Тобамовирус крестоцветных: полная нуклеотидная последовательность и механизм экспрессии гена белка оболочки

Иванов, Петр Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тобамовирус крестоцветных: полная нуклеотидная последовательность и механизм экспрессии гена белка оболочки
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Тобамовирус крестоцветных: полная нуклеотидная последовательность и механизм экспрессии гена белка оболочки"

С'Э СЧ!

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 578.865:578.233.443

ИВАНОВ Петр Алексеевич

ТОБАМОВИРУС КРЕСТОЦВЕТНЫХ: ПОЛНАЯ НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ И МЕХАНИЗМ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА БЕЛКА ОБОЛОЧКИ

03.00.06 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

академик РАН, профессор И.Г. Атабсков доктор биологических наук Ю.Л. Дорохов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук E.H. Доброе доктор биологических наук С.К. Заврисв

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.Л. Овчинникова

Защита состоится 21 апреля 1997 года в 14:30 на заседании Специализированного Совета Д 053.05.70 при Московском Государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 21 марта 1997 года.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат химических наук

Б.Н. Каграмаиов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Тобамовирусы — группа палочковидных вирусов растений с однокомпонентным (+)-РНК-геномом дайной около 6400 нуклеотидов. Группа довольно хорошо изучена, так как ее типовой представитель — вирус табачной мозаики (ВТМ) является известным модельным объектом современной молекулярной биологии и вирусологии.

Вирусы с позитивной геномной РНК составляют более 80% от всех известных фитовирусов. Исследование структуры и экспрессии подобных геномов необходимо для решения таких фундаментальных вопросов клеточной и молекулярной биологии, как регуляция трансляции эухариотических. мРНК, транспорт генетического материала, реакция клетки на вирусную инфекцию, эволюция РНК-геномов и др. Кроме того, такая работа имеет большое прикладное значение — фитопатогенные вирусы наносят серьезный экономический ущерб сельскому хозяйству.

В 1992 году на кафедре вирусологии МГУ им. М.ВЛомоиосова из Oleracia officinalis L. был вылелен новый тобамовирус с расширенным кругом хозяев (crTMV или кр-ВТМ). кр-ВТМ серологически близок к вирусу мозаики подорожника (RMV), что позволяет отнести его к малоизученной субгруппе RMV-подобных тобамовирусов (см. Oshima and Harrison, 1975; Wetter, 1986). Помимо растений семейства пасленовых (Nicotiam tabacum L.), кр-ВТМ системно заражает растения семейства крестоцветных: Brassica chinensis L., В. тара L., Arabidopsü thaliana L и др. Данный вирус и явился объектом настоящей работы. Очевидно, что подробное изучение генома кр-ВТМ поможет расширить современные представления о проблемах транспорта и видоспецифичности вирусной инфекции, а также устойчивости растений к вирусам. Дополнительный интерес к кр-ВТМ связан с одним из его растений-хозяев — Arabidopsis thaliana. Благодаря простоте организации геном А. thaliana стал одним из популярных объектов генетики растений и уже достаточно хорошо изучен, поэтому кр-ВТМ весьма перспективен для изучения взаимодействий в системе хозяин-патоген.

Целью данной работы было исследование первичной последовательности геномной РНК кр-ВТМ и изучение особенностей экспрессии гена бека оболочки (БО) этого вируса. Известно, что БО тобамовирусов не только участвует в сборке вирионов (см. обзор Okada, 1986), но и играет важную роль в дальнем транспорте вируса по сосудистой системе растения (Dorokhov et al., 1984; Takamatsu et al, 1987; Osbourn et al, 1990; Holt and Beachy, 1991; Hilf and Dawson, 1993), а также взаимодействует с хозяйскими клеточными факторами (Saito et al, 1987, 1989; Knorr and Dawson, 1988; Culver and Dawson, 1989, 1991; Berzal-Hemmz et al, 1995). Мутации в БО видоизменяют симптомы инфекции (Dawson et al, 1988). Таким образом, особенности экспрессии гена БО могут оказаться одной из причин возникновения феномена широкого круга растений-хозяев у кр-ВТМ.

В ходе исследования решались следующие задачи: клонирование генома кр-ВТМ в виде кДНК, определение нуклеотидной последовательности вирусспецифических клоков, сравнительный анализ кодируемых РНК кр-ВТМ белков и нетранслируе-мых областей генома. Для изучения механизма экспрессии гена БО были созданы разнообразные генноинженерные конструкции. Эти конструкции транскрибировали с помощью РНК-полимеразы бактериофага Т7 и транслировали in vitro в бесклеточных системах лизата ретикулоцитов кролика, асцитиой карциномы Кребс-2 и экстракта зародышей пшеницы.

Научная новизна работы. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность геномной РНК кр-ВТМ (6312 п.о). Показано, что структура генома данного вируса имеет ряд «шкальных особенностей — обнаружены дополнительные псевдоузлы в 3'-концевой негранслируемой области, большая область перекрывания генов транспортного

и капеидного белков и другие интересные черты. Последовательности транспортных белков кр-ВТМ и других тобамовирусов заметно различаются. Эксперименты по трансляции in vitro показали, что белок оболочки кр-ВТМ может синтезироваться по неканонической модели внутренней инициации трансляции. Этот способ экспрессии генов редко встречается среди эукариотаческих мРНК, а у тобамовирусов описан впервые. Область внутренней посадки рибосом (ОВПР или IRES; 148 нуклеотидов) эффективно функционирует в бесклешчных системах животного и растительного происхождения и обеспечивает сшггез белка как на "природных", так и на химерных матрицах. Структура ОВПРю отличается от структуры известных IRES-погаедоватеяьносгей (пикорнавирусы, вирус гепатита С и др.).

Практическая ценность работы. Библиотека кДНК-клонов кр-ВТМ может быть использована для создания трансгенных растений. Известно, что растения, экспрессирующие некоторые участки вирусного генома, были устойчивы к инфекции. Подобные случаи описаны для генов 54К (Tenllado et al., 1995; Nguyen et al., 1996) и белка оболочки (Powell Abel et ai, 1986), а также антисмысловых вариантов 5' и З'-негранслируемых областей генома тобамовирусов (Nelson et al., 1993; Powell et al., 1989). На основе данных о последовательности геномной РНК кр-BTJvl можно разработать системы диагностики этого вируса и всей субгруппы RMV-подобных тобамовирусов, например с применением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Область внутренней посадки рибосом может использоваться для одновременной экспрессии различных генов с полнцисгронных матриц в клетках эукариот.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского 4 марта 1996 года. Результаты исследований были представлены на международных конференциях: "Fundamental and applied problems in phytovirology", Yalta, 1994; "Frontiers in biochemistry and molecular biology. The legacy of Audrey Belozersky", Moscow, 1995; "Bayev Memorial conference", Moscow, 1996; "IV German-Russian Workshop in Biotechnology", St.-Petersburg, 1996.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура работы. Диссертация состоит из глав "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение" "Выводы". Работа изложена на 145 страницах, содержит 23 рисунка и 1 таблицу. Список цитированной литературы включает 267 публикаций.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Часть 1. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИ1АПИЯ ГЕНОМНОЙ РНК кр-ВТМ

1.1. Стратегия определения нуклеотидной последовательности геномной РНК кр-ВТМ.

Вирусный препарат получали из растений турнепса (Brassica compestris L.), выращенных в условиях теплицы. Для синтеза доуцепочечной кДНК на матрице геномной РНК кр-ВТМ, применялся обычный метод с использованием обратной транскриптазы, РНКазы Н и ДНК-полимеразы I E.coli (Gubler and Hoffman, 1983). Клонирование и секвенирование вирусной кДНК проводили в несколько этапов. Сначала полученную с рассеянной затравки кДНК лигировали в плазмидные векторы pBluescript II SK и pGEM3zf по сайтам Smal и EcoRV. Частичное определение последовательности, гибридизация и последующий компьютерный анализ позволили выявить клоны, соответствующие генам ТБ и БО.

! ! г - ! 1000 2000 3000 4000 5000 6000

122К (П07ак)

- -----(IAG 18К(156ак)

pol.... i_EMidk

кэп #J-Ш_[¡EL.

ijQTs oQIr тРНК-подобиа*

l/oJV ¿УК структура

(1601ак) (267ак)

ь т—

äffe

LMC кш »iiii^—R

Рисунок 1. Общая схема строения генома кр-ВТМ. Открытые рамки трансляции обозначены прямоугольниками, некодирующие области —линиями. MET, HEL, POL — домены метилтрапсферазы, хеликазы и РНК-зависимой РНК-полимеразы. Под геномной РНК показаны субгеномные РНК (h„ LMC). Наличие упомянутых сгРНКу кр-ВТМ доказано методом Нозерн блот-гибридизации (см. ню/ее). Звездочка обозначает 7-метилгушшзин (кэп-структура). СгРНК h не каптирована (предполагается по аналогии с другими тобамавирусши).

Так как в области между нуклеотидными остатками 4877 и 5809 отмечались некоторые различия среди независимых кДНК-клонов, были синтезированы олигонуклеотиды, служившие ираймерами для полимеразной цепной реакции (ПЦР). С помощью ПЦР были получены клоны, соответствующие гену ТБ и N-концевой части гена БО. Для определения последовательности З'-концевой нетранслируемой области вирусная РНК была полиаденилирована с помощью ро1уА-полимеразы E.coli, после чего с затравки d(T)u была синтезирована кДНК, соответствовавшая З'-концевой части генома кр-ВТМ. Для получения клонов в области генов 122/178К использовались затравки, комплементарные участкам 16541674, 2593-2613, 3913-3933 и 4918-4938 нуклеотидной последовательности геномной РНК. Наконец, последовательность 5'-концевой части генома кр-ВТМ (125 нуклеотидов) была определена прямым секвенированием вирусной РНК с использованием обратной транскриптазы.

Около 98 % последовательности геномной РНК секвенировано по двум и более независимым перекрывающимся кДНК-клонам, при этом анализировались как (+), так и (-)-цепи кДНК.

1.2. Кодирующие области генома кр-ВТМ.

Геном кр-ВТМ (6312 нуклеотидов) заметно короче, чем у других известных тобамовирусов, например BTM-U1 или Ob (соответственно 6395 и 6507 нуклеотидов). С помощью компьютерного анализа выявлены, по меньшей мере, 4 открытые рамки трансляции (ОРТ), которые могут быть экспрессированы in vivo согласно правилу Трифонова (Trifonov, 1987) и кодируют белки с молекулярными массами 122К (ОРТ!), 178К (ОРТ2), 29К (ОРТЗ) и 17К (ОРТ4). Первый AUG-кодон, (нуклеотиды 69-71), соответствующий 5'-проксимальной ОРТ1, имеет оптимальный контекст (см. обзор Kozak, 1991), в отличие от второго AUG (основания 96-98), нуклеотидный контекст которого субоптимален. Это позволяет предположить, что именно первый кодон является стартовым для ОРТ1. Данная ОРТ заканчивается терминирующим amber-кодоном UAG (нуклеотиды 3391-3393), предполагаемый

122К-белок состоит из 1107 аминокислот. Непосредственно за amber-кодоном следуют триплеты САА и UUA, типичные и для других тобамовирусных последовательностей. Предполагается (Skuzeski et al., 1991), что этот мотив усиливает супрессию слабого стоп-кодона UAG и облегчает синтез белка, кодируемого ОРТ2 (178К, 1601 аминокислота). ОРТ2 имеет общий с ОРТ1 старт и заканчивается терминирующим U АА-кодоном (нуклеотиды 4873-4875).

ОРТЗ начинается через 2 нуклеотида после терминирующего кодона ОРТ2 и кодирует потенциальный полипептид длиной 267 аминокислот (29К). Данная ОРТ перекрывается на 77 нуклеотидов (включая терминирующий кодон) с ОРТ4 (18К), кодирующей белок оболочки (БО), (156 аминокислотных остатков). Это перекрывание значительно превосходит подобное у тобамовирусов субгруппы 2 (SHMV и CGMMY, 26 нуклеотидов в обоих случаях), а у тобамовирусов субгрупп 1а и lb и вовсе отсутствует (Ikeda et al., 1993).

1.3. Белки 122К nl 78К.

Белки с молекулярной массой приблизительно 122К и 178К были обнаружены среди продуктов трансляции in vitro геномной РНК кр-ВТМ в лизате ретмсулоцитов кролика, что хорошо согласуется с данными сиквенса (результаты не показаны). Анализ аминокислотной последовательности предполагаемого 122К-бежа позволил выявить 2 консервативных области — метилтрансферазный и NTP-связывающий (хеликазный) домены, найденные ранее в решшкативных белках (+)-РНК-содержащих вирусов (см. обзор Koonin and Dolja, 1993). Эти домены локализуются соответственно в N- и С-концевых областях 122К-белка кр-ВТМ (рис.1). Метилтрансферазный домен обнаружен с помощью компьютерного анализа последовательностей у различных групп (+)-РНК-содержащих вирусов, в нем выявлены 3 уникальных консервативных мотива, отличные от мотивов клеточных метидтрансфераз (Rozanov et al., 1992). Доказано, что 126К-белок BTM-U1 обладает гуанилилтрансферазной активностью и участвует в кэппировании геномной вирусной РНК (Dunigan and Zaitlin, 1990). Как показывает сравнение Ы-концевых областей 130К-белков тобамовирусов, предполагаемый метилтрансферазный домен 122К-белка кр-ВТМ содержит все известные консервативные элементы; аминокислотные последовательности тобамовирусов в данном районе высоко гомологичны между собой (рис.2А). Метилтрансферазы тобамовирусов относятся к т.н. первому типу и причислены к "тобамоподобной" группе (Koonin and Dolja, 1993).

Большинство вирусов с позитивным РНК-геномом размером более 6000 нуклеотидов кодируют собственную РНК-хеликазу. Предполагается, что она участвует в расплетении двуцепочечной (+,-) РНК во время репликации и, возможно, трансляции (Gorbalenya and Koonin, 1989). Хеликазы (+)-РНК содержащих вирусов классифицированы в 3 суперсемейства; в суперсемейсгве 1, куда отнесены тобамовирусы, выявлены 7 консервативных мотивов, обнаруженные и у кр-ВТМ (Hodgman, 1988; Gorbalenya et al., 1988a,b; Gorbalenya et al., 1989). Мотив 1 содержит пурин-связывающий блок: Gly-x-Pro-Gly-x-Gly-Lys-Tre (х-любая аминокислота) (рис. 2Б). Lain et al. (1990,1991) доказали, что С1-белок потивируса шарка сливы (PPV) расплетает РНК-дуплекс в присутствии АТФ. Экспериментально показана важность NTP-связывающего мотива для репродукции вируса — мутации в соответствующем районе 2С-белка вируса полиомиелита заметно снижали уровень репликации вирусного генома (Mirzayan and Wimmcr, 1992: Teterma et ah, 1992). Гипотетический хеликазный домен кр-ВТМ находится в С-концевой области 122К белка..С-конец 178К-белка кр-ВТМ (область, непосредственно следующая за amber-кодоном) соответствует домену предполагаемой РНК-зависимой РНК-полимеразы. Koonin (1991) охарактеризовал для этого домена восемь аминокислотных мотивов, обнаруженных и у кр-ВТМ (рис.3).

Л. Метилтрансфсразный домен.

] 1

CrTMV 78 AVHSLAGGFRSLELE

TMGMV 78 ........L.A... .

TMV 7Я ........L......

L 7R ........L......

CGMMV 78 S.......L.L____

PMMV 7Я ........L......

Ob 78

.. i..

36 36 36 36 36

. L.

■ VM.

. .м.

127 ESTLMlfTHS FSNIIKYV 826

127 ......S KYK..LH.. 830

127 ......С .Y...L... 835

127 835

130 ____H. . .LE..К1Д . 842

127 ....... •Y..VL... 839

127 ......s ■Y..LL... 834

Б. Хеликазный домен.

* * * *

CrTMV 821 VILVDGVPGC GKTKEIIE 4 SEDLILVPGKEASKMI

TMGMV 825 KV........ 4 0. . ..Q.kh..

TMV R?7 .V........ ......LS A n . . Q.AE. .

L 827 ■ V........ ......LS 4 E. . ... 4 t .RQ.AE..

CGMMV IT........ ...A...A 4 ПТ .V.T. . R. . AA. .

pmmv 352 ■ T........ ......LS 4 D. . .V. .. ..Q.AE..

Ob B?fi Ф ......LR 4 .V. .. ____AA. .

III

CrTMV TMGMV 01 L

CGMMV

PMMV

( *** ) [ *** 1 33 RLFIDEGL 18 AYVYGDTQg

35 ........

34 AVYV____

34 ........

36 ...V____

18 18 18 18 18 18

.F.F..A..

■ F.......

.F.F.....

f ] [ * " ] [ CrTMV 24 EVRR-VTL-RC 64 KDVOTVHEVgSETYEKTAIVR 11 ASPHVLVALTRHTT 37

TMGMV 24 U1 24 L 24 CGMMV 24 PMMV 24

•M.,-T. -T.,-T..-.. •T.,-T..L.. .-..Y..H-.. • T.,-T . .-..

24 .K..-T.

64 .N......I.G..F.DVSL..

64 S. .H......G. . .SDVSt. .

64 A. .H......G. .. A.DVSL . .

64 N.......I.G. -F.E. .V. . 11 D

64 E. .H......G. .F.DVSL. .

64 Q.......I.G____EVSL. .

11 S............К 37

11 D........S. . .C 37

11 D......S.S. . .K 37

К 37

11 Q...L..S.S...R 37

11 E......G.....R 37

Рисунок 2. Сравнение последовательностей предполагаемых метштранс-феразпого (А) и хеликазного (Б) доменов 130К-белков кр-ВТМ и других тобамовирусое. Римскими цифрами обозначены консервативные мотивы, нумерация согласно обзору Koonw and Dolja (1993). Арабские цифры показывают количество аминокислотных остатков между мотивами, а также расстояние до N- и С-концов 130К-белка. Точками показаны совпадающие аминокислоты. Аминокислотные остатки, принадлежащие к консепсусной последовательности "тобамоподобных" метилтрансфераз 1 типа и хеликаз суперсемейства 1 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты (консервативные гидрофобные остатки отмечены звездочкой).

Домен РНК-зависимой РНК-полимеразы.

CrTMV 1345 MIKSQPK 10 Y

TMGMV 1295 ....... 10

U1 1300 .Y.A... 10 .

L 1300 ...A... 10 ,

CGMMV 1394 ...R... 10 .

PMMV 1323 ...o... 1 0

Ob 1306 I...... 1 0

, .Q. .G.LAG-......L. .

..........L......Q. .

..........L......Q • .

. .W. .V. . -V.KY. . -KF.

......L. . .V......Q. .

..........I......ОМ.

III

[ * *]

CrTMV 10 YTRKTPAQIEDFF

TMGMV 10 F.....E..QE..

U1 10 F.......A____

L 10 F............

CGMMV 10 ____K.EDLQE..

PMMV 10 ......1...E..

Ob 10 F.....E. . .E. .

[ * ]

13 LDISKYDKSgN

13 ......T____

13 ...........

13 ..V........

13 ..V.......s

13 ...........

13 . .V........

[

CrTMV 44 WYÇRKSGDVTTFIGHTIIIA-CLSSMIP

TMGMV 44

01 44

L 44

CGMMV 44

PMMV 44

Ob 44

] [ * **] 6 AAFCGDDSLI

........V. . p. . .A. T e, G . . . . , . . .L

........V. . Я FP T A G. . . . . .. .L

Y....... ........F. . Д VA I, fi ■ S. . .

Jt T fi G. . . . . . -IL

........V. . S ____V

VII

VIIX

CrTMV TMGMV U1 L

CGMMV

PMMV

Í **][***)

28 KYGYFÇGRY 11 YDPLKLISK 72

28 R.......I 10 ......

28 Q........ 11 ......

28 .......K. 11 P.....

28 R........ 11 ......

28 T........ 11 V____I. ..

76 75 72

Рисунок 3. Сравнение последовательностей предполагаемого домена РНК-зависимой РНК-полимеразы (lSOK-белок) кр-ВТМ и остальных тобамовирусое. Консервативные мотивы пронумерованы в соответствии с работами Koonin (1991) и Koonin and Dolja (1993). Цифры обозначают расстояние до N и С-концов lHOK-бежа, а также количество аминокислотных остатков между мотивами. Аминокислотные остатки, принадлежащие к консенсусной последовательности РНК-полимеразных доменов суперсемейства 3 выделены жириым шрифтом и подчеркнуты (консервативные гидрофобные остатки отмечены звездочкой).

Из них наибольшим сходством среди различных групп вирусов обладают мотивы IV, V и VI. Последовательность GDD (Gly-Asp-Asp, мотив VI; иногда вместо G присутствует S) окружена гидрофобными аминокислотными остатками и инвариантна у всех (+)-РНК-внрусов (Kamer and Argos, 1984). Мутагенез участков IV, V и VI РНК-репликазы вируса энцефаломиокардита (EMCV) подтвердил их важность для нормальной полммеразной активности (Sankar and Porter, 1992).

Высказывалось предположение, что эти мотивы участвуют в связывании К'ТР-субстрата (Коопт, 1991). По результатам филогенетического анализа РНК-зависимые РНК-полимеразы тобамовирусов отнесены к супергруппе 3 и причислены к ветви "тобамоподобных" РНК-репликаэ вместе с тобра-, трюсорна-, клостсро- и гордеивирусами (Коошпапс! Оо^а, 1993).

1.4. 29К — Транспортный белок.

29К-белок кр-ВТМ состоит из 267 аминокислотных остатков; последовательность транспортного белка (ТБ) кр-ВТМ заметно отличается от ТБ типового штамма Ш и остальных тобамовирусов (рис.4). Например, она содержит самое высокое среди всех известных тобамовирусов количество основных аминокислот: аргинина — 13, лизина — 30 и гистидина — 3. Компьютерный анализ показывает, что изоэлектрическая точка (р1=9,76) предполагаемого белка существенно выше, чем у остальных тобамовирусов: ВТМ-Ш (8,97), ТМОМУ (112) (7,03), Ь-штамма (8,10), СвММУ (9,40), СЖЙУ (8,08) и ЗНМУ (ТМУ-Сс) (8,01).

На рис.4 представлено сравнение аминокислотных последовательностей 29К-белка кр-ВТМ и транспортных белков девяти других тобамовирусов, известных на сегодняшний день. В средней части ЗОК-белков были обнаружены две сравнительно консервативных области (I и II), а С-концевая область состоит из грех более вариабельных регионов (а, Ь, с), обогащенных отрицательно- (а, с) и положительно-(Ь) заряженными аминокислотами (8аНо е( а1, 1988).

Консервативные участки I (аминокислоты 52-96) и II выявлены и в последовательности 29К-белка кр-ВТМ (рис.4,5). Наши результаты показывают, что область II тобамовирусных ТБ значительно длиннее, чем предложено в работе Эайо <?/ а1. (1988) и у кр-ВТМ располагается между аминокислотными остатками ПО и 201. Размер н положение региона II соответствуют домену А, отвечающему за связывание с одноцепочечными ДНК и РНК (аминокислоты 110-186 в последовательности ТБ кр-ВТМ), описанному в работе Ситку ег а1. (1992). Недавно было доказано, что экспрессированньш в Е.соИ 29К-белок кр-ВТМ может связываться с полноразмерной геномной РНК, образуя стабильный комплекс (1\апо\! а а1„ 1994).

С-концевая часть ТБ тобамовирусов содержит второй РНК-связывающий домен (В) (у кр-ВТМ — аминокислоты 186-267), обогащенный положительно заряженными аминокислотами (Сйоуьку а а1., 1992). В соответствующей области 29К-белка кр-ВТМ найден самый длинный среди известных тобамовирусов непрерывный участок, состоящий из подобных аминокислот (Ьув-А^-А^-Ьуз-Ьув-Ьуз). Этот мотив может быть частью РНК-связывающего мотива. После появления работы Бако ее а1. (1988) были опубликованы последовательности еще нескольких тобамовирусных транспортных белков. Сопоставление С-концевых областей ТБ с учетом новых данных, в том числе и последовательности ТБ кр-ВТМ, позволяет усомниться в правомерности выделения особых регионов а, Ь и с (рис.4,5).

По результатам сравнительного анализа, в составе 29К-белка кр-ВТМ выявлены, помимо РНК-связывающих доменов А и В, следующие функционально важные области (рис.4,5): домен С, соответствующий консервативному району I — аминокислоты 64-85 (конформация транспортного белка, Сйоувку е/ а/., 1990,1992); домен О — аминокислоты 239-267 (фосфорилирование ТБ, \Vatanabe ег я/., 1992; Оитку ег а1„ 1993); домен Е — аминокислоты 125-211 (взаимодействие с плазмодссмами, \Vaigmarm е! а!., 1994) к а-спиральный гидрофобный участок — аминокислотные остатки 184-198 (Вегпа, 1995).

PMMV ------------------------MA-LVvKddV-K—IsE-FInLSaaE [21]

OM ------------------------MA-LVvKgkV-n—IriE-FZdL t KroE [21]

L ------------------------MA-LVvRgkV-n--InE-FIdLSKsE [21J

CGMMV------------------------Ms-L-sKvsVenslkpEkFvkiSwvd [24]

SHMV ------------------------Mse-VsKist--llapEkFvkLSvsd [23]

TMV ------------------------MA-LVvKgkV-n--InB-FIdLtKmE [21]

TMGMV------------------------MA-vslrdtV-K--IsE-FIdLSKqd [21]

ORSV rogrlrfvvllsifpiktfsepcytMA-LVlrdsi-K--IsE-FInLSasE [45]

cb ------------------------Ms----KaiV-K--IdE-FXkXSKsE [18]

CrTMV------------------------Msi-Vsyep—K—vsd-FlnLSKkE [20]

PMMV KfLPavmTsVKt-VR-iSrVDKviaM--EH--dSLSdVnLLKGV-K-LvKdGYVC- [68] OM KiLPsmFTpVKS-V-mcSoVDKI—MVhEM—ESLSeVnLLKGV-K-LidsGYVC- [68] L KILPsmFTpVKS-V-mvSkVDKI—MVtiEN—ESLSeVnLbKGV-K-LiegGXVC- [68]

CGMMV KlLPnyF----SilRylSitDf--svVkaqsyESLvpVkllrGVd--LtKhlïVt- [71]

SHMV KfkwkapsrVcSiVq--S--DtI-sM-taNg-rSbEtfDvIXdVlKhaeeytYVdv [72] TMV KiLPsmFTpVKS-V-mcSkVDKI--MVhEN--ESLSeVnLLKGV-K-LidsGXVC- [68] TMGMV eiLPafmIkVKS-VP.-iStVDKI--Mavkli--dSLSdVDLLKGV-K-LvKkGYVC- [68] ORSV KILPsalTaVKS-VR-iSkVDKIisy—EM—dtLSdiDLLKGV-K-LvenGYVC- [92] Ob evLPa-FTrmKS-VR-vStVDKI - -Ma kENdni - -SeVDLLKGV-K-LvKnGïVC- [ 64 ] CrTMV eibPkalTrlKt-Vs-iStkDils—VkE—sEtLcdiDIiinVp—bdKyrXVgi [68]

]

PMMV LAGLWSGEWNL-PDHCRGGVSVCLVEKRMqRddEATLGSXrTsAA-K-KR- [116] OM lÄGlWtGE«NL-PDNCRGGVSVCLVDKRMeRddEArLGSyyTMA-K-KR- [116] L LvGLWSGEWNL-PDMC«fiGVSVCrnTOKRMeKadEATbGSÏyTÂAA-K-KR- [116] CGMMV bXGvWSGvWSv-PesCHGGatVaLVDtBMhavaEgTickf-sApAtv—Re [119]

SHMV L-GvVlSGqWlL-PkgtpGsaeiiLlDsRlkgkasv-LavfncrAAt---qe [118]

TMV LAGLWtGEVraL-PDNCRGGVSVCLVDKEMeSadEATLGSÏyTAAA-K-H®.- [116] TMGMV LAcäLWSGEHNL-PDNCEGGVSVCiVDKEMkRslcEATLGaXh-RpAcK-Kn- [116] ORSV LAGLWtGEWNL-PDNCKGGVSiCLVDKRMkRanEATLGSYhTs-AcK-KR- [140] Ob I. vGLWSGEWNLl PDNCRGGVS i CLiDKRMqRhnEATLGS Yt T kAs -K -Kn -[113]

CrTMV L-GaVftGEW-LvPDfvkGOTtisviDKRlanskEcviGtYr-AAA-KsKR- [115] --[ -La.

С-домен

t______W.___Д__1

PMMV FaFKlIPNYSITTaDAeifv-WQVLVNIRgVaMekGFCPLSLEFVSVCIVhks [168]

OM FQFKvvPNYalTTqDAmKnv-ttQVXVNIRnVkMsAGFCPLSLEFVSVCIVyrN [168]

L FQFKvvPNYgITTkDAeKni-WQVbVNIknVkMs AGyCPLSLEFVS VCI VyШ [168]

CGMMV Fsvf rIPNYSvvaaDAlrdp-WslfVrlsnVgikdGFhPLtLE-Va-ClVatt [169]

SHMV FQFlisPgYSlTcaDAlKkp-fviscNvidlpvkdGFtPLSvE-ia-ClVqfs [168]

TMV FQFKvvPNYalTTqDAmKnv-WQVLVNIRnVkMsAGFCPIiSIjEFVSVCIVyrN [168]

TMGMV FsFKlIPNÏSITseDAeKhp-WQVLVNIkgVaHeeGyCPLSLEFVSiCvVhkN [168]

ORSV FtFKi IFNYS vTTaDAlKgi-KQVmtNIRgVeMekGFCPLSLEFVSiCvVyIN [192]

Ob FsFKlIPNYSITsqDAerrp-WeVmVHIRgVaMseGwCPLSLEFVSVCIVhkN [165]

CrTMV FQFKlvPNïfvsTvDA-KrkpWQVhVrIqd2kieAGwqPLaLEyVSVaraVt-N [166]

[

Ч(=

А-домен Е-домеи

_Ц__'31___ _ (b)__

PMMV N--IKLGLREKIT-SVseGGPvEbTEaWDEFiEsVPMadRLrKFRnqs- (214)

OM N--IKLGLREKIT-SVrDGGP!rELTEEWDEFinBdVPMsiRLaKFRsrtg [215]

L N--IKLGLREKvT-SVnDGGFmEI,sEEWDEFmEnVPMsvRLaKFRtkss [215]

CGMMV MsiIKkGLRasvveSVv-ss~dqs-iVlDslsEIcVepffdkvpisaavm [215]

SHMV NcvItrsLtmKlk--enpatrtfsaEE-VDEllg-smttlR3ieglrk-- [212]

TMV N—IKLGLBEKIT-nVrDGGR-ELTEEWDEPirBdVPMsiRLaKFRsctg [215]

TMGMV Nvr-K-GLBErll-SVtOGsPiELTEkWeEFvdeVPMavkLeKvpen-- [213]

ORSV N—IKLGLKEKIl-nVteGGPtELTEaWDEFvElcVPMaaRLksFRsvii- [238]

Ob Nvr-K-GIJSEKvT-aVseddaiEIiTEEVVDEFiEaVPMarRLqnlR-kp- (210]

CrTMV NvvmK-GLREXv v-a inDpdv- EgfEgWDEFvdsVaafkavdnFkrrK- [212]

-4 --/-r-*j

Е-доиен «-спираль

14» ] I Ц..................I.M

А-домеи В-домен

(b)

PKMV KKgsnkyV----G-KrndMkg-lnkeG---Kl--------------

OM KKs---dVrk—G-KiSss---dRSapn — K-nyr-----------

L Kr----------GpKnrmtJlgkgRS-GgrpKpk---sfde------

CGMMV ardpsyrsrsq---svS---g—R--Gkr-----------------

SHMV KKep-ndVvq—G-hlSaeydvkRSvkrt-Ksentpg~krr-v---

TMV KKs---dVrk—G-KnSsN---dRSvpn—K-nyr-----------

TMGMV KKem---V----G-nnvnNkkir.nS-Gk--Kg--------------

ORSV KKkpsnsskfvnG-K-Srlns—Rn-----Klnyengdsdvgtsvv

Ob Kynkeke------nKnlnNk-n— SiGvs-Kpvglernk-vr-svv

CrTMV KKveekgVvs----Kyky-----R—pe—Kyagpdsf--------

^Fa- ■■■ ... , Ii

В-домен

(b) (c)

H-t---------—

PMMV fdK----vrigqns-----E—SS--------dAeSsS-F- [257]

OM nvKdfggmsfkknnll---dDdSet------tvAeSDS-F-[268]

L veKef-------dr.ll---EDeaet.------svAdSDSy-- [264]

CGMMV hsKppnrrl---dsas---EesSS-vsfddg-l-qSDht-- [269]

SHMV nvdsvslglgkgksvsaknEDteS-v-£ddgil-dSDS---[283]

TMV nvKdfggmsfkknnll---dDdSea------tvAeSDS-F- [268]

TMGMV f-Kiee---------X---EDnvS----ddesiA-SsStF-[256)

ORSV ddivv—gngvsdirl---dDdces—fd----AqSeSy— [303]

Ob -rKgvrsdsslgvtdmsq—DgSSs----e---isSDS-Fi [274]

CrTMV nlKeenvlqhykpesvpvfr—Sg-vgr-----AhSDa---[267]

- ■»]

¡4-M

В-домен D-домен

Рисунок 4. Выравнивание аминокиаготных последовательностей транспортных белков кр-ВТМ и девяти других тобамовирусов. Аминокислоты, обозначенные заглавнылш буквами, совпадают у пяти и более вирусов и штаммов. Жирным шрифтом отмечены аминокислоты, консервативные, по крайней мере, для семи последовательностей. Консервативные (1,11) и вариабельные (а,Ъ,с) области указаны согласно работе Saito et al, (1988) (выделены пунктирными линиями; названия помещены в скобках). РНК-связывающие домены А и В показаны двойными стрелками, а домены С, D, Е - одинарными (см. текст).

ГШ.

соон

ГШ,

(И)

(а)1

(Ь) 8 (с)1

на

соон

110

201

Рисунок 5. Транспортный белок кр-ВТМ. А: Карта функционально важных доменов ЗОК-белка. Домены А, В, С, D, Е и а-спираль обозначены закрашенными прямоугольниками (см. текст). Б: Консервативные (1,11) и вариабельные (а,Ь,с) участки последовательности ЗОК-белка кр-ВТМ. Области, описанше у Saito et al, (1988), за исключением участка I, выделены в скобках (см. текст). Все цифры приведены в координатах аминокислотной последовательности ТБ кр-ВТМ. Рисунки А и Б выполнены в одинаковом масштабе. Использованы материалы статей: Meshi et aL, (1989) и Waigmann et aL, (1994), а также обзора Lucas and Gilbertson, (1994), с изменениями и дополнениями.

Участок фосфорилирования ТБ BTM-U1 состоит из аминокислот серин-258,265 и треонин-261 (Citovsky et al., 1993). В С-концевой области ТБ кр-ВТМ обнаружены консервативные остатки серина в положениях 258 и 265, но отсутствует треонин-261 (рис.4).

Как отмечалось выше, ОРТ ТБ и БО перекрываются на 77 нуклеотидов. Этот участок геномной РНК кр-ВТМ может образовывать вторичную структуру в виде шпильки (рис.7А), имеющую свободную энергию -12,9 ккал/моль и расположенную непосредственно перед терминирующим UAA-кодоном 29К-беяка. Рис.7Б показывает альтернативный вариант укладки РНК с образованием псевдоузлов: стебли I и II имеют свободную энергию соответственно -5,5 и -4,0 ккал/моль, то есть энергетические параметры обоих предполагаемых вариантов вторичной структуры РНК весьма близки. Недавно было показано, что геномы тобамовирусов субгруппы 1а содержат короткую ОРТ (ОРТ-Х), расположенную между генами ТБ и БО, и кодирующую маленький положительно зпряженный белок с молекулярной массой около 4 КДа (Morozov et al., 1993). При трансляции in vitro с Т7-РНК-транскриптов, продукт ОРТ-Х образовывал устойчивый комплекс с а-субъединицей эукариотаче-ского фактора трансляции eEF-1 из люата ретикулоцитов кролика и экстракта зародышей пшеницы (Федоркин и др., 1995). На рнс.6 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей С-концевой части 29К-белка кр-ВТМ и соответствующей части белка ОРТ-Х:

ОРТ-Х белок 'ГМУ-Ш: УЬОуНУ-э 1 БУгУ1 VIаУСИрпг-то. 29К-белок кр-ВТМ: УГ^-НУкреБУрУг гздУеКаЬзс1а

Рисунок 6. Сравнение аминокислотных последовательностей ОРТ-Х и С-концевой части ТБ кр-ВТМ. Заглавными буквами показаны совпадающие аминокислоты.

В данном случае сходство последовательностей значительно выше, чем обычно наблюдается при сравнении вариабельных С-концевых областей тобамовирусных транспортных белков. Если предполагаемый белок ОРТ-Х действительно играет особую роль во время инфекции, можно допустить, что эта консервативная последовательность выражается либо в виде отдельного белка (BTM-U1), либо слитно в составе единого ТБ-ОРТ-Х белка (кр-ВТМ).

1.5. 18К — Белок оболочки.

Капсидный белок кр-ВТМ состоит из 156 аминокислот. На рис.8 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей БО нескольких тобамовиру-сов. Сравнительный анализ последовательностей показывает, что БО кр-ВТМ сходен со структурным белком RMV и отличается от БО BTM-U1. Взаимодействие БО тобамовирусов (на примере ВТМ) с РНК и соседними белковыми субъединицами вириона подробно изучено методами рентгеноструктурного анализа (Champness et al, 1976; Stubbs et al., 1977; Stubbs and Stauflacher, 1981; Namba and Stubbs, 1986; Altshuh et al., 1987; Namba et al., 1989). Показано (все дальнейшие цифры приводятся в координатах БО BTM-U1), что Arg90 и Arg92 образуют водородные связи с фосфатными группами РНК. Аминокислоты Ш-135 формируют правозакрученную а-спираль, содержащую гидрофобный участок связывания с шпсапсидируемой РНК. Каждая белковая субъединица аминокислотными остатками 114-123 взаимодействует с триплетом оснований РНК. Эта а-спираль при помощи водородных связей специфически связывается с рибозой (Aspl 16) и азотистым основанием (Aspl 15, Arg 122). Aspl 15 и Arg 122 также принимают участие в образовании латеральных солевых мостиков с аминокислотами (соответственно с Arg 113 и Asp 88) соседней белковой субъединицы. Как видно из рис.8, все упомянутые аминокислоты консервативны для всех тобамовирусов, в том числе и кр-ВТМ.

1.6. Предполагаемый участок начала сборки вирионов.

Как показывает анализ вторичной структуры геномной РНК, предполагаемый участок инициации сборки вирионов (Оа) находится в С-концевой части гена ТБ. Его структура близка к структуре Оа BTM-U1 (см. обзор Okada, 1986). Область начала сборки кр-ВТМ содержит три стабильных шпильки (I, II, III). Известно, что у BTM-U1 чередование остатков гуанозина с периодичностью в один триплет (GAAGAAGUCGUUG) в петле шпильки I необходимо для узнавания данной последовательности 34-субъедшшчным двойным диском белка оболочки и начала сборки вируса (Turner and Butler, 1986 и Turner et al., 1988). С другой стороны, Оа тобамовируса SHMV вообще не содержит подобного чередования (Fucuda et al., 1980, Atreya and Siegel, 1989). У кр-ВТМ в петле шпильки I также присутствуют характерные G-повторы: (GCAGGUUGACGCCG), хотя и в меньшем количестве, чем у BTM-U1. Любопытно отметить, что мотив AGGUUG встречается в петле I как у SHMV, так и у кр-ВТМ. Сравнение участков Оа BTM-UI, SHMV и кр-ВТМ позволяет предположить, что у кр-ВТМ сочетаются элементы Оа BTM-U1 и SHMV.

1.7. 5'-концевая лидерная последовательность.

5'-концевая лидерная последовательность у кр-ВТМ состоит из 68 нуклеотидов. В позициях 7 и 15 присутствуют остатки гуанозина, что, вообще говоря, нетипично для тобамовирусов, за исключением TMGMV(U2) (G в положениях 4, 13 и 19) и Ob (G в положении 53). 5'-лидерная последовательность — энхансер трансляции геномной вирусной РНК (Sleat et al., 1987,1988; Gallie et al., 1987a,b,c; 1989). Важную роль при этом играют 25-нуклеотидный мотив (САА)П и прямой повтор (ACAAUUAC).

А.

Г!

а а

с - g g - с g - с g - с U - А g - u U U g - с g - с с - g g а а - u с - g g - с

aaucaguac caguauuuc u

uaa

ccagugcauaucggca-

aagaaaa

Б.

aagaaaa

|~АТС|

ucuuacaacauuacaaaccc

uugucacaa

aug ucuuacaacauuacaaacccg■

aaucaguaccaguauuucgcagcggugug■

cguagccyuac —

l—ccg gacgg-

uaa ccagugc— auaucggc,uugucacaa A

Рисунок 7. Два варианта вторичной структуры геномной РНК кр-ВТМ в радоне перекрывания ОРТ генов ТБ и БО. AUG—инициаторный кодой гена БО; VAA — терминирующий кодой гена ТБ. I и Н—стебли предполагаемых псевдоузлов (см. текст).

Известно, что у BTM-U1 триплет AUU (нуклеотиды 15-17) является сайтом связывания SOS-рибосомы (Туе еЛ а(., 1984). У кр-ВТМ в 5'-НТО сайт AUU встречается дважды — в позициях 12-14 и 31-33. Для кр-ВТМ характерно отсутствие 8-нуклеотидного прямого повтора (имеется только одна несовершенная копия — ACAAAUUAC), однако область (САА)П более выражена. Как показали эксперименты по мутагенезу 5'-негранслируемой области, наличие двух участков (САА)-повторов является достаточным условием усиления трансляции (Gallie and Walbot, 1992). Эффективность трансляции in vitro геномных РНК кр-ВТМ и штамма U1 в лизате ретикулоцитов кролика практически совпадала (результаты не показаны).

СгТМУ МЗта1ТНРКОУОУГААУИДЕР1РМЬ№С15А.ЬБОЗУ!2ТОАДКПТУКООРЗИЬЬ5 53 НМУ ИЗУК1ТНБВДУОУГЛАУИАЕРГРМЬЫОСУЗДЬЗОЗУС!ТОАСПСТУКООРАМЬЬЗ 53 БД мг5Г31ТЗЕ30ЕУГЬЗЗУТ,тА0Р1ЕЬЬОТСТ55КН0Г2Т00ЛНГТУа0аГЗЕУЖ 53

ТМУ MSУSITTPSQFVFLSSAWADPIE1INLCTNAX,GNQFCTQQARTWQRQFSEVWK 53 ОМ KSYSITTPSQFVFLSSAWADPIELIЫLCIHALGNQFg,3^i^QARTWQROFSEVWK 53 ТМвМУ МРТТ1№ЗРЗОЕУУЬЗЗАУАСРУОЬ1МЬСГЫАЬСКСЗЕфТООА11ТТУОСОГАГ>А№К 53 ОКБУ МЗУТ1ТЕРЗКЬАУЬЗЗАИАОРНЗЬ1ЫЬСТ№ЬСКОГОТООАКТТУОООГАОУ¥а 53 ССММУ №таО1ТРЗКЫАГЗАБУУРтатЬЬЫРЬУА30СТАГОТ2АС1№ЗГКЕ31,ЗА1,РЗ 53 впт УЛГБ1РТРЗОЬ№ГТЕЫ¥АВУ1?ГЮ1ПЬ1}1ЛЯ5ПЗГйТй5СЯ1)Е1ПЕ11.1К50У 53 РММУ МАУТУЗЗА»ЮЬУУЬСЗУМАЕРЬЕЕООТХТЗЛЬСТОГОТООАКТТУ<ЗООГЗОУИК 53 ОЪ МРУГУТЗРЗОЕУУГСЗУИАОРХТГХОЗХТУАЬСЫОГОТСНАКТГУОООГЗОЬЕК 53 Р11 МРХТУЗЗР№ЬУУГСЗУИАПР1АЫЕЬСТУЗЬС№РОТОЫАПТТУОООГЗОЬРК 53

СгТМУ AWAPS^RFPETGSR--VУVHSAVIKPLУEALMKSFDTИ^RIIEa'EEESRP-SASE 106

ЕМУ Т1УАРЫОКг,РБТСРН--УТОНЗАУРКРЬУЕАХМКЗРПТВШ1110ТЕЕОЗИР-ЗАЗО 106

ОА РРРОЗГУМ-рСОУТК--УУЯШАУЬОРЫГА1.ЬаТГОТ1т11ЕУЕНОаЗР-ГТАЕ 106

Ь РЕР25ТтагРС07УК--ЧУКУКАЧЬОРЬХТАХ1ЬСА1?ОТИП(.11ЕЧ1;ЯООЗР-1ТАЕ 106

ТМУ РЗР0УТУМ,РСЗОЕК--УУиУЫАУЬОРЬУТА1.ЪСАРВТ1Ш«1ЕУЕ№АЫР-ТТАЕ 106

ОМ РЗР0УТУ№РБЗПГК--УУЕУМАУЕПРЬУТЛ1ХСАГПТВДШ1ЕУЕ!ВДАда-ТТАЕ 106 ТМСМУ РУРЗМТУ1^РАЗОЕУ--УУКУЫЗТЬОРЬ1ТА1ЛМЗРО:ГЮт11ЕУПКОРАРЫТТ-Е 106 ОКБУ РУРИ,ТЗКРРА6АСУГКУУНУ0Р1Е0РЬ1ТЕШетЕТ>ТКШ1ХЕУЕМРдЬ,Р-ТТТЕ 108 ССММУ ЗУУ01КЗ!»РОАСКУАКЬ-К-СРУЕКР1ГУЗЬЬЗЗТСТМгаУ1ЕУУПРЗМР-'ГТАЕ 106

гнму ЗУУЗР1БОТРАЕРАУХ1У1КОР313ТУУТАЬМЗТ-тКШУ1ЕУЕНЗТНУ-ТТАЕ 107 РММУ Т1РТАТУ11РРАТСГК--УЕКУМАУЪСЗЬУЗА1.ЬСАЕОТетт11ЕУЕЫРаИР-1ТАЕ 106

ОЬ ТУРТНТМКРЫ0СЕМСГКУРНУКЗГЬ0РЫЗАЬММЗГ0Х!«П111ЕУСМРАЫРМ'ТЗЕ 108

Р11 ТУРТЯТУКГЗООЕЫСЕНУРКУИЗТЬПРЫТАЬЬЫЗЕОПатПЕХЕЫРАЫРМ-ТАЕ 108

* * *

СгТМУ таИАТОКУООАХУ31КЗОЮЬЬ1,ЗЕЬЗЗСНСУММКАЕГЕА---ЬУРИТТАААТ 156

ЯЧУ УАМАТОНУСОАТУАХКЗОЮЬЬЬНЕЬЗКОНСУШНАЕРЕА---ИРМТТАРАТ 156

ОА ТЬОАТБЖУООАТУА1КЗА1ШЬУИЕЬУНСТ6ЬУЫдМТРЕЗМЗСЬУ-НТЗАРАЗ 158

Ь ТЬ0АТКШ5ПАТУА1КЗА1ШЪУЖЬтаСТС:Ш)0ОТгеЗМЗЕЬУ-НТЗАРАЗ 158

ТОТ ТЪПАТККУРОАТУАМЗАРШЫУКЬШСТСЗИЖЗЗГЕЗЗЗСХЛГ-ИТЗСРАТ 158

ОМ ТЬОАТККУОПАТУАШЗЫШЬтеЕЫКЗТСЗУШЗЗГЕЗЗЗбЬУ-тЗбРАТ 158

ТМСМУ ЮТАТОКУПСАТУАХКАЗГШЕАНШЬУКНТСИРКОАСгаТАЗбЬЧ-ИТТТРАТ 158

ОВЗУ ТЬВАТККУМ)АТУА1КЗА1НЫЬ1КЕЬУТ!аТ6МУН0УЗРЕТ13СЬТ-Ш:33 157

ССММУ 5ЕЫАУККТППАЗТААЛАЕ1ЕЫЬ1Е313КаГБУУ15КАЕРЕААРЗУУ-ИЗЕАТТЗКА 160 гнму ОШАУКНТОСАЗТА1НШЬЕОЬЬЗЬЬТЫ5ТСУГШТЗВЕЗАЗСЬТ-Ш^ОТРКТА 163

РММУ ТЬСАГККУОТАТУА1ИА313НШЖ1теСТСМУК0А1ЕЕЗАЗСЬТ-ИАТТР 156

ОЬ УАЗАТ0КУВОАТУЖКАС1ШЬШЕЬтеСТСМШТАЗГЕТУЗЫЬТ~КТТТТТТ 161

рц 1АЗА1анУ25АТУА1№С1нмшнЕЬАнетстмтузгЕТ1зы1т-иттмтт 160

* ** 4

Рисунок 8. Аминокислотные последовательности структурных белков кр-ВТМ и остальных тобамовирусов. Жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки, совпадающие у всех вирусов. РНК-связывшоиций участок подчеркнут (см. текст). Упомянутые в тексте консервативные аминокислотные остатки отмечены звездочками.

270

5' - CUU —• UGGUG •

- GUCAUCAGGÜ

A-CC

■CUGCUGCUACU-uagg-240 V

iii

AUA--GCGCAO-

IUI!

pCGCGU -i ■GCA-J \

III 225

- CGU-- GG

■AGUG■

— ÜCACn

—uuuuu-,

200 -C-UCUG

L UGAAUC-GAAGAG-AU -

■AGA—j -GU-GGC-AUUC

| I III H

1— UAAAUCCG-UAGG -160

iii

■ AAA— WACGC-

- AAUGCG

■ CCA

III

■ GGU -

■ AAUG -

INI

-UUAC

-uuuu

]

СШ-GGG

■OAAAUC-GAAACCC-С-> I 103

тБНК-подоОная структура

Рисунок 9. Структура области псевдоузлов кр-ВТМ. Нумерация нуклеотидов — начиная от 3'-конца генома. Терминирующий кодон гена белка оболочки подчеркнут и выделен жирным шрифтом. Римскими цифрами обозначены элементы двойной спиральной структуры псевдоузлов.

1.8.3'-концевая негранслируемая область.

З'-концевая нетранслируемая область (НТО) тобамовирусов (201п.о у ВТМ-Ш, 235 нуклеотидов у кр-ВТМ) содержит два структурных элемента: тРНК-подобную структуру и расположенную непосредственно перед ней область так называемых псевдоузлов (van Bekum et al, 1985; Takamatsu et al, 1990). З'-концевая часть геномной РНК кр-ВТМ может образовывать шесть потенциально стабильных псевдоузлов в НТО и один псевдоузел в С-концевой части гена БО (рис.9). В последовательности З'НТО BTM-U1 найдено только 5 псевдоузлов. Эксперименты Takamatsu et al. (1990) доказали значение области псевдоузлов, особенно ближайшего к З'-концу РНК, для успешной репликации вирусного генома. Наибольшее сходство последовательностей З'-НТО U1 и кр-ВТМ отмечается в районе двух З'-проксииальных псевдоузлов, образующих тРНК-подобную структуру. Мотив UAAGCUU, найденный в аминоацилирующем плече у кр-ВТМ, типичен для тобамовирусов, присоединяющих гистидии. С другой стороны, предполагаемая антикодоновая петля кр-ВТМ содержит не гисгадиновый, а глутаминовый антикодон (UUG). Вопрос, связано ли данное отклоните в тРНК-подобной структуре кр-ВТМ с присоединением соответствующей аминокислоты, остается открытым и нуждается в отдельном исследовании.

Часть 2. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ВЕЖА ОБОЛОЧКИ.

2.1. Общие замечания.

Широко известно, что большинство эукариотических мРНК транслируется по модели "сканирующей рибосомы". Показано, что 40S субъединица рибосом связывается с 5'-кэп-структурой и мигрирует вдоль нетранслируемой лидерной последовательности до встречи с AUG-кодоном (Kozak, 1986, 1989). Хотя у основной массы эукариотических мРНК трансляционно активна только первая ОРТ, предложены различные механизмы для полицистронного функционирования мРНК в клетках эукариот (Kozak, 1986). Если AUG-кодон первой ОРТ не имеет оптимального нуклеогидного контекста, 40S- субъединица может миновать его и инициировать синтез белка на одном из последующих AUG-кодонов (так называемый leaky scanning механизм). Для объяснения инициации трансляции ряда функционально бицистронных эукариотических мРНК была предложена модель терминировання-реинициации (Kozak, 1989). Еще один механизм нелинейной миграции рибосом (так называемое шунтирование) был недавно описан для 35S-РНК вируса мозаики цветной капусты (cauliflower mosaic virus, CaMV) (Futterer et al., 1993).

В отличие от большинства эукариотических мРНК, синтез белка у пикорнавнру-сов происходит по мехаш!зму внутренней инициации трансляции. 5'-нетранслируемая последовательность геномной РНК этой группы вирусов содержит так называемую область внутренней посадки рибосом (ОВПР) или internal ribosome entry site (1RES) (Jang et al, 1988; Pelletier and Sonenberg, 1988; Jackson et al., 1990). Эта область имеет развитую вторичную структуру и содержит пиримидин-богатый участок перед стартовым AUG-кодоном (см. обзоры Sonenberg and Pelletier, 1989; Agol, 1991; Wïmmer et al., 1993). Феномен внутренней посадки рибосом описан и для других вирусных (Tsukiyama-Kohara et al, 1992; Wang et al., 1993; Rijnbrand et al., 1995; Berlioz and Darlix, 1995; Liu et al, 1991; Liu and Inglis, 1992; L cet al, 1994; Levis and Astier-Manifacier, 1993; Basso et al, 1994; Meulewaeter et al, 1992; Gramstad et al, 1994) и клеточных (Macejak and Sarnow, 1991; Jackson, 1991: Oh et al., 1992) РНК.

Опыты по трансляции in vitro показывают, что обычно из четырех тобамовирус-ных ОРТ только две (130 и 180К) экспрессируются непосредственно с геномной РНК (Pelham and Jackson, 1976). Два других белка (ТБ и БО) транслируются с двух субгеномных РНК (сгРНК). Со структурно бицистронной сгРНК- Ь синтезируется только ТБ, в то время как 3'-концевой ген БО не выражается. БО транслируется с собственной LMC-crPHK (см. обзор Palukaitis and Zaitlin, 1986).

2.2. Трансляция геномной РНК кр-ВТМ,

Трансляция выделенного из агарозного геля препарата геномной РНК кр-ВТМ в экстракте из зародышей пшеницы (ЭЗП) (рис.10) и лнзате ретикулоцнтОв кролика (JIPK) (результаты не показаны) приводила к образованию белкового продукта, приблизительно соответствовавшего БО кр-ВТМ по молекулярной массе и положению в геле после электрофореза. Этот продукт специфично взаимодействовал с антителами к БО кр-ВТМ в реакции иммунопреципитации (рис.10). При использовании, в качестве негативного контроля, геномной РНК BTM-U1; похожие продукты трансляции отсутствовали (рис.10). Данные результаты позволили высказать предположение о возможной экспрессии гена БО по механизму внутренней инициации трансляции. Для подтверждения или опровержения гипотезы о вероятном синтезе БО по модели внутренней посадки рибосом были получены 2 набора бицистронных генноинженерных конструкций: а) матрицы на основе природной комбинации генов, моделирующие субгеномную РНК Ь; б) серия химерных матриц — предполагаемая ОВПР клонировалась между первым и вторым цистроном, допуская возможность экспрессии З'-проксимального репортерного гена GUS (глюкуронидаза). Конструкции транскрибировались с помощью РНК-полимеразы бактериофага Т7 и транслировались in vitro в бесклеточных системах ЭЗП, ЛРК и Кребс-2.

Рисунок 10. Синтез белка оболочки во время трансляции in vitro геномной РНК кр-ВТМ в бесклеточной системе экстракта зародышей пиияшцы. Белки, меченые по [35SJ-Meinuonwiy, разделялись электрофорезом в градиентном 8-20 % потшкрил-амидном геле в присутствии SDS. Концентрация РНК— 40/jg/mL Дорожки (слева направо): эндогаишя проба (РНК не добавляется); гпраяс-ляция гаюмной РНК BTM-U1; трансляция

геномной РНК кр-ВТМ; трансляция можцистронного Т7-РНК-транскрипта ШРЕсоСР (см. PUC.11F) — содержит только ген БО; (crTMV+IgcpcrTMV) —

иммуиопреципитация продуктов трансляции геномной РНК кр-ВТМ антителами к БО кр-ВТМ; (AMPEcoCP+IgcpcrTMV) — иммунопреишштация продукта трансляции Т7-РНК-транскрштш АМРЕсоСР антителами к БО кр-ВТМ; им-мунопрещтшпагщя продук-тов трансляции геномной РНК BTM-U1 антителами к

бовтм-ш.

БО

2.3. Трансляция конструкций, полученных с использованием природной комбинации генов: (ТБ-БО-З'НТО).

В первой серии экспериментов исследовалась трансляция двух типов синтетических бицисгронных транскриптов, содержавших гены ТБ, БО и 3'-концевую НТО, в системах JIPK (рис.12) и Кребс-2 (результаты не показаны). Транскрипты первого типа (LMPCP) содержали З'-проксимальный фрагмент генома кр-ВТМ протяженностью 1665 нуклеотидов и 228-нуклеотидную лидерную последовательность, полученную из С-концевой части репликазного гена 178К кр-ВТМ (рис.11). Трансляция in vitro бицистронного РНК-транскрипта LMPCP приводила к образованию двух мажорных белковых продуктов с молекулярными массами около 30-ти и 18-ти кДа. Полипептид 18К был идентифицирован как белок оболочки кр-ВТМ методом иммунопреципитации радиоактивно-меченых (по 355-метионину) продуктов трансляции антителами к вирионам кр-ВТМ. Дополнительные свидетельства в пользу идентификации белков 30 и 18К как ТБ и БО были получены при

Мм1 htl

лл

ISIMI N«I . f —I-L*

I " I

EctRI gm

1 Sm»I Mc«X ,

TÜSJttFCi*

ZevRI SVT T

«««4 Sc«ri a« fr

T=\

S69* S*9* E«*SI 3VTT

7—4

Ео«ш emrt

f Siul Nc* I,

S44A

<50T4

С С

G—С UA <3—С

UA А а—с со гз Аи с

ь'- оассягабазисс силаоисвАс GU G

'' -

я—

с:—СЗ

j г——1 ' пг—с

cuGcscc 1а urai сселил- а о—а 1 с и

С В

ЛТВЗМРСР

IMPÄCPSmal

¿^ CT"

Рисунок 11. Схема конструкций серии "ТБ-БО-З'НТО" Сприродные" матрицы, моделирующие субгепомную РНК h): (А) исходный транскрипт LMPCP с 228-нуклеотидной лидерной последовательностью; (В) транскрипт TBSMPCP с 5'-концевьш участком TBS (блокирует трансляцию гена ТБ); (С) транскрипт ATBSMPCP с делецией 57 нуклеотидов в последовательности TBS; (D и Е) моноцистроиные транскрипты LMPACPSma и TBSMPACPSma с удаленным геном БО; (F) транскрипт АМРЕсоСР — делетировапа S'-концевая часть гена ТБ; (G) предполагаемая вторичная структура TBS-поаедователыюсти. Открытые рамки трансляции обозначены прямоугольниками. Цифры показывают положение первого нуклеотидного остатка инициаторного кодона и последнего нуклеотида терминирующего кодона генов ТБ и БО в координатах последовательности геномной РИКкр-ВТМ (Dorokhov et al., 1994).

изучении продукте® трансляции моноцистронных конструкций LMPACPSma (делегированы ген БО и З'НТО, рис. И) и ЛМРЕсоСР (делегирован ген ТБ, рис.11). С каждого из этих транскрипгов синтезировался единственный белок, соответственно ТБ и БО (рис.12). Эти результаты показывают, что транскрипт LMPCP функционирует в системе ЛРК как бицистронная матрица (рис.12), однако не позволяют с уверенностью утверждать, что второй ген (БО) экспрессируется по механизму внутренней инициации трансляции, так как в принципе возможна интерпретация данных согласно моделям сканирования рибосом и терминирования-решшциации. Для дальнейшего исследования особенностей трансляции гена БО были получены конструкции и транскрипты второго типа (TBSMPCP, рис.11),

ей

433020,114,4-

Рч

и с-

а. о

см

ги О

от

Рн

CLi

со

ь <

в S

го PL,

£ "S6 а. о

U е- П П от Г 1 Чг п.

(-< си

2 S

от со Ю 03 Н Н

о о

Й W

с* а.

S S

<1 <

_j -j

< §

о £

Рисунок 12. Белки, синтезирующиеся при трансляции РНК-транскришнов серии "ТБ-БО-З'НТО" в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика. Продукты трансляции, меченые по [358]-метионину разделялись электрофорезом в градиентном 8-20 % полиакриламидном геле в присутствии SDS. Концентрация РНК—40 pg/mL Положение ТБ, БО и пептидных маркеров молекулярного веса показано стрелками. Возле каждой дорожки обозначено название соответствующего транскрипта (подробная расшифровка в подписи к рис.11).

содержавшие полученную из двух плазмидных полилинкеров (pGEM-3zf и pBluescript II SK+) 98-нуклеотидную последовательность TBS (название от translation blocking sequence или блокирующая трансляцию последовательность). Этот участок расположен непосредственно перед ОРТ транспортного белка и не допускает синтез ТБ с моноцистронного транскрипта TBSMPACPSma (рис.12). Данный эффект, вероятно, связан со способностью TBS формировать потенциально стабильную шпилечную структуру на 5' конце химерной мРНК (рис.11).

Рис.12 показывает, что, несмотря на заблокированую трансляцию гена ТБ, расположенный следом за ним ген БО (бицистронная конструкция TBSMPCP) успешно транслируется. Это означает, что синтез белка с У -проксимального генаБО не зависит от экспрессии предшествующего гена ТБ. Данный вывод подтверждается результатами трансляции конструкции ATBSMPCP (рис.12), в которой была удалена основная часть (57 нуклеотадов) TBS-последовательности. Такая деления восстанавливала истинную бицистронность мРНК и приводила к синтезу обоих вирусных белков (ТБ и БО) с транскрипта ATBSMPCP (рис.12).

2.4.Трансляния химерных бицистронных конструкций серии

Н-БО-ОВПРБО-GUS.

В последующей серии опытов использовались химерные бицистронные конструкции, содержавшие ген белка оболочки кр-ВТМ как первый, 5'-проксимальный, цисгрон и, в качестве маркерного гена, 3'-проксимальный ген ß-глюкуронидазы (GUS). Данный набор конструкций транслировался в системах ЭЗП и ЛРК. Все транскрипты содержали потенциально стабильную шпильку (Н, hairpin) перед

IMStp_^^_

<«) "ll. cp Ы... }{ «и I HCPIRESepGUS

о') "ii cp lasj gus i hcpuiepgus -j|. gus zu hcpctßcus

<c> "El CP I шГ

ар

(■») вС

bpGUS

w pH ;j «д I UI^gus

IREScp

(0 J-££—lm£Z-jj M I CPIRESCPGUS

| CP ISM " !! GUS 1

4141

1 CP :: gus 1

(S) -I.. Irffl) {{ GUS 1 CPU1SPGUS

(h) 5-GGGC3AAUUGGGUACCGGGCCCCCCCUCGAGGUCGACGGUAU с I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I III I II CCAUGGCCCGGGGGGGAGCUCCAGCUGCCAU 13

'AUG

Рисунок 13. Схема химерных конструкций серии "H-CP-IREScr-GUS (a) HCPIREScrGUS — гены БО и GVS разделены последовательностью ОВПРбо, трансляция БО блокирована шпилькой (Н); (b) HCPUPPGUS— участок Ulsr, предшествующий гену БО BTM-U1 (150 нуклеотидов), клонирован между генами БО и GUS; (с) HCPaßGUS— aß-лидер Х-вируса картофеля (PVX) (83 нуклеотида) расположен между генами БО и GUS; (d-е) UPFGUS и aßGUS—моноцистронные варианты конструкций (h) и (с), ген GUS под контролем последовательности Ulsp и aß-лидера PVX; (f-g) CPIREScpGUS и CPUlsrGUS конструкции (а) (Ь) с удаленной шпилькой; (h) —предполагаемая вторичная структура шпильки (Н).

началом ОРТ гена БО. Эта идеальная шпилечная структура была получена путем дупликации части полилинкера векторной плазмиды с образованием 33-нуклеотидного инвертированного повтора. Основная цель подобных манипуляций — не допустить экспрессию 5'-проксимального цистрона и, следовательно, исключить объяснение трансляции второго гена по моделям сканирования рибосом и терминирования-реиюшиации. Во всех химерных конструкциях для клонирования репортерного гена GUS под контроль лидерных или регуляторных последовательностей использовался сайт рестрикции Ncol (CCATGG), содержащий ATG-триплет в рамке считывания маркерного гена. Синтезированный с такой матрицы РНК-транскрипт имеет близкий к оптимальному нуклеогидный контекст стартового кодона (Kozak, 1986,1989,1991); уровень экспрессии исследуемого гена значительно повышается по сравнению с другими способами клонирования (Sleat et al., 1988). Первоначально экспрессия генов БО и GUS исследовалась в опытах с матрицей HCPIREScpGUS (рис.13). Данная конструкция содержала в межгенной области в качестве спейсера предполагаемую 148-нуклеотидную ОВПРво (IREScp). Наличие шпильки в бицистронном транскрипте HCPIREScrGUS полностью блокировало трансляцию первого цистрона, в то время как с З'-проксимального гена GUS синтезировался белок с ожидаемой молекулярной массой, обладавший типичной для продукта гена GUS ферментативной активностью (рис.14). В дальнейшем в

ся

оР

се Р О

о,

сл Р О со. Ö с. CJ

со р

гР

Р —

и ж

Р Ц

СП. Ö

хл Р

О М & Р кл

о 2:

со. ö

ft.

U К

€ з

и ft

Ü er

и (

Р №

-GUS

со

сл ш

Й ft.

-Б1

Рисунок 14, Радиоавтограф продуктов трансляции in vitro РНК-транскриптов серии "H-CP-IREScrGUS" в белюк-синтезирующих системах экстракта зародышей пшеницы (А) и лизата ретикулоцитов кролика (Б). Положение БО, GUS и пептидных маркеров молекулярного €еса показано стрелками.

качестве контрольных спенсеров использовались сф-лидер Х-вируса картофеля (PVX) (83 нуклеотида) и 150-нуклеотидная последовательность UIsp, полученная при амплификации методом ПЦР участка, непосредственно предшествующего гену БО BTM-U1. Выбор именно этих последовательностей обусловлен тем, что, ар-лидер PVX является сильным трансляционным энхансером (Smirnyagina et. al., 1991, Tomashevskaya et al., 1993), a UIsp, — структурный аналог ОВПРбо- В бицистрон-ных конструкциях HCPapGUS и HCPUlspGUS, где первый и второй цистроны были разделены ap-лидером и сиейсером Ulsp , не транслировались уже оба гена (рис.14). На последнем этапе анализировались транскрипты CPIREScpGUS и CPUlspGUS с удаленными шпильками (рис13). В конструкции CPIREScpGUS были активны оба цисгрона (синтез БО и GUS), а у мРНК CPUlspGUS U1 — только один (синтез БО) (рис.14). Эти результаты показывают, что, в отличие от BTM-U1 — типового представителя тобамовирусов, область вирусной РНК кр-BTM перед геном БО способна обеспечивать внутреннюю инициацию трансляции in vitro.

2,5. Вторичная структура области внутренней посадки рибосом.

Последовательность ОВПРво содержит пурин-богатый участок и может формировать сравнительно простую вторичную структуру (рис.15). Функциональная роль различных элементов последовательности, а также минимально необходимая для успешной экспрессии БО протяженность ОВПР остаются неясными. Хотя граница области и не определена точно, она, очевидно, расположена внутри 148-нуклеотидного региона, служившего спейсером в опытах по трансляции химерных бицистронных мРНК. Анализ вторичной структуры показывает, что РНК в районе ОВПР может образовывать две шпильки (рис.15). Заслуживает внимания также и расположение пурин-богатого мотива (протяженностью в 31 нуклеотид, из них 29

остатков адснозина и гуанозина) между этими шпильками. Необходимо отметить, что пурин-богатый участок содержит 9-нуклеотидный прямой повтор AAAAGAAGG и мотив GAAGAAAA, представляющий собой несовершенную обращенную копию данного повтора. Для решения вопроса о важности этих элементов необходимы дальнейшие эксперименты по направленному мутагенезу ОВПРш.

2.6. Обсуждение результатов.

Давно известно, что у тобамовирусов непосредственно с геномной РНК транслируется только 5'-проксимальный ген. С некэппированной бицистронной сгРНК-Ь синтезируется только ТБ, в то время как вторая, кэппированная сгРНК служит матрицей для синтеза БО (см. обзор Palukaitis and Zaitlin, 1986). Неожиданно, результаты опытов по трансляции РНК кр-ВТМ указали на возможность прямой трансляции БО с геномной РНК.

Бицисгронные некэппированные транскрипты серии ТБ-БО-З'НТО можно считать аналогами субгеномной РНК Ь. Показано, что при трансляции одной из этих конструкций (TBSMPCP) З'-проксимальный ген БО выражался, несмотря на заблокированную экспрессию первого гена ТБ (рис.12). Это также подтверждает возможность трансляции in vitro гена БО по модели внутренней посадки рибосом.

Область перед геном БО кр-ВТМ (148 нуклеотидов, ОВПРво или IREScp), использовалась в качестве межгенного спейсера в химерных бицистронных конструкциях (рис.13). Необходимо было выяснить, способна ли ОВПР эффективно функционировать вместе с чужеродным геном GUS или речь идет о феномене, проявляющемся только на природных матрицах. Также требовал ответа и вопрос о роли кодирующей последовательности гена БО в процессе внутренней посадки рибосом и инициирования синтеза белка. Оказалось, что последовательность IREScp обеспечивала внутреннюю инициацию трансляции З'-проксималъного гена GUS в системе ЭЗП; отсюда следует вывод — кодирующая часть гена БО не является абсолютно необходимой для успешной экспрессии маркерного гена. В то же время нельзя исключить, что область после стартового AUG-кодона гена БО может быть важна для поддержания отмечавшегося в экспериментах с "природными" матрицами достаточно высокого уровня синтеза БО. Для решения данной проблемы требуются дальнейшие опыты по мутагенезу участков последовательности до и после AUG-кодона гена БО.

Эксперименты с конструкцией HCPUlspGUS, содержавшей в межгенной области последовательность BTM-U1, доказали, что описанный для кр-ВТМ феномен необычен в группе тобамовирусов. Рис.14 показывает, что эквивалент ОВПРбо из генома ВТМ vulgare, типового представителя группы, был нефункционален, т.е. не обеспечивал экспрессию З'-проксимального цистрона.

Опыты по трансляции in vitro показывают, что ОВПРбо одинаково эффективно инициирует синтез белка в бесклеточных системах как растительного (ЭЗП), так и животного /ЛPK, .Кребс-2) .происхождения. Явление .внутренней .посадки .рибосом, как и следовало ожидать, не зависело от наличия или отсутствия кэп-структуры на 5'-конце исследуемых мРНК.

В настоящей работе впервые описан тобамовирусный геном, содержащий область внутренней посадки рибосом. Представленные результаты свидетельствуют, что сравнительно простая по структуре и небольшая по размерам ОВПРво значительно отличается от ОВПР пякорнавирусных и других эукариотических мРНК. (см. обзоры: Agol, 1991, Wimmeret al., 1993). Сделанный вывод о вероятной экспрессии гена БО по механизму внутренней инициации трансляции in vitro не исключает того, что in vivo возможен конкурентный синтез БО с моноцистронной сгРНК. В листьях зараженного кр-ВТМ табака методом Нозерн блот-гибридизации были обнаружены две разновидности РНК, соответствовавшие по размерам

G A A U U С G U С G А U U С G G U

А.

G С

U-A „ U-A f\G-C I/G-U " A-U

№

U-A

А G

А С

пурин-богатый участок

A G G-C G-C C-G C-G A-U G-C_ a-it „GUAC-G

i111 А ^jaug-U

a-u

А С U-G G-U A-U A-U

UGCAGCAU-AGAAGGAAAAAGAAGGUUGAAGAAAAGGGUGUAGU-AAUUUGAAAGAAGAAA

AUG

U-3'

Рисунок 15. Предполагаемая вторичная структура 148-нуклеотидной области внутренней посадки рибосом (ОВПРво или ЩЕЯср). Прямой повтор, входящий в состав пурин-богатого участка, выделен жирным шрифтом. Инициаторный кодон гена белка оболочки отмечен рамкой.

субгеномным тобамовирусньш РНК Ь и ЬМС (результаты не показаны). Можно предполагать, что оба механизма участвуют в экспрессии гена БО, то есть трансляция БО с моноцистронной сгРНК ЬМС сосуществует с параллельным синтезом белка по модели внутренней посадки рибосом непосредственно с геномной РНК и/или сгРНК 12.

ВЫВОДЫ.

1.Геном нового тобамовируса, заражающего растения семейства крестоцветных (кр-ВТМ), клонирован в видекДНК.

2.0пределена полная нуклеотидная последовательность геномной РНК кр-ВТМ (6312 п.о.).

3.Выявлены 4 открытые рамки трансляции, кодирующие полипептиды с молекулярными массами 178, 122, 29 и 18кДа.

4.Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей позволил установить:

а)бслки 122 и 178К контролируют репликацию вирусного генома;

б)бедок 29К обеспечивает межклеточный транспорт вирусной инфекции;

в)белок 18К является капсидным белком вируса.

5.Структура генома кр-ВТМ имеет ряд уникальных особенностей, в том числе: а)гены транспортного и структурного белков перекрываются на 77

нуклеотидных остатков; область перекрывания может образовывать потенциально стабильную вторичную структуру;

б)обнаружены дополнительные псевдоузлы в З'-конневой незранслируемой области;

в)изоэлектрическая точка транспортного бежа заметно выше, чем у остальных тобамовирусов;

г)найдены существенные отличия от известных тобамовирусов в тРНК-подобной структуре и участке начала сборки вирионов.

6.В ходе экспериментов по трансляции различных бицистронных матриц доказано, что белок оболочки кр-ВТМ может синтезироваться in vitro по механизму внутренней инициации трансляции. Данный способ экспрессии генов редко встречается среди эукариотических мРНК, а у тобамовирусов описан впервые.

7.Охарактеризована область внутренней посадки рибосом (IRES) (148 нуклеотидов). Показано, что IRES-последовательность эффективно функционирует в бесклеточных системах как растительного, так и животного происхождения и инициирует синтез белка не только на "природных" но и на химерных матрицах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Дорохов Ю.Л., Иванов П.А., Новиков В.К., Ефимов В.А., Атабеков И.Г. "Тобамовирус крестоцветных: нуклеотидная последовательность генов транспортного белка, капсидного белка и З'-концевой нетранслируемой области." Доклады Академии Наук (1993), т.332, 4, стр. 518-522.

2. Дорохов ЮЛ., Иванов П.А., Новиков В.К., Ефимов В.А., Атабеков И.Г. "Тобамовирус крестоцветных: нуклеотидная последовательность 5'-нетранслируемой области и генов неструктурных белков, контролирующих репликацию вирусного генома." Доклады Академии Наук (1994), т.335, 6, стр. 792-798.

3. Иванов К.И., Иванов П.А., Тимофеева Е.К., Ефимов В.А., Дорохов Ю.Л. "Клонирование генов транспортных белков двух штаммов вируса табачной мозаики и их экспрессия в клетках Escherichia coli." Биоорганическая химия (¡994), т.20, 7, стр. 751-758.

4. Ivanov K.I., Ivanov P.A., Timofeeva Е.К., Dorokhov Yu.L. and J.G.Atabekov. "The immobilized movement proteins of two tobamoviruses form stable ribonucleoprotein complexes with full-length viral genomic RNA." FEBS Letters (1994), 346, p.217-220.

5. Dorokhov Yu.L., Ivanov P.A., Novikov V.K., Agranovsky A.A., Morosov S.Yu., Efimov V.A., Casper R. and Atabekov J.G. "Complete nucleotide sequence and genome organization of a tobamovirus infecting cruciferae plants." FEBS Letters (1994), 350, p.5-8.

6. Dorokhov Yu.L., Ivanov P.A., Ivanov K.I., Timofeeva E.K., Kalinina N.O. "The crucifer tobamovirus: nucleotide sequence and mode of genome expression." Abstracts of International Conference "Fundamental and applied problems in phytovirology", Ukraine, Crimea, Yalta, 22-26 May, 1994, p.6.

1. Dorokhov Yu.L., Ivanov P.A., Skulachev M.V., Tomashevskaya O.L., Rodionova N.P., Karpova O.V. and Atabekov J.G. "A tobamovirus genome that contains an internal ribosome entry sites." Abstracts of Bayev Memorial Conference, Russia, Moscow, 20-22 May, 1996, p. 192.

8. Дорохов Ю.Л., Иванов П.А., Карпова O.B., Скулачев М.В., Родионова Н.П., Фролова О.Ю., Атабеков И.Г. "Геном нового тобамовируса содержит участок внутренней посадки рибосом." Доклады Академии Паук (1997), в печати.

9. Ivanov Р.А., Karpova O.V., Skulachev M.V., Tomashevskaya O.L., Rodionova N.P., Dorokhov Yu.L. and Atabekov J.G. "A tobamovirus genome that contains an internal ribosome entry site functional in vitro." Virology (1997), in press.

Информация о работе

Иванов, Петр Алексеевич
кандидата биологических наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.06

Автореферат

Похожие работы