Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение антигенной структуры альфавирусов при помощи моноклональных антител
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Изучение антигенной структуры альфавирусов при помощи моноклональных антител"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ. МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО
На правах рукописи
ЛОКТЕВ Валерий Борисович
изучение антигенной: структуры альфавирусов ■ ПРИ помощи моноклоналышх антител
Специальность 03.00.Об - вирусология;
... автореферат диссертаций на соискание ученой степени поктооа биологических наук-
МОСКВА - 1993 г.
Работа выполнена^ в ВНИИ молекулярной биологии, НЕЮ "Вектор'
-ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: • ■ член-корреспондент РАМН, профессор В. А. Лаикавич профессор, доктор биологических.наук A.A.Куц профессор, доктор биологических наук KL В. Козлов
ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: ■ Московский НИИ-вирусных препаратов
РАМН.
Защита состоится 1994 г. в ^ часов
на заседании специализированнбго' совета .'Д001,20. 01 при НИИ вирусологии им' Д.И.Ивановского Российской АМН,, по адресу: 123098, Москва, ул. К Ф. Гамалеи, 16.. ■ .
С диссертацией можно, ознакомиться .'в библиотеке НИИ вирусологии им.' Д. И.Ивановского Российской АМН. . .
* I л .. .
Автореферат разослан - 135^года.
Ученый секретарь-специализированного.
совета, кандидат медицинский наук. . . .' . -
старший научный сотрудник ' А. И Чуковский
- 1 -ЕВЕДНШЗ
йотуальносза проблем -Проблема изучения антигенной структуры.
картирования антигенных детерминант на уровне первичной последовательности вирусных белков имеет' особое, принципиальное значение з современной.вирусологии.' Именно с этими исследованиям;! связывается дальнейший прогресс в изучении противовирусного ш<уунитега и в создании ■ новых, более1 безопасных и более зффэктивннх яротЕзовя-русных вакцин.
Гибридомная- технология и уникальные свойства мояоклональнш: антител, в начале 80-х годов стимулировали- проведения исследований з этом направлении з отношении многих вирусов теплокровны:-:, патогенных для человека: Привлечение соврешвиых .•¿слэк.улярна-оио-логических и физкко-хиштееских методоз к этим исследованиям позволило получить целый комплекс нов?.::: Фундаментальных данных: о природе взакиодойстзяя антигена и антитела, о структуре и шуккцни .вирусных глнкопротеикоз, о механизмах формирования псотизсзк-руеного иммунитета, о структуре вирусных актягеш-ых детэр;дшант и их основных функциях. Волее того, мояво сказать, что на основе этих исследований появилось новее научное направление - "белкшаз ивиз'нерия",- занимаюеэяся ковструированизм аоЕ1К белковых молекул.
Сочетание зтнх" подходов с исследованием биологии коннрэтннл вирусов дало зоэшаяоегь симулировать ковка подходы к сзвер-Еенствовализ вакаан,' диагностических *.-:зтодсз- и открыло новые направления для дальнейших нсслздоваиггй патогенеза вирусных инфэг:-иий. Исследования з этой с-Здаети з отнесении зльфгзирусоз КиЭет принципиально валзюэ значение, так как многие альфавирусы зкооио-патогенны для человека и «нагин сельскохозяйственных • жавотшх. С другой стороны, алз£~зирусн двляются чрезвычайно удобная вирусными агента}.<и- длл проведения кзлекулярно-оиологичеекпе исследований. Они легко гсудьтгзируатся в лабораторных условиях на различных культурах клеток; получение яг биомассы не вкзквает затруднений, геном их относительно прссто устроен и они зызнзг-эт развитие инфекционного процесса у лабораторных ¿статных.
У альфазирусов выделяется' четыре антигенных кошлэкса: ютз-зекс Венесуэльского зкцефзложедита лошадей ! типичны! представ::-
тель - вирус ВЗЛ), кожлекс Восточного энцефаломиелита лошадей i вирус ВсЭЛ), комплекс Западного энцефаломиелита лошадей (вирус 3SJ5j . комплекс Леса Семашки. а такжз ряд неклассифицированных вирусов (V/esLavay et al. , 19S5: Львов, ISSSa). Исследованиям вирусов комплексов 'БЗЛ и Леса Семдлкй посвящено достаточно больное количество исследований. Значительно >,:енее подробные, а порой просто отрывочные кгсхгдозанкя проверены в отное»нии вирусов двух друтиз аиткгекних кокглехеоа альфавирусов. Это, по всей вероятности', соьнсняетсл более висекой иг патогенноетью, а следовательно кеооходаюстьв соблюдать определенные правила безопасной работы и шеть необходимые условия для нее (Recombinant DMA research: proposed aoLious under agudelines. , 1930). Недостаточность исследования вирусов ко;.£плекоов БЭЛ и ЕсЗЛ и послуиша основанием для проведения исследований антигенной структур»" и картированию антигенный дзтерыпаазт вирусов зх;::с дну:: комплексов. Полученные данные значительно дополнили на сегоднн;:;ний:декв информацию по 'биологии двух тшшшшх представителей антигенных -комп-лзксов ВЭЛ и ВсЭЛ.
tass зо^л>; ксспсгоиакиз. Приступал в 1С8-1 году к формировали::: коллекн.:н гиеридо;,:, езкроткруадкх ;.:зкоклонадьные asTKieza к вирусу изиеоуэхьажо онцзёзло;.;;;елнга гссадей и вирусу восточного знцзерйло'мзлпта хсгадоз, мы надеялись с покощью МКА изучить антигенную структуру типичных .представителей двух антигенный комплексов альфавпрусов, а также построить карты антигенной структуры двух поверхностнух газоэпротевзов Е1 и Е2 вирусов .ЮЛ . и 'ВсЭЛ. йзучзние свойств КйЛ дало бы -нам еозмсжость -вшвкть домены вирусных глшопротеиков, участвующих в реакции нейтрализации, во взаимодействии с рецепторами эритроците®,. и -вндущфугаазх развитие противовирусного иммунитета. С помощью анализа структуры геногла ¡¿сходнш вирусов и .антигенных мутантов, .устойчивых к действию кзйтрализуюцих и протект.ивныи- ISA, - ш надеялись- картировать районы reHOisi вируса, .формирующее и играющие главную роль в противовирусной. ййяузиггете. ото могло бы уточнить функции поверхностных ггикопротеинов -исследованных адьфавирусов, •. ...быивйть биологически Бакнь:э районы этих белпв, картировать их ..на геноме и - оценить Бозшйаоеть создания противовирусных субьединичнш -вакцин.
Ерододлгая работу в этом направлении,,мы;дополнили проводимые-
исследования рядом новых моментов, которые прямо не вытекали из первоначально спланированных целей -исследования. Так логик» работы заставила формализовать и выделить в отдельное направление работы по формированию коллекции гибридных клеточных линий с изучением их основных свойств как собственно культур клеток. Синтез пептидов и исследование взаимодействия антител е ниши дало нсвте информацию об топологии антигенных- детерминант. Было изучено вза-шодействке МВД с некоторыми фрагментами белка Е2. полученными генно-ижознернкм- способом. Проведено сравнительное исследование антигенной" структуры-вакцинных • и вирулентных стазов зирусов ЗЭЛ и -ВсЭЛ, что дало - достаточно много новой информации о всзмсшшс механизмах аттенуации и антигенных..отличиях, наблюдаемых у вакцинных. штаммов вирусов ВЭЛ и ВсЭЛ. Выявленный антигенный перекрест мезду вирусами БЭЛ-и ВсЭЛ, относящихся к различным антигенным комплексам альфавирусоз, заставил более подробно изучить антигенные взаимоотношения этих комплексов. Подобная .те работа была проведена и по отношению к другому выявленному антигенному перекресту между альфа и-флавивирусаки. ■ Выявление трех сайтоз ка гп-копротеине Е2, участвующих в.РТГА, сформулировало новое направление в наших исследованиях и позволило выявить и предварительно картировать К-район альфавирусоз.
Научная исзгаза. • В-результате проделанной работы создан банк - гибридом НПО" "Вектор" в котором депонированы гибридом к следующим- вирусам, и антигенам: 32 тибридомы к вирусу венесуэльского •энцефаломиелита лошадей, 34 гибридомы к вирусу восточного энцефаломиелита локадей, 15 гибридом к вирусу клешево-го энцефалита, 7 гибридом-к белку р24 вируса иммунодефицита человека 1 типа, 5 гибридом к ортопоксвирусам, 5' крысиных гибридом к вирусу полиомиелита- 2 типа, 3 крысиных гибридом к вирусу гепатита В, 11 мышиных-гибридом к шести-различным формам цитсхрома Р-А50. Проведено депонирование.во-Всесоюзной коллекции культур клеток м гибридных клеточных линий,, а на шесть клеточных- линий получены авторские, свидетельства.
Впервые, с помощью моноклональных антител к гликопротеину 21 вируса ВЭЛ, изучена антигенная структура данного белка и показана схожсть антигенной структуры трех аташов: Тринидад, ТС-83 и "30 вируса ЗЭЛ. Предло.тена карта антигенной структура гликопвстениа
Е1,. включающая в себя 5 сайтов, объединяющих" 8 .-эпигонов связывания ША. Сайт Е1-1 обеспечивает-индукцию-протективнья:антител и тем самым активно участвует в формировании противовирусного-иммунитета и совместно с элитопами сайтов Е1-3 и Е1-5 обеспечивает антигенный перекрест вируса ВЭЛ и ВсЭЛ. .. Причем эпитопы Е1-5а,Ь,с антигенно схожи с детерминантами белка Е вируса КЭ.
Ка гликопротеине Е вируса КЭ обнаружено,не менее двух групп перекрестна реагирующих эпитопов, ..один из которых обеспечивает перекрестные реакши внутри серокомплекса вируса КЗ, а другой месту альфа и флавивирусами. Сопоставление первичных последовательностей вирусов ВЭЛ, ВсЭЛ и КЭ показало,, что тройной:перекрест может допустить для вируса КЭ только одна непрерывная последовательность от 164 до.204 аминокислотного остатка белка Е.. Это поз--воляет высказать предположение, что данный район белка Е вируса отвечает, за впервые выявленный■антигенный перекрест между альфа и флавивирусами. Для альфавирусов данный район распадается на два дискретных-района 198 - 222 а. о. и 285 - '297 а. -о. белка Е1 вируса БЭЛ. - ,
Получена наиболее полная, .из известных на настоящее время, коллекция гибридом, - секретирующих ША к гликопротеину Е2 вируса ВЭЛ. В нее включено 24 гибридомы'мышиного и крысиного происховде-: ния. Изучена антигенная структура белка'ЕЕ. Предложена карта антигенной структуры гликопротеина Е2, .включающая в себя 6-сайтов, сбьединятаих 21 злктоп связывания'МКА. 'Эпитопы сайтов Е2-2 и Е2-6 связаны с нейтрализацией .вируса" ВЭЛ и совместно с -эпитопами сайта Е?-3 вовлечены в. реакцию торможения гешгглютинации. . Ж4 к остальным сайтам белка Е2 не проявляют биологической .- активности. Показана принципиально-важная роль гликопротеина-Е2 в Армировании противовирусяого'кммуннтета. - Впервые-выявлено 13 эпитопов, индуцирующих синтез протективных -антител и тем самым непосредственно участвующих в-формировании-противовирусного иммунитета Один из них локализован на белке Е1, а остальные 12 на гли-копротеине Е2 вируса ВЭЛ.
Впервые создана коллекция гибридом, -.-синтезирующих' шкокло-нальные антитела к структурным белкам.вируса восточного знцефало-ииелита .лошадей. Коллекция состоит .из 16--мышиных и 24 крысиных гибридом. Исследована функциональная нагруженность,, вирусных гли-
копротеинов. Нейтрализующие,- тормозящие гемагглютинацию и протек-тивные-антитела индуцяруктзя антигенными детерминантами большего поверхностного"гликопротеина Е2.. Создана классификация антигенных сайтов-и эпитопов,. построены карты антигенной структуры поверхностных гликопротеинов вируса ВсЭЛ. На гликопротеине Е1 картировано. 4 неперекрывающихся антигенных сайта. На гликопротеине Е2 картировано 7 частично перекрываюпдахся антигенных сайтов, 4 из которых, индуцируют МКА, ■ активные-.в биологических-реакциях. Эти 4 сайта расположены, в виде единой структуры, частично перекрывающийся структуры, на поверхности гликопротеина-Е2.
Впервые- обнаружены - значительные антигенные изменения гликопротеина- Е2 штамма ТС-83 и штамма- 230. Данные изменения касаются только эпитопов,■ индуцирующих синтез .протективных антител. Из 13 идентифицированных эпитопов, которые ответственны за формирование-протективных- моноклональных.антител, у штамма ТС-83-изменено три, а у 230 штамма -'-шесть эпитопов в составе 2 сайтоз. Полученные результаты говорят о необходимости дальнейшего совершенствования имеющихся, вакцинных препаратов против этого опасного инфекционного заболевания.
С помошвю-панели из 17 моноклональных антител, блокирующих реакцию- гемагглютинации, изучена рецепторная область вируса БЭЛ и ВсЭЛ,. обеспечивающая-взаимодействие в.ирионоз с клеткой. Показана доминирующая роль- гликопротеина Е2 вируса ВЭЛ и ВсЭЛ в-формировании- вирусного рецептора; взаимодействующего с мембраной эритроцита.. В этой области, с помощью конкурентного радиоиммуноакалкза, выделено-3.антигенных сайта. ' Эти сайты, а случае вируса 53Л, участвуют в реакциях, вируснейтралязапда и моноклональнка антитела к этим-районам защищают беспородных: белых шяей'от-летальной инфекции.
На белке Е2 вирусов ВсЭЛ и ВЭЛ впервые обнаруясен и предварительно картирован консервативный район (К-район), формирующий пе-рекрестнореагирующие антитела, тормозящие гемаггдюгшгашпо у ти-.пичных. представителей четырех антигенных комплексов альфавируссэ, таких как: вирусы западного энцефаломиелита-лошадей, Леса Семли-ки, Синдбис, Гета, Аура, Чикунгуяья. Пиксуна. Путем ееквенирова-ния. гена белка.Е2 антигенных вариантов, избегающих протектизногс действия МКА к К-району, показано участие аминокислотных остатков
59 и 232 е формировании К-района, что говорит о формировании сайга Е2-3 дзумя различными участками полипептидной цепи бежа Е2.
С покопхью нейтрализующих и цротективных МКА-получена коллекция иг 13 антигенных вариантов вируса БЭЛ и 2 АВ вируса ЕсЭЛ, резистентных к действию этих МКА. Использование селекции m vivo позволило картировать расположение зпитопов, связанных с синтезов лротективнш антител. Секвенирование генов белков этих вариантов локализовало для вируса ВЭЛ три сайта белка Е2 - (57-60 а. о., 232 а.о. , 162-216 а.о.) и один сайт на белке El (206 а.о.). Два из трех районов на белке Е2 связаны с процессом нейтрализации инфек-ционности вируса ВЭЛ Для вируса ВсЭЛ картировано два сайта на белке Е2, вовлеченных в реакцию нейтрализации вирусной инфекцион-кости. С этим процессом оказались связаны- аыыокиелотные остатки-72 и 116 (сайт Е2-2) и 272 (сайт Е2-3).
Лля более детального картирования двух наиболее 'интересных сайтов вируса БЭЛ - сайтов Е2-2 и Е2-6, ответственных за формирование протектквных, вируснейтрализующих и блокирующих гемагглети-езцию антител, были синтезированы 9 пептидов. Последовательность Z7íix пептидов ступенчато перекрывала районы 30-75 1 аминокислотных остатков (а. о.) и 202-250 а. о. белка Е2 вируса ВЭЛ, в которых были картированы антигенные мутации, вызываемые МКА к сайтам Е2-2 и ES-6. Ей один из синтезированных пептидов не взаимодействовал в иммуксферментном анализе с панелью из 17-МКА к белку Е2 вируса 53.1 Одкато большинство пептидов взаимодействовали с полкклональ-кой антивирусной сывороткой, -а два из них-индуцировали появление -антивирусных антител. Сайт Е2-2, по всей вероятности, связан с аминокислотными остатками 30-45, а район 57-62 а. о. белка Е2, в котором наблюдаются антигенные мутации,' не-является антигенной детерминантой линейного типа, а-участвует в формировании антигенных детерминант информационного /типа. Картирование района 202-250 а о. показало, что в этом .районе все пептиды хорошо распознается антивирусной поликлональной - сызороткой.
Впервые показано, что аминокислотные остатки 235-240 гдикоп- . ротеина Е2 формируют линейный эпитоц, обеспечивающий перекрест между вирусами ВЭЛ и ВсЭЛ, и не распознаются 19 видах® перекрестно-реагирующих с вирусами ВЭЛ и ВсЭЛ монрклонадьных.^.антител.
1§ийгете£нсзя.'-^нач«шэ-1з реажаацкя -рззульхахоз ксследазгшкй.
Результаты работы по изучению антигенной структуры вирусов ЕЭЛ и ' ВЬ'ЗЛ, типичных- представителей двух антигенных комплексов альфави-русов, представляют собой законченный цикл исследований, позволивший- авторам -предложить новую классификацию антигексй структуры ' этих вирусов и уточнивших функции вирусных гликспротэияоз з процессе- форшрования противовирусного иммунитета.
Коллекция гибридом имеет' значение, ;сак методическая база и основа для'-проведения иммунологических исследований вирусных антигенов. Возможность неограниченного длительного хранения данной коллекции позволяет утверждать, что мы имеем большую коллекцию реферэнс препаратов етраззвгкх антигенный профиль суазстзуяетс сегодня вирусных штаммов. Это позволит з будущем оценивать антигенную изменчивость вирусов з процесса их эволюции.
Полученная коллекция гибридом к различны« вирусным антигенам используется для получения манскдокаяькых антител, которые пгнме-няюгся для разработки' новых лиагясстячгсггях систем для знруеа ЗЭЛ и ЕсЗЛ, на основе которых в НПО "Вектор" выпускаются кс.чгэпчэскцэ тест 'системы для-вируса клйквого знпе^алгта и белка ?2С. Ионсклональныэ антитела к вирусным антигенам, представленные з работе, выпускаются как самостоятельные препараты, пмеютиэ коммерческое значение. Вольпглнотво из нп:: включено в каталог пзодг<г~ цип -НПО "Взктср", производится и зыпус:зется »агют еертя!.™ для использования з лзборатсрявг исследования.':.
--г^гсс;";? з-г^-ггг. Коллегия гт-т^г'ггс1! ссстояг^г! из 32 гибридом зирусу венесуэльского гкцг*8ЛО!с:ад:ггз догалеи. 34 гаЗрадоы к вирусу достойного зкцесалсми^лнтз. легален. :5 рИДСМ к зирусу КГ53535Г0 ЗНЦ5уЗЛИТ3,' 7 ГНбГЛДОМ к бел:Г' ~24 вируса ::\е;угга дефицита чзлзггка 1 типа , 5 пЛрхгдсм к сргзлсксзи-руеам, £ кр^сллы;: гпбрядсм к вирусу пал!:0"_т,ел:™а 2 тгтга,. 3 крксг-ных гибридом к вирусу гепатита В. 11 мыл::?»:: пйркзем к «гсг" различным фермам иитсхромз Р-4ЕС.
Данные пэ антигенной структур? гхикопротеяка 31 у тзех тг-ч-«ов: Тринидад, ТС-83 и 230 вируса 'ВЭЛ. Карту антигенной стргктузы глиг.зпротоипа 31, вкдючакиун з себя 5 сайтоз, сСьядиняюза: 3 тспоз связывания }<КА.
Данные по изучению антигенной структуры глихопротеияа Е2 вл-руса ВЭЛ. Карту антигенной структуры гликеппетеняа £2. В!сж-гах2г!я
в себя 6 сайтов, объединяющих 20 эпитопов связьшания МКА, причем зпитопы сайтов Е2-2 и Е2-6 связаны с нейтрализацией вируса ВЭЛ и совместно с эпитопами сайта Е2-3 вовлечены в реакцию торможения гемагглютинации.
Принципиально важная роль гликопротеина - Е2 в формировании противовирусного иммунитета. Выявление 13 апитопов, индуцирующих синтез протективных антител и тем самым непосредственно участвующих в формировании противовирусного иммунитета. Один из них локализован на белке Е1, а остальные 12 на гликопротеине■Е2 вируса ВЭЛ
Созданную классификацию антигенных сайтов и. эпитопов,, карты антигенной структуры поверхностных гликопротеинов вируса ВсЭЛ. Картирование на гликопротеине Е1 4 неперекрывающихся антигенных -сайта, а на гликопротеине'Е2 - 7 частично перекрывающихся антигенных сайтов, 4 из которых-индуцируют ШТ, активные в биологических реакциях. Эти 4 сайта расположены в-виде единой структуры, частично перекрывающийся структуры,'на поверхности гликопротеина Е2, причем нейтрализующие, тормозящие гемагглютинации и протек-тивные антитела индуцируются антигенными детерминантами большего -поверхностного гликопротеина Е2.
Обнаруженные значительные антигенные изменения гликопротеина Е2 штамма ТС-83 и особенно штамма 230. Данные изменения касаются только эпитопов, . индуцирующих синтез протективных антител. Из 13 идентифицированных эпитопов, которые ответственны за формирование протективных моноклональных антител, у стажа ТС-ВЗ изменено три,' а у 230 штамма - шесть эпитопов в составе 2 сайтов.
Доминирующая роль гликопротеина Е2 вируса ВЭЛ'и ВсЭЛ в формировании вирусного рецептора, взаимодействующего с мембраной эритроцита, и включающего в себя не менее 3 антигенных сайтов. Наличие на белке Е2 вирусов ВсЭЛ и ЕЗЛ консервативного участка (К-района), формируипего-перекрестнореагирующие антитела, тормозящие гемагглвгинацию у типичных представителей четырех антигенных комплексов альфавирусов, таких как: вирусы западного энцефаломиелита лошадей, Леса Семлики, Синдбис, Гета, Аура, Чикунгунья, Шксуна. Участие аминокислотных остатков 59 и 232 в формировании К-ргйона.
Получение 13 антигенных вариантов вируса ВЭЛ и 2 АВ вируса
ВсЭЛ, резистентны? к нейтрализующему или протективному действию этих ША. Локализацию для вируса ВЭЛ трех сайтов бежа Е2 (57-60 6LO., 232 а. о., 182-216 а. о.)' и одного на белке Е1(20б а. о.}. Взаимосвязь двух из трех этих районов на белке Е2 с процессом нейтрализации- инфекционности вируса ВЭЛ. Картирование двух сайтоз на белке Е2 вируса ВсЭЛ, вовлеченных в реакцию нейтрализации вирусной инфекционности- и связанных с аминокислотными остатками 72 И 116 (сайт Е2-2) и 272 (сайт Е2-3).
Данные- о том, что аминокислотные остатки 235-240 гликопроте-ина Е2 формируют линейный эпитоп, обеспечивающий-перекрест между вирусами ВЭЛ и ВсЭЛ.
Агфсбацяа- работы. ■ Основные материалы диссертации были представлены или доложены на следующих конференциях, симпозиумах: "Генная и- клеточная инженерия в решении. фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1989); "Arboviruses and srboviral infections" (Moscow, - 1989); "Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита" (Иркутск, 1990); "Молекулярная-биология и медицина" (Ленинград, 1990); "Современные направления создания медицинских диагкостикумоз" (Москва,
1990); "Актуальные проблемы биотехнологии" (Кодьцово, 1990); Вторая 'всесоюзная конференция "Геном человека - 91" (Москва, 1991); "Medical.Biotechnology, Immunization and AIDS", International conference (Leningrad, 1993); "Арбовирусы и арбовируеные инфекции", Всесоюзный научный симпозиум (Яытгашо, 1931); "International Conference on Molecular biology- aspects cf diagnostics and therapy of AIDS" (Novosibirsk, Akadorrgorcdck,
1991); "International Symposium of structure and function of regulatory polypeptides" (Kfoskow, 1992); "VIII - International Conference . on AIDS/I 11 STD World congress" (Amsterdam, 1S821; "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООЛ" (Волгоград,
1992); "Клиническая и экспериментальная фармакология. Новые материалы и методы в медицине" 'Международная - конференция студентов и молодых ученых (Киев, 1992); Вторая всесоюзная конференция "Генная и клеточная иняэнерия" (Москва,- 1992); IXth International Congress cf.Virology (Glasgow,1993).
В завершенном виде работа была, доложена на заседании вирусологического семинара НИИ молекулярной биологии 9 июня 1953 года.
- ■ - 1С - ~
Основные экспериментальные результаты, представленные .в диссертации, получены в соавторстве с-II А.- Разумовым, Е. В. .Агаповым и А. В. Перебоевым, у которых автор являлся руководителем диссертационных работ. На разных этапах ее выполнения в-ней принимали участие: сотрудники института вирусологии , им. Д. И. Ивановского FAMH - к. м. к. Л. А. Лаврова (разделы 4, 7); к.м. н. Е. Э. Мельникова (разделы 4, 7); проф., д. м. к., заслуженным деятелем науки России, С. Я. Гайдамович (разделы 4, 7); сотрудники НПО "Вектор" - Е. Е. Протопопова (разделы 3, 4, 6); С. Д. Лебедева (разделы 8); RA. Святченко (разделы 5, 8, 9); к. б. н. 1Е Фролов (разделы 7, 8); к. б. н. A.A. Колыхалов (разделы 7, 8); к. б. н. ЕЕ. Волчков (раздел 8); д. б. н. С. К НетесоЕ (разделы 7, 8); к. м. н. А. Д. Хуоаинова (разделы 4, 7); А. К Сабиров (раздел 9); к.х. н. 5. Е. Самуков (раздел 9); Е. Е. Коновалов (раздел 3); k.M. н. А. Г. Покровский (раздел 3); к. С. н. A.A. Ильичевым (раздел 9); к. б. к.
3. ifeKcurcB (passe« 9); к. б. н. А. К. Закабунин (раздел 9), а тскжс другие соавторы, ссылки на которых даны в тексте диссертационной работы при списании конкретных результатов исследований.
• Цу&Еззщк!. По материалам диссертации опубликовано 38 работ в отечественной и зарубежной печати, • включая, 2 авторских свидетельства на изобретение.
РХ^ЗУамТЛТЕ!
ЕкггЕгекак.
В результате проделанной работы была получена коллекция гибридом, секретиругацих моноклональные антитела к вирусным антигенам. Эти гибридомы были депонированны в созданном Банке гибридом НПО "Вектор". В эту коллекцию воали 32 гибридомы к вирусу ВЗЛ, в том числе 23 крысиных и 9 мышиных гибридом; 34 гибридомы .к-вирусу ВоЭЛ, в том числе 17 крысиных и 37 мышиных гибридом; 15 гибридом к вирусу КЗ, полученных на основе мышиных-миеломных линий; 7 .гибридом к белку р24 ВИЧ-1, в том числе 4 мышиных .и 3 .крысиных гибридомы, а такие ряд. других гибридом.
В созданный каталог, коллекции -гибридом -включены. данные, о 113
гибрядомах, секретируших .ЧКА к различным антигенам. 3 него вошли: гибридомы которые непосредственно были использованы"для выполнения данной работы в качестве исследовательских или контрольных препаратов; гибридомы, депонированные во Всесоюзной колдакции культур клеток; гибридомы имевшие коммерческое применение и дошедшие в коммерческий каталог НПО "Вектор". Их ША, как' и сами гибридомы, достаточно изучены и пригодны для решения прикладных задач, связанных с проблемами иммунодиагностики и биотехнология Культуральные свойства данных клеточных линий и их музейных аак-ладок достаточно изучены для того, чтобы обеспечить их длительное хранение и наработку МКА.
К большому сожалению, в каталог не включены данные по гиб си-домам, находящимся на хранении з банке гибридом НПО "Вгктсо", но не прошедшим полное изучение в лаборатория. У нас сложилась следующая ситуация. В Российской официальной коллекции нами депонировано 14 клеточных линий, з наз каталог входит 112 кзето«зах линий, а имеется на хранении более 315 гибридом, продуцирукглп; )iHA к различным вирусным антигенам.
Данные по изучения гидридом приведены з паспортах атгниоз гибридных культивируемых клеток. В них представлены данные по ха-рактеризации 14 различных гибридом, ;сак кьетного, так и крысиного происхождения. Анализ их культуралькых свойств говорит о том, что основой их своеобразия является, з первую очередь, специфичность секретируемых ими USA. Уникальныя гоэшяюстям MRA з анализе антигенной структуры вирусных бэлкоз '"Л посвящена заняал работа.
Пзучвнза аагкгакяой структуры згруез. Е23
Ш попытались использовать МНД для изучения антигеняей структуры двух альфагируссз, вирусов ЕЭЛ и ВзЭЛ, я&зтшся тя-шияши представителями одакгм-гяшгг азтзггзаьх серокомплэксоэ альфззирусов. На момент начала работ по исследованию антигеннс.1 структуру вируса 22Л была опубликована ^аскэтзскя одна работа Rcehrig et al. (lS8£b), па вирусу ЕсЗЛ и его антигенному комплексу кем неизвестны, до каетсзггго времени, псл'торгзкерныэ публикации. Есть только несколько косгеняьк ссылок, rcscpszax о том, что аьэрикгяскиз авторы иь:е.от несколько пйрндоу к вирус" ВсЗЛ
''fcenr:?. isa;). -
Вирус ВЭЛ, как и все альфавирусы, имеет два основных поверхностных гликопротеина. На гликопротеине El было ранее выделено 4 зпитопа связывания МКА (Roehrig et al., 1982b). Конкурентный ра-диоиммуноанализ позволили предложить карту антигенной структуры гликопротеина El гируса ВЭЛ. На ней выделено пять неперекрывак>-елхся сайтов, включающих в себя 8 зпитопов связывания ■ ЫКА. В предлагаемой карте выделены неперекрывающиеся сайты связывания МКА, причем в сайт 3 входят 2 зпитопа, в сайт 5-3 эпитола и остальные сайты имеют по одному зпитопу. Взаимодействие МКА со всеми сайтами не влияет на инфекционность. вируса in vitro, но МКА SD2 к сайту Е1-1 обладают выраженным протективным эффектом (Табл. 1). Сайты 1, 3 и 5 содержат зпитопы, обеспечивающие антигенный перекрест мезду вирусами ВЭЛ и ВсЭЛ, а такжг.вирусом КЭ. Разрабо-
Таблица 1. Свойства моноклональных антител к гликопротеину
El вируса ВЭЛ
МКА Вид Сайт- . Титр в ТРИА РН РТГА
зпитоп (обратные величины)
Trd ТС-83 230 ВсЭЛ КЭ ВЭЛ ВЭЛ
8D2 Крыса El -la 270000 270000 180000 500 -
4СС Крыса El -2a 270000 270000 130000 - -
2Е12 Крыса El' -3a 540000 si0000 810000 50000 -
539 Мьоь El -3d 1Б0000 81000 81000 ' - -
4^3 Крыса El -4a 30000 30000 .11000 -
1D3 ХЫСЬ El -5a 270000 270000 270000 - 24300
1С5 мыщь El -5b 540000 540000 540000 - 24300
1Е30 Ишь El -5c 270000 270000 270000 50000 48600
Примечание: В экспериментах использовались асцитические етд-
. кости соответствующих гибридом. Представлены данные 3-4' экспериментов.
тайная нами карта антигенной структуры более подробна, чем
описанная ранее ({?оеЬг1е еЬ а!., 1982Ь)..По всей вероятности, эти
карты' взаимна дополняют друг друга, но решить вопрос об их соответствии можно только экспериментальным путем. Наибольший'интерес представляют районы белка Е1, вызывающие формирование протектив-ных антител и тем самым, участвующие в формировании противовирусного иммунитета. Наши результаты по картированию сайта 51-1 путем получения антигенного мутанта, устойчивого к действию 1Ш 802, показали вовлечение в этот район 206 а. о. гдикопротеина £1. К сожалению, они остаются на сегодняшний день единственными экспериментальными данными по этому вопросу.
Целью.дальнейших исследований было изучение-антигенной структуры глякопротеина Е2 вирусз ВЗЛ. Полученная панель МКА (Табл. 21 х атому белку позволила - предложить карту антигенной структуры гликопротеина Е2, зключаюиутс в себя 6 сайтоз, обьедияякетх 21 заитоп связывания МНА (Рис. 1). Эпитспы сайтоз 32-2 и Е2-6 «казались связаны с нейтрализацией вируса БЭЛ и совместно с эпигонами сайта Е2-3 были вовлечены- з реакцию тсрмогэяия гемагглЕтчнахвн. УНА к остальным сайтам белка Е2 не проявляли биологической актиз-ности з реакции нейтрализации и гормоявняя гемагглктинации.
Предложенная на;,а модель антигенной структуры гликопроте-н-на Е2 вируса ЮЛ отличается от списанной Коеггп? э1 а1. С1В82Ъ; и КоеИпёг & ШаЬЬз^ (1985). В результате использования для отбора позитивных гибридом на первом этапе РИЛ, а на втором ?Н, а ?акгэ получения мыаиньпс и крысиных гибридом к данному вирусу, удалось выявить значительно больсз зпитопов, ответственных за протекция, нейтрализацию и гемагглэткяацизз. Это позволяет сказать, что дачная классификация более подробна и дает более правильнее представление о функциях и организации зирусньг: гликслрстеиног.. Вопрос соответствия двух моделей-антигенной организации этих белков юяет быть решен двумя способами: изучением взаютоЯ конкуренции двух панелей НКА или картированием на гене?» вируса К?Д зпитопов связывания моноклональных антител, пелучекяых накн американскими авторами. Картирование зштопоз связывания !£А с помотаю пептидов и путем получения антигенных вариантов было проведено параллельно наш и группой американских азтореэ. ГЬлучоз-:-:ыэ данные говорят о том, что результаты этой работы точны а зза-■тяо леполпямт друг дпута, но псе ге, полуденная нака паяелз- МКА
Е£-ьо
-1а
Ё2-Ьа,е
М 1 1 1 1 .1 Е2-2а 1 1 I! 1 1 1 Е2-4а,й
П11П1 Е2-2Ь 1 И 1 1 1 1 Е2-4Ъ,е
1М11М Е2-2с I ; М ! 1 ! Е2-40
М 1 1 1 1 1 Е2-За 1111111
п
...III 53-3 Т
' А 1 1 -Эе
-- 11111
! 1! 11 22-За Е2-ЗЬ Е2-Зо
1 1 I ! 1
Е2-5а
Рес.1 Карта антигенной структуры гликопротеина Е2 вируса ВЭЛ, птамм -им. ' •
Обозначения:
эпитеты, - ответственные за РН, РТГА и протекцию
РТГА и протекция
- только РТГА
- 15 - ■
значительно более разнообразна и позволяет выявить новые районы на белке Е1 и Е2 не обнаруженные нашими коллегами из США. ■
Таблица 2. Панель ЫКА-к гликопротеяну Е2 вируса БЭЛ
. Белок Имму-' Сайт- Взаимодействие с вирусом БЭЛ МКА Вйд мишень, ногензпитоп ___
1 ' 2 .ТРИА РН РТГА Протекция т (ЕеЕ
В5 крыса Е2 230 Е2-1а + - - - +
В12 крыса Е2 ТС-83 Е2-2а + + + +
Е8 ■ крыса Б2 230 . Е2-2Ь + +■ + + -
701 крыса - Е2 ТС-83 Е2-2с + + ■ + + +
4Г6 крыса 22 ТС-83 . Е2-За + - + +
4С5 . крыса - Е2 ТС-83 Е2-2Ь - + - + -
7СЗ крыса - Е2 ТС-83 £2-Зс - +■ • - +
7А6 крыса - Е2 ТС-83. Е2-ЗС) -Ь - - + . + ^ и.
ЗС4- мышь Е2 Тг& 22-Зэ + - ' + +
4Н5 крыса - Е2 ТС-83 Е2-3 Г . - + +
4С7 крыса Е2 ТС-83 Е2-43 + ' - . - ■
668 крыса Е2 ТС-83 Е2-4Ь + • • - - - ' '. - -
301 ■ крыса -Е2 ТС-83 Е2-.4С - - -
1а0 МЫШЬ Е2 Тгс1. Е2-4С1 • - ' -
1В9 мышь . Е2- . ТС-83 Е2-4е +• - - -
1РЗ крыса Е2 ТС-83 Е2-5а + - - - -
3211 каша Е2 ТС-ВЗ 22-ба • + * + -
204 мышь Е2 Тгс). £2-бЬ + + + + +
5Е7 крыса Е2 Тг& Е2-6с + д. + -
5А12 крыса Е2 Тгй. Е2-бс1 + + + +
5010 крыса Е2 Тгй. Б2-бэ 4- + ¥ + -
Примечания: 1 - специфичность МКА определена методом имму-ноблотинга; 2 - "белок-мишень" определен при помощи радиолкмуноа-реиипитации. "+" - наличие регистрируемого эффекта; - его
отсутствие.
Особый интерес всегда вызывает лротективная активность монок-лонадьнкх антител по отношению к экспериментальной вирусной ин-фэкции у животных. Выявление протективной активности МКА позволяет справедливо считать, что эпитоп связывания на вирусном гликоп-ротеине этих МКА вызывает индукцию защитных антител и, .тем.самым, играет принципиальную роль б формировании противовирусного-, иммунитета. Изучение протективной активности полученной панели -МКА показало, что на гликопротеине•Е2 удалось .выявить зпитопы связывания для 12 типов протективных ЫКА, .тогда как,на' -гликопротеине И всего лишь один ( Табл. 3). Зпитопы связывания протективных ША. картируются в составе трех сайтов Е2-2.Е2-3 и Е2-6 гликопротеика Е2 и в сайте Е1-1 гликопротеина El,вируса ЕЭД. . Причем,- более 95% протективной активности связано, с сайтом Е2-0 я.МКА ЗЕ11, по всей" вероятности, взашодействувдши с центром данного. района. - Важно отметить, что многие виды ША обладают .протективным. действием без зараяеняого вейишазуюцгго эффекта in vitro на культуре .клеток.
Ранее Mathews & Roehrig (1382; 1985) обнаружили, что с про--тективвой активностью у вируса ЕЭЛ связано 4 эпигона на-белке Е2 и един ка F1, причем все эти МКА к Е2 обладали • вируснейтрадизу»-13й агаивнсстыо m vitre. Максимальной протективной. активностью обладали МКА 1А4А-1, распознайте зпитоп Е2с и .аавдвдзюиие .всех .цветных от 100 Лд50 вируса БЭЛ, Егамма Тринидад, при введении MEA в дозе Кшг/кызш. При- определений' протективной активности Mathews & Ro^hríg (1981) нормировали ее по количеству. ША,. .вводимых животному, при использовании постоянной дозы вируса для разрешения (100 ЛлсО) состояния пассивной иммунизации. При этом они показали, что отсутствует прямо пропорциональная зависимость между дозой вводимых МКА и степенью протективного эффекта Так в диапазоне от 1 до 10 мкг/животное для МКА 1А4А-1 степень протективной активности изменялась б 100000 раз. Это позволило нам упростить методику регистрации протективного эффекта и оценивать его как индекс резистентности после введения животным.МКА.
К сожалению, разный способ расчета протективной активности липид "нас возможности прямого сравнения экспериментальных данных 'по протективной активности МКА. ' Косвенные сценки показывают, что протективная активность МКА 1А4А-1, распознающих-эшггоп Е2с,. была
не Солее чем б. О Îg, ДЦ50, а. другие МКА, полученные американскими авторами .имели значительно более низкуя активность. Нами получено пять видов МКА к различным-зпитопам трех сайтов, обладающих сравнимой или более'высокой протективной активностью, что говорит о более сложной' природе формирования противовирусного иммунитета и об участии в этом процессе не менее 13 зпотопов в составе 4 сайтов. .
Таблица 3. Изучение протективного действия- МКА к вирусу S3-!
ША Имму- Сайт-■ ноген зпитоп PH ТРИА Протекция
Trd Trd M?( le)
8D2 . ТС-83 E'1-la <10 270000 5. 3
312 7С-83 В2-2а <10 540000 6. 3
Е8 230 Е2-2Ь 20 810000 2.Q
731 ТС-83 ЕЕ-2с . <10- 540000 5.1
4F6 ТС-83 Е2-За . <10 160000 2.0
7А6. ТС-83 E2-3d . <10 . 18GOOO 2.0
, ЗС4 Trd. Е2-Зэ ■ 40 240000 2. 0
4Б5 ТС-83 Е2-ЗГ <10 270000 >2.0
ЗЕ11 ТС-83 Е2-ба 5000-220000 8.5
2D4 Trd.- Е2-6Ь 5120 730000 6.4
5Е7 . ■ Trd.. Б2-бс 12800 ,218000 6.1
5А12 ■ Trd. E2-6d SCO 145000 ' - 5. 6 -
5D10 Trd. E2-60 ,1600 243000 5.3
. Примечания; приведены обратные-величины'тигров, а для протекции индекс резистентности в-. Ьд, , вызываемый введением .¡¿НА беспородным белым мьлдам.
.Полученные дачные подтверждают предположение о том, что гди-копротеин Е2 играет принципиально важную-и* доминирующую роль, в формировании противовирусного" иммунитета. Ка - нем - раеполозены большинства зпитопоа, - индуцирувдп. синтез- зирусяейтрааигуюгих,
антигемзгглштйнирующнх и протективных антител. Причем, впервые, установлено, что с биологической активностью связано- три неперекрывающихся сайуа белка Е2.
Получение МКА, распознающих альфа и флавивирусы, не было описано ранее и поэтому не укладывается в существующую классификацию антигенной структуры гликопротеинов В1 вируса ЕЭЛ и белка Е вируса КЭ (Табл. 4). Более того, это позволяет, сказать,-что нами выявлены новые антигенные специфичности этих вирусных белков.- Биологический смысл наблюдаемого антигенного перекреста не ясен. Вполне возможно, что мы имеем дело со случайным антигенным перекрестом,' который иногда наблюдается для некоторых белков. Другое объяснение моякт заключаться в том, что бедок Е вируса КЭ. и белок Е1 вируса ВЭЛ являются родственными белками, эволюционировавшими от обшэго "белка-предка", а выявленные антигенные районы имеют важное значение и поэтому они сохранились в течение эволюции. И последняя возможность заключается.в том, что эти белки, зволюцион-но не связаны, но поскольку они являются поверхностными гликопро-теинами оболочечных вирусов, то этот район .имеет антигенной подобие ■ввиду того, что он либо выполняет сходную функцию в вирионе, либо принципиально важен для репликации РНК-содержащих оболочечных вирусов- ' К сожалению, мы не располагаем прямыми зксперимен-' тальными данными, однозначно подтверждающая! или опровергающими эти предположения. _ однако» вполне ясно, что альфа и флавивирусы имеют различную организацию генома,' степень гомологии белка Е Вируса КЭ и Е1 вируса ВЭЛ и ВсЗЛ низка. Это натолкнуло-нас на мысль попытаться -обнаружить гомологичные участки'белков этих вирусов, способные быть антигенными детерминантами и, тем самым, локализовать на первичной последовательности районы, обеспечивающие дан-■ ный антигенный перекрест.
Сопоставление первичных последовательностей вирусов ВЭЛ, ВсЗЛ и КЭ показало, что тройной перекрест может допустить для вируса КЭ только одна непрерывная последовательность: от 164 до 204 аминокислотного остатка белка Е. На рисунке 2 представлена гипотетическая альфа-спиральная развертка одной части из этого района Видно, что на одной стороне спирали имеется кластер незамоня-, едихся аминокислот. Это позволяет высказать предположение, что
Е КЭ" 164 Е1 ВЭЛ 285 Е1 ВсЭЛ 285
АЗтБКЕКГП. .ь. .кг. .о?рг.
•А. .КС. .ТРТ7
2 1
Нт
Ъза
Рис. 2 Альфа-спиральная-развертка локально гомологичных" районов белка:31 ."вируса ВЭЛУ ВсЭЛ-и бежа Б" вируса КЭ.
Приведена последовательность151"белка випуса ВЭЛ. Отличающиеся аминокислоты - белка Е - вируса - КЭ и ВсЭЛ пвиведены ггаззеэ соответствуяцей'ашшокислоты бежа Е1 гагоуса* ВЗЯ стро-згая буквами.--Обведея кластер; незаш«я»Ёяхся аминокислот' на одной стороне спирали.
- 20 - ' данный район белка Е гаруса отвечает за наблюдаемый антигенный перекрест между альфе и флавирусами. .Для адафавирусов данный район распадается на два дискретных района от 195 до 222 а. о. и от 2£5 - 297 а. о. белка Е1 вируса БЭЛ
Таблица 4. Оценка специфической активности ЫКА и полигональных автисывороток с различными вирусными антигенами.
МКА или Иммуно Титр в ТРИА (обр. вел)
антнсыв. ген Е белок Вирус КЗ ВЗЛ БЭЛ ВсЭЛ
КЗ ■ шт. 205 шт. ТС-83 ■ШТ. 230
актисывор. КЗ 48000 48000 <100 <100 <100
Крал.
аНТЕСЫЕСр. 230 430 430 12100 12100 н. 0.
.„С^.ор. Ее о Л 930 2700 9300 0300 48600
licp;:. гсг^п:.
- <50 < 00 <00 <00
1С". Г 8Г. 04300 1С 200 61200 01200 <50
тс-сз 16200 2-1300 48000 48200 <50
^ Г - X и ТС- сз ¿0000 4 £600 COI 00 01200 50000
Z-Í'-. белок Е 7Г.900 ¿,-j uu'O <00 <00 <50
г Е 21000 72000 <50 <50 <50
бело;: ?. л 45000 72300 <00 <50 <53
ЕЬишч&ь"»: ь о. - fs спрогеллли.
П-лучяшу? юих результаты по картированию на сшпоуз;оготаоЛ гсглсдззател-ксотй доке-нг, сСегпечиБаиаего апткгекк1& порэкрест изг~у елг^а и £л~г::б>;руса?,:и, основаны на кзсвешшх дзвяых п, ко-даго. нуг^слгоя ь прзмзй практической пр&зеркс. 'Такие данные могут быть получены при изучс :ше третичной структуры кошлекса белка Е и Í.KA. к содахенкю, такого рода эксперименты к .вастоясэыу Ерекэнк es» не проведены, ввиду .их высокой сложности,/ неотработанности ыетодик крясталнзации белков вируса КЗ и чрезмерной сто-
'ймостя. Отсутствуют даж данные по третичной структуре белка Г, хотя имеются устные'сообщения о попытках проведения такой' работы австрийскими''учеными: Мы-надеямся, что результаты их работы подтвердят правильность наших" выводов по картированию антигенного перекреста между альфа и флавивирусами.-
1Ьугсз1:гэ шгт.чгис.сЯ структура вируса ПсЗЛ.'
Следующим'этапом нашей работы было получение коллекции гибридом, синтезирующих■моноклональные антитела к структурным белкам вируса ВсЭЛ' Полученная- коллекция состоит из 10 мышиных и 24 крысиных гибридом, 3 таблице 5 представлены наиболее типичные МКА к вирусу. ВсЭЛ, а такмк-все МКА обладающие биологической активностью.
.Таблица о.
Свойства- МКА, взаимодействующих с вирусом Восточного энпефаломие лита лошадей.
Взаимодействие с вирусом ВсЭЛ
Белок- ■ЫХ- лиг л* Протекция
МКА. Вид ИФА ' РН РТГА
мишень (ИР, 1?)
7В6 МЫШЬ ' Е1СИБ) 60000 - -
ЗСб мышь Е1(ИЙ 60С00 - -
4ВЗ ' МЫШЬ' Е1(ИБ) 240000 -
3.4 мышь Е1СИЕ) 60000 - -
9Г2 мышь - Е1СИБ) 120000 - -
8Е5 , мышь £1(ИБ) 120000 - -
1В10 мышь ЕКИБ) 50000 - -
1Е10* мышь Е1(ИБ) 30000 - -
6012 крыса Е1(ЙБ) аоооо -
4Р6* крыса Е2(ИБ) 60000 Н. 0. 150 . --
7СЗ* крыса Е2( РИП) 60000 Н. 0. 640
701* коыса Е2ГРИП) 50000 К. 0. 320-
крыса ЕПСРИП) 600СС о. С£0- **
4С5* крыса Е2(?ЯП) . 30000 Н. 0. 640
4Н5* крыса Е2(РИП) - 60000 н. 0. 1280 .
ЗС4ж крыса Е2(ИБ) 60С00 Н- 0. ". 160л -
4Е4 крыса £2(КБ) 120000 .3200 1280 6.4
1РЗ крыса Е2(Ш 240000 2000 320 6.2
2НЗ крыса Е2(КБ) 60000, - 220 -
5Н5 крыса Е2(Ш1А). 480000 16000 10240 >8.7
5й11 крыса Е2СКРЙА) 120000 . - « 6.7
1В2 мышь Е2( ИВ) 120000 - - 6.5
1Б11 мыла С (КБ) 120000 - - -
1С4 мьиь С (ИБ) 60000 - - -
Примечания: а - ЫКА получены к вирусу ЕЗД; ** - обратные величины титров; "-" - отсутствие кгаимодойстыл; (КБ) - спехг^пч-костй определена методов им;,;упо5лотинга; (РКП) - специфичность определена входом радкоиммуноирециинтсшп; СКР11А) - снвца&зч-кэсть сщх'^слоии изс^нло метено:« кетазгрентного радас.,йИйушгка-о!Р) - индекс р^^итсьтносги (в 1в):..огкошоико величин тит-рс-и ькруси, сарсдолип^^: на .г^&кяших сОр&Зотааних, и не обработанных ЫКА; н. о - но определяли.
Это возводило создать нерву» кгасск&кацав и построить карту антигенной структуры поверхностны^ гликоиротепнав ьируиа ЕоЗЛ, ТИПИЧНОГО представители однотипного сеуокскзА^кеа, .йа&Ыйфуесв.
глпкопро/е;:;:^ Б1 при исмоа; конкурентного гм&йо&яа&аь УД^-лсо;. ¡гартпро^атл не мерное 4 пекерепрывакщпхеп антигенных -сайтов.
Конкурентный анализ зватспов глаг.опротепна.ЕЕ показал наличие ш кгнее семи сайтов на глшепротекве Е2 (-Рве. 3). Шссть сайтов, частично перекрываясь, расположены на глккопротеине.Е2 в виде непрерывкой последовательности, цродетавлякзрй собой, .по-видимому, шкунодешцавгну» область.,. Причем, -биологически Бкачимые район« ояагшоотся сгруппированными в .коуяакхну» .структуру - домен. Б эту область не .включается лишь сайт Е2-7, взаимодействук>-еий с протективнши ■ МП". 1В2. МКА к 4 сайтам способны.нейтрализовать вирусную-.инфекционность--.на культуре клеток,,, .блокировать реакция» вирусной--.-гешггаюгинации-'-'и способны защитить;животных о?
Ь,о,<1, е-Ь - 11111
Е2-2а,Ьф I
22-4
Е2-5 Е2-6
-Е2-7-
Е2-4 152-5 Е2-6-
-22-7-
В..
йс.з Карта антигенной структуры-гликопротеинэ Е2 вирусов ВсЭЛ,
а) 5А-- вариант, в) штамм 310,
сайты---Е2-4,5,6 даны.без разбивки на-эштоиы.
!!!
РТГА
РТГА.РН, Протекция Протекция•
Отсутствие биологических функций
заражения не менее чем 6.0 lg ДЦ50 вируса'ВеЭЛ. . Причем,- сайт Е2-7 формирует перекрестно реагирующие протегсгивные *>ноклоналъные. антитела, которые защищают одновременно- от летальной-инфекции вирусами ЕЭЛ и ВсЭД.
Полученные нами результаты- показывают, - что--все МКА, демонстрирующее ■ вируснейтрализующий, • ачтигемагглютинирующий или протективный эффект, - оказались -.специфичными к:гликопротеину Е2 вируса ВеЭЛ. Этот факт свидетельствует о.доминирующей-роли данного белка в формировании ■ гуморального -Иммунитета- против вируса ВеЭЛ в организме теплокровных. Среди протективных в отношении вируса ВеЭЛ -моноклональньгх антител имеются- как-нейтрализующие МКА 5Н5, 4Е4 и 1F3, так и ненейтрализуюшие-5811, -1В2-МКА. Однако, максимальным протективным эффектом- обладали вируснейтрализующие, ачтигемагглюпширующке МКА 5Н5, распознающие эпитоп . £2-2а.. -Они гапкдали животных от заражения ' более, - чем 8.7 lg 'ДЦ50 -'вируса
МКА IBS -примечательны еще в одном-плане. ••:- Помимо высокой цро-тективной активности (индекс резистентности 6.5 lg), ■ эти'ЫКА"'обладает такж свойство;-« взаимодействовать в. с -вирусом ВЭЛ. Это натолкнуло нас на мысль изучить протективные свойства МКА-1 ¡32 и в отношении вируса БЭЛ. Оказалось,- -что -даиные-.MRA были способны- заедать бежа-мывей от-зврежзвия дозой 100.- ЛД50 -вируса БЗЛ. Такого рода детерминанты ранее не, были описаны'для альфавирусов;- хотя их присутствие на вирионе можно подразумевать, - исходя из ■■ известных фактов о наличие перекрестной протекши -антителами к одному аль-фавирусу по отношению к другому (Hearn, 1931-, 'Staaw.and Kisslir.g, 1957; Burns et al. , 1S64).
йаучеаш • гата-еиной - структур вакцшшш -и Екруленгньй-кгги-ш si-фуеа ВЭЛ -.» ВоЗЛ -при -jetxxmi ыоишдоншвнш-щтггая.
Следующим этапом нашей.работы-было-проведение 'сравнительного иаучения антигенной .структуры некоторых - вирулентных и аттенуиро-ванных штаммов вирусов ВЭЛ и ВсЗЛ. Следует отметить, .что для по-.лучения гибридом к вирусу ЬсЗЛ был использован только" вирулентный Егамм этого вируса, а для вируса.ВЭЛ на первых этапах работы были использованы .аттенуировакные,- штаммы -и-только на-заключительном этапе - штамм'Тринидад. Несмотря на ото были обнарузкены - опреде-
ленные -антигенные, отличия- у-вирусов ВЭЛ, причем, все они были обнаружены только: у. аттенуированных-штаммов.
Изучение взаимодействия МКА,- не имевших, протективной актйз-ности;-. ..с раздичными"~штаммами.вируса "ВЭЛ методами•ЙФА и. ТРИА не выявило "значимых-отличий -и показало антигенную идентичность этих районов-у трех исследованных, штаммов вируса ВЭЛ. -
Интересно^- что с. помощью л роте ктивных МКА были обнаружены значительные антигенные- изменения гликопротеина Е2 штамма ■ ТС-83 и, особенное- штамма -230 вируса ВЭЛ. Из 13 идентифицированных "про-тективных" 'эпит0п0в' у штамма, ТС-83 изменено три,-а у 230 штамма -цЕсть--эоттопов,-8-:состав®-2:-сайтов (Табл.- б). При сравнении карт антигенной структуры-видно,, что- в процессе аттенуацик подвесга-ется.. изменениям - наиболее -- важный^ в протеютшном отноаеяни сайт Е2гб'. У. штамма- 230: ок. модифицируется- наиболее- аначительно.-
Таблица 6., Изучение взаимодействия, протективных МКА с зиру-лентными и аттенуированными штаммами-.вируса ЕЭЛ.'.
Сайт- РН (обр. вех.). . - РТГА . 'ТРИА
МКА- ЗГОГГОП •__.__;____
Тгс! ТС-83.-230 , ТгсМС-83 230 Тг1. ТС-аЗ 230.
802 ..- Е1-1а <10 <10 <10 . <10. <10 <10 270000 270000 270000-В12 Е2-2а <10 50000 <10 640 2560 <4 540000 540000 <1000
ЕЗ . Е2-2Ь. 20 1250 .62500 < 4 - 64 . 640 .810000 310000 810000
7Ш Е2-2С. <10 . 500 . 6000 - 40 ■ 40 . 320.540000 180000 180000
4Гб Е2-За..<10 <10 <10 40 40 '160 160000 160000 160000.
7А6 Е2-ЗС1 <10 <10 <10; , 160 . 160 320 180000 180000 180000
ЗС4 Е2-Зё .40- <10/. <10 80 80 , 80.240000 240000 240СШ
4Н5- Е2-ЗГ <10 <10 <10 . 1280 640 .1280 270000 270С00 27ЕЮ00
ЗЕ11 Е2-6а 5000 5000 - <10 " 320 40 <10 220000 220С00 <1000
204 -Е2-6Ь 5120 5120 - <10 1280 1280 : <10 730000 730000. <1000 .
5Е7 Е2-6с'12800 . н. о н. о 1280 н. о н.0.218000. <1СЮ <1Ш
5А12 "Е2-бсЗ 800 Н. о н. О 40- Н; о. Н.0 145СШ <100/ <100
5010 Е2-бе 1600 Н. а. н. о ■- 640 я. о . я. о 213000 <1СО " <100
• - 25 -
Обнаруженные антигенные изменения показывают, что в-процессе аттенуации произошли изменения в-районах белка Е2, - ответственных аа формирование-противовирусного, иммунитета Вакцинные .штаммы в США и СССР, полученные независимо друг от друга,- значительно отличаются от вирулентного штамма Тг<3,. что-говорит о-неадекватности использования аттенуированнкх штаммов, особенно 230, в-качестве вакцинных. Схожесть, антигенных изменений позволяет предположить, что процесс аттенуации связан с определенными изменениями в структуре гликопротеина Е2. Обнаруженные антигенные—изменения должны касаться и -инактивированных вакцинных препаратов, производимых на основе■штамма ТС-83 в США и, особенно, -.на - основе. 230 штамма в СССР. Это, по всей-вероятности, также-должно относиться и к штамму СМ-27, -который имеет аминокислотную структуру белка -Е2, тождественную-штамму 230 (Юферов^и др.", 1-189-, -1992). От этого недостатка, по всей вероятности,. не будут избавлены и препараты инактивированных вакцин на основе штамма СМ-27 ;(Карпова' и Ди-линский, 1992).!
Наибольшие изменения -коснулись сайта Е2-6 вируса ВЭЛ. • Следу-, ет сказать, что сопоставление-аминокислотных-последовательностей белка Е2 исследованных-'штаммов, вируса.ВЭЛ показывает, что наибольшие отличия имеет штамм 230 - 9 аминокислотных замен и два сайта гликозилирования вместо трех у штамма -.Тг& Штамм ТС-83-имеет 7 замен- и сохраняет все сайты гликозилирования. Эти аминокислотные замены, особенно, выраженные в -области 200-220 а о. служат, -по видимому, 'структурной основой .наблюдаемых антигенных отличий. Но к сожалению, мы не располагаем прямыми данными, позволяющими связать - аттенуацию и антигенные изменения сайта Е2-6. Дать прямой ответ г.а этот вопрос, по-всей вероятности, может дать направленная модификация данного района белка .Е2.
Исследование антигенной структуры - аттенуированного штамма 310 было проведено с помощью панели из 9 типов анти-Е1 и 32 типа анти-Е2 ЫКА к вирусам ЮЛ и ВсЭЛ (Табл. 7). .'В антигенной структуре гликопротеина Е1 не было выявлено различий между- вирулентным и аттенуированным штаммом, н^ 8 из-32-Е2-специфичных--ША выявили различия между двумя штаммами. Причем, характерно, что преимущественной модификации подверглись районы отвечающие-аа-формирование протективных,-вируснейтрализующих.и.блокирующих гемагглюти-
■ - 27 -
нация антител. Сравнительные карты антигенной структуры этих двух штаммов вируса ВсЭЛ наглядно показывают, что значительной (вплоть до их исчезновения) антигенной модификации подверглись сайты Е2-2 и Е2-3, а у сайта Е2-1 изменилось только два эпитопа - Е2-1е к Е2-1Г, взаимодействующие с МКА 4Е5 и 4С5 (Рис. 3).
Таблица 7. Исследование перекрестного взаимодействия панели , МКА с вирусами ВсЭЛ и ЕЗЛ при помощи ИФА.
ВЭЛ
ВсЭЛ
м МКА йммуноген Белок-мишень " Тгй ТС-83 230 БА 310
1. &2 ВсЭЛ - Е2. . ■ - - - + . +
2.. 5.3 ВсЭЛ Е2 ' - + - +
3. 2Б5 ВсЭЛ Е2 - - + +
4. 7.10 ВсЭЛ Е2 ■ - + +
5. 4В10 ВсЭЛ Е2 - - ■ +. ■ +
6. 169 • ВсЭЛ . Е2 - - - ■ '+ • +
7-, 9Е10 ВсЭЛ Е2 • - - + +
8. 406 ВсЭЛ Е2 - - - + ■ . +
9. 1С10 ' ВсЭЛ Е2 - - - 'т 4-
10. 5311 ВсЭЛ Е2 - - - г ' -
11. 4Е4 ВсЭЛ Е2 - ' - - 4- -
12. 1РЗ ВсЭЛ - - - 4 -
13. 5Н5 ВсЭЛ - - - 4 -
14. 9310 ВсЗЛ Е2 1 + -Г ;
15. 1203 ВсЭЛ Е2 1 + 4- - - ;
16. 407 ВЭЛ ' Е2 \ + + 4- + - 1
17.' 4Н5 . юл Е2 1 + + 4- 4- - 1
18. 304 . ВЭЛ ' Е2 1 + + + + + !
19. 7М ' ВЭЛ Е2 1 + + + + ' ■ + 1
20. 4Р& ВЭЛ Е2 1 + ■ + ' + + I
21. 7А6 ВЭЛ Е2 1 + ■ + + . + ■ > 1
22. 4C5 вал Е2
23. 2H3 ВсЗЛ Е2
24. B12 вэл Е2
25. B5 вал Е2
26. 2D4 вэл Е2
27. 1B2 ВсЭЛ Е2
28. 1GG8 ВсЭЛ Е2
29. S. 1Í ВсЭЛ . Е2
SO. • 4.14 ВсЭЛ Е2
—i 15E4 БсЗЛ Е2
22. 13HÔ ЗсЭЛ Е2
3E11 БЗЛ Е2
-24. ÍQ10 ВЭЛ со
25. 4311 ззл Е2
J^ü. 031 вэл Е2
Or? ES ззл Е2
ПО •JU. 7B6 БсЗЛ El
20. 205 ЗсЭЛ' F1
4P 4U. 4БЗ ВсЭЛ . El
41. SF2 ВсЭЛ El
42. 8E5 ВсЭЛ El
43. 1D10 ВсЭЛ El
44. a4 ВсЭЛ - El
45.- 6D12 .ВсЭЛ - El
45. 1E10 ВЭЛ El
46. 2E12 ВЭЛ El
4a 5R9 - ВЭЛ El
49. 1D3 вэл El.
ПП 106 юл El
51. • ÍB11 ВсЭЛ
52. гс4 ■ Бегл . G
I + +■ + + +-
I + + + +
I + + ■ - i-
l> + + . - +
! + +■ - + +
I +' + + ' ' + + -
I + T + -+
! + + + + +
i + + + +
! + + -t- + +
: r + - + + +
+ - - - -
* + - -
- - - - -
т - - ■ - -
- - - + +
- - - -f- -t-
- - - - + +
- - - . + +
- - + +
- - +
- - - + ' + "
I I + + + + +
I + I + + + H. 0.
+ + + - -
+ + + - -
+ + + , - -
1 J- - T +
!,ЖА 1ГВ, 5Н6, 4Е4 и 5311, распознающие сайт Е2-2 и Е2-3, нейтрализуют инфекционность Еируса ВсЭЛ и обеспечивают защиту организма от летальной инфекции. Причем МКА БНб пси взаимодействии с эпитопом Е2-2а обеспечивают защиту от более чем 8.7 ЛЛоО вируса ВсЗЛ (К сожалению, нам-не удалось использовать более высокие дозы вируса для заражения .тавотных, так как для этого требовалась использовать для заражения животных вирусную суспензию с титозм более чем 11 1'д'ЛД50/мл). Доминантность эпитопа Е2~2а пои формировании противовирусной зашиты,- подчеркивается тем, что более 95% наблюдаемого наш протективного эффекта МКА связано е ним и МКА 5311, распознающие тот ж сайт к полностью конкурирующие в КРИА с -МКА 5Нб, защищают. животных в 100 раз- хуже.
Вышесказанное, позволяет сделать вывод о том, что аттенукро-ванный пггамм 310 вируса ВсЗЛ имеет значительную антигенную модификацию протективных зпитопов белка Е2 и, по всей вероятности, не может быть использован или рекомендован в - качестве -вакцинного. Бедавно появилось сообщение о-том, что на основе штамма 310 получен новый аттенуированный'пггамм К-40 вируса ВсЭЛ (Мопков и соав., 1992). Видимо-следует признать, что необходимо тщательно•исследовать его антигенную структуру перед тем как рекомендовать его в качестве вакцинного.
- Проведенный сравнительный анализ антигенной структуры вир." лентных штаммов вирусов ЕЭЛ и ВсЭЛ, - их вакцинных дериватов показывает, что в процессе зттенуапип произошло изменение антигенной структуры гликопротеина Е2. Причем, следует отметить, что у всех трех исследованных аттекукрованных -штаммов модификациям подвергается сайокы, сбеспечивашие формирование вацктных антител. Молчь-пке районы, не участвующие в процессах формирования протективного иммунитета, не подверглись антигенным изменениям. Данная закономерность наводит на мысль о теской взаимосвязи процесса аттенув-ции и архитектоники поверхностного гликопготеина Е2. Видимо, следует высказать пведположение, что изменение структуры районов, играющих важную роль в • нейтрализации вируса и, возмоясго, вс вза*--модействии с клеточными рецепторами, резко снижает патогенность вируса ВЭЛ и ВсЭЛ. Несомненно, что при конструировании вакцин против вирусов ВЭЛ и ВсЭЛ необходимо учитывать полученные данные
• -"30- ..... .......
и обязательно.проводить исследования антигенной структуры поверхностных гликопротеинов альфавирусов, использованных для этого, а также говорит о необходимости новых подходов для создания и совершенствования вакцинных препаратов против этих опасных вирусных инфекций; .
Другим аспектом этой.работы явился анализ перекрестной реактивности МКА по отношению к вирусам-ВЭЛ и ВсЭЛ. Он показал наличие значительных антигенных перекрестов у всех трех структурных белков. Для белка El обнаружено два перекрестно-реагирующего эпи-топа, для белка С - один, а для гликопротеина Е2 - 19 перекрестно реагирующих эпитопов (Табл. 7). Надо отметить, что 10 из них вовлечены в формирование биологически активных антител, способных блокировать РГА, нейтрализовать вирусную инфекционность и обеспечивать протегегивный эффект in vivo. Для МКА 1Е2 (Сайт Е2-7 вируса ВсЭЛ) удалось показать перекрестную протективную активность по отношению к вирусам ВЭЛ и ВсЭЛ.
Эти результаты оказались'для нас. несколько неожиданным^ так как известно, что гликопротеин El является более консервативным, нежели Е2 (Kinney and Trent, 1982), Процент-гомологии аминокислот поверхностных белков вирусов ВсЭЛ и ВЭЛ составляет 60Z для El и 46% ДЛЯ Е2 (Волчков И др.,, 1991). Недавно, Weaver et al. (1992а, b) на основе анализа первичных структур генома вирусов. ВЭЛ и ВсЭЛ предложил эволюционное дерево этих вирусов. Из его результатов следует, что вирусы. ВЭЛ и ВсЭЛ • дивергировали •. от Общего предка относительно недавно, приблизительно 10 веков назад. Это косвенно подтверждает наши результаты я позволяет нам говорить о том, что общие антигенные детерминанты именноена;гликопротеине Е2 вирусов ВсЭЛ и ВЭЛ играют.важную роль в репликации вируса и поэтому сохранились в процессе эволюции.- В пользу этого предположения говорит таклоэ и то, что среди перекрестнореагирующих ЫКА половина распознает биологически важные для вируса структуры (из 19-ти общих для вирусов ВсЭЛ и ВЭЛ антигенных детерминант 10 оказались способными индуцировать AT, обладавшие в той или иной степени активностью в биологических реакциях). Это может говорить о сходстве механизмов иммунной защиты организма от инфекции, вызываемой двумя вирусами, аналогичности факторов вирулентности обоих вирусов и следовательно' - о сходстве отдельных этапов их патоге-
неза
■ Цгучеяяз a- KsjfflipossHEe ■ ИГЛ воиэноатзфуеав ЕЭЛ a BcSJt
Гемагглютинируюшдя активность для многих альфавирус-ов связывается с белком SI , (Clegg et al. , 1983; Chanas et al. , 1982; Dalrymple et al. , 1975; Roehrig et al. , 19S0; Roehrig et al. , 1982a; ■ Schmaraljohn et al. , 1983)» но для вируса БЭЛ и ВеЗЛ по литературным данным (Roehrig et al. , 1982b; Roenrig and Mathews, 1985) и данным наших исследований она ассоциируется с гликопроте-ином Е2. С помощью панели из 17 моноклональных антител, блокирующих реакцию гемагглютинацяи, была более подробна изучена репеп-торная область вируса ЕЭЛ и ВсЭЛ, обеспечивающая взаимодействие вкрковов с эритроцитами. Полненные результаты подтвердили доми-лкруетуз роль глнкспротеипз Е2 вируса ЕЭЛ и ВсЭЛ в формирования вирусного рецептора, воакгздейотвуэдгго с «екСраксй эритроцита.
У-онкурзиткый анализ а сочвташга с данными перекрестных 'зза-имодсйстгнй 1!НЛ позволяет виделить на глнкопротеипо Е2 два района, участвующих в гемагглютнкацип - вариабельный и консерзгтпв-кцй. C3ai".:c:;5icT:i:? ISA о ггозеерзйтгяпыи районом одинакевз эффективно блокирует гемагглвтииацио у типичных представителей' 4 антигенных комплексов альфавкрусов (Табл. 8). К-район ограничен раз-ыеращ одним сайтом для вируса ВсЭЛ и двумя сайтами для вируса ЕЭЛ, которые вкдззчзэт -з себя ряд зпктспоз.
Варпгбгл ыиа район акгс? бегьет? размер и я состоит не :/экг-р. чем ;:з двух сайтов. Его зплтепы ьевлечеш з кзйтрагязйккэ ¡гирко-sos елтителамч к оСоегмчхве."? Формирование противовирусного ibmj*-нцтета. Все зто говорит о тем, что варпабелгипй и коноэрз2п;г:пл; районы кгразаг вашу» роль в процессе взаимодсйстви? вируса с клеткой и, по всей вероятности, является реиепторвшш областями альфавкрусов.
ItoscspsotroM it-района позволяет лредполоязггь, что эта поверхностная структура вириона имеет пркшэшкальпо важзое значение для репликации альфазирусов, причем, она выполняет сходную функцию для всех исследованных альфавирусов. -
-32-.
Таблица 8. Р:эучение перекрестных взаимодействий МКА, обладающих активностью в РТГА, с различными представителями альфави-русов.
Имму- Титр в РТГА
МКА __'_ ■
ноген * **
Trd ТС-83 ВсЭЛ ВсЭЛ ЗЭЛ ВС ЕЛС ВП ВЧ Гета Аура
4Н5 вэл 640 1280 1280 2560 2560 640 5120 640 1280 10240 640
4F6 ~ЗЛ 80' 320 160 640 320 160 320 80 320 640 20
SC4. I3J! SO 12S0 160 640 20 20 1280 320 320 5120 10
гг 160 640 640 640 640 320 1280 320 2560 20480 160
~Dl БЭЛ 1 ЦП ■'■on S20 640 320 40 640 160 1280 1280 80
7СЙ ВЭЛ 320 640 640 640 320 40 1280 80 640 1280 80
7AS ЗЭЛ 160 1280 320 320 320 * 80 1280 40 320 1280 80
ЗЕ11 юл 320 320
В12 вэл 640 640
5Д10 ВЭЛ 640
5Е7 ВЭЛ 1280
5А12 .БЭЛ' 40 - - • - - -
2Д4 БЭЛ 160 -- - - - - - ' - -
Ш ВсЭЛ - - 1280 1280
1F3 ЕсЭЛ - - 20 320 ' - -■-.-. - ' -5Н5 ВсЭД - 2580-20480 ' - - - - - ' -
2НЗ ВсЭЛ 320 1280 320 1280 2560 2560 2560 1280 5120 2560 20
Примечания: титры в РТГА приведены в обратных величинах, "-" означает титр в РТГА менее 10. * ВсЭЛ - южный вариант вируса ЕсЭЛ,, ** ВсЭЛ - штамм Виргиния этого же вируса, ЗЭЛ - Западный энцефаломиелит лошадей, ЕС - вирус Синдбис, ВЛС - вирус Леса Сем-лики, ВП - вирус Пиксуна, ВЧ - вирус Чикунгунья.
До настоящего времени К-район белка Е2 не был описан, хотя известны достаточно обширные коллекции МКА к различным альфави-' русам. Ранее, аналогичный по функции эпитоп Eld, обеспечивающий
группоспецифичный перекрест в ELISA, Оыл картирован на гдкколро-те.чне Е1 вируса ЗЭЛ. ЫКА к атому эпитопу обладали также актив-костью в РТГА по отношению к гомологичному вирусу ( Hunt апс Rcehrig, 1985). Вопрос о пространственных взаимоотношениях эпите-¡1 a Eld и К-района остается открытым, однако их функциональная схолесть позволяет предположить, что зпитоп Eld мотет располагаться в непосредственной близости от К-райояа белка Е2. Полненные результаты показывают схожесть антигенной организации гликсп-ротеинов Е1 и Е2 вирусов БЭЛ и ВсЭЛ и отличие данных вирусов от альфавируссв двух других антигенных комплексов, заключающиеся в несколько иной роли гликопротеинов Е1 и Е2.
У типичных представителей двух других антигенных комплексов альфавирусов - комплексов ЗЭЛ и леса Семлики - функциональная нагружеяпость поверхностных гликопротеинов представляется несколько другой. Адагигеютглюгинврукззя.активность ассоциируется с белком Е1, кейгралазудая и протеетивная - с Е2.
Ери исследовании глжонрагекна Е1 вируса ВсЭЛ нам не удалось обнаружить :5А, тормозящих гег.:аггллг'ИнацЕй, хотя, по данным конкурентке го анализа, было, ¡гартнроьано не менее четырех взаимноке-перекрь^свдгхся антигенных сайтов па молекуле ' глнкопротенпа Е1. Tcic.vj у !ША к белку Е1 отсутствовала нейтрализующая и протеетивная активность. Сходные результаты были получены к при исследовании 6e.ira El гаруса -Е91, на котором удалось картировать сод.».-одна йнйюн, синтез протектизкых антитез
Сравнивая функциональную с-ргавкзецзд гликсвротвш* FZ г;-гус-о» Г2Л и БсЗЛ, уйлыжщхс?. типичными представителями равя'ла? .чнтга-акккх К0!л:,т!р!СС0Б, лкгкс заметить некоторые ofiE-ie зькокоме!-йос'ги, отлачаодае их от других альфавпрусоЕ. Девйгкадцажг йг-Е2-специфичных ША реагирует с обоими вирусами. У обеих, вкруесг функциональная активность (нейтрагиеация, протекция is актнгенег:-лйггшируквдэн активность) ассоциируется, в основном, с трем:; cal-тaci, частично перекрывакднмпся ме)<;ду собой и образуацяин единую структуру. 3 этой области выделяется К-райсн (сайт Е2-1), оСеспе-чнваявдй перекрест в РТГА всех исследованных альфавкрусов• и район, аналогичный эпитопу Е2-2а у вируса ВсЭЛ. и эпигона»,! Е2-ба вируса вэл. над к этим эпигонам обладают чрезвычайно . вкраязннкм протекткЕНЫм эффектом (более 95% суммарной активности всех }Щ),
- 24 - '
высокой активностью в реакции нейтрализации и РТГА. И * наконец, оба вируса имеют в своей структуре сайт Е2-4, обращающий на себя внимание своей иммунодоминантностью. ■ К этим сайтам получено наибольшее количество гибридом, они непосредственно примыкают к функционально активному району и вааимодействие с ниш ША не влияет.на функцию гликопротеина Е2.
Еаретфозаяш аязигемзЕй" р&гвр&таня сайхоз кгруссзз ЕЭЛ и ЕсЭЛ дутеы шлучеккя аеткгаш&к ыутанмв, устойЧизгзс-tt -дййспкгз-не&гралгзугйзгг ы гфотегегггагьк • шшшюв -акгаган. -
Следующим большим этапом нашей работы была попытка картировать на геноме вирусов антигенные детерминанты гликопротеинов El и Е2 непосредственно участвующие-в формировании противовирусного иммунитета. С этой целью были проведены попытки экспериментального картирования по трем основным направлениям:
- Получение антигенных мутантов вирусов БЭЛ и ВсЗЛ, устойчивых к нейтрализующему действию МКА в опытах in vitro или к про-тективному действию МКА в опытах in vivo.
- Проведение экспериментов1 по. взаимодействию МКА с фрагментами белка Е2, полученных генно-инженерным способом. -
- Химический синтез пептидов,- моделирующих-антигенные детерминанты белка Е2 вируса БЭЛ, с последующей проверкой взаимодействия их с панелью МКА и поликлональными антисыворотками.
Суть картирования через ограниченную ■ фрагментацию вирусных гликопротеинов нам представлялся проблематичными,, ■ так как он' был экспериментально опробован и . не принес значительного- успеха (Roehrig et al.-, 1982b; Roehrig & Mathews, 1985). .Из полученных фрагментов.реагировал с МКА только пептид с молекулярным- весом порядка 14 кд. Более мелкие пептиды теряли взаимодействие с антителами.
Анализ аминокислотной последовательности поверхностных гликопротеинов El и Е2 с целью выявления участков белков, служащих потенциальными антигенными детерминантами, в сочетании.с данными по картированию антигенных мутаций послужил нам исходными данными по синтезу пептидов. Хэчется отдельно упомянуть о попытке картирования -зпитопов связывания перекрестно реагирующих антител, вза-имодействуюших с вирусами КЗ, ВЭЛ и ВсЭЛ. Сопоставление первичных
последовательностей вирусов ВЭЛ, ВсЭЛ и КЭ показало, что тройной .перекрест может допустить для вируса КЭ только одна непрерывная последовательность от 164 до 204 аминокислотного остатка белка Е, а для альфавирусов данный район распадается на два дискретных района от 198 до 222 а. о. и от 285 - 297 а о. белка El вируса ВЭЛ. Это позволяет сказать, . что в некоторых случаях возможно картирование таких перекрестно реагирующих детерминант методами анализа первичных структур этих белков. Хотя существует довольно много ограничений для проведения подобного сопоставления, но в случае перекрестно реагирующих антител, необладаздих вируснейтрализугацей или протективной активностью, этот метод молит быть альтернативой при попытках картирования эпигонов связывания этих антител.
С помощью нейтрализующих и протективных МКА была получена коллекция из ■ 13 антигенных вариантов вируса ЮЛ и 2 АВ вируса ВсЭЛ, резистентных к действию этих.-МКА.. Селекция с помощью протективных антител была проведена на беспородных белых мышах. Использование селекции in vivo позволило картировать расположение эпитопов, связанных с синтезом протективных антител. Секвенирование генов белков El и Е2 показано наличие точечных аминокислотных замен, представленных в таблидё 9. Было локализовало для вируса ВЭЛ той сайта белка Е2 (57-50 а о., 232 а о., 182-216 а. о.) и один на белке Е1(205 . а о.). Два из трех районов на белке Е2 связаны с процессом нейтрализации инфекционности вируса ЮЛ. Для вируса ВсЭЛ картировано два " сайта на белке Е2, вовлеченных в реакции; нейтрализации вирусной инфекционности. С этим процессом оказались-связаны аминокислотные остатки 72 и 116 (сайг Е2-2) и 272 (сайт Е2-3).
На белке Е2 вируса ВЭЛ было картировано 13 мутаций и на белке El одна мутация. Нетрудно заметить, что мутации на белке Ег можно сгрупирозать на две большие группы, расположенные в районе 60 а. о. и 180 - 216 а о., и отдельно лежалая мутация в 232. поло-Ксении.
На топологической карте антигенной структуры гликоппотеина Е2 (Рис. 1) можно легко заметить, что зпитопы связывания использованных для селекции MEA-расположены достаточно близко друг от друга Это говорит о том, что районы 50 - 60 а о., 180 - 216 а о.
и 232 а. о. бежа Е2 расположены достаточно близко .между собой локализуются, по всей вероятности, -в области верхушки шпика ге-теродимера El - Е2 вириона вируса ВЗЛ. В непосредственной близости к "данному району примыкает эпигон .связывания МКА ■ 8Д2. Это предположение,- можно сделать на основе взаимного влияния МКА 7А6"' H-8D2. Таким образом/, можно, высказать гипотезу, что'в функционально активные районы гетеродимера Е1 - Е2- входят аминокислотные остатки 50 - 60, 180 - 216 и 232 белка Е2 и район 200 - 210 остатков белка Е1.
Таблица 9. Расположение- мутаций у антигенных вариантов вируса ВЭЛ.
вариант Вирусный Мутация Аминокислотная Позиция на Эпитоп штамм замена бедке Б2
Антигенные варианты подучены при помоши нейтрализующего эффекта на культуре клеток (in vitro)
АВ.В12 АВ.Е8 АВ. 2D4 i АВ. 2D4 AR B12+2D4
АВ. 5 Al 2
ТС-83
230
ТС-83
Trd
ТС-83
Trd
ТСС -> TAC
ААС AAS AAG ТСС AAG ТСС AGC
GAC GAG ААС TAC GAG ТТС AGA
S -> Y N -> S К--> Е К -> N S -У Y К -> Е S -> F S -> R
57 60 213 213 ■ 57 ' 213180 182
Антигенные варианты получены при помощи протективных :МКА . беспородных белых мышах (in vivo)
E2r2a. E2-2b E2-6b -E2-6b E2-2a E2-6b E2-6d ' E2-6d на
АВ.В12 " ; ... Trd TCC -> TTC . ; -s ~> F 57 E2-2a
АВ. 7D1 . -. " Trd GGC -> GAC . . G -> D 59 E2-2c
А& 2D4 \ ", '.Trd ACA -> CCA . T -> P 214 E2-6b
дазЕи . Trd CAG -> CCG-. : Q P 216 E2-6a
АБ. 7А6 Trd CAG -> GAS Q -> R 232 E2-3d
АВ. 8D2 - Trd GAA -> AAA R -> К 206 El-la
Примечания: Аминокислоты приведены в. однобуквенном обозначении.
Понятно, что дачная гипотеза верна при условии, что локализованные мутации расположены в зпитопах, с которыми связываются МКА, использованные для получения этих мутантов. Поскольку эпито-пы вируса ВЭЛ достаточно устойчивы к обработке денатурирующими агентами, можно было предположить, что мы имеем дело с. линейными детерминантами, мало подверженными конформацконяым шипениям.
Однако, ряд фактов указывал, что ш имеем дел? с более сложным явлением, чем представлялось нам ранее. Так •«•огке мутации -попадают в районы непредсказанные на основе теоретического аяали-за аминокислотной последовательности. Более того, замены в положении 213, 214 и 216 белка Е2 расположены • в районе сайта гликози-лирования а, по всей вероятности, не должны быть доступны для взаимодействия с МКА.
Замена, возникавшая" под действием МКА- 7Д1 в 59 положении белка 1£, тага»,' видимо, не 'связана с-, эпитопом, который узнает данное 1Ш. ША 7Д1 перекрестно взаимодействует -с вирусом ВсЭЛ, но аминокислотная последовательность в этом 'районе у вирусов ВЭЛ и, БсЗЛ различна. Некоторые "другие факты рассмотренные в диссерта- ' дяонной работе, тага® подтверждают предположение, что- мутации в виз? указанных районах изменяет конфор.чацию антигенных детерми-' нант, расположенных в стороне от 'этих районов. "
' Попытка локализации антигенных-детерминант на вирусе"ВЭЛ для МКА 701 и 7А6, реагирующих с К-районом аль-фавирусов, показала наличие замен а. о. фекилаяанина в 232 положении белка Е2 на аргинин для АВ 7А6 и а. о. глутамина на аспарагин в 59 положении для АЕ 701. Вовлечение 59 и 232 аминокислоты в формирование К района говорит, по всей вероятности, о том что он формируется аминокислотными остатками двух различных участков аминокислотной цепи белка Е2. Данное предположение подтверждается стерической близостью сайтов Е2-2 и Е2-3 вируса ВЭЛ, конформацконной неустойчивостью ряда эпигонов К-района к обработке денатурируидянн агентами и картированием в районе'207 - 214 а о.' белка Е2 сайта Ё2-6. К сожалению, более подробно картировать К-район путем получения более обширной коллекций антигенных вариантов нам не удалось из-за относительно невысокого уровня нейтрализующей и протектизной активности остальных ЫКА к К-району. ' ■ \ : ;'.'."
- Картированные мутации располагаются в достаточно далеко ,
расположенных районах белка Е2,- а мутация в районе 59 .а о., вызываемая МКА 7D1, расположена рядом с мутациями вызываемыми МКА.В12, и Е8. Эти МКА также распознают сайт 2 белка Е2 и вызывают мутации в положении 57 и 60. Картирование сайта 6 белка Е2. вируса БЭЛ показало, что этот район связан с 180-216 а а и также вызывает образование антигемагглютинируюших антител. Это подтверждается данными оаубликоваными-Johnson et а!., в 1990.г по' картированию анти- ' генной мутации вируса ВЭЛ в положении- 207, вызываемой антигемагг-лютинизугаими МКА.
Совокупность вышеприведенных . данных говорит о схожести аространственноя организации белка Е2 у различных - представителей альфавирусов. Ло веек вероятности, можно выделить два домена,■играющих биологически важную роль: первый связан с аминокислотными мутациями в районе 50 - 60 а о. , второй с мутациями.в районе 180 - ¿20 а о. йартированный нами К-оайон, видимо, является переход-, ным медду ними, и формируется из- аминокислотных- остатков двух цепей, участвующих в■организации этих двуг доменов. Причем, эти домены имеют пространственную структуру, характерную для каждого представителя альфавирусов, а К-район, связанный с этими доменами сохраняет строго консервативную пространственную-структуру. К сожалению, данные, полученные при исследовании вируса ВсЭЛ и картированию сайтов Е2-2 и - Е2-3 этого вируса, . не полностью укладьша- ; ются в выскааанное предположение. K-район вируса ВсЭЛ полностью сохраняется, но биологическая активность, связанная с сайгами Е2-2 и Е2-3, ассоциируется с аминокислотными.остатками в положении 72, 116 и 272. Эти результаты показывают своеобразие данного вируса и говорят о том. что требуется дальнейшее изучение пространственной организации поверхностных гликопротеинов различных представителей альфавирусов. Вышеизложенное по поводу роли особенностей первичной структуры вирусных белков.в формировании антигенных детерминант еще раз подчеркивает сложность взаимодействия виоуса с организмом хозяина,, даже на уровне гуморального китята. Необходимо таклее отметить, что трактовка локализации мутаций,. приводящих к изменению первичной структуры бел-лагере свойства связывания с МКА, как однозначное свидетельство расположения зпитспа связывания МКА,- требует большой аккуратности. 'Особенно это касается данных, полученных с помо^ьп
МКА ic нелинейным эпмтопам. Прямое указание на локализацию антигенных детерминант может быть получено лишь при анализе комплекса данных, среди которых основную роль могли бы сыграть результаты рентгеноструктурного исследования кристаллов вирусных белков с МКА или их фрагментами.
Картирована-антигенные детерйэжант сайтов Е2-2 и Е2-6 вируса ВЭЛ при 1к»гоан паитвдов.
Для более точного картирования антигенных детерминант и подтверждения результатов, полученных при помоеи антигенных ваои-антов, нами была предпринята попытка локализации эпитопов связывания антител с помощью химически синтезированных пептидов. Для этого была выбрана область 30-75 а-о. и 202-250 а о. белка Б2 вируса ВЭЛ. Еыбор данных районов был обусловлен рядом соображений:
Во-первых, в этих районах располагались мутации у антигенных вариантов вируса ВЭЛ,
Во-вторых, МКА» использованные для селекции антигенных вариантов, распознавали два различных антигенных сайта и обладали способностью нейтрализовать вирусную инфекционность и. защшпзли животных от заражения вирулентным штаммом вируса ВЭЛ"
- В-третьих, ■ данные два района состоят из достаточно гидрофильных аминокислот и могут претендовать на роль антигенных детерминант.
В-четвертых, пептиды VE2pep02 (21-45 а о.), VE2pep03 (41-65 а. о.), VE2pepll (201-225 а о.) и VE2pepl2 (221-245 а. о.), полученные и исследованные Hunt et al. (1990) не взаимодействовали с гипериммуной мышиной асцитической жидкостью к вирусу ВЭЛ (штамм ТС-83), а именно в этой области и располагаются мутации, картированные нами.
Было синтезировано В пептидов. Последовательность этих пептидов ступенчато перекрывала районы 30-75 аминокислотных остатков и 202-250 а. о. белка Е2 вируса ВЗЛ, ■ в которых были картированы антигенные мутации, вызываемые ША к сайтам Е2-2 и Е2-6 (Рис. 4). Ни один из синтезированных пептидов не взаимодействовал в иммуно-ферментном анализе с панелью из 17 ША к белку Е2 вируса ВЭЛ. Однако, большинство пептидов взаимодействовали с подикжшальной антивирусной сывороткой, а два. из них индуцировали появление анти-
т
Ев -1 1 «— В12
20 30 40 ' 50 I 11 70
вал - ксАУаэснзр 1А1Еаукз1ю ниоэт^шаБ Бсшииззан шжгаошж
ВсЭЛ - ' К.ОНЗК.Я......Е.ЛО.А .А.УХЛ... АЫР..КИ).У СШЫЗИШЗ
Титр (ИВА) Пептиды
1000 ЕАУКЗБО ШХНТС
320 а НЕСШШЭЕЗС
во тнюгз езгоьс
■--.о техлззаи ьгангс •
-с оу никтшетс
-■-Г-.' ... _ .
722 - зссоткхзег икткакзас тклезска'/н 1ШШтК5 ЕКЕ?КАА0А1 253 - к-рзтевсуг. оевуртт—с .втк.....г 12.к......он.. коз.!'.
Титр (КФА) Пептид:
1 боо ссатнБяг ппсжагБас 2оо с тккЕаслш? ъ
1боо (3200 а антнвсэл сывороткой) ж ьоншятнз бкхо
1боо ( <50 с аятиВсЭЛ сывороткой)' шз схьркаасатс
Рис. 4 Сравнение аминокислотной последовательности вирусов ВЭЛ
и ВсЭЛ. Взаимодействие пептидов' с антивирусной' сывороткой в ИФА.
-- - подчеркнуты гомологичные фрагменты белка Е2.
- подчеркнута аминокислотная последовательность
пэрекрэстно-рвагируюизго, линейного эпитопа 229-243.
Стрелочка:® указана каста мутация вызываемые КЖА.
вирусных антител. Сайт Е2-2 , по всей вероятности, связан с аминокислотными остатками 30-45, а район 57-62 а. о. белка Е2, в котором наблюдаются антигенные мутации, не является антигенной де-терминантой линейного типа, а участвует в формировании антигенных детерминант конформационного типа. Картирование района 202-250 а. о. показало, что в этом районе все пептиды хорошо распознаются антивирусной поликлональной сывороткой. Показано, что остатки 235-240 формируют линейный эпитоп, обеспечивающий перекрест между вирусами ЮЛ и ВсЭЛ, и нераспознаюпщйся 19 видами перекрестно-реагирующих с вирусами БЭЛ и ВсЭЛ моноклональных антител.
Полученные результаты лишь частично подтверждают данные, полученные Hunt et al. (1990), которым не удалось показать наличие взаимодействия пептидов к данным районам с антителами против штамма ТС-S3 вируса 'ВЭЛ, хотя гипериммуные асцитические жидкости к некоторым другим представителям вирусов комплекса ВЭЛ реагировали с этими пептидами. Это несовпадение может объясняться рядом методических особенностей при проведении экспериментов. В наших экспериментам мы использовали значительно более короткие пептиды, ксньюгированные с носителем и состоящие, как правило, . из 11-14 остатков. Американские авторы для проведения ELISA" использовали пептиды в свободном состоянии, состоящие из 25 аминокислотных остаткоз. Иммобилизация пептида на носитель могла несколько изменить его конформащда и обеспечить наличие взаимодействия с антивирусными антителами. Использование свободных пептидов для проведения твердофазной ELISA, в случае' коротких пептидов, нам представлялось некорректным, ввиду их резко различной растворимости и способности сорбироваться на твердой фазе полистироловьп: микроплат.
Так как использованные нами пептиды были значительно короче, чем использовали Hunt et al. (1990), тс в районе 34-70 нам удалось легко выделить "активный центр", с которым связана основная часть иммуногенной и антигенной активности данного района. Она связана с пептидом 34-45 'а. о. , с которым ассоциируется, приблизительно, две трети этой активности и который справедливо можно считать центром данного района. ' . "
К сожалению, в результате проведенного исследования не удалось получить прямых доказательств, говорящих о том, что пептид
34-45 а.о. является центром сайта Е2-2 гликопротеина Е2. Однако, данные Hunt et al. (1990) показывают, что на протяжении первых 245 а. о. белка Е2 основная антигенная и иммуногенная активность связана с районами 1-25 а. о. и 141-165 а. о., а район 81-121 а о. практически не опознается гипериммуными асцитическими жидкостями, полученными к различным представителям вирусов серокомплекса ЕЭЛ. Район 1-25 а о. на основе данных по количественной (93%) конкуренции между антипептидной сывороткой и МКА 534D-6 могшо связать с эпктопом Е2а Антитела к данному району полностью лишены какой либо биологической активности и это позволяет утверждать. что зпитоп S2a не идентичен сайту Е2-2 (по нашей классификации). Эти соображения позволяют считать, что район 34-45 а о. на псотягзкий :Н>рвьа 1-Ю остатков белка S2 является наиболее вероятным кандида-гсм а центр сайта £2-2.
Проверка ззаимодейетвия МКА к основным сайтам гликопротеина Е2 вируса ВЭЯ с рекомбикачтным полипептидом, содержали 1-173 а о. Золка Е2 показала, что с ним взаимодействуют АйА 1, 2, 4 и 5 сайту и поликлональнач антивирусная сыворотка Это подтверждает наш данные о тем, что этот сайт Е2-2 располагается в начале белка Е2. К сожалению, картирование сайтов 1, 4 и 5 оразалось невозможным, так как МКА к этим сайта лишены биологической активности к не реагировали с полученными пептидами. Дальнейший синтез пептидов для картирования этих детерминант нам представлялся не перспективным в свете . полученных нами данных ко связыванию МКА с пептидами к опыту американских исследователей, таете синтезировавших келтиды и не получивших связызанин с ША. Следует отметить, что к сайтам Е2-1 и Е2-5 .было получено всего по одному виду- МКА. Это говорит об их относительно низкой иымуногенностк, • что нельзя сказать об эпитопах. сайта Е2-4, к которым получено -основная касса ША, кеоб-ладащих- протектквной активностью.
Насколько иная картина наблюдалась в относе кии другого исследуемого начя гкдро&кьного района балка Е2 - района 202-250 а о. Три из четырех пептидов вза5заэД8йс?вукг? в высоком титре с кроличьей антивирусной сывороткой (ВЗЛ, ТС-83), а па данным Hunt c-t al. (1990) пептиды этого района не взаимодействуй? анти ТС-83 аоцитами, несмотря на свои значительно больсие размера Пептид VE2pepl2 (221-245); полученный Hunt et al. (1980), вызывает пеяв-
ления антивирусных антител в низком титре 1: 40 - 1:100, а пептид?
. 229-243 а. о. , ■ полученный наш и имевший значительно меньшие размеры, дает появление антивирусных антител е титре 1:3000.
Антипептидная антисыворотка к пептиду 229-243 не обладала вируснейтрализуюдей и антигемагглэтинирующей активностью, характерной для сайта б вируса ВЭЛ. Для уточнения локализации райопг, 229-243 а. о. на карте антигенной структуры белка Е2 была проведена конкуренция меченой анткпептидной сыворотки с панелью МКА к основным сайтам белка Е2 за зпитоп связывания на нативной молекуле белка Е2. ' Было обнаружено, что дачная антипептидная сыворотка не конкурирует ни с одним из исследованных НКА к белку 22 вируса ГОЛ. Это позволило высказать предположение, что район 229-243 а. о. является отдельным антигенным сайтом и не имеет отношения к сайту Е2-6,вируса ВЭЛ. Это новый седьмой сайт на белке Е2 и он не распознается имеющимися в нашем распоряжении ШСА к вирусу ВЭЛ. Дополнительная проверка взаимной конкуренции антипептидных меченых антител с 9 типами 1-ЯА к . вирусу ВсЭЛ, перекрестно реагирующих с вирусом ВЭЛ, тага® показала отсутствие конкуренции.
выводы- •-■'•;
1. Создан банк гибридом ЕЛО "Вектор" в котором депонированы гибридомы к следующим вирусам и антигенам: 32 гибридомьг к вирусу венесуэльского энцефаломиелита лошадей, в том числе 23 крысиных и 9 мышиных гибридом; 34 гибридомы к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей, в том числе 17 крысиных и 17 мышиных гибридом; 1с гибридом к вирусу клещевого гицефалит^, получв'з^чп' на основб шкных миеломных линий; 7 гибридом к белку р24 вируса иммунодефицита человека 1 типа, в том числе 4 мьшннх и 3 кшсилых гиСркдг-мы; 5 гибридом к ортогтоксвирусам, в том числе 4 крысиных гибриде-мы к вирусу эктромелии и одна мышиная гибридома к вирусу оспы обезьян; б крысиных гибридом к вирусу полиомиелита, тип 2; 3 крысиных гибридом к вирусу гепатита В; 11 мышиных гибридом к шести различным формам ци'тохрома Р-450. Составлен каталог, вклк>-чаюшцй в себя данные о 113 гибридомах, секретируюдих ЫКА к различным антигенам. Клеточные линии, • включенные в него, изучены в р соответствии с требованиями, сформулированными во Всесоюзном паспорте гибридных клеточных линий.. Проведено депонирование с па-'
рентными целями 14 гибридных клеточных линий, в том числе во Всесоюзной коллекции культур клеток 10 клеточных линий.
2. Впервые получена коллекция из 8 гибридом, секретируюших мо- -ноклональные антитела к гликопротеину El вируса ВЭЛ, изучена ан- тигенная .структура данного белка и показана схожесть антигенной ■ структуры трех штаммов: Тринидад, ТС-83 и 230.вируса ВЭЛ. Предложена карта, антигенной структуры гликопротеина El, включающая в. себя 5 сайтов, объединяющих 8 эпйтопов связывания MRA. . Сайт El-1 обеспечивает индукцию протективных антител и тем самым активно участвует в формировании противовирусного иммунитета и совместно с эпитопами сайтов Е1-3 и Е1-5 обеспечивает антигенный перекрест вируса ВЭЛ и ВсЭЛ. Причем зпитопы Е1-Ба,Ь,с антигенно схожи с детерминантами белка Е Еируса КЭ.
3. ГЬлучена наиболее полная, из известных на настоящее время, ;<оллекция гибридом, секретирующих ЩА к гликопротеину Е2 вируса ЗЗЛ. В нее включено 24 гибридомы мышиного и крысиного происхождения. Изучена антигенная структура этого бэлка, предложена карта антигенной структуры гликопротеина Е2, включающая в себя 6 сайтов, объединяющих 21 эпитоп связывания ША. Эпитопы сайтов Е2-2 и Е2-6 связаны с нейтрализацией вируса ВЭЛ и совместно.с эпитопами сайта Е2-3 вовлечены в реакцию торможения гемагглютинации. МКА к остальным сайтам белка Е2 не проявляет биологической активности.. Показана принципиально' важная роль гликопротеина Е2 в формировании противовирусного иммунитета Впервые выявлено 13 эпйтопов индуцирующих синтез-.протективных антител и, тем самым, -непосредственно участвующих в формировании противовирусного иммунитета Один из них локализован на белке El, а остальные 12 на гликопротеина JS2 вируса ВЭЛ. :
4..На . гликопротеине Е вируса КЗ обнаружено не менее двух групп перекрестно реагирующих эпйтопов, один из которых обеспечивает перекрестные реакции внутри серокомплекса вируса КЗ, а другой между альфа и флавивирусами. Сопоставление аминокислотных последовательностей вирусов ВЭЛ, ВсЭЛ и КЭ показало, что только одна непрерывная последовательность от 164 до 204 аминокислотного остатка белка Е может допустить этот тройной перекрест. Лля аль-фавирусов данный район распадается на. два дискретных района от 1S8 до £22 а. о. и от 285 - 297 а; о. белка El вируса ВЗЛ.
5. . Впервые создана классификация антигенных сайтов и эпитопов, построены карты антигенной структуры поверхностных гликопро-теинов вируса ВсЭЛ На гликопротеине Е1 картировано 4 неперекры-
. вающихся .антигенных сайта На гликоупротеине Е2 картировано 7 частично перекрывающихся антигенных сайтов, 4 из которых индуцируют МКА, активные в биологических реакциях. Эти 4 сайта расположены в виде единой, частично перекрывающейся структуры, на поверхности гликопротеина Е2. Исследована функциональная нагружен-ность вирусных гликопротеинов. Впервые установлено, что нейтрализующие,. тормозящие гемагглютинацию и протективные антитела индуцируются антигенными детерминантами гликопротеина Е2 вируса' ВсВЛ
6. Впервые обнаружены значительные антигенные'. отличия от штамма ТгсЗ у гликопротеина Е2 штамма ТС-83 и особенно штамма 230. Данные изменения касаются только эпитопов, индуцирующих, синтез протективных антител. Из 13 идентифицированных эпитопов ответственных за формирование протективных моноклональяых антител, у штамма ТС-83 изменено три, а у 230 штамма - шесть эпитопов в составе 2 сайтов. Полученные результаты говорят о необходимости дальнейшего совершенствования имеющихся вакцинных препаратов против этого опасного инфекционного заболевания. ' " . -
' 7. С помощью панели из 17 моноклональных. антител, блокирующих реакцию гемагглютинации, изучены рецепторные области вирусов ВЭЛ и ВсЭЛ, обеспечивающих взаимодействие • вирионов с клеткой. Показана доминирующей роль гликопротеина Е2 вирусов ВЭЛ. и ВсЭЛ в формировании вирусного рецептора, взаимодействующего с мембраной эритроцита. В рецепторной области с помошью конкурентного радиоимму-ноанализа выделено 3 антигенных сайта Эти сайты участвуют в реакциях вируснейтрализации и моноклональные антитела к этим районам защишдют беспородных белых мышей от летальной инфекции. Впервые установлено наличие на белке Е2 вирусов ВсЭЛ и ВЭЛ консервативного участка (К-района), формирующего перекрестнореагируюгие антитела, тормозящие гемагглютинацию у типичных представителей четырех антигенных комплексов, альфавирусов, таких гак: вирусы Западного энцефаломиелита, лошадей. Леса Семлики, Снндбис, Гета, Аура, Чикунгунья, Шксуна . •■
8. Селекцией с помощью нейтрализующее и протективных конок-, лональных антител, взаимодействующих различными районами гликоп-
ротеинов £1 и Б2 вируса ВЭЛ и ВсЭЛ, получено 13 антигенных вариантов вируса ВЭЛ и 2 АВ вируса ВсЭЛ Антигенные варианты приобрели резистентность нейтрализующему или протективному действию МКА, использованных для селекции и, как правило, утратили способность взаимодействовать в иммуноферментном анализе с моноклональными антителами, используемыми для их получения. Определение первичной структуры генов белков Е1 и Е2, полученных вариантов, показало наличие точечных аминокислотных замен. Это позволило локализовать для вируса ЮЛ три сайта белка Е2 (57-60 а о., 232 а о., 182-216 а о.) и один на белке Е1(205 ас.). Два из трех районов на белке 52 связаны с процессом нейтрализации инфекционности вируса ВЭЛ. .Зля аивуса ВсЭЛ картировано два сайта на белке Е2, вовлеченных в реакцию нейтрализации вирусной инфекционности. С сайтом 22-2 оказались связаны аминокислотные остатки 72 и 116, а с сайтом Е2-3 -272 а. о.. Путем секвенирования гена белка Е2 антигенных вариантов, избегающих протективдаго действия УНА к К-району, показано участие аминокислотных остатков 59 и 232 в формировании К-района, что говорит .о формировании сайта Е2-3 двумя различными участками яолипептидной цепи белка Е2.
9. Для более детального картирования двух наиболее интересны;-: сайтов вируса ВЭЛ - сайтов Е2-2 и Е2-6, ответственных за формирование протективных, вируснейтр&газувдах_и блоютруювох гемагглотп-нацию антител, были синтезированы и изучены 9 пептидов. Ни один из синтезированных пептидов' на взаимодействовал в иммуноферментном анализе с панелью ка-17 Ш'к белку Е2 вируса ВЭЛ.' Однако большинство пептидов взаимодействовали с поликлойальной антивирусной сывороткой, а два из .них индуцировала ■ появление- антивирусных антител. Сайт Е'2-2 , по всей вероятности, связан с амлнз-кислотныш остаткам: 30-45, а район 57-52 а. о. бзлкз. Е2, с котором наблюдаются антигенные мутация, нз является антигенной детер-кгаантой линейного типа, а участвует в формировании антигенных детерминант конформационного типа. Картирование района 202-250 а о. показал», что в этом районе все пептиды хорошо распознаются антивирусной полигональной сывороткой. Впервые показано, что аминокислотные остатки 235-240 гл1гкопротеина Е2' формируют линейный элитоп, обеспзчиваЮы?1й перекрест между вирусам: ВЭЛ и ЕсЭЛ, и ;;е распознавшийся 19 видами перекрестно-реагирующих с вирусами
БЭЛ и ВсЭЛ моноклональных антител.
язучшк- работ, С'Публйиозазз&н ш теме диссертация:
1. Агапов К. Ь. , Лебедева С. Л. , Разумов НА., Фоолов ЛЬ., Ксл^-халоэ А. А. , Нетесов С. В. , Локтев В. Б. (1990) Картирование В-клеточных детерминант гликопротеина Е2 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей при помечая моноклональных антител. Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита, Тез. докладов Всесоюзного симпозиума., Иркутск, 1990, с. 16.
2. Агапов Е. В. , Лебедева С. Д., Разумов И. А., Фролов' Я В., Колы-халов А. А. , Локтев В. В., Нетесов С. Е , Сандахчиев Л С.
(1991) Варианты вируса ВЭЛ, резистентные к нейтрализующему действию шноклональных антител, Доклады Академии наук СССР 320, N б, с. 1485 -148S.
3. Волчков Е Е., Волчкова Е А., Колыхалов - А. А. , Фролов И. Е , Локтев ЕЕ, Нетесов С. Е (1980) Полная -нуклеотидная последовательность генома вируса восточного энцефаломиелита лошадей, Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита, Тез. докладов Всесоюзного симпозиума., Иркутск 1990, с. 16.
■ 4. Гайдадавич С. Я. , • Локтез Е В. , Лаврова Е А., }даксютов А. 3., Мельникова Е. Е., Перебоев А. Е , Протопопова Е. Е . Разумов II А., Свешникова а А., Хусаинова А. Д. (1990)' Яоноклональные антитела перекрестно' реагирующие с вирусом клещевого к вирусом венесуэльского энцефаломиелита лошадей, Вопр. вирусологи;:. О,
5. Казачинская Е. 31, Конакова .В. В. , Святченко В. А. . rasyj«г.а И. А. . Локтев ЕВ. (199Г) Изучение и характеризация гибридом, сек-ретирукщих моноклональные антитела к вирусу гепатита А. Оценка возможности их использования в диагностических системах, в Клиническая "и экспериментальная фармакология, Новые материалы и методы в медицине, Материала международной конференции студентов и молодых ученых, Киев, 1992, 105-106. • : .
6. Коновалов Е. Ё._, Разумов И. А. , . РаспопинЕЕ, Локтев ЕЕ (1990) Получение коллекции гибридом, продуцирующих крысиные ко-
ноклонадьные антитела к вирусу эктромелии, в Молекулярная биология и медицина, Тезисы докладов, Ленинград, 1990, с. 161. .
7. Коновалов Б. Е., Перебоев А. В., Протопопова Е. R, Локтев В. Б. (1990) Получение коллекции'гибридом, продуцирующих монокло-нальные антитела к белку Р24 вируса иммунодефицита человека 1 типа, в Современные направления создания медицинских диагностику-. мов, Москва, 1990, с. 27.
8. Коновалов Е. Е., Локтев Е Б. , Покровский А. Г., Федюк Е Е , Черных А. И., Нечаев Ю. С., Куляндин С. А., Киприянов С. М., Офицеров Е И. (1992) Изучение антигенной структуры белка р24 вируса иммунодефицита человека 1 типа при помощ моноклональных антител, Бестник. Рос. Акад. Мед. Наук, N 9-10 , 55-59.
9. Куляндин С. А., Покровский А. Г. , Коновалов Е. Е.', Локтев ЕВ. (1990) Использование моноклональных антител к белку Р24 вируса иммунодефицита человека 1 типа для иммуноаффинной очистки, белка и. тестирования антигенпродуцируюших клеток, в Современные направления создания медицинских диагнастикумов, Москва, 1990, с. 28.
10. Локтев Е В.Гайдамович С. Я , Лаврова Е А., Максютов А. 3., Мельникова Е. Е., Шребоев А. В., Протопопова Е. Е , Разумов iL А., Свешникова. ЕА., Хусаинова А. Д.' (1990) Шноклональные антитела перекрестно реагирующие с вирусом клещзвого и вирусом венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Современные проблемы зпиде-' миологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита, Тез. докладов Всесоюзного симпозиума., Иркутск, 1990, с. 7-8.
11. Локтев Е<ЕРазумов И. А., Агапов Е. В., Перебоев А.' Е,, Протопопова Е. Е, (1330) Изучение антигенной структуры гликопро-теинов El и 12 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей при поыопщ моноклональных антител, Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита, Тез. докладов Всесоюзного симпозиума.,' Иркутск, 1990, с. 18,
12. Локтев RR, Перебоев А. Е , Протопопова .Е.В , Разумов И. А. (1991) Поиск и изучение структуры гена клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита, Вторая всесоюзная конференция "Геном человека - 91" ВИНИТИ,. Москва, 1091, с. 90.
13. Локтев Е R , Святченко Е А., Перебоев. А. Е , Агапов Е. Е ,' Разумов И. А., Сабиров А. R , Мизенко- Г. А., Самуков Е Е (1992) Изучение антигенной структуры вируса ВЭЛ Картирование сайтов
. - 49 -
Е2-2 и Е2-6 гликопротеина Ё2 с помощью пептидов, в Генетика и биохимия вирулентности возбудителей 00И, Материалы Российской кок- ференции, Волгоград, 1992, с. 18.
14. Нетесов' С. К , Локтев К В., Протопопова Е. К , Хусаинова А. Д. (1992) Поиск и изучение структуры гена клеточного редептоса для вируса клещевого энцефалита. Вторая всесоюзная планово-отчетная конференция "Генная и клеточная инженерия", Мэсква, 1932. с. 40.
15. Перебоев А. К , Протопопова Е. Е , Агапов Е. К , Локтев а Б. (1990) Изучение антигенной структуры гликопротеинов Е1 и Е2 вируса ВсЭЛ при помощи моноклональных антител, в Молекулярная биология и медицина. Тезисы докладов, Ленинград, 1990, о. 160.
16. Перебоев А. Е , Волчков а Е., Протопопова Е. К , Локтев ЕВ. (1990) Изучение антигенной структуры, гликопротеинов Е1 и Е2 вируса ВсЭЛ при помощи МКА, в "Актуальные проблемы биотехнологии, Материалы второй отраслевой конференции - конкурса молодых ученых, Кольцове, 1990, с. 32. 1
17. Перебоев А. а , Агапов Е. В., Разумов- И. А., - Локтев Е Б. (1993) Патент Российской .федерации N 1671688, от 26. 02.93 по заявке N 4642737/13 от 27.01.89.. - ' ' ' ,
'18. Перебоев А. Е , Агапов Е.В., Святченко ЕА., Локтев ЕЕ (1993) Авторское свидетельство СССР N 1798372 по заявке К 487 4821/13 от 10. 07. 90, опубликовано 28. 02. 93
19. "Перебоев А. Е , Протопопова Е. Е , Агапов Е. Е , Святченко ЕА. , Разумов НА., Локтев ЕЕ. (1993) Изучение антигенной структуры гликопротеинов Е1 и Е2 вируса восточного знцфадомиелита лошадей при помощи моноклональных антител, Вопр. вирусологии, -т. 38, N 3, с. 117-122, 1995'.
20. Протопопова Е. Е , Порываева Е А. , Разумов К. А., ЛсктеЕ Е Б. (1990) Крысиные , гоноклональные 'антитела к НВэАг антигену, ,е Современные направления создания -медицинских диагностикушв, Москва, 1990, с. 38.
21. Разумов И.'А., Протопопова Е.Е , Шребоев А.Е Локтев ЕЕ (1989) Использование моноклональных антител для типирования и обнаружения антигенов вируса клещевого энцефалита, в Генная и меточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии,'
- Мат. : всесоюзной конферен., Тарту, 1989, с. 176-179.
22. Разумов К А., Агапов Е. В., Перебоев А. Е , Протопопова Е. Е Лебедеза С. Д., Локтев Е Б. (1091) Изучение антигенной структуры гликопротеина Е1 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей с помощью моноклоналъных антител, Мол. ' генет. , микробиол. и ви-русол., N. 6, 21-24.
23. Разумов И. А., Агапов Е. Е , Протопопова Е. Е , Локтев Е Е (1991) Изучение антигенной структуры альфавирусов при помощи моноклоналъных антител, в Итоги науки и техники, сер. Вирусология, т. 24, Арбовирусы и арбовирусные инфекции, под ред. Д. К. Львова, Шсква, 1991, с. 54.
24. Разумов И. А. , Агапов Е. Е , Перебоев А. Е , Протопопова Е. Е . Лебедева С. Д. . Локтев ЕЕ (1991) Изучение антигенной структуры гликопротеина Е2 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей с помошыа крысиных монокдональных антител, Вопр. ви-русол. , 36, N 1. 34-37.
25. Разумов К А., Перебоев А. Е Г Агапов Е. Е , Протопопова Е. Е , Хусаинова А. Д., Агапов Е. Е , Мельникова Е. Э., Гайдашвич. С. Я., Локтев ЕЕ (1991) Изучение рецепторной области вируса ве- ' несуэльского энцефаломиелита лошадей при помощи шноклональных . антител, Вопр. вирусол., 36, N б, 489-492.
26. Разумов И. А., Агапов Е. Е , Перебоев А. Е , Протопопова Е. Е, Лебедева С. Д., Локтев ЕВ. (1992) Изучение антигенной-структуры вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей при помощи шноклональных антител, 1. ' Получение гибридом, и антигенная структура белка. Е1,' в Итоги науки и техники, сер. Вирусология; т. 28, Арбовирусы и арбовирусные инфекции, часть' II, под.ред. Д. К. Львова, Москва, 1992, с. 66-73.
27. Разумов Я А., Агапов Е. Е, Перебоев А. Е., Протопопова' Е.В., Лебедева С. Д., 'Локтев ЕЕ ' (1992) Изучение антигенной , структуры вируса венесуэльского энцефаломиелита лоиадей при помо-
Ецг моноклоналъных антител. II. Антигенная структура белка Е2 и протективная активность моноклоналъных антител, в Итоги науки и техники, сер. Вирусология, т. 28, Арбовирусы и арбовирусные инфекции, часть II, под ред. Д.К. Львова, Москва, 1992, с. 73-80.
28. Святченко Е А., Перебоев А. Е , Агапов Е. Е , Разумов И. А. , ■ Сабиров А.Н., ¡¡¿изенко Г.А., Самуков ЕЕ, Локтев ЕВ. (1993) Изучение антигенной структуры вируса венесуэльского энцефаломиелита
лошадей. Картирование сайтов Е2-2 и Е2-5 гликопротеинз Е£ с по• мощью пептидов, Вопр. вирусол., 1993, т. 38. N 4, с. 162-1 С.
29. Федек Е В. , Коновалов Е. Е. , Локтев В. Е. , Урываев Л. В. . Еу-ляпди.ч С. А. . Покровский А. Г. (1992) Выявление и количественное определение антигенов гяпуса иммунодефицита человека типов 1 к 2. Еспв. вирусол. . 37. К 3. 135-13Е.
30. Ar-oi.ov Д. С. , Rukav 1 schn!коv M.Y. . Eelvae-v А.П. , • В. (1991) 7 he biotechnolcgical Ьазю for rranufucture cf '.от- no-generation EIA kits far the detection of HBsAg antigen anc iir antibodies, in Medical Biotechnology, Inrnunizaticn and AIDE. International conference, Abstract, Leningrad, USSR, 1991. Р2-Ю.
31. Fedyuk N. V. , Konovalov E. E. , Loktev V. B. , Urivaev L. V. . Pokrovsky A. G. (1991) Detection and quantitation of hursn inr.uncdef iciency viruses I and II antigens, in Abstract International Conference cn 'i-tolecular biology aspects of diagnostics ar.d therapy of AIDS, Novosibirsk, Akadei^jorodok, 1-5 July 1991, p. 32.
32. Fedyuk N. V. , Konovalov E..E. , Pokrovsky A. G. , Loktev V. B. , Kcvaler.ko 5. A. , Plaskin D Y. (1992) Detection and quantitation of p24 ant.sen of HIV, in Abstracts ccrssunicaticn International Syrtposiura of structure end function of repulatcrv polypeptides. Moskow, 25-30 June 1992, p, IS.
G3. Fedyuk N. V. , Konovalov E. E. , Pokrovsky A. G. , LcKtev V. E. Kovalenko Б. A. (1992) Detection of the core HIV-1 antigen P24 r>v enzyme lraunoassay [ EI A3 and immunofluorescence assay, in VIII -International Conference on AIDS/I 11 STD World congress, Amsterdam. The Netherlands, 19-24 Jule 1992, v. 3, p. 2C.
34. Loktev V. B. , Svatchenko V. A. , Agapov E. V. , Pereboev A. V. , Razumov I. A. , Sabirov A. N. , ¡.iisenko G. A. , Samukov V. V. (1991) Syntetic peptide vaccines to Venezuelan equine encephalomyelitis virus, in Medical Biotechnology, Immunization and AIDS. International conference, Abstract, Leningrad, USSR. 1991, S6-9
35. Razunpv 'I. A., .A'gapov E. V. ,' Pereboev A. V. . ProtoooDaw E. V. , Lebedeva S. D. , Loktev V. B. (1991) Investigation c: antigenic structure of attenuated and virulent Venezuelan equine encephalomyelitis virus by of monoclonal antibodies, Biomedical Science, 2, 610-615.
36. A. V. Pereboev, E. V. Agapov, V. A. Svjatchenko, I. A. Razumov, E. V. Protopopova and V. B. Loktev, (1933) Investigation of antigenic structure of Eastern Equine Encephalomyelitis virus by means of monoclonal antibodies, IX International Congress of Virology, Glasgow, Scotland, 8-13 August 1993, Abstract, Suppl. P80-39.
37. V. B. Loktev, V. A, Svyatchenko, A. V. Pereboev, E. V. Agapov, Î.À. Razumov, V. V. Sa-nukov, (1993) The study of E2-2 and E2-6 sites of E2 glycoprotein of Venezuelan Equine Encephalomyelitis virus using peptides, IX international Congress of Virology. Glasgow, Scotia" i, 8-13 August 1993, Abstract, Suppl. P80-40.
38. V. B. Loktev, I. A. Razumov, A. V. Pereboev, A. D. Khusainova, S. Ya Gaidairovich, A. A. Kolykhalov. (1993) The study of the hemagglutination activity domains of Venezuelan Equine Encephalomyelitis virus and Eastern Equine Encephalomyelitis viruses, ÎX International Congress of Virology, Glasgovi, Scotland, 8-13 August 1993, Abstrait, Suppl. P80-41.
-
Локтев, Валерий Борисович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1993
-
ВАК 03.00.06
- Анализ первичной структуры генома альфавирусов серокомплекса СИНДБИС-ЗЭЛ
- Характеристика взаимодействия моноклональных антител с различными олигомерными формами D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
- Генотипирование альфавирусов серокомплекса синдбис-западного энцефаломиелита лошадей
- Изучение антигенной структуры вируса восточного энцефаломиелита лошадей при помощи моноклональных антител
- Новые иммунодиагностические и иммунотерапевтические препараты на основе моноклональных антител
