Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение особенностей первичной структуры генома вакцинного штамма вируса табачной мозаики V-69

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Снегирева, Полина Борисовна, Москва

/ М/У 9 / О // /

/ к/ ^1'

У.

4^-7

С-У / У

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБШЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И.ВАВИЛОВА

на правах рукописи УДК 577.113.5:578.865.1

СНЕГИРЕВА Полина Борисовна

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ВАКЦИННОГО ШТАММА ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ У-69

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.00.15 - Генетика

Научный руководитель: кандидат биологических наук, Шиян А.Н.

^ Москва 1999 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

1. ВВЕДЕНИЕ................................................................................................5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................7

2.1. Организация генома ВТМ................................................................7

2.1.1. Геном ВТМ содержит три открытые рамки считывания........................7

2.1.2. Структура концевых некодирующих участков генома...........................8

2.1.3. Субгеномные мРНК....................................................................14

2.1.4. Сборка вирусных частиц......................... .....................................16

2.2. Репликация и синтез вирусных белков...............................................17

2.3. Ближний транспорт ВТМ...............................................................23

2.3.1. Плазмодесмы в системе межклеточного транспорта растения...............23

2.3.2. Вирусы растений кодируют специальные транспортные белки..............26

2.3.3. Транспортный белок ВТМ............................................................29

2.3.4. Механизм межклеточного транспорта ВТМ......................................35

2.4. Дальний транспорт ВТМ...............................................................37

2.5. Перекрестная защита растений.........................................................41

2.5.1. Феномен перекрестной защиты и успехи ее практического использования..................................................................................41

2.5.2. Механизм перекрестной защиты....................................................47

2.5.3. Молекулярные основы аттенуации вакцинных штаммов.....................51

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.....................................................................55

3.1. Материалы.................................................................................55

3.1.1. Растительный материал...............................................................55

3.1.2. Бактериальные штаммы...............................................................55

3.1.3. Плазмидные векторы..................................................................55

3.1.4. Олигонуклеотидные праймеры......................................................55

3.1.5. Ферментные препараты................................................................55

3.1.6. Реактивы и расходные материалы...................................................57

3.1.7. Среды......................................................................................57

3.1.8. Фотоматериалы.........................................................................58

3.2. Методы......................................................................................59

3.2.1. Получение препарата РНК ВТМ У-69..............................................59

3.2.1.1. Получение и осветление экстракта................................................59

3.2.1.2. Дробное высаливание вирусных частиц........................................59

3.2.1.3. Дальнейшая очистка препарата вирусных частиц.............................60

3.2.1.4. Выделение геномной РНК BTM V-69...........................................61

3.2.2. Синтез кДНК генома BTM V-69.....................................................62

3.2.2.1. Получение набора случайных фрагментов кДНК генома BTM V-69.....62

3.2.2.2. Направленный синтез перекрывающихся фрагментов кДНК

с пар специфических праймеров........................ .....................................64

3.2.3. Встраивание кДНК в вектор..........................................................64

3.2.4. Трансформация бактериальных клеток рекомбинантными плазмидами......................................................................................65

3.2.5. Выделение плазмидной ДНК.........................................................66

3.2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)...............................................67

3.2.7. Реакции секвенирования..............................................................68

3.2.7.1. Секвенирование по Максаму и Гилберту.......................................68

3.2.7.2. Секвенирование по Сэнгеру.......................................................71

3.2.8. Электрофоретическое разделение продуктов реакций секвенирования

в полиакриламидном геле (ПААГ).........................................................71

3.2.8.1. Приготовление секвенирующего геля............................................71

3.2.8.2. Проведение электрофореза.........................................................73

3.2.8.3. Обработка геля после электрофореза............................................73

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.......................................................................................74

4.1. Клонирование генома BTM V-69......................................................74

4.1.1. Клонотека случайных фрагментов кДНК генома BTM V-69.................74

4.1.2. Клонотека перекрывающихся фрагментов кДНК генома BTM V-69.......78

4.2. Нуклеотидная последовательность геномной РНК вакцинного штамма V-69 вируса табачной мозаики..............................................................83

5. ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................................94

6. ВЫВОДЫ...........................................................................................108

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................110

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВТМ - вирус табачной мозаики ВОМ - вирус огуречной мозаики ДТ - десмотубула

ЗФБ - зеленый флуоресцентный белок (jellyfish green fluorescent protein)

ПД - плазмодесма

ТБ - транспортный белок

ЭР - эндоплазматический ретикулум

ТРГТС - тРНК-подобная структура

оц-кДНК - одноцепочечная кДНК

дц-кДНК - двухцепочечная кДНК

п.н. - пара нуклеотидов

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПААГ - полиакриламидный гель

ДСН -додецилсульфат натрия

ДТТ - дитиотрейтол

ИПТГ - изопропил-Р-Б-тиогалактозид

ТЕМЕД - М,К,К',М'-тетраметилэтилендиамин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

X-gal - 5-бромо-4-хлор-3-индолил-Р-Б-галактозид

1. ВВЕДЕНИЕ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Вирусы растений вызывают многочисленные заболевания практически всех экономически важных культур, значительно снижая их урожайность и товарные характеристики (Matthews, 1991). Ежегодные потери от вирусных инфекций оцениваются в несколько тысяч миллионов US$ без учета расходов на проведение защитных мероприятий (Pappu et al., 1995). Вирус табачной мозаики (ВТМ) поражает широкий круг растений-хозяев, в том числе табак, томаты и перец. В результате инфекций ВТМ теряется до 25% урожая тепличных посадок томатов.

Один из способов контроля вирусных заболеваний состоит в защитной вакцинации растений слабопатогенными вирусными изолятами, отбираемыми из природных популяций вируса или получаемыми искусственно путем мутагенеза патогенных форм. Заражение растений вакцинными штаммами делает их устойчивыми к вторичной суперинфекции родственными патогенными вирусами. Несмотря на то, что явление перекрестной защиты известно уже 70 лет (McKinney, 1929), а вакцинация давно и успешно применяется в сельскохозяйственной практике выращивания цитрусовых, томатов, папайи и кабачков (Farinelli and Malnoe, 1996), молекулярные основы ослабления или усиления патогенности вирусов, а также механизмы перекрестной защиты исследованы слабо. Глубокое изучение данных механизмов, которое впрочем, выходит за рамки представленной диссертационной работы, возможно, позволит направленно конструировать новые универсальные вакцинные штаммы, которые смогут составить конкуренцию модным сейчас вирусоустойчивым трансгенным растениям.

Объектом данной диссертационной работы являлся природный аттенуированный штамм V-69 вируса табачной мозаики, полученный ранее в нашей лаборатории и используемый для вакцинации томатов. Выбор объекта исследования определялся важными вакцинными характеристиками штамма, такими, как низкая патогенность, значительная генетическая стабильность и высокий защитный эффект, выделяющими его среди других известных вакцинных штаммов ВТМ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью данной диссертационной работы было на примере вакцинного штамма У-69 ВТМ выявить гены или участки генома, мутации в которых определяют ослабление патогенности вируса, и попытаться установить механизмы, обусловливающие явление перекрестной защиты.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать клонотеку кДНК геномной РНК вакцинного штамма У-69 ВТМ и осуществить секвенирование полученной клонотеки с целью установления первичной структуры генома ВТМ У-69.

2. Провести сравнительный анализ нуклеотидной последовательности геномной РНК штамма У-69 с последовательностями других известных (в том числе вакцинных) штаммов ВТМ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Организация генома ВТМ.

2.1.1. Геном ВТМ содержит три открытые рамки считывания.

Вирус табачной мозаики (ВТМ) относится к группе тобамовирусов, насчитывающей в настоящее время, по крайней мере, 15 вирусов (без учета количества штаммов):

1) вирус некротической желтой жилковой мозаики свеклы;

2) вирус мозаики китайской капусты;

3) тобамовирус крестоцветных;

4) вирус зеленой крапчатой мозаики огурцов;

5) вирус кольцевой пятнистости орхидеи;

6) вирус слабой крапчатости паприки;

7) вирус слабой крапчатости перца;

8) вирус мозаики подорожника;

9) вирус мозаики кроталярии;

10) вирус слабой зеленой мозаики табака;

11) вирус табачной мозаики;

12) тобамовирус ОЬ;

13) вирус мозаики томатов;

14) вирус посветления жилок турнепса;

15) вирус опунции Сэммонса (Заттопэ).

Следует отметить, что определенные неудобства вызывает встречающееся в современной литературе параллельное использование синонимичных названий тобамовирусов. Такое дублирование способно привести к искусственному удвоению состава вирусной группы, а также исказить представление о таксономической иерархии внутри группы. Этот вопрос заслуживает особого рассмотрения в связи с тем, что объектом данной работы служил штамм т.н. томатной группы ВТМ, иначе объединяемой под названием вируса мозаики томатов. Мы в настоящей работе при упоминании вирусов этой группы придерживаемся термина "томатный штамм ВТМ" по причине более частого его применения.

Вирусные частицы тобамовирусов содержат геномную однонитевую РНК (т.н.

плюс-РНК), которая служит матрицей для трансляции 5'-концевого гена (Matthews, 1991). Единственная геномная РНК вирусов этой группы содержит три гена, продукты которых обнаруживаются в инфицированных тканях растений. Последовательности генов у ряда представителей группы частично перекрываются (рис.1). Три гена кодируют четыре белка молекулярного веса 126 kDa (126К-белок), 183 kDa (183К-белок), 30 kDa (транспортный белок) и 17.5 kDa (белок оболочки) (рис.1). Коллинеарные белки 126К и 183К транслируются с общего 5'-концевого гена непосредственно с геномной РНК вируса: синтез 126К-белка завершается на внутреннем терминирующем кодоне, а 183К-белок образуется при сквозном прочтении этого терминатора (Pelham, 1978). Белки 126К и 183К необходимы для репликации вирусного генома и являются наиболее консервативными в ряду тобамовирусов (Ishikawa et al., 1986; Ohno et al., 1984). Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности выявил в пределах гена 183К дополнительную рамку считывания, продукт трансляции которой (предположительно молекулярного веса 54 kDa) однако не обнаружен (рис.4). Геномная РНК тобамовирусов фланкирована короткими 5'- и 3'-некодирующими последовательностями (рис.1).

Геномная РНК ВТМ (штамма vulgare, так же называемого штаммом U1) состоит из 6395 нуклеотидов. Границы кодирующих последовательностей генов расположены следующим образом (позиции на карте генома ВТМ): 126/183К - 69-4919 (амбер терминатор UAG для 126К в поз. 3417); 30К - 4903-5709; ген белка оболочки - 57126191. Таким образом, конец гена 126/183К перекрывается пятью кодонами с геном транспортного ЗОК-белка, который в свою очередь терминируется за два нуклеотида до начала гена белка оболочки (Goelet et al., 1982) (рис.1).

2.1.2. Структура концевых некодирующих участков генома.

Геномная РНК ВТМ - одна из наиболее эффективно транслируемых природных матриц, как in vivo, так и in vitro, что связано с наличием специфических 3'- и 5'-концевых некодирующих последовательностей. 5'-Некодирующая лидерная последовательность (т.н. Омега) расположена непосредственно перед 126/183К-геном ВТМ и состоит из 68-ми нуклеотидов (поз. 1-68) (рис.1, 2). Впервые она была идентифицирована как устойчивая к действию РНКазы Т1 структура вирусной РНК,

126К/183К

-^^-ЗОК^БО^ 3'

втмь

(6384)

71_

втм

уи^аге (6395)

68_

всзмт

(6355)

70_

взкмо

(6421)

вмк

60_

1143

сс

Л

500 264

сс

500 268

сс

498 256

158

202

15Х

204

У11

158

210

СС

<

ВСКП (6357) 69_ 495

ОЬ (6507) 68_ ¡ШИДмйИ 501

257

156

199

сс

>1Ь

11

4

1б(

26?

<

500

264

сс

К1О

176

283

сс

161

209

Рис.1. Организация геномов тобамовирусов:ВТМ - вирус табачной мозаики, ВСЗМТ - вирус слабой зеленой мозаики табака, ВСКП - вирус слабой крапчатости перца, ОЬ - тобамовирус ОЬ, ВЗКМО - вирус зеленой крапчатой мозаики огурца, ВМК -вирус мозаики кроталярии. Кодирующие области геномов представлены прямоугольниками: 126К/183К - ген репликазы; 30К - ген транспортного белка; БО -ген белка оболочки; З'-и 5'- некодирующие последовательности представлены отрезками прямой; пунктирной линией обозначены несеквенированные области геномов; размеры кодируемых белков указаны в аминокислотных остатках на соответствующих генах, длина некодирующих участков указана в нуклеотидах; сс -сайт начала сборки вируса; 1а, 1Ь, 2 - классификация тобамовирусов по расположению сайта начала сборки (С изменениями из 1кес1а et а1., 1993).

втм -► -► -►

, m7GpppGUAUUUUUACAACAAUUACCAACAACAACAAACAACAAACAACAUUACAAUUACUAUUUACAAUUACAAUG

ВТМ L m7GpppGUAUUUUUACAACAAUUACCAACAACAACAACAAACAACAACAACAUUACAUUUUACAUUCUACAACUACAAUG

ВТМ m7GpppGUA(lJUIJU)ACAACAAUUACCAACAACAACAACAAACAACAA dahlemense

ВСКП m7GpppGUAAAUUUUUCACAAUUUAACAACAACAACACAAACAACAAACAACAUUACAAACAAAAUACAACUACAAUG

B3KMO m7GpppGU(JUUAAUlJUUUAUAAlJUAAACAAACAACAACAACAACAACAAACAAUUUUAAAACAACAAUG

BC3MT m7GpppGAUGUUUUAAUAGUUUUCGACAACAACAAUUAAAACAAAAACAACAUAUUACAAACAACAAACAACAACAAUG

Рис.2. Структура 5'-лидерных (Омега) последовательностей тобамовирусов: ВТМ - вируса табачной мозаики (штаммы: vulgare, L и dahlemense); ВСКП - вируса слабой крапчатости перца, ВЗКМО - вируса зеленой крапчатой мозаики огурца; ВСЗМТ - вируса слабой зеленой мозаики табака. Каждый лидер начинается с гуанозина, несущего кэп-структуру, и заканчивается на стартовом кодонеА1Ю (выделен) для 126/183К-белков. Стрелками указаны прямые восьминуклеотидные повторы, (САА)п-область подчеркнута прямой линией (Из Gallie and Walbot, 1992).

о

четко выявляемая электрофорезом (Matthews, 1991). Первый и единственный гуанозин в составе Омеги (поз. 1) кэпирован (имеет структуру m7GpppG). В первичных структурах 5'-лидеров тобамовирусов выявлены два элемента, определяющие их влияние на эффективность трансляции матрицы: последовательность (САА)п (п=7-10) и прямой повтор ACAAUUAC (рис.2). В геноме ВТМ vulgare две копии повтора фланкируют (САА)п-область справа (поз. 47-54 и 60-67) и одна копия - слева (поз. 1219) (рис.2). Наличие восьминуклеотидных повторов и, в особенности (САА)-мотива, необходимо для функционирования энхансера, но относительное расположение и удаленность друг от друга структурных элементов Омеги не имеют существенного значения (Gallie and Walbot, 1992). Основная роль 5'-лидера заключается в формировании инициирующего дисомного комплекса с рибосомами: одна из рибосом связывается со стартовым AUG-кодоном 126/183К-гена (поз. 69-71), вторая - с AUU-кодоном (поз. 14-16) ближе к 5'-концу геномной РНК вируса. Недавно обнаружен хозяйский белок р102 необходимый для трансляции в клетках растений и специфически связывающийся с (САА)-областью Омеги, а также с З'-некодирующей последовательностью генома ВТМ (Tanguay and Gallie, 1996). В связи с этим полагают, что структурные элементы 5'-лидера вовлечены в специфическое связывание белковых факторов инициации белкового синтеза (Gallie and Walbot, 1992). В составе химерных конструкций Омега усиливает трансляцию как прокариотических так и эукариотических генов in vivo (Gallie et al., 1989; 1991; Gallie and Walbot, 1990) и in vitro (Gallie et al., 1987a, b). Степень повышения экспрессии сильно зависит от источника и концентрации рибосом (Gallie et al., 1988), а также организма-реципиента: она максимальна в клетках двудольных растений (Gallie et al., 1989), умеренна в ооцитах Xenopus laevis (Gallie et al., 1987b), культуре клеток млекопитающих (Gallie et al, 1991) и однодольных растений (Gallie et al., 1989), и не детектируется в дрожжевых клетках (Everett and Gallie, 1992). Влияние лидерной последовательности на стабильность транслируемой матрицы не установлено (Gallie et al., 1989;1991). Получены данные, указывающие на необходимость Омеги для эффективной репликации генома ВТМ (Takamatsu et al., 1991; Watanabe et al., 1996).

Геномные РНК многих вирусов растений на своих 3'-концах содержат аминоацилированные нетранслируемые участки, которые посредством водородных

связей формируют вторичные структуры сходные с L-конформацией тРНК, т.н. тРНК-подобные структуры (ТРПС). Секвенирование этих структур показало, что их тРНК-подобные участки имеют лишь незначительную гомологию с тРНК, лишены модифицированных нуклеотидов и не укладываются в классическую для тРНК модель "клеверного листа". ТРПС узнаются некоторыми тРНК-специфическими ферментами, такими как аминоацил-тРНК-синтетазы, пептидилгидролаза, тРНК-метилтрансфераза, РНКаза Р и нуклеотидилтрансфераза (Metthews, 1991; Haenni and Chapeville, 1997).

З'-Некодирующая последовательность геномной РНК ВТМ (поз. 6192-6395) начинается сразу за геном белка оболочки, состоит из 204-х нуклеотидов и аминоацилирована как правило гистидином (Goelet et al., 1982) (рис.1). Во вторичной структуре З'-некодирующей последовательности ВТМ выявлены два домена: псевдокнотный (поз. 6229-6300) (van Belkum et al., 1985) и тРНК-подобный (поз. 63016395) (Joshi et al., 1985) (рис.3). Последовательность псевдокнотного домена (72 нуклеотида) организована в три псевдокнота, образуемых путем спаривания оснований, принадлежащих петле шпилечной структуры, с основаниями, находящимися в однонитевой области РНК (рис.3).

З'-Некодирующий участок генома ВТМ имеет важное функциональ�