Изучение генетического полиморфизма аттенуированных и патогенных штаммов тобамовирусов

Славохотова, Анна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение генетического полиморфизма аттенуированных и патогенных штаммов тобамовирусов
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетического полиморфизма аттенуированных и патогенных штаммов тобамовирусов"

На правок рукописи

СЛАВОХОТОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА АТТЕНУИРОВАННЫХ И ПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ ТОБАМОВИРУСОВ

03.00.15-генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□03460540

МОСКВА-2009

003460540

Работа выполнена в лаборатории генетики растений Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Научный руководитель

кандидат биологических наук Александр Николаевич Шиян

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Ирина Васильевна Голденкова-Павлова

кандидат сельскохозяйственных наук Карина Алексеевна Можаева

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет - Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева

на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина 3. Факс: (499)132-12-89, электронная почта: iogen@vigg.ru, Интернет: www.vigg.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н. И. Вавилова

часов

РАН.

Автореферат разослан "

2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Татьяна Аркадьевна Синельщикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Практически все растительные вирусы являются патогенными и вызывают различные заболевания сельскохозяйственных культур. На сегодняшний день существует несколько способов защиты от фитовирусов. К традиционным и наиболее надежным относятся методы селекции, благодаря которым возможно создание сортов или гибридов с генами, детерминирующими устойчивость к вирусным заболеваниям. Сравнительно новыми являются биотехнологические методы, при использовании которых можно либо каждый раз получать оздоровленный посадочный материал, либо создавать линии трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции. Однако, для применения перечисленных методов по созданию невосприимчивых гибридов необходимо наличие доноров с генами устойчивости. Альтернативным способом может быть применение ослабленных (аттенуированных) штаммов, которые заражают растение, но не вызывают внешних симптомов инфекции и способствуют развитию защитного ответа к близкородственным патогенным штаммам. Селекция аттенуированных штаммов позволяет выбрать лучший изолят, обладающий максимальной генетической стабильностью и наибольшей способностью к перекрестной защите. Такой штамм называется вакцинным, а обработка им растений на ранних этапах развития обозначается как вакцинация. В результате, в случае заражения сильно патогенным штаммом вируса, значительно уменьшается число больных растений, или же ослабляются симптомы заболевания, что приводит к снижению потерь урожая.

Наличие арсенала молекулярно-биологических методов значительно облегчает установление генетической природы атгенуации. Для этого определяют, а затем сравнивают первичные структуры вирусных геномов родственных патогенных и аттенуированных штаммов. Анализ полученных результатов позволяет выявить мутации и определить, в каком из генов вируса возникли изменения, приводящие к ослаблению симптомов. Эти данные важны для целенаправленных генно-инженерных работ по дальнейшему улучшению имеющихся вакцинных штаммов и созданию новых ослабленных штаммов на основании геномов патогенных изолятов без применения традиционной селекции.

тобамовирусов: томатные штаммы вируса табачной мозаики (ВТМ) или, как принято называть сегодня, вируса мозаики томатов (ВМТо), а также изоляты вируса зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО). Помимо выявления и описания особенностей огуречных штаммов тобамовирусов, выделенных в России, мы также исследовали их эволюционные связи с другими тобамовирусами и степень родства с известными штаммами ВЗКМО.

Однако, главным в работе являлось определение генетической природы аттенуации штаммов, а также установление общих закономерностей аттенуации путем сравнения первичных структур геномов ослабленных и патогенных штаммов, изученных нами и имеющихся в базе данных СепВапк.

Цели и задачи исследования. Основная цель данной работы — определить генетическую природу аттенуации, т.е. выявить потенциально значимые мутации, отличающие патогенные и аттенуированные штаммы. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определить полные первичные структуры геномов вакцинного штамма ВИРОГ-43М и патогенных изолятов МС-1, МС-2, поражающих огурцы.

2. Установить возможные эволюционные связи исследуемых нами штаммов с другими тобамовирусами.

3. Сравнить динамику размножения вакцинного штамма ВИРОГ-43М и патогенных штаммов МС-1, МС-2.

4. Установить полные нуклеотидные последовательности геномов аттенуированного штамма № 51 и патогенного штамма № 20 вируса мозаики томатов.

5. Выяснить динамику размножения вакцинного штамма У-69, аттенуированного штамма № 51 и двух патогенных изолятов № 20 и 111 вируса мозаики томатов.

6. На основании полученных результатов и данных по другим аттенуированным и патогенным штаммам выявить критичную для аттенуации область генома тобамовирусов.

Научная новизна и практическая значимость. Несмотря на высокую частоту встречаемости вирусных инфекций огурцов в тепличных хозяйствах России и значительные потери урожайности (до 40%), биологические особенности различных патогенных изолятов, их первичные структуры и видовые принадлежности не были изучены. Нами впервые были определены нуклеотидные последовательности геномов патогенных штаммов МС-1 и МС-2, а также изучена динамика их накопления в растениях огурца. Была подтверждена принадлежность этих штаммов к ВЗКМО, определены

эволюционные связи исследуемых изолятов с другими представителями тобамовирусов и описаны особенности данных штаммов в сравнении со штаммами ВЗКМО, изученными в других странах мира.

Поскольку у растений сем. Тыквенные не найдено генов устойчивости к ВЗКМО, большой интерес представляет разработка эффективных способов борьбы с данным вирусом. Для этого в нашей лаборатории был получен вакцинный штамм ВЗКМО ВИРОГ-43М, который был запатентован и с успехом прошел производственные испытания. Нами была определена первичная структура вакцинного штамма ВИРОГ-43М и особенности его размножения в растениях огурца по сравнению с патогенными изолятами МС-1 и МС-2. Стоит отметить, что, кроме ИОГен РАН, вакцинный штамм ВЗКМО был получек в Японии, где он применяется для защиты арбузов от патогенных штаммов (Motoyoshi et al., 1988), однако, информация о первичной структуре этого штамма и особенностях его размножения в растении-хозяине отсутствует.

Для большей представительности данных о генетических различиях патогенных и аттенуированных тобамовирусов, кроме штаммов ВЗКМО, в данной работе изучались патогенные и аггенуированные штаммы другого представителя рода тобамовирусов, вируса мозаики томатов (ВМТо). Нами была определена пуклеотидная последовательность генома аттенуированного штамма № 51, обладающего по сравнению с изученным ранее (Снегирева с соавторами, 2005) вакцинным штаммом V-69 меньшей способностью к перекрестной защите. Также была определена первичная структура патогенного штамма ВМТо № 20, вызывающего, кроме характерной мозаики, потерю апикального доминирования у растений табака. Для всех четырех штаммов были выяснены особенности размножения в растениях-хозяевах. Наконец, на основании результатов данной работы и сведений о первичных структурах ослабленных изолятов, полученных в различных странах мира, показана общая закономерность аттенуации штаммов тобамовирусов.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта-Гурзуф, 2006), «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Украина, Алушта, 2006), FEBS Advanced Lecture Courses on System Biology: "From Molccules to Life" (Austria, Gösau, 2007), Third European Congress of Virology (Germany, Nuernberg, 2007), ESF Research Conference on Antiviral Applications of RNA Interference (Spain, Sant Feliu de Guixols, 2008), Второй Всероссийской конференции

«Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам», (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на /&S страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего fS6 источников, и приложений. Работа содержит 12 таблиц и 17 рисунков.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

В работе использовались патогенные штаммы ВЗКМО МС-1, МС-2 и вакцинный штамм ВИРОГ-43М, размножающиеся на растениях огурца. Кроме того, исследовались патогенные штаммы ВМТо R1, № 20, аттенуированный штамм №51 и вакцинный штамм V-69, поражающие табаки и томаты. Для выделения штаммов использовался метод заражения соответствующих растений-хозяев вирусными частицами с карборундом. Экстракты вирусных частиц получали с помощью стандартной методики (Атабеков, 1981) с некоторыми модификациями, после чего проводили дробное высаливание вирусных частиц сульфатом аммония и двухкратное переосаждение полиэтиленгликолем 6000.

Первичные структуры штаммов ВЗКМО и ВМТо устанавливали с помощью метода "праймер-опосредованной прогулки по геному". Секвенирование проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http://www.genome-centre.narod.ru/). Для этого очищали вирусные частицы, из которых выделяли вирусную РНК методом сорбции РНК на окиси кремния в растворе гуанидин тиоцианата (Гусев, 1997). Затем ставили реакцию обратной транскрипции со случайными гексамерными праймерами с помощью набора RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit (фирма «Fermentas») по прилагаемому протоколу. Вторую цепь синтезировали со специфических праймеров, и амплифицировали нужный фрагмент с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полученный ПЦР-фрагмент выделяли из геля с помощью набора Diatom DNA elution (ООО «Лаборатория ИзоГен») по прилагаемому протоколу или использовали методику с гуанидин тиоцианатом (Грибанов и др., 1996). После очистки ПЦР-

фрагмента определяли его качество и концентрацию электрофорезом в агарозном геле и использовали аликвоту для секвенирования.

При определении динамики накопления штаммов ВЗКМО и ВМТо в растениях-хозяевах использовали метод твердофазного гетерогенного иммупоферментного анализа (ИФА) Для проведения ИФА выращивали растения табака Samsun и огурца в климокамере 'Fisons Fitotron' с фотопериодом 16 ч (день) и 8 ч (ночь) при температуре +24°С. При достижении фазы трех листьев два первых настоящих нижних листа 10 растений огурца и 10 растений табака заражали 100 мкл очищенных вирусных частиц штаммов ВЗКМО или ВМТо, содержащих 1 мкг геномной РНК. На третий день после инокуляции выбирали 6 одинаково развитых растений огурца и 7 растений табака, у которых с верхних нсзараженных листьев брали дисковые высечки (диаметр 0,7 см). Такие же высечки с тех же листьев выделяли на седьмой, десятый и четырнадцатый день после заражения и использовали затем для ИФА. ИФА проводили с помощью наборов ИммуноФА-ВТМ-ПХ фирмы «Иммунотех» и Adgen Identikit CGMMV фирмы «Adgen» по прилагаемым протоколам.

Результаты я обсуждение Определение первичных структур геномов штаммов МС-1, МС-2, ВИРОГ-43М

В результате определения полных первичных структур вирусных РНК вакцинного ВИРОГ-43М и двух патогенных штаммов МС-1 и МС-2 было установлено, что все геномы содержат 6422 иуклеотида (и.) и имеют, как и все тобамовирусы, четыре открытые рамки считывания (ОРС). Первая и вторая совмещённые ОРС кодируют 129 к Да (К) короткую репликазу (позиции с 60-го по 3396-й н.) и 186К длинную репликазу (позиции с 60-го по 5006-й н.), причем 186К синтезируется только в результате супрессии стоп-кодона в положении 3692 (см. рис.1). Третья рамка кодирует транспортный белок (позиции с 4993-го по 5787-й н.), а четвертая - капсидный белок, или, как исторически принято его называть, белок оболочки (позиции с 5762-го по 6248-й н.). 5'-нетраислируемая область (5-НТО; позиции с 1-го по 59-й н.) и З'-НТО (позиции с 6248-го по 6422-й н.) состоят из 59 и 175 н., соответственно.

Нами установлено, что штаммы МС-1, МС-2 и ВИРОГ-43М имеют идентичные нуклеотидные последовательности 5'- и З'-НТО и генов белков оболочки. Сходство по генам транспортных белков, коротких и длинных репликаз составляет 99,9%, 99,8% и 99,8%, соответственно. Ввиду такой

Рвдшзэ (123486 #)

S?62 1

6249

№1

11 WET 1 ГЕЛ Н>1 ГО" | I | "ю 1

аминокислоты 1 41 453 858 1112 1135 1640 ТЕ

и}тл«пда

1 И 1И

Ш9

2ВУ

33SÍ SS45

и 1

4993

264

5787

8«2

Рис. 1. Структура геномов штаммов ВИРОГ-43М, МС-1, МС-2.

Прямоугольниками показаны кодирующие области генома: ТБ - транспортный белок, БО - белок оболочки, короткая репликаза (129К) и длинная репликаза (186К). Короткая репликаза содержит метилтрансферазный (МЕТ) и геликазный (TEJI) домены. Длинная репликаза, синтезирующаяся в результате супрессии UAG-кодона (пунктирная стрелка), содержит также полимеразный (ПОЛ) домен. 5'- и З'-НТО обозначены прямыми линиями.

высокой гомологии последующие анализы (определение круга растений-хозяев, сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей с таковыми у тобамовирусов и штаммов ВЗКМО, филогенетический анализ) проводились только для патогенного штамма МС-1.

Определение круга растений-хозяев штамма МС-1

Одной из важных характеристик вирусов является круг его хозяев. Поскольку полученные ранее в лаборатории генетики растений ИОГен РАН штаммы вирусов, поражающих огурцы, подробно не изучались, необходимо было определить, поражают ли они растения-тестеры, характерные для ВЗКМО, а также других представителей сем. Тыквенные. Для этого заражали очищенными препаратами вирусных частиц растения-тестеры: лебеду ('Chenopodium amaranticolor) и дурман (Datura stramonium), а также представителей сем. Тыквенные: кабачок (Cucurbita pepo var. giraumons), дыню (Cucumis melo) и огурец (Cucumis sativum) в качестве положительного контроля.

Было установлено, что штамм МС-1, подобно типичным представителям ВЗКМО, не вызывает внешних симптомов у дурмана, но приводит к появлению мелких локальных некрозов на инокулированных штаммом листьях лебеды. У кабачка и дыни патогенный штамм вызывал системную инфекцию, проявлявшуюся в виде симптомов, сходных с симптомами на растениях огурца (зеленую мозаику, крапчатость, иногда деформацию листьев). Заражение растений штаммом МС-1 было подтверждено с помощью обратной транскрипции препарата РНК из зараженных растений и последующей ПЦР с соответствующих праймеров. Электрофорез ПЦР проб в 1% агарозном геле представлен на рис. 2.

Первая дорожка - маркер молекулярного веса - lkb DNA Ladder ("Fermenias"); 2-5 дорожки - ПЦР пробы, полученные на препаратах РНК из зараженных вирусом МС-1 растений огурца, дыни, кабачка, лебеда и дурмана,

соответственно.

ПЦР-фрагмент, синтезированный с праймеров 4771+ и 4-, имеет длину 474 н.

Рис. 2. Результаты ОТ-ЛЦР анализа круга растений-хозяев для штаммов МС-1, МС-2.

Сравнение иуклеотидных и аминокислотных' последовательностей геномов и белков штамма МС-1 и других представителей тобамовирусов

В настоящее время представляется очевидным, что при обнаружении нового штамма вируса, даже если он вызывает характерные симптомы и имеет соответствующий круг хозяев, однозначно и исчерпывающе установить его видовую принадлежность позволяют только данные сравнительного анализа первичных структур генома и аминокислотных последовательностей его белков. Парные сравнения иуклеотидных последовательностей геномов и выведенных из них аминокислотных последовательностей четырех белков штамма МС-1 и представителей тобамовирусов были проведены с помощью компьютерной программы AiiBee - Multiple Alignment (сайт в Интернете http://www.genebee.msu.su /services/ malign_full.html).

В результате анализов установлено, что штамм МС-1, как и остальные два изучаемых штамма (МС-2, ВИРОГ-43М), является типичным изолятом ВЗКМО, поскольку, гомология МС-1 с представителем ВЗКМО штаммом SH по аминокислотному составу превышает 98% (показатели выделены жирным в таблице 1). Следует отметить, что если различие аминокислотных последовательностей белков штаммов менее 10%, то это штаммы одного вида. С другими тобамовирусами, поражающими растения сем. Тыквенные гомология значительно ниже и не превышает 64,93% по нуклеотидному составу (с длинной репликазой вируса зеленой крапчатой мозаики цуккини, ZGMMV) и 75,9% по аминокислотному составу (с длинными репликазами ZGMMV и кьюри вируса зеленой крапчатой мозаики огурца, KGMMV). Максимальное подобие с вирусами, поражающими растения других семейств, составляет

ю-

§ä ф

га

S о

го

Ч <у

ю ф

500 п.н."

i -щш

Таблица 1.

Парные сравнения нуклеотидных последовательностей геномов и аминокислотных последовательностей белков штамма МС-1 и других представителен тобамовирусов

Процент идентичных нуклеотидов и аминокислот

Короткая репликаэа Длинная репликаза ТБ БО

Название вируса 5'- нто н. ак. н. ак. н. ак. н. ак. 3'- нто

ССММУ-БН 96,1 85 99,2 85,7 99,1 91,3 98,5 89, 6 99,4 91, 9

гаму 46,9 49, 4 71,9 64, 93 75, 9 50, 5 73,1 47, 9 63,4 31, 6

К6ММУ 48,2 50,8 72 53,6 75,9 51,4 72,9 40, 4 64,6 51,9

СГММУ 48,3 52,4 71,5 55 75 52 75,2 40, 9 64,8 43,8

СЖЭУ 55,9 42,2 50, 6 43, 9 55,8 37,7 38, 9 40,9 53,4 21,4

УоМУ 61,3 41, 8 52,3 44,2 57,7 40,8 44,1 39,8 55,3 41,2

ЭНМУ 41,9 41,1 52, 9 - 56,4 - 42,7 - 60,7 -

гаге - - - - - 39,9 48, 9 38,4 54 -

ИМУ 59,3 42,2 52, 9 44,5 57,8 39,4 42,3 40,1 54,7 43, 4

ТОМУ 63,9 41,7 53, 7 44,2 59 36,7 45,8 40,2 50, 9 42,3

ТУСУ 58,2 41,8 52, 9 43, 9 58,3 36,7 42,4 41,2 54 40,3

ТМСМУ 56 42, 6 54 44, 5 58,2 37,7 49,8 43, 4 49,7 43,2

РаММУ 64,3 43,3 53, 6 44, 9 59 36,3 46,1 40, 9 48,5 38, 6

РММоУ 63 41,4 54,1 43,7 59,3 39,8 46,4 42,2 51, 6 50,1

ТМУ 56 42 53,1 43, 6 58,6 37,1 43,3 41,8 54,7 51,2

НЬБУ 51, 6 43,2 56,3 45, 9 61,3 36 44 40, 4 61,3 26, 6

ОЬРУ 62,4 42,2 55 43, 6 59 37,1 46,8 41,2 48,5 40,3

Примечания: в столбцах сокращением ак обозначен процент идентичных аминокислот с консервативными заменами; н. - процент идентичных нуклеотидов. Графы отмечены прочерком, в случае отсутствия данных о первичных структурах и аминокислотных последовательностях штаммов.

Сокращения: ТБ - транспортный белок; БО - белок оболочки; НТО -нетранслируемая область; СОММУ - вирус зеленой крапчатой мозаики огурца; 20ММУ - вирус зеленой крапчатой мозаики цуккини; КОММУ - кыори вирус зеленой крапчатой мозаики огурца; СРММУ - вирус крапчатой мозаики плодов огурца; ОЯБУ - вирус кольцевой пятнистости орхидеи; УоМУ - вирус мозаики китайской капусты; БНМУ - вирус мозаики кроталярии; РгМУ - вирус мозаики плюмерии; ЯМУ - вирус мозаики подорожника; ТоМУ - вирус мозаики томатов; ТУСУ - вирус посветления жилок турнепса; ТМСМУ - вирус слабой зеленой мозаики табака; РаММУ - вирус слабой крапчатости паприки; РММоУ - вирус слабой крапчатости перца; ТМУ - вирус табачной мозаики; НЬ8У -латентный вирус гибискуса; ОЬРУ - обуда вирус перца.

64,3% по нуклеотидному составу (с последовательностью 5-НТО вируса слабой крапчатости паприки) и 61,3% по аминокислотному составу (с последовательностью длинной репликазы латентного вируса гибискуса).

Множественные выравнивания н филогенетический анализ аминокислотных к нуклеотндных последовательностей белков штамма МС-1 и тобамовнрусов Чтобы установить эволюционные связи штамма МС-1 с другими тобамовирусами, были проведены множественные выравнивания аминокислотных и нуклеотидных последовательностей вирусов, а также филогенетические анализы. Для множественных выравниваний использовали компьютерную программу AliBee - Multiple Alignment. Филогенетические деревья строились с помощью статистического метода ближайшего соседа (от английского neighbor-joining), основанного на принципе матриц расстояний. Статистическая надежность узлов построенного дерева оценивалась критерием бутстрэп, имеющим не менее 1000 повторений.

Филогенетический анализ первичных структур геномов и аминокислотных последовательностей белков подтвердил, что штамм МС-1 является типичным

"С С

ИС-1

CBIHV

ZGKHV

KGHHV

■опт

ORSV

ioltV

RKV

r.'CV

ТоНУ

THV

f'tiriov

FaHttV

OLrV

■THGHV

■ SHHV

• HLSV

Рис. 3. Филогенетическое множественного выравнивания коротких реплнказ тобамовнрусов и штамма МС-1.

0,4: . 0.5 . 0.6 ' С.?

дерево, построенное на основании аминокислотных последовательностей

штаммом ВЗКМО, т.к. во всех деревьях он входит в одну подгруппу с представителем ВЗКМО, штаммом SH (см. рис. 3). Следует отметить, что существенных различий между деревьями, построенными на основании нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, не наблюдалось. Особенно четко распределение тобамовирусов на группы показывает филогенетическое дерево, построенное на основании аминокислотных последовательностей коротких репликаз (см. рис. 3).

Ранее было показано, что все тобамовирусы кластеризуются в группы в зависимости от таксономической принадлежности растений-хозяев (Gibbs, 1999). В результате проведенного нами филогенетического анализа также было подтверждено, что из всех тобамовирусов выделяется группа вирусов растений сем. Тыквенные, включающая в себя ВЗКМО (CGMMV), ZGMMV, KGMMV и CFMMV (сокращения вирусов приведены в примечаниях к таблице 1). Интересно, что вирусы KGMMV и CFMMV, паразитирующие, как и ВЗКМО, на огурце, выделяются в отдельную подгруппу, а сам ВЗКМО не входит в подгруппу ни с одним из других вирусов тыквенных. Кроме вирусов тыквенных выделяется группа вирусов сем. Пасленовые, включающая TMV, ToMV, PMMoV, PaMMV, ObPV и TMGMV. Еще одна группа состоит из вирусов растений сем. Крестоцветные и Подорожниковые: YoMV, TVCV, RMV. Последняя группа, не имеет постоянного состава, а ее представители (SHMV, HLSV, ORSV) могут объединяться с описанными выше группами в зависимости от того, какая область генома была взята для филогенетического анализа.

Приведенные результаты филогенетического анализа белков оболочек и репликаз тобамовирусов позволяют предполагать, что вирусы растений сем. Тыквенные имели отличного от вирусов других семейств предка. Это предположение подтверждают также данные множественного выравнивания аминокислотных последовательностей репликаз тобамовирусов, в результате анализа которых были выделены специфичные компоненты, характерные для группы вирусов сем. Тыквенные и вирусов растений других семейств. Специфический фрагмент аминокислот коротких репликаз для трех вирусов тыквенных (CFMMV, KGMMV, ZGMMV) располагался с 628 по 666 аминокислоту (соответствует неконсервативной области между метилтрансферазным и геликазным доменами). Еще один фрагмент, характерный только для KGMMV и ZGMMV и располагался с 155 по 172 аминокислоту (метилтрансферазный домен). Примечательно, что данный участок отсутствовал у ВЗКМО, но был обнаружен у SHMV, HLSV. Для

вирусов растений, не поражающих сем. Тыквенные, был характерен другой специфичный фрагмент с 338 по 354 (область метилтрансферазного домена), отсутствовавший у вирусов первой группы.

Изучение полиморфизма нуклеотидных и аминокислотных последовательностей внутри подгруппы ВЗКМО

Хотя ВЗКМО выделяется в самостоятельную подгруппу, однако и внутри этой подгруппы существует полиморфизм. Нам представлялось интересным посмотреть, каким образом первичные структуры изолятов из России укладываются в общую картину вариабельности геномов ВЗКМО. В настоящее время описано 30 штаммов ВЗКМО, причем 23 штамма были выделены в Азии и только 7 в Европе (информация взята из базы данных Genbank, август 2008г). Необходимо отметить, что в базе данных GenBank присутствуют данные о 27 нуклеотидных последовательностях генов белка оболочки, 12 последовательностях генов транспортного белка и только 7 первичных структурах всего генома. Учитывая, что у трех исследованных нами штаммов полностью определены последовательности вирусных геномов и то, что это представители ВЗКМО, выделенные в России впервые, наши данные вносят существенный вклад в базу данных.

Для изучения полиморфизма штаммов ВЗКМО с помощью программы АНВее - Multiple Alignment были проведены парные выравнивания имеющихся в базе данных GenBank изолятов с нашим штаммом МС-1. В результате парного сравнения последовательностей было установлено, что все штаммы ВЗКМО имеют высокую гомологию кодирующих областей генома: от 78% до 97,7% по нуклсотидному составу и от 97,4% до 100% по аминокислотному.

Поскольку у большинства штаммов известна только первичная последовательность гена белка оболочки, дивергенцию внутри ВЗКМО рассматривали на основе этого гена. Оказалось, что из 27 штаммов ВЗКМО только у 8 обнаружились замены относительно консенсуса, причем наибольший показатель составляет 2 замены на 161 аминокислоту (штаммы BG, Y, GR-7). Белок оболочки нашего штамма идентичен по аминокислотной последовательности белкам оболочки греческих штаммов GR-3 и GR-5, выделенных из арбуза. Однако это не идентичные штаммы, т.к. по нуклеотидным последовательностям генов белков оболочек показатель сходства составляет порядка 96%, что соответствует 13 различиям. Для греческих штаммов и изолята МС-1 была обнаружена единственная аминокислотная замена Asp-65 —* Ser относительно консенсусной последовательности. Отметим, что выделенный и изученный ранее в нашей

лаборатории изолят ВЗКМО №3 (Одинцова Т.И. с соавторами, 2000), вызывающий выраженные желтые мозаичные симптомы у растений огурца, тоже имеет эту замену. При сравнении аминокислотных последовательностей белков оболочки штамма МС-1 и других тобамовирусов, было выяснено, что в этой позиции встречаются остатки аланина, глутаминовой кислоты, глицина.

Для большинства штаммов выявлена полная идентичность аминокислотных последовательностей белков оболочек между собой и относительно консенсуса. Эти штаммы были выделены в Корее, Индии, Китае и Японии и составляют группу восточных изолятов. Данную группу отличает от европейских изолятов одна замена аспарагина на серин в положении 65. Интересно, что штамм Fra, хоть и был получен во Франции, также входит в основную группу и имеет 100% идентичность с консенсусной последовательностью.

На основании полученных данных можно сделать вывод о существовании в настоящее время двух основных групп штаммов ВЗКМО. Первая -европейская, куда входят греческие штаммы и изучаемые нами штаммы МС-1, МС-2 и ВИРОГ-43М. Вторая группа, число изученных штаммов которой значительно превышает количество изолятов в первой группе, представлена азиатскими штаммами. Скорее всего, для группы азиатских штаммов был характерен другой, отличный от европейских штаммов, источник инфекции. Попадание штамма Fra, выделенного во Франции, в группу восточных штаммов можно объяснить тем, что этот вирус вместе с зараженными семенами тыквенных мог быть привезен из Азии.

Сравнительный анализ первичных структур вакцинного штамма ВИРОГ-43М и патогенных изолятов МС-1 и МС-2

В результате сравнения первичных структур геномов патогенного МС-1 и вакцинного штамма ВИРОГ-43М было выявлено шесть трансзиций. Две из шести трансзиций, располагающиеся в гене репликазы и в гене транспортного белка, являются молчащими. Четыре остальные мутации у вакцинного штамма ВИРОГ-43М, находящиеся в гене репликазы, приводят к аминокислотным заменам (см. рис. 4). Первая замена у вакцинного штамма ВИРОГ-43М (Gly-86—»Ser) располагается в метилтрансферазном домене репликазы, последняя (Pro-1362—» Leu) в полимеразном домене, а вторая (Ser-534 —> Phe) и третья (Рго-698 —> Leu) — в неконсервативной области между метилтрансферазным и геликазным доменами (каждый последний показатель в ряду приводимых аминокислотных замен соответствует ВИРОГ-43М).

МС-1

Репликаза (129/133 К)

Аминокислотные

МЕТ _ ГЕЛ ПОЛ 1 161

замены 4Г 88 453 534 698 858 1112 1185 1362 16407

Нуототвдм Q С С С

иугации

Аминокислотные замены

355 16SO 2152 4144 1 264

„.. Репликаза (129/186 К)

МС-2

МЕТ ГЕЛ ПОП 1 161

453 534 658 858 1112 11S5 1362 1640Г ТБ |

Нувкощдике G С Т С 1 .........1' ■

муякш 315 1690 2552 4144 1 264

ВИРОГ-43М Репликаза<123/18вК1

МЕТ ГЕЛ ПОЛ 1 161

Аминокислотные

замены ---

*Гвб453 534 £98 858 1112 1195 Ш2 1640 Нуототвдии« А Т Т Т J-

М/гадаа 315 16« 2151 41« 1 264

Рис. 4. Нуклеотидные мутации н аминокислотные замены у вакцинного штамма ВИРОГ-43М по сравнению с патогенными штаммами МС-1 н МС-2.

При сравнении нуклеотидных последовательностей геномов патогенного изолята МС-2 и вакцинного штамма ВИРОГ-43М было обнаружено 9 трансзиций в гене репликазы, 6 из которых являются молчащими. Три точковые мутации, приводящие к аминокислотным заменам Gly-86 —» Ser, Ser-534 —> Phe и Pro-1362 —* Leu у штаммов МС-2 и МС-1 совпадают. Однако характерная для штамма МС-1 мутация в положении 2152 у патогенного штамма МС-2 отсутствовала, поэтому в позиции 698 репликазы штамма МС-2 присутствует лейцин, а не пролин. При визуальной оценке проявления симптомов заболевания и скорости их появления не было существенных различий между изолятами МС-1 и МС-2. Поэтому, скорее всего, замена в положении 698 у штамма МС-1 не является критичной для аттенуации.

Динамика размножения вакцинного штамма ВИРОГ-43М по сравнению с патогенными штаммами МС-1 и МС-2 в растениях огурца Поскольку вакцинный штамм ВИРОГ-43М был впервые получен в лаборатории генетики растений ИОГен РАН, и других сведений, кроме его бессимптомности и способности к защите, ранее не имелось, было важно изучить особенности динамики размножения данного штамма в растениях огурца и сравнить с динамикой накопления патогенных изолятов. Наиболее доступным способом измерения накопления вируса в зараженном растении является определение методом ИФА количества белка оболочки, основного по

массе компонента вирусной частицы. Результаты данного эксперимента приведены в виде графика на рис. 5, где количество белка оболочки в пробе представлено в виде оптической плотности окраски, получаемой в результате ИФА, и рассчитано как среднее арифметическое значение отдельных проб. Для каждой точки графика вычисляли также стандартные отклонения, которые изображены на графике в виде планок.

Как видно из графика, на третий день после заражения и патогенные, и вакцинный штаммы вируса присутствовали в верхних неинокулированных листьях растений огурца в крайне малых количествах, но их скорости размножения уже на этой стадии различались. Так, средний уровень накопления достигал для ВИРОГ-43М 0,15 o.e., для патогенного штамма МС-2 он составлял 0,278 o.e., а для штамма МС-1 — 0,576 o.e.

С третьего по седьмой день после заражения наблюдалось значительное увеличение количества белка оболочки ВЗКМО. Уже на этой стадии инфекции с помощью ИФА можно было легко отличить патогенные штаммы от вакцинного. Для вакцинного штамма средний уровень накопления составлял всего 0,231 o.e., тогда как для штамма МС-2 этот показатель достигал 0,728 o.e. Количество белка оболочки штамма МС-1, также как и на третий день после инокуляции, было максимальным и составляло 0,967 o.e., однако различия между штаммами МС-1 и МС-2 к этому времени находились в пределах погрешности.

Наибольшее увеличение количества белков оболочки вирусов наблюдалось с 7-го по 10-й день после заражения. Уровень накопления у всех штаммов к этому времени, не зависимо от патогенности, практически выходит на плато.

Интересно, что на 10-й день у растений, зараженных патогенными штаммами, можно было различить первые симптомы вирусной инфекции в виде мозаики на молодых листьях. Максимальный уровень накопления был у штамма МС-1 и составлял 2,263 o.e. Ненамного отличался этот показатель у штамма МС-2 (2,168 o.e.). Для вакцинного штамма ВИРОГ-43М уровень накопления белка оболочки не превышал 0,532 o.e.

На 14-й день наблюдалось понижение количества белка оболочки для штаммов МС-1 (2,159 o.e.) и ВИРОГ-43М (0,465 o.e.), и небольшое увеличение для штамма МС-2 (2,354 o.e.), однако эти колебания находились в пределах погрешности.

В результате проведенного эксперимента было установлено, что вакцинный штамм накапливается в 5 раз меньше, чем патогенные штаммы. Несмотря на то, что штамм МС-1 превышал по скорости размножения штамм

2,5

1,5

0,5

♦ -ВИРОГ-43М—С— МС-1

МС-2

Д.П.И.

Рис. 5. График динамики накопления штаммов ПЗКМО ВИРОГ-43М, МС-1 и МС-2 в растениях огурца.

МС-2 на протяжении 3-7 дней после инокуляции, в конечном итоге эти различия нивелируются.

Поэтому, можно полагать, что различия между патогенными штаммами МС-1 и МС-2 по аминокислотам в положении 698 белка репликазы (Рго-698 и Ьеь698), если и наблюдаются, то только на ранних этапах репликации. Необходимо отметить, что, если патогенные штаммы вызывали появление характерных симптомов заболевания уже на 10-й день эксперимента, то вакцинный штамм ВИРОГ-43М оставался бессимптомным и на 21-й день, что подтверждало данные о его высокой генетической стабильности и защитных свойствах.

Ранее было показано, что патогенный ревертант R1 отличается от вакцинного штамма V-69 всего на одну аминокислоту His-528 —> Arg, и именно она вызывает аттенуацию (Снегирева с соавт., 2005). Нами было определено, что аттенуированный изолят № 51, вызывающий меньшую способность к перекрестной защите у растений томата, отличается от вакцинного штамма V-69 по трем позициям в гене репликазы и одной - в гене белка оболочки.

Сравнительный анализ нервичных структур патогенных и аттенуироваиных штаммов ВМТо

Мутации Т-2087—» G, G-4710 -> А и А-5880 G приводили к соответствующим аминокислотным заменам: Asp-672 —> Glu в неконсервативной области между метилтрансферзным и геликазным доменами, Glu-1546 —> Lys в полимеразном домене репликазы и Thr-60 —+ Ala в белке оболочки (см. рис. 6).

У сильно патогенного штамма № 20 было выявлено 29 отличий в первичной структуре генома по сравнению с изученным ранее (Снегирева с соавторами, 2005) ревертантом R1. Из них только восемь отличий по нуклеотидам вели к аминокислотным заменам, причем семь располагались в репликазе, а одна в белке оболочки (Ser-102 —► Asn). Интересно, что в положении 1660, 1661 наблюдалась инверсия GA —» AG. В репликазе штамма №20 присутствовали две аминокислотные замены (Asp-672 —» Glu и Glu-1546 —>Lys), обнаруженные также в штамме № 51, и пять новых (Arg-530 —> Lys, Ser-797 -» Cys, Glu-979 -> Gin, Tyr-984 — His, Val-1386 Ile). В позиции 528, как и у патогенного ревертанта R1, присутствует гистидин, а не аргинин, что, как было установлено ранее (Снегирева с соавторами, 2005), является причиной отсутствия агтенуации штамма.

Для исследуемых нами штаммов ВМТо самым близким из занесенных в базу данных GenBank тобамовирусов являлся штамм ВМТо L, выделенный из

V-69 Репликаза (130/180 KDa)

мет_тел_тол_ i_161

Аминокислотной

Замены Нуклеотцаныв

мутзцмк

Аминокислотные

замены Н/хпеитидные мутации

И 1 H R D S 1 Е Y III V E î 1 Гг s I

49 297 628 530 672 797 Я06 979 984 10831115 1386 1546 G а T A 6 r G 6 1654 16S0 208? Й4еи 3006 3C2I 4233 4?!0 16161 1 ть |60 264 мм 102 G 6037

Репликаза (130/180 kDa) №51

МЕТ ГЕЛ non 1 161

I i I R R E S I £ Y Ml V К rT- s|

49 297 528 530 672 797806 979 984 10831115 1386 1546 1616 (_ ТБ (60 102

1654 leeo 20.37 2460 ЗООб 3021 G A •S2M '710 1 2б4зйо G 6007

R-1 Репгатеаза (130/130 kDa)

MET ГЕЛ ПОЛ 1 161

Аминокислотные [ I H R D S | É Y (

замены

297 i¡28 5J0 6^279; 806 6¿9 9¡¡4 10831115 13g6 1 646 1616| ТБ |gp 102

Нщаенпщныи .6И 1кс ¿зет 2460 300Í 3021 4283 47*10 1 264 siso RÍ?7 нутлцнн

Репликаза (130/180 kOai

МЕТ ГЕЛ ПОЛ 1 161

^иноислотные | | |Н К Е С | QH||g I К ||_|Т М |

замам 49 297 523 530 672 737 806 979 884 10831115 1386 1546 16181 ТЬ )б0 102

1654 1660 ZM7»SO 3&ЗЮ1 «2S1 4719 1 264 Д ^

Рис. 6. Нуклеотндные мутации и аминокислотные замены у аттенуированных и патогенных штаммов ВМТо.

■ Нукпеотидиые и/тэиии

растений томата (Ohno et al., 1984). От штамма R1 он отличался по 37 позициям первичной структуры генома и пяти аминокислотам: Glu-672 (штамм L) —> Asp (штамм Rl), Gln-979 Glu, His-984 -> Туг, Lys-1546 Glu (репликаза) и Ala-86 —» Ser (белок оболочки).

При сравнении штамма №20 с ВМТо L, выяснилось, что их отличает только три аминокислоты в репликазе и одна в белке оболочки. Т.е. эти штаммы эволюционно даже ближе друг к другу, чем R1 и №20. Штамм № 20, в отличие от вакцинного штамма V-69, аттенуированного штамма № 51 и ревертанта R1, имел в положениях 979 и 984 глутамин и гистидин, соответственно, что, как было показано ранее (Meshi, et al., 1988), не позволяет вирусу размножаться в томатах с геном устойчивости Тт-1. Остальные замены были специфичны только для штамма № 20.

Динамика размножения аттенуированных и патогенных штаммов ВМТо в растениях табака Для всех четырех штаммов ВМТо была определена скорость размножения в растениях табака. На третий день после заражения как патогенные, так и аттенуированные штаммы ВМТо присутствовали в листьях в достоверно неразличимых количествах (см. рис. 7). По-видимому, к этому моменту вирусные частицы только попадали в верхние неинокулированные листья. Средний уровень вакцинного штамма V-69 был наибольшим (0,146 o.e.), для аттенуированного штамма № 51 он составлял 0,117 o.e., а для патогенных

—«—У-65 — ~--№51 ... ; - « -№20 —*—Г*У Рис. 7. График дннамики накопления штаммов ВТМ в растениях табака.

С третьего по седьмой день наблюдалось резкое увеличение количества белка оболочки ВМТо для патогенпых штаммов и незначительное для аттенуированных. Если для аттенуированных штаммов (V-69 и №51) уровень накопления белка оболочки возрастал по сравнению с третьим днем эксперимента только на 10%, то для сильно патогенного штамма № 20 данный показатель увеличивался почти в 20 раз и составлял 1,902 o.e. Штамм R1, хотя и являлся патогенным ревертантом, накапливался к седьмому дню в 5 раз меньше (до 0,577 o.e.), чем изолят № 20.

К 10-му дню у растений, зараженных патогенным штаммом № 20, можно было различить первые симптомы вирусной инфекции в виде мозаики на молодых листьях. При этом уровень накопления белка оболочки штамма № 20 незначительно отличался от показателей на 7-й день (1,972 o.e.). Штамм R1 накапливался с меньшей скоростью, чем штамм № 20, что проявлялось в замедлении появления симптомов инфекции (наблюдались только на 12-й день), при этом количество белка оболочки соответствовало 1,239 o.e. Практически, штамм R1 всё ещё находился в экспоненциальной фазе размножения. Штаммы № 51 и V-69 не вызывали возникновение симптомов вирусной инфекции, а уровни их накопления на 10-й день составляли 0,213 и 0,196 o.e., соответственно, что слабо отличалось от уровня на 3 день после инокуляции.

Только на 14-й день уровни накопления аттенуированных штаммов заметно повышались и соответствовали 0,499 o.e. (V-69) и 0,463 o.e. (№ 51), что в 4 раза ниже уровня штамма № 20 и в 3 раза ниже, чем у штамма R1. Уровень размножения патогенного штамма № 20 к 14 дню вырос незначительно (2,133 o.e.), причем увеличение показателя по сравнению с 10-м днем находится в пределах отклонения. У штамма R1 данный показатель был значительно меньше и составлял 1,559 o.e., что примерно в 1,5 раза меньше, чем у штамма № 20.

Следует отметить, что динамика размножения штаммов ВМТо отличалась от динамики размножения штаммов ВЗКМО. Так, и у патогенных изолятов ВЗКМО МС-1, МС-2, и у вакцинного штамма ВИРОГ-43М максимальный уровень накопления в растениях огурца наблюдался на 10-й день после заражения. Динамика размножения патогенных изолятов отличалась от характера накопления вакцинного штамма исходным уровнем поступления вируса в неинокулированный лист и максимальным уровнем накопления. Для ослабленных и патогенных штаммов ВМТо уровень накопления белков оболочки на 3-й день был одинаковым. Затем размножение ослабленных

штаммов как бы растягивалось во времени, а максимальное количество белков оболочки изолятов наблюдалось на 14-й день. Фактически, с 7-го по 14-й день аттенуированные штаммы ВМТо всё ещё находились в экспоненциальной фазе роста. У сильно патогенного штамма № 20 уже на 7-й день после заражения наблюдался практически выход на плато; правда, незначительный рост продолжался до 14-го дня. Более слабый ревертант R1 отставал по уровню накопления во времени, и даже на 14-й день количество белка оболочки было в 1,5 раза ниже, чем у штамма № 20. Однако на 14-й день у штамма R1 всё ещё сохранялась значительная тенденция к росту.

Итак, существенных различий в динамике накопления белков оболочки у аттенуированных штаммов не наблюдалось. Обнаруженные нами у штамма №51 две обратные мутации (реверсии к дикому типу) в гене репликазы и одна мутация в гене белка оболочки практически не влияли на патогенность. Штамм №20 является сильно патогенным и накапливается в 1,5 больше, чем изолят R1. Репликаза изолята №20 отличается от реликазы ревертанта R1 по 7 аминокислотам. Как было упомянуто выше, две замены в геликазном домене приводят к тому, что штамм №20 не может размножаться в томатах с геном устойчивости Тт-1. Замены в положении 672 и 1546 обнаружены также и у аттенуированного штамма № 51, и, следовательно, не могут влиять на увеличение патогенности штамма. Аминокислотные замены Arg-530 —* Lys и Val-1386 —> lie консервативные, и, скорее всего, не могут являться причиной столь интенсивного размножения штамма № 20. Замена Ser-797 —» Cys, располагающаяся в области репликазы между метилтрансферазным и геликазным доменами, не относится к консервативной и, вероятно, именно эта замена могла стать причиной наиболее интенсивного накопления штамма № 20 в растениях табака.

Сравнение изучаемых аттенуированных штаммов ВМТо и ВЗКМО с другими известными ослабленными штаммами тобамовнрусов На сегодняшний день, кроме изученных в данной работе штаммов ВМТо и ВЗКМО, известны также другие аттенуированные штаммы тобамовнрусов. Это аттенуированные табачные штаммы ВТМ М (Holt et а!., 1990) и V-36 (Lewandowski and Dawson, 1993), томатные штаммы ВМТо L11A (Nishiguchi et al., 1985) и L11A-F (Yamamoto H. et al, 2002), а также штаммы, поражающие перцы — PMMoV С1421 (Hagiwara et al., 2002) и TPalSch (Ichiki T.U. et al, 2005). Причиной аттенуации для каждого штамма являются нуклеотидные мутации, расположенные в неконсервативной области между

метилтрансферазным и геликазным доменами. В этой же области находятся дополнительные замены, изменяющие степень ослабления изолятов (см. рис. 7).

У исследованного в данной работе вакцинного штамма ВЗКМО, как было отмечено выше, были выявлены аминокислотные замены, лежащие в метилтрансферазном и полимеразном доменах, а также в неконсервативной области между этими доменами. Исходя из приведенных выше данных, критичной для аттенуации, скорее всего, является неконсервативная замена Phe-534 —» Ser в НКО. а замены Gly-86 —> Ser в метилтрансферазном и Pro-1362 —* Leu в полимеразном доменах, вероятно, могли влиять на степень ослабления патогенности. Подобная ситуация, например, была показана японскими исследователями для группы штаммов вирусов ВМТо L, Lll, L11A, различающихся по степени патогенности (Nishiguchi et al, 1985, Kubota et al., 2003).

Ser

hSC-1

ВИРОГ-43М

Ser i

Pro Leu

V-69

534 His Arg

L11A

528 Cys T»r

Вирус зеленой крапчзтой нозаиш огурца

Вирус табачной мозаики томатов

Asp ±

Ser Ttir

Glu Lys

±±

U1 V-36

Ser

C1421

834 Tfir Cys

Вирус табачной мозаики

TPalích

Val Ala

Ttir Ser Cys Leu

tíf

Вирус мягкой мозаики перца

Рис. 7.

"556 6497SO

Аминокислотные

замены в белках вирусных репликаз

аттенуированных штаммов тобамовирусов.

Аналогичная ситуация просматривается и для изученных нами штаммов ВМТо. Для ревертанта вакцинного штамма V-69 изолята R1, имеющего пониженную патогенность, была выявлена единственная реверсия Arg-528 —* His в неконсервативной области между метилтрансферазным и геликазным доменами, и именно она была критичной для восстановления патогенности (Снегирева с соавторами, 2005). Однако, сравнение первичных структур геномов вакцинного штамма V-69 и его ревертанта R1 с сильно патогенным изолятом №20 и ослабленным штаммом № 51 выявляет дополнительные различия, как в неконсервативной области (Arg-530 —► Lys и Ser-797 —» Cys) и полимеразном домене (Val-1386 —* lie) репликазы, так и в белке оболочки (Thr-60 —* Ala, Ser-102 —* Asn). Следует вспомнить, что белок оболочки участвует в формировании регошкативно-транспортного комплекса ВТМ, необходимого для передвижения вируса по плазмодесмам в соседние клетки (Asurmendi S. et ai., 2004). Следовательно, замены в белке оболочки могут влиять на скорость распространения вируса по растению, что мы, возможно, наблюдаем в динамике накопления штаммов ВМТо.

Стоит отметить, что полученные другими исследователями аттенуированные штаммы тобамовирусов характеризовались различными отклонениями при размножении и распространении по растению по сравнению с исходными патогенными изолятами, но для всех ослабленных штаммов наблюдалось пониженное накопление в растениях-хозяевах (Ding et al., 1995; Watanabe et al., 1987; Hagiwara et al., 2002; Ichiki T.U. et al., 2005). Нами с помощью ИФА была определена динамика накопления аттенуированных и патогенных штаммов ВМТо и ВЗКМО. Следует упомянуть, что уровень накопления белка оболочки в значительной мере коррелирует со степенью репликации вируса. Было установлено, что аттенуированные штаммы ВЗКМО и ВМТо накапливаются приблизительно в 5 раз меньше, чем сильно патогенные штаммы изоляты. То есть, помимо бессимптомности, ослабленные штаммы характеризуются пониженным уровнем синтеза белка оболочки и, соответственно, малой скоростью накопления вируса.

Феномен аттенуации и пониженного уровня накопления ослабленных штаммов в настоящий момент объясняется исходя из функций короткой репликазы. Известно, что короткая репликаза ВТМ помимо участия в формировании регогакативного комплекса (Goregaoker S.P. and Culver J.N., 2003), является также супрессором посттранскрипционного замолкания генов (PTGS), или РНК-интерференции (Voinnet et al., 1999). Способность ряда тобамовирусов, в том числе ВТМ U1, суппрессировать PTGS была показана

еще в 1999 году (Voinnet et al., 1999). Детально этот механизм был изучен на биологически схожем вирусе мозаики томатов (Kubota et al., 2003). Как выяснилось, суппрессорная активность негативно коррелирует с мутациями в короткой репликазе, отвечающими за ослабление и бессимтомность вируса, то есть в бессимптомных штаммах суппрессор мало активен или не активен (Kubota ct al., 2003).

Механизм взаимодействия вируса с растением в ранний инфекционный период представляется следующим. Когда тобамовирус попадает в растительную клетку в ней включается механизм направленной деградации инородной двуцепочечной РНК, синтезирующейся в результате репликации вирусного генома. Вследствие этого, на протяжении всей инфекции образуются 21-25 п.н. малые интерференционные РНК (small interfering RNA, siPHK), которые поступают в комплекс, индуцирующий замолкание РНК (RNA-induced silencing complex, RISC). RISC вызывает специфическую деградацию любой однонитевой РНК в области, гомологичной siPHK. Вирус, в свою очередь, обладает защитным механизмом супрессии РНК-интерференции. Короткая репликаза тобамовирусов блокирует включение siPHK в RISC и распространение образовавшихся siPHK по растению, а, значит, и пс даст «включить» PTGS в соседних с инфицированными клетках. Короткая репликаза аттенуированного штамма тобамовируса с пониженной супрессорной активностью не успевает блокировать распространение siPHK по растению и не подавляет РНК-интерференцию. Необходимо отметить, что ослабленный штамм не утрачивает способность к ближнему и дальнему транспорту. В каждой растительной клетке, куда попадает siPIIK или ослабленный вирус, формируется механизм РНК-интерференции, направленный на расщепление РНК, имеющей высокую гомологию с исходным ослабленным вакцинным штаммом, в частности РНК родственного патогенного штамма. В результате деградации вновь поступающей вирусной РНК репликация патогенного штамма будет подавляться.

выводы

1. Показано, что исследованные нами штаммы являются типичными штаммами вируса зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО) и составляют со штаммами ВЗКМО из Греции отдельную европейскую подгруппу.

2. В результате анализа полных нуклеотидных последовательностей вирусных РНК вакцинного и двух патогенных штаммов ВЗКМО установлено, что:

• вакцинный штамм ВИРОГ-43М отличается от патогенного изолята МС-1 четырьмя нуклеотидными мутациями в гене репликазы, которые приводят к аминокислотным заменам (Gly-86 —» Ser, Ser-534 —» Phe, Leu-698 — Pro и Pro-]362 Leu);

• замена Leu-698 —» Pro в белке репликазы патогенного штамма МС-2 отсутствует и, следовательно, не является критичной для аттенуации.

3. Результаты исследования динамики накопления штаммов ВЗКМО в растениях огурца показали, что:

• вакцинный штамм ВИРОГ-43М накапливается в растениях в 5 раз меньше по сравнению с патогенными изолятами МС-1 и МС-2;

• патогенные штаммы МС-1 и МС-2 не различаются по динамике размножения в пределах погрешностей.

4. Сравнительный анализ первичных структур геномов изолятов №51 и № 20 вируса мозаики томатов (ВМТо) показал, что:

• аттенуированный штамм № 51 отличается от вакцинного штамма V-69 по трем мутациям, определяющим аминокислотные замены, две из которых располагаются в гене репликазы и одна в гене белка оболочки;

• патогенный штамм № 20 отличается от ревертанта R1 по 29 позициям в первичной структуре, из них 8 приводят к аминокислотным заменам (семь в гене репликазы и одна замена в гене белка оболочки), но у них обоих имеется одинаковая, относительно вакцинного штамма V-69 и аггенуированного штамма № 51 реверсия к дикому типу, отвечающая за развитие симптомов.

5. В результате исследования динамики накопления штаммов ВМТо в растениях табака выяснено, что:

• аттенуированный штамм ВМТо № 51 не отличается по скорости размножения от вакцинного V-69;

• штаммы № 51 и V-69 накапливаются в 4,5 раз меньше, чем патогенный штамм № 20, и в 3 раза меньше, чем ревертант R1;

• уровень накопления патогенного штамма № 20 максимальный и превышает по этому показателю штамм R1 в 1,5 раза;

• в отличие от изолятов ВЗКМО, уровень и время накопления штаммов ВМТо в растениях табака зависит от степени патогенности штаммов.

6. Анализ обнаруженных у аттенуированных и патогенных штаммов тобамовирусов различий по аминокислотным последовательностям свидетельствует, что критичной для аттенуации является неконсервативная область между метилтрансферазным и геликазным доменами короткой репликазы.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Андреева Э.Н., Слаеохотова А. А., Извекова Л. И., Елизарова Е. В., Шиян

A. Н., Блинова Г. П., Пухальский В.А. Штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца ВИРОГ-43М для вакцинации растений огурца // Патент №2320721.-2006.

2. Истомина Е.А., Слаеохотова А.А., Шиян А.Н., Андреева Э.Н., Пухальский В.А. Молекулярно-генетическая природа патогенности и апатогенности вирусов растений. Материалы XIV Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Ялта-Гурзуф, Украина. - 2006. -С. 46-48.

3. Слаеохотова А.А., Истомина Е.А., Шиян А.Н., Андреева Э.Н. Исследование первичной структуры апатогенных и патогенных штаммов и механизмов атгенуации // Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире». - Москва. - 2006. - С. 184.

4. Слаеохотова А.А., Шиян А.Н., Андреева Э.Н. Анализ гена транспортного белка изолята Московский-1 вируса зеленой крапчатой мозаики огурца // «Факторы экспериментальной эволюции организмов». Сборник научных трудов. -Киев. - Логос. - 2006. - С.133-137.

5. Slavohkotova A. A., Andreeva Е. A., Shijan А. N.. Odintsova Т. /., Pukhalskij V. A. Investigation of attenuated tobamovirus strains for development plant virus protection method // Proceedings of the Third European Congress of Virology. - Nuernberg, Germany. - 2007. - P.58

6. Slavokhotova AA., Shiyan A.N., Andreeva E.N., Pukhalskij V.A. Plant-virus system investigation for understanding attenuation mechanism and for developing new plant virus protection methods // Proceedings of the Second FEBS Advanced Lecture Courses on System Biology: "From Molecules to Life". - Gosau, Austria. - 2007. - P. 170.

7. Пухальский B.A., Одинцова Т.И., Извекова Л.И., Андреева Э.Н., Коростылева Т.В., Истомина Е.А., Слаеохотова А.А., Шиян А.Н., Козловская Г.В., Оболенкова Л.А., Бадаева Е.Д., Билинская Е.Н. Проблемам естественного и приобретенного иммунитета растений. К развитию идей Н.И. Вавилова // Информационный вестник ВОГиС. -2007.-T.il, №3/4. - С. 631-650.

8. Слаеохотова А.А., Андреева Э.Н., Шиян А.Н., Одинцова Т.И., Пухальский

B.А. Особенности генов белка оболочки российских штаммов вируса зеленой крапчатой мозаики огурца // - Генетика. - 2007.- Т. 43., №9. -

C.1-6.

9. Слаеохотова А.А., Истомина, Е.А., Шиян А.Н., Андреева Э.Н., Одинцова Т. И, Пухальский В. А. Изучение полиморфизма атгенуированных и патогенных штаммов тобамовирусов // Материалы второй Всероссийской конференции «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам». - Санкт-Петербург. - 2008. - С. 35-38.

Подписано в печать:

16.01.2009

Заказ № 1443 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Славохотова, Анна Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Род тобамовирус (tobamovirus): представители и краткая характеристика

1.1.1. Вирус зеленой крапчатой мозаики огурца.

1.1.2. Вирус табачной мозаики.

1.2. Организация геномов вируса табачной мозаики и вируса зеленой крапчатой мозаики огурца.

1.3. Хранение и передача генетической информации вируса.

1.3.1. Стабильность вирусного генома обеспечивают структуры на 5'- и 3'-концах

1.3.2. Трансляция и образование вирусных репликаз.

1.3.3. Репликация геномной РНК ВТМ.

1.3.4. Субгеномные мРНК.

1.4. Транспорт ВТМ.

1.4.1. Межклеточный транспорт вируса.

1.4.2. Сборка вирионов.

1.4.3. Дальний транспорт вируса.

1.5. Защитная система растения.

1.5.1 Сайленсинг РНК.

1.5.2. Феномен перекрестной защиты.

1.5.3. Сверхчувствительная реакция.

1.5.5. Убиквитинирование.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ.

2.2. МЕТОДЫ.

2.2.1. Выделение вирусных штаммов и зараэ/сение растений.

2.2.2.Очистка вирусных частиц и выделение вирусной РНК.

2.2.3. Синтез первой цепи кДНК с помощью обратной транскрипции и попимеразная цепная реакция.

2.2.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля или путем прямого осаждения

2.2.6. Автоматическое секвенирование.

2.2.7. Твердофазный гетерогенный иммуноферментный анализ (ИФА).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. ИЗУЧЕНИЕ ШТАММОВ ВЗКМО.

3.1.1. Определение первичных структур геномов штаммов МС-1, МС-2, ВИРОГ-43М

3.1.2. Определение круга растений-хозяев штамма МС-1.

3.1.3. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей геномов и белков штамма МС-1 и других представителей тобамовирусов.

3.1.4. Множественное выравнивание и филогенетический анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей белков штамма МС-1 и тобамовирусов.

3.1.4. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей штамма МС-1 с известными штаммами ВЗКМО.

3.1.5. Сравнительный анализ первичной структуры вакцинного штамма ВИРОГ-43Мс патогенными МС-1, МС-2.

3.1.6. Динамика размножения в растениях огурца вакцинного штамма ВИРОГ-43М по сравнению с патогенными штаммами МС-1, МС-2.

3.2. Изучение полиморфизма штаммов ВМТо.

3.2.1. Сравнительный анализ первичных структур патогенных и аттенуированных штаммов ВМТо.

3.2.2. Динамика размножения аттенуированных и патогенных штаммов ВМТо в растениях табака.

3.3. Сравнение изучаемых аттенуированных штаммов ВМТо и ВЗКМО с другими известными ослабленными штаммами тобамовирусов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение генетического полиморфизма аттенуированных и патогенных штаммов тобамовирусов"

Практически все обнаруженные растительные вирусы являются патогенными и вызывают заболевания сельскохозяйственных культур различной степени тяжести, иногда приводящие к гибели растений или полной потере урожая. На сегодняшний день существуют различные способы защиты от фитовирусов. К традиционным и наиболее надежным относятся методы селекции, благодаря которым возможно создание сортов или гибридов с генами, детерминирующими устойчивость к вирусным заболеваниям. Сравнительно новыми являются биотехнологические методы, при использовании которых можно либо каждый раз получать оздоровленный посадочный материал, либо создавать линии трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции. Однако, для применения перечисленных методов по созданию невосприимчивых гибридов необходимо наличие доноров с генами устойчивости. Альтернативным способом может быть применение ослабленных (аттенуированных) штаммов, которые заражают растение, но не вызывают внешних симптомов инфекции и способствуют развитию защитного ответа к близкородственным патогенным штаммам. Селекция аттенуированных штаммов позволяет выбрать лучший изолят, обладающий максимальной генетической стабильностью и наибольшей способностью к перекрестной защите. Такой штамм называется вакцинным, а обработка им растений на ранних этапах развития обозначается как вакцинация. В результате, в случае заражения сильно патогенным штаммом вируса, значительно уменьшается число больных растений, или же ослабляются симптомы заболевания, что приводит к снижению потерь урожая. Такой метод защиты очень прост, т. к. необходима лишь однократная обработка сеянцев вакцинным штаммом с помощью распылительных устройств, и не требует значительных материальных затрат.

Получение аттенуированных штаммов, безусловно, выгодно для защиты растений. Для создания ослабленных изолятов раньше использовали метод селекции, когда на фоне массового заражения выявляли растения без симптомов инфекции и путем многих пассажей и отбора получали стабильный аттенуированный штамм. В настоящее время с использованием арсенала молекулярно-биологических методов, возможно установить генетическую природу аттенуации. Для этого необходимо определить, а затем сравнить первичные структуры вирусных геномов родственных патогенных и аттенуированных штаммов. Анализ полученных результатов позволяет выявить мутации и определить, в каком из генов вируса возникли изменения, приводящие к ослаблению симптомов. Эти данные важны для целенаправленных генно-инженерных работ по дальнейшему улучшению имеющихся вакцинных штаммов и созданию новых ослабленных штаммов на основании геномов патогенных изолятов без применения традиционной селекции.

Лаборатория генетики растений Института общей генетики (ИОГен) им. Н.И. Вавилова РАН многие годы занималась разработкой вакцинных штаммов для защиты хозяйственно-ценных овощных культур от патогенных вирусов. Для данной работы были выбраны следующие представители рода тобамовирусов: томатные штаммы вируса табачной мозаики (ВТМ) или, как принято называть сегодня, вируса мозаики томатов (ВМТо), а также изоляты вируса зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО). Помимо выявления и описания особенностей огуречных штаммов тобамовирусов, выделенных в России, мы также исследовали их эволюционные связи с другими тобамовирусами и степень родства с известными штаммами ВЗКМО.

Однако, главным в работе являлось определение генетической природы аттенуации штаммов, а также установление общих закономерностей аттенуации путем сравнения первичных структур геномов ослабленных и патогенных штаммов изученных нами и имеющихся в базе данных GenBank.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Славохотова, Анна Александровна

3. Результаты исследования динамики накопления штаммов ВЗКМО в растениях огурца показали, что:

• патогенные штаммы МС-1 и МС-2 не различаются по динамике размножения в пределах погрешностей.

4. Сравнительный анализ первичных структур геномов изолятов №51 и-№ 20 вируса мозаики томатов (ВМТо) показал, что:

• патогенный штамм № 20 отличается от ревертанта R1 по 29 позициям в первичной структуре, из них 8 приводят к аминокислотным заменам (семь в гене репликазы и одна замена в гене белка оболочки), но у них обоих имеется одинаковая, относительно вакцинного штамма V-69 и аттенуированного штамма № 51 реверсия к дикому типу, отвечающая за развитие симптомов.

5. В результате исследования динамики накопления штаммов ВМТо в растениях табака выяснено, что:

• аттенуированный штамм ВМТо № 51 не отличается по скорости размножения от вакцинного V-69;

• штаммы № 51 и V-69 накапливаются в 4,5 раз меньше, чем патогенный штамм № 20, и в 3 раза меньше, чем ревертант R1;

• уровень накопления патогенного штамма № 20 максимальный и превышает по этому показателю штамм R1 в 1,5 раза;

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа посвящена 'изучению полиморфизма аттенуированных и патогенных штаммов тобамовирусов. В ходе работы определены полные нуклеотидные последовательности геномов патогенных изолятов ВЗКМО МС-1, МС-2. Кроме того, впервые была установлена первичная структура генома вакцинного штамма ВИРОГ-43М, имеющего особую ценность, поскольку возможно применение данного штамма на практике для защиты растений огурца от патогенных штаммов ВЗКМО. Поскольку это первая работа, изучающая особенности изолятов ВЗКМО в России, с помощью множественных выравниваний аминокислотных и нуклеотидных последовательностей, а также данных филогенетического анализа было выяснено, что исследуемые штаммы являлись типичными штаммами ВЗКМО. При сравнении, с другими известными штаммами' ВЗКМО было установлено, что самыми близкими были изоляты CGR и GR-3, GR-5, выделенные в Греции из огурца и арбуза, соответственно. Кроме того, на основании полученных данных можно сделать вывод о наличие двух групп штаммов ВЗКМО: европейской, куда входили греческие штаммы и российские штаммы, и, азиатской, которая включала остальные известные штаммы.

В результате сравнительного анализа геномов штаммов ВЗКМО у вакцинного штамма ВИРОГ-43М было выявлено четыре нуклеотидные мутации; располагавшиеся в гене репликазы и ведущие к заменам аминокислот. Благодаря эксперименту, определяющему динамику размножения изучаемых штаммов, не было выявлено различий в уровне накопления патогенных штаммов МС-1 и МС-2, что свидетельствует, что обнаруженная в штаммах МС-2 и ВИРОГ-43М замена Lei-698 —>• Pro не являлась критичной для аттенуации. Также было установлено, что вакцинный штамм ВИРОГ-43М накапливался в 5 раз меньше, чем патогенные. Наибольший скачок инфекции как у патогенных штаммов МС-1 и МС-2, так и у вакцинного ВИРОГ-43М происходит с 7-го по 10-й день.

В результате определения первичных структур новых штаммов ВМТо, было определено, что аттенуированный штамм № 51 отличался от V-69 по трем мутациям в гене репликазе и одной в гене БО. Две из мутаций вели к аминокислотным заменам в репликазе штамма № 51: глутаминовой кислоте в позиции 672 и лизину в положении 1546. Они обнаруживались также у патогенного штамма № 20, и являлись реверсиями к дикому типу. Поскольку не наблюдалось достоверных различий в динамики накопления изучаемых атгенуированных штаммов V-69 и № 51, то можно сделать вывод, что, обнаруженные реверсии не способствовали увеличению скорости размножения изолята и усилению симптомов и, следовательно, не были критичными для аттенуации. Помимо реверсий была также найдена специфичная для штамма № 51 мутация G-5880 А в гене БО, обуславливающая замену Thr-60 —> Ala. В данной работе показано, что аттенуированный штамм № 51 и вакцинный V-69 накапливаются в 4,5 раз меньше, чем патогенный штамм № 20, и в 3 раза меньше, чем ревертант R1.

Нами было установлено, что самым агрессивным являлся патогенный штамм № 20, как по резкости симптомов и скорости их появления, так и по уровню и скорости накопления БО. Стоит отметить, что количество БО у изолята № 20 к моменту появления симптомов было в 1,5 раза больше, чем у штамма R1. Штамм R1 являлся патогенным ревертантом вакцинного штамма V-69, а его репликаза отличалась от репликазы штамма № 20 по 7 аминокислотам. Скорее всего, наличие серина в положение 797 в НКО репликазы штамма № 20 могло быть причиной повышенной скорости накопления штамма № 20 по сравнению с ревертантом R1. Интересно, что в результате определения особенностей размножения штаммов ВЗКМО и ВМТо были выявлены различия. Так, динамика размножения патогенных изолятов ВЗКМО отличалась от характера накопления вакцинного штамма исходным уровнем поступления вируса в неинокулированный лист и максимальным уровнем накопления. Для ослабленных и патогенных штаммов ВМТо уровень накопления белков оболочки на 3-й день был одинаковым, но затем размножение ослабленных штаммов как бы растягивалось во времени, а максимальное количество белков оболочки изолятов наблюдалось на лишь 14-й день. Очевидно, что уровень и время накопления штаммов ВМТо в растениях табака зависит от степени патогенности штаммов.

Наконец, сравнительный анализ атгенуированных и патогенных штаммов тобамовирусов, исследованных в данной работе и полученных в других странах мира, позволяет заключить, что критичные для аттенуации аминокислотные замены располагаются в белке репликазе, в НКО между МЕТ и ГЕЛ доменами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Славохотова, Анна Александровна, Москва

1. Атабеков И.Т. Практикум по общей вирусологии. // Изд. Московскогоуниверситета. 1981. - С. 60-73.

2. Гусев А.А. Простой метод выделения и очистки РНК. // Биорганическая химия. 1997. -Т. 23, № 9. - С. 763-765.

3. Грибанов О.Г., Щербаков А.В., Перевозчикова Н.А., Гусев А.А. Использование аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки фрагментов ДНК, ДНК плазмид и РНК. // Биохимия. 1996. - Т. 61, № 6. - С. 1064-1070.

4. Иванов П. А., Чудинова Е. М.,. Шанина Н. А. Фактор инициации трансляции eIF3 может связываться с микротрубочками в клетках млекопитающих // Молекулярная биология. 2001. - Т. 35, N 4. - С. 638-646.

5. Одинцова Т.И., Андреева Э.Н., Пухалъский В.А., Мусолямов А.Х., Егоров Ц.А. Структурный анализ белка оболочки вируса зеленой крапчатой мозаики огурца.// Биохимия 2000. - Т.65 (5). - С. 672-679.

6. Снегирева П.Б., Истомина Е.А., Шиян А.Н. Единственная реверсия в гене белков репликазы аттенуированного томатного штамма V-69 вируса табачной мозаики вызывает усиление патогенности вируса // Генетика 2005. - Т.41(1). - С.40-47.

7. Реунов А.В. Вирусный патогенез и защитные механизмы растений / -Владивосток: Дальнаука. С.1999 -215.

8. Макарова Ю.А., Крамеров Д.А. Некодирующие РНК. // Биохимия 2007. -Т. 72 (11). - С.1427- 1448.

9. Шкаликов В.А.Защита растений от болезней / Москва: Колос. 2004 - С.50.

10. Ainsworth G. Mosaic diseases of the cucumber // Ann. appl. Biol. 1935 -Vol. 22.-P. 55 -67.

11. Ali A., Natsuaki Т., Okuda S. Identification and molecular characterization of viruses infecting Cucurbits in Pakistan // J. Phytopathology 2004. - Vol.l52. - P.677-682.

12. Anandalakshmi R. Pruss GJ, Ge X, Marathe R, Mallory AC, Smith TH, Vance VB. A viral suppressor of gene silencing in plants // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. -Vol. 95.-P. 13079-13084.

13. Agrawal N., Dasaradhi P.V., Mohmmed A., Malhotra P., Bhatnagar R.K., Mukherjee S.K. RNA interference: biology, mechanism, and applications // Microbiol Mol Biol Rev. 2003. - Vol. 67. No 4. - P. 657- 685.

14. Aravin A.A., Klenov M.S., Vagin V.V., Bantignies F., Cavalli G., Gvozdev V.A. Dissection of a natural RNA silencing process in the Drosophila melanogaster germ line. // Mol Cell Biol. 2004.- Vol.- 24. P. 6742-6750.

15. Asurmendi S., Berg R.H., Koo J.C., Beachy R.N. Coat protein regulates formation of replication complexes during tobacco mosaic virus infection.// PNAS. -2004. Vol. 101, No. 5. - P.1415-1420.

16. Asurmendi S., Berg R.H., Smith T.J., Bendahmane M., Beachy R.N. Aggregation of TMV CP plays a role in CP functions and in coat-protein-mediated resistance // Virology. -2007. -Vol. 366 P.98—106

17. Baulcombe D. RNA silencing in plants. // Nature. 2004. - Vol. 16, No 431(7006). -P.356-363.

18. BazziniA., Asurmendi S., Hopp H., Beachy R. Tobacco mosaic virus (TMV) and potato virus X (PVX) coat proteins confer heterologous interference to PVX and TMV infection, respectively // Journal of General Virology. 2006. - Vol. 87. - P. 1005-1012.

19. Beachy R. N. Zaitlin M. Characterization and in vitro translation of the RNAs from less-than-full-length, virus-related, nucleoprotein rods present in tobacco mosaic virus preparations // Virology. 1977. - Vol. 81. - P. 160-169.

20. Boubourakas I.N., Hatziloukas E., Antignus Y., Katis N. I. Etiology of leaf chlorosis and deterioration of the fruit interior of watermelon plants // Journal of Phytopathology. 2004. - Vol. 152, No. 10. - P. 580-588.

21. Воуко V., Ferralli J., Ashby J., Schellenbaum P., Heinlein M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA // Nat. Cell Biol. 2000. - Vol. 2. -P. 826-832.

22. Воуко V., Ни Q., Seemanpillai M., Ashby J., Heinlein M. Validation of microtubule-associated Tobacco mosaic virus RNA movement and involvement of microtubule-aligned particle trafficking // The Plant Journal. 2007. - Vol. 51. - P. 589-603.

23. Bruening G., Beachy R. N., Scalla R. & Zaitlin M. In vitro and in vivo translation of the ribonucleic acids of cowpea strain of tobacco mosaic virus // Virology. -1976.-Vol. 71.-P. 498-517.

24. Buchon N., Vaury C. RNAi: a defensive RNA-silencing against viruses and , transposable elements // Heredity. 2006. - Vol. 96. - P. 195 - 202.

25. BuckK. W. Replication of tobacco mosaic virus RNA // Phil.Trans. R. Soc. Lond. В. 1996.-Vol.354.-P. 613-627.

26. Canto T, MacFarlane SA, Palukaitis P. ORF6 of Tobacco mosaic virus is a determinant of viral pathogenicity in Nicotiana benthamiana II J Gen Virol. 2004. - Vol. 10.-P. 3123-33.

27. Carrington J.C., Kasschau K.D., Mahajan S.K., Schaad M.C. Cell-to-cell and long-distance transport of viruses in plants // Plant Cell. 1996. - Vol. 8, No. 10. - P. 16691681.

28. Chandrika R. S. Rabindran D. J. Lewandowski K. L. Manjunath, W. O. Dawson. Full-length tobacco mosaic virus RNAs and defective RNAs have different 3'-replication signals // Virology. 2000. - Vol. 273. - P. 198-209.

29. Chen M.H., Sheng J., Hind G., Handa A.K., Citovsky V. Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement // J: EMBO. 2000. - Vol. 19, No. 5. - P. 913-920.

30. Cheng N.H., Su C.L., Carter S.A., Nelson R.S. Vascular invasion routes and systemic accumulation patterns of tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana II J. Plant. 2000. - Vol. 23, No. 3. - P. 349-362.

31. Citovsky V. Tobacco mosaic virus: a pioneer of cell-to-cell movement // Phil.Trans. R. Soc. Lond. B. 1999. - Vol. 354. - P. 637-643.

32. Citovsky V., Knorr D., Schuster G. & Zambryski P. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single- strand nucleic acid binding protein // Cell. 1990. - Vol. 60. - P. 637-647.

33. Citovsky V., McLean B.G., Zupan J.R., Zambryski P. Phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein by a developmentally regulated plant cell wall-associated protein kinase // Genes Dev. 1993. - Vol. 7, No. 5. - P. 904-910.

34. Citovsky V., Wong M.L., Shaw A. L., Prasad B.V., Zambryski P. Visualization and characterization of tobacco mosaic virus movement protein binding to single-stranded nucleic acids // Plant Cell. 1992. - Vol. 4, No. 4. - P. 397-411.

35. Csorba T, Bovi A, Dalmay T, Burgyan J. The pi22 subunit of tobacco mosaic virus replicase is a potent silencing suppressor and compromises both small interfering RNA- and microRNA-mediated pathways // J Virol. 2007. - Vol. 81, No. 21. - P. 11768-80.

36. Dalmay Т., Szittya G. , Burgyan J. Generation of defective interfering RNA dimers of cymbidium ringspot tombusvirus // Virology. 1995. - Vol. 207. - P. 510-517.

37. Deiman В. A. A. К Koenen P. W. Verlaan, C. W. Pleij. Minimal template requirements for initiation of minus-strand synthesis in vitro by the RNA-dependent RNA polymerase of turnip yellow mosaic virus // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 3965-3972.

38. DingX.S., Shintaku M.H., Carter S.A., Nelson R.S. Accumulation of mild and severe strains of tobacco mosaic virus in minor veins of tobacco // Mol. Plant Microbe. Interact. 1995. - Vol. 8. - P. 32-^10.

39. Dreher T. W. С. H. Tsai, J. M. Skuzeski. Aminoacylation identity switch of turnip yellow mosaic virus RNA from valine to methionine results in an infectious virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - P. 12212-12216.

40. Duca S., Betti L., Trebbi G., Serafini-Fracassini D., Torrigiani P. Transglutaminase activity changes during the hypersensitive reaction, a typical defense response of tobacco NN plants to TMV // Physiologia Plantarum. 2007. - Vol. 13. - P. 241— 250.

41. Dunigan D.D. and Zaitlin M. Capping of tobacco mosaic virus RNA. Analis of viral-encoded gyaniltransferase-like activity. // J. Biol. Chem. 1990. - Vol.-265.-P. 7779-7786.

42. Ehrenfeld N., Canon P., Stange С., Medina C., Arce-Johnson P. Tobamovirus coat protein cpcg induces an HR-like response in sensitive tobacco plants // Mol. Cells.-2005.-Vol. 19. No 3.-P. 418-427.

43. EhrenfeldN, Gonzalez A, Canon P, Medina C, Perez-Acle T, Arce-Johnson P. Structure-function relationship between the tobamovirus TMV-Cg coat protein and the HR-like response.// J Gen Virol. 2008 - Vol. 89, No. 3. - P. 809-817.

44. Erickson F.L., Holzberg S., Calderon-Urrea A., Handley V., Axtell M., Corr C., Baker B. The helicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defence response in tobacco // J. Plant. 1999. - Vol. 18, No. 1. - P. 67-75.

45. Espinoza Cancino C, Medina Arevalo C, Arce-Johnson P. Expression of the crucifer-infecting TMV-Cg movement protein in tobacco plants complements in trans a TMV-U1 trafficking-deficient mutant // Biol Res. 2006. - Vol. 39, No. 2. - P. 269-79.

46. Fujiki M., Kawakami S., Kim R. W., Beachy R. N. Domains of tobacco mosaic virus movement protein essential for its membrane association // Journal of General Virology. 2006. - Vol. 87 - P. 2699-2707.

47. Gafny R., Lapidot M., Berna A., Holt СЛ., Deom C.M., Beachy R.N. Effects of terminal deletion mutations on function of the movement protein of tobacco mosaic virus // Virology. 1992. - Vol. 187, No. 2. - P. 499-507.

48. Gallie D. R. A tale of two termini: a functional interaction between the termini of an mRNA is a prerequisite for efficient translation initiation // Gene. 1998. - Vol. 216. -P. 1-11.

49. Gallie D.R. The 5'-leader of tobacco mosaic virus promotes translation through enhanced recruitment of eIF4F // Nucleic Acids Research. 2002. - Vol. 30 No. 15.-P. 3401-3411.

50. Gallie D.R., Walbot V. Identification of the motifs within the tobacco mosaic virus 5'-leader responsible for enhancing translation // NAR. 1992. - Vol. 20. - P. 46314638.

51. Gasciolli V, Mallory AC, Bartel DP, Vaucheret H. Partially redundant functions of Arabidopsis DICER-like enzymes and a role for DCL4 in producing trans-acting siRNAs // Curr Biol. 2005. - Vol. 2005. - P. 15:1494-1500.

52. Gibbs A. Evolution and origins of tobamoviruses // Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. V. 1999. - Vol. 354, No. 1383. - P. 593-602.

53. GoeletP. & Karn J. Tobacco mosaic virus induces the synthesis of a family of 39 coterminal messenger RNAs and their complements // J Mol Biol. 1982. - Vol. 154. - P. 541-550.

54. Gorbalenya A.E., Koonin E.V. Viral proteins containing the purine NTP-binding sequence pattern. // Nucleic Acids Res. 1989. - Vol. 17. - P.8413-8440.

55. Goregaoker S. P. D. J. Lewandowski, J. N. Culver. Identification and functional analysis of an interaction between domains of the 126/183-kDa replicase-associated proteins of tobacco mosaic virus // Virology. 2001. - Vol. 282. - P. 320-328.

56. Goregaoker S.P., Culver J.N. Oligomerization and activity of the helicase domain of the tobacco mosaic virus 126- and 183-kilodalton replicase proteins // J Virol. -2003. Vol. 77, No. 6. - P. 3549-3556.

57. Grdzelishvili V.Z., Chapman S.N., Dawson W.O., Lewandowski D.J. Mapping of the Tobacco mosaic virus movement protein and coat protein subgenomic RNA promoters in vivo // Virology. 2000. - Vol. 275, No. 1. - P. 177-192.

58. Guilley H., Jonard G., Kukla В., Richards K.E. Sequence of 1000 nucleotides at the 3' end of tobacco mosaic virus RNA // Nucleic Acids Res. 1979. - Vol. 6, No. 4. - P. 1287-1308.

59. HaenniA-L., Chapeville F. An enigma: the role of viral RNA aminoacylation // Acta Biochimica Polonica 1997. - Vol. 44, No. 4. - P.827 - 839

60. Hamacher J., Wettern M., Schulz M. Ubiquitination of TMV coat protein aggregates in infected tobacco leaves // J. Phytopathology. 2003. - Vol. 151. - P. 652-659.

61. Hamilton A. J., Baulcombe D. C. A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants // Science. 1999. - Vol. 286. - P. 950-952.

62. Heinlein M. Plasmodesmata: dynamic regulation and role in macromolecular cell-to-cell signaling // Curr. Opin. Plant Biol. 2002. - Vol. 5, No. 6. - P. 543-552.

63. Heinlein M, Epel B.L., Padgett H.S., Beachy R.N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton // Science. 1995. - Vol. 270, No. 5244. - P. 1983-1985.

64. Higgins T. J. V., Goodwin P. B. & Whitfield P. R. Occurrence of short particles in beans infected with cowpea strain of TMV II Evidence that short particles contain the cistron for coat-protein // Virology. 1976. - Vol. 71. - P. 486-497.

65. Hills G.J., Plaskitt K.A., Young N.D., Dunigan D.D., Watts J.W., Wilson T.M., Zaitlin M. Immunogold localization of the intracellular sites of structural and nonstructural tobacco mosaic virus proteins. // Virology. 1987. - Vol. 161, No. 2. -P.488-496.

66. Himber C, Dunoyer P, Moissiard G, Ritzenthaler C, Voinnet O. Transitivity-dependent and -independent cell-to-cell movement of RNA silencing // EMBO J. 2003. -Vol. 22, No. 17. - P. 4523-33.

67. Hirashima K., Watanabe Y. RNA helicase domain of tobamovirus replicase executes cell-to-cell movement possibly through collaboration with its nonconserved region // J. Virol. 2003. - Vol. 77, No. 22. - P. 12357-12362.

68. Hirashima K., Watanabe Y. Tobamovirus replicase coding region is involved in cell-to-cell movement // J. Virol. 2001. - Vol. 75, No. 18. - P. 8831-8836.

69. Hunter T.R., Hunt Т., Knowland J., Zimmern D. Messenger RNA for the coat protein of tobacco mosaic virus // Nature. 1976. - V. 260 , No. 5554. - P. 759-764.

70. Ishihama A., Barbier P. Molecular anatomy of viral RNA-directed RNA. polymerases. // Arch. Virol. 1994. - Vol.134. - P.235-258.

71. Jshikawa M. T. Meshi F. Motoyoshi N. Takamatsu, Y. Okada. In vitro mutagenesis of the putative replicase genes of tobacco mosaic virus // Nucleic Acids Res. -1986. Vol. 14. - P. 8291-8305.

72. Ivanov P.A., Karpova O.V., Skulachev M.V., Tomashevskaya O.L., Rodionova N.P., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G. A tobamovirus genome that contains an internal ribosome entry site functional in vitro // Virology. 1997. - Vol. 232, No. 1. - P. 32-43.

73. Joshi R.L., Chapeville F., Haenni A.L. Conformational requirements of tobacco mosaic virus RNA for aminoacylation and adenylation // Nucleic Acids Res. 1985. -Vol. 13, No. 2.-P. 347-354.

74. Kahn T. W„ Lapidot M., Heinlein M., Reichel C., Cooper В., Gafny R., Beachy R.N. Domains of the TMV movement protein involved in subcellular localization // J. Plant. 1998. - Vol. 15, No. 1. - P. 15-25.

75. Kalmykova A.I., Nurminsky D.I., Ryzhov D.V., Shevelyov Y.Y. Regulated chromatin domain comprising cluster of co-expressed genes in Drosophila melanogaster // Nucleic Acids Res 2005. - Vol. 33 .- P. 1435-1444.

76. Kawakami S., Watanabe Y., Beachy R. N. Tobacco mosaic virus infection spreads cell to cell as intact replication complexes // PNAS. 2004. - Vol. 101(16). - P. 6291-6296.

77. Kim S.-M., Lee J.-M., Yim K.-O., Oh M.-H., Park J.-W., Kim. K.-H. Nucleotide sequences of two korean isolates of cucumber green mottle mosaic virus. // Mol. Cells. 2003. - Vol. 16. No. 3. - P. 407-412

78. Koev G. B. R. Mohan, W. A. Miller. Primary and secondarystructural elements required for synthesis of barley yellow dwarf virus subgenomic NA1 // J. Virol. 1999. -Vol.73.-P. 2876-2885.

79. Koev G„ Miller W. A. A. Positive-strand RNA virus with three very different subgenomic RNA promoters // J. Virology. 2000. - Vol. 74, No. 13. - P. 5988-5996.

80. Koonin E. V., V. V. Dolja. Evolution and taxonomy of positivestrand RNA viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1993. - Vol. 28. - P. 375-430.

81. Kragler F., Curin M., Trutnyeva K., Gansch A. & Waigmann E. MPB2C, a microtubule-associated plant protein binds to and interferes with cell-to-cell transport of tobacco mosaic virus movement protein// Plant Physiol. 2003. - Vol. 132. - P. 1870-1883.

82. Kubota К., Tsuda S., Tamai A., Meshi T. Tomato mosaic virus replication protein suppresses virus-targeted posttranscriptional gene silencing // J. Virol. 2003. -Vol. 77, No 20. - P.l 1016-11026.

83. Kumagai M. H., Donson J, della-Cioppa G, Harvey D, Hartley K, Grill LK. Cytoplasmic inhibition of carotenoid biosynthesis with virus-derived RNA // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P. 1679-1683.

84. Kurihara Y, Inaba N, Kutsuna N, Takeda A, Tagami Y, Watanabe Y. Binding of tobamovirus replication protein with small RNA duplexes // J Gen Virol. 2007. - Vol. 88, No. 8. - P. 2347-52.

85. Lakatos L. G. Szittya D. Silhavy, J. Burgyan. Molecular mechanism of RNA silencing suppression mediated by pi9 protein of tombusviruses // EMBO J. 2004. - Vol. 23. - P. 876-884.

86. Leathers V. R. Tanguay M. Kobayashi, D. R. Gallie. A phylogenetically conserved sequence within viral 3'-untranslated RNA pseudoknots regulates translation // Mol. Cell. Biol. 1993. - Vol. 13. - P. 5331-5347.

87. Lewandowski D.J., Dawson W.O. A single amino acid in tobacco mosaic virus replicase prevents symptom production // Mol. Plant Microbe. Interact. 1993. - Vol. 6. - P. 157-160.

88. Lewandowski D.J., Dawson W.O. Functions of the 126- and 183-kDa proteins of tobacco mosaic virus // Virology. 2000. - Vol. 271, No. 1. - P. 90-98.

89. Lu В., Stubbs G., Culver J.N. Coat protein interactions involved in tobacco mosaic tobamovirus cross-protection. // Virology. 1998. - Vol. 248, No 2. - P. 188-198.

90. Mandahar C.L. Multiplication of RNA plant viruses / Springer. - 2006. - P.2, 61,87-101,272-280

91. Mas P. & Beachy R. N. Role of microtubules in the intracellular distribution of tobacco mosaic virus movement protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. -P.12345-12349.

92. Mas P., Beachy R.N. Replication of tobacco mosaic virus on endoplasmic reticulum and role of the cytoskeleton and virus movement protein in intracellular distribution of viraKRNA // J. Cell Biol. 1999. - Vol. 147, No. 5. - P. 945-958.

93. Matsumoto Т.; Nara Y.; Furuya H.; Takahashi H.; Tairako K.; Yamamoto H. Characteristics for practical use of attenuated isolate LI lA-Fukushima of tomato mosaic virus // Journal Of General Plant Pathology. 2002. - Vol. 68, No. 4. - P. 382-384.

94. McLean B.G., Zupan J., Zambryski P.C. Tobacco mosaic virus movement protein associates with the cytoskeleton in tobacco cell // Plant Cell. 1995. - Vol. 7, No. 12. -P. 2101-2114.

95. Merits A., Kettunen R., Makinen K., Lampio A., Auvinen P., Kaariainen L., Ahola T. Virus-specific capping of tobacco mosaic virus RNA: methylation of GTP prior to formation of covalent complex pI26-m7GMP // FEBS Lett. 1999. - Vol. 455. - P:145-48.

96. Moreno IM, Thompson JR, Garcia-Arenal F. Analysis of the systemic colonization of cucumber plants by Cucumber green mottle mosaic virus // J Gen Virol. -2004. V. 85, No. 3. - P. 749-59.

97. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans // Plant Cell. 1990. - Vol. 2. - P. 279-289.

98. Nishiguchi M., Kikuchi S., Kiho Y, Ohno Т., Meshi Т., Okada Y Molecular basis of plant viral virulence; the complete nucleotide sequence of an attenuated strain of tobacco mosaic virus //Nucleic Acids Res. 1985. - Vol. 13, No. 15. - P. 5585-5590.

99. Nishiguchi M., Motoyoshi F., Oshima N. Behaviour of a temperature-sensitive strain of tobacco mosaic virus in tomato leaves and protoplasts // J. Gen. Virol. 1978. - Vol. -P. 39:53-61.

100. Ohno Т., Aoyagi M., Yamanashi Y., Saito H., Ikawa /., Meshi Т., Okada Y. Nucleotide sequence of the TMV (tomato strain) genome and comparison with the common strain genome // J. Biochem. 1984. - Vol. 96. - P. 1915-1923.

101. Ohno Т., Takamatsu N., Meshi Т., Okada Y, Nishigushi M., Kiho Y Single amino acid substitution in 30k protein of TMV defective in virus transport function // Virology. 1983. - Vol. 131. - P. 255-258.

102. Osman T.A., ffemenway C.L., Buck К W. Role of the 3' tRNA-like structure in tobacco mosaic virus minus-strand RNA synthesis by the viral RNA-dependent RNA polymerase In vitro // J. Virol. 2000. - Vol. 74, No. 24. - P. 11671-11680.

103. Padmanabhan M.S., Kramer S.R., Wang X., Culver J.N. TMV Aux/IAA Interactions: Reprogramming the Auxin Response Pathway to Enhance Virus Infection // J. of Virology. - 2008. - Vol. 82(5). - P. 2477-2485.

104. Padmanabhan M.S., Shiferaw H., Culver J.N. The Tobacco mosaic virus replicase protein disrupts the localization and function of interacting Aux/IAA proteins // Mol Plant Microbe Interact. 2006. - Vol. 19. - P. 864-73.

105. Pelham H.R.B. Leaky UAG termination codon in tobacco mosaic virus RNA //Nature. 1978. - Vol. 272. - P. 469-471.

106. Pruss G. Bowman L., Vance V. В. A calmodulin-related protein that suppresses posttranscriptional gene silencing in plants // Science. 2000. - Vol. 290. - P. 142-144.

107. QuF.T. Ren, T. J. Morris. The coat protein of turnip crinkle virus suppresses posttranscriptional gene silencing at an early initiation step // J. Virol. 2003. - Vol. 77. - P. 511-522.

108. Ratcliff F., MacFarlane S., Baulcombe D. C. Gene silencing without DNA: RNA-mediated cross protection between viruses // Plant Cell. 1999. - Vol. 11. - P. 12071215.

109. Reichel C., Beachy R. N. Degradation of tobacco mosaic virus movement protein by the 26S proteasome // J. Virol. 2000. - Vol. 74. - P. 3330-3337.

110. Reichel C., Mas P., Beachy R.N. The role of the ER and cytoskeleton in plant viral trafficking // Trends Plant Sci. 1999. - Vol. 4, No. 11. - P. 458-462.

111. Rozanov M.N., Koonin E.V., Gorbalenya A.E. Conservation of the putative methyltransferase domain: a hallmark of the 'Sindbis-like' supergroup of positive-strand RNA viruses. // J. Gen. Virol. 1992. - Vol.73, No 8. - P. 2129-2134.

112. Ruiz M. Т., Voinnet O., Baulcombe D. C. Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing// Plant Cell. 1998. - Vol. 10. - P. 937-946.

113. Sarot E, Payen-Groschene G, Bucheton A, Pelisson A. Evidence for a piwi-dependent RNA silencing of the gypsy endogenous retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene // Genetics. 2004. - Vol. 166. - P. 1313-1321.

114. Saumet A. and Lecellier C. Anti-viral RNA silencing: do we look like plants? // Retrovirology. 2006. Vol. 3, No. 3 - doi: 10.1186/1742-4690-3-3

115. Schwartz M., Chen J, Janda M, Sullivan M, den Boon J, Ahlquist P. A positive-strand RNA virus replication complex parallels form and function of retrovirus capsids // Mol. Cell. 2002. - Vol. 9. - P. 505-514.

116. Shintaku M.N., Carter S.A., Bao Y., Nelson R.N. Mapping nucleotides in the 126-kDa protein gene that control the differential symptoms induced by two strains of tobacco mosaic virus// Virology. 1996. - Vol. 221. - P.218-225.

117. Siddiqui SA, Sarmiento C, Valkonen S, Truve E, Lehto K. Suppression of infectious TMV genomes expressed in young transgenic tobacco plants // Mol Plant Microbe Interact. V. 2007. - Vol. 20, No. 12. - P. 1489-94.

118. Siegel, R. W., S. Adkins, and С. C. Kao. 1997. Sequence-specific recognitions of a subgenomic RNA promoter by a viral RNA polymerase. PNAS. Vol. 9. - P. 123811243.

119. Silhavy D. A. Molnar A. Lucioli G. Szittya C. Hornyik M. Tavazza, J. Burgyan. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21- to 25-nucleotide double-stranded RNAs // EMBO J. 2002. - Vol. 21. - P. 3070-3080.

120. Silhavy D., J. Burgyan. Effects and side-effects of viral RNA silencing suppressors on short RNAs // Trends Plant Sci. 2004. - Vol. 9. - P. 76-83.

121. Skuzeski J.M., Nichols L.M., Gesteland R.F., Atkins J.F. The signal for a leaky UAG stop codon in several plant viruses includes the two downstream codons // J. Mol. Biol.- 1991. Vol. 218, No. 2. - P. 365-373.

122. Smith. A Textbook of Plant Virus Diseases / Churchill. 2nd ed. 1957

123. Sulzinski M.A., Gabaro K.A., Palukaitis P. and Zaitlin M. Replication of tobacco mosaic virus. VII. Characterization of a third subgenomic TMV RNA // Virology- 1985.-Vol. 145. P.132-140.

124. Susi P, Pehu E, Lehto K. Replication in the phloem is not necessary for efficient vascular transport of tobacco mosaic tobamovirus // FEBS Lett. V. 1999. - Vol. 447,No. l.-P. 121-123.

125. Szittya, G., Molnar, A., Silhavy, D., Hornyik, C. , Burgyan, J. Short defective interfering RNAs of tombusviruses are not targeted but trigger post-transcriptional gene silencing against their helper virus. // Plant Cell 2002. Vol. 14. - P. 359-372.

126. Szweykowska-Kulinska Z., Jarmoowski A., Figlerowicz M. RNA interference and its role in the regulation of eukaryotic gene expression. // Acta Biochimica Polonica. -2003. Vol. 50(1)

127. Tagami Y, Watanabe Y. Effects of brefeldin A on the localization of Tobamovirus movement protein and cell-to-cell movement of the virus // Virology. 2007. -Vol. 361, No. l.-P. 133-40.

128. Takamatsu N., Watanabe Y., Meshi T. and Okada Y. Mutational analysis of the pseudoknot region in the 3' noncoding region of tobacco mosaic virus RNA. // J. Virol. -1990.-Vol.64. P.3686-3693.

129. TakizawaM., Goto A., Watanabe Y. The tobacco ubiquitin-activating enzymes NtElA and NtElB are induced by tobacco mosaic virus, wounding and stress hormones. // Mol. Cells. -2005. Vol. 19, No. 2 - P. 228-231

130. Tan S.H., Nishiguchi M., Murata M., Motoyoshi F. The genome structure of kyuri green mottle mosaic tobamovirus and its comparison with that of cucumber green mottle mosaic tobamovirus // Arch. Virol. 2000. - Vol. 145, No. 6. - P. 1067-1079.

131. Ugaki M, Tomiyama M, Kakutani T, Hidaka S, Kiguchi T, Nagata R, Sato T, Motoyoshi F, Nishiguchi M. The complete nucleotide sequence of cucumber green mottle mosaic virus (SH strain) genomic RNA // J Gen Virol. 1991. - Vol. 72. - P. 1487-95.

132. Van Belkum A., Abrahams J. P., Pleij C. W. A., Bosch L. Five pseudoknots at the 204 nucleotides long 3' noncoding region of tobacco mosaic virus RNA // Nucleic Acids Res. 1985. - Vol. 13. - P. 7673-7686.

133. Vierstra, R. D. The ubiquitin/26S proteasome pathway, the complex last chapter in the life of many plant proteins. // Trends Plant Sci.- 2003. Vol. 8, 135-142.

134. Voinnet O. Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections //Nat. Rev. Genet. 2005. - Vol. 6. - P. 206-220.

135. Voinnet O., Pinto Y.M., Baulcombe D.C. Suppression of gene silencing: ageneral strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. -Vol. 96, No 24. - P.l4147-14152.

136. Voinnet O. RNA silencing as a plant immune system against viruses // Trends Genet. 2001. - Vol. 17. - P. 449-459.

137. Waigmann E., Chen M.H., Bachmaier R., Ghoshroy S., Citovsky V. Regulation of plasmodesmal transport by phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein. // J.EMBO. 2000. - Vol. 19, No 18. - P.4875-4884

138. Watanabe Y., Morita N., Nishiguchi M., Okada Y. Attenuated strains of tobacco mosaic virus. Reduced synthesis of a viral protein with a cell-to-cell movement function. J. Mol. Biol. -1987. V. 194(4). P. 699-704.

139. Wilson T.M.A. Cotranslational disassambly of tobacco mosaic virus in vitro // Virology. 1984. - Vol. 137. - P. 255-265.

140. Wilson T.M.A. Strategies to protect crop plant against virus: pathogen-derived resistance blossoms//PNAS. 1993. - Vol. 90. - P. 3134-3141.

141. Wu X., Xu Z. and Shaw J.G. Uncoating of tobacco mosaic virus RNA in protoplasts. // Virology. 1994 .- Vol. 200. P. 256-262

142. Yang G., Qiu B.S., LiuX.G., Li Y., WangX.F. Nonsense mutations of replicase and movement protein genes contributes to the attenuation of an avirulent tomato mosaic virus // Virus Res. 2002. - Vol. 87. - P. 119-128.

143. Zhang X. Y R. Yuan Y. Pei S. S. Lin T. Tuschl D. J. Patel, N. H. Chua. Cucumber mosaic virus-encoded 2b suppressor inhibits Arabidopsis Argonautel cleavage activity to counter plant defense // Genes Dev. 2006. - Vol. 20. - P. 3255-3268.

Информация о работе

Славохотова, Анна Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Изучение генетического полиморфизма аттенуированных и патогенных штаммов тобамовирусов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы