Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование иммуногенных и протективных свойств рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего структурные белки вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ). Изучение антигенной активности синтетических пептидов, моделирующих антигенные детерминанты вируса ВЭЛ.

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Исследование иммуногенных и протективных свойств рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего структурные белки вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ). Изучение антигенной активности синтетических пептидов, моделирующих антигенные детерминанты вируса ВЭЛ."

Министерство здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации НПО "Вектор" Научно-исследовательский институт Молекулярной Биологии

На правах рукописи •

Святченко Виктор Александрович

Исследование иммуногенных и протективных свойств рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего структурные белки вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ). Изучение антигенной активности синтетических пептидов, моделирующих антигенные детерминанты вируса ВЭЛ.

03.00.06.- вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове -1994

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте Молекулярной Биологии, НПО"Вектор"

Научные руководители: кандидат биологических наук Е.В.Агапов, кандидат биологических наук В.Б.Локтев.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАЕН, профессор, доктор биологических наук Н.П.Мертвецов кандидат медицинских наук Г.М. Игнатьев

Ведущая организация: Институт вирусологии им.Д.И. Ивановского РАМН.

Защита диссертации состоится Уг^Щ^ШЭАт. в^у,час. на заседании . Специализированного совета К .. 098.08.01. при научно-исследовательском институте молекулярной биологии НПО "Вектор", по адресу 633159, Новосибирская обл., Новосибирский "р-н, п. Кольцово.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке .научно-исследовательского института молекулярной биологии, НПО "Вектор"

Автореферат разослан иХН-еЖ, 1994г. • Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических' наж/N. ь (7 Т.Н. Шубина

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Среди заболеваний вирусной этиологии человека и животных значительное место занимают инфекционные заболевания, вызываемые альфавирусами, в первую очередь вирусами американских энцефаломиелитов лошадей. Последние включают трех представителей: вирусы Венесуэльского (ВЭЛ), Восточного (БсЭЛ) и Западного (ЗЭЛ) энцефаломиелитов лошадей. Указанные вирусы имеют широкое распространение . на Американском континенте и зарегистрированы в большинстве стран Северной, Центральной и йкной Америки. Вирус ВЭЛ вызывает лихорадочное заболевание у человека, которое при сравнительно невысокой летальности, в значительном проценте случаев сопровождается, развитием стойких нарушений здоровья выражающихся в параличах, парезах, упорных головных болях- Заболевание склонно к эпидемическому распространению, описан ряд вспышек с вовлечением в эпидемический процесс десятков тысяч человек. Особая актуальность данного возбудителя обусловлена его ярковыраженной способностью к аэрогенному шфщированию лабораторного- персонала, так как исследовательские работы с вирусом ВЭЛ проводятся во многих лабораториях мира. - 4

. . Вышеизложенные свойства вируса ВЭЛ. обусловили проведение

Широкомасштабных исследований, направленных на всестороннее

изучение данного возбудителя с целью разработки .средств

диагностики, лечешя а профилактики, вызываемого вирусом ВЭЛ

заболевания, и: в первую очередь, высокоэффективных вакцинных

препапатов. В настоящее время для создания иммунопрофилактических

средств нового поколения наиболее перспективными являются

следуйте направления: получение синтетических ишуногенных

-1 -

пептидов, разработка - прокариотических и эукариотаческих продуцентов ишуногенных Оелков и создание рекомбинантных вирусов экспрессирунцих чужеродные белки. Достаточно полные данные об особенностях структуры и организации вирусного генома и антигенной структуре вируса ВЭЛ сделали возможным проведение исследований, направленных на реализацию вышеприведенных подходов к созданию современных средств вакцинопрофилактики. . .

.Цель и задачи исследования. При проведении данной работы преследовалась цель получения и всестороннего исследования иммуногенных свойств рекомбинантного . вируса • осповакцины, экспрессирувдего структурные белки вируса ВЭЛ (УН26) и оценки перспективности его использования в качестве вакцинного препарата против Венесуэльского энцефаломиелита; получение синтетических пептидов с антигенной активностью иммунодоминантного белка вируса ВЭЛ г гликопротеина Е2 и исследование их иммузкшашческих и иммуногенных свойств. Для этого решались следувдие задачи:

-изучение способности 7В26 к экспрессии структурных белков вируса ВЭЛ и ■ индукции иммунного ответа в организме иммунизированных животных.

-исследование протективной активности УВ26 при различных способах иммунизации и инфицирования; зависимости протективного аффекта иммунизации от используемой - иммунизирующей дозы; 'стабильности встройки чужеродней генетической информации в геном вируса ОВ.

-исследование напряженности иммунного ответа, вызванного

УЕ26; определение влияния предварительной • иммунизации организма

животных вирусом ОВ на иммунный ответ, индуцированный ЧВ2.6..

-выбор участков гли-опротеина Е2 вируса ВЭЛ, перспективных

-2-

для получения синтетических пептидов; получение пептидов, корреспондирующих аминокислотную последовательность . антигенно-значимых районов гликопротеина Е2 вируса ВЭЛ и исследование их иммунохимических и иммуногенных свойств.

Научная новизна работа. В результате проделанной работы, впервые получен и исследован рекомбинантный вирус ОБ сс встроенной к-ДНК копией 26S РНК вируса ВЭЛ (шт. ТРД). Иммунизация лабораторных животных VH26 приводит к формированию иммунного ответа к вирусу ВЭЛ, иммунязироваЕЕые VB26 животные обладает высоким уровнем резистентности к инфицированию летальными дозами вируса ВЭЛ. Впервые, для рекомбинантных штаммов вируса ОВ, экспрессирущих структурные белки . вируса ВЭЛ, показана эффективность против аэрогенного инфицирования и способность к индукции защитного иммунного ответа при оральном (per оз) введении препарата. Показано, что предварительная иммунизация организма вирусом ОВ не влияет, отрицательным образом, нз развитие иммунного ответа к рекомбинантному вирусу VR2S.

Получены пептиды, корреспондирующие последовательность иммунодоминантного белка вируса ВЭЛ- гликопротеина Е2 в районах 30-75 и 202-250 аминокислотных остатков (а.о.). Впервые показано, что участок 235-240 а.о. г.п.Е2 представляет, собой линейный эпитоп индуцирующий формирование антител перекрестно-реагирующих с вирусами ВЭЛ и ВсЭЛ.

¡фактическая ценность работы. В результате проведенных

исследований получен рекомбинантный вирус ОВ, экспрессируниий

структурные -белки вируса ВЭЛ. Иммуногенные свойства

рекомбинантного штамма свидетельствуют о перспективности

получения на его основе вакцинного препарата для медицинской и

-3-

ветеринарной практики. Рекомбшантный штамм VR26 депонирован в Государственной коллекции вирусных препаратов iIKB N 944).

СХЗъем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения и трех глав: обзора литературных данных (глава I), исходных материалов и осноеных методов (глава 2), результатов исследований и их обсукдения (глава 3), выводов и списка цитируемой литературы (19? ссылок). Работа изложена на 190 страницах машинописного текста, включая 7 рисунков, 9 таблиц и 2 приложения

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены или доложены на следующих конференциях, симпозиумах:

"8th International Congres oî Virology" Berlin. 1989;

Вторая отраслевая конференция-конкурс "Актуальные проблемы биотехнологии" Кольцове. 1990;

Всесоюзная школа-семинар "Молекулярная биология и медицина" Ленинград. 1990;

"Medical biotechnology, iiraunization and AIDS" International conference. Leningrad. 1991.

Б завершенном виде диссертационная работа представлена на заседают научного семинара ВНИИ МБ 27 апреля 1994г.

Основные положения диссертации отражены • в семи опубликованных научных работах.

Использованные сокращения: АВ- антигенный вариант; АГ-

" антиген; а.о.- аминокислотные остатки; AT- антитела; ЕОЕ-

.здягкоосразузеая единица; БсЗЛ- Восточный энцефаломиелит лошадей;

ВЭЛ- Венесуэльский энцефаломиелит лошадей; гп- гликопротеин; ИЕ--

индекс резистентности; КФА- иммуноферментный анализ; КЗ-

коэффпциект защиты; МАТ- монсклоиалькые • антитела; 0В- вирус

ссповакцинн; 00Е- оспянообразующая единица; РИА- радиоиммуншй

-4-

анализ; РН- реакция нейтрализации; РТГА- реакция т:р?лс:*;:ения гемагглютинации; ск.- скарификационное введение; ТК-тшдшшназа; 1РД- вирулентный став» ¿гпЬеу; вируса

ВЭЛ; Т1Щ50- 50% тканевая цитопатсгенная доза; УБ25-рекомбинантный вирус ОВ с встроенной к-ДНК копией 265 РНК вируса ЗЭ.1.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

•. Исследование антигенной яктмвностч синтетических пептидов, корреспондирующих аминокислотную последовательность гликопротеина Е2 вируса ВЭЛ.

С целью получения синтетических препаратов с антигенной активностью вируса ВЭЛ и картирования его антигенных детерминант, ответственных за формирование противовирусного иммунитетз, была

дггринят 9 попытка синтеза и ^угй ,™г.£г.тг,

¡таг/кодоминантнсго белка кгоусз 3? 1-гетссггоотвгн'г НС. 1лл этого была выбрана область 30-75 а.о. ?,п?,-л50 ?.о. т-лккопрсте««?- Г".. •1яшзг районы были забраны на оснсъ^-ак тсгс, -то з зтт/:_ г^сз»:. ранее были картированы мутации у антигенных вагийнтсз зио/'г; 537. МАТ, использованные для селекции аятагэйЕКХ ззриантоз о2дздг."" выраженной вируснейтрализущей активностью и способностью зшицать «азотных от заражения вирулеятадл зпгзшсу г?; гкруез ВЭЛ.

Было синтезировано 9 пептидов. Полученные пептиды :тсгтс7ьз0~п-тсь ' для татуясхйкпчзсксгс анализа. Результате

приведены в Табл.1. Ни один кг синтезированных пептидов :->~ взаимодействовал в ИФА с панелью МАТ к вирусу ВЭЛ. Восемь из девяти пептидов достаточно хооотс взаимодействовали

Таблица I.

Иммунохимические свойства пептидов.

Пептиды, Титр в ИФА Взаимодейст- Защита

номера антипептидной антивирусной вие пептидов от 100 ДЦдд

а.о. от сыворотки сыворотки » с МАТ вируса ВЭЛ

начала £2 против вируса против пептида

34-45 25 1000 - -

•40-50 - 320 - -

45-55 - 80 - -

53-65 - - - -

59-69 - 80 - -

202-220 - 1600 - -

220-231 - 200 - • -

229-243 3200 1600 '

238-250 - 1600 - -

Примечания: *- использовали кроличью или .мышиную антисыворотку к очищенному вирусу ВЭЛ с титром в ИФА не менее 20000.

отсутствие эффекта или титр в ИФА менее 25. Титры антител представлены в обратных величинах.

поликлональной гшершмунной кроличьей сывороткой, специфичной к вирусу ВЭЛ. Из всех проанализированных антипептидных сывороток наличие значительного количества - антител"к нативному вирусу БЭЛ отмечено лишь в сыворотке к пептиду 8 (229-243 а.о.). Данная сыворотка перекрестно реагировала с вирусом ВсЭЛ, титр антител взаимодействующее с нативным вирусом ВсЭЛ составил 1:3000. Сыворотки крови, полученные от животных , аялуиизированных пептидами I (-34-45 а.о.) и 8 (22Э-243 а.о.), тестировались на вируснейтрализующую и янтиг»«рггдагаг^руацу» активность. Бн."о иокнзяно, что д":гне сыворотки tie содержат вируенейтрализуюпш. и тормозящих гемагглютинацшо антител. Трехкратно иммунизированные различными пептидами мыши оказались незащищенными от летальной инфекции при заражении их дозой 100 ДЯ50 вируса ВЭЛ.

Из представленных результатов следует, что в районе 34-70

а.о'. пептид I (34-45 а.о.) достаточно хорошо щяггарует

детерминанты балка SZ, в то же время, мутгцхи у затиг^нни;

вариантов, селектированные МАТ, жжгшзуятся в области

На основании данных фактов мокю высказать предзслсяккг'г

что наблюдаемые мутации в 57-62 положении балка ~.2 опоср«-дсвчнс

изменяют конформацию другого района или эти зминокислсгнье

остатки вместе с другим районом аминокислотной цепи г.л.ЕС

формируют антигенную детерминанту конформапионного типа.

Конформзционнкй'характер данного антигенного сайта vE2-2,

классификации Разумова И.А.) подтверждается рядом фактов:

нарушением взаимодействия МАТ с г.п.Е2 после проведения

иммуноблоттинга, отсутствием взаимодействия пептида 5

а.о.) со. всеми исследованными препаратами МАТ и отсутствием

связывания антипептидных сывороток, соответствующих дакнему

-7-

району с .нативным вирусным антигеном.

Пептиды 7 (220-231 а.о.), 8 (229-243 а.о.) и 9 (238-250 а.о.) частично перекрываются своими концевыми районами, причем в случае пептидов 8 и 9 перекрытие составляет шесть аминокислот в положении 238-243. Антипептидные сыворотки против пептидов 9 и 7 не реагируют с нативным вирусным, антигеном. Из вышеизложенного следует, что иммунохимически активный район пептида 8 (229-243 а.о.) связан с остатками 230-240. Причем в этом районе 6 аминокислот в положении 235-240 полностью гомологичны у вирусов ВЭЛ и ВсЭЛ. На основании этого моаио утверждать, что аминокислотные остатки 235-240 являются линейной антигенной детерминантой, индуцирующей формирование перекрестно- реагирующих антител, экспонированной на поверхности г.п.Е2 вирусов ВЭЛ и ВсЭЛ. Важно подчеркнуть, что полученные данные однозначно говорят о том, что а.о. 235-240 локализованы на поверхности белка Е2 и представляют собой простую линейную детерминанту. Высокая иммуногенность данного района делают это место -на гл. Е2 перспективным для встройки и экспрессии чужеродных линейных антигенных детерминант в составе г.п.Е2 альфавирусов.

Все, химически синтезированные пептиды несмотря на то, что

они взаимодействовали с специфичной к вирусу ВЭЛ антисывороткой,

а пептид 8 (229-243 а.о.) стимулировал синтез значительных

•количеств антител против натиадого вируса ВЭЛ, к сожалению

неспособны формировать защитный иммунный ответ у иммунизированных

животных. Да основании приведенных фактов можно заключить, что

антигенные детерминанты г.п.Е2, ответственные за формирование

противовирусного иммунитета представляют собой многоксшоненяз»

информационно устроенную структуру, в формировании которой

-8-

принимают участие области} удаленные друг от друга в полшептидной цепи. В работе Hunt et al. было показано, что пептиды соответствуйте районам-- г.п.Е2 в . которых' авторами - были -картированы мутации у антигенных вариантов, полученных при помоши вируснейтрализующих МАТ, не взаимодействовали с данными МАТ и не индуцировали развитие защитного иммунитета против инфицирования вирусом ВЭЛ. Это также подтверждает, что антигенные районы белка Е2. вируса ВЭЛ, критические в отношении индукции вяруснейтрализуших антител и защитного иммунного ответа , имеют сложную конформационную структуру.

2. Имиуногенные свойства рексибинантного вируса ОВ, экспрессируицего структурные белки вируса ВЭЛ (VR26).

Другим перспективным направлением в• конструировании потенциальных вакцинных препаратов, которое реализовывалось нами, явилось получение и исследование иммуногенных свойств рекомбинантного вируса ОВ, экспрессирухщего белки вируса ВЭЛ. С нашей точки зрения, лучшим вариантом при конструировании рекомбинантного вируса, было интегрирование в векторную систему генов всех структурных белков вируса ВЭЛ. Этот подход можно реализовать при получении полной ДНК- копии 26S РНК, которая кодирует все структурные белки вируса ВЭЛ. Следует подчеркнуть, что при использовании полной ДЕК- копии 26S РНК сохраняется вся стратегия синтеза и транспорта структурных белков, которая наблюдается при инфицировании клеток вирусом ВЭЛ.

Исследование первичной и антигенной структуры гликопротеинов EI и Е2 вирулентного (ТРД) и аттенуированных штаммов вируса ВЭЛ выявило ряд существенных различий. У штамма ТС-83, например, идентифицировано 7 аминокислотных замен в последовательности

белка Е2. шташ ТС-83 имеет модифицированный антигенный сайт Е2-6, который относится к наиболее важным сайтам белка Е2 в отношении формирования противовирусного иммунитета. Приведенные данные позволили нам прийти к заключению, что использование полной ДНК-копии 26S РНК вирулентного шт. ТРД для интегрирования в геном вируса ОВ будет более перспективным и адекватным, нежели использование к-ДНК копии структурной области генома аттенуированного штамма.

Фроловым И.В., на основе очищенной геномной РНК вируса ВЭЛ шт.ТРД, был получен набор рекомбинантных плазмид, • содержащих в своем составе всю последовательность ДНК- копии его субгеномной 26S РНК, направляпцей синтез всех структурных белков вируса: -С-E3-E2-6K-EI. С помощью генно- инженерных манипуляций к-ДНК 26S РНК вируса ВЭЛ шт.ТРД была собрана под контролем сильного ранне-позднего промотора гена белка 7,5К;вируса С® и встроена в ТК- ген этого же вируса, находящийся в составе плазмиды рТК1285. Полученная в результате рекомбинантная плазмида,' использовалась Урмановым И.Х. для интеграции последовательности 26S РНК в геном вируса ОВ коммерческого штамма ЛИНП. Из нескольких клонов рекомбинантного вируса' ОВ, показавших при блот-гибридизации изолированных ДНК, наличие специфической встройки в геном, - для дальнейшей характеризации был отобрав клон VB26.

2.1. Исследование способности VR26 к ендукции иммунного ответа в организме животных.

С целью определения способности VH26 к экспрессии

структурных белков вируса ВЭЛ ln vivo и к формированию иммунного

ответа в организме животных, иммунизировали кроликов и мышей.

Кроликов ишунизировали методом скарификации (ск.), мышей-

-10-

интраплантзрно (и.пл.). Иммунизирующая доза в обоих случаях

составила Ю'ССБ/аазотное. Ьа Zi сутки у зивотпых застаэлг сыворотки крови- Тигры антител,. специфичных к парусу 53Л, _гегер»

определяв мзтодсл И5А, были равны 1:СС0С соответстрвнно.

7Н25 кроликов; иммунизирующая доза в данном случае составила

хгсшкоз определялось на.лгсю ант;-гтзл спадаичных, как к г.д. Е2.

ид ркс.х. представлены результаты исследования зНеНзг.^-'-^ско'^ активности индивидуальных сывороток полученных от 5~ иммунизированных_ (сл.) УЯ26 кроликов. Каздув сыворотку

йыСОК11МИ дОЗаМй ЬИ^У'Сс! ЬОл

г*« П/Щ.»«!! Т71Г\/1 т>

вносят клеточная составляющая иммунного ответа.

Для исследования способности 7Й26 к Формированию иэдпнсгс

ЛССЛбдОйгзНпй О Но Ч о О КО ^ С1*ВСрСТ0К -т" __ -

Титр В ИФД 2 10" 5%

а

7

75%

20%

13%

33%

54®

46%

Титр в РН

640

- 320

- 160 - 80 - 40

20 10

Ш& РН Протективная активность

Рис.1.

Специфическая активность индивидуальных сывороток иммунизированных 7В26 кроликов (ск.). Примечания: а- Значения титров антител приведены в обратных величинах.

б-Щютективными считали сыворотки защэдаюцие мышей от заражения вирусом БЭЛ в дозе 100 ЫЭ50.

ти кроликов иммунизированных per os (5xI0600E) VH26 показали, что в сыворотках иммунизированных per os яквотвкх определялись достаточно высокие титры специфичных к вирусу "'ВЗЛ " 2!гп?тел?~ все-сывироткн полами тельные а Ш, содержал?. шфгК1л:ош;ув активность вируса ВЭЛ елтитела, в р&злкчЕыг. ткттгх г обладали протективной активностью, что свйдэтельстьуе? ■

отметить, что 6% исследованных сывороток а& содержали антитез czoi™"'"".'"".^ » «ту« -иЯй nouuiusi i, ..с, ттря иммтаизтти

методом скарификации вирусспецифЕЧбские антитела определялись во всех оез исключения сыворотках.

С целью " определения влияния встройки чужеродной генетической информации на антигенные свойства вируса ОВ, сыворотки иммунизированных YR26 животных (Ю700Е) тестировали на *т'!.тг."1!*е ентит«л, сптешйичнкх к вирусу ОВ в ИФА и PH. В качестве сравнения лсгсльоовалп кроликов,

'визированных шт. ЛИВ" ы*руе& ОЬ ЦЭ'СОЕ). Результаты гфк^декы на Табл.2. Как, следует кз пр&дстаьввяных результатов, рекомзкнантный шта?в! VE25, несмотря на встройку чужеродной генетической ивформаши и ИГ фенотип сохранил, в значительной мере, присущие вирусу ОВ ярковырааенные шмуногеннне свойства к способность формировать напряженный противовирусный иммунитет.

Таким образом, рекомбинантный вирус ОВ VR26 эффективно представляет иммунной системе организма гликопротеины EI к EZ вируса ВЭЛ и вызывает формирование ■ специфичного к вирусу ВЭЛ тамунного ответа. Анализ специфической активности индивидуальных сывороток иммунизированных • VH26 кроликов показал, что ск.

введение VH26 вызывает развитие иммунного ответа,

-13-

Таблица 2.

Анализ специфической активности индивидуальных сывороток животных иммунизированных УВ26 и вирусом ОВ (шт. ЛМВП).

НИВОТНЬЕ ШМУШШШЯ КФА РН

ВЭЛ ' ОВ ВЭЛ ' ОВ

КРОШКИ ТВ26 1000 ! зооо - 320

-/- - 3000 9000 160 640

3000 ¿000 640

3000 9000 160 640

ОВ(ЛИВП) - 18000 - 1280

- 9000 - 640

;мьш 7В26 1000 3000 - 160

1000 3000 - 160

-/- 1000 3000 - 160

1 3000 9000 80 320

1 ] • ов(ливп) - 9000 - 320

! - 9000 - 320

Примечания: I. Кроликов иммунизировали ок., мышей - и.пл. таге или вирусом ов (ю7оое).

2. В- качестве контрольных использовали сыворотки гивотных, полученные до иммунизации.

3. "-» - отсутствие эффекта.

-14-

характеризующегося значительной гетерогенностью по наличию

вкруснейтралкзукщих и протектквннх антител.. Ео Есех сыворотках активных -в ИФА,-полученных от - орзльно -- иммунизированных кроликов--------

стгеделялось наличие вт^'^срейтрзли^укудку и чро^'^ктиЕН^у :7т/'*'■■ ~.

ЧТО овшгительствувт О Рфф^^^ИВНОЙ ИНДУКЦИИ ^УУООЗЛЬНС^О

ж.муннсго ответа при данном способе иммунизации.

инициирует рэзвитие выгаченного и^'-унног'' отв^тт вирусу ОБ, на основании чего можно утверждать, что зекомокнзвтнкГ. вирус ОВ, несмотря на встройку чужеродной генетической информации

тт 'Ги таилткп огч-^-гчотгтг-г» ▼ от^татмхгтл ггтта т>ггг>ггг\п ПО тг»л«*ггтлч-1лтттто

свойства.

2.2. Исследование протективных свойств ЧВ26 при периферической инфицировании аивотных.

Исследование протективной активности УБ2б при заражении иммунизированных животных летальными дозами вируса ВЭЛ, проводили

с» ^1127 Iя КТ}С ЛИК.£I4!. С С" СТГ>ЛЯЛ>* ПССрС ДСТ12С?Л

подкожного введения стандартных девятикратных разведений патогенного штамма ТРД. Иммуногенность выражали через индекс резистентности (ИР), представляющий собой, раг -_.сть между вируса ВЭЛ, определенного для не иммунных животных р. о*-7,; пя ?чивотннх, г^^'.унизирсвзнных ¥?.26. Результаты

приведены в Табл.3. Мнгти и кролики, иммунизированные УЕ25 дозой

7

70 были резистентны в 100% случаев при зара^енит* их дозой

10е5 ЛДсл вируса ВЭЛ. Результаты, полученные при использований двухкратной схемы иммунизации, свидетельствуют об исключительно высокой степени загинценнссти хивотных. Дзавды имглунизированные

7

кролики и мыши (иммунизирующая доза 10 00Е) были устойчивы б

100% случаев даже к введению Ю9 ДД^ патогенного штамма ТРД

-15-

Таблица 3.

Резистентность иммунизированных УВ26 яивотных к инфицированию

вирусом БЭЛ.

Вид 1Иммунизирув-гивотного| шая доза | (002) 1О£10(.ГЩ50)| Ю^оСДДзд) Контроль ( Иммунизация ( 7В26 Индекс резистентности. 1с£10

0д н с кр э тн е я иммунизация

мыши ! 1сГ 1 9.5-0.2 ! <1±0.4 ; 1 г.9-0.2 ! ^1-0.5 | 1С'- ; 9.6-0.4 | 3.0^0.6 1С' | 9.5-0.4 ) 5.7-0.4 »8.9^.4 £6.9-0.5 6.8-0.7 4Л±0.Ь

Кролики ! 1С~ ! 8.2-0.6 10" | 9.2-0.6 0+0.3 $1-0.2 9.2±0.7 »8.2-0.6

Двухкратная иммунизация

Мнгти | И' 1 • Ю6 I 10= ! то~ 1 тпО ! 9.8-0.3 Э•8—0•3 9.8-0.3 ■ 9.7-0.4 3.7-0.4 0+0.1 0+0.1 0+0.1 3.4±0.7 6.2-0.5 9.в±0.3 9.8-0.3 9.8±0.3 6.3±0.8 3.5±0.5

Кролики | 10^ I 1С6 9.3-0.4 9.5-0.4 ■ 0+0.2 0+0.2 ' 9.3-0.4 9.5±0.4

Примечания: I. Е качестве контрольных использовали интактных

ЕИВОТНЫХ.

2. Доверительный интервал рассчитан для Р=0.05. ' -16-

вируса ВЭЛ.

В Тйбл.З. также представлены результаты исследования завйсшэсти защитного эффекта от используемой "дозы. 'Снгавние 'яшуиязирукядай-дозы■ с то' до ТО" • • 005/жсь;"■

случае однократной иммунизация, сспрсБсаслзлогъ постен? чн.-з." снижением устойчивости животных к заражение патогенным etwmíy вируса БЭЛ. Однократное введение 10' и 1С" ОСЕ vrzo приводило ••: формированию 100" устойчивости гластах к nonxcKi-cvv зьед-:ь:т. lO^HÍgQ вируса ВЭЛ. При снижении дозы 7Е25 до 1С'-ОСЕ на

"I .-se» ÍÍP p^^fniDTTтт С Д ТТптт тгвт) v ^псчтоп-^ шлдштоттш* ттгтзп** ТП' " ТГ;'

-¡О """ .........

«t 10" 00Е была отмечена 100% устойчивость мышей к введению ¿D

ДДсд вируса ВЭЛ, а при дальнейшем снижении иммунизирующей дезы до

I04 и Ю3ООЕ log1Q ИР снижался до 6.3 к 3.7, соответственно.

Полученные результаты показывают, что рекомбинантный вирус ОВ VH26 индуцирует формирование исключительно высокого уровня протективного иммунитета против периферического инфицирования вирусом 5ЭЛ. До настоящего времени столь знсокит: уроа»кь зз;:глт:-' животных, обусловленный рексмоинантными эируезди •J5. не стмечэн. Только для нескольких вирусов был списан, по крзйн*?. мере, сравнимый уровень защита, так, рексйбинант гксг^бссзруюж-гп. G вируса бешенства обеспечивал защиту ""зстных от инфицирования вирусом бешенства в дозе 10'~'ЛЗЦ-. РексмбинантньП! штамм вируса ОВ, экспрессируюций структурные белки аттенуированного штамма ТС-83 вируса ЗЗЛ, индуцировал защиту животных от периферического заражения вирусом ВЭЛ дозса

Скарификационный способ иммунизации является общепринятым при использовании рекомбинантных штаммов на осноЕв вируса СВ. 5 токе рхэмя. очевидные недостатки метода, обуславливают посейд^ние

исследований направленных на разработку других, не менее эффективных, способов иммунизации. В нашей работе был выбран способ орального (per os) введения препарата, обладащий несомненными практическими преимуществами. Исследование протективной эффективности оральной иммунизации показало достаточно еысокий уровень защищенности животных. Результаты представлены в Табл.4. log1Q ИР для однократно иммунизированных per os кроликов (иммунизирухоая доза 5хЮ6С0Е) при периферическом инфицировании патогенным штаммом вируса ВЭЛ составил 6.2. Однако необходимо отметить, наличие единичной независимой от инфицирующей дозы гибели кроликов, сыворотки крови которых не содержали специфичных к вирусу ЕэЛ антител. Для выяснения причины отсутствия иммунного ответа к вирусу ВЭЛ у данных кроликов, in сыворотки были проанализированы на наличие антигел против вируса ОВ. В сыворотках кроликов, оказавшихся серснегатизнымп и чувствительными к иафшщрованию вирусом БЭЛ, было отмечено полное отсутствие антител ешцефичных к вирусу ОВ, что свидетельствует об отсутствии репликации' рекомбинантного штамма у ■ данных еивоткых. Этот, факт моано объяснить индивидуальными особенностями нелинейных кроликов. По нашему мнении, наиболее вероятной причиной , препятствующей размножению рекомбинантного штамма, является поваленная кислотность секретов слизистых оболочек, так как вирус ОВ весьма чувствителен к кислой среде. Следует отметить, что рефрактерность отмечена для незначительного количества животных (3 кролика из 50-ти)

Для исследования напряженности иммунного ответа, вызванного VR26, определяли степень защищенности, животных через продолжительный период времени после иммунизации. Кролики и мыши,

Таблица 4.

Резистентность орально иммунизированных VB26 кроликов к - • подкожному инфицированию вирусом ВЭЛ.— -----

Иммунизация Инфицирушая доза, Д!%0 Гибель/всего % гибели

VR26 Q 0/10 С-10

ю4 2/10 20±13

ю5 1/10 10*10

ю6 0/10 0+10

га7 5/10 50-17■

Контроль I02 4/4 100-25

с

Примечания: I. Кролики иммунизировались per os дозой 5x10 00Е VR26

2. Стандартная ошибка процента определена по табл. Генеса.

иммунизированные VR26 в дозе 2хЮ6 и 1хЮ600Е, соответственно, спустя 7 месяцев после иммунизации были устойчивы в 100% случаев к подкожному инфицированию дозой 103ЛД50 патогенного шт. ТРД вируса ВЭЛ.

Кроме того, была исследована способность VH26 формировать перекрестный иммунный ответ' к другому высокопатогенному представителю альфавирусов -вирусу Восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ). С этой целью иммунизированных VH26 мышей- (и.пл., Ю^ООЕ) инфицировали летальными дозами вируса ВсЭЛ. Из полученных результатов следует, что иммунизированные VR26 мыши обладали существенной степенью устойчивости к заражению вирусом ВсЭЛ. Так, при подкожном введении 100 ДЦэтого вируса, более половины иммунизированных животных были резистентны к инфицированию.

С целью исследования стабильности встройки чужеродной генетической информации (к-ДНК 26S РНК взфуса ВЭЛ) в геном вируса ОВ, было выполнено 6 пассажей на ХАО куриных эмбрионов или 3 последовательных пассажа VH26 на коже кроликов. После' этого, наработанный на ХАО куриных Эмбрионов VR26 тестировали на протективную.. активность. Однократная иммунизация 'мышей' дозой 5хЮ6ООЕ VR26 . обеспечивала ' 100%-ую резистентность животных к подкожному введению I07 ЛД50 вируса ВЭЛ, что свидетельствует о высокой стабильности данного рекомбинантного штамма.

Исследование протективных свойств VR26 при периферическом

инфицировании животных вирусом ВЭЛ показало исключительную

эффективность данного рекомбинантного штамма. Впервые, для

рекомбинантных штаммов вируса ОВ, экспрессирумшх белки вируса

ВЭЛ, показана способность к индукции высоких уровней

протективного иммунитета при иммунизации per os. Эффективность

-20-

7R26 против инфицирования вирусом ВсЭЛ', наряду со способностью к

индукции выраженного иммунного ответа к вирусу ОВ, свидетельствует _ о _ перспективности получения на его основе поливалентного вакцинного препарата как для медицинской, так и для ветеринарной практики.

2.3. Исследование протективных свойств VR26 при аэрогенном инфицировании шшоттх.

Исследовательские работы с вирусом ВЭЛ в лабораторных условиях сопровождаются высоким риском аэрогенного инфицирования персонала. Протективный потенциал 7R26 против аэрогенного

инфицирования исследовали на мышах и кроликах, иммунизацию

g

проводили посредством однократного введения 10 00Е

рекомбинантного вируса., Мышей иммунизировали интраплантарно,

кроликов методом скарификации или per os. На 21 сутки после

иммунизации осуществляли инфицирование опытных и контрольных

животных аэрозолем вируса ВЭЛ (шт.ТРД) в динамической аэрозольной

камере УКСД-2.5. Результаты экспериментов приведены в Табл.5.

Иммунизированные VE26 животные обладали значительной степенью

устойчивости к аэрогенному инфицированию, так длл однократно

иммунизированных мышей значение респираторной ЛД50 составило 572

БОЕ вируса ВЭЛ, что значительно превосходило соответствующее

значение для неиммунизированных мышей (ЛД50- 4,3 БОЕ).

Коэффициент защиты (соотношение респираторной _ ДЦ^ для

иммунизированных и неиммунизированных животных) равнялся 133.

Степень защищенности ,/фо ликов оказалась несколько' ниже,

коффициент защиты для кроликов, иммунизированных методом

скарификации -45. Следует отметить эффективность иммунизации per

os, значения ЛД50 для скарификационно и орально иммунизированных

-21-

животных статистически не отличаются. Это еще раз подчеркивает перспективность данного способа иммунизации.

Уровень защиты против аэрогенного инфицирования, при котором возбудитель проникает в ЦНС животного через слабо контролируемый иммунной системой ольфакторный тракт, оказался значительно ниже чем против периферического заражения, однако достаточным, исходя из требований предъявляемых к вакцинным преператам. В связи с этим следует подчеркнуть, что применяемый ныне для вакцинации персонала, работающего с инфекционным вирусом ВЭЛ, аттенуированный штамм 230 при иммунизации мышей рекомендуемой иммунизирующей дозой обеспечивает коэффициент защиты 11.2.

2.4. Влияние предварительной иммунизация организма еивотных вирусом 0В на шааунвый ответ индуцированный реко&бинанишы вирусом УЕ26.

Значительная часть населения в прошлом вакцинировалась вирусом 0В. В связи с этим возникает вопрос, не будет ли предварительная .вакцинация организма вирусом ОВ подавлять иммунный отЕет индуцированный рекомбинантным штаммом. С целью ' исследования.,влияния предварительной иммунизации организма ' животных вирусом ОВ на развитие иммунного ответа, обусловленного рекомбинантным вирусом, двум группам мышей по 20 голов вводили

с •

вирус ОВ (шт. ЛИВП) в дозе 10 ООЕ/мышь. Спустя месяц одну из

груда иммунизировали 7Н26 (Ю6ООЕ), параллельно той же дозой УЕ26

. иммунизировали группу неиммунизированных животных. Через 21 день

все три группы мышей инфицировали вирусом ВЭЛ в дозе 107ДИ50. Из

результатов представленных в Табл.6, следует, что мыши иммунные к

вирусу ОВ имели такие же титры специфичных к вирусу ВЭЛ антител,

как ранее неиммунизированные вирусом ОВ животные и, что особенно

-22-

Таблица 5.

Резистентность иммунизированных УВ26 мышей к аэрогенному заражению вирусом ВЭЛ.

Иммунизированные УВ26 мыши Неиммунные мыши

Инфицирующая доза, БОЕ % гибели Инфицирующая доза, БОЕ % гибели

9.0 17.0 100.0 440.0 0 0 20 70 1.2 33.0 66.0 . 35 100 100

(СТ«50) =572 БОЕ, 1д5=164-1990 БОЕ (СТ№50) =4.3 БОЕ 1д5=3.2-5.7 БОЕ

Примечания: сот50- доза, вызывающая гибель у 50% аэрогенно инфицированных вирусом ВЭЛ мышей, 195-доверительный интервал на уровне вероятности 95*.

Таблица 6.

Влияние предварительной иммунизации вирусом ОВ на иммунный ответ, вызванный рекомбинантным вирусом УН26.

Иммунизация Титры антител в ИФА (РН) Резистентность гибель/ всего

к вирусу ОВ к вирусу ВЭЛ

Вирус ОВ а 4000 (40) - (-) 20/20

Вирус 0В+УН266 32000 (160) 300 (-) 1/20

7В26 в 2000 (20) 300 (-) 1/20 '

Примечания: а.- группа мышей иммунизированных вирусом ОВ

б.- группа мышей иммунизированных вирусом ОВ и месяц спустя иммунизированных УВ26

в.- группа мышей иммунизированных 7Л26 (Ю600Е)

-23-

.важно, такой же высокий уровень резистентности к инфицированию патогенным штаммом вируса ВЭЛ. !

На основании полученных результатов, можно утверждать, что рекомбинантный штамм VH26 эффективно экспрессирует структурные белки вируса ВЭЛ в организме иммунных к вирусу OB животных, данное свойство рексмбинантного■штамма имеет большое значение, так как значительная часть населения тлеет определенный уровень иммунитета к вирусу OB.

2.5. Ультраструктурное исследование органов мышей иммунизированных VB26 и инфицированных вирусом ЮЛ.

Мышей иммунизировали интраплантарно VR26 в дозе Ю6 OOE/жиЕотное. Одну группу иммунизированных VB26 животных, спустя 21 день после иммунизации, инфицировали, посредством подкожного введения I04 дЦд0 вируса ВЭЛ, другую группу иммунизированных VB26 мышей оставляли неинфицировакной. Для исследования отбирали образцы коры головного мозга, обонятельной луковицы, печени и селезенки через 3, 5, 10 и 15 суток после иммунизации VB26 и на теже сроки после инфицирования вирусом ВЭЛ. В качестве -контроля использовали.. органы интактных мышей, мышей иммунизированных Инвариантом вируса OB в дозе Ю6ООЕ/животное и неиммувизированных мышей, инфицированных вирусом ВЭЛ в дозе IO^lügQ. Исследование проводили с помощью электронного микроскопа JEM-100S и Н-600 (Япония) в лаборатории Е.И. Рябчиковой.

Проведенное исследование показало, что иммунизация мышей VB26 не вызывает патологических изменений в ткани обонятельной луковицы, коры головного мозга, печени и селезенки. Наблюдаемые в селезенке морфологические изменения, свидетельствуют об активации иммунной системы. Инфицирование, иммунизированных VR26 животных

летальными дозами патогенного шт. ТРД 'вируса ВЭЛ, не приводит к

формированию патоморфологических процессов в тканях ьпдеукзззнных органов. Ни з одном из препаратов, полученных от п.мунизирс ванных VR.Î6 х инфицированных вирусом ВЭЛ тавотных, частиц;-.' вируса ЕЭЛ не Г::;;.' с Гружены, что свидетельствует о; элективном подавлении р-плккации вируса ВЭЛ в организме иммунизированных ¡азотных к их высокой степени защищенности.

Выводи.

1. Впервые, получен рекомбинантный вирус OB (VR26) со

nCipwcxixiujil г1шт Копией лвз rriri itíi^MMrt ¡rit ЬйиуЧ:н плл.

что VB26 эффективно экспрессирует гп. Е2 и El вируса ВЭЛ in vivo и индуцирует развитие напряженного иммунного ответа к вирусам ВЭЛ и ОВ у иммунизированных животных. VE26 сохраняет свои иммуногенные свойства при пассировании, что свидетельствует о стабильности встройки чужеродной генетической информации в геном вируса ОВ.

аэрогенного инфицирования летальными дозами вируса ЕЭЛ,

4. Показано, что УН26 при оральной иммунизации кроликов вызывает формирование резистентности кивотных к пешФешческому

защиты- 35) инфицированию патогенным штаммом ТРД вируса ВЭЛ.

5. Исследование влияния предварительной иммунизации животных вирусом ОВ на иммунный ответ, обусловленный введением УЙ26, показало, что рекомринантный вирус УН26 эффективно реплицируется в организме иммунных к вирусу ОВ животных и индуцирует развитие высокого уровня защитного иммунитета против инфицирования вирусом ВЭЛ.

6. Ультраструктурное исследование органов мышей показало, что иммунизация УН26 не вызывает патологических изменений в ткани печени, селезенки и коры головного мозга. Наблюдаемые в селезенке морфологические изменения свидетельствуют об активации иммунной системы. Инфицирование иммунизированных УБ26 животных летальными дозами вируса ВЭЛ не приводят' к формированию каких-либо патоморфологических процессов в тканях вышеуказанных органов.

7. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о. перспективности рекомбинантного штамма УБ26 для разработки на его основе вакцинного препарата против Венесуэльского, энцефаломиелита лошадей. • •

8. Установлено, что синтетические пептиды, воспроизводящие аминокислотную последовательность районов 35-70 и 202-250 а.о. г.п.Е2 вируса ; ВЭЛ неспособны к индукции защитного иммунного ответа, хотя они эффективно реагировали с поликлональными вирусспецифичными антителами, а пептид 8 (229-243 а.о.), при иммунизации животных, вызывал появление значительных количеств антивирусных антител, взаимодействующих с нативным вирусом ВЭЛ. Впервые, на молекуле г.п. Е2 картирован линейный эпитоп (235-24С а.о.), инициирующий синтез перекрестно-реагирующих с вирусами ВЭ1 и ВсЭЛ антител.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. E.Y. Agapov, V.A. Svyatchenko, I.H. Urmanov, 0.1. Serpinsky, I.Y. Frolov, S.V. Netesov. Use of recombinant vaccinia

virus expressing Venezuelan equine encephalomyelitis virus structural proteins for protective immunization of mice // YITIth International Congress of Virology, -Berlin, 1990, -P2-20, -148.

2. B.A. Святченко, Е.В.Агапов, И.Х. Урманов, О.И. Серпинский, И.В. Фролов, А.А. Колыхалов, С.В. Нетесов. йммуногенные свойства рекомбинантного вируса осповакцины со встроенной 26S РНК вируса ВЭЛ // Материалы 2й отраслевой конференции-конкурсе молодых ученых "Актуальные проблемы биотехнологии" -1990, -Кольцово, -с.30-31.

3. В.А. Святченко, Е.В. Агапов, И.Х. Урманов, О.И. Серпинский, И.В. «ролов, А. А. Колыхалов, С.В. Нетесов. Йммуногенные свойства рекомбинантного Еируса осповакцины со встроенной ДНК-копией 26S РНК вируса ВЭЛ // Материалы Всесоюзной школы-семинара "Молекулярная биология и медицина" -1990, -Ленинград, -с.56

4. V.А.Svyatcheriko, E.V.Agapov, I.H. Urranov, ■ O.I. Serpinsky, I.Y. Frolov, S.V. Netesov. Recombinant vaccinia, virus protects animals efficiently against Venezuelan encephalomyelitis virus // International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS. -Leningrad, -1991. -36-8.

5. Y.B. Loktev, I.A. Rasumov, V.A. Svyatchenko, E.V. Agapov, A.Y. Pereboev, A.N. Sabi„-ov, G.A. Hiseriko, A.I. Zakabunin, A.A. Ilyichev. Synthetic peptide vaccines to Venezuelan equine encephalomyelitis virus // International Conference on Medical

Biotechnology, Immunization and AIDS. -Leningrad, -1991, -S6-9.

' -27-'

6. В.А. Святченко, A.B. Перебоев, Е.В. Агапов, И.А. Разумов, А.Н. Сабиров, Г.А. Мизенко, В.В.Самуков, В.Б. . Локтев. Картирование с помощью пептидов сайтов Е2-2 и Е2-6 гликопротеина Е2 вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей // Вопр. вирусол. -1993, -N4, -с.162-167.

7. В.А. Святченко, . Е.В.• Агапов, И.Х. Урманов, О.И. Серпинский, И.В. Фролов, A.A. Колыхалов, A.B. Рыжиков, C.B. Нетесов. Иммуногенные свойства рекомбинантного вируса осповакцины со встроенной ДНК-копией 26S РНК вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей // Вопр. вирусол. ^-1993, -N5, -С.222-226. _

Г"