Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональный анализ транспортных белков тобамовирусов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Функциональный анализ транспортных белков тобамовирусов"

московский государственный университет

имени М. В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 578.865:578.233.443

ИВАНОВ Константин /Ильич

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЙШ ТТАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ ТОБАМОВИРУСОВ

ОЗ.ОО.Об-Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

академик РАН, профессор И.Г. Атабеков доктор биологических наук ЮЛ. Дорохов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук А.А. Аграновский доктор биологических наук С.К. Завриев

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится 29 октября 1997 года в 10:00 на заседании Специализированного Совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 22 сентября 1997 года.

Ученый секретарь Специализированного Ученого сове кандидат химических наук:

В.Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. При заражении растений вирусы проникают в небольшое число первично-инфицированных клеток. Эффективность последующего транспорта инфекции в окружающие здоровые клетки является ключевым процессом, определяющим патогенность и симптоматику вирусных заболеваний, а также спектр хозяев вируса. Использование плазмодесм для транспорта инфекции, а не выход в межклеточное пространство - характерное эволюционное приобретение вирусов растений в отличие от вирусов животных и бактериофагов.

Традиционная точка зрения на проблему распространения фитовируса из клетки в клетку как на генетически пассивный процесс, происходящий без участия вирусспецифических лолипептидов, в последнее время была кардинально пересмотрена. Появились экспериментальные факты, свидетельствующие, что транспорт вирусного генетического материала является активным процессом, выполняющимся с участием кодируемых вирусом транспортных белков (ТБ) (Atabekov and Dorokhov, 1984).

Необходимость изучении механизма действия транспортных белков продиктована тем, что их функция в значительной мере определяет скорость распространения инфекции и степень поражения растения. Исследования этой проблемы в значительной степени сосредоточены на классическом объекте - тобамовирусе табачной мозаики (ВТМ). Обнаружено, что транспортный белок ВТМ размером 30 кДа способен модифицировать плазмодесмы, увеличивая их пропускную способность (Wolf et al., 1989), а также прочно связываться с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами (Citovsky et al., 1990). Предполагается, что межклеточный транспорт ВТМ осуществляется в форме вирусспецифических рибонуклеопротеиновых (РНП) комплексов, способных перемещаться по модифицированным плазмодесмам (Citovsky and Zambryski, 1991). Однако, отсутствуют экспериментальные подтверждения того, что РНП комплексы действительно предстаагают собой транспортные интермедиаты, перемещающиеся из клетки в клетку по плазмодесмам и не участвующие в репликации вируса. Остается также неизвестным механизм взаимодействия транспортных белков с компонентами плазмодесм.

Изучение транспортного белка in vitro долгое время было затруднено сложностью его выделения из тканей инфицированного растения, так как трансляция вирусной субгеномной РНК, кодирующей 30 кДа полипептид, дает in vivo очень малые количества белка и протекает в самом начале инфекционного процесса (Watanabe et al., 1984). Между тем, совершенно очевидно, что для исследования 30 кДа полипептида с помощью современных биохимических методов требуюся препаративные количества очищенного белка. Эта задача решалась в данной работе путем экспрессии в E.coli генов транспортных белков в виде гибридов с металл-связывающими пептидами.

Целью настоящей работы явилось:

1)получение бактериальных штаммов-продуцентов гибридных транспортных белков тобамовирусов, в структуре которых заложена возможность выделения и очистки их посредством металл-хелатной аффинной хроматографии;

2)разработка метода исследования комплексов транспортных белков с полноразмерными вирусными геномными РНК;

3)изучение влияния транспортных белков на трансляцию вирусных РНК;

4)поиск клеточных белков, специфически связывающихся с транспортными белками.

Научная новизна и практическая ценность работы. Получены очищенные препараты гибридных транспортных белков двух тобамовирусов: ВТМ штамма U1 и тобамовируса крестоцветных (кр-ВТМ) с N-концевыми аффинными доменами из шести остатков гистидина. Наряду с полноразмерным 30 кДа белком ВТМ U1, выделены два его делеционных мутанта: DEL4 и DEL10, у которых отсутствуют функционально важные участки аминокислотной последовательности.

Разработан новый метод исследования рибонуклеопротеиновых (РНП) и белок-белковых комплексов, основанный на нековалентной иммобилизации полипептида-мишени на металл-хелатном сорбенте. С помощью этого метода впервые показано, что транспортные белки ВТМ U1 и кр-ВТМ образуют устойчивые комплексы с полноразмерными вирусными геномными РНК.

Впервые установлено, что транспортные белки тобамовирусов эффективно подавляют трансляцию РНК in vitro, что показывает возможность существования внутри инфицированной клетки пула молекул вирусных РНК, участвующих в перемещении по плазмодесмам и полностью исключенных из репликации.

В настоящей работе обнаружены полипептиды клеточных стенок, способные связываться с транспортными белками тобамовирусов. Возможно, что обнаруженные полипептиды являются компонентами рецептора, взаимодействующего с вирусными транспортными белками.

Результаты данной работы позволяют глубже понять механизм межклеточного транспорта вирусной инфекции. Возможность с помощью методов молекулярной биологии повлиять на выражение функции транспорта имеет большое прикладное значение, так как фитопатогенные вирусы наносят серьезный экономический ущерб сельскому хозяйству. Обнаружение тесной взаимосвязи между транспортом инфекции и некоторыми видами устойчивости к фитопатогенным вирусам (Meshi et а]., 1989; Calder and Palukaitis, 1992; Weber et al., 1993) открывает перспективы разработки новых подходов к получению вирусоустойчивых растений.

Апробадия работы. Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-

химической биологии им. А.Н.Белозерского 21 апреля 1997 года. Результаты работы докладывались на международных конференциях: "Fundamental and applied problems in phytovirology", Ялта, Украина, 1994; "Russian-german workshop on plant biotechnology", Гатерслебен, Германия, 1994; "Xth international congress of virology", Иерусалим, Израиль 1996; "16th annual meeting of american society for virology", Боземан, США, 1997.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из глав "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы". Работа изложена на 96 страницах, содержит 29 рисунков и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В 1992 году на кафедре вирусологии МГУ им. М.В.Ломоносова из Oleracia officinalis L. был выделен новый тобамовирус с расширенным кругом хозяев (Новиков В.К., неопубликованные данные). Было обнаружено, что помимо Nicotiana tabacum L. (инфицируемого ВТМ U1), новый вирус заражает растения семейства крестоцветных: Brassica chinensis L., В. rapa L., В. napus L., В. compestris L., Arabidopsis thaliana. Участки генома этого вируса, получившего обозначение кр-ВТМ, были клонированы в виде кДНК, что дало возможность определить его полную нуклеотидную последовательность (Dorokhov et al., 1994). Подобно другим тобамовирусам, геном кр-ВТМ содержит ген, кодирующий гипотетический транспортный белок с размером 30 кДа. В то же время, аминокислотные последовательности 30 кДа белков ВТМ U1 и кр-ВТМ не полностью гомологичны (Dorokhov et al., 1994; Иванов П.А., 1997). В настоящей работе были получены очищенные препараты 30 кДа белков ВТМ U1 и кр-ВТМ, и проведены сравнительные исследования биохимических свойств этих полипептидов.

1. Получение очищенных препаратов транспортных белков ВТМ U1 и кр-ВТМ.

Применение аффинной хроматографии для очистки рекомбинантных белков обычно предполагает введение в целевой полипептид дополнительного домена, участвующего в связывании с соответствующим сорбентом. На сегодняшний день известно большое число таких доменов, однако почти все они обладают общим недостатком: достаточно большой длиной. Гибридные белки, содержащие такие протяженные домены, обладают существенно большими размерами, чем их предшественники, и значительно

отличаются от исходных белков по своей третичной структуре. Подобные изменения в третичной структуре белков могут приводить к частичной или полной потере их функциональной активности. Условием сохранения нативной конформации белка при очистке его методом аффинной хроматографии является минимальная длина домена, участвующего в связывании с сорбентом.

Метод металл-хелатной аффинной хроматографии (IMAC) (Porath et al., 1975) основан на введении в один из концов рекомбинантного белка короткой последовательности основных аминокислот, способных прочно связываться с иммобилизованными ионами металлов. Обычно для создания искусственных металл-связывающих доменов в белке используются гистидин-богатые последовательности. Типичным сорбентом IMAC является иммобилизованный комплексон I (нитрилотриацетат или НТА) в комплексе с катионом никеля (Hochuli et al, 1988), получивший сокращенное обозначение Ni-HTA. Связывание гибридного белка с Ni-НТА сорбентом осуществляется только в щелочной области рН, когда имидазольные кольца гистидинов депротонированы. При понижении рН комплекс разрушается и рекомбинантный белок элюируется с колонки. Таким образом, становится возможным предварительно очистить препарат в щелочной среде от несвязавшихся с сорбентом белков E.coli, а затем понизить рН и отдельно элюировать целевой белок с колонки.

В настоящей работе методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на матрице вирусной кДНК были получены последовательности 30 кДа-генов ВТМ U1 и кр-ВТМ. Амплифицированные фрагменты ДНК лигировали в плазмидный вектор pQE-9 (DIAGEN, Германия), предназначенный для экспрессии рекомбинантных генов в виде гибридных белков, содержащих N-концевой аффинный домен из шести остатков гистидина ((Гис)б). Клетки E.coli штамма M15, трансформированные этими конструкциями, выращивали в небольших объемах культуральной среды, а затем индуцировали экспрессию в них клонированных генов при помощи IPTG. Полученные клеточные лизаты анализировали методом электрофореза в содержащем SDS 12% ПААГ по методу Лэммли (Laemmli, 1970), причем в качестве негативного контроля использовали лизаты клеток, выращенных без добавления IPTG. В результате в ряде клонов удалось обнаружить высокий уровень биосинтеза белков с молекулярными массами порядка 30 кДа, соответствующих по подвижности в геле транспортным белкам кр-ВТМ и ВТМ U1 (рис. 1 - дорожки 2 и 5). На следующем этапе работы с помощью хроматографии на Ni-HTA агарозе проводили препаративную очистку рекомбинантных белков от белков E.coli, проверяя чистоту полученных препаратов в денатурирующем ПААГ по Лэммли (рис. 1 - дорожки 3 и 6).

Таким образом, нами были получены бактериальные штаммы-продуценты гибридных транспортных белков ВТМ U1 и тобамовируса крестоцветных (кр-ВТМ) с N-концевыми (Гис)б-аффинными доменами и проведена очистка этих белков методом металл-хелатной аффинной хроматографии.

А Б

M 1 2 3 4 97- - г-

66- - '

45" ' - • te*- •••

l—'J __

29- ..

Рис. 1 Анализ результатов экспрессии генов транспортных белков кр-ВТМ (Л) и ВТМ 171 (Б) в Е.соИ. Лизаты клеток, содержащих плазмиду рОЕ-9 с клонированными генами 30 кДа белков тобамовирусов анализировали в денатурирующем 12% ПААГ по Лэммли до (дорожки 1,4) и после (дорожки 2,5) индукции 1РТО. Никель-хелатная аффинная хроматография полученных лизатов позволила получить чистые (Гис)$ гибридные транспортные белки (дорожки 3,6). Слева указаны молекулярные массы маркерных белков в килодалътонах.

Для исследования функции транспортных белков использовали не только полноразмерные белки, но и их производные с искусственно укороченной аминокислотной последовательностью. Бактериальные штаммы-продуценты (Гис)б-делеционных мутантов транспортного белка ВТМ U1 были получены на основе конструкций DEL4 и DEL10, любезно предоставленных V.Citovsky (Стони Брук, США). В конструкции DEL4 удалены аминокислоты со 130 по 185 (130-185), при этом частично затронуты РНК-связывающий домен А (112-185) (Citovsky et al., 1992) и домен Е, ответственный за увеличение пропускной способности плазмодесм (126-224) (Waigmann et al., 1994). В случае DEL10, где отсутствуют аминокислоты со 185 по 268, полностью инактивирован РНК-связывающий домен В (185-268) (Citovsky et al, 1992). Кроме того, в DEL10 удалена часть домена Е (126-224), включая 19 аминокислот (195-213), ответственных за локализацию транспортного белка в клеточных стенках (Berna et al., 1991). Клонирование, экспрессию и хроматографическую очистку (Гис)б-ЭЕЬ4 и (Гис)б-БЕЫО проводили как описано выше для транспортных белков ВТМ U1 и кр-ВТМ.

2. Иммобилизованные транспортные белки тобамовирусов формируют устойчивые комплексы с полноразмерными вирусными геномными РНЕ.

Способность 30 кДа транспортного белка BTM U1 прочно связываться с молекулами РНК (Citovsky et al., 1990) позволила предположить, что в процессе межклеточного транспорта ТБ выполняют для вирусных РНК функцию молекулярных шаперонов. Связывание транспортного белка ВТМ с РНК не зависит от последовательности нуклеотидов в РНК и имеет кооперативный характер. Это означает, что молекулы транспортного белка функционируют наподобие SSB-белков E.coli, равномерно "одевая" вирусную РНК. В соответствии с таким механизмом, при образовании рибонуклеопротеинового (РНП) комплекса происходит распрямление молекулы вирусной РНК, она уменьшается в диаметре и приобретает способность перемещаться по плазмодесмам из клетки в клетку. В первых экспериментах по связыванию 30 кДа ТБ ВТМ U1 с РНК использовалась модельная система, где в качестве субстрата для транспортного белка использовался РНК-транскрипт длиной 182 нуклеотида. Взаимодействие 30 кДа ТБ ВТМ U1 с РНК-транскриптом было показано с помощью методов замедления в геле и ковалентной сшивки ультрафиолетом (Citovsky et al., 1990). Однако, такой эксперимент достаточно далек от сценария, по которому происходит связывание транспортного белка и вирусной РНК in vivo. В отличие от короткого транскрипта, вероятным природным субстратом для ТБ является геномная РНК ВТМ длиной около 6400 нуклеотидов. Такая протяженная молекула не может эффективно использоваться как в опытах по замедлению РНП комплексов в геле, так и в опытах по их сшивке ультрафиолетом. Чтобы показать взаимодействие транспортного белка и полноразмерной вирусной геномной РНК, был разработан новый метод, основанный на описанной выше иммобилизации белков на никель-хелатном сорбенте.

Принцип метода заключается в том, что связанные с никель-хелатным сорбентом белки могут взаимодействовать с молекулами нуклеиновых кислот любого размера, образуя иммобилизованные РНП комплексы. Так как связь белка с сорбентом является нековалентной, она не нарушает третичную структуру белка, и вместе с тем прочность такой связи достаточна, чтобы не происходило самопроизвольное элюирование белка с колонки. Достоинством метода является обратимость взаимодействия белка с сорбентом: десорбцию белка с никель-хелатной колонки можно осуществлять как путем понижения рН, так и путем добавления низкомолекулярных соединений (имидазол, гистидин), конкурирующих за центры связывания с катионом никеля. Кроме того, метод позволяет проводить ренатурацию белка в иммобилизованном состоянии. Это особенно важно при работе с гидрофобными белками, склонными к агрегации в процессе диализа. Недавно была проведена ренатурация иммобилизованного на никель-хелатном сорбенте гидрофобного белка D1 из тилакоидных мембран злаков с полным восстановлением нативной структуры полипептидной

цепи (Фрадков А.Ф., 1995). Учитывая, что транспортные белки тобамовирусов обладают гидрофобными свойствами, их ренатурацию после хроматографической очистки было решено также проводить в иммобилизованном состоянии.

Перед началом проведения экспериментов по связыванию транспортных белков тобамовирусов с полноразмерными вирусными геномными РНК было показано, что введение шстидин-богатого лидера в рекомбинантные белки не привело к потере ими способности взаимодействовать с РНК. Для этого использовали описанный ранее метод, основанный на ковалентной сшивке РНП комплексов (СйоУБку й а1., 1990). Очищенные препараты гибридных транспортных белков ВТМ Ш и кр-ВТМ диализовали против трис-НС1 буфера низкой концентрации и инкубировали с радиоактивно-меченным РНК-транскриптом длиной 800 нуклеотидов. РНК-транскрипт ковалентно сшивали с белком в местах контакта при помощи ультрафиолета, а затем разрушали свободные от белка участки РНК при помощи РНКазы А. Анализ ковалентно-связанных комплексов гель-электрофорезом показал, что полученные гибридные транспортные белки подобно своим природным аналогам обладают РНК-связывающими свойствами (рис. 2).

1 2 3 4 5 6 7 8

6846-

25- .

U1 ПК К УФ- кр ПК К УФ-

Рис. 2 Электрофорез в 12% ПЛАТ с ДСН ковалентно-связанных комплексов, образованных транспортными белками ВТМ Ш (дорожка 1) и кр-ВТМ (дорожка 5) с радиоактивно-меченным РНК-транскриптом длиной 800 нуклеотидов. Транспортные белки инкубировали с РНК, затем облучали препараты ультрафиолетом, обрабатывали РПКазой Л и наносили на ПЛАТ. В серии контрольных экспериментов после инкубации препараты обрабатывали протеиназой К (дорожки 2,6), инкубацию проводили в присутствии 1000-кратного избытка немеченого транскрипта (дорожки 3,7), не облучали препараты ультрафиолетом (дорожки 4,8). После проведения электрофореза, гели высушивали и авторадиографировали. Слева указаны молекулярные массы маркерных белков в килодальтонах.

Интересно, что подвижность комплексов белок-РНК в полиакриламидном геле оказалась лишь незначительно меньше

подвижности свободных белков. Аналогичные результаты описаны СЛОтку й а!., 1990 для ковалентно-связанных комплексов транспортного бежа ВТМ Ш с РНК-транскриптом длиной 182 нуклеотида. Предложенное объяснение этого заключается в том, что после обработки РНКазой только несколько непосредственно контактирующих с белком нуклеотидов остаются в составе комплекса (Спешку й а1., 1990). РНК-связывающие свойства полученных гибридных транспортных белков ВТМ Ш и кр-ВТМ были также показаны, помимо описанного выше метода, при инкубации белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозпых мембранах, с радиоактивно-меченными РНК-транскриптами.

Для демонстрации связывания полученных гибридных транспортных белков тобамовирусов с полноразмерными вирусными геномными РНК, проводили эксперименты по схеме, представленной на рис. 3. Предварительно очищенные препараты рекомбинантных белков (стадия 1) иммобилизовали на никель-хелатном сорбенте при рН 8,0 в 8М растворе мочевины (стадия 2). Для максимального насыщения белком центров связывания с сорбентом, белки наносили на колонку в значительном избытке. Ренатурацию иммобилизованных белков проводили путем приложения к колонке понижающегося градиента концентрации мочевины, осуществляя медленное удаление денатурирующего агента. После окончания ренатурации иммобилизованного белка, на колонку наносили препарат геномной РНК ВТМ (стадия 3). Связывание РНК ВТМ с транспортными белками приводило к образованию иммобилизованных РНП комплексов (стадия 4). Для извлечения РНК из РНП комплексов, через колонку пропускали буферный раствор с градиентно повышающейся концентрацией №С1 (стадия 5).

Связи белок-РНК и белок-сорбент обладают разной устойчивостью в растворах с повышающейся концентрацией соли. Известно, что взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами в большой степени обусловлены электростатическими силами. Эти взаимодействия ингабируются при повышении ионной силы раствора, причем, чем прочнее комплекс белка с нуклеиновой кислотой, тем большая концентрация соли требуется для его диссоциации. С другой стороны, связывание гибридных (Гис)б-белков с металл-хелатным сорбентом практически не зависит от ионной силы раствора, а значит солевой градиент можно эффективно использовать на стадии 5, чтобы извлекать РНК из иммобилизованного РНП комплекса. На завершающей стадии 6, осуществляли десорбцию транспортных белков с колонки путем понижения рН элюента.

Проведение эксперимента контролировали, используя спектрофотометр с проточной кюветой, регистрирующий поглощение в интервале 254-280 нм. В этом диапазоне длин волн возможно одновременное измерение поглощения белков (Хмах=280нм) и нуклеиновых кислот (Хмах=254нм). В ходе регистрации каждого пика, собирали фракции элюата, которые затем анализировали гель-электрофорезом на присутствие в них транспортных белков и вирусной

Никель-хелатный сорбент

Иммобилизация очищенного транспортного бежа на нгасель-хелашсм сорбенте прирН 8,0

Экспрессия гена транспортного балка в Е со1£ краматсграфичесжая очистка поточенного белка на никаль-хелатном сорбенте

Транспортный белок

Аффинный домен из шести г остатков тстпдмна

Сгазыванне транспортного белка с палноразмешсй вирусной геномной ^НК

О

-ЫТА "МГ

Иммобилизованный транспортный белок

Полноразмерная вирусная геномная РНК

Образование иммобилизованного риб ш>клешрстаннаваго (РНП) комплекса

-ЫТА-ЫГ

МТА"1МГ

Дисссцишия РНПксмшш: возрастающей гащентраш

-ГМТА-М!

РНП комплекс *

Элкиия транспартнсго белкз с ништь-хелатнаго сорбента при рН 5,0

ЫТА-ЫГ

О

*Птелпаложитвдьно, РНП шетлехс образован кооперативно оэязшэшшнися с РКК молекулами транспсрпето белка Относитатьный размер молекул РНК аитшо уменьшен для наглядности изображения.

Рис. 3 Схема проведения эксперимента по связыванию гибридных (Гис)а-трапспортпых белков тобамовирусов с полпорашерными вирусными геномными РНК,

РНК. На рис. 4 представлена хроматограмма, полученная при проведении эксперимента по связыванию иммобилизованного (Гис)6-транспортного белка ВТМ ТЛ с полноразмерной геномной РНК ВТМ Ш.

10« 20 30 40

Номера фракций

I II

III М

-68 -46

В

И

^ -25 -3234

-2114

«« -12.5

Рис. 4 Гибридный (Гис) ¿-транспортный белок ВТМ VI образует устойчивый РНП комплекс с полноразмерной геномной РЫК ВТМ VI.

A) Хроматограмма, полученная при проведении эксперимента по связыванию иммобилизованного (Тис) ¿-транспортного белка ВТМ VI с полноразмерпой геномной РНК ВТМ VI. Стрелками отмечены момент нанесения па колонку РНК (первая стрелка) и начало приложения к колонке линейно повышающегося градиента концентрации ЫаС1 (вторая стрелка). Хроматографические пики отмечены латинскими цифрами.

Б) Электрофорез (12% ПААГ с ДСН) фракций, соответствующих ликам Т-Ш, показал присутствие 30 кДа (Гис)(-транспортного белка только в материале фракции III (гель окрашивали кумасси). Справа указаны молекулярные массы маркерных белков в килодальтонах.

B) Элгктофорез в 3% ПААГ фракции П. Окрашивание геля метилеиовым синим позволило обнаружить во фракции II полноразмерную геномную РНК ВТМ VI (6400 нуклеотидов). Справа отмечены положения в геле маркерных РНК и указано число нуклеотидов в них.

Большая часть нанесенной на колонку вирусной РНК связывалась с иммобилизованным транспортным белком, образуя РНП комплекс, однако часть молекул РНК "проскакивала" через колонку, не участвуя во взаимодействии. Такие молекулы элюировались первыми (пик I). Для проверки того, что материал первого пика не содержат транспортного белка, соответствующую ему фракцию анализировали в ПААГ с ДСН. Как видно на рис. 4 (дорожка I), в этой фракции транспортный белок отсутствовал. На следующей стадии эксперимента к колонке с иммобилизованным РНП комплексом прилагали линейно повышающийся градиент концентрации NaCl. Когда концентрация соли в элюенте достигла значения 0.4М, был зарегистрирован пик (II) РНК, извлеченной из РНП комплекса. Фракцию, соответствующую пику II, анализировали в 3% ПААГ на присутствие в ней РНК ВТМ длиной 6400 нуклеотидов. На рис. 4,В видно, что фракция II действительно содержала полноразмерную вирусную геномную РНК. Вместе с тем, в этой фракции не обнаружили транспортного белка ВТМ U1 (рис. 4,Б, дорожка II). Десорбцию (Гис)б-транспортного белка с колонки осуществляли путем понижения pH элюента, регистрируя при этом пик (III). Электрофорез в ПААГ с ДСН материала из фракции, соответствующей пику III, показал наличие в нем транспортного белка ВТМ U1 (рис. 4,Б, дорожка III).

Аналогичный эксперимент по связыванию (Гис)§-транспортного белка тобамовируса, инфицирующего растения семейства крестоцветных (кр-ВТМ), с геномной РНК ВТМ U1 также показал образование РНП комплекса. Интересно, что по устойчивости в солевом растворе этот комплекс не отличается от комплекса транспортного белка ВТМ UI с РНК ВТМ U1. На хроматограмме, полученной при исследовании взаимодействия транспортного белка кр-ВТМ с РНК ВТМ U1 (рис. 5), видно, что иммобилизованный РНП комплекс разрушается (пик II) при той же концентрации NaCl (0.4 М),

20 30

Номера фракций

Рис. 5 Хроматограмма, полученная в ходе эксперимента по связыванию иммобилизованного (Гис)¿-транспортного белка тобамовируса, инфицирующего растения семейства крестоцветных (кр-ВТМ), с полноразмерной геномной РНК ВТМ VI. Обозначения см. рис. 4,А.

что и в описанном выше опыте с транспортным белком ВТМ Ш. Таким образом, транспортные белки двух тобамовирусов ВТМ Ш и кр-ВТМ обладают общим свойством образовывать устойчивые РНП комплексы с полноразмерной вирусной геномной РНК

Известно, что отрицательно заряженные молекулы нуклеиновых кислот способны взаимодействовать с двузарядными катионами металлов. Чтобы исключить возможность того, что наблюдаемое связывание вирусной РНК обусловлено ее сродством к №2+-хелатному сорбенту, провели контрольный эксперимент, в котором РНК наносили на колонку, не содержащую иммобилизованного белка. Полученная в ходе эксперимента хроматограмма (рис. 6) показала, что практически вся РНК не задерживалась на колонке и элкжровалась в пике I.

В другом контрольном эксперименте исследовали возможность образования РНП комплекса между вирусной РНК и белком, не обладающим выраженными РНК-связывающими свойствами. В качестве такого белка был выбран рекомбинантный (Гис)^-проинсулин человека, любезно предоставленный А.Ф. Фрадковым (Институт Биоорганической химии РАН). Соотношение площадей пиков I и II на хроматограмме (рис. 6) свидетельствует о том, что только незначительная часть молекул РНК связывалась с (Гис)^-проинсулином. С другой стороны прочность образующегося комплекса оказалась существенно ниже, чем прочность РНП комплексов транспортных белков. Концентрация ЫаС1, необходимая для разрушения комплекса проинсулина с РНК ВТМ Ш, оказалась в два раза ниже, чем аналогичная концентрация для РНП комплексов транспортных белков, и составила 0.2М (рис. 6, пик И).

Полученные данные позволяют сделать вывод, что транспортные белки тобамовирусов образуют устойчивые комплексы с полноразмерными вирусными геномными РНК. Эти результаты согласуются с гипотезой о том, что транспортные белки тобамовирусов выполняют для вирусных РНК функцию молекулярных шаперонов. Выше показано, что введение короткого аффинного домена из шести остатков гистидина в состав гибридных белков не оказывает влияния на их РНК-связывающие свойства. Предложенный на основании этих данных метод дает возможность проводить функциональные исследования различных РНК- и ДНК-связывающих белков в иммобилизованном состоянии. Этот метод позволяет работать с гидрофобными белками, склонными к агрегации в растворе, и использовать в качестве субстрата протяженные молекулы нуклеиновых кислот. Метод иммобилизации гибридных белков на металл-хелатном сорбенте может применяться для изучения различных типов взаимодействий. Субстратами для иммобилизованных (Гис)б-белков могут быть нуклеиновые кислоты, белки, а также низкомолекулярные соединения.

0.4 z

Номера фракций

| о.:

Я <

РНК ВТМ U1. не связанная в РНП комплекс

i II ,/

РНК ВТМ U1. извлечённая из РНП комплекса

Номера фракций

Рас. 6 Хроматограммы, полученные при проведении контрольных экспериментов.

А) Вирусная РНК не связывается с металл-хелатньт сорбентом. В контрольном эксперименте РНК наносили на колонку с никелъ-НТА агарозой без иммобилизованного (Гис)^-белка. Практически вся РНК сразу элюироваласъ с колонки (пик I), не взаимодействуя с сорбентом.

Б) Исследование комплекса иммобилизованного (Гис) е-проинсулина, не обладающего выраженными РНК-связывающими свойствами, с полноразмерной геномной РНК ВТМ VI. Площадь пика I существенно превышает площадь пика II, что свидетельствует о малом количестве РПК, связанной в комплекс. Этот комплекс характеризуется низкой прочностью, и разрушается уже при концентрации А'аС! 0.2М (пик II). Обозначения см. рис. 4,А

о.з

3. Кодируемые тобамовирусами транспортные белки подавляют трансляцию геномных вирусных РНК in vitro.

Влияние транспортных белков на трансляцию РНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе исследовали, добавляя рекомбинантные полипептиды в трансляционную систему либо в свободном состоянии, либо в форме предварительно сформированных РНП комплексов. Изучали зависимость степени ингибирования

трансляции от соотношения между ТБ и РНК. Для этого формировали частично "одетые" (ненасыщенные) РНП комплексы. Так как связывание транспортных белков с РНК является неспецифическим по отношению к последовательности РНК, ставили параллельные опыты с различными матрицами. В частности, использовали геномные РНК ВТМ U1, кр-ВТМ и вируса мозаики костра (ВМК). На рис. 7 представлен электрофоретический анализ продуктов трансляции различных вирусных геномных РНК в присутствии (Гис)б-транспортного белка кр-ВТМ. Добавление в трансляционную пробу ТБ кр-ВТМ в молярном соотношении с РНК 100:1 или 150:1 приводило к существенному подавлению синтеза белка по сравнению с контролем (дорожки 2, 4, 6).

Эффективность ингибирования трансляции напрямую зависит от молярного соотношения транспортного белка и РНК. Из рис. 7 видно, что при понижении соотношения ТБ:РНК от 100:1 до 25:1 наблюдалось постепенное уменьшение степени подавления синтеза белка (дорожки 8-11). Можно предположить, что при недостатке белка растет доля

1 2 J 4 5 6 7 8 9 10 И ¡2

-—46К

■*—зок.

— I43K

Рис. 7 (Гис) ¿-транспортный белок кр-ВТМ подавляет трансляцию вирусных РНК в бесклеточной белоксиитезирующей системе из экстракта зародышей пшеницы. ТБ добавляли либо непосредственно в систему (дорожки 1-7), либо после преинкубации с РНК (дорожки 8-12). Показан радиоавтограф (8-20% ПЛАТ) продуктов трансляции РНК ВТМ VI, кр-ВТМ и ВМК.

Дорожки 1-7: 1-препарат РНК кр-ВТМ без добавления ТБ; 2-РНК кр ВТМ с ТБ кр ВТМ в соотношении 1:100; 3-препарат РНК ВТМ VI без добавления ТБ; 4-РНК ВТМ VI с ТБ кр ВТМ в соотношении 1:150; 5-препарат РНК ВМК без добавления ТБ; 6-РНК ВМК с ТБ кр ВТМ в соотношении 1:100; 7-ТБ кр-ВТМ без добавления РНК. Дорожки 8-11: РНК ВТМ VI преинкубировали с ТБ кр-ВТМ в молярных соотношениях 1:100 (дорожка 8), 1:75 (дорожка 9), 1:50 (дорожка 10), 1:25 (дорожка 11). Дорожка 12: продукты трансляции РНК ВТМ VI после ее экстракции фенолом из РНП комплекса с ТБ кр-ВТМ (соотношение 1:100).

Справа указаны молекулярные массы маркерных белков в килодальтонах. Во все препараты добавляли ингибитор РНКаз RNasin в количестве 1 ед. активности на 1 мкл.

молекул РНК, которые либо вообще не связаны в комплекс с ТБ, либо содержат только очень короткие "одетые" белком участки. Интересно,

что способность РНК эффективно транслироваться в бесклеточной системе полностью восстанавливается после ее экстракции фенолом из РНП комплекса (рис. 7, дорожка 12). Этот факт является подтверждением того, что наблюдаемое ингибирование синтеза белка обусловлено образованием комплексов между ТБ и вирусными РНК.

Транспортный белок ВТМ 1Л также обладал способностью эффективно ингибировать трансляцию РНК при молярном соотношении ТБ:РНК 100:1 (рис. 8, дорожка 4). В то же время делеционный мутант ТБ ВТМ Ш БЕЬ4, у которого удалены аминокислоты со 130 по 185, практически не подавлял синтез белка. Даже при соотношении белок:РНК 500:1 ингибирования трансляции РНК не наблюдалось (рис. 8, дорожка 2). Естественно предположить, что БЕЫ, у которого частично удален РНК-связывающий домен А, образует неустойчивые комплексы с РНК и, следовательно, не подавляет ее трансляцию.

1 2 3 4 5

Рис. 8 Сравнение способности (Гис) ¡-транспортного белка ВТМ VI и его делеционного мутанта DEL4 подавлять трансляцию в бесклеточной белоксинтезирующей системе из лизатов ретикулоцитов кролика (ЛРК). РНК ВТМ VI добавляли в ЛРК после преинкубации с белками. Показан радиоавтограф (8-20% ПААГ) продуктов трансляции.

Дорожка 1: контроль без добавления РНК (эндогенная проба). Дорожки 2,3: РНК ВТМ VI преинкубировали с DEL 4 в молярных соотношениях 1:500 (дорожка 2) и 1:100 (дорожка 3). Дорожка 4: РНК ВТМ U1 преинкубировали с ТБ ВТМ VI в соотношении 1:100. Дорожка 5: препарат PIIK ВТМ VI без добавления ТБ. Справа указаны молекулярные массы маркерных белков в килодальтонах. Во все препараты добавляли ингибитор РНКаз BNasin в количестве 1 ед. активности на 1 мкл.

Относительную нестабильность РНП комплексов, образованных DEL4 и РНК, мы показали методом фильтрации через две различно заряженные мембраны. Принцип метода основан на том, что РНП комплекс удерживается на первой мембране из нитроцеллюлозы, в то время как свободная РНК проходит через нее и связывается со второй положительно заряженной мембраной (Wong and Lohman, 1993). Использование [32Р]-меченого РНК транскрипта позволило определить

долю молекул РНК, связанных с белком, по соотношению радиоактивности первого и второго фильтров. В случае инкубации (Гис)б-0ЕЬ4 с [32Р]-транскриптом в молярном соотношении 100:1 только 30% РНК было связано в РНП комплекс и удерживалось верхней мембраной. В то же время, полноразмерный (Гис)б-ТБ ВТМ U1 при таком же соотношении с транскриптом связывал РНК на 99%.

В контрольном эксперименте показали, что ингибирование трансляции РНК транспортными белками ВТМ U1 и кр-ВТМ обусловлено проявлением их РНK-связывающей активности, а не является следствием подавления ими компонентов трансляционной системы. Опыты проводили с белком, заведомо не обладающим выраженными РНК-связывающими свойствами, но, как и вирусные ТБ, содержавшим (Гис)б-концевой фрагмент. В качестве такого белка использовали относительно короткий (19.5 кДа) полипептвд-(Гис)б~ дигидрофолатредуктазу (ДГФР) мыши. Было установлено, что при добавлении в трансляционную систему (Гис)б-ДГФР в молярном соотношении с РНК 150:1 ингибирования трансляции не происходит (рис. 9).

92.5K ——69К

4Ж —~30К

—-ж

Рис. 9 (Гис)б-ДГФР не ингибирует трансляцию вирусных РНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе из лизатов ретикулоцитов кролика. Показан радиоавтограф (8-20% ПААГ) продуктов трансляции РНК ВТМ U1 и РНК ВМК в присутствии ДГФР (соотношение 1:150). Дорожка 1: контроль без добавления РНК (эндогенная проба). Дорожка 2: РНК BIM U1 без добавления белка. Дорожка 3: РНК ВТМ U1 преинкубировали с ДГФР. Дорожки 4,5 аналогично 2,3, но в качестве матрицы использовали тотальный препарат РНК ВМК. Справа указаны молекулярные массы маркерных белков в килодальтонах. Во все препараты добавляли ингибитор РНКаз RNasin в количестве 1 ед. активности на 1 мкл.

Следующим этапом работы стало исследование инфекционности РНП комплексов в ячменных протопластах. В отличие от свободной РНК ВТМ U1, ее комплекс с (Гис)б-транспортным белком ВТМ U1 в молярном соотношении 1:100 не инфицировал протопласты. Однако при соотношении 1:25, когда транспортного белка было явно недостаточно для образования протяженных РНП комплексов, преинкубированная с белком РНК ВТМ U1 сохраняла

1 2 3 4 5

инфекционность. Эти результаты свидетельствуют о том, что вирусная РНК в составе собранного in vitro нетранслируемого РНП комплекса теряет способность реплицироваться в протопластах. С другой стороны, транслируемый in vitro комплекс дефектного по РНК-связыванию мутанта DEL4 с РНК ВТМ Ш (соотношение 500:1) инфицировал инокулированные протопласты. Эти данные позволяют сделать вывод, что инфекционность вирусной РНК в составе РНП комплекса в протопластах определяется прочностью связывания с ней транспортного белка.

Неожиданные результаты были получены в опытах по исследованию инфекционности РНП комплексов в растениях C.amaranticolor. Обнаружили, что инокуляция растений преформированным РНП комплексом ТБ ВТМ U1 с РНК ВТМ U1 вызывает образование даже большего числа некрозов, чем инокуляция свободной РНК. Возможно это вызвано тем, что РНК в составе комплекса, в отличие от "голой" РНК, защищена от клеточных нуклеаз кооперативно связанными молекулами транспортного белка. Как и следовало ожидать, комплекс DEL4 с РНК ВТМ U1 также заражал C.amaranticolor. Способность нетранслируемого in vitro и неинфекционного в протопластах комплекса ТБ ВТМ U1 с РНК ВТМ U1 эффективно заражать C.amaranticolor предполагает наличие у растений механизма разборки РНП комплекса или его перевода в транслируемую форму. Известно, что у протопластов, в отличие от растительных клеток, отсутствуют плазмодесмы, по которым, вероятно, осуществляется межклеточное перемещение вирусных РНК. Можно предположить, что разборка или структурная перестройка РНП комплекса происходит непосредственно в процессе его транспорта по плазмодесмам. РНП комплекс, по-видимому, не участвует в репликации в первично инокулированной клетке, а сразу перемещается по плазмодесмам в соседние клетки. В это время происходит его разборка или переход в транслируемую форму. После попадения вирусной РНК в соседние клетки, в них начинается нормальный цикл репликации вируса.

Таким образом, транспортные белки тобамовирусов выполняют роль неспецифических по отношению к последовательности РНК репрессоров трансляции. Способность ТБ подавлять трансляцию мРНК зависит от молярного соотношения между ТБ и РНК. Минимальный размер участка связывания транспортного белка с РНК составляет 4-7 нуклеотидов на молекулу белка (Citovsky et al., 1990). Исследуемые в данной работе нетранслируемые РНП комплексы, образованные при соотношении ТБ:РНК 100:1 или 150:1, представляют собой частично "одетые" белком молекулы РНК. Можно предположить, что РНК в составе таких комплексов содержит протяженные участки, кооперативно связанные с транспортным белком. Известно, что посадка рибосом осуществляется только на 5'-конец РНК ВТМ. Поэтому для образования нетранслируемых комплексов с РНК ВТМ необходимо хотя бы частичное связывание ее 5'-концевого участка с молекулами транспортного белка. Однако природа распределения мономеров ТБ по всей длине РНК ВТМ пока неизвестна.

4. Гибридный (Гис)б-транспортный белок ВТМ Ш фосфорилируется протеинкиназой клеточных стенок Мсойапи ¡аЬасит

Полученный в данной работе гибридный (Гис)6-транспортный белок ВТМ Ш сохраняет способность своего природного аналога фосфорилироваться протеинкиназой из фракции клеточных стенок МсоНапа гаЪасит (Сйоувку й а1., 1993). Был проведен эксперимент, в котором (Гис)б-транспортный белок ВТМ Ш инкубировали с препаратом клеточных стенок в присутствии [у-32Р]-АТФ. С помощью радиоавтографии показали образование ковалентной связи между 30 кДа белком и радиоактивно-меченным фосфатом (рис. 10).

M

2 3

M

Рис. 10 Электрофорез в ПЛАТ с ДСП очищенных фосфорилированных белков (Гис)(-ТБ ВТМ Ш и (ruc)i-DEL4. Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим (А), высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой (Б). На дорожку M нанесены маркерные белки (молекулярные массы указаны слева), на дорожки 1 и 2 - исходные препараты (Гис)(-ТБ BIM U1 и (Тис)ц-ОЕЬ4. Дорожки 3 и 4 содержат очищенные препараты этих белков, полученные после их фосфорилирования протеинкиназой клеточных стенок Nicotiana tabacum в присутствии [у-32Р]-АТФ.

Приведенные выше данные позволяют говорить о том, что (Гис)б-транспортные белки тобамовирусов сохраняют основные биохимические свойства своих природных аналогов (связывание с РНК, фосфорилирование). На основании этого было решено использовать гибридные (Гис)б-белки для обнаружения клеточных компонентов, взаимодействующих с транспортными белками тобамовирусов.

5. Идентификация белков клеточных стенок, специфически взаимодействующих с транспортными белками тобамо-вирусов.

5.1. Гипотеза о взаимодействии транспортных белков тобамовирусов с белками клетки-хозяина.

Первые предположения о том, что вирусные компоненты должны взаимодействовать с молекулами клетки-хозяина возникли на основании данных о том, что транспорт вирусной инфекции из клетки в клетку является активным процессом (Atabekov and Dorokhov, 1984). На молекулярном уровне это означает, что процесс межклеточного транспорта происходит с участием кодируемых вирусом молекул, индуцирующих такие структурные изменения в растительных клетках, которые позволяют инфекционному материалу перемещаться из клетки в клетку. Позднее было показано, что функция транспорта выполняется с участием кодируемых вирусами транспортных белков, а путями межклеточного перемещения вирусного инфекционного материала являются плазмодесмы. Это позволило предположить, что в процессе распространения вирусной инфекции из клетки в клетку транспортные белки могут взаимодействовать с белками плазмодесм. Гипотеза о существовании клеточных белков (входящих в состав плазмодесм или посредством сигнальной цепи связанных с плазмодесмами), взаимодействующих с вирусными транспортными белками, подкрепляется следующими экспериментальными данными: иммуноцитохимические исследования показали, что ТБ ВТМ локализован в плазмодесмах листьев, зараженных ВТМ (Tomenius et al., 1987). Atkins et al., 1991 методом мечения иммунозолотом показали, что у растений, трансгенных по гену ТБ ВТМ, транспортный белок также локализуется в плазмодесмах. Еще одно подтверждение взаимодействия ТБ ВТМ с компонентами плазмодесм было получено в опытах с использованием флуоресцентных изоционат-меченных декстранов (F-декстранов). Эти опыты показали, что в трансгенных по ТБ ВТМ растениях пропускная способность плазмодесм увеличивается до 5-6 нм (Wolf et al., 1989). Таким образом было показано, что транспортный белок ВТМ взаимодействует с клеточными компонентами (вероятно белками), индуцируя структурные изменения плазмодесм. Делеционный анализ позволил обнаружить домены в составе ТБ ВТМ U1, ответственные за локализацию в клеточных стенках (Веша et al., 1991) и увеличение пропускной способности плазмодесм (Waigmann et al., 1994). На основании этих данных предположили, что транспортные белки содержат сигнальные последовательности, участвующие во взаимодействии с плазмодесмами (см. обзор Ding, 1997). Возникает логический вопрос: если в состав транспортного белка входит определенная сигнальная последовательность, то в клетке должен существовать белок, ответственный за узнавание такой последовательности и передачу сигнала. В животных клетках подобные функции выполняют рецепторы, специфически связывающиеся с определенными лигандами. В растительных клетках сигнальные

каскады еще недостаточно изучены, но уже сегодня можно с уверенностью говорить о принципиально сходных с животными механизмах передачи сигнала (Braun and Walker, 1996). Таким образом, можно предположить, что в клеточных стенках растений существуют ассоциированные с плазмодесмами рецепторы, специфически узнающие сигнальные последовательности в составе транспортных белков.

5.2. Комплексы (Гис)¿-транспортных белков тобамовирусов с белками клеточных стенок

Для обнаружения клеточных полипептидов, взаимодействующих с транспортными белками, использовали метод, основанный на использовании радиоактивно-меченных белковых зондов. В качестве зондов использовали гомогенные препараты меченных изотопом 14С (Гис) ¿-транспортных белков, а субстратом для них служили иммобилизованные на нитроцеллюлозных мембранах белки из растительных клеточных стенок. Радиоактивно-меченные белки получали путем добавления в культуральную среду [14С]-аминокислот одновременно с началом индукции биосинтеза транспортного белка с помощью IPTG. При этом большая часть изотопной метки включается во вновь-синтезируемый бактериальной клеткой (Гис)б-белок. Очистку препаратов радиоактивно-меченных (Гис)б-транспортных белков проводили методом металл-хелатной аффинной хроматографии.

Белки клеточных стенок листьев рапса (Brassica napus) переносили с гелей на нитроцеллюлозные мембраны и инкубировали с [14С]-(Гис)б транспортными белками. На радиоавтографах мембран обнаружили две зоны, соответствующие белкам клеточных стенок: первая интенсивная зона на уровне 27 кДа (предположительно, дублет), и вторая менее интенсивная зона на уровне 50 кДа (рис. 11). Оба исследуемых транспортных белка (ВТМ U1 и кр-ВТМ) связывались с одними и теми же растительными белками. Это, вероятно, свидетельствует о том, что в составе этих транспортных белков присутствует одинаковая сигнальная последовательность, которая узнается определенными клеточными белками. Обнаруженное сходное поведение транспортных белков по отношению к клеточным белкам служит еще одним доказательством (наряду с РНК-связыванием) их функционального подобия.

Следуя предположению, что наблюдаемое связывание транспортных белков с клеточными компонентами является специфическим, проводили контрольный эксперимент, в котором в качестве белкового зонда использовали [иС]-(Гис)§ дигидрофолатредуктазу (ДГФР) мыши. [14С]-(Гис)б ДГФР получали аналогично [14С] -транспортным белкам, добавляя в культуральную среду радиоактивно-меченные аминокислоты. (Гис)б-ДГФР, которая полностью отличается от транспортных белков тобамовирусов как по последовательности, так и по выполняемой функции, не образовывала устойчивых комплексов с клеточными белками (рис. 11). Этот результат свидетельствует в пользу гипотезы о том, что транспортные белки тобамовирусов (в отличие от ДГФР) содержат сигнальную

последовательность, специфически узнаваемую белками клеточных стенок. Отсутствие взаимодействия (Гис)б-ДГФР с растительными компонентами в контрольном эксперименте исключает возможность того, что связывание с ними (Гис)б-транспортных белков обусловлено присутствием аффинного домена из шести остатков гистидина.

4-

У

4

¿К

4?

в

/

4P

66.2 — 55.0 —

42.7 — 40.0 —

31.0 —

21.5 —

14.4 —

66.2 — 55.0 — 66.2 — 55.0 —

4 42.740.0 — < 42.7 — 40.0 — " lf

? V 31.0 — f i - ... ■<; i < 31.0 — i - 'WSTOSÄ Г ' - **

21.5 — \ 21.5 — S ' 4

- 14.4 — . ^ ■ v 14.4 — f

1

1

1

2

Рис. 11 (Гис) ¿-транспортные бедки BIM U1 (А) и кр-ВТМ (Б) образуют комплексы с белками клеточных стенок (КС) Brassica napus. Белки клеточных стенок разделяли электрофорезом в 12% ПЛАТ с ДСП и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После забивки участков неспецифической адсорбции, мембраны инкубировали в растворе, содержащем [14С]-меченный (Гис)¡-транспортный белок. По окончании инкубации, мембраны отмывали от несвязавшегося белка, высушивали и радиоавтографировали. Положение растительных белков, связывающихся с транспортными белками тобамовирусов отмечены стрелками. В контрольном эксперименте (В) мембрану с иммобилизованными на ней растительными белками инкубировали с [иС]-меченой (Гис) ¡-дигидрофолатредуктазой мыши (ДГФР). Связывание (Гис)ц-ДГФР с клеточными белками в контроле не наблюдалось. В слот 1 каждого геля наносили радиоактивно-меченные (Гис) (-белки, которые использовались в данном эксперименте в качестве зонда. На каждом блоте слева указаны молекулярные массы маркерных белков в килодальтонах.

Поиск консервативных участков в составе транспортных белков, предположительно отвечающих за их связывание с компонентами клеточных стенок, проводили на основании данных выравнивания аминокислотных последовательностей 30 кДа полипептидов ВТМ Ш и кр-ВТМ. При этом исходили из того, что эти участки должны содержаться в составе картированных ранее доменов, отвечающих за локализацию транспортных белков в клеточных стенках и за увеличение пропускной способности плазмодесм (домен Е). Выравнивание последовательностей транспортных белков ВТМ Ш и кр-ВТМ (рис. 12) позволило выделить консервативный мотив У\Т)ЕР(МЕ) (аминокислоты со 193 по 199), входящий в состав домена

Е, и одновременно перекрывающийся с доменом, отвечающим за локализацию транспортных белков в клеточных стенках.

ТБВТМШ : HSbVVKGKVNIimriDLTKtlEKIIiaiffTEVKSVHCSKmKJllVHEllESbSEVHL : 55 ТБхр-ВТМ : MS-IVSYEeKVSDrbtttSKKiS!Il.SKSLTEbRrVSISTKDIISVKESETLCDIDL : 54

TBBTMUt : LKCA/KLXDSGYVCLAGLVVTGEin^IjPDKCECOTSVCLVDKRIIEEADEATLGSYYT : ЦО

ТБкр-ВТМ : LIHVSLDKraweibGAVITCTra.VPDEVKOTTOISVlDKEbMSKECVIC'ryEA : 109

126

Г

ТБ ВТМ Ul : AAXKKKFQFKWPЕПГДХЙО ТЕ sp-BTM : AAKSKBTQFKLVfimVSoV^SKKra

домен Е, ответственный за увеличение пропускной способности плазмодесм (126-224)

локализация ТБ в клеточных стенках (195-213) Ч а-спиральвый мотив (187-201)

ТБ ВТМ U1 : SD^^JiSSt®RSVPm<lJYW/KDrGa-lSFKKtnn.IDDDSEATraESDSF : 26В ТБкр-ВТМ : Gv"5"y"YEEEKYACED-Sr)3bKEEir^QHYKEESVPVFRSGVGRSH£DA- : 267

Рис. 12 Выравнивание аминокислотных последовательностей транспортных белков ВТМ U1 и кр-ВТМ. В области обширного домена Е, ответственного за увеличение пропускной способности плазмодесм, совпадающие аминокислоты выделены черным цветом, а химически родственные-серым. Пунктиром отмечен консервативный мотив WDEF(ME) (см. текст). Выравнивание последовательностей проводилось с использованием программы OPTAL. Результаты выравнивания представлены программой GeneDoc. Цифры обозначают количество аминокислотных остатков.

Обнаруженный консервативный мотив WDEF(ME) является частью предполагаемой а-спирали, включающей в себя остатки аспарагиновой (D) и глутаминовой (Е) кислот, участвующих в локализации транспортных белков в клеточных стенках (Вегпа, 1995). Интересно, что мотив WDEF(ME) присутствует в последовательностях транспортных белков еще пяти известных тобамовирусов (Иванов П.А., 1997), что, возможно, свидетельствует о его важной роли в процессе транспорта. Транспортные белки других тобамовирусов содержат аналогичные мотивы WxEF, VDE и VxD (где х-неконсервативная аминокислота). Таким образом, мотив WDEF(ME) представляет собой высоко консервативную аминокислотную последовательность, которая присутствует целиком или частично у всех без исключения транспортных белков тобамовирусов. Не исключено, что последовательность WDEF(ME) является участком связывания транспортного белка с обнаруженными в данной работе белками клеточных стенок. Можно предположить, что, взаимодействуя с клеточными белками, эта последовательность выполняет роль сигнала для инициации структурной перестройки плазмодесм. Термин

"последовательность" в данном случае не вполне корректен, так как помимо аминокислотной последовательности как таковой, важную роль во взаимодействии с клеточными белками может играть а-спиральная третичная структура данного участка полипептидной цепи.

Одновременно с обнаружением ТБ-связывающих белков клеточных стенок рапса (Brassica napus), проводили сходные эксперименты с полипептидами тобака (Nicotiana tabacum). В качестве зонда использовали [14С]-меченный (Гис)б-ТБ кр-ВТМ. Эксперимент по связыванию [14С]-меченого (Гис)б-ТБ кр-ВТМ с белками клеточных стенок листьев Nicotiana tabacum позволил обнаружить два растительных полипептида (33 кДа и 50 кДа), обладающих наибольшим сродством к зонду. Контрольный опыт с (Гис)6-ДГФР в качестве зонда показал отсутствие связывания ДГФР с белками клеточных стенок тобака.

Аналогичные эксперименты, в которых зондами для связывания с клеточными полипептидами служили [1251]-меченные (Гис)б-транспортные белки, проводили в ходе совместной работы с Институтом Биотехнологии университета Хельсинки. Метод с использованием иодированных белков позволил обнаружить еще два полипептида клеточных стенок Brassica napus и Nicotiana tabacum, образующих прочные комплексы с транспортными белками. Этим полипептидам на радиоавтографах соответствовали наиболее интенсивные зоны с молекулярными массами порядка 14 кДа и 19 кДа (О.Ю. Фролова, неопубликованные данные). Вместе с тем показали, что обнаруженные ранее с помощью [14С] -зондов клеточные полипептиды связываются также и с иодированными транспортными белками.

6. Предполагаемый механизм межклеточного транспорта вирусного инфекционного материала.

Маловероятно, что протяженная молекула вирусной РНК, обладающая избыточным отрицательным зарядом, существует внутри клетки в свободном состоянии. Одним из путей стабилизации такой молекулы и ее защиты от клеточных нуклеаз может быть образование РНП комплекса с РНК-связывающими белками. Более десяти лет назад были получены первые результаты, свидетельствующие о том, что в зараженных ВТМ растениях присутствуют информосомо-подобные РНП комплексы (Dorokhov et al., 1983, 1984). После обнаружения РНК-связывающих свойств у ТБ ВТМ U1 (Citovsky et al., 1990) предположили, что подобные РНП комплексы могут быть образованы кооперативно связанными с вирусной РНК молекулами транспортного белка. Была выдвинута гипотеза о том, что транспортный белок в составе такого РНП комплекса выполняет функцию молекулярного шаперона для вирусной РНК, позволяя ей перемещается из клетки в клетку по модифицированным плазмодесмам (Citovsky et al., 1990; Citovsky et al., 1992).

В данной работе показано, что транспортные белки двух тобамовирусов (ВТМ U1 и кр-ВТМ) образуют в иммобилизованном

состоянии устойчивые комплексы с полноразмерными вирусными геномными РНК. Эти результаты позволяют предполагать, что формирование РНП комплексов является общей стратегией тобамовирусов для межклеточного транспорта своего инфекционного материала.

Следуя гипотезе, что обнаруженные РНП комплексы представляют собой транспортные интермедиаты, РНК в их составе должна выводиться из цикла репликации и переключаться на выполнение транспортной функции. Это предположение подтверждают результаты настоящей работы, свидетельствующие о том, что транспортные белки БТМ U1 и кр-ВТМ способны эффективно ингибировать трансляцию мРНК in vitro. Возможно, что на стадии, предшествующей транспорту через плазмодесмы, вирусная РНК перестает выполнять функцию матрицы белкового синтеза и переходит в форму нетранслируемого РНП комплекса. Интересно, что степень подавления трансляции мРНК определяется молярным соотношением между РНК и транспортными белками. Эти наблюдения согласуются с данными о том, что связывание транспортных белков с вирусной РНК носит кооперативный характер.

Из литературы известно, что при наличии в клетке молекул транспортного белка происходит увеличение пропускной способности плазмодесм (Wolf et al., 1989, 1991; Waigmann et al., 1994; Ding et al., 1995; Waigmann and Zambryski, 1996). Подобная модификация плазмодесм позволяет осуществить перемещение по ним распрямленного РНП комплекса (Citovsky et al., 1992). Принято считать, что модификация плазмодесм, наряду с формированием РНП комплекса, является ключевой стадией процесса межклеточного транспорта тобамовирусов. Как уже обсуждалось выше, растущее количество экспериментальных данных заставляет предполагать, что в растительных клеточных стенках существуют рецепторы, регулирующие пропускную способность плазмодесм. В настоящей работе охарактеризованы белки клеточных стенок, специфически узнающие транспортные белки тобамовирусов. Возможно, обнаруженные полипептиды являются компонентами рецептора, индуцирующего структурную модификацию плазмодесмы. Можно предположить, что в здоровой клетке лигандами такого рецептора являются растительные белки, обеспечивающие межклеточный транспорт крупных молекул через плазмодесмы. Так как эти белки выполняют регуляторную функцию, они, скорее всего, присутствуют в клетке в черезвычайно малых количествах. В зараженной вирусом клетке у этих белков появляется конкурент за связывание с рецептором - вирусный транспортный белок. Нельзя исключить, что в составе аминокислотных последовательностей клеточного лиганда и транспортных белков присутствуют сходные консервативные мотивы (например, мотив WDEF(ME)), узнаваемые рецептором. Однако за счет более высокой аффинности транспортных белков к рецептору или более высокой их концентрации в клетке, "управление" плазмодесмами в зараженной клетке практически полностью переходит к вирусу.

Таким образом, с учетом литературных данных и результатов настоящей работы можно предложить следующий сценарий, по которому может осуществляться межклеточный транспорт вирусной инфекции:

1)Нетранслируемые вирусные РНК в составе РНП комплекса выводятся из процесса репликации и вовлекаются в межклеточный транспорт. При формировании РНП комплексов молекулы РНК распрямляются и переходят от статистического клубка к линейной конформации с минимальным диаметром.

2)Происходит опосредованная рецепторами модификация (увеличение пропускной способности) плазмодесм. При этом лигандами рецепторов выступают транспортные белки, находящиеся либо в свободном состоянии, либо в составе РНП комплекса.

3)В процессе перемещения через плазмодесмы нетранслируемый РНП комплекс дестабилизируется белками плазмодесмы и/или происходит его разборка. РНП комплекс переходит в транслируемую форму и во вновь зараженной клетке опять начинается репликация вируса.

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы в исследовании межклеточного транспорта вирусной инфекции, наши знания в этой области далеки от завершенного состояния. Выяснение подробных механизмов действия транспортных белков остается актуальной проблемой, требующей дальнейшего изучения.

ВЫВОДЫ.

1) Получены бактериальные штаммы-продуценты гибридных (Гис)6-транспортных белков ВТМ U1 и кр-ВТМ.

2)Проведена хроматсграфическая очистка (Гис)б-транспортных белков ВТМ U1, кр-ВТМ и делеционных мутантов ВТМ U1 от белков E.coli на никель-хелатном сорбенте.

3)Разработан метод исследования рибонуклеопротеиновых комплексов, основанный на связывании иммобилизованных на металл-хелатном сорбенте (Гис)б-белков с нуклеиновыми кислотами. Метод позволяет работать с молекулами нуклеиновых кислот любой длины, а также может использоваться для исследования белок-белковых взаимодействий. С помощью этого метода показано, что (Гис)б-транспортные белки ВТМ U1 и кр-ВТМ образуют устойчивые комплексы с полноразмерными геномными вирусными РНК.

4)Обнаружено, что транспортные белки ВТМ U1 и кр-ВТМ выполняют in vitro роль неспецифических по отношению к последовательности РНК репрессоров трансляции.

5)Охаракгеризованы полипептиды клеточных стенок Brassica napus и Nicotiana tabacum, образующие комплексы с транспортными белками ВТМ U1 и кр-ВТМ.

6) Предложен механизм межклеточного транспорта вирусного инфекционного материала в виде нетранслируемого РНП комплекса. Предполагается, что:

а)на стадии, предшествующей транспорту через плазмодесмы, вирусная РНК перестает выполнять функцию матрицы белкового синтеза и переходит в форму нетранслируемого РНП комплекса;

б)увелнчение пропускной способности плазмодесм регулируется рецепторами, для которых транспортные белки являются лигандами;

в)в процессе перемещения по плазмодесмам, нетранслируемый РНП комплекс переходит в транслируемую форму.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Иванов К.И., Иванов П.А., Тимофеева Е.К., Ефимов В.А., Дорохов Ю.Л. "Клонирование генов транспортных белков двух штаммов вируса табачной мозаики и их экспрессия в клетках Escherichia coli" Биоорганическая химия (1994), т.20, стр. 751-758.

2. Ivanov K.I., Ivanov Р.А., Timofeeva Е.К., Dorokhov Yu.L., Atabekov J.G. "The immobilized movement proteins of two tobamoviruses form stable ribonucleoprotein complexes with full-length viral genomic RNA" FEBS Letters (1994), 346, p.217-220.

3. Dorokhov Yu.L., Ivanov P.A., Ivanov K.I., Timofeeva E.K., Kalinina N.O. "The crucifer tobamovirus: nucleotide sequence and mode of genome expression" Abstracts of International Conference "Fundamental and applied problems in phytovirology", Yalta, Crimea, Ukraine, 22-26 May, 1994, p. 6.

4. Дорохов Ю.Л., Карпова O.B., Калинина H.O., Иванов К.И., Фролова О.Ю., Самуилова О.В., Родионова Н.П., Атабеков И.Г. "Кодируемые тобамовирусами транспортные белки подавляют трансляцию геномных вирусных РНК in vitro" Доклады РАН (1996), т. 349, стр. 259-261.

5. Ivanov K.I., Dorokhov Yu.L., Atabekov J.G. "Characterization of host plant proteins interacting with tobamovirus movement proteins" Abstracts of Xth International Congress of Virology, Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996, p. 118.

6. Ivanov K.I., Dorokhov Yu.L., Atabekov J.G. "Characterization of host plant cell wall proteins interacting with movement proteins of tobamoviruses" Abstracts of 16th Annual Meeting of American Society for Virology, Bozeman, Montana, USA, 19-23 July, 1997, p. 212.

7. Karpova O.V., Ivanov K.I., Rodionova N.P., Dorokhov Yu.L., Atabekov J.G. "Nontranslability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA-movement protein complexes formed in vitro" Virology (1997), 230, p. 11-21.

Издательство АО "Диалог-МГУ". ЛР № 063999 от 04.04.95 г. Подписано к печати 17.09.97 г. Усл.печ.л. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ 683. Тел. 939-3890, 939-3891, 928-1042. Факс 939-3893. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.