Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хроматографическое выделение и характеризация гидрофобных вирусных и рекомбинантных белков и их фрагментов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Хроматографическое выделение и характеризация гидрофобных вирусных и рекомбинантных белков и их фрагментов"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ НПО "ВЕКТОР"

На правах рукописи

Акименко Зоя Александровна

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРЙЗАДИЯ ГИДРОФОБНЫХ ЁИРУСНЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ И ИХ ФРАГМЕНТОВ.

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата- химических наук

Кольцове. 199

Работа выполнена в научно-исследовательском институте молекулярной биологии Министерства Здравоохранения Per

Научный руководитель кандидат химических наук Офицеров ЕЛ'.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Мертвецов H.H. кандидат химических наук, Серпинский O.K.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии Hfe.M.M. Шемякина РАН

заседании Специализированного совета К 098.06.01 в НИК молекулярной биологик по адресу: 533159. г..Кольцове Новосибирского р-на. Новоеибиоскок облает;.

3 диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ. молекулярной биологии НПО "Вектор"

. у

Автореферат разослан " 1/ь " Д б-'у^ 1993 года Ученый секретарь Специализированного

на

мических наук Т.Н. Шубина

Актуальность проблемы. Одним из ключевых этапов в решении ряда проблем молекулярной биологии, биоорганической химии, и биотехнологии является получение высокочмстта белков и пептидов. Изучение пространственной структуры, постгрансляционной модификации в клетках, исследования биологической активности, антигенных, иммунагенных и других свойств белков - далеко не полный перечень задач, для решения которых необходимо иметь индивидуальные белки. Спектр методов разделения смесей полшептидов, используемых в настоящее время для получения необходимых индивидуальных белков, достаточно широк и разнообразен. Однако разработка эффективной схемы очистки целевых белков Есе еве остается сложной задачей. 'Дополнительные трудности возникают при выделении малорастворимых, гидрофобных белков. К ним относятся многие структурные белки -вирусов, а также некоторые рекомбинантные белки, образующие в клетках-продуцентах тельца включения, практически нерастворимые в обычных водных растворах. Подходы к выделению этих белков в настоящее время интенсивно разрабатываются.

Целью настоящих исследований явилась разработка методов разделения гидрофобных вирусных белков, их полипептвдных фрагментов и некоторых рекомбинантных белков, изучение их первичной структуры, иммунохиыических и других свойств.

Научная новизна и практическая значимость. С использованием звращэнно-фазовой хроматографии на макропористых сорбентах отечественного производства и элвентов, содержадих муравьиную кислоту, разработан эффективный метод очистки гидрофобных вирусных белков. С псмовьп разработанного метода выделен ряд кндивидуазь-¡гых белков вируса гриппа, клещевого энцефалита, Венесуэльского энцефаломиелита лошадей и Марбург. Получены новые данные об га первичной структуре, необходимые для изучения процесснита этих

белков. Показано, что в жестких условиях выделения сохраняется антигенная активность выделенных белков. На примере гемагглюти-нина вируса гриппа двух подтипов и белка. Е клещевого энцефалита показано взаимодействие с антисыворотками к соответствующим вируса« в радиоишуиоанализе и иммуноблоте.

Высокомолекулярный фрагмент гемаггдютинина вируса гриппа и белки вируса Ыарбург были использованы для исследования их про-текгиЕНой активности.

Разработан метод получения интерферона ct2 человека из малорастворимых телец включения и проведено исследование его первичной структуры. Доказана идентичность строения продукта экспрессии искусственного гена интерферона aZ его природному аналогу. Разработан метод выделения и очистки рекомбинантного ангиогенина из -состава химерного белка, изучены его физико-химические свойства и структура. Доказана правильность экспрессии соответствующего эукариотического гена в клетках E.Coli.

Разработан новый эффективный метод получения крупного поли-пептиднсго фрагмента гемагглютинина, содержащего в своей структуре участки, соответствующие антигенным детерминантам и сайту, узнающему рецептор. Изучены его свойства и показана перспективность использования в исследовательских и практических целях.

Полученные в дачной работе результаты были частью исследовании, проводимых в НИИ МБ по разработке субъединичкых и пептидных вакцин против-вирусов гриппа и Марбург (ШЕ-0884, ИМБ-0886, ВК-2468/1); исследований белков вируса клещевого энцефалита, проводимых совместно с Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН и Новосиби; :кого Института Биоорганической химии СО РАН.

Апробация работу. Основные результаты опубликованы в Б пе-

чатных работах. Материалы диссертации докладывались на VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллинн, 1S87), на конференции ВХО им. Менделеева "Молекулярная сорбция биологически активных веществ" (Пенза, 1990), на научных конференциях ВНИИ МБ.

Объем работы и структура диссертации. Диссертация изложена яа 114 страницах машинописного текста, включая 22 рисунка, 5 таблиц и список цитируемой литературы (99 наименований), состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, результаты и обсуждения, экспериментальная часта (материалы и методы). выводы.

Содержание работа.

Получение и харангеризацяя крупных Фрагментов вирусных белков и продуктов генно-инженерного синтеза. Для изучения антигенных детерминант, исследования иммуногенных, протективных, ре-цепторных и других свойств молекул белков широко используют пептидные фрагменты, полученные путем расщепления исследуемых белков химическими или ферментативными методами. Так, практически зсе данные по структуре и иммунохимнческим свойствам гемагглюти-нина (НА) получены на его высокомолекулярном пслипептиднсм фрагменте, выделенном при обработке вируса гриппа подтипа H3N2 про-теазой брсмелайн. Такой полипептид представляет собой НА с прс-теолатически отлепленной гидрофобной, находящейся з лm vu нем слое мембраны частью молекулы. Однако, этот метод сказался не пффекти.оел для получения геиагглятинина вируса гриппа ледтипа h'INl, несмотря 'ta то, что он имеет значительную гомологию пар-зичноа структуры с НА подтипа КЗ. Поэтому строение и сзсйстга чапечг/лы г°магглютинина подтипа Н1 практически не были подтгеря-.т^ны пкепеоиментально.

- б -

Задачей настоящего раздела работы было изучение структуры и свойств гемагглютинина вируса гриппа подтипа HI человека. Для зтсгс необходимо было разработать способ выделения высокомолекулярного полипептида гемагглютинина, содержащего практически все его антигенные детерминанты.

На основании анализа имеющейся в литературе информации о первичной последовательности гемагглютининов вируса гриппа подтипа HIN'l для нескольких десятков штаммов и о последовательностях других структурных белков вируса гриппа - нейраминидазе (NA), нуклеопротешговом (NP)- и матриксном (Ы) белках, нами установлена консервативность в расположении метионинов и кислото-лайильных связей Asp-Pro в этих белках. Метионины в молекуле НА расположены так, что при избирательном расщеплении белков по этой аминокислоте, например, бромистым цианом, возможно образование высокомолекулярного фрагмента, состоящего из трех олиго-пептидов тяжелой и легкой цепи, соединенных дисульфидными связями. всего 386 (рис.1) аминокислот. В то же время белки М, NP и NA при таком расщеплении будут образовывать низкомолекулярные пептиды.

Это явилось основой предложенного нами способа получения высокомолекулярного фрагмента НА гриппа подтипа H1N1. Суспензию вируса растворяли в 70Z муравьиной кислоте и в полученный раствор добавляли бромистый циан. Образующийся высокомоле!<улярный фрагмент гемагглютинина был отделен от смеси низкомолекулярных пепткдоБ.остальных белков вириона гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом G-100. Молекулярная масса полученного фрагмента, определенная с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, соответствовала расче.яой и составила бОкД. Гомогенность полученного полипептида доказана аналитической обращение-фаговой высокоэффективной хроматографией и электрофорезом. Полученные экспе-

риментальные данные по составу аминокислот выделенного тидного фрагмента НА тагасе соответствовали расчетным.

полипе-

42

276

у///)/у)/ //7МШ

3 3 10.

А

326

337 I •

Ш////////А

__ _221

Рис.1. Схема фрагментации гемаггдютинина вируса гриппа А/Киев/59/79 (НШ). Заштрихованы бромциановые пептиды тяжелой и легкой цепей. Б-Б - дисульфидкые связи. Пронумерованы циствины, образующие дисульфидкые связи, и последние аминокислоты' тяжелой и легкой цепей НА.

Для выяснения расположения дисульфидных связей в молекуле гемагглютинина нами была определена М-концевая последовательность трех полипептидов, из которых состоит броициаяовый фрагмент ( рис 1). Было определено 15 аминокислот одигопептида тяжелой цепи и по три Н-концевые аминокислоты пептидов, связанных с ним дисульфидными «остяками. Полученные последовательности соответствует Н-концевым аминокислотам - е1ц-Азп-1ои пептида легкой цепи, и АБр-а1и-Суз пептида из тяжелой цепи гемаггэзтинина, что указывает на связь цистеинов в положении 4 тяжелой цепи я 137 легкой цепи, а также цистеинов 42 и 276 тяжелой цепи НА. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено что.

расположение двух дисульфидкых связей в молекуле гемагглютинина подтипа Н1К1 аналогично расположению дисульфидных связей, для ге-ыагглютининов подтипа НЗМ£.

Поскольку выделенный фрагмент гемагглютинина содержит практически все антигенные детерминанты и аминокислоты, входящие ь сайт, узнающий клеточный рецептор, нами была проведена работа по исследованию антигенных, протекгивных и рецепторных свойств гемагглютинина. Методом иммуноблотинга и методом радиоиммуноанали-за показано, что фрагмент НА взаимодействует с гипериммунной антивирусной сывороткой.

Протективные свойства были изучены для высокомолекулярного полипептидного фрагмента НА вируса гриппа подтипа НЗН2 ( штамм А/А1сМ/2/68, адаптированный к мышам). Эти исследования проводились совместно с М.П. Смолиной в НИИЫБ. Показано, что иммунизация ишек фрагментом гемагглютинина и субъединичной вакциной, полученной на основе белков оболочки вируса гриппа, вызывает практически одинаковый рост противогриппозных антител. Иммунизация фрагментом НА защищает животных от последующего заражения 10 ДЯ50 вируса.

Эксперименты по исследованию' рецепторных свойств выделенного фрагмента гемагглютинина были проведены с использованием конкурентного радиорецепторного анализа' с меченым {Л12^; вирусов гриппа. Для гемагглютинина вируса гриппа А подтипа Н2 слублико ваш данные рентгеноструктурного анализа по локализации рецептс-рузнаотего сайта гемагглютинина. Известны ключевые аминокислоты, выстилащие дно рецепторузнающего "кармана" - дз(Азп), 186(11о), 201 (Аге), 220(Аге), 226 31п), 228(Иу), единичные замены которых

приводят к изменение тропизма вирусных мутантов. Поскольку для

в

НА вируса гриппа А различных подтипов существует высокая степень

гомологии участков, формирующих каркас молекулы, считают, что они имеют-сходную пространственную структуру. Последовательность тяжелой цепи гемагглютинина подтипа Н1 включает гомологичный рецептору знающий участок НА, который, по аналогии .с гемагглютини-ном подтипа НЗ, сформирован аминокислотной последовательностью, ограниченной положениями 84-249, и полностью входит в выделенный нами фрагмент.

Исследования рецепторнкх свойств проводили с гемагглютини-нсм, смесью легкой и тяжелой цепей НА с восстановленными и кар-боксиметилированнкми цистеинами, и восстановленным и карбсксметилированным бромциановьм фрагментом тяжелой цепи гемагглютинина гриппа штамма А/ Киев/59/79. Работа по рецептсрному анализу проведена совместно с Юркиной Э.А. зо ШЮМБ. Исследования показали, что все полипептиды специфически связываются с клеточными рецепторами, хотя и менее эффективно, чем НА. У фрагмента НА способность к рецепции на поверхности клеток в сравнении с на-тивным гемагглогинином была ниже в 2,5 раза, а в сравнении с восстановленным гемаггдютининсм - в 1,5 раза ниже.

Таким образом, установлено, что основной линейный участок НА', узнающий рецепторы клеток, находится в полипептидном фрагменте, включающем.аминокислоты с 1 по 273. Несмотря на значительное денатурирующее воздействие в результате всех стадии получения этого пелипептида, включая разрушение всех связей, одна ио которых (35-135) пространственно и линейно сближена с рецег.торным сайтом, полипептид сохраняет способность к специфическому связыванию с клетками. Эти данные представляют особый ■лг.теоес, поскольку известно, что расщепление НА на полипептиды ":п;гесдит к значительному снижению антигенных свойств сбразуших-фрагментов. а восстановление дисулафидных связей НА ведет к

полной потере способности их связываться с вируснейтрализугацими антителами.

Характериаащя химерного пожпептида геиагглти-нин -а-галактозвдаза. Разработанный нами метод получения высокомолекулярного фрагмента НА вируса гриппа был применен для доказательства экспрессии гена гемаггдютинина в составе рекомби-нантного химерного белка в-галактозидаза-гемагглютинин. Генно-инженерные работы по получению слитого белка галактозида-за-гемагглютинин гриппа проведены в НИКГИ ВАВ Киприяновым С.М. Для доказательства наличия полипептида гемагглютинина в составе слитого белка, экспрессированного в клетках E.coll, мы провели эксперимент по выщеплению из химерного полипептида высокомолекулярного фрагмента НА бромистым цианом. Эдектрофоретическим анализом белкового гидролизата, полученного после обработки суспензии клеток E.coll бромистым цианом, был обнаружен полипептид, соответствующий по молекулярной массе негликозилированному бром-циановому фрагменту тяжелой цепи НА. Взаимодействие этого полипептида с кроличьей антисывороткой к вирусу гриппа было продемонстрировано методом иммуноблоттинга.

Выделение и характеризация вирусных белков. С целью выделения и очистки структурных белков вирусов, содержащих оболочку, мы разработали метод,- основанный на использовании обравденно-фа-зовой хроматографии на отечественных широкопористых сорбентах. Первоначально для сорбентов Полисш-ОДС-300 и -500 на модельной смеси белков: овальбумине и бычьем сывороточном альбумине был подобран оптимальный состав элюентов, скорость потока и предельная нагрузка белков на сорбент. Было установлено, что эффективной ааиируицей системо,. является градиент ацетонитрила или спирта в 6QZ муравьиной кислоте. Эшюент, ъ состав которого входит изопро-

- и -

пайол, позволяет при хроматографии добиться лучаего разделения модельных белков, чем здюент, содержащий ацетонитрил. Показано, что на сорбенте с более крупными лорами -50 нм ( Псли-сил-ОДС-БОО) наблюдается более эффективнее разрешение белков. На этом сорбенте проводили разделение структурных белков вируса гриппа подтта НШ, штамм Чили 1/83, подтипа НЗМ2, итамм Ленинград 335/80; вируса клещевого энцефалита, штамм Софьт; вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей, лтамм ТС-83; Марбург, ¡цтачм ПОПП.

Исходный осадок зирионов, подученный высокоскоростным центрифугированием суспензии вируса, растворяли б 60-100% муравьиной кислоте и полученный раствор вирусных полипептидов наносили на хрсматографическу» колонку, уравновешенную 60" муразьиней кислотой. При хроматографии с практически количественным выходсм удалось выделить структурные белки вируса гриппа: гемагглятинин, нуклеопротеиновый (НР) и матриксньй (М), с молекулярными массами 78, 60, и 22 кД'соответственно (рис.2}.'

Аналогично были получены поверхностные гликопротеины и кап-сидные белки вирусов клещевого онцеФалита (ЕКЭ), Венесуэльского энцефаломиелита лоиздей (ВГОЛ), а также, белки "МР-96 и УР-АС вируса Марбург. Гомогенность выделенных вирусных белкез была подтверждена электрофорезом гз полиакрилаыиднем геле. Количествеиный анализ.аминокислотного состава был проведен для структурных белков вируса гриппа подтипа НШ (Чили 1/83), подтипа НЗМ2 и"е-нинграз ГЛБ. .00), а также зля гликспротеина Е и кзлеидного. белка •Ж."}. ". г-л-чиз. что.пкепораментальяо определенный аминскпслстнш . о*дксв удовдвтворэтельно совпадает с литературными закиши. гтесчитамными на основании я публикованных г.сследоза-?«льл<ч1т»а нуклостиасв г* нов соответствует«! белков.

Рис. 2.(а)Хроматографкческое разделение белков вируса гриппа А человека (штамм Чили 1/83, подтип K1N1) , на колонке 4,6*40 мм, с Полисил-ОДС-500 (Юмкм); элзоенгы: А-муравьиная кислота -вода 6:4; В -муравьиная кислота-изоп-рог.анол-вода, 4:5:1. Штриховой линией показано процентное содержание эяюента В в злюирующем растворе А. Скорость потека 1мл/мин.; (б) электрофоретический анализ чистоты полученных фракций NP- (1), М- (2) и НА-белков (3) в 13%. геле. Номер дорожки соответствует номеру фракции. Цифры-справа - молекулярные массы маркерных белков в кД.

Для изучения процессинга была определена Н-кокцевая последовательность НА, К, -МР белков вирусов гриппа, а также поверхностных и капсидных белков ВКЭ и ВВЭЛ.

Для гемагглютинина вируса гриппа подтипа Н1 (штамм Чили 1/83) впервые бьгла определена последовательность аминокислот тяжелой и легкой цепей НА. Для гемагглютинина подтипа 1Ш2, атамм

0

Ленинград 385/80, получена последовательность аминокислот легкой

цепи, совпадающая с опубликованной ранее К-кониевой последовательностью легкой пепи БА для ряда штаммов этого подтипа. К-концевая аминокислотная последовательность тяжелой цепи гемагглюти-нина не определялась, что, по-видимому, обусловлено циклизацией и-концевого глутамина. Аналогичный результат бьш опубликован ранее для гемагглютинина вируса гриппа, ятамм Гонконг.

Попытка определить методом Эдмана И-концевые аминокислотные последовательности выделенных М и ИР белков вируса гриппа дала отрицательный результат, что, возможно, связано с наличием в этих белках ацилированных производных И-концевых аминокислот.

Для выделенного хроматографией капсидного белка ЕКЭ быль, определена К-концевая последовательность А1а-61у-Ьуз-А1а. Таким образом, для капсидного белка ВКЗ показано, что после синтеза его на рибосоме происходит протеолитическое отщепление К-концевого метионкна меточной аминопептидазой, так же, как и для ранее изученных капсидных белков других флавивирусоЕ.

•При секвенировании белка Е последовательность аминокислот определить не удалось. Это, вероятно, обусловлено наличием на М-конце заблокированной аминокислоты, не вступающей в реакцию Эдмана. Интересно отметить. что гликопротеин С родственных фла-вивирусок: желтой лихогадки. Западного Нила, Канжин. Лейте имеет незаблокированную И-концевую аминокислоту. По-видимому, пос\-трансляшюнная модификация белка Е вируса клетевого энцефалита отличается от процессии; а поверхностных гликопоотеинов этих ви-русор.

Для гликопротеина Е1 вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей . нами определена Ы- концевая последовательность Туг-Ми-Шз-РЬе-ТЬг-ТЬг-Меи Она соответствовала последовательности аминокислот, рассчитанной по структуре участка генома ви-

руса, кодирующего этот белок. Аналогичный эксперимент с хрома-тографически очищенным Е2-белком ВВЗД не дал положительного результата, что, по всей вероятности, обусловлено наличием на N-конце исследуемого полипептида модифицированной аминокислоты.

Определенный интерес представляло исследование N-концевой последовательности капсидного белка ЕВЗЛ. Если для флавивирусзв был выявлен однотипный механизм процессинга капсидного белка, то для альфаЕирусоз к началу проведения налей работы закономерностей в процессинге капсидных белков установлено не было, поскольку было опубликовано исследование только одного представителя ■этого семейства - Еируса СиндОис. Для пего было показано, что синтез С-белка на рибосоме происходит с первого ATG ксдона £63 РНК, и что М-концевой метионин. ацетилировак. Однако, поскольку в 5'-концевой области 26S РНК альфавируссв имеются три близко расположенные друг от друга кодона AIG, то для других представителей этого семейства возможна трансляция с одного из этих кодовое. Для вируса вэл, к сожалению, ни один из трех кодснсе не удоволетворяет требованиям правила Козака, которое позволяет определить наиболее вероятный сайт начала трансляции гена.

В настоящей работе бша определена N-концевая ' последовательность капсидного белка из трех аминокислот Met-Gln-Prc. Этот результат можно интерпретировать так, что синтез С-белка у вируса Bai начинается с третьего ATG кодона 2CZ РНК. ¿¡знаке, нельзя полностью исключить вариант, в котором трансляция начин-чс-тси одного из предыдущих кодснсв AT-G и лидернии пептид, претсгву»-зий установленной последовательности аминокислот, отщепллстся с кдеткгд при согревали:! Оелка.

Яосг'ьй¡е углсвия. -испсльссванице для с?;зс?.;'.лиза::ии лгема-г.тг.й.г,' лгту'гггутных йолкез гаоугев. мсгли ~.г;«вест:! к их пнач«!•

тельной денатурации.' Нами были исследованы иммунохимические свойства некоторых вирусных белков, выделенных разработанным методом. С помощью радиоиммуноанализа было проведено сравнение хроматографически очищенного гемагглютинина с НА в составе вируса и показано, что выделенный гемагглютинин взаимодействует с антисывоткой к вирусу гриппа.

Индивидуальные бедки вируса клещевого энцефалита были исследованы иммуноблотингом, показавшим, что антисыворотка к ВКЭ специфически взаимодействует с гликопротеином Е, как в составе вируса, так и с хроматографически очищенным белком.

Выделенные структурные белки вируса Марбург №-96 и УР-40 были использованы для изучения иммуногенной активности. Эта работа была проведена совместно с лабораторией НЮШБ под руководством Игнатьева Г.М. Лимфоциты морских свинок, иммунизированных белком ЫР, обладали пролиферативной активностью при их стимуляции белком сравнимой с активностью ..лмфоцитов, взятых у животных, иммунизированных инактивированным вирусом Марбург. Белок УР-40 в аналогичном тесте вызывал слабую пролиферацию лимфоцитов у морских свинок. Белок использованный для иммунизации морских свинок, оказывал защитный эффект при последующем введении животным летальных доз вируса Марбург.

■На основании этих предварительных данных можно предположить, что белок ИР представляет интерес для дальнейшего изучения с целью конструирования глкцин против вируса Марбург.

Очистка и характеризация рекомбинантных белков. К рекомби-нантным белкам, предназначенным для использования в медицине и ветеринарии, предъявляются требования, разработанные Минздравом РФ« в соответствию! с рекомендациями ВОВ. В эти требования входят обязательная характеризация белка по составу аминокислот, а

- 16 -

также анализ N- и С-концевых аминокислот.

С целью такой характеризации нами была проведена работа по очистке рекомбинантных лейкоцитарного интерферона «2 и ангиоге-нина ( фактор роста кровеносных сосудов) для последующего доказательства правильности экспрессии искусственных генов, кодирующих эти белки. Штамм-продуцент генно-инженернсго интерферона с(2 человека был создан в НИИМБ. Было показано, что з лизатах клеток E.coll, несущих ген интерферона (IFN) в составе экспрессирухжего вектора, присутствует продукт с биологическими и иммунологическими свойствами лейкоцитарного интерферона а2 человека. Высокое содержание рекомбинантного инт."рферока в клетках продуцента приводит к образованию телец включения, нерастворимых б обычных водных растворах. Поэтому при его выделении и очистке возникают проблемы, характерные для pafiora с гидрофобными белками.

йами был разработан метод выделения гомогенного рекомбинантного интерферона из предварительно очищенных телец включения. Исходный продукт растворяли в 7.5 М солянокислом гуанидине или 100Z муравьиной кислоте и хроматографировали на аирокопорис-. теш обрааденно-фазовом носителе Полисил ОДС-ЗОО в элюенте с градиентом смеси ащетонитрила и изопрогганола (1:1) в 50Z муравьиной ккслоте. При хроматографии был получен практически гомогенный по электрофорезу полипептид (рис. 3), использованный для структурных исследований. Было установлено, что аминокислотный состав выделенного рекомбинантного^ интерферона соответствует составу природного аналога.-

На следующем этапе работы нами было исследовано, происходит лл в клетках E.ccii удаление N-концевсго метионина. «сдои которого используется для трансляции искусственного гена ¡FN. а ис--уегтггкнем гене жгтвпйесока, использованием дл.ч ¿строики г

плазмиду, были проведены замены нуклеотидов, не приводящие к изменению последовательности аминокислот в полипептиде интерферона. Исключением был только инициирующий колон АТЕ.

f-\ сог

0,6 0,5

0,Ъ 0,1

0.1

/

/

/

%В Г 1 90

/ i/1

/

60

30

I 2

ж

ьт

18 Кд

¿и мин

Рис. З.а) Хроматография интерферона на колонке 4.6x40 мм с широкопсристим c-tp .^енно-фззовым носителем Поли-сид-ОЕС-ЗОЭ (IOmkm); эжснты: А - муравьиная кислота-вода Б - шетснитрил -изопропансл- вода (З-.i-l) в 50Х муравьиной кислоте. Штриховой линией показано процентное содержание элюента В в элюирующем растворе А. Скорость элю-ции 1мл/мин. б) электрофорез в 12.5 X ПААГ. Номер дорожки соответствует номеру фракции хроматографии, пик 2- интерферон.

Поэтому при экспрессии гена интерферона возможен биосинтез полипептида, содержащего одну из трех №-концевых аминокислот: формилметионин, метионин, образующийся в результате деформилиро-вания, и цистеин, образующийся при протеолизе Л-концевой аминокислоты аминопепгидазой. Известно, что модификация или удаление цистеина отрицательно сказывается на биологической активности интерферона.

Экспериментально определенная нами аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида Суз-Азр-1_еи-Рго-С1п соответствовала структуре природного «2 интерферона.

С- концевые аминокислоты Интерферона, определенные с использованием исчерпывающего гидролиза полипептида смесью карбок-сипептидаз А и Б, а также карбоксипептидазой Р, соответствую: С-концевой структуре интерферона.

Кроме того, для доказательства идентичности рекоибинантног< и природного интерферона мы использовали фрагмента»® ре комби нантного интерферона бромистым цианом по остаткам метионина I последующим определением Н- концевых аминокислот в образовавших ся пептидах. В результате проведенного анализа идентифицировав! лейцин, аргинин, кзслейцнн, лизин и цистеиновая кислота, соот ветствувдие М-концевш остаткам пептидов природного интерферона которые должны образоваться после расщгплекия его бромщшном.

Таким образом, прямой анализ выделенного рекомбинаятног интерферона позволил нам сделать вывод о соответствии его струн туры природному белку - лейкоцитарному интерферону «2 человека.

Выявление н харакгериващю аигиогенкна (фактор роста кро иеносных сосудов). Работа по клонированию и экспрессии аягиоге пина человека в составе химерного белка с В-галактоаидааой был проведена Коваленко С.П. в Институте Биосгсганической химии СС

РАН, под руководством профессора Мертвецова Н.П. Экспрессия слитого белка была показана злектрофоретическим анализом. С целью вьпцепления полипептида ангисгенина из химерного белка в области слияния его с галактозидазой был предусмотрен сайт растепления аминокислот по кислотолабильной связи аспарагиновая кислота -пролин. Поскольку в аминокислотной последовательности самого ая-гиогенина связи Asp-Pro нет, то в условиях мягкого кислотного гидролиза из химерного рекомбинантного полипептида 8-галактози-даза-ангиогенин должен выщепиться полноразмерный ангиогенин, начинающийся с Я-концевого пролина.

Для получения полипептида, соответствующего по структуре ангиогенину, нами были использованы условия избирательного гидролиза пептидной связи Asp-Pro в 707. муравьиной кислоте. Однако анализ продуктов кислотного гидролиза бактериальных белков в муравьиной кислоте электрофорезом показал, что наблюдается гидролиз белков, но при этом полипепгид с молекулярной массой, рассчитанной для ангиогенина, не образуется. Поэтому мы провели расщепление исходного продукта в пиридин-ацетатном буфере с 6М солянокислым гуанидином. В этих условиях удалось осуществить ограниченный кислотный гидролиз с образованием полипептида с молекулярной массой, соответствующей ангиогенин-,".

■Целевой продукт был выделен из подученой смеси фрагменте?, белков хроматографией на обращение»-фазовом сорбенте Полисил 0ДС-300 в системе элюции муравьиной кислотой. Для полученного гомогенного полипептида нами была определена N- концевая последовательность из 7 аминокислот - Pro-Ser-Arg-Tyr-Trp-His-Phe. Эта последовательность полностью соотвествовала структуре семи N-концевых аминокислот ангиогенина. Аминокислотный состав, определенный после гидролиза выделенного полипептида, также удовлет-

ворительно совпал с расчетными данными состава аминокислот анги-огенина.

3 результате проведенных исследований разработан метод выделения и очистки рекомбинантного ангиогенина из химерного белка. Доказано соответствие структуры выделенного полипептидг структуре гена, кодирующего ангиогенин.

I

• 2ЫЕСДЫ

Разработан эффективный метод очистки гидрофобных вирусных белков, основанный на обращенно-фазозой хроматографии с использованием отечественных макропористых сорбентов.

2. Показано, что выделенные хроматографией гемагглюгикю вируса гриппа двух подтипов и белок Е клещевого энцефалита взаимодействуют с антисыворотками к соответствующим вирусам, и, следовательно, разработанные методы позволяют сохранить иммунохими-ческие свойства вирусных белков.

3. Выделен ряд индивидуальных белков вируса гриппа,' клещевого энцефалита, венесуэльского энцефаломиелита лошадей и получены новые данные об их первичной структуре, важные ,с точки зрения изучения процессинга этих белкоз.

. 4. Разработан новый эффективный метод получения крупной падипептздкого фрагмента гемагглвтинина, содержащего а свсо! структуре участки, соответствующие антигенным д^терминачтзм ; сайту. узнающему рецептор. Изучены его свойства и показана перспективность использования 3 исследовательских и практических цс-

ЛЯХ. ' . -

а. -Лсказаиа-изентячность строения продукта экспрессии ис-•с/гстагансго генаЧП» в клетках Е.сэ'И эгс приссдсму аналогу, 'цельс'розсас'стаи «етсл получения ятого аолипоптида-из на-

юрастворимых телец включения и проведано исследование его пер-зичной структуры.

6. Разработан метод выделения и очистки рекоыбинантного ак-■исгенина, изучены его физико-химические свойства и структура, :оказана правильность экспрессии соответствующего эукариотичес-<ого гена в клетках E.Coli.

Основное содержание диссертант изложено в работая:

1. Е.А.Петренко, С.М.Киприянов, Г.А.Мизенкс, A.M. Ерошит, Г.Ф.Сиволобова, м.Ю.Рукавишников, 3.А.Акименко, А.Н.Болдырев, В.В.Калашников. Конструирование и экспрессия в Escherichia coli гена гибридного гемагглктиника подтипа Н1-НЗ вируса гриппа.// Молекулярная биология 1990. Т.24. Вып.2. С. 408-416.

2. Петренко В.А., Киприянов С.Ы., Семенова Л.Н., Акименко S.A., Рукавишников М.Ю., Болдырев А.Н., Поздняков П.И., Кокдра-хин Ю.В., Клонирование к экспрессия в E.Coli гемагглютикина вируса -гриппа подтипа H1N1. //Молекулярная биология. 1989. Т.23.

С, 8Й9-898.

3. Юокина Э.А.. Акименко З.А., Зыков С.А., Офицеров В.К., РецепторнЫе свойства гемагглюгинина вируса гриппа и его полипеп--тидных фрагментов.// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 193S. hi.6. С.43- -si:.

4. Акименко Э.А., Зыков С.А.. Ястребов С.И.., Офицеров В.К., Высокоэффективная жидкостная хроматография и характеризацкя структурных белков вируса гриппа.// Биооргаяическая химия 1990. Т.15. N.1C. C.1G37-1G42.

5. Агафонов А.П., Игнатьев Г.М,, Кузьмин В.А., Акименко З.А., Косарева Т.В.. Иммуногенные свойства белков вируса Мар-бург.// Вопросы вирусологии 1992. Т.37, ИЛ. С.56-61.

и^ицеров а.л., дкиыенко а.д., аыков в.А., // Способ выделения и свойства высокомолекулярного бромцианового фрагмента гемагглзотинина гриппа, подтип H1N1. Всесоюзный симпозиум по химки белков и пептидов, 7-й. -Таллинн, 1987. С.18.

7. Акименко S.A., Ляпустин В.Н., Шапров В.В., Хроматографи-,ческое выделение и характеризация белков вируса клещевого энцефалита.// Конф. ВХО им. Менделеева "Молек. сорбция биол. актив. äesgCTB": Сборник тезисов. Пенза. 1990. С.68.