' количество вирионов и после высвобождения из них геномной РНК на ней осуществляется синтез вирусспецифических белков. При заражении клеток с множественностью 4 БОЕ на клетку в чаоть клеток, по всей видимости, проникает несколько вирионов и . шоольшой синтез вирусспецифических белкоЕ, отмеченный в ранние сроки (8-11 часов), обусловлен трансляцией белкоЕ с РНК, высвобожденных из вирионов. В большую часть клеток, зараженных при 'инфицирующей дозе А БОЕ/клетка, проникает, по всей видимости, одна вирусная частица и для активного синтеза вирусспецифических белков в. клетках необходима репликация геномной РНК.

Бирусспецифические белки р47 (KS1), р34, р24, и р23, синтез которых замаскирован клеточными белками, хорошо оОяарузйдзЕятся после обработки клеток ЦТ'К и KaOl (рис. 1, дорохка 5). Следует отметать, что комбинация обработок ИШ и NaOl подавляет синтез не только клеточных белков, но и вирус спецшШческих белков р69, р21, р12.

Элиминирование включения метки в клеточные белки при обработко •'клеток.ЦГИ и NsPl, вероятно, обусловлено тем, что гипертонический концентрации Nací подезляит процесс инициации трансляции мРНК. Небольшая длина клеточных мРНК, по всей видимости, обеспечивает полную трансляцию основной части мРНК клеток уже в течение 20 мчн обработки клеток haCI, т.е. до введения метет. Поскольку инициация трансляции некоторого количества геномной РНК вируса КЭ осушествля-ется до начала обработок, последующая элонгация трансляции этой длинной мРНК приводит к синтезу вирусспецифических белков на фоне практически полного отсутствия синтеза белков клеток. Отсутствие образования в условиях обработок ЦГИ и NaCi белков р69 и р12 может быть обусловлено подавлением процессов протеолиза, обеспечивающих обрачование этих белков из промежуточных полипептвдов-предшествен-яиков. Это предположение подтверждается фактом более интенсивного образования в условиях обработок клеток ЦГИ и NaCl полипептида белка р79, который, как показано наш при сравнении пептидных карт белков 12], является предшественником белка рбЗ (N33) - ргеКБЗ.

Аналог белка р53 - белок Е оболочки вирионов, мигрирует при электрофорезе широкой полосой, что свидетельствует о его гетерогенности пс ЭФП. В зараженных метках ПЭС имеется два белка р53, обла-

дпюдих близкой подвижностью. Эти белки хорошо выявляются в 15S, но не в 10Ж ПА1'. 00а эти бежа но набору продуктов ограниченного протеолизэ идентичны. 14С-машоза и 5н-глшозямин включаются только в белок р53 меньшей электрофоретической подвижности. Это свидетельствует о том, что аналог белка К вируса КЗ в зарзженных. клетках существует в двух формах - гликозилмроввнкой и негликозилированной. Гетерогенность белка Е по электрофоретической подвикности может являться отражением включения в вирионы белка р53 разной стопени гликозилирования. Существование негликозилированной формы белка Е' отмечено также для вируса ЯЛ (Sohlesinger et al., 1933).

Так ш, как и для других флавивирусов (Shapiro et al., 1972; Smith, Wright, 1935), высокая степень гликозилирования отмечается не только для белка р53, но и для бэлков р-17 (NR1 ) и р21 (ргзМ) вируса КЗ (рис. 1 ), что подтверждается такле данными Дживанян и др. (1987) и btephenson et al. (19Э7). Нами отмечено также небольшое, но хорошо выявляемое при электрофоретическом анализе в 1G5E ПАГ и длительной экспозиции гелей, включение углеводных меток (14С-манно-

зы и сЕ-глвкозаминэ ) в белки рЭЗ (NS5 ), р79 и р69 (KS3 ). Эти данные свидетельствуют о том, что потенциальная возможность гликозилирования NS5 и US3, вытекающая из сведений о нуклеотидной последовательности генома вируса НЭ (Плетнев и др., 198Э), реализуются в зараженных клетках. О реализации сайтов гликозилирования по N-типу, имеющихся в белках N55 и NS3, свидетельствуют также данные, полученные при воздействии на клетки ингибитора гликозилирования -туникамицина (Дживанян и др., 1987). Гликозилирование белков NS5 и 1IS3 фяавивпрусов отмечено в ряде работ (Westaway, 1975; Gtohlnan et al, 1976; Westawsy, Shew, 1977), тогда как в других исследованиях • гликозилирование не было обнаружено. По Есей видимости, разноречивость экспериментальных данных связана о недостаточной стеценсв разделения высокомолекулярных белков в 15Ж ПАГ и низким уровнем включения радиоактивных углеводов в белки HS5 и NS3. Небольшое' вкточение радиоактивных углеводов в зоне высокомолекулярных '-белкев вируса КЗ мокно отметить также и в работе Stephenson et al.(1987).

Белок pi2 является клеточной формой структурного бэлка 0 и имеет большую ЭФП [2], что объясняется отщеплением - из него СООН-концезой, якорной последовательности, в результате которого, образуется нирионный белок С (Плетнев, 1990; Wengler et al., 1989).

Другие низкомолекулярные белки - р24, р23, р18 и ,р12, соответствуют, по всей видимости, белкам NS4b, Ж2а, NS2b и NS4a.

Как и для других флавивирусов, при репродукции зируса КЭ в

клетках ПЭС не обнаруживается аналога третьего структурного белка -р8 (М) [2]. По всей яидимости, вне вирионов этот белок быстро деградирует.

1.2. Закономерности синтеза белков в бесклэточных системах, программируемых вирионной РНК

В связи с тем, что синтез вирусспецифических белков флавивирусов в культурах клеток осуществляется на фоне высокого синтеза клеточных оелков, для подавления которого необходимо применить ряд обработок, приводящих одновременно к значительно меньшей утилизации радиоактивных метек, нами предпринято изучение ■трансляции геномной РНК вируса КЗ в бесклэточных системах. Одна из тасих систем, ос.-говой которой являктся экстракты из клеток Кребс-2, оыла эффективно использована для изучения биосинтеза пикорнаьирус-ных сэлков (Svitlcin, Agol, 1978).

Предварительные исследования показали, что при добавлении к босклеточным системам на основа клеток Крэбс-2 вирионноЯ РНК вируса КЭ наиболее высокое •включение радиоактивных аминокислот в полшеп-тиды осуществляется при невысоких концентрациях KCl (75 мМ). Ыаряду с полипептидами р53 и р13, которые идентичны по пептидным картам вирионнш белкам Е и С, синтезируется значительное количество внсс-комолякулярнну полилептидов с мол. массами до 160 КД [2]. Показано, что большинство этих'Нолшэптидоб имеет общую КН-,-концевую после до-вательность аминокислот и содеркит аминокислотные последовательности полилептидов р53 и р13. Увеличена концентрации KCl до 125 мМ приводит к резкому уменьшению количества этих полипептидов и одновременному увеличению количества р53, pis и дугглета белков р33/36. Замена части KCl (75 мМ) на КСН^СОО способствует синтезу небольших количеств полипептидов р93, р79 и pS9 (рис. 2, дорожа 2), из которых, по меньшей мерз, один - рбЭ, идентичен одному из неструктурных белков - WS3 вирусе КЭ, поскольку они обладали одинаковым набором продуктов ограниченного протеолкза [20].

Трансляция РНК вируса КЭ в лизатах ретикулоцитоз 1гролика при различных ионных условиях приводит к образованию гетерогенной смеси белков, не содержащей зрелых структурных белков (рис. 2, дорожки 4-7). При изучении трансляции з лизатвх ретикулоцитов РНК флавиви-р/сов ЗН и Кандкин показано, что образующаяся гетерогенная смесь 'полилептидов содержит аминокислотные последовательности структурных белков (Wengler et al., 1579; Monokton, Westaway, 1932). Все эти данные привели к предположению, что в лизатах. ретикулоцитов отсут-

Hic. 2. Продукта троншяцпя РНК ифуса

КЭ В 09СКЛ9 точной системе из

клеток Кребс-2 и лизатов peitf-

кулоцитов кролика [7, 20]. .

Представлены продукты, образующиеся в бесклеточной системе из клеток Кребс-2 при 75 мМ KCl и 50 мМ ацетата калия в отсутствие экзогенной матрицы (1) или в присутствии РНК вируса КЭ (треки 2,3) й 0,5» Тритона Х-100 кС) я в лизатах ретикулоцитов в отсутствие экзогенной матрицы при 110 мМ ацетата калия (8) и в присутствии РНК вируса КЭ при 135 (4), 110 (5), 85 (6) и S5 (7) мМ ацетата калия. Бесклеточные системы инкубировали 3 часа.

ствуют компоненты, необходимые. для образования зрелых структурных белков и присутствующие в экстрактах из клеток Кребс-2. Добавление небольших количеств экстракта из клеток Кребс-2 приводит к образованию в лизатах ретикулоцитов полщгоптидов р53 и р13 и одноц. .-.энному уменьшению количества высокомолекулярных голигогпгидор. Лозяе разделения компонентов экстракта клеток Кребс-2 было показано, что наибольшей активностью обладает фракция мембран эндоплазматического ретикулума, очищенная от примеси рибосом. Дополнительным свидетельством необходимости мембран для образования зрелых структурны* белков является то, что набор полишштвдов, синтезируемых в бескле-гочкой системе из клеток Кребс-2 б присутствии детергента тритона Х-100, который солюбилизирует мембранные структуры, сходен с набором продуктов, обнаруживаемых в лизатах ретикулоцитов, и содержит следовые количества р53 и р13 (рис. 2, дорожка 3). Таким образом, процессинг предшественника структурных белков вируса КЭ осуществляется на мембранах с участием клеточных протевз.

Для выяснения механизма инициации трансляции РНК вируса КЭ были проведены опыты с инициаторной После исчерпывающего переваривания продуктов трансляции вируса КЭ в Сескдэ-точных системах из клеток Кребс-2 показано, что форгам[35ЗЬм<»тио-нин, в основном, содержится в одном пептиде (г). Это указывает на то, что в Сесклеточннх системах реализуется один сайт инициации трансляции. О его локализации на генома свидетельствуют наши дашше о влиянии 7-мвтилгуаноз1ша-Г)'-иоко^)Сфата (п'ор) на трансляцию РНК

раз -

Р79-рсз - «

Р55 - СЪ

1 П » ито

• Р П1 ■

- й :

рзв-

Р 2G-|>23-

pß-

¿3

вируса НЭ 120]. Большинство эукариоти^еских пРНК, в том числе и РНК фяавивирусов (Wengler et al., 1978; Cleaves, Bubin, 1979), содержит на 5'-конце вкэп"-структуру (œ^Gppp), которая играет ванную роль в инициации трансляции. Трансляция таких матриц in vitro угнетается аналогами "кэш", одним из которых является m7Gp (Weber et al., 1978). Из наших данных"следует, что n'Gp угнетает трансляцию клеточных шЕНК и РНК вируса КЗ, и не влияет на трансляцию РШ вируса энцефаломиокардита, которая содержит на 5'-конце нэ "кэп"~ структуру, s кэвалентно присоединенный белок (Дрыгай и др., 1979). Включение формид [ЗБ8]-метиокина в полипептид р13, но не в р53, указывает не то, что инициаторный участок содержится в р13. Полу-■ченные данные свидетельствуют о том, что участок генома, кодирующий структурные балки вируса КЭ, непосредственно примыкает к 5'-концу вирионной РШ. Существенно более поздняя аккумуляция в бе силе точной системе из клеток Кребс-2 неструктурных белков, по меньшей мэре, полипептида р69 свидетельствует об удаленности участка, кодирующего неструктурные белки, от 5'-конца РНК вируса КЭ [20].

Данные о механизме и последовательности образования зрелых структурных белков из Еолшюптида-предшественнина получены в пульс-чейз экспериментах с использованием инициаторной î [35s]iist-tENK^e"t (рис. 3) при условиях, исключающих повторную инициацию трансляции. Через 15-20 мин после добавления РНК в бесклеточной системе СИНТе-

ос

зируется дуплет полипептидов р36/33, ме1~4ихся f[ÖUS]Met и идентичных по набору олигспелтидов р13, который образуется в ходе длительного чейза и также метится ï[35S]Met. Это свидетельствует о соответствии полипептидов р36/33 нэрасшепленвшу участку С-ргеЫ, который процессирует в дальнейшем до зрелых белков С и Н. Образование зрелого белка M нами не било выявлено вследствие отсутствия в нем метионина, на что указывают данные ко определению нуклэотвдкой последовательности структурной области генома вируса КЭ (Плетнев и др., 1986). Полипептиды р26/23, по всей видимости, представляют собой СООН-концевые фрагменты полипептвдоЕ р36/33 и являются предшественниками белка М. Полипептид т)53 образуется не нанее чем через

ос

20 мин, не метится i[ £]Met и его количества в ходе чейзз не изменяются. В специальном опыте при изучении образования зрелого структурного белка S в лизатах ретикулоцитов в условиях добавления мембран клеток Кребс-2 на фоне исключения повторной инициации трансляции с помошыо пактамицша показано, что отщепление полипептида р53 из образующего полипептида-предшественника осуществляется не позднее 10 мин, т.е. только в случае, если размер предшественника

МБТК* ¿О^МЕТ^ р- р« Б] М£Т-|

; рЗЗ —^ - ** "

' «Л'-»* -

Н _ ••=; «к -

пипчпч п* п ч п ч п*ч п го «<0 во <Бэ го «о во <во

ВРЕМЯ < МИК>

Рис. 3- Аккумуляция полипептидов в бесклэточной системе из клеток

Кребс-2, программируемой РНК вируса НЭ при использовании в

качестве субстрата г[^ВЩеЪ-ШЛС^®'1 или [35S]Ыet [15].

В различные интервалы времени из бесклеточной системы отбирали аликвоты и разделяли на 2 порции, из которых одна (п, пульс) сразу фиксировалась для электрофореза, а другая (ч, чейз). - после инкубации в присутствии ЦГИ (200 мкг/мл). Полное время- инкубации . составляло 3 часа.

не превышает 56 КД [7]. Дальнейшее увеличение длины• полипейтида-прэдшественника, по всей видимости, приводит к тому, что полипептидная цепь приобретает структуру, которая препятствует взаимодействию с мембранами и дальнейшему созреванию структурных' белков. 1

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что в бес—, клеточной системе из клеток Кребс-2 осуществляется эффективная, трансляция 5'-концевой области генома вируса КЭ, кодирующей структурные белки, тогда как последующая область генома, кодирующая

неструктурные бэлкк транслируется с низкой эффективность». Процес-оинг структурных белков осуществляется с помощью клеточных протеаз: отщ9Пле1И9 бзлкй Б происходит быстро, тогда как белок С прогрессирует медленно из нел^еп'.чиов р36/33, отщепленных из нолилептида-предшествеккика , одновременно с белком Е- Бэлок М образуется из полипептидов р26/2й, предстаашоших собой, ССОК-концовуп часть псл1шептадсв рЗЗ/'ЗЗ, по всей видимости, позке белка С.

1.3. Сравнительный анализ электрофораткческсй подвижности внруесьецифлчэских белков фдавивирусов

Сравнительный электрофоратическиЛ анализ высокомолекулярных вируоспецифических бь.тов 12 флаЕивирусов из 5 серологических груш, был проведен в 8% ПАГ в ДСН-фосфатной буферной системе (Westa•.vay =1.. 1974). В этой работе нэ было обнаружено существенных от.тачий в числе и ЭФЛ высокомолекулярных вирус-спэцифических белков, за исключением заметно меньней подвипшости белка N33 вируса денге-2. 3 то же врэмя, анализ вирусслецкфичесгшх балков трех вирусов комплекса КЗ и вируса ЗК в 7,5% ПАГ в прерывистой буферной система ЬаепиН (.1970) выявил значительные различия в ЭФГГ белков N35, и Е (Панков и др., 1982),

В результате этих исследований оставалось неясным, действительно ли при размножении флевивирусов различных групп образуются различные высокомолекулярные вирусспецяфичь гаже белки или же различия е числе и ЭФЯ отдельных вирусспецифических белков определяются индивидуальными характеристиками использованных штаммов вирусов.

■С целью выяснения этих вопросов проведено изучение ЭФП высокомолекулярных вЕрусспецлфитеских белков 8 штаммов вируса КЭ и 6 'другта вирусов, входящих б комплекс КЗ: КЖЗ, Лангат, Непшш, ОМ, 'ЫЭО и Иовзссан, в также фдавивирусоз, относящихся к различным серологическим комплексам: денге-2, Зика, ЗН и Уганда 3,

В клэтках, зараженных флавивируааки, синтезируются высокомолекулярные вирусспецифические белки МЕ.5, N53 и Е. На электрофореграм-мах белков клеток, (рис. 4), зараженных вирусам! комплекса КЗ (дорожки 1-3, 7-10), в зоне .между белками N35 и N33 определяется белок р79 (ргеЯЗЗ), который нэ обкврукиваэтея в контрольных незаракешшх клетках (дорошка 11) и в клетках, зараженных другими флавивирусами.

При сравнении ЭФЯ белков мзб различных флавивирусов мокно отметить, что белки всех исследованных вирусов комплекса КЭ, кроме вируса Повассан, имеют одинаковую подвижность. Немного медленнее двигается белки N55 вирусов Повассан, ЗН и Уганда 5. Еще медленное

движутся белки изо вирусов денге-2 я Зш:а.

Вирусспецифдчесюю бвлкя ИБЗ флавивирусов обладают более выряженными различиями ЭФП, чем белки Для большинства

представителей комплексе КЗ, а именно, вирусов КЗ (штаммы Софькн, 25С, ЭК-328, Айна£ Б-680 и ЮБ-45), ЛЭО, Негшк, ОГЛ и КЛБ, подвижность белков.кзЗ одинакова, ко она немного меньше для вирусов Повассан и Лангат , а такта для штамма Скалица вируса КЗ. Изученные нами флавивирусы, переносимые комарами, значительно различаются по ЗШ белка ИБЗ. Если ЭФП бежа N03 вирусов ЗН и Уганда & близка к ЭФП белка N33 вирусов Лангат и Повассан, то для вирусоя Зикэ и-денге-2 подвижность етого Солка существенно ниже и приближается к ЭФП балла ргензз вирусов комплекса КЗ.

Белок ргсНБЗ (р79) образуется при заражении клеток рядсм Еирусов комплекса НЭ. При инфекции клеток ЦЭС шталмами ЭК-328, Айна и Б-880 вируса КЭ этот белок не обнаружив?лея. Б клетках ПЭС, зараженных вирусом Повассан, Оелок ргемзз образуется слабо пли не обнаруживался вовсе, тогда как в клетках ЬНН-21 он активно синтезируется, что свидетельствует о различиях процессов ттротеолиза белков в различных клеточных системах.

Подобно у. ибЗ, вирусспецифэтеские болки Е флавизирусоз таеют неодинаковую ЭФП. Подвикность белков В вирусов комплекса КЭ практически одинакова, за исключением вируиа Повассан и штамма

• - " Рис. 4. Электрофоретичес-

а Ш И Я-2 У ЭМ П С 153 Ск К кий анализ вы?окомолек*-

лярных вируссиецифических <; болтов флавивирусов [6].

им С^3 ч' ин^К3

^ л. среда клеток ВНК-21 заме; ненэ на среду с .актиномл-■ ' * "Г? 1 цином В, через час вводи-

вгзАЗЗ-*-=» •• V к.

г (С, .„, А 1 ли С-гидролизат хлорел-

СЗ <л ■ лн, через 7 часов клетки

П95 С'* ^ «С» сиу

авизировали и анализирэ-

* вали е 10% ПАТ. Обозначе-

-•»> ,; г- ния Еирусов: Л - Лангат,

V р-, ) ч? Ш - шотландский энцефало-

. 4 миелит, Н - Нагиши, Д-2 -

■и'з С'Э^а.^г'"* денге-2, У - Уганда э,

- V I" ' '•1 зн ~ Западный Нил, П -

' / . ; ¡¿- , Повассан, штаммы КЗ: С -

•т :Ъ V- - - Софыш, Ск - Скагаде.

2 " > г л Дорожка 11 характеризует

Скалице вируса КЭ, белки Е которых движутся в геле заметно медленнее. Другие флавивирусы гетерогенкы го ЭФП белка Е, а именно, белок' Е вируса денг9--2 движется медленнее, а белки Е вирусов БН и Уганда s быстрее, чем соответствующие белки вирусов комплекса КЭ. На основании наших данных можно говорить о гомогенности вирусов комплекса КЭ по ЭКГ белка Е.

Синтез бёлка NG1 выявляется хорошо в условиях сильного подавления синтеза клеточных белков при обработке клеток ПЭО гипертоническим pacïBupOiV ИаИ [6]. Выявлено, что белки NS1 как различных флавивирусов, так и разных штаммов вируса КЭ, отличаются по ЭФП.

Б настоящей работе показано, что белки HS5, NS3 и Е имеют одинаковую или близкую ЭФП у Еирусов комплекса КЭ, в то время как соответствующие белки флавивирусов, принадлежащих к другим антигенным грушам, отличаются по ЭФП как от белков вирусов комплекса КЭ, так и мекду собой. Одинаковая подвижность белков NS5, N53 и Е ряда штаммов вируса КЭ и вируса ШЗО была отмечена такке Heinz, Kunz (1982 >

Вирус Ловассан отличается от других вирусов комплекса КЭ меньшей подвижностью белка Е. Кроме того, вирус Повассан близок по-ЭФП белка NS5 к изученным фдввивирусам, не принадлежащим к комплексу КЭ. Однако, в клетках ВНК-21, заракенных вирусом Повассан, отмечен активный синтез белка ргеШЗЗ - белка, характерного для вирусов комплекса КЭ. На бсновании этих данных можно говорить о том, что вирус Повасоан принадлежит к комплексу КЭ, но менее других'вирусов этого комплекса связан с ним. Эта данные согласуются с данными о серологических взаимосвязях вирусов антигенной группы КЭ, о которых пойдет речь в главе 2.

1.4. Иммунохимические свойства влрусспецифичэских белков

Антигенную активность вирусспецифических белков выявляли с помощью кдауноблога при использовании гшгериммуншгх антисывороток, полученных при иммунизации кроликов суспензиями мозга зараженных мышей (рис- 5Л), а также иммуносорбции на антителах гипериммунного лошадиного 7-глобулина производства объединения "Вирион" (Томск), пришитых на сефарозе [291. Для обнаружения кроличьих антител, связавшихся с вирусспецифическиш белками на нитроцеллюлозных фильтрах, использовали препарат "антитела диагностические против иммуноглобулинов кролика, меченые гороксидазой", производства ЙЭМ им. Н.Ф. Гамалеи ЕАШ. О специфичности используемых антисывороток свидетельствовали данные контрольных экспериментов, в которых не отме-

чено связывания клеточных белков с вирусспецифическими антителами. Оба метода хорошо выявляют белки рЭЗ (JJS5) > р69 (NS3), р53 (Е) и р13 (С), что свидетельствует о их еысокой имммуногенной активности. Небольшая степень отделения с помощью иммуносорбции белков р18, р21, р23, и р24, вероятнее всего, обусловлена небольшой индукцией антител к 1шм при иммунизации кивотных. Белок НБ1 вируса КЗ также, как для других флавивирусоз (Winkler eb al., 1968), существует в клетках в форме дилера (&WS1). Этот белок обладает высокой антигенной активностью в иммуноблоте в отличие от мономэрной формы (р47) (рис. 5А). На stom рисунке представлены данные об антигенной активности белка N53 в составе бежа р79 (ргеИЗЗ). Повторное иммуиохими-чоское тестирование высокомолекулярных белков, элшрованных из ПАТ, показало, что белок HS3 антигенно активен и в форме белка р69.

Наличие активности в РДПА препаратов клеток, зараженных вирусом КЭ, после обрэбки 1% ДОН [16], привело нас к поиску вирусспеци-фических белков; сохраняющее способность к преципитации антителами поело воздействия жестких диссоциирующих условий. Для детекции прецшштирующей активности использован метод БИЭФ, который более чувствителен я удобен, чем РДПА. Для диссоциации белков клеток применяли нэ прогревание при 100°С в. течение 1 минуты, а инкубацию при комнатной температуре в течение 3-4 часов, поскольку прогревание приводит к исчезновению преципитируицей активности. Успеху

А : „_» —NS5

dm eg---pre иss

l.»H—»> ^'I'llll'f I'l Б

И * -

ч_с «55 N55

Рис. Б. Выявление антигенной активности вируоспецифических. белков'

вируса КЭ с помощью иммуноблота (А) и двумерного ДСНУиммуно

электрофореза (Б) [16, 34].

Клетки ПЭС, зараженные вирусом КЭ, через 28 часов после инфекции лизировали и разделяли в ю% ШТ. А - Довоака ! - негретая прбба, дерокка 2 - проба прогиета при ШСгС в течение минуты. Б - полоску ПАТ заплавляли з вгйрозу и проводили екмузчэфорез.

проведения такой работы помогло то, что прощшитируицая активность устойчива к воздействию диссоциирующих условий, которые создаются в буфере Laenraly (25? ДСП, 5S мэркаптозтанола). Для выяснения того, какой белок обладает антигенной активность« при этих диссоциирующих условиях, была -использована штодика (Chua and Blomberg, 1979) с некоторыми модификациями. Полосу ГАГ с разделенными белками заплав-ляли в IS агарозу с 1% дезоксихолата, который использовали для лучшей электроэлюции белков в агэрозный гель. В ходе электрофореза во втором направлении белют проходили через гель 1,5% тритона X-100i который использовали для связывания ДОН и переводу такгол образом белков в форму близкую к нативной. После этого электрофореза в агарозном гелэ с гип&риммуншм 7-глобуликом образовывались ракетные полосы преципитации, соответствующие по своему положению белкам NS5 к dîjsi (рис. 5Б). Другие, антигенно активные в иммуноблоте и имму-носорбции вирусслецифаческие белки не взаимодействуют после указанных диссоциирующих воздействий с антителами с образованием ракетных гюлос преципитации. Дополнительная обработка лизатов клеток 4M и 8М мочевиной приводила к тому, что белок <i\*3i терял способность образовывать ракетную полосу преципитации.

Таким образом, наибольшей антигенной активностью среди вирус-специфических оелков вируса КЗ обладают белки NS&, NS3, Б, NS1 и с. Из гас, белки NS5 и NSI не чувствительна к воздействию ДОН и меркап-тоэтанола,' а белок Н35 - к обработке мочевиной.

1.4. Заключение.

Полученные данные о спектра вируссгоцвфических белков вируса КЭ, о динамике их синтеза в течение единичного цикла репродукции вируса, о включении углеводов в состав балков, о кх кммунохимвческой активности получены нами впервые и в дальнейшем подтверждены в работах других исследователей (Heinz, Kunz, 1932; Stephenson et al-., 1587; Дкиеннян"и др., 1987; Плетнев, 1930).

Выявленный Ii vUjc набор вирусспецифических белков вируса КЗ близок- к набору • втгрусепецкфвческих бе/лов флавивирусов из других антигенных групп. Исключение составляет ïo, что в клетках, зараженных вирусами комплекса КЭ, белок KSэ существует и хорошо выявляется таете и в форг« предшественника - ргьШЗ. Существование Оелла ргеГЕЗ вируса КЭ подтверждено Морозовой (1991) при использовании моноклональных антител к Оелку KS3. Возможно, что существование preNS3 обусловлено дефектами разрезания белка NS3 от Оелков NS2b и Н34а. При определенных условиях балок pi-e¡íS3 выявляется и для дру-

гих флазивлрусов tOsden, Poirier, 1985; Cauchi et al., 1991). Показано, что этот оолок представляет сооой полипвптидную цепь, состоящую из белков NS3 и KS4a и связанную с мембранами якорной последовательностью бежа HS4a (Cola et al., 1983; Cauohi et al., 1991; ЪоЪ1й, 1992). Выявлено, что полллептвд KS3-4a вируса ЭДМ является стабильным предшественником, который резистентен к дальнейшему протеолитическому процессингу дата в присутствии зрелого HS3 (liobig, 1992). Предположено, что стабильность полипептида NS3-2a вируса ЭДМ обусловлена конформоционныш изменениями, существенными для проявления другой ферментативной функции белка NS3 флавкЕирусов - голЕмэразной, которая предсказана на основе анализа первичной структуры белков и показана экспериментально (Gorbalenya et al., 1989; Плетнев, 1990; Wengler, Wengler, 1992).

Значительным отличием синтеза белков вируса КЭ in." vivo и in vavo является то, что неструктурные Оэлки практически не транслируются с геномной РЖ в бесклеточных системах. Возмокно, имеется барьер в элонгации трансляции гигантского полипептвдз-предшествен-никв, . coflepxnn;OTo последовательности всех вирусспецифагеосклх белков, и этот оарьор успешно преодолевается в клетках. В последующих работах по изучения процесскнга неструктурных белков флавнвируеов использовались генетические конструкции, не содержанию последовательностей, кодкруизЕх структурные белки (Wengler et гй., 1991).

Полученные даншэ о механизме синтеза и процвеекпга структурных белков Birpyea КЭ подтверждена при изучении трансляция геяйи-ческях конструкщй, содержащих последовательности, кодирующие структурные белки флававврусов (Howak et al., 1989; Euis-Mnares et al., 1989; llzrkoïî, 19S9).

Устгшоздзншй нема порядок расположения участков, кодирующих структурные белки, на генс?лэ флавнвирусов подтвержден при изучении нуклеотидных посдэдовзтельностей геномных РНК (Ricr at al., 1985). Существенно, что опыта по трансляции рнк вируса КЭ в бесклеточных системах позволили выявить последовательность образования зрелых структурных белков и необходимость для их процессинга связанных с мембранами клеточных протеаз, которые осуществляют котрансляционную модисрпсацшо полнпептида-предаественника.

Совокупность данных оО организации генома флавивирусов и синтезе флазивирусных оелков послужили обоснованием выделения флавивпрусов из семейства îo^aviridae в отдельное семейство -Plaviviridae (VfeBtriway et al., 19S5).

ймуномдалчэсков изучение вирусспецифических белков вируса К^

показало, что не только аналоги структурных оелков Е к С, но и неструктурные оелкн hs5, кез и ksi , обладают высокой активностью и что их иммунохимическая эктиеность модулируется по-разкому физико-химическими воздействиями. Эти данные имеют существенное значение для понимания а интерпретации материала, изложенного в следующей главе. Полученная информация о свойствах Оелка N35 подтверждает данные Qursshl and Trent '.1973), указнваюздш на высокую взгмунохимк-ческузо активность оелка HS5 флавизируса - вируса ЭСЛ.

2. АНАЛИЗ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР ВИРУСА KD.

Для .диагностики и дифференциации флавивизирусов в качестве антигенных препаратов первоначально использовались экстракты и . суспензии тканей зараженных животных, такие как сахарозо-ацотоновый, боратно-сслевой антигены, которые обладали ГА-ективностью и позволяли поэтому проводить диагностику флавивирусов по антигенным доторманаятам вириоков в РИГА (Clarke, Cabals, 1950). Основной антиген вируса КЗ, присутствующий в таких препаратах, ооычно образовывал в РДПЛ полосу преципитация посередине м&зкду лунками с антигеном и антисывороткой (Ржахова, Чумаков, 1965; Горев, 1966). -При концентрировании вкруссодержащкх культуральных жидкостей этот антиген такке преобладал над вирионами (Кокорев, .Захирова, 1966; Неустроев, Рубш, 1S6S, 1968; lee et al., 19S1), которые обладали иными диффузионными свойствами (Рубин. 1972).

Ультрацентрифугирование препаратов флавивирусов приводило к тому, чта этот антиген оставался в надосздкэ, тогда как вирионы осаждались кз дно пробирок (Hawues. Marshall, 1967; Гайдамович, Лаврова, 1974). Это послужило основанием для обозначения неосаждаэмого при ультрацентрифугирования антигена флавивирусов, как-"растворимого" iPA) (SoMee-inger, 1977; Rüssel et al., 1980). Одним из свойств, позволяющих дифференцировать РА от вирионов б РСК, являлась высокая степень резистентности антигенной активности РА к диссощшруюЕйм воздействиям (обработка ДОН, мэркаптоатонолом) (Brandt st al.,.1970; EoltelB et al., 1975; Cardiff et al., 1971; Rai and Ohosh, 1976). Благодаря этому p. результате фракционирования в градиентах концентрации сахарозы выявлено, что РА флавивирусов отличается от вирионов существенно более низкими седвментациошшми свойствами - коэффициент седиментации около 7 s, тогда как для . вирионоз зтот показатель составляет 175-210 S (Brandt st al., 1970; Smith et al., 1970).

В результате седимэнтациовного анализа в препаратах вируса КЭ

выявлен материал, составлявшей второй пик ГА-активности в положении 65-70 я (Hsinz, Kunz, 1977), который находится на периферии широкого пика инфекционности, совпадающего с пиком вирионов (lee et al., "1939). Наличие второго пика ГА-активности вмвсте с обнаружением во фракциях &TGсо пина пончикообразяых структур диаметром 10-14 нм послужило основанием для постулирования существования МСГА - неин- , секционного антигена йлавквируеов, иммунохимически родствешого Бирконам (Brandt et al., 1970; Hitano at al., 1974; Deila-Porta, ïtestû-A-ду, 1977; Cardiff et al., 1971; Schlesinger, 1977; Kuaael et ai., 1980; I,ее et al., 1989). МСГА стимулирует образование в организме животных ГА-ингибярущих, нейтрализущих, комплементевязкваю-щих к протэктиБных антител, но его серологическое родство с вирио-нами не является полным (Cardiff et al., 1971; Heinz,_Kunz, 197S). МСГА не образуется в культурах клеток комаров, а в клетках млокошт-татаг.га его продукция отмечается на поздних стадиях инфекции (Sinavaohatant, Olsen, 1973; Hg, Westaway, 1903; Лаврова, 1977). Зтот антиген не является продуктом разрушения вирионов, так как структуры, производные от вирионов, обладают иными физико-хлшчесними и морфологическими характеристиками (Smith et al., 1970; Heina. Kunz, 1979; Heinz et al., 1981). Исследование мембранных структур зараженных флавигирусами клеток показало, что они обладают высокой иммукохимической активностью, характерной для. вирионов, несмотря на отсутствие ГА-активности (Stohlman et, al., 1975, 1978). Репродукция в клетках Vero рекомбинантов вируса оспо-ввкцшш, содержащих последовательность генома вируса ЯЭ, соответствующую белкам М, Е и US1, сопровоядается интенсивным синтезом структур, взаимодействующих с моноклональными антителами к белку. Е и сходных по седиментационным свойствам с МСГА (Магзоп et al., 1991 ). Все эти данные свидетельствуют о правомочности обозначения бсвх структур, в том числе и МСГА, иммунохимическая активность которых обеспечивается белком Е, как вирионный антиген (ДА).

Определение молекулярной массы белка - носителя антигенной активности РА разными авторами давало широкий диапазон величин:, от 39-40 до 53-58 килодальтон (Cardiff et al., 1970, 1971; Bai, Grosh, 1976; EolreiB et al., 1975). Использование поли- и моноклоналышх антител, специфичных для РА, и сопоставление пептидных карт позволим идентифицировать белок РА как неструктурный белок ЭД31 (Smith et al., 1S35; Lee et al., 1989). Эта данные подтверждают обоснованность обозначения рядом авторов РА флавивируоов как неструктурного, • нэвирионногс антигена (НА). Для НА флаЕявирусов была отмечена высо-

кая степень ассоциации с мембранами андошгазматического ретгасулума (Stohlman et al., 1978) и высокая степень экспонирования на поверхности клеток (Westaway, Goodman, 1987). В то же время определено, что СООН-концеввя последовательность бежа Ж1 не содержит якорного домена, имеющегося у белков Е и С (Rice et al., 1985). Исследование взаимосвязи бежа usi с мембранами показало, что сразу после синтеза белок N31 гидрофилен, что соответствует данным о последовательности аминокислот, и приобретает свойства меморансвязонного Оелка только после дамеризации (Wirdtler et al., 1989; Pan, Mason, 1990; Gauchi et al., 1991). Это указыл-"пт, что белок îîSi принадлежит к классу амфитропннх белков, которые существуют в клетке либо в свободном состоянии, либо ассоциированы с мембранами (Вито, 1968). Внеклеточная форма оелка KS1 также представлена как в форме, свя-зашой с мембранами, так и в фэрме, свооодцой от них (Mason, 1939).

2.1. Способы выявления и Еммукшвлические свойства вирноннсго и невкрионного антигенов

Для детекции антигенов использовали антисыворотки, получезшые в результате иммунизации кроликов и белых мышей суспензиями мозга новорожденных белых мышей, зараженных вирусом НЭ. Наиболее часто использовали коммерческий препарат - гилериммунный т-глобулин из сыворотки лошадей, многократно иммунизированных суспензиями мозга белых мышей, производства объединения "Вирион" (Томск). Лаяние раздела 1.4. свидетельствуют о шлиспецифичности этих иммунных препаратов - содержании б них антител к большинству вирусспецифгческпх белков. В качестве моноспецяфдчЕога иммунного препарата использовали кроличьи аятисыворотки к очищенным шрионам.

Для получения антигенных препаратов вируса НЭ использовались улътрацентрифугирование вируесодэржащих культуральккх вддксстей (режим 12-14 мяк gxAfflii) и концентрация надосадочной жидкости либо ультрафильтрацией, - либо осаждением 70S сульфатом аммония. Материал осадка, полученного после ультрацентрпфугЕрозэнин, представляет собой препарат БА, а концентрат надосадочной кидкости - препарат НА.

Основной антиген вируса КЗ содержится в надосадочной квдкости к представляет собой НА, который образует в РДПА полосу преципитации с гиперкммунаш 7-глсоулином посередине между лункаш (рис. 6) и не взаимодействует с антисывороткой к очицв1Шым вирионам.

Цри взаимодействии препаратов Е.4 с антителами обычно выявляются две полосы преципитации. Одна, более четкая полоса образуется не расстоянии около 1,2 мм от лунки с антигеном уке через 6-8 часов, а

Рис. 6. Преципитирущая активность препаратов ВА (А) и НА (Б) вируса КЗ, полученных в культурах клеток ЛЭС [4]. В лунки 1-6 помещали антигенные_ препараты, полученные после инкубации культур в течение 8 часов и в интервалы времени 8-16, 16-24, 24-32, 32-40, 40-48 часов после заражения, соответственно. В средние лунки помещали гипэриммунный 7-глобулин. Концентрацию ВА из вируссодбржащей жидкости в 100 раз осуществляли ультрацентрифугированием, последующую, концентрацию НА в 7,5 раз проводили осавде-нием 70% СА. А и Б - схема и фотография окра-пенных полос преципитации, соответственно. Расстояние мэкду лунками - 5,5 мм.

другая, менее четкая полоса появляется приблизительно через 48 часов и отстоит от лунки с антигеном на 0,8 мм (рис. 6А). Образование этих линий преципитации как при использовании гшериммунного ч-гло-б.,лина из сыворотки лошади, так и антисыворотки к очищенным вирир-нзм, свидетельствует о том, что антигён, оСразуиций их, и есть ВА.

После неоднократного введения препаратов ВА в агаровый гель' образуется еще' одна полоса преципитации на расстоянии 2-2,5 мм от лунки с антигеном. Эта третья полоса преципитации сливается» с полосой преципитации, образуемой препаратами НА, что говорит о частичном осаждении НА при использованных нами режимах осаждения ВА.

ВА и НА вируса КЭ различались также по иммуноалектрофоратичес-ким свойствам. ВА формировал при взаимодействии в РИЭФ ракетную полосу преципитации, обрамляющую лунку и вытянутую в сторону катода. Такая форма обусловлена даижением в использованной нами электрофоре тической системе части ВА к аноду, а основной популяции ВА -к катоду. Это хорошо видно при анализе двйжения ВА в электрическом поле с помощью РИЭФ и ПИЗФ [14, 26]. НА образовывал в РИЭФ остроконечную преципитационную ракету в катодной, удаленной от лунки части агарозных гелей. Особенности иммуноэлектрофорегического поведения ВА и НА вируса КЭ можно видеть на рис. 12-15, иллюстрирующих данные соответствующих разделов. Следует отметить, что иммуноэлектрофоре-тические методы позволяют проводить не только качественную, но и количественную оценку антигенов в вирусных препаратах благодаря определению площади ракетной полосы преципитации (Аксельсен и др.,

1977). Кроме того, эта метода просты, удоош и не требуют получения моноспэцнфичшх антисывороток.

Использованные антисыворотки обладали высокой специфичностью, поскольку не*образовывали полос преципитации с контрольными препаратами, полученными из незараженных культур клеток.

При изучении динамики появления ВА показано, что интенсивный синтез ВА наблюдается с 16 по 48 часы (рис. 6). При оценке высот ракет ВА, образуемых при шмуно электрофоре за, наибольшая концентрация ВА была выявлена через 32-40 часов после заражения, тогда как в более ранние или более поздние сроки количество ВА было приблизительно в два раза меньшим. При изучении динамики накопления НА ■выявлено, что синтез на начинается уие в ранние сроки после заражения - через 8-16 часов. Наибольшее количество НА отмечено в период с 24 по 40 часы после заражения.

Отсутствие'гемЕГГлюиширупцой активности б препаратах НА является значительным отличиэм НА от ВА, но нэ может являться свидетельством полного различия антигенных детерминант ВА и НА, которое было подучено в опытах та истощению гипериммунного 7-глооулинз. Этот иммунный препарат после инкубации его в смеси с препаратом НА и последующем использования в РДПА этой смеси в качестве аятисыво-ротки образует с препаратами ВА двойную полосу преципитации, характерную для ВА, но не образует полосы преципитации, типичной для этого антигена, с- аппаратами НА. И наоборот, гкперикмунный 7-глобулля после истощения его препаратом ВА продолжает образовывать полосу преципитации посередине между лунками с препаратом НА, но не образует с препаратом ВА полос преципитации, характерных для ВА. Для выявления ^иммунохимических отлична БА и КА вируса КЭ использовали также моноклональные антитела к белкам Е и N31, полученные при совместных исследованиях сотрудниками ИПВЭ РАМН и Новосибирского Института бисорганической химии СО РАН, и препараты ВА и КА, полученные с помощью барьерного электрофореза (см. раздел 4.3.) и содержащие по данным РЙЭФ только один из указанных антигенов. Показано, что препараты ВА взаимодействовали в ИЖ только с моно-клональнзши антителами к структурному белку Е , тогда как препараты НА - только с моноклональными антителами к неструктурному белку N31. Все эгл данкне о-Бздегельсгвуют о полной разнице антигенных свойств ВА и НА вируса КЭ.

Следует отметить Сольь'ув специфичность КА ьирусов комплекса КЭ по отношению к гетеродогкчшй антисьворотке по сравнению о ВА [5]. Так, ВА вируса Воваосан образует полосу преципитации с гипериммуя-

ним т-глооулином против КЭ, ко эта полоса не сливается с полосой преципитации, образуемой ВА гомологичного вируса - Еируса КЭ. О слабом связывании в РДПА ВА ряда штаммов вируса Повассан с иммунной сывороткой к вирусу КЭ свидетельствуют данные Леоновой (1992). В отличие от этого, НА вируса Повассан не образовывал полосы преципитации с гипериммунным ^-глобулином против КЭ даже при многократном введении антигена и антител. Это свидетельствует о практически полном иммунологическом несоответствии НА вирусов КЭ и Повассан. Вирус Повассан, скорее всего, является вирусом, который наименее антиген-но сЕязан с вирусом КЭ. Это подтверждается данными других исследователей, из которых о,дни не включают вирус Повассан в антигенную группу КЭ (йеКайЫа, РохЧегПеХй, 1974), а другие отмечают односто-рсннуго связь вируса Повассан с вирусом КЭ (СаИвйег е* а1., 1989).

Другие вирусы комплекса КЭ более близки к вирусу КЭ. Так, при взаимодействии НА вирусов КЭ (штаммы Софыга и 256), Лангат, ОГЛ и Ногиыи с гипериммунннм 7-глобулином против КЭ выявлены следующие закономерности. НА вирусов КЭ (штаммы Софьин и 256) образуют с гомологичной антисывороткой полосы преципитации, которые не только сливаются, но и образуют "шпору"4 с полосами преципитации, образованными гетерологичными по отношению к используемой антисыЕо'ротке антигенами (НА вирусов Лангат, ОГЛ и Негшш). Это свидетельствует о наличии частичного иммунологического несоответствия между гомологичными и гетерологичными антигенами. Внутри своих групп гомологичные (НА штаммов Софьин и 255) и гетерслогичные (НА вирусов Лангат, ОГЛ и Негишк) по отношению к антисыворотке антигены не дифференцируются друг от друга. Сходные закономерности взаимосвязи вирусов комплекса КЗ были выявлены ранее при использовании сахарозо-эцетонового антигена, который в РДПА идентичен НА (Ржахова, Чумаков, 1965; Горев, ¡969), и антигена, получаемого из культуральных вируссодермадак жидкостей осаждением с помощью ПЭГ, -который представляет собой ВА (Рубин, 1972).

2.2. Закономерности осаждения антигенов полиэтиленгликол^м.

Одним из способов концентрации вирионсв вируса КЭ' является осаждение их с помощью относительно невысоких концентраций ПЭГ (Чумаков и др., 1968). В связи с тем, что было не ясно, возможно ли использовать ПЭГ для концентрации НА вируса КЭ, нами было проведено

4 - прещшитациошое образование, известное для близкородственных антигенов и отмеченное для Еирусов комплекса КЭ Горевым (1969).

подрооное изучение способности ПЭГ осаздать антигены вируса КЗ.

В результате использования дробного осакдения антигенов последовательно увеличлвакшшся концентрациями ПЭГ было показано, что препарата вируса КЗ, полученные осадившем ПЭГ вплоть до 7%, обладают ГА-активностью, максимум которой приходится на 2% ПЭГ [5]. Эти препараты имеют высокую концентррцию ВА и небольшое количество НА. При последующем добавлении ГИГ, начиная с 8% и вплоть до 22%, осаждается основная часть НА (рис. 7). Данные об осаждении НА вируса КЭ при невысоких концентрациях ПЭГ (5%) присутствуют также в работе Ъёе ег а.1. (1939).

ЭлэктрофорэтпческиЯ анализ антигенных препаратов показал, что препараты, полученные из исходной вируссодеряащзй жидкости при добавлении ПЭГ до , содержат, в основном, вирионные белки. Препараты, полученные осакдениэн ПЭГ в диапазоне 4-7?, содержат меньшее количество вирионных белков к большее количество примесей. Препараты, полученные при последующем добавлении ПЭГ как из исходной, так и из подвергнутой ультрацентрифугировакию вируссодержащей жидкости, содержат значительное количество Солков, часть из которых совпадает по ЗСП с неструктурными белками Ж5, ИБЗ, Н31 вируса КЭ.

Как указано в разделе 2.1., часть НА ооаадаотся ультрацентрифугированием, которое обеспечивает концентратов в осадке основных количеств ВА. Для выявления особенностей осакдения носедимзнтирую-' щих ВА и НА наш предпринято дробное фракционирование с помощью ПЭГ

Рис. 7. СИЭФ. Иммугешапггеские профили осаздения антигенов вируса КЭ из вируссодеряв-щей культуральной жидкости

с помощью ПЭГ [22]. Цифры в лунках указывают применяемые для осанщения антигенов концентрации ПЭГ в процентах. Анод -вверху, катод - внизу.

- э- ' : ; *

: «Г» го^

2Б

белков и белковых структур из Еируссодержащей культуральной жидкости, подвергнутся ультрацентрифугировагаго. Осаждение основной популяции ВА происходит при добавлении к вируссодержащей жидкости, не подвергнутой ультрацентрифугированию, ПЭГ до 3% , тогда как осаждение ВА, не концентрирующегося при ультрацентрифугировании, осуществляется большими концентрациями ГЭГ - 3-6%. Значительная часть НА, осаждающаяся невысокими концентрациями ПЭГ (до Б-7Ж), удаляется из вируссодержащей жидкости в резулвтате ультрацентрифугирования. Анализ антигенов вируса КЭ, присутствующих в вируссодержащей культуральной жидкости и осажденных ПЭГ, свидетельствует о гетерогенности физико-химичегасчх свойств Нй^ При невысоких концентрациях ПЭГ выпадают в осадок формы НА, частично седиментирушие при центрифугировании, тогда как при введении больших количеств осавдащих агентов концентрируются НА, че осаждаемые при использованном нами режимэ ультрацентрифугирования. Для того, чтобы интерпретировать получение данные, следует коснуться механизма осаждающего действия ПЭГ.

Введение в раствор ЕЗГ приводит не тслько к активному разрушению гидратннх оболочек и уменьшению растворимости белков ег а1., 1973; Ро1воп, 1974), но и к образованию в растворе пространственной сетки взаимодействующих друг с другом молекул полимера (Тихошшсо, 1973; Ъаигеп-Ь, 1967). Плотность этой сетки зависит от концентрации полимера. Осаждаемый объект, если он стерически не способен включиться в такую сэтну, не удерживается его в раствора и осаждается. Это объединяет феномен осаждения.с помощью ПЭГ с гельфильтрациошым разделением и указывает на то,- что определяющим з нем являются такие параметры как размер, форма, а также масса осаждаемого объекта. Известно, что единичные белки осаждаются высокими концентрациями ПЭГ (не ниже 20%). Поэтому осаждение НД вируса КЭ в широком диапазоне концентраций ПЭГ дает основание предположить, что НА представляют собой различающиеся по указанным параметрам надмолекулярные комплексы. По осаждению ПЭГ ВА представляет собой довольно гомогенную популяцию антигенных структур, что, учитывая сказанное выше о механизме действия ПЭГ, можно интерпретировать как близость ВА по размеру и форме. Осаждение ВА 3-7% ПЭГ может свидетельствовать о том, что небольшая, часть ВА имеет несколько меньшие размеры, чем основная популяция ВА, осаждающаяся при добавлении ПЭГ до 3% .

Следует отметить, что метод дробного осаждения антигенов вируса КЭ представляет собой простой и удобный способ получения препаратов Нй, не содержащих ВА.

2.3. Седимсытацжжше и хроматографкчоские характеристики антигенов препаратов Еируса клещевого энцефалита.

Дальнейшее изучение физико-химических свойств антигенов вируса КЭ было проведено с помощью седиментации в сахарозных градиентах и хроматографии.'

типичный пример седиментациошшх профилей препарата структур вируса КЭ представлен на рис. 8. Следует отметить близость распределений оптической плотности при 230 км (0И280) и метки по РНК, а также распределения белковой метки и величин ГА-активности. Совпадение пиков по Есем вышеуказанным параметрам наблюдается для зоны с коэффициентом седиментации 2С0-210 Б, которая содержит нативные вкрионы, и обозначена наш как пул 1. Следующий, меньший пик по ГА-активности и белковой метке соответствует по коэффициенту седиментации 70 Б и несколько предваряет пик по сю280 и метке по РНК, который обычно превосходил по указанным показателям фракции пула 1. Эти два пика, которые трудно дискриминировать друг от друга, обозначены наш как фракции пула 2. Верхушечные фракции градиента, для которых характерно снижение величин ов2„0, меток по белку и РНК, выделены в пул-о- Для пула з, в ряде случаев, отмечается небольшой подъем величин ГА-активности.

Практически, данные по величинам указанных параметров позволяют судить только о распределении основной массы вирионов (пул 1 ) и поймесей (пул 2 и 3). Более исчерпывающая характеристика седимэнта-

1—1

Рис. 8. СедименгациоЕнне профили

препарата вирусспецифических структур вируса КЭ, получен-

ного с помощью ультрацентрифугирования, в 5-30 % гради-

енте концентрация сахарозы

114].

Величины ГА-активности выражали в обратных двоичных логарифмах разьедений франций.

Дна г V II 20 25 Я34Г Л/- <ррахиии

ционных свойств антигенных структур вируса КЗ получена нами благодаря использованию иммуноэлектрофоретических методов, которые позволили судить о качественном и количественном распределении ВА и-НА вируса КЭ по фракциям градиента (рис. 9А). Видно, что ВА-присутствует не только во фракциях, пула 1, но и во фракциях, прилегающих к нему, в донных фракциях и во фракциях верхней части градиента, соотготствуывдп отчасти фракциям 2 пика ГА-активности. Часть НА сегментирует вместе с осяоеной массой вирионов и его распределение по фракциям совпадает с распределением ВА, а основное количество НА' находится в верхной части градиента, во фракциях пулов 2 и 3.

Сходное распределение антигенов вирусов ЯЗ и КЭ по фракциям ' градиента получено при использовании для детекции моноклоиальшх антител к белкам Ни NSI (Lee et al., 1989; Мавоп, 1989; Сгоокв et я1., 1990). Отличие состояло в том, что нами выявлен НА", седименти-

антигенов вируса КЗ.

Вируссодериащузо жидкость культур клеток ПЭС ультрацентрифуги— роЕали, осадок суспендировали и подвергали седиментации в 5-ЗОЖ градиенте концентрации сахарозы в пробиоках объемом 60 мл в~ роторе 3xS5 центрифуги NSB-fi5 при 22000 об/мин' в течение 4 часов. Фракции собирали со дна пробирки.

Надосадочную ¡жидкость после ультрацентрифугирования концентрировали ультрафильтрацией на фильтре PSJ1I, и хроматографаровали на колонке, заноженной с.ефакрилом s-400 (диаметр - г,5 см, №0018 -46 см). Для калибровки колонки использовали маркам: голубой дек-, стран 2000, фертагган (3», каталазу (К) и альбумин человека CIA), имеющие молекулярные массы 2000, 4Б0, 240 и 69 КД, соответственно.

Фракции вносили в лукки агарозных гелей, не содержащих 7-глобулина, выдерживали 4 часа при комнатной температуре и затем проводили иммуноэлектрофорез.

рупдий в положении вириояов. Отсутствие такого НА. е исследованиях упомянутых авторов объясняется тем, что в первом случае вирусные препараты получали в культура клеток 7ег&, в которой в ходе вируо-ноЕ инфекции не наблюдается разрушения клеток (Мавоп, 1989), а во втором - ь культуре клеток ПЭС на равякх стадиях инфекции (Lee et al., 1989; Crooks et al., 1990), когда вирусные препараты содержат, в основном, вирионные структуры пула 1.

Хроматографию препаратов структур вируса КЗ, которые осталгоь неосажденными после улътрацептрифутирования, проводили на различных носителях - сефарозе 6В, сефакрилах s-200r в-300 и S-400. Распределение меток по белку и РНК, а также 0D28q, не дает существенной информации о содержании ЗА и НА во фракциях, тогда как использование иклунозлектрохимических методов позволяет судить о распределении БА и НА по хроматографическкм фракциям. ВА, содержащийся в препаратах низкомолекулярных структур вируса КЭ, элюируется только во фракциях следующих за свободным объемом колонки (рис. 9Б, фракции 17-23). Небольшое количество НА элюируется с колонки вместе с ВА. Основное количество НА выходит с колонки позжэ, во фракциях 23-3',', -включая фракции, в которые элшруются белковые маркеры (фракции 32-38).' Элюция НА во все хроматографические фракции указывает на высокую степень гетерогенности НА по размерам.

Аналогичные данные о распределении антигенных структур вирусе КЭ при хроматографии■ были получены Сгоокв et al. (1990). Детекция KA вируса КЭ по белку NS1 показала широкое распределение _ НА по хроматографическим фракциям. Молекулярная масса НА вируса КЭ определена в 331 КД, что интерпретировано как существование НА в форме гексаморного образования бежа N31, переходящего в димерную структуру после воздействия ДСН.

2.4. Исследование состава вирионного и невирионного антигенов.

Изучение белкового состава НА проводилось по двум направлениям. Одно из направлений заключалось в электрофоретическом анализе полос преципитации, образуемых при иммуноэлектрофорезе. Ракетные полосы преципитации выявлялись в результате радиоавтографии высушенных агарозынх гелей. Области геля, содержащие ракетные полосы преципитаций, размачивались водой и переносились в лизирующий буфер Лэммли. Аналогичный метод применсп также для анализа белков антиге-лов Eirpyca герпеса (Norrild et al., 1985). Эффективность метода опробована нами при анализе ВА, различающихся по седимзнтациошюы и электрофоретическим свойствам. Показано, что неседиментиругацие

формы ВА не отличаются по оелковому составу от основной популяции вирионов: полосы преципитации содержат три структурных оелка 1ИЗ]. При анализе полосы преципитации, образуемой ВА в анодной части геля, показано, что этот ВА содержит вместо белка M белок р21-24 126]. Это указывает на то, что анодная популяция ВА представляет собой незрелые вирионы, на которых не прошел протеолиз предшественника бежа М.

Анализ полос преципитации, образуемых НА вируса КЭ, выявил, что основным белковым компонентом НА является белок US1, который' представлен не только димерной, но олигомарными формами более высокого порядка (рис. 10). Существенно, что значительная часть белка ' NS1 деградировала и присутствует в форме белков р26 и р24. Это хорошо видно при переводе мультшерных форм бежа HS1 в мономерную кипячением в течение Ь мин. По всей видимости, выявление нами в полосах преципитации, образуемых НА в РДПА, белка р20 [4] объясняется тем, что в этом случае_ процессы деградации белка NS1 резко усилены из-за активации действия сывороточных протеаз при инкубации агаровых гелей при 37°С.

Другое направление идентификации антигэнно активного белка НА состояло в изучении го/мунохимической активности белковых компонентов антигенных структур после обработки антигенных препаратов детергентами. В разделе 1.4. показано, что практически все вирус-

антигэнную активность после

Рис. 10. Электрофоретический

анализ белков из полос

преципитации, образуемых

антигенами вируса КЭ в '

РКЭФ [34].

Дорожка 1 - белки из полосы преципитации, образуемой ВА; на дорожках 2-8 представлены белки из полос преципитации, образуемых НА: в составе препарата разрушенных клеток, полученных в осадке в результате осветления вируссодержа-шей культуральной жидкости -дорокки 2,3, и в составе препаратов, полученных из над-осадочной жидкости осаждением 10% ПЭГ (дорокки 4,5) и ПЭГ в диапазоне 10-22% (дорожки 6,7). Дорожкам 1,3,5,7 соответствуют пробы, прогретцд! при 100 С в речение 5 мин.

специфические оэлки сохраняют свою

ргоо-*? w Iй*"' Р Ц

'Щ ■ ' I \

■К* I

Ш * Р» Ь- -IjdKSl

F -JTb

& Ï "Si NS1

^ - — р 26 1

_р2*

' ' " г ъ ч s б 7

воздействия детергентов. Хйжетпенаты клеток ПЭС, зараженных вирусом КЭ, обладают лымунохимичеокой активностью, присущей как ВД, так и НА. ВА, содержащийся в гомогвкатах клеток, сохранял свою иммуно-э лекгрофоретичэскую активность в присутствии 1% лаурклсахарозы, 1% тзина 45, 15» BriJ 58. При добавлении 1 % дигатонша и 1% тритона Х-100 ВА гомогенатов клеток терял прэципитируюшую активность. Воздействие детергентов не подавляет активность НА гомогенатов клеток. Следует отметить, что обработка гомогенатов клеток детергентами [28], как и в случае с прогреванием [4], повышает еыход НА, если судить по высоте и площади ракетных полис преципитации. Разрушение НА вируса КЭ как структуры и освобоззденке субъедкниц НА, активные ■центры которых в составе структуры были в значительной мере закрыты,' мокэт объяснять активацию НА вируса КЭ при прогревании и воздействии детергентов.

Исследование иммунохимической активности белковых компонентов препаратов ВА и НА после воздействия детергентов проводили с помощью иммуноссрбции - отделения из препаратов ВА к НА белков, связывающихся с полшиганалыпши антителами гипэрнммунного 7-глобулина, пришитыми на сефарозе, и анализом белков препаратов НА с помощью иммунсблота.

Известно, что обработка вирионов вируса КЭ неионными детергентами приводит к отделению белка Е от нуклеокапсида (Heinz, Kunz, 1981). Белок Е после удаления детергентов образует структуры в форме розеток. Иммунсэлектрохимические характеристики белка Е сходны с теми, которые обнаружены нами для вирионов: имеются как катодная, так и анодная субпопуляции [23]. Различие состояло в существенно меньшей, интенсивности ракетных полос преципитации, образуемых белком Е, что, вероятнее всего, обусловлено больней аффинностью вирионов. Эти данные свидетельствуют о том, что икмуно-электрофоретические. свойства ВА определяются белком Е. Нуклеокапсад не образовывал ракетных полос преципитации и не отделялся на пришитых к сефарозе антителах, тогда как клеточный аналог белка С -полипептид .р13, активно взаимодействовал с антителами, иммобилизованными на сефарозе [23, 29]. Это указывает на то, что белок С в составе нуклеокапсида обладает такой конформацией, которая не позволяет ему взаимодействовать с антителами.

Проведение иммуносорбции белков из препаратов НА вируса КЭ показало, что антитела отделяют из препаратов НА гетерогенный белок с молэхулярной массой 77-86 КД наряду с небольшим количеством белка N55 [28, 29]. Наличие белка р77-85 в элюатах наряду с присутствием

ряда белков, имевдих меньшую молекулярную массу, Онло интерпретировано как следствие протеолиза белка IIS5. В дальнейшем, исследование антигенной активности препаратов НА с помощью иммуноблота и сопоставления пептидных карт белков К35, N31, р77-85 и р24-2б показало, что гетерогенный белок р77-85 представляет собой не продукт деградации белка ES5, а является димерной формой бежа NS1 [34].

Гетерогенность, физико-химических характеристик НА вируса КЭ ' привела нас к заключению, что НА представляет собой не белок, а структуру, состоящую не только из белков, но и из небелковых компонентов. С целью проверки етого предположения были использованы различные радиоактивные метки и анализ в РЮФ НА, меченого тли." Выявление полос преципитации НА с помощью 14С-уридина, 14С-холина и различных углеводных меток свидетельствует о том, что в состав НА входят углеводы, липида и РНК. В совокупности, данные этого раздела свидетельствуют о связи гликопрогевда usi с мембранными структура- • ми, что отмечено для флаьнвируссв с помощью двухфазных систем и воздействия щелочных условий -'(Wir&lei» et al., 1989; Pan, Mason, 199P; Cauchi et al., 1991).

2.5. Злектронномикроскоютеский анализ антигенных структур.

Для морфологического анализа,-проводимого с помощью негативного контрастирования, использовали как сами вирусные препараты, так и материал, экстрагированный из полос преципитации . Электронномик- • роскопический анализ фракций пула 1 градиэнта концентрации сахарозы.. установил, что они содержат большое количество интактных вирионов диаметром 42-5 нм. Анализ материала, экстрагированного из анодиых и катодных полос преципитации, образуемых ВА в составе пула 1, выявил типичные вирионные структуры, покрытые иммуноглобулинами.

Фракции верхней части градиента концентрации сахарозы содержат, в основном, мелкие звездчатые структуры неправильной формы и слэдоЕые количества структур, сходных по морфологии -с нвтивными вирионами. В результате электрошюшшроскопического анализа препаратов полос преципитации, образуемых ВА фракций пулов 2 и 3, было выявлено, что эти катодные полосы преципитации, сливаюэдеся' с ракетными полосами преципитации ВА фракций пула 1 (см. рис. ЗА), образованы структурами, морфологически сходными с вирионами [14]. Существонно, что в препаратах полос преципитации, образуемых ВА, не выявлено кольцеобразных структур, сходных по морфологии с гипотетическим МСГА. При электронномикроскопичеоком анализе материала, элшровашгого из полос преципитации, образуемых НА, содержащимся в

пулах 2 и 3, выявлены крупные аггрегаты гранулярно-фибриллярных структур, которые, по всей видимости, образовались при взаимодействии антител с вышеупомянутыми звездчатыми структурами. Ореда этих аггрегатов обнаруживаются кольцеооразные частицы диаметром ъ-10 нм, имеющие в ряде случаев полость. Такие же частицы выявляются и при электронномикроскопическом изучении фракций, полученных после гель-фильтрации препаратов НА вируса КЗ (рис. 11). Полученные наш дан-

Рис. 11. Электронномккроскопические изооражчу^я структур из фракций, полученных после гельфкльтрацки препарата НА на колонке, заполненной свфакрилом S-400 [31 ].

ные о морфологии РЕА вируса КЗ тру дао, к сожалении, сопоставить с данными других авторов, поскольку исследователи, анализирующие антигенные структуры вируса кэ и приводящие сведения о высокой степени гетерогенности НА вируса, приводят морфологические наблюдения только относительно - вирионных структур, ограничиваясь рассуждениями о гекрамерной природе ЯД, как нативной структуры (lee et al., 1989; ОгооЗсз et al., 1990).

2.6. Оценка иммунологических свойств препаратов невириояного антигена

Защита против флзвивирусных инфекций обеспечивается вакцинацией либо живой, либо шактизированной вакциной (Stephenson, 1988). В результате вакцинации в организме продуцируются вируснеятрализунщие антитела, связывающие синтезируемые вирионы по антигенным детерминантам белка £ л таким образом обеспечивающие инактивацию инфекционных вирионоз при заражении людей. В то же время при определенных концентрациях антитела ^ против белка £ могут усиливать репродукцию флавивкрусов (Philipctts et al., 1985, 1987). Это обстоятельство стимулировало проведение ряда исследований по оценке возможной иммунологической значимости структуры флавивирусов, антигенная активность которой обеспечивается неструктурным белком HS1. Было показано, что моноклональные антитела к белку NS1 вирусов ЖЛ и денге-2 и сам белок ЫВ1 частично предохраняют обезьян и мышей от вирусной якфдкцш, причем моноклинальные антитела, не ооладащке способностью связывать комплемент, протективной активностью не

обладают (Sohlesln£er et al., 198b, 1S86, 1987; Gould et al., 1986; Henchal et al., 1983). Получэш данные, свждотельствушие, что ослабление флавивирусной инфекции обеспечивается присоединением антител к белку NS1. экспонированному на поверхности зараженных клеток, связыванием комплемента с образовавшимся иммунным комплексом и последующим лизисом клеток (Schlesinger et al., 1990). Отмеченная протективная активность белка NS1 - носителя антигенной ' активности IIA фдзвивирусов, к сожалению, не определена количественно методами, применяемыми для оценки флавивярусных вакцин. Сравнение протэктивяых свойств вакцинных образцов ВА и НА вируса КЗ привело к неоднозначным результатам. Одни авторы приводят данные," свидетельствующие о сопоставимости протэктивннх активностей НА и ВА вируса КЭ (Соколова и др., 1989), тогда как другие считают, что лишь ВА Ьбладвет протективными свойствами (Тимофеев и Др., 1987).

Поэтому нами предприняты исследования протективных . и иммуногенных свойств изученных препаратов антигенных структур - ВА и НА вируса КЭ, близких по своим свойствам к вакцинным образцам.

Препараты антигенов вируса КЗ получали из вируссодержащей жидкости клеток ПЭС с помошью осаждения при разных концентрациях ПЭГ и барьерного электрофореза (подробно о нем изложено в разделе 5.3), характеризовали на содержание антигенов, количество белка, шгактязировали формалином и определяли иммунологическую активность.

Исследуемые препараты вируса КЗ можно разделить по содержанию в них антигенов на три группы.

Препараты 1 группы, условно обозначенные вами как препараты БА/НА, содержат как ВА, так и НА. Они обладают инфекционной (см. табл. 1), :сошлементсвязызакщэй (титры 1:2 - 1:16) и темагглюгини-• ругацей (титры 1:16 - 1:1024) активностями и содержат суммарный белок в диапазоне 3-4 мг/мл. За исключением образца 4, который обладал невысокой инфекционной активностью, небольшой активностью в РГА (титр 1:2) и нэ был активен в РСК, препараты первой группы по-количеству и соотношению антигенов сходны с неконцентрированной нультуральноЯ каактивированной вакциной против КЭ, получаемой .в культурах ФЭК.

Большинство препаратов ЕА/ЫА обладали высокой протективной активностью. Низкая протективная активность препарата 4 привела нас к необходимости выяснения того, какие количества ВА но имеют протективных свойств. .Для этого были изучены препараты 2 группы, кото- рыв по своим характеристикам близки к очищенной, концентрированной вакцине против КЭ, получаемой на культурах ФЭК.

Таблица "! - Инфекционные и протектизныэ свойства препаратов вируса КЗ [35].

Группа и номер препарата Способ получения препаратов Количество антигенов по отношению к ИСХ0ЙН0М£1%) • А. ИА ПА**

ВА НА

1 Исходная вируссодержащая культуральная жидкость 100 100 н'.о. Б, 16

ВА/НА р 3 Осаждение 2'И% ПЭГ Соединение препаратов-Ъ и 10 _100_1' 16 "тоа..... 30 '"7748" 4,48 "4', ОСТ" 3,57

I 1 1 4 Анодная фракция препарата, полученного &% ПЗГ 0,5 15 3,21 0,94

! 1 I ! ВА 1 ! ! 5 Смесь катодных фракций препаратов, полученных 8® ПЭГ и в диапазоне 8-22» ПЭГ 16 0 3,23 3,77

6 -у- "а* Катодная фракция препарата, полученного 8$ ПЭГ 100 —то~ 0 —0—0— н.о. н7о. н.о." 7,34

1 9 Осаждение в диапазоне 10-205? ПЗГ и и.о. 3,33 1,91

\ ■ КА 10 Анодная фракция препарата, полученного в диапазоне 8-22Я ПЗГ 0 30 2,00 2,37

» 1 1 О ' ~гг! Осаждение ПЭГ в диапазоне 10-20:5 0 0 ~ *" 0 ТОО" 20 "" 4 Т200~ н.о." н7о. ■ ~Т70Т~ "2^05"

* - инфекционная активность (1к ы>цг/о,оз гс1) ** - протектввная активность: индекс резистентности Щ-п/т1) и.о.- не опродалялк 5и

Для получения препвоатов 9-13 использовали кадосадочну» кидкость после предварительного осаждения белковых структур из исходной вируссодер&оЕэй аидкости при рззикх концентрациях ПЭГ (8% или 10%).

Препараты 2-й группы - препараты ВА (5-8), содержат только ВА со следовыми количествами балластных белков, ГА-активность препаратов 5,6 составляла 1:16-1:32. Количество суммарного белка в образцах, используемых для определения лротективпсй активности, составляло манее ' мкг/мл. Отсутстеиэ примесных белков, по видимому, защищаидгас виру? от инактивации, в препаратах 1-й группы приводит к току, что инфекционная активность препаратов обычно невысока. Добавление к препарату 5 белковых примесей в виде препарата 10 приводит к существенному сохранению инфекционной активности (см. табл. 1, препарат 3).

Оценка защитных свойств препаратов 5-8 показала, что ВА является высонопротективным антигеном и что значительное снижение его количества приводит к резкому падению протективных свойств. Моино сделать вывод, что дальнейшее сникениэ количества ВА до уровня, который нэ детектируется в РИЭФ, обеспечивает отсутствие протективных свойств. Это существенно важно для оценки протективной активности препаратов НА вируса КЭ.

Для получения препаратов 3-й группы - препаратов НА (9-13), использовали повторное осаждение в диапазона 10-22$ ПЭГ после • предварительного осазадения антигенных структур 8% или 10$ ПЭГ. Отсутствие ВА в препарате 10 было обеспечено тем, что небольшое' количество ВА, которое не осадилось при добавлении 8% ПЭГ, было отделено от НА благодаря барьерному электрофорезу. Препараты НА нэ обладали ГА-активностыо и имели низкую инфекционную активность (1-3 lg id50/o,03 мл). Антигенная активность препаратов НА хорошо выявлялась в РКОФ. Количество белкэ в препаратах НА не превышало 2-3 мг/мл.

Исследования показали, что препараты НА имеют невысокую про-тективную активность (ИР равен 1,91-2,49). Протективная антивность. препарата 11 не была выявлена. Это может быть обусловлено высокой концентрацией балластных белков, которая маскирует протективную активность НА. Снияение концентрации балластных белков в препаратах 12-13 осуществлялось разведэнием препарата 11. что приводит к одновременному умельпенив количества НА. Несмотря на это препараты 12-13 обладают достоверной, хотя и небольшой, протективной активностью. Исследование препарата 13, составленного смешиванием препаратов ВА i-i НА, показало, что НА не усиливает протективной активности ВА вируса КЭ.

Поскольку препараты НА обладали следовой инфекционной активностью, нами предпринято исследование их иммуногенных свойств. Иммунизация кроликов нативншш препаратами НА приводила к продукции . антител как к ВА, так и к НА. Это указывает либо на то, 'что. количества ВА, не детектируемые с помощью РИЭФ, достаточно иммуяогенны, или на го, что остаточный инфекционный вирус вызывал у кроликов пнаппарантнуи инфекцию с образованием антител к ВА. Антитела к ВА синтезировались уже. после 1-2 иммунизация, тогда как продукция значительных количеств антител к НА осуществлялась только после ' полного курса иммунизации. Использование инактивированных формалином препаратов НА нэ приводило к существенной продукции антител я ВА дане после проведения полного курса иммунизации, тогда как уро-

вень антител к НА был сходен с полученным при. Егмунизации натавннда вирусными суспензиями. Эти данные свидетельствуют о существенно меньших иммуногэнных свойствах НА по сравнению с ВА и о том, что иммуногенная активность НА посла обработки формалином практически не теряется. Полученные данные оО иммуногеншх свойствах проясняют давнюю дискуссию о времени индукции у зсролкков преципитирующнх антител к вирусу КЭ (Ржахова, 1967; Рубин, 1972). По всей видимости, в первом случае речь шла о продукции антител к НА вируса КЭ, тогда как во втором - об образовании прецклитирухших антител к вирионам.

2.7. Заключение.

Проведенные исследования позволили получить новую информацию о свойствах антигенов флавивирусов. Выявлена электрофоретичеекая гетерогенность ВА вируса КЭ, его неоднородность по диффузионным свойствам и наличие части популяции ВА, обладающей другими седимен-тациошшми свойствами, нежели основная часть вирионов. Нами показано, что медленноседиментируший ЕА антигенно и морфологически идентичен вирионам и не имеет отношения it пончикообразным структурам флавивирусов, которые рассматривались как особое белковое образование, антнгенно близкое к вирионам, - МОГЛ. Наш получены данные, свидетельствующие о тем, что морфологически сходное образование вируса КЭ - кольцеобразная структура, диаметром 5-10 нм, обладает антигенной активностью, присущей НА вируса КЭ. Сходные по форме и размеру кольцеобразные частица выявлены при анализе прёпаратов пестивирусов, которые классификационно слизки к флавивирусам (Hitohie and Jernelius, 1958). На основании "того, что эти кольцеобразные структуры гостивирусоа не образовывали смешанных иммузшых комплексов с вирионамя, было высказано предполокзннз о связи таких частиц с "растворимым" антигеном пестивирусов.

В то не время следует учитывать, что основной структурное образование , выявляемое во фракциях, содержащих наибольшее количество НА, представляет собой'звездчатые структуры, которые при взаимодействии с антителами образуют бесформенные конгломераты. По всей видимости, НА, как антиген, существует в двух формах: кольцеобразные частиц, возможно, состоящих из мультпмерных форм белка nsi, п звездчатые образования, предзтавлящие собой мембранные структуры клеток с экспонированными на них вирусспецифкческими белкам:". Исследования, показывающие тесную связь белка NS1 с мембранами, нэ позволяют судить о структурной организации белка NS1 (Winkler et al., 1S85; Mason, 1989; Fan, Мавоп, 1990).

Полученную информацию необходимо учитывать яри разработке диагностических и вакцинных препаратов, В отношении диагностической ценности НА флавивирусов имеется довольно иного свидетельств большей специфичности НА, нежели ВА. Специфичность НА использована для дифференциации штаммов вируса ЗН (Лаврова, Гайдамович, 1975; Лаврова, Обухова, 1978). В токе время в пределах антигенных подгрупп НА не полностью отличают один вирус от другого. Было показано, что использование обработки сахарозо-ацетоновых антигенов мочевиной позволяет хорошо дифференцировать вирусы комплекса КЗ (Гайдамович и др., 1985). В то же время наши данные о различной чувствительности белков NS1 и KS5 к обработке мочевиной и показанная ранее высокая типоспецифичность бэлка NS5 вирусов антигенного комплекса ЯЭ-ЗН (Qureshi, Trent, 1973) могут рассматриваться как свидетельство того, что активность антигенных препаратов, используемых' в работах Деменева (1984) и Гайдамович и др., (1985) вероятно обеспечивается также и белком N35. Кроме того, один из апитопов белка Е не чувствителен к диссоциирующим воздействиям (Heinz et ai., 1983) и также может вносить определенный вклад в антигенную активность сахарозо-ацетоновых антигенов. Эти соображения приводят к необходимости использовать для дифференциации и типирования флавивирусов белка N51 и мсноклональкых антител к нему. Показано, что белок NS1 вируса денге-2 содеряогг 8 антигенных эпитопов (Henchal et al., 1987). Использование набора моноклоналъкых антител к белку usi вируса денге-2 показало, что большинство антител специфично для этого вируса (Faloonar, Young, 1991). Отмечено, что ряд антител реагирует с белком NS1 Бируса декге других типов, а некоторые реагируют с фяа-вивирусэми антигенной группы ЯЗ. Эти данные, наряду с нашили наблю- . дениями о специфичности НА вируса КЭ, свидетельствуют, что использование полиспецифичных антисывороток не может обеспечить полную-степень дифференцирования флавивирусоЕ внутри антигенных групп.

Вопрос о профилактической ценности НА флавивирусов остается • открытым. Из нашэй работы следует, что основным протективным•• агентом вируса КЗ являются вириош, тогда как НА вируса КЗ обладает существенно меньшей протективной активностью. В то же время следует учитывать особенности протективного воздействия НА. Возможно, что. способы оценки протективной активности вирконов не применимы для , изучения защитных свойств НА. Следует учитывать, что НА, как это показано наги, обладает меньшей иммуногенной способностью, чем влрионы. Поэтому курс вакцинации должен быть более длительным. Не исключено, чтс ввэдекие антител к НА в организм неяосредствездо

после заражения может иметь более существенное значение, чем предварительная иммунизация.

3. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА С ЧУБСШТЕЛЬКШ КЛЕТКАМИ

Вирус КЗ так же, как для болипикство флавивирусов, репродуцируется в клетках млекопитающих и беспозвоночных (Чунихин, Леонова, 1S85). Репродукция вируса КЭ в организме млекопитающих осуществляется в различных формах: в виде острого, хронического и персисти-рущего течения инфекции (Погодина и др., 1986).

Вирус КЭ размножается во многих культурах клеток млекопитающих. <Андаапаридзе, Богомолова, 1964; Левкович и др., 1967). Инфекция протекает в ряда культур с цитопагкческим действием, а в других -без повреждения клеток. Одни культуры продуцируют при репликации вируса КЭ гемагглютинины, а в других культурах значительное накопление инфекционного вируса не сопровождается образованием гемагглв-тининов.

3.1. Репродукция вируса клещевого энцефалита в культурах клеток млекопитающих,

• В связи с тем, что для понимания механизмов взаимоотношения вируса с различными клеткам;;, необходима всесторонняя характеристика структур вируса КЭ, наш проведено исследование как инфехционности, так и антигенного состава вирусспецифкческих структур при репродукции вируса КЭ в различных системах клеток млекопитающих.

Использовали перевиваемые клеточные культуры - линию клеток ПЭС, линию фибробластов сирийского хомяка ВНК-21, линию фибробластов китайского хомячка Ag17, линии почечных клеток эмбриона зеленой мартышки 6619, эмбриональных фибробластов человека КМ-1, фибробластов индийского оленя мунгкака Muntiacus mimt.iak (КОМ) и почечных клеток тасманийской сумчатой крысы Potorous tridaotylis (РТК), и первичную культуру КПЗ],!.

В-культурах клеток ПЭС, ВНК-21 и Agi7 вирусная инфекция характеризуется острым течением с выраженным цитопатогенным эффектом через 2-3 суток после заражения. В других культурах - РТК-1, КМ-1, КОМ, 6619 и КПЗМ. наблюдается хроническая 1Шфекция с сохранением монослоя клеток и длительной продукцией вируса (до 3 недель).

Титрование вируссодернащих жидкостей культур клеток показало, что ГА-активность не превышает Б 1об1/2р> а инфекционная активность варьирует в диапазоне 6-9 lgSOE/мл (табл. 2). Размеры бляшек

КУЛЬТУРА КЛЕТОК ГЕМАГГЖУГИ-НИРУЩАЯ , АКТИВНОСТЬ КНФЕКЦМ-ОННОСГЬ, lgBOE/мл

ПЭО 5 8,90*0,01

ВНК-21 5 8,84-0,05

Ag17 1 6,27*0,23

РТК-1 <1 6,11-0,14

КМ-1 1 7,78-0,07

КОН 3 • 0,04-0,16

6619 <1 7,33*0,11

КПЗМ ... 1-2 8,90-0,02

* - выражена в log1 ^р, где Р

максимальное двоичное разведение, ..вызывавшее гемагглютинвцию.

варьировали от 1 до 4 мм в диаметре. Сопоставление вели-Габл. 2. Характеристики' репродукции ,mH и инфекционной актив-вируса КЗ в культурах клеток [23]. ностэй вируссодержащих жидкостей культур клеток млекопитающих показало, что нет зависимости между этими параметрами. Отсутствие или наличие небольшой ГА-активности и низкая продукция инфекционных частиц. - около б ig БОЕ/'мл, отмечены в культурах Ag17 и РТК-1. Наличие высокой инфекционной активности вируса КЗ в клетках КМ-1 и КПЗМ сопровождается небольшой ГА-активностыо, тогда как в клетках ЛЭС и ВНК-21 отмечается как высокая ГА-активность, так и высокая инфек-.ционность вируса КЗ.

Существенным моментом является отсутствие зависимости ... между кнфекциошюстью и количеством ВА, которое оценивали по величина и радиоактивности ракетного преципитата (рис. 12). В культурах ПЭС и Ag17 при практически одинаковых количествах ВА уровни инфекцион ности значительно различаются - по меньшей мере на 3 порядка. Ин-фекционность поддерживающей среда клеток Agi7 и РТК-1 сопоставима, тогда как по количеству ЕА эти культуры различаются. В культурах РТК-1, 6619 и КОМ продуцируются приблизительно одинаковне количества ВА, тогда как инфекционность культуральной жидкости,- из которой выделены указанные антигены, колеблется от S до 8 lg BÇE/мл. Все э то позволяет предположить, что для каждой культуры клеток соотношение инфекционных и физических вирионных частиц различно. ;

Отмечено, что различие двух типов инфекции коррелирует с характером синтеза белков в зараженных клетках [33]. Острая вирусная инфекция сопровождается активным синтезом вирусспецифических белков непосредственно после латентного периода. Обычно синтез-клеточных белков несколько подавляется. Для хронической инфекций характерно отсутствие сколько-нибудь заметного подавления синтеза клеточных белков. Благодаря применению иммуносорбции показано, что

t г Ъ к 5 6 7

Препараты получали ультрацентрифугированием в рэямме 14x105 Культуры клеток: ■ 1 - ПЭС, 2 - БНК-21 , 3 - Agi7, 4 - РТК, 5 - КМ, 6 - КОМ, 7 - 6619.

вирусспецифические белки синтезируются в наибольших количествах спустя длительное время после заражения - 5-6 суток.

Следующим существенным моментом является различие синтеза антигенных структур вируса КЭ в зависимости от клеточных систем, в которых этот вирус размножается. ВА, синтезирующийся в культурах клеток млекопитающих, в которых развивается острая вирусная инфекция, электрофоретически гетероген, э именно, при электрофорезе в буфере Свендсена разделяется на анодную и катодную субполуляции. Катодная субпопуляция содоркит Оелки Е, С, М. Анодной субпопуляции ВА, синтез^фупцегося в клетках ПЭС и ЕШ-21, свойственен дефицит структурных белков С и M и наличие вкесто них белка р21-24 [26]. Часть вирионов, продуцируюдихся в клетках Ag17, неподвижна в электрическом поле. Вируссодеркещая зшдкость культур клеток, в которых осуществляется острая инфекция, содернит значительные количества вирионов, не седиментирунщих при ультрацентрпфугироваяии в реккме 14x106 g х мин. В тс 'ке время в клетках с хроническим течением инфекции - культуры КОМ, КМ-1. 6619 и КПЗЫ, популяция вирионов более однородна по елэктрофорэтичбским и седиментационным свойствам. ЕА представлен только катодной субпопуляцибй вирионов, а наличие неседиментирущего ВА отмечено только при продукции вируса в клетках КОМ. Вируссодержащая кидкость культур клеток млекопитающих, поддерживающих хроническую инфекцию, не содернит НА вируса КЭ, осаждающегося при ультрацентрифугировании.

Различия характеристик репродукции вируса КЭ яри острой и хронической инфекции, по ьсей видимости, объясняется разницей в синтезе белков. Ранний активный синтез вируссноцкфячзских белков в культурах клеток с острим течением инфекции приводит к быстрому нарушению :слп точного метаболизме', рэзрушениго меток и, как следствие, к неоднородности популяции виряоков и Iii вируса КЭ по физико-химическим свойствам.

3.2. Изменчивость вируса клещевого энцефалита при пассирогании через иксодовых клещей п мылких млекопитающих

Мммуноэлвктрофорегические исследования вируса КЭ выявили гете- . рогенность ВА по движению в электрическом поло - основная часть ВА' смещалась при электрофорезе в агарозных гелях к катоду- а меньшая -к анеду. Зти исследования были проведены на прототипном штамме Еируса КЭ Софьин, который образует крупные бляшки и обладает высокой периферической активностью. .Для клопа вируса КЭ, получившего после пассирования через клещей -мелкобляшечный фенотип, показано, что это изменение сопровождается изменения?,1¡а в величине и месторасположению образующегося в РИЭО преципитата ВА (Дживэнян и др., 1S83). Для выяснения возможных причин изменения фено- и генотппз-ческих свойств вируса КЗ наш было предпринято сопоставление имму-ноэлектрохимпчееккх свойств ЗА пята штаммов с изменениями биологических характеристик вируса после пассирования через клощей • и мелких млекопитающих 121j.

Штаммы УК—101, УК-1Й4, ПК-36 и ПК-183, выделенные из клещей, собранных в Удмурдской АССР а Приморском крае, до пассирования через клещей Hyaioima anatolioum обладали сходными свойствами - образовывали через 4-5 дней после заражения в культуре клеток ПЭС под эгьровьм потгрытием крупные бляшеи (4-6 мм в диамотре) и имели высокую периферическую активность (ИИ в пределах от 1 до 1,7 lg ED50 ). При размножении этих штаммов в культуре клеток ПЭС практически полная деструкция клеточного монослоя достигалась через 2 суток после инфекции, тлтры ийфзкщюнпости составляли 5*10® - 2"1С" БОЕ/кл, а тктры гемаггллтннинов - 1:64 - 1:256. При анализе в РИЭФ препаратор ВА этих штаммов, полученных из вируссодержащей жидкости культур клеток ПЗС, выявлялось обычное для вируса КЭ образование- полос' преципитации. Выявлено, что основная часть ВА смещается :< катоду, а . набольшая часть, которая быстро насыщается антителами;- к аноду (рис. IЗА). Таким образом, указанные штаммы аналогичны по своим -

Рис. 13. Анализ препаратов ВА штаммов

вируса КЗ в РИЭФ [25]. А, Б, - штаммы УК—101 и ПК-20; а, -штамм УК-101 после пассирования в клещах; О - штамм 1Ш-20 после пассирования в полевках. Препараты получены ультрацентрифугированием в режиме 14x1 С МЛН £хМИН.

биологическим и иммунохимическим характеристикам штамму Софыш.

Штамм ПК-20 отличается от других исследованных штаммов по ' составу ВА при сходном количестве инфекционных частиц и отсутствию ГА-активности в клетках ПЭС. Анализ в РИЭФ и ПИЭФ препаратов ¡¡¡.гамма ПК-20 выявил подавляющее преобладание анодного ВА (рис. 13, Б). Небольшое количество катодного ВА Есе кэ продуцируется в клетках ПЭС, поскольку при длительной радиоавтографаи гелей 1МЭФ препарата ВА штамма ПК-20, меченного ["Чз]-метионином, выявляется и катодная полоса преципитации ВА. Отличие качественного и количественного состава популяции ВА для штамма ПК-20 коррелирует с отличием птамма ПК-20 от других исследованных штаммов по другим свойствам. Так, . штамм ПК-20 обладает низкой периферической активностью (ИИ равен 5,6 ЬВ50) и способен образовывать в культуре клеток ПЭС только мелкие, точечные бляшки (менее 1 мм).

В результате пассирования через клещей Нуа1огпта апа-Ьо^оит, проводимого при 37°С штаммы .УК-101, УК-124, ПК-36 и ПК-183 после 11, 18, 15 и 20 пассакеЯ, соответственно, приобретают способность образовывать мелкие бляшки, которые как и Сляыхи штамма ПК-20, образуются на 2 дня позднее, чем крупные. В течение 2-3 пассажей крупные бляшки полностью замещаются мелкими. Этот процесс сопровождается снижением периферической активности штаммов - ИИ увеличивается до 5,2-6,0 Ы»5Г). При дальнейшем пассировашш штаммов УК-101, УК-124 и ЛК-35'в течение'10, 5 и 8 пассажей, соответственно, эти характеристики не изменяются. Пассированные через клещей штаммы вызывают более позднюю деструкцию меток - через 3-4 дня после инфекции, и сохраняют при размножении в клетках ПЭС высокую инфекционность (около 9 1§Б0Е/мл). ГА-активность при этом либо резко снижается (титр 1:2-1:4) для штамма ПК-183, либо пропадает совсем. Изменение свойств штаммов после пассирования чероз клещей сопровождается

изменением состава ВА - синтез катодного ВА подавляется, а синтез анодного ВА или остается на том хе уровне или изменяется незначительно. Таким образом, пассирование штаммов вируса КЭ через клещей приводит к изменению биологических характеристик, которое сопровождается изменением электрофоретических характеристик вирионов.

Реверсия всех исходных характеристик штаммов УК—101• УК-124, ПК-183 осуществляется при однократном пассировании через полевок. Из крови выделяется вирус, имеющий исходные характеристики ттяммов - высокую периферическую и ГА-активносги, способность образовывать крупные бляшки и синтезировать основную, катодную часть ВА. Пассирование через организм полевок штамма ПК-20 также приводит к изменения его свойств - Ш снижается до 2,0 л^ ы>50, приобретается крутюблятечный фенотип, ГА-активность достигает титров 1:4-1:8. Все эти признаки, по всей видимости, обусловлены приобретением штаммом ПК-20 способности синтезировать большие количества катодного ВА. Что касается изменения бляпючного фенотипа этих штаммов, то его интерпретировать труднее. Как известно, в основе титрования инфэкционности методом бляшек под агаровым покрытием лежит неспособность пораженных вирусом клеток окрашиваться нейтралы.::.' красным. Малый размер бляшек, более позднее их выявление, "ар/цду с более поздний развитием цитопатогекного эффекта в клетках ПЭС для штаммов с доминированием ансдаой компонента ВА, может свидетельствовать о замедленном развитии инфекционного процесса.

Таким образом, полученные данные позволяют судить о направленности селективного процесса в природных' популяциях вируса -КЗ: утрата или снижение патогезносто этого вируса для чувствительных животных происходит в результате очень длительного размножения в переносчиках - иксодовых нлецах, а для восстановления данной характеристики достаточно разового попадания в организм естественных хозяев - полевок.

3.3. Заключение.

Проведенные исследования по -изучению репродукции вируса КЗ в различных клеточных системах показали, что физико- и биохимические свойства вирусных структур зависят от вида клеточных культур. Это' обстоятельство необходимо учитывать при производстве вакцинных и диагностических препаратов, так как имеются свидетельства, что иммунологические свойства вирионов также варьируют в зависимости от клеточного субстрата (Эльберт и др., 1992).

Наша раоота свидетельствует о цэлзеоооразнссгк кннх, накеи клетки ФЭК, субстратов для производства вакцины против КЭ, которые осуществляют репродукции Епруса КЭ Сэз разрушения клеток. В качестве таких субстратов предложены первичные и перевиваемые клетки почек зеленых мартышек (Slbert et al., 1991; Грачев и др., 1985; Чумаков и др., 1Э91). Вируссодержацие суспензии, полученные из таких клеток, предложено применять в качестве вакцины без очистки от белковых примесей. Из навих данных следует, что такие клеточные субстраты хюодуцнруют вирионы значительно болбе гомогенные по физико-химическим свойствам, нежели клетки <КЖ. Это мскет указывать на то, что из таких препаратов существенно проще и с большим выходом можно получать очищенную вакцину по технологии, используемой для вирусных суспензий, полученных из клеток ФЭК (Kunz et al., 1930; Эльберт и др., 1985).

Другой аспект взаимодействия вируса КЭ с клетками касается изменений, происходящих с вирусом в результате его пребывания в организме членистоногих, в данном случае клещей. Изменение фено- и генотшшческих свойств вируса КЭ, полученное на примере штамма ЭК-323 -и его дериватов (Дкиванян и др., 1985), подтверждено наш при длительном пассировании в клещах ряда штаммов из Приморского края и Удмурдской АССР, что свидетельствует с закономерности изменений свойств вируса КЭ, происходящих при смене хозяина. Эти данные наряду с датами популяционного анализа ~гаммов из других регионов (БочкоЕа и др., 1990; Дживаняп и др, 1990) указывают на то, что благодаря пассированию вируса КЭ в юющзх в природе поддерживается существование штаммовых вариантов, обладающих сниженной патогек-ностью. Такие штаммы быстро - при периферическом заражении млекопитающих в течение одного пассажа, а при внутримозговом заражении в течение 2-3 лассакей (Даиванян и др., 1S83), восстанавливают харак-теристшш, присущие штаммам до пассирования в клещах.

Существование двух различающихся гю патогенным свойствам вариантов вируса КЭ может' быть необходимо для эффективной циркуляции вируса в природе "(Алексеев, 1996). Сохранение популяции вируса КЭ в мелких млекопитающих и клешах, а такка переход вируса от одного хозяйка к другому обеспечивается, по всей видимости, различием биологических характеристик штаммовых вариантов, например, по способности выхода вирионов из клеток млекопитающих, по характеру 'гликознлирования белков и по интерферирующим свойства?.! (Дживанян и др., 1991; Карганова, 1991).

4. ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Полученная информация об иммунохпмических свойствах антигенную структур вируса КЭ послужила основой для разработки методкк, которые могут быть использованы для практических целей.

4.1. Использование модификации встречного иммуноелектрофореза для диагностики клещевого энцефалита

Метод встречного иммуноелектрофореза (ВИЭФ) с успехом применяется для диагностики вирусного гепатита, аденовирусных л энтеро-вирусных инфекций (Вильяме и др., 1Э7Э; Залесский, 1982; Зоваков и др.. 1983). В ВИЭФ полоса преципитации образуется при взаимодействии антигена, двигающегося в электрическом поле к аноду, и антител, двигающихся под действием электроэндоосмоса к катоду.

В отличие от большинства других антигенов, при использованных условиях электрофоретического разделения ВА вируса КЭ движется к катоду. Поэтому была разработана модификация методики ВИЭФ, в которой ВА, двигающийся к катоду, образует видимую в проходящем света полосу преципитации с антителами, двигающимися к аноду [iо].

Для выявления антител в сыворотках больных людей методов ВИЭФ в реакции использовали 4 антигенных.единицы (АЕ) ВА вируса КЭ (-за одну аЕ принимали предельное разведение препарата ВА, при котором образовывалась видимая в проходящем свете полоса преципитации)• За величину тигра антител принимали предельное разведение сыворотки, при котором образовывалась видимая в проходящем свете под050 преципитации.

Сравнение результатов, полученных при исследовании 28 проб сывороток с помощью ВИЭФ и РДПА, показало, что метод ВИЭФ более чувствителен: в РИЭФ антитела были выявлены в 25 пробах сывороток, а в РДПА - только в 13. Преимуществом ВИЭФ является также быстрота реакции - полоса преципитации полностью образуется • уже через 2 часа, тогда как в РДПА это происходит в течение 2 суток.

Из 118 исследованных проб сывороток в ВИЭФ были положительными на наличие антител 85 (72%), а в РПГА - 109 (92%) сывороток. Из этих 118 проб сывороток в РСК было исследовано 108 проб сывороток, положительными на наличие антител оказалась 91 (84%) проба. .'Титры, выявляемые в сыворотках больных людей методом ВИЭФ, не превышали разведение 1:16, тогда как в РПГА они достигали 1:640, а р РСК -1 :256. Сравнение величин титров антител в РПГА и ВИЭФ и в РСК и ВИЭФ показало, что имеется соответствие между полученными резуль-

татами (коэффициенты коррэляции +0,65 и 40,61, соответственно).

Таким образам, использованная наш модификация ВИЗФ оказалась более чувствительной, для обнаружения вирусспецифических антител, чем РДПА, и менее чувствительной, чем РСК и РИГА. Эта методика проста в постановке, позволяет быстро получать результаты и не требует обработки сывороток перед исследованием. Метод ВИЭФ может быть применен для диагностики вируса КЭ в качестве дополнительного к РИГА и РСК.

4.2. Применение ракетного иммунозяектрофореза для анализа вирусных препаратов, инактивировандаг формалином

Исходный препарат вируса КЭ представлял собой инактивированную формалином вируосодержащую жидкость культуры ФЭК - полуфабрикат вакцины, полученный в объединении "яВирж>н" (Томск).

В предварительное опытах было установлено, что антигены инак-тквированного форма л жом вируса КЭ взаимодействуют с вирусспецифическими антителами гиперяммунного т-глобулина практически так зке, как и нативные вирусные антигены. Примесные антигены, содержащиеся в полуфабрикате вакцины, ке искажают картины выявления специфичных для антигенов вируса КЭ полос преципитации.

• Фракционирование полуфабриката вакцины против КЭ проводили с ■помощью улътрафилътрации и гель-хроматографии. Ультррфильтрацию проводили ьа мембранах УАМ-50 ("Владипор"). Сконцентрированный с помощью ультрафяльтрации полуфабрикат вакцины хроматографировали на колонках, заполненных модифицированным нолизшп'-лпирролидоном макропористым стеклом (производство Горьковскогс опытного завода ВНИШП) с диаметром пор 70 нм, в соответствии с технологией производства очишенной и концентрированной вакцины против КЭ, внедренной в ИПВЭ РАМН (Кгав11л1коу еЪ а1., 1935; Эльберт К др., 1985).

В ходе гель-хроматографии ультраконцентрат вакцины разделялся по оптической плотности на два пика: первый, небольшой пик следовал непосредственно за свободным объемом колонки, второй следовал за ним и был существенно больше. Полученные фракции были объединены в два пула (1 - фракции первого пика, 2 - фракции второго пика), существенно отличавшиеся по качественному и количественному составу вируеннх антигенов (рис. 14).

Исходный препарат, ультраконцентрат и пул 2 гельхроматографи-ческих фракций содержал ВА и НА в одинаковом соотношении (0,28, 0,30 и 0,31, соответственно), но в ультракокцентрате они были в

Рис.14. Анализ образцов вакцины в РМЭФ [30!.

1 - полуфабрикат;

2 - ультраконцентрат;

3, 4 - пулы 1 и 2 гель-хроматографических фрак-. циП ультраконцентрате; 5 - ультрафильтра!.

большей концентрации (примерно в 10 раз при сокращении объема полуфабриката вакцины в 20 раз). Количество ВА в ультраконцентрате составляло около^45Ж от исходного. Потери ВА, возможно, связаны с его сорбцией на мембранах, поскольку ВА в ультрафильтрате не выявлялся. Потери НА при ультрафилырации существенно меньше - в сумме ого количество в ультраконценграте и ультрафильтрате составляло около 80S от исходного. При гельгрсматографип не удалось полностью разделить ВА и НА. Пул 1 гельхроматографических фракций содеркал', по данным РИЗФ и РДПА, только ВА. Пул 2 содеркал оба антигена.

Таким образом, РМЭФ может быть применен для качественного и количественного анализа антигенного состава закщшных образцоЕ..и характеристики технологических процессов получения вакцины против КЭ.

4.3. Использование барьерного электрофореза для очистки препаратов вируса КЭ

На основании различий электрофоретического поведения при РИЭФ • БА и НА вируса КЭ была предпринята разработка препаративного разделения антигенных структур вируса КЭ при использовании элементов РИЭФ - агарсзы и буфера Свендсена. Сконструированное устройство, состоящее из камеры введения, камер накопления и электродных камер, подробно описано [27] я, в основных чертах, сходно с'устройством Van de 7/oude, Davies (1963). На рис. 15 представлен пример электрофоретического разделения в устройстве.

Препарат ВА, полученный ультрацентрифугированием, содержит около 2/3 ВА и 1/3 НА, имеющихся в исходной вируссодеряащей куль-туральной шдкости. Остальная часть ВА и НА присутствует в прэйа-

Ряс. 1Ь. Анализ в РИЭ£ анти-

■Л

а;6

генных препаратов вируса

КЭ до е после барьерного

электрофорэза [27]. 1,4- исходные препараты ВА и НД, полученные с помощью ультрацентрифугирования и последующей концентрацией с помощью ультрафильтрации;

2, 5 - препараты, получение г.з катодных ксмэр;

3, 6 - препараты, полученные из анодных камер.

рате, полученном с помощью ультгафильтраши. После Блзктрофореза происходит распределение антигенных структур по камерам устройства. В кагодных камерах содержится только ВА. Эффективность очистки подтверждается данными электронно-шкроскопического и. белкового анализа. В катодной камере после разделения препарата ВА содержится Сольное количество морфологически полноценных вирионов при отсугствш'1 примесей (суммарное количество белка не превышает 100 мкг/мл). Эти С5элкк представлены структурными белками при следовых количествах других белков. В анодкнх камерах после электрофореза препаратов ЗА и НА отмечается накопление НА. Пр^ электронно-макроскопическом анализе и анализе белков в ПААГ б образцах анодных камее не обнаружено вирионов и структурного белка Е при наличии значительных, количеств других белков - суммарное количество белка составляло около 800 мкг/мл. Разработанный способ разделения антигенных структур вируса КЭ обеспечивается применением буфера Свендсена, имеющего рН 8,8, ионную силу 0,08 и высокую буферную емкость, и агарозы с высоким показателем электроэндоосмоса (-0,33 лг). Поскольку больдкнотво белков и белковых структур имеют хкелую природу, они так псе, как и меньшая часть ВА вируса КЭ штамма Софь-ин, обладают в буфере Свендсена отрицательным зарядом и двинутся в

лзктрическом поле к аноду. Высокая степень элэктроэндоссмоса гзрозы создает движение буферного расгвора к катоду и сббспечиЕа-т накопление значительной части ВА штата Софьин в катодной камее. отсутствие в ней примесей, заряженных в буфере Свендсена так. то они ДЕИгаштся к аноду, определяет существенное достоинство пособэ - получение препаративных количеств чистого Ьк.

Другим достоинством улекгрофоретичаского разделения антигенных структур вируса КЭ является возможность получения в анодной амере НА, свободного от примеси ВА. Это достигается как примешаем ступенчатого получения препаратов НА, содержащих следоше оличества ВА, так и меньшей скоростью движения к аноду части ВА. оеледнее обеспечивается применением агарозннх мостиков, через ко-орые ВА, как более крупная структура, движется медленнее, чем НА.

4.4. Заключение.

Осуществление указанных разработок основано на особенностях лектрофоретического поведения антигенных структур вируса КЭ при одосранных электрсфоретических условиях: основное количество ВА еремещается при электрофорезе к катоду, а НА и клеточные примеси к аноду.

Разработанный нами метод ВИЭй>, к сожалению, уступает по увствительности стандартным серологическим методикам (РТГА и 'СК). Введение в медицинскую практику высокочувствительного ИФМ Караванов и др., 1990) существенно снижает возможности практические использование В1ГЭФ длп диагностики КЗ. В то же время' эта выработанная нами модификация ВИЭФ может быть применена для дчаг-сстики других флпвга^руеккх инфекций, для которых не разработано ммуноферментных систем, поскольку на примере вируса 8Н показано, :ю иммуноэлектрофоретическое поведение антигенов этого вируса жое же, как и у вируса КЭ (Ляпустш и др., 1983).

Использование иммунофэрментных м&тодое для контроля вирусных репаратов (Тимофеев и др.. 1987) также сужает возмокность исиоль-юзания метода РйЭФ. Тем не менее, не исключено, что этот метод ¡окет быть использован для характеристики технологических процес-:ов производства вакцины (ультрафильтрация и хроматография) и вотирования качества партий материалов, применяемых для этих грсцесоов, поскольку метод РИЭФ предоставляет возможность детекти-юеэть НА вируса КЭ.

В отношении аналитического микроустройства для барьерного

электрофореза мокно отметить, что опкт работы с им оудет полезен для разраоотки новых вариантов устройства, которые могут быть использованы в практике вакцинных производств.

В целом, материал, изложенный в этой глаЕе моешо рассматривав как иллюстрацию разраоотки практических методик, ' основываясь н;. свойствах конкретного Еирусного объекта.

ВЫВОДЫ

1. Проведено изучение синтеза и иммунохимических свойств вирусспецифических белков вируса КЭ.

а) Покрзано, что набор вирусспецифических белков вируса КЭ сходен е набором вирусспецифических белков других флавивирусов. Выявлены белки p93(NS5), рбЭ(КБЗ), р53(Е), p47(NS1), р21(ргеМ), р13(С), а также- белки р24, р23, р18 и р11. Показано, что время интенсивного синтеза вирусспецифических белков зависит от мнокест-Еенности инфекции. При высокой множественности белки интенсивно синтезируются через 8-14 часов, а при низкой - позже, через 14-23 часа после инфекции. Показано, что белок N33 частично существует в форме предшественника - бежа р79 (preNS3). Отмечена высокая степень гликозилирования белков Е, д"31 и ргек, а таккз небольшое включение углеводов в белки NS5, NS3 и preN33.

б) Проведено изучение трансляции РКК вируса КЭ в бесклеточных системах. Показано, что t п ut tro осуществляется эффективная трансляция 5'-концевой области генома флавивирусов, кодирующей последовательно структурные белки сие, и слабая экспрессия последующей области генома, кодирующей неструктурные белки. Показано, что предшественник структурных белков подвергается процессингу в ходе его синтеза при участии клеточных протеаз, ассоциированных с мембранами.

в) Показано, что неструктурные белки NS5 вирусов комплекса КЭ имеют одинаковую ЭФП.'ЭФП белков Jí£5 вируса Повассан и.ряда флавивирусов, принадлежащих к другим антигенным группам, сходна и немного ниже, чем у белка WS5 вирусов комплекса КЭ. Установлено, что белки р'гекзз обычно активно синтезируются в клетках, зараженных вирусами комплекса КЭ. ЭФП белков KS3 флавивирусов других антигенных груш и вируса Повассан варьирует в диапазоне величин, присущих белкам NS3 и ргеНБЗ вируса КЭ. На основании данных о подвижности вирусспецифических белков мокно говорить о том, что вирус Повассан входит в комплекс КЗ, но менее других вирусов связан с ним.

г) Показана высокая иммунохимичесхая активность белков МБ5, N53, 431 , Е и р13, из которых болтл: ТТ35 и вз1 не чувствительны к диссоциирующим воздействиям. ■

2. Проведено изучение антигенных структур зируса КЭ.

а) При репродукции вируса КЭ, ломгао вирионов, синтезируется НА, который представляет собой надаолокулярпуз структуру, связанную с мембранами и кардинально отличающуюся от вирионов по диффузионным» электрофоретическим и иммунохимическим свойствам.

б) Показано, что иммуноэлектрсфэретическив свойства вирионов определяются белком Е и что белок 0 в составе нуклеокапсида не • обладает икмунохимической активностью.-

в) Выявлено, что основными антигенэыми компонентами НА являются димерные ' и мульгимерные формы белка Н51, чясть которых деградирована.

г) В результате изучения характеристик осаяденля ВА и НА вируса КЭ с помощью ПЭГ, в 'также проведения седиментационного и хроматографического анализа препаратов вируса КЭ показано, что НА вируса КЭ обладает суаественпо более гетерогенными физико-химическими характеристиками, чем ВА. ■ .

д) Морфологически НА представляет собой мелкие, "звездчатые" структуры, оСразущиэ при взаимодействии "с анть'телами скопления агрегатов гранулярного характера, среда которых обнаруживаются кольцеобразные частицы, имеющие диаметр 5-10 нм и внутреннюю, полость. Это свидетельствует о том, что кольцеобразные структуры, отождествлявшиеся ранее с МСГА флавивируссь. антигенно сходны не с вирионами, а с НА, и являются одной из форм НА.

е) Показано, что НА вируса КЭ обладает естественно меньшими протехтивннми свойствами, чем ВА, и не оказывает усиливающего Еффекта на протбктпвную активность при добавлении к препаратам ВА.

3- ПроЕедено изучение особенностей взаимодействуя вируса КЭ с. клетками млекопитающих й клещей.

а) Показано, что острое и хроническое течение вирусной инфекции сопрсвондается различиями в физико-химических' свойствах вирионов и в соотношении их инфекционных и антигенных свойств.

б) Выявлена высокая степень изменчивости вируса ' КЭ при пассировании через иксодовых клещей и мелких млекопитающих, что может объясняться различием селективных свойств хозяйских систем.

4. Полученные результаты послужили основой для решений, ряда прикладных задач:

а) разработана модификация встречного тмуноэлектрофореза, которая может быть использоеенэ для диагностики КЭ.

ö) отработаны условия иммукоэлектрохимического анализа инакти-вированных формалином препаратов вируса КЗ, что позволяет проводить анализ антигенного состава образцов Еакцяны и характеризовать процессы концентрации и очистки вакцины с помощью иммуноэлектрофореза. .

в) разработан метод барьерного электрофореза, который позволяет получать из неочищенных препаратов ЕИруса КЭ чистые образцы вирионов и препарзты КА, освобожденные от примесей ВА вируса КЭ.

' БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарен руководству Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН (дхфектор - академик РАМН С.Г.Дроздов) за предоставленную возмокность провести исследование, результаты которого изложены в этом докладе.

Развитие работы проходило в обстановке благожелательной .критики и при постоянной поддеркке со стороны члена-корреспондента РАМН В.А.Лашкевича, в лаборатории которого проведены исследования и которому автор глубоко благодарен.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с сотрудниками ИПВЭ РАМН: В.И.Аголом, Е.Б.Андреевой, Т.С.Гркцун, Т.И.Дшванян, А.И.Жанковым, А.С.Каравановым, Г.Г.Карга-новой, М.Б.Королевым, В.М.Лисаком, А.Н.Мустэфяной, Г.И.Пивановой, И.А.РешьтникоЕЫМ, Ю.В.Свкткинш, С.Г.Соболевым, С.П.Чунихикым; МГУ: Т.Ю. Угаровой; ЛанНКИЭМ им. Пастера: Е.Д.Соколовой; ТомНИИВС: Н.Н,Киселевой, которым я глубоко олагодарек.

Выполнение экспериментальной частя работы было бы невозможно без помоли лаборантов Н.Ю.Емелиной, Л.Т.Карпенко, А.А.Симуниной и З.С.Тимофеевой, который я сердечно благодарен.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДОКЛАДА-

1. LyapuBtin V.N., Evitkin Y.V., Lashkevich V.A. Synthesis oi virus-specific proteins in tick-Ъоте enoephalitie virus-infected pig embryo kidney cells. Atta virol., 1930, v. 24, N 5, с. 305-ЭЮ.

2. Svitkin Y.7., Ugarova Т.У., Chcrnovskaya I.V., lyapustin V.N., Lashkevich-V.A., Agol V.l. Translation of tick-Ъотае encephalitis virus (Xlavivirus) in vitro: Synthesis of two structural polypeptides. - Virology, 1381, v. 110, p. 26-343. Лиоак 3.M., Королев М.Б., Ляпустик B.H., Лашкевич В.А.

Методические подходы к изучению структуры флавивирусов. - В кн.: Тез. докл. XII Всесоюзной кснф. по электронной микроскопии. М., "Наука", 1982, с. 290-291.

4. Ляпусиш В.Н., Жанков А.И., Дшванян Т.И., Лаиневич В.А. Характеристики низкомолекулярного невирионного ("растворимого") антигена вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., 1983, Js 2, с• 200-207•

5. JbmycTHF B.H., Лашкевич Б. А. Получение вирионного и низко-молэкул.чрного невириошого (''растворимого") антигена вируса клещевого энцефалита дробным осаждением полкэтиленгликолем. Вопр. Еиру-сол., 1983, №. 4, с. 122-124,

6. Ляпустин В.Н., Жанков А.И., Дкиванян Т.Н., Лашкевич В.А. Сравнительный анализ эхектрофоретической подвижности высокомолекулярных впрусспецифических белков флавивирусов. - Вопр. вирусов, 1984, .4 6, с. 740-743.

7. Svitkin Y.V.,' Lyapustin V.N., Laehkevioli V.A., Agol V.l. D.iífarenóos between translation product oí tiok-borne enoephalitie. vii-us RN¿ in oell-free oystems from Krebs-2 oells and. rabbit retioulo3yte3: involvement of membrane in the processing of nascent precursors cf flavivirus proteinB. - Virology, 19B4, v. 135, p. 536-541 .

8. Свиткин Ю.В., Ляпустин B.H., Лашкевич В.А., Агол B.H. Мемб-ран-зависимый процессинг насцентного предшественника структурных белков флавивируса (вирус клещевого энцефалита) , в бесклеточных системах. В кн.: Тез. докл. 16-ой конф. федерации Европейских биохимических обществ. М., 1984, V-003, р. 230.

9. Андреева Е.Б., Ливанова Г.П.,-Ляпуспи В.Hi, Караванов A.C., Лашкевич В.А., Неклюдова ß.M. Использование метода встречного имму-ноэлектрофореза для диагностики клещевого энцефалита. В кн.: Тез. докл. Всесоюзной конф. по природной очаговс-сти болезней. Тюмень-Ыоскьа, 1984. с. 7.

Ю.Лягустин В.Н., Андреева Е.В., Ливанова Г.П., Караванов A.C., Лашкевич 5.А. Еылзление антител к виряонному антигену вируса клещевого энцефалита в сыворотках больных людэй с помощью встречного имнулозлектрсфореза. - Вопр. вирусол., 1985, tö 1, с. 102-104.

11. Ляпустин В.К., Грицун Т.О., Решетников И.А., Чунихин С.П., Лашкевич В.А. Синтез вирусспецифических белков вирусов; клещевого энцефалита и Западный Нил. В ich.: "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", Тез. докл., М., 1985, с. 200-201.

12. Лисак В.М., Королев М.Б., Ляпустин В.Н., Грицун Т.О., Дщ-ванян Т.И., Лашкевич В.А. Электронномикроскопический анализ высокомолекулярных структур, особенностей строения и репродукции- вируса клещевого энцефалите. В кн.: "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", Тез. докл., М., 1985, с. 202-203.

13. Дкиванян Т.Н., Ляпустин В.Н., Жанков А.И., Лашкевич S.A. Сравнительное изучение вирусспецифических белков флавивирусов.

В кн.: "Актуальнее проблемы медицинской вирусологии", Тез. докл., И., 1985. С. 222-223.

14. Ляпустин В.Н., Лисак В.М., Грицун Т.О., Королев М.Б., Лаш-хевич В.А. Иммунохимический и электроЕЯомикроскошческий аналш высокомолекулярных структур вируса клэщезого энцефалита. Вопр. вирусол., 1985, Je 4, с." 419-427.

15. Lyapustin V.M., Svitkin Y.Y., lashievich V.A., Agol V.l. Л tentative model of iormation of structural proteins of tiok-borne er.oephalitis vii-uc (flavivirus). PEBS Letters, 1986a, v. 200, Je 2, p. -31 4-316.

-16. Ляпустин В.Н., Грщун Т.О., Лашневич В.А. Наструктурннй белок вируса клещевого энцефалита обладает преципитирувдей актив-гостью, 'характерной для невириснного ("растворимого") антигена. Вопр. вирусол., 1986, Je 3, С. 329-333.

. 17. Lyapustin V.N., Gritsun T.S., Labhkevioh V.A. Effeot oi the multiplicity of infeoticr. on eyntheeiB of the tiolc-borne enoe-phalitis virus-specified proteins during a single replicatior oyole. Aota virol., 1985, v. 30, N 4, с. 28Э-233.

18. Ляпустин B.H., Грицун Т.О., Каргаяова Г.Г., Лашкевич В.А. Пиванова Г.П., Караванов A.C. Пршенение кг.мунохимических методов для определения качественного и количественного состава специфичных для клещевого энцефалита препаратов антигенов и антител. В кн.: "Актуальные вопросы' производства жлмунобиологических препаратов,' Материалы мекинститутской научной конф., Томск, 1986, с. 24-24.

. 19. Грицун Т.О., Ляпустин В.Н., Лисэк B.W., Королев М.Б., Лашкевич. В.А. Седжентационная и электрофоретаческая гетерогенность вирионного антигена вируса клещевого энцефалита. В кн.: "Актуальные вопросы производства иммуноСиологичесзсих препаратов", Материалы мекинститутской.научной конф.. Томск, 1986, с. 63-64.

20. Свиткин D.B., Ляпустин В.Н., Лашкевич В.А., Агол В.И. Синтез и мембранзависимый процессинг предшественника структурных белков вируса клещевого энцефалита (флавиЕирус) в бесклеточшх системах. Молекулярная биология, 1986, 20, JS 5, с. 1251-1264.

21. Чунихин С.П., Решетников И.А., Ляпустин B.h. Изменчивость вируса клещевого энцефалита при пассировании через иксодовых клещей и мелких млекопитающих:. Мед. паразитол. и паразитарные болезни, 1986, J6 6, с. Б8-61 .

22. Ляпустин В.Н., Грицун Т.С., Лашкевич В-А. Характеристики осаждения антигенных структур вируса клещэвого внцефалита пож-

этиленглинолем и сульфатом аммояья. Еопр. влрусол., /937, Л 2, с. 188-195.

23. 1*рицун T.G., Ляпустин В.Н., Лиспк В.М., Королев М.Б., Лаиневич В.А. Элеитрофоретическая и седиментационная гетерогенность вирионного антигена вируса клещевого энцефалита. Вопр. в»гоусол., 1987, Ш 2, с. 196-204.

24. Ляпустин В.Н., Грицун Т.е., Лашкевич В.А. Глшсозилирован-няе и негллкозилированные белки вируса клещевого энцефалита, синтезирующиеся в перевиваемых клетках печки эмбриона свиньи. Вопр. Бирусол., 1987, 5 3, с. 337-342.

25. ЛяпустЕН В.Н., Чунихин С.П., Решетников М.А., Лашкевич В.А. . Изменения синтеза вирионного внткгена вируса клещевого энцефалита после пассирования через иксодовых клэщей и мелких, млекопитающих. Вопр. вирусол., 1987, Л 4, с. 451-456.

26. Ляпустин В.Н., Лашкевич В.А., Мустафяна А.Н., Решетников И.А., Чушшш (7.П. Зависимость синтеза вирионных структур вируса клещевого энцефалита от вида клеточных культур. Вопр. вирусол., 1Э37, Ä 6, 707-709.

27. Ляпустин В.Н., Карганова Г.Г., Соболев С.Г., Грицун Т.е. Препаративное разделение структур вируса клещевого энцефалита" с помощью электрофореза в годной фазе. Вопр. вирусол., 1938, Л 1, с. 93-102.

28. Грицун Т.О., Ляпустин В.Н., Карганова Г.Г"., Лашкевич В.А-Невириокный ("растворимый") антиген вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., 19Ü3, Л 2, с. 217-227.

29. Ляпустин В.Н., Карганова Г.Г , /¿устафина А.Н., Грицун Т.О., Латжввич З.А. Выявление вирусспецифичэских белкоя вируса клещеБого • энцефалита с покошью иммукосорбщш. Вопр. вирусол., 1988, й 4,

с. 448-452.

30. Соколова Е.Д., Киселева H.H., Роккева Л.В., Осипова Е.Г., Ляпустин В.Н., Лашкевич В.А. Изучение иммуногенности и антигенного ' состава фракций культуралькой вакцины против клещевого энцефалита, полученных методами ультрафильтрации, гель-хроматографии и ультрацентрифугирования. Б кн.: "Клещевой энцефалит", Сборник трудов ШЭДЭМ игл. Пастера, т. 65, Ленинград, 1989, с. 141-150. • .

31. Грицун Т.О., Лисах B.W., Ляпустин В.Н., Королев М.Б.,■ Лашкевич В.А. Мэдлвнноседимвнтирувдий гемагглютигош вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., 1989, Ja 4, с. 449-454.

32. Ляпустин В.Н., Грицун Т.О., Лашкевич В.А. Иммунохишчвский

анализ вирусспецифкческих белков и надмолекулярных структур вирус клещевого энцефалита. В кн.: "Арбовирусы и арбовкрусны» инфекции" Тез. докл., М., 1939, о. 20-21, р. 75-76.

33. Ляпустин В.П., Мустафияа А-Н., Лаппсевич В. А. Репродукци; вируса клещевого энцефалита в различных культурах клеток млеко-штающих и соматических гибридах. В кн.: "Современные проблем эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита" Тез. докл., Иркутск, 1990, с. 8-9.

34. Гршун Т.е., ляпустин В.Н., Шаталов А.Г., Лашкевич В.А, Ынокествэнныэ формы белке N31 как основного компонента невириопногс ("растворимого") антигена вируса клещевого энцефалита. Вопр. вируоол., 1990, № 6. с.471-474.

35- Ляпустин В.Н., Ливанова Г.П., Караванов A.C., Лазневич ВJ Сопоставление протективных свойств препаратов вирионного и невири-онного ("растворимого") антигенов вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., 1991, №6, с. 498-50Q.

Подписано к печати 23.03.93 г. Заказ M 269 . Тиран 80 екз. Институт полиомиелита и вирусных ьнцэфалитов Российской АМН.

Информация о работе

Ляпустин, Виктор Николаевич
доктора биологических наук
Москва, 1993
ВАК 03.00.06

Автореферат

Молекулярно-биологический и иммунологический анализ вирусспецифических белков и надмолекулярных структур вируса клещевого энцефалита - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы