Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение антигенной структуры вируса восточного энцефаломиелита лошадей при помощи моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение антигенной структуры вируса восточного энцефаломиелита лошадей при помощи моноклональных антител"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКШ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ НПО "ВЕКТОР".

на правах рукописи

ПЕРЕБОЕВ АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ВИРУСА ВОСТОЧНОГО ЭНдаМОЖЬШТА ЛОШАДЕЙ ПРИ ПОМОЩИ МОНОКЛОНМЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.оо.об - вирусология

л

, А ВТО РЕ ФЕ Р А Т

диссертации- на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 1992

Раоота выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной биологии НПО "Вектор".

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Б.Б.ЛоктеЕ

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук H.H. Сергеев

Кандидат биологических наук А.В.Таранин

Ведущая организация:

Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН.

Защита диссертации состоится 42- 199^ г. в час, заседании Специализированного совета К 09a.08.01 при Всесог ном научно-исследоватольском институте молекулярной биологии £ "Вектор" по адресу 633159, Новосибирская обл.. Новосибирский р-п.Кольцово.

С диссертацией мошо.ознакомиться в библиотеке Всесоюзно научно-исследовательского института молекулярной биологии.

Автореферат разослан 4S - /^n forir

Ученый секретарь Специализированного.совета ; кандидат химических наук Т.Н.Щубина

ОЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность -проблею* Вирусу ВсЗЛ уделяется значительное внимание б связи с тем. что он является весьма патогенным для человека. Летальность при этой инфекции достигает 70-75«. Зпи-г гоотки в США среди лошадей возникают практически ежегодно, ■главным соразом вдоль Атлантического побережья и Мексиканского залива. Периодически - через 10-15 лет - происходят белее или менее значительные, вспышки заболевания.

Природным резервуаром возоудителя служат прежде всего птшы, кз которых значительную часть составляют мигрирущке на большие расстояния перелетные птицы. Все это обусловливает необходимость всестороннего изучения данного возбудителя с целью разработки средств диагностики, профилактики а лечения вызываемого вирусом'.ВсЗЛ заболевания.

До настоящего времени -Эффективных средств профилактики инфекции ВсЗЛ не было создано. Имеющиеся аттенуированные птам-ш и тшактивированнне препараты не удовлетворяют требованиям надежности и безопасности для человека. Вирус ВсЬД в последние годы начинает интенсивно изучаться. Это, видимо, объясняется усилением активности вируса в природе в конце 80-х годов и возникающей опасностью появления вспышек данного заболевания. Подучены данные по первичной структуре РНК генома вируса. Однако, антигенная, структура вируса ВсЗЛ остается практически не изученной, особенно те ее аспекты, исследование которых вез-, можно лишь с.применением МАТ. Имеются лииь единичные сообщения по этому поводу. В то же. время многие альфавирусы детально исследованы с этой стороны.

В этой связи вызывает интерес изучение вируса ВсЗЛ, осо-

2 - ■

бенностэй его биологии, локализации участков вирусных белков, участвующее а формировании противовирусного иммунитета, определение антигенных связей вируса ВсЭЛ о другими, альфавирусаш.

Цель и задачи исследования При выполнении данной работы преследовалась цель изучить особенности антигенной структуры вируса ВсЭЛ. Дли этого решались следушие задачи:

- Получение и характернаация панели МАТ к вирусу ВсЭЛ;.

- Определение рели вирусных белков в формировании прсч'вовир'/сного ^лмунлтв^э í "

- Гопсдсго-функциональнсе картирование антигенных дзтер-

П032Е'ХНССТ!1Ы1С ГДИКОГТиОТ бИРСВ Е1 -I F2 *

- лзученпе -антигенных- взаимоотношений -вису са-ВсЭЛ с щ/-паи. слигззпГ'/самк.

Научная новизна и практическая ценность работы Создана коллекция гибридом, секретирущих моноклональные антитела к структурным белкам вируса ВсЭЛ* Впервые с помощью МАТ исследована антигенная структура вируса 8сЭЛ. Построена тополо-гсфункциональная карта антигенной структуры вируса ВсЭЛ. Проведано изучение антигенных взаимоотношений вируса ВсЭЛ с другими альфавирусаш. Обнаружен антигенный район, индуцирующий синтез антител, блокирующим гемагглютинацию адьфаБирусами. Полученные материалы могут быть использованы для создания высо-козффектиных диагностических средств и прсфмактических препаратов против БсЭЛ. .

Объем я структура диссертвгаш Диссертация состоит из bss-".* г:лтл глаз: обзора литературы (Глава 1), исходных мате-•.Глава г ¡. основных методов (Глава ">;, результатов

водов к списка шифруемое литературы (122 сскжсь Расст:. к:— ложена на 115 страницах машинописного текста,.включает : рг-. сунка, 9 таолкц к г щжложения.

Ашхрооацая работы Материалы диссертации докладывались ва. 2-й отраслевой конференции-конкурсе "Актуальные проблемы биотехнологии" (Кольцово, 1990г.), Всесоюзной шгадш-семшарэ "Молекулярная биология л медицина". (Ленинград, 1990г.). В завершенном виде диссертационная работа долокена не заседании научного1 семинара ВНИИ МБ 10 июня 1992 г.

Основные положения диссертации отрадны в пяти опубликованных научных работах. ' .

Использованные сокращения АТ - антителе; МАТ - монокло-нальные антитела; БсЭЛ - Воточшй энцефаломиелит лоладей; ВЗЛ

- Венесуэльский энцефаломиелит лошадей; ИЩА - ишуноферментЕКЕ анализ; РН -реакция нейтрализации; РТГА - реакция торькжения гемагглютинации; ТРИА - твердофазный радиоиммуноанаяиз; ПЭГ -полпзтиленглкколь; ГАТ - гкпоксантин, аминоптерин, тимидин; гп

- гликопротеин. ■

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАЕОТЬ!

I. Получение габрндои, скк-гезируксгн. к вирус? ВсЗЯ

Самок крыс юи ишунизировали двукратно с интервалом в две недели внутриорюшинным•введением 100 мкг очиаенного вирусь БсЭЛ в смеси с полным адъювантом Фрейкда ("Вадга"). За I дня до слияния внутривенно вводили 50 мкг вируса, суспешгарованяо-го в.физрастворе... Самок-мшзея вахв/оиммунизировали ко таксе ве схеме, но ввдтркбрмйшно вводили 50 мкг, а внутрквейно зо №<г вируса.

Иммунные спленоциты. смешивали с клетками миеломы y-з или iis-1, соответственно виду животного, в соотношения 1:5. Смесь клеток обрабатывали 50% раствором ПЭГ 2СОО ("Merck") и распределяли в 9б-луночные культуральные микроплайшеты в селективной среде ГАТ. -Культурапьную среду лунок с выросшими гибридами тестировали на продукцию МАТ методом ИФА с очшенным вирусам ВсЭД в качестве антигена. Положительные гибридомы клонировали методом предельных разведений, клоны переводили з массовую культуру и замораживали в "'Жидком азоте. В качестве препаратов МАТ использовали гаорздомную культурзльную среду и есиитичоские яидкости, полученные путем- выращивания клеток гаоридом в сингекных животных.

Било проведено 4 слияния миедомных клеток if-з со сшзе-лоцлтами крыс Lou и 2 слияния клеток NS-1 с клетками селезенок мышей зна/'З, иммунизированных очищенным препаратом вируса ЕсС'Л. Пц результатам первичного скрининга в ИФА было отобрано окало 120 гибридом, растущих на селективной среде ГАТ и синтезирующих специфические AT к вирусу ВсЭЛ. По результатам скрининга кленов было отобрано 46 гибридом, стабильно секретирую-ииг МАТ к вирусу ВсЭЛ- Стабильными считали гибрвдомы, не дао-дае расщепления по свойству продукция МАТ при клонирований (100« позитивных клонов). После наработки и титрования в ИФА зешггных препаратов для дальнейшей работы было отобрано 16 типе б МАТ мышиной и 24 типа (ДАТ крысиной природы, иыеших титр IK низе 1:30000 в асците по данным ИФА. Замороженные культуры ймн депонированы в банке гибридом ВНИИ-МБ. Две- линии: 7В6 я ."-ш депонированы.во Беессгоной'коллекции клеточных куль-

Нс^ ,}-'"Л г-'Л'ЛЬТ'ГСи ЗИЧВОК ИЗ И300Г0Т9'П'8 .

Кроме того, в расоте оыла использована коялекпЕ* ■ типов МАТ, полученных И.А.Разумовым к вирусу ВЭЛ, из ксторк:-: восемь-перекрестно реагирующих.с вирусом ВсЗЛ в ЙФА к ртга гш (4F6, 7СЗ, 7D1, 7А6, 4С5, 4Н5. ЗС4, 1ЕЮ) применяли для конкурентного анализа.антигенных детерминант вируса ВсЗЛ.

... 2.ХарактеризацйяМАТ. .

2.1. Определение белка-ыпиенн для М4Т.

Определение вирусного белка-мишени для МАТ проводили методом ишуноблоттинга. Оказалось, что 38 типов МАТ, полученных "к вирусу ВсЭЛ, спещфгёески связываются со структурными белка-' ■ми данного,вируса, представленными в денатурированной форме. Согласно-общепринятым представлениям, данные МАТ реагирует с независящими от конформации ■■ антигенными детерминанта?®. На ' Рис.1 представлена фотографая результатов жмувсблоттинга для некоторых Т1шов ШТ. Восемь типов МАТ- реагировали в иммуноб-лоттинге с гашсопротенном Е1, двадцать восемь - с та Е2 и два - с-капсиднш«- белком С. Для 2-х "типов FMT (5Н6 и 5G11 ) ое-• -лок-дашень .'данным-- методом - -определить • не удалось. Из 19 исполь-■-зованных-нами.:ВЭЛ-спёцифичных; МАТ в иммуноблоттинге реагирова-•т' 14 ■ типов МАТ-. ■■■ Из - них'.д; взаимодействовали • с гп В", к .м- - : гп £2. Специфичность пяти.-типов.ШТ-, реагирумвк с ВЗЛ к ВсЗЛ, Оыла установлена методом радаоишу^опрецивдташш *-э1-мечеяных белков «газированного. Тритон Х-1оо взгруса ВсЭЛ. Эти МАТ взаимодействовали с гп Е2 '(Рис...2). Данные МАТ, возможно, распознают апитспы, .'Сформированные за счет третичной'структуры вирусного белка. - ..'•.

: 2.2. , Диализ ■ -бяолоййёской ■ акткшо'сти flAT.

■Биолопиеская'-акздшность МАТ была установлена в фушщко-■ - 6 -

I I H S61 8 TAHHi titi KiSM

Издоена:. Ч• - з, 5 - 1Sкультуральная среда, гаоридом 7Вб, >"!0, 1311, 43?б, ЗС4., 7Д6, . 7СЗ, 7Е1. 4Н5. 424, 1F3, 5Ы6. 5С11.2НЗ, 1Б2, соответственно, а - нормальная крысиная сыворотка, :: - красаная антасыворотка к вирусу ВсЭЛ.

I г ? н г 6 *

?пс а. Ражтс«омуаспрецяпятацня структурных оелков вируса-. ВсЭЛ •¿гояоктональнывд ангятвлаыя.

Лсрсгка; : - сы-сь МАГ к г-япсспротвинаы 21 я Е2 вируса ВсЭЛ:

- - , ДС5. 731 , 7СЗ. Tili. COOT3S тотзвмко.

- чс&нзлья&а хс1сякя.ч гыасреяса.

нальном анализе (РН,..РТГА, пассивная зашита животных). Оказалось, что ю типов--МАТ способны блокировать гвмап\шпшацих> вируса ВсЭЛ. Восемь из них были-такав способны блокировать ГА, вызываемую вирусом ВЭЛ.'Три типа МАТ нейтрализовали инфекционную активность вируса ВсЗЛ на культуре клеток (МАТ 4Б4, 153, 5Е6). Пять типов ЫАТ.(4Е4, 1РЗ, 5Н6, 5611, 1В2) при связывании с-вирусом ВсЗЛ запасшли белых мышей от развитая летальной- инфекции. При . этом наличие протективных свойств МАТ не всегда совпадало с наличием нейтрализувдей .активности (МАТ 5211, 1В2). Свойства всех МАТ, специфичных к гп Е1 и МАТ к га Ег. обладающих биологической..активностью, приведены в Табл. 1. Нейтрализующая, антигекагглатинирушая и протективная активность МАТ ассоциировалась только с гп-Е2 вируса ВсЭЛ.

2.3. Анализ конкурентного связывания ШТ с поверх-

ностккш глякопрбтеЕнаыи вируса ВсЗЛ, Для картирования антигенных детерминант был проведен анализ конкурентного взаимодействия немеченных и радиоактивно меченных МАТ, специфичных к гликопротеину Е1. Использовали е меченных 125 i к 8 немеченных МАТ. Данные анализа позволяет заключить, что-на гп Е" вируса ВсЭЛ имеется не менее четырех Бзаю.шонеперекрывакшхся сайтов связывания МАТ - сггш; £1-1,2,3 и 4. Связывание МАТ с -зтил® сайтам не проявляйте/: биологическими эффектами. - _ .

.Для, картирования эпитспов гликопротеша . Е2 использовал: го меченных ,251 и 24 немеченных МАТ. Данные анализа позволила идентифицировать на гя три антигенных сайта (12-4, Е2-5, Е2-6), связываясь с .которыми-. МАТ.. не проявляет активности в 6е~. ¿логических.рейашях и 4 сайта, (Е2-1.2,3,7), етвечащнх на . - 8 -

Таблица 1.

Свойства МАТ, взаимодействующих с вирусом Восточного энцефалоютелита лошадей

Взаимодействие с вирусом ВсЭГ

МАТ Вид Белок- ИФд"* РН** р^рд**Пр°текхдая мишень (ИР, 1^)

ТВб

-1Р6*

7СЗ*

7В1*

7А6»

4С5»

4Н5*

ЗС4*

4ЕА

1РЗ

2НЗ

5Н6

5а\л

1вг

1В11

1 а

мышь

мышь

мышь

мыть ■

мшь

мыэхь

мышь

МЫЩЬ ' крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса мыть мышь

МЫЗЕЬ

Е1(ИБ) 31(ИБ) Е1(ИБ) Н1(ИБ) 31(ИБ) 31(ИБ) 21(ИБ) 31(ИБ)

Е1 аш)'

'32 (ИБ) 22 (РШ)

В2(рип)

вг(рип)

вг(рип)

Ег(РШ)

Е2(ИБ)

Е2(ИБ)

Ег(ИБ)

вг(ИБ)

бОООО 6СЮОО 240000 бОООО

1гоооо 1гоооо

50000 30000 50000 60000 . 60000 60000 бОООО

зоооо 60000 бОООО 120ООО 240000 бОООО

Е2(КРИ4) 480000 Е2(КРМ) 120000 вг(ИБ) 120000

С (ИБ) 120000

н.о. н.о. л.о. н.о. н.о. н.о. н.о. 3200 . 2000

1 6000

160 640 320 320 640 1280 160 1230 320 320 10240

6.4

б.г

>8.7 6,7

6.5

С (ИБ)

60000

» - МАТ получены к вирусу ВЭЛ; *« - обратные величины титров; "-и - отсутствие взаимодействия; (ИБ) - специфичность определена методом иммуноблогсшта; (РИП) -.специфичность определена- методом радиотадунопрещшитации; (КРИА) -- специфичность определена косвенно.- методом конкурентного ра-дкоаммуноанализа; (ИР) -. индекс резистентности (в.'Ц):'■■'отношение величин титров вируса, определенных.: на животных обработанных,. 'т не обработанных МАТ: н.о - не определяли.

вирионе за формирование вируснеЯтрализушии, внтигемагглвтинк-руших или протектизшх антител (Табл. 2). МАТ к трем эпитопам в составе 2-х сайтов (Е2-2а, Е2-За,Ъ) нейтрализовали вирус на

¡j *

культуре клеток. Три сайта оказались способными вызывать индукцию AT, подавлякщих агглютинацию эритроцитов (сайты E2~l3,b,c,d,e,i,g,h; Е2-2а; £2~За,Ъ). Сайт Е2-1 содержит 8 зпитотов для перекрестнореагирущих в РТГА с вирусами ВсЭЛ и ВЭЛ МАТ. Моноклональные антитела к 5 эпитопам трех сайтов (Е2-2а,Ъ; Е2-За,Ъ; Е2- 7) были способны защищать зшвотных от летальной инфекции. Эпитопы связывания для MAT 5Н6 и 5G11 картируются в составе одного сайта на гп 12, что мокно рассматривать как доказательство того, что белком-мишенью для этих МАТ является именно Е2. На основании данных конкурентного анализа и биологической активности WIT наш построена топологическая карта их взаимного расположения. (Рис.з). При ее построеншш данные конкурентного анализа были использованы для выделения сайтов связывания МАТ, а данные по биологической активности антител - для выделения зпитопов связывания МАТ внутри одного сайта.

. Конкурентный анализ связывания МАТ с эпитопами гликопро-теина 22 показал наличие не менее- семи сайтов на гликопротеине е2 (Табл. 2, рис.з). Шесть сайтов, частично перекрываясъ, расположены не гликопротеине Е2 в виде непрерывной последовательности, представляющей собой, по-видимому, иммунодощшвнт-ную область. Причем биологически значимые районы оказывается сгруппированными в компактную структуру - домен. В ату область не включается лишь сайт Е2-7, взаимодействующий с протоктйокыг ми МАТ 1В2.

Таблица 2. .

Свойства ешггопов гликопротеина Е2 вируса ВсЭЛ

Сайт, эпитоп ват Функция

Е2-1а *4Р6 ■ РТГА

Е2-1Ь »тез РТГА

гг-ic *7D1 РТГА

E2-1d #ТАб РТГА

22-1 е #4С5 РТГА .--

32-1 f #4Н5 РТГА,-.

sz-«e газ - РТГА

32-tft «ЗС4 РТГА

32-2а SK6 РН,РТГА,протекция

; 72-гь_5Г.Г-!_Протекция i

i 2£-3a -iE-1 . PH. РТГА, Протекция i ■ j 52-3b_1 УЗ •■ РН,РТГА,Протекция

32—¿а 12В12

£2-4Ъ ЗВ10 —. |

12ВЗ .. — 1

12-40. 1А12 • —'•

32-4« TCJ2

22-42 - * 1В1.1

22-4« 16В4 — - 1!u

¿2-3» : 1У9 . . ■ 1

SZ-Sb TtZ - •

EZ-5« 4.14 .■' .---- 1

S2-6 203 1 | .

22-7 • , „ Поотвкция ...i

Примечания; Ш - JUT ГОзатяааш в peaххаи нейтрализации; РТГА - MAT шзаткввн а рамсда тормажеякя гомагглютинации; Протехцдя - ШХ способны зпяитать tosseft от летальной инфекцка ЗсЗ.Т: - - стсутгтваю эффекта: # - IUT гголучекы к вирусу БЗД.

ЕЗ-Ю В аг-1ъ В //■///■//У/1 ■ *

22-1 <1 В 32-1« в Г-Г

Е2-19 1 Е2-1Ь I ;вг-2а ЗМИИ»«! | ВЕг-зьЦ Е2-4Ь Ег-4с 532-5 1

зг-гъ ''¿ЯШ гг-4а 22-5»!

22-1 Г В 22-1« Я с т-а а £2-4е 32-11 Е2-5Ь Е2-5о

Ряс.з. Тсоалого-фущщациальнзя карта эшггогаэа гявюзротеиаа 32 вируса Восточного авцефадо>швлнта лошадей.

Обозначения: .' - гвавв» сайтов дэотаюал

- граням впатрзоа ^ - рн, РТГА. Протекая*

- ртга

отсутствие _ - биолигячвскжх фуякыяЯ

С нейтрализующей активностью оказались связаны;три зпито-

па сайтов Е2-2 и Е2-3 вируса ВсЭЛ. ' МАТ. к этим сайтам,,а-также

антитела к сайту Е2-1. оказались способны блокировать агглютк-

е

Еалшо гусиных эритроштов (Табл. 2; Рис.з). Взаимосвязь этих двух активностей со строго определенными районами гп Е2 характерна также и для вируса ВЭЛ. У других представителей альфави-'русов гемаглвтинирующая активность обычно связывается с гп ш, а у вируса Леса Семлики с этими двумя свойствами.связаны разные зпитош белка Е2.

На гп Е2 вируса ВсЭЛ обнаружено, три антигенных сайта, участвующих в гемагглютинаши. Два из них, обеспечивающие так-г.е нейтрализацию, являются, по-видимому, видо специфичными (Е2-2а, За.Ь). Сайт Е2-1 представляет собой сложную структура в формировании которой принимают участие эпитопы, носящие ка* линейный, та.с и конформашоннозависимый характер. Этот райо! распознают восемь типов МАТ различного, происхождения, которые одинаково хорошо взаимодействуют с вирусами ВсЭЛ и ВЭЛ в РТГА. Это позволило нам предположить--, группоспешфгшость данногс сайта для адьфавирусов.

Семнадцать типов МАТ, обладающих РТГА-активностыо по отношению к вирусам ВсЭЛ или ВЭЛ, из которых 8 типов реагировал в данной реакции с обоими вирусами были исследованы на способность подавлять гемагглютинашш, • вызываемую другими альфави-руеемк. • Были исследованны г шташа вируса ВсЭЛ, 2 штамма вируса ВЭЛ, а также по одному штамму.вирусов ЗЭЛ, Сицдбис, Лес; Сешшк, Пиксува, Чикунгунья, Гета и Аура. Данные по перекрестному взаимодействию МАТ. в РТГА с альфавирусами МА' представлены в Табл.з. Оказалось, что перекрестнореЕгирущие

Таблица 8.

Изучение перекрестных взаимодействий МАТ.- обладающих активностью а РТГА, с различными«предо? 'чтелями альфазирусоз.

МАТ тшу- ■Титл В РТГА

ногэв : :" 1 ВсЭЛ г ВсЭЛ ВЭЛ* ** ВЭЛ ЗЭЛ ВС ВЛС ВП ВЧ Гзта!Аура

4Е4; 1РЗ 5Н6 2ЯЗ 4Н5 ■ 4Р6.' ЗС4 ¿сз: 73)1 7СЗ ТАЗ : 3211 ВТ2 5В10 5ЕТ 5А12 гт ВсЭЛ ВсЭЛ ВсЭЛ ВсЭЛ ВЭЛ ВЭЛ ВЭЛ' ВЗЛ ВЭЛ ВЭЛ ВЭЛ ВЭЛ ВЭЛ вэл ВЭЛ ВЭЛ ВЭЛ . 1280 1бО 0240 зго 1280 160 160 640 320 : 640 зго 1230 .- зго 2048С 1280 2560 640 640 640 640 ' 640 : зго - ) - 320 1280 го 80 160 160 320 160 320 640 640 1280 . 40 1280 - 1280 1290 320 1280 .640 320 640 1280 320 640 2560 2560 320 20 640 320 320 320 2560 640 160 20 320 40 40 30 2560 5120 зго 1280 1280 640 1280 1гео 1280 640 80 320 зго 160 80 40 5120 1280 320 320 2560 1280 640 320 2560 10240 540 5120 20480 1230 1280 1280 20 640 20 1 С 160 80 30 30

Примечания; тятры в РТГА приведена-..в обратных,величинах, означает'титр в РТГА < Ю; . . ,

ВсЭЛ1 Юкный-: вариант, вируса ВсЭЛ; ВсЭЛ2 - штамм Виргиния вврусз-ВсЭЛ; ВЭЛ-* - штамм Трянядад-'.вируса -ВЭЛ; .ВЭЛ** ~ штамм ТС-83 вируса ВЭЛ:

ЗЭЛ - вирус Западного - энцефаломиелита лошадей (штамм Калифорния);

ВС - ВИРУС СиНДбЛС (ШТаММ-Аг 339) ;

ВЛС - вирус Леса Семлики (Прототипныйитамм);

ВП - вирус Пиксуна .-(штамм ВеАг -35645):

ВЧ - вирус Чикунгунья (штамм Росс);

влрус Тета - штамм АМН" 2021; '

-ярус Атра - агам* ЗеА~ 1 о31 б .•;

вирусами ВсЭЛ и ВЭЛ МАТ взаимодействуют^ такхе и со веема исследованными альфавирусами* В то же время, имеются также МАТ, блокирующие гемагглютинащда,.... вызываемую.-лишь--.вирусом, к которому они были получены..

Конкурентный.анализ, в сочетании с данными перекрестных взаимодействий МАТ, позволяет выделить на гликопротеине Е2 две района участвущих в гемагглютинации - вариабельный и консервативный. Взаимодействие МАТ с консервативным районом (К-райо-ном) одинаково эффективно блокирует гемагглютинашш у. ..различных представителей 4 антигенных комплексов .альфавирусов. Консервативный район для вируса ВсЭЛ ограничен по ..размерам одним сайтом (Е2-1), который, включает. в себя 8 эпитопов. -МАТ к К-району вируса ВсЭЛ не проявляют никаких биологических аффектов кроме торможения РГА. Вариабель^ район имеет больше размеры и состоит из двух сайтов. Его апитопы вовлечены е нейтрализацию вирионов:антителами и обеспечивают формирование противовирусного иммунитета. Все это говорит о том,.что вариабельный и консервативный районы играют ваяную роль в процессе взаимодействия вируса с клеткой и, по всей вероятности, являются рецепторными.областями альфавирусов. Консерватизм К-райо-на позволяет предположить, что эта поверхностная структура вя-риона имеет принципиально важное значение, для репликации альфавиру сов.' причем она ..выполняет - сходную функцию для .всех исследованных альфавирусов. '

До настоящего времени К-район белка .Е2 не сил описан, хотя известны достаточно обширные коллекции МАТ. к различным альфавгрусам. -Это мргет быть.объяснено тем, .что. практически все МАТ, распознание К-район икоггг зсрыскное происхождение 1

голько однн тип мышиных МАТ. из ав исследованных наш, распоз-иет данный:район. Это позволяет высказать прэдполонение, что С-район плохо опознается иммунной системой мыши я поэтому он £е был описан ранее .

2.4. Анализ перекрестного взаннодейстззл вируса ВсЗЛ с другиыа альфавирусама.

Панель МАТ, полученных к вирусу ВсЭЛ,. а также панель МАТ с вирусу ВЭЛ использовали для изучения общих энтигэнеых детер-шнант этих-вирусов. Панель.моноклональных АТ, полученных к гирусам В.сЗЛ и ВЭЛ, исследовали на способность связываться в 1ФА с антигенами вируса ВсЭЛ (ЗА-вариант и вакцинный зтакм ио) и вируса ВЭЛ (штамм Тринидад). Была исследовании зо типов 1АТ, полученных к вирусу ВсЭЛ (22 Е2- и 8 Е1-специфичные) а 19 гипов МАТ к вирусу ВЭЛ (15 и 4, соответственно). Анализ данных [оказывает, что на гп Е1 вирусов ВсЭЛ иВЭЛ имеется 1 общая щтигенная детерминанта (исследовано 12 Е1-специфичных МАТ), грлчем согласно нашим исследованиям. эта детерминанта сСнару-:вна и на белке Е вируса клещевого энцефалита. На гп Е2 сбоях ирусов имеется 19 обшх детерминант (из 37. Ег-специвичных !АТ).. Следует отметать, что из этих 19-ти, 15 антигенных дэ-•эрминант формируют АТ, обладанию биологическим- эффектом. Это южет говорить о сходстве механизмов иммунной зашиты организма >т ивф9ЩЩ2, вызываемой двумя вирусами, аналогичности факторов ¡крулентноста обеих вирусов и следовательно - о сходстве отельных этапов их патогенеза. . Именно поэтому для вируса эта ¡айоны могут быть важными н сохраняться прн эволзяши.

.При :сравнении , пары. атачаюз БД - 310 бьшэ показано, что .нтягэвяыо детерминанты за глиходротеияа 31 атэкаа 31 о гяруез

ВсЗД идентичны таковым .для SA-варианта вируса ВсЭЛ. В то se время с помощью'МАТ установлено, что гп Е2 вакцинного:, итамме 31 о .лишен 6-ми антигенных детерминант по сравнению с .ба-вари-антом.у Причем из этих 8-ш, 6 обладали биологической значимостью. Это говорит о том, что процессы, приводящие к вттенуа-шш, возможно, затрагивают в первую очередь, районы» играющие. важную роль в биологии вируса.

Сравнивая функциональную организацию гп:Е2 вирусов БЭЛ и БсЭЛ, являющихся типичными представителями различных антигенных комплексов, легко, заметить некоторыеобщие закономерности. . Девятнадцать из. 38 Е2-спецкфЕЧНьгх. МАТ реагируют с обоими .вирусами. У обоих .вирусов .функциональная активность (нейтрализация, протекция и антигемагглютшшрущая; активность) ассоциируется в основномс тремя сайта®, частично-перекрывавшимися менду собой Е- образуюащми аданую.-структуру..'- В этой области выделяется К-район (сайт Е2-1), оббснечйзащий дерекрест в РГГА всех исследованных адьфавирусов и район, .аналогичный эпитощ- Е2-2а у вируса ВсЭЛ и эпиталам Е2-6а вируса ВЗЛ. -МАТ к этим эштопам обладает чрезвычайно .-.выраженным-' протективнкм .гф-фектом (более' 90S - суммарной=активности--всех--МАТ-.),• высокой активностью в реакции!нейтрализации' и РГГА. И наконец, оба вируса имеют - в своей: .структуре 'сайт Е2-4, -.- обращающий на себя внимание своей -ишунодоминантностью.- -К этим-'.сайтам '.получено наибольшее^количество гибридом, они непосредственно, дрдагшсаит к функционально активному району, и взаимодействие о -;.-еими ííáT не влияет на функцию-ra.Е2..

npir исследовании гп Е1 вируса Всал'наи не удалось' обнару^-шть íiAT, тормозящих гемагглютагаащю, хотя- 'по данным^ ковку-

рентного анализа было картировано не менее четырех взаимноне-перекрывающихся антигенных сайтов на молекуле гликопротеикз Также у МАТ к белку Е1 отсутствовала нейтрализующая и дроте-ктивная активность. Сходные результаты были получены и при исследовании бблка 31 вируса ВЭЛ, на котором удалось картировать только один эпитоп, индуцирующий синтез протективных антител.

У типичных представителей двух других антигенных комплексов альфавируссв - комплексов ЗЭЛ и леса Семлики функциональная нагруяенность гп 22 представляется несколько другой. Антигемагг.'потинирухшая активность ассоциируется с -белком 31, нейтрализующая и протективная - с 32.

Однако, наряду с суще с гзенгЪм сходством антигенной структуры вирусов ВсЭЛ и ВЭЛ, нам удалось:обнаружить и явные отличия, существующие- между ними. Так, на гп Е1 обнаружена лаиь одна антигенная детерминанта, общая для двух вирусов. На гп Е2 вируса ВсЭЛ моноклональными АТ распознается 13 уникальных детерминант, . среди которых 4 формируют биологически значимые противовирусные МАТ. Для.вируса ВЭЛ таких детерминант.нами обнаружено е. , ВЫВ ОД У

1. Впервые создана коллекция гибридом, синтезирующих мо-нсклсналышв. антитела. к структурным белкам'вируса Восточного энцефаломиелита лозадей. Коллекция состоит из 16 мышиных я £4 ксысяных гибсидс-м.

. Свойства полученных -МАТ изучены в иммунсфарквнтнсм шзлпи, :глмунсолоттинге, пзакциях ггоуснс« кчйтззлпззцик.

торможения гемагглютшации, пассивной защиты-животных. Показано, что нейтрализующие, тормозящие гемагглютинашсо и.протек-

тивные антитела индуцируются антигенными"- детерминантами по-

е ■

верхностного гликопротеина Е2.

3. Методом ТРИА проведен анализ конкурентного связывания МАТ с вирусом ВсЭЛ. Создана "клася^икация и построена карТЕ антигенной структуры поверхностных гликспротеинов. вируса ВсЭЛ. На гликопротеине Е1 картировано 4 неперекрывающихся антигенные сайта. На гликопротеине Еа картировано 7 частично перекрывающихся антигенных сайтов, 4 из которых индуцируютлМАТ, активные в оиологическкх реакциях. Эти 4 сайта сгруппированы в единую структуру - домен.

4."На гликопротеине Е2 впервые" оонарукен антигенный район, антитела к которому тормозят гемагглютинацию, вызываемув альфавирусами.всех серокомплексов. . Данный район содержит эпигоны связывания МАТ, носящие как линейный, так и так и конфор-кашоннозависимый. характер. •

5. 'Исследовано перекрестное взаимодействие, панели МАТ с вирусами ВсЭЛ и ВЭЛ. Показано наличие .не'менее 19 ооших антигенных детерминант на гп Ег дь^х вирусов, 15 из которых индуцируют синтез 11, обладающих биологическим эффектом. На гп Е' ооааруаена 1 соаая антигеннаядетерминанта. В то же время нг гп Е1 и £2 какдого вируса имеются -'специфические антигенные детерминанта, обусловливающие своеооразие .их-антигенной орган1.' заиик.

Основные результаты диссертации изложены-в следующих рзоотэя.

*. А.В.ПереОоев, Е.Е.Волчков, Е.В,Протопопова, Е,В.Аге-нов, Е.А.Святченкс, И.А.Разумов, 'В.Е.Локтев, С.В,Навесов "Изучение антигенной структуры вируса Восточного айцефаломие-

дата■-лошадей, при иомопщ монсклональных антител./ Материалы 2Я праслевой. конференции-конкурса молодых ученых "Актуальные гроолемы биотехнологии" - 1990. - п.Кольцове. - с.32-33.

2. А.3.Перебоев, Е.В.Протопопова, Е.В.Агапов, З.А.Сзят-генко, И.А.Разумов, В.Б.Локтев. Изучение антигенной структуры труса Восточного энцефаломиелита лошадей при помоши монокло-[альных антител. /Материалы Всесоюзной школы-семинара "Молеку-шрная биология и медицина". - 1990. - г.Ленинград. - с.15.

* 3. А.с. 1671688 /А.В. Перебоев. Е.З.Агапсв. LА.Разумов, в.Б-.Доктев. • "Штамм т-сядншс культивируемых хле-'ок аявотного Mus musculua £» - продуцент монсклональных антя-•эл к гликспротеину-Sl вируса Восточного энцефаломиелита лс-:адей". - 22.од.'-?". • *

А.с. по заявке N 487482.1 от 10.07.90 / А.В.Перебоев, I.В.Агапов, -В.А.Святченко. В.Б.Локтев. "Штамм гибридных культивируемых клеток хивотного Mua musculua. L. - продуцент про-'вктизкых маноклональных антител к вирусу Восточного энцефзло-мвлита лошадей4.. положительное решение от 22.04.91.

5. A.V PereBoev, S.V Agapor, V.A Svjatohenko, Г.А laauaavy 2.V Protopopova, ,V.B ,boktev. Investigation oi intigenio structure at Easter«.--equine encephalomyelitis virus •y nls^rs oi monoclonal antibodies./ Biomedical Sciences. - 3

Гзчатй'