Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия консервативных антигенов вируса гриппа A в растениях на поверхности химерных частиц ВТМ

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия консервативных антигенов вируса гриппа A в растениях на поверхности химерных частиц ВТМ"

005059881

На правах рукописи

оМг

ПЕТУХОВА Наталья Витальевна

ЭКСПРЕССИЯ КОНСЕРВАТИВНЫХ АНТИГЕНОВ ВИРУСА ГРИППА Л В РАСТЕНИЯХ НА ПОВЕРХНОСТИ ХИМЕРНЫХ ЧАСТИЦ ВТМ: ИММУНОГЕННЫЕ И ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА КАНДИДАТНЫХ ВАКЦИН

03.02.02 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 МАЙ 2013

Москва 2013

005059881

Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Иванов Петр Алексеевич

Официальные оппоненты:

Лунин Владимир Глебович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, лаборатория биологически активных наноструктур, руководитель.

Соловьев Андрей Геннадьевич, доктор биологических наук, профессор, НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», отдел биохимии вирусов растений, лаборатория генной инженерии вирусов, ведущий научный сотрудник.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова» РАМН.

Защита состоится «23» мая 2013 г. в____ов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских

и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, стр. 12, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан «23» апреля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

Актуальность проблемы.

Вирус гриппа является наиболее опасным респираторным заболеванием человека и животных. Сезонный грипп вызывает около 600 миллионов случаев заболеваний человека и 400 тысяч смертей каждый год. Реассортация человеческих, птичьих и свиных штаммов может дать начало новой пандемии, сходной с «Испанкой» 1918 г. (по разным оценкам, от 20 до 50 миллионов жертв). Большинство современных вакцин содержит НА (гемагглютинин) и NA (нейраминидазу). Эти гликопротеины являются высоко иммуногенными, но, одновременно, и высоко вариабельными, поэтому поиски «Священного Грааля» (Rudolph and Ben-Yedidia, 2011) сосредоточены на разработке вакцины широкого спектра действия, содержащей консервативные вирусные антигены. Наибольшее внимание уделяется эктодомену М2е (23 аминокислотных остатка, аа; практически неизменны у всех изолятов, известных с 1933 года) минорного белка М2 вируса гриппа А, образующего теграмерные ионные каналы вириона. Установлено, что антитела к М2е могут обеспечивать защиту против субтипов вируса гриппа со сходной последовательностью пептида (Neirynck et al., 1999). 14 аа пептида слияния (fusion-пептид, fp), расположенного в N-терминальной части субъединицы НА2, являются единственной консервативной последовательностью среди всех НА вируса гриппа (Chun et al., 2008). Было показано, что моноклональные антитела к fusion-пептиду могут взаимодействовать практически со всеми вирусными НА (Li et ai, 2010).

Экспрессия белков и пеитидов в растениях имеет ряд ценных преимуществ: посттрансляционная модификация белков, как правило, сходна с таковой в животных клетках (Giddings, 2001); биобезопасность; быстрота и высокий уровень накопления целевых белков и пептидов; низкая себестоимость продукта; возможность создания так называемых «съедобных» вакцин против различных инфекций (Pascual et al, 2007).

Последовательности целевых пептидов могут быть клонированы в ген белка оболочки (БО) фитовируса, например, вируса табачной мозаики (ВТМ; Tobacco mosaic virus, TMV), таким образом, чтобы чужеродный пептид был экспонирован на поверхности химерной вирусной частицы (Chimeric Virus Particle, CVP) (Porta and Lomonossoff, 1998). Внесение структурных изменений и модификаций в БО может существенно влиять на биологию вируса и характер развития вирусной инфекции в растениях (Culver et al., 2002). Для успешной вакцинации антигены должны быть представлены иммунной системе в высоко упорядоченном, мультикопийном, квазикристаллическом виде; CVP является подходящей моделью и способна стимулировать пролиферацию дендритных клеток и других антиген-презентирующих клеток (Smith et al., 2009).

Цели и задачи исследования

Основной целью данной работы было получение кандидатной «универсальной» вакцины против вируса гриппа А на основе экспрессии консервативных антигенов М2е и fp в растениях на

поверхности частиц ВТМ, а также изучение биологических свойств рекомбинантных вирусов и влияния модифицированных БО на развитие вирусной инфекции, в том числе на системный транспорт.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Создание вирусных векторов, предназначенных для агроинокуляции растений и несущих последовательности консервативных эпитопов вируса гриппа А (М2е и fp) в открытой рамке трансляции БО ВТМ; мутагенез М2е-антигена.

2. Изучение круга растений-хозяев и особенностей инфекций, вызванных рекомбинантными вирусами.

3. Анализ экспрессии и динамики накопления модифицированных вариантов БО в инокулированных и системных листьях.

4. Исследование генетической стабильности рекомбинантных вирусов.

5. Анализ иммуногенных свойств предполагаемых химерных вирионов: соотношение антител к М2е-эпитопу и к носителю (БО); профили субклассов специфических иммуноглобулинов; возможное взаимодействие с белком М2 на поверхности клеток, зараженных вирусом гриппа А.

6. Определение протективных свойств химерных вирусных частиц TMV-M2e при заражении гомологичным и гетерологичным штаммами вируса гриппа А.

Научная новизна и практическая значимость Созданы вирусные векторы TMV-M2e и TMV-fp. На основе консенсусной человеческой последовательности М2е получили два мутантных варианта с заменами остатков цистеина (cys) в 17 и 19 положениях на остатки серина (ser) или аланина (ala). Все векторы были генетически стабильны и способны к эффективной системной инфекции, уровень накопления БО-М2е достигал 4 г/кг верхних листьев. Частицы TMV-M2e состояли из 2-х структурных белков (содержание БО-М2е - 90%). Развитие инфекции TMV-M2e-ala существенным образом отличалось от TMV-M2e-ser. Соотношение антител (АТ) к эпитопу и носителю (БО) в сыворотках мышей варьировало от 2.7/1 (ser) до 5/1 (ala); АТ взаимодействовали с белком М2 на поверхности клеток, зараженных вирусом гриппа. Профили иммуноглобулинов IgGl/IgG2a: 0.7/1 (ser) и 3.2/1 (ala). Мыши, вакцинированные TMV-M2e-ala/ser, были устойчивы к заражению 5 летальных доз (LD50) гомологичного вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1); TMV-M2e-ala обеспечивал высокую степень защиты от 5LD5o гетерологичного вируса A/Californ¡a/04/09 (H1N1) (4 аа замены в последовательности М2е без учета мутаций цистеинов, уровень выживаемости 70%). Апробация работы

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова.

Результаты работы докладывались на семинарах кафедры вирусологии Биологического факультета, а также на отечественных и международных конференциях: Юбилейная научная конференция «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» к 45-летию НИИ гриппа (Санкт-Петербург, Россия), 2012; The 4th ESWI Influenza Conference (Malta), 2011; 36th FEBS Congress «Biochemistry for Tomorrow's Medicine» (Torino, Italy), 2011; III International Forum «Rusnanotech» (Moscow, Russia), 2010; Международная конференция «Биотехнология, нанотехнология и физико-химическая биология» (Алма-Ата, Казахстан), 2010.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из которых 2 статьи в рецензируемых журналах и 5 тезисов международных конференций.

Структура работы

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы».

Работа изложена на Щс траницах, содержит ^^"рисунков и ¿P таблиц.

Содержание работы

1. Создание экспериментальной системы презентации М2е-эпитопа и fusion-пептида в составе генома TMV-U1.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие консенсусный вариант М2е-пептида человека (Liu et al., 2005), а также fusion-пептид (fp) гемагглютинина (Chun et al., 2008), были оптимизированы для экспрессии в растениях с помощью вирусных векторов на основе данных о частоте использования различных кодонов у Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum и двух вирусных белков оболочки, которые эффективно экспрессируются при инфекции растений вирусами Tobacco mosaic virus, TMV-U1 (BTM) (Goelet et al., 1982) и Alternanthera mosaic virus, AltMV-MU (Ivanov et al., 2011). Иногда последовательности оптимальных кодонов совпадали; рекомендованные кодоны для некоторых аминокислотных остатков, таких как Leu, Thr, Ile и Val, различались, поэтому был выбран компромиссный вариант. Данный подход также обеспечивал эффективную экспрессию в Е. coli и высокий уровень накопления соответствующих слитых белков DHFR-M2e и DHFR-fp.

Векторы TMV-M2e и TMV-fp клонировали в бинарный вектор pBinl9 между левой (LB) и правой (RB) границами Т-ДНК (рис.1). Итоговые конструкции содержали полноразмерную кДНК ВТМ с последовательностями эпитопов в гене БО под контролем промотора гена Actin 2 из Arabidopsis thaliana и терминатора гена нопалинсинтазы (nos) и были рассчитаны на последующее

использование метода агроинокуляции как наиболее эффективного способа заражения растений вирусным вектором (рис.1) (Fischer et al., 1999).

2. Экспрессия слитых белков DHFR-M2e и DHFR-fp в Е. coli и получение соответствующих антисывороток.

Последовательность М2е-пептида была клонирована в вектор pQE40 (QIAGEN, Германия) в рамку трансляции гена дигидрофолатредуктазы (DHFR) мыши (рис.2А). Белки DHFR-M2e (pQE40-M2e) и DHFR (pQE40) были экспрессированы в E.coli штамма XL-1 Blue. (рис.2В), выделены на колонках с Ni-NTA агарозой и диализованы против тридистиллированной воды при комнатной температуре. DHFR-M2e использовали для внутрибрюшинной иммунизации мышей (3 раза по 100 мкг на инъекцию с 2-х недельными интервалами). Полученная антисыворотка (AS) применялась в последующих экспериментах (см. ниже). С помощью Вестерн блот анализа было показано, что мышиная поликлональная антисыворотка (AS DHFR-M2e) против слитого белка DHFR-M2e содержит значительно большее количество антител, специфичных к М2е-пептиду, по сравнению с антителами против белка-носителя (DHFR). Сыворотку AS DHFR-M2e при разведении 1:50000 можно считать специфичной только к М2е-пептиду (рис.2С).

3Дф

Рис.1. Рекомбинантные вирусные векторы на основе генома ВТМ, содержащие последовательности М2е и fp. Затемненные блоки соответствуют генам репликазы, транспортного белка (30 кДа), белка оболочки (СР) и З'-нетранслируемой области (З'-NTR) генома TMV-U1. RB, LB - правая и левая границы Т-ДНК соответственно. Act2 - Actin2 транскрипционный промотор из Arabidopsis thaliana, nos -терминатор транскрипции гена нопалин синтазы. Указанные последовательности обозначают 3 версии М2е-пептида и fusion-пептида, клонированные между аминокислотными остатками 155 и 156 БО ВТМ. Замены в последовательности М2е обозначены подчеркиванием.

Сыворотку к Ишоп-пептиду (Ав ОНРЯ^р) получали аналогичным образом с А8 DHFR-M2e, и анализировали с помощью Вестерн блоттинга, при этом существенной разницы в специфичности к эпитопу и носителю выявить не удалось. При разведении 1:3000 сыворотка

TMV-M2e-cys = TMV-M2e-ser = TMV-M2e-ala = TMV-fp =

SLLTEVETPIRNEWESRSNDSSD SLLTEVETPIRNEWEARANDSSD GLFGAIAGFIEGGW

Glyl55

\

Serl56

UAG

Replicase

взаимодействовала с белками НАО и НА2 вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1) (результаты не показаны).

3. Характер развития вирусной инфекции при заражении растений рекомбинантными вирусами.

По сравнению с вирусом дикого типа, отличительными симптомами инфекции после агроинокуляции ТМУ-М2е-суз и ТМУ-М2е-зег являлись желтые хлорозы верхних листьев, что демонстрирует влияние слитого с БО М2е-пептида на взаимодействие вируса с хозяином. В отличие от ТМУ-М2е-суз, распространение вирусной инфекции ТМУ-М2е-8ег происходило быстрее, симптомы обнаруживались на несколько дней раньше (10 д.п.и.), а некрозы отсутствовали (рис.ЗА). Ранее было показано, что даже единичная нуклеотидная мутация в гене БО ВТМ штамма II1, приводящая к аминокислотной замене, может значительным образом влиять на симптомы вирусной инфекции (Вапецее е/ а/., 1995).

RBS

В.

6xHis

97453020-

DHFR

М2е

pQE40-M2e

Clone 2 Clone 3 pQE40

+IPTG +IPTG *'P TG

1:10,000 1:20,000 1:50,000 Antiserum to DHFR-M2e

1 = DHRR,

2 = DHFR-M2e

Рис.2. Экспрессия слитого белка DHFR-M2e в E.coli и проверка соответствующей антисыворотки (AS). А. Основные элементы плазмидной конструкции, использованной для экспрессии белка DHFR-M2e в E.coli. Обозначения: RBS - ribosome-binding site [сайт посадки рибосомы); 6xHis -участок, предназначенный для очистки на аффинной колонке Ni-NTA. В. Электрофоретический анализ белков E.coli до и после индукции с помощью IPTG (окраска по Кумасси). Анализировали три независимых клона pQE40-M2e (№ 1-3). Штамм E.coli, несущий экспрессионный вектор pQE40 и продуцирующий белок DHFR, использовали в качестве положительного контроля экспрессии. С. Вестерн блот анализ двух выделенных белков с использованием антисыворотки (Antiserum, AS) DHFR-M2e. Каждая проба представляет собой 100 нг очищенного белка. Положение белковых маркеров отмечено стрелками.

Рис.3. А. Симптомы системной вирусной инфекции, вызванной рекомбинантным вирусом TMV-M2e-ser на N. benthamiana (10 д.п.и.). В. Сравнение симптомов вирусной инфекции, вызванной TMV-M2e-ser (справа) TMV-M2e-aIa (слева) на N. benthamiana (24 д.п.и.).

Необходимо отметить существенную разницу в развитии вирусной инфекции, вызванной , TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala, отличающихся друг от друга двумя аминокислотными заменами в положениях 17 и 19 последовательности чужеродного пептида М2е. Наличие аланинов в данных позициях М2е-эпитопа приводит к значительно более мягким симптомам инфекции. В частности, инфицированные рекомбинантными вирусами растения Nicotiana benthamiana (рис.ЗВ) или Nicotiana sylvestris (рис.4В) заметно отличаются по высоте; через 10-12 д.п.и. N. benthamiana, зараженные TMV-M2e-ser, останавливаются в своем развитии, а при инфекции TMV-M2e-ala растения продолжают расти и развиваться. Можно предполагать, что рекомбинантный вирус TMV-M2e-ser, в отличие от TMV-M2e-ala, приобретает способность проникать в апикальную меристему растений за счет возможного фосфорилирования БО и/или вирусных частиц по дополнительным остаткам серина. Оба вируса также вызывают системную инфекцию у растений Nicotiana excelsior и Nicotiana clevelandii. Напротив, при заражении Datura stramonium и Chenopodium múrale наблюдали симптомы только на инокулированных листьях: у С. múrale возникала крапчатость и локальные очаги инфекции (0,5-1 мм в диаметре), а у D. stramonium -обширные желтые хлорозы и некрозы, причем меньше всего некрозов наблюдали при заражении TMV-M2e-ala.

Для сравнения инфекционности рекомбинантных вирусов TMV-M2e и ВТМ дикого типа (TMV-wt) проводили заражение растений Nicotiana glutinosa, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN, Nicotiana tabacum cv. Xanthi nc, обеспечивающих гиперчувствительный ответ на инфекцию ВТМ. Как правило, общее количество некрозов при заражении вирусом дикого типа было несколько больше, чем при инфекции рекомбинантными вирусами, хотя разницу можно, скорее всего, считать несущественной. Размеры некрозов, вызываемые как вирусом дикого типа, так и рекомбинантными вирусами TMV-M2e, в среднем варьировали от 1 до 3 мм в диаметре. В целом, анализ данных о количестве и размерах некрозов позволяет сделать вывод, что некоторые

различия в проявлениях гиперчувствительного ответа на инфекцию рекомбинантными ТМУ-М2е, а также ТМУ-и^ являются незначительными и статистически недостоверными. Аминокислотные замены в чужеродной последовательности БО-М2е (Сув^ег и Суз-А1а) не оказывают существенного влияния на межклеточный транспорт: размеры некрозов, образующихся в случае заражения всеми вариантами рекомбинантных вирусов ТМУ-М2е, незначительно отличаются друг от друга и от вируса дикого типа (ТМУ-и 1 (рис.4А).

N tobaeum cv. Xinthl nc

Рис.4. А. Гиперчувствительный ответ растений на заражение TMV-M2e-cys (левая половина листа) и TMV-wt (правая половина листа) (5 д.п.и.). В. Сравнение системных симптомов инфекции TMV-M2e-ser (слева) и TMV-M2e-ala (справа) на Nicotiana sylvestris (54 д.п.и.).

Симптомы, вызываемые рекомбинантным вирусом TMV-fp у растений Nicotiana benthamiana, заметно отличались от симптомов при заражении различными вариантами TMV-М2е: наблюдались обширные системные некрозы, а также выраженная деформация верхних листьев; некротизация затрагивала и главный стебель растения, что приводило к его «надлому» (рис.5).

Рис.5. Системные симптомы, вызванные рекомбинантным вирусом ТМАМр на N. Ьеп1Иат1апа (24 д.п.и). А) Системные некрозы; В) «Надлом» некротизированного стебля растения.

Ранее было показано, что химерные частицы, несущие на С-конце БО трансмембранные пептиды различного происхождения с высоким содержанием гидрофобных аминокислот не были

N. glutinosa

способны системно инфицировать растения Шсойапа /аЬасит (1л е/ о/., 2006). Риэюп-пептид НА вируса гриппа на 85% состоит из гидрофобных аминокислот и, принимая во внимание его функциональную роль в слиянии мембран после проникновения вируса гриппа в клетку, можно сделать вывод, что, по нашим сведениям, ТМУ-ф является первым рекомбинантным вирусом с протяженным гидрофобным чужеродным эпитопом, способным вызывать эффективную системную инфекцию растений N. ЬепЛат1апа.

4. Анализ экспрессии модифицированных БО ВТМ.

БО-М2е. Электрофоретический анализ в ПААГ экстракта системных листьев, зараженных TMV-M2e-cys, TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala с последующей окраской по Кумасси показал наличие выраженной полосы, соответствующей предполагаемому БО с М2 е-эпитопом (около 24 кДа). Вестерн блоттинг подтвердил, что белок, локализующийся в данной области, взаимодействует с антителами к БО ВТМ и М2 е (рис.6). Следовательно, можно заключить, что векторы TMV-M2e способны к репликации, ближнему и дальнему транспорту в растении и системной экспрессии модифицированного БО без потери чужеродного эпитопа.

TMV-M2e- TMV-M2e- Тми-мге-

Рис.6. Вестерн блот анализ растительных экстрактов после заражения рекомбинантными вирусами ТМУ-М2е. 1 - ТМУ-М2е-суз, - экстракт из верхних симптомных листьев, 14 д.п.и., 0.6 мг растительного материала; 2 - ТМУ-М2е-суя, экстракт инокулированных листьев, 14 д.п.и., 0.6 мг; 3 -ТМУ-М2е-эег, экстракт из симптомных системных листьев, 11 д.п.и., 0.5 мг; 4 - ТМУ-М2е-зег, экстракт из системных листьев без симптомов, 11 д.п.и., 0.55 мг; 5 - ТМУ-М2е-а1а, экстракт из симптомных системных листьев, 24 д.п.и., 0.1 мг; 6 - ТМУ-М2е-а1а, экстракт из системных листьев без симптомов, 24 д.п.и., 0.2 мг. Обозначены соответствующие рекомбинантные вирусы, Аэ СР-ТМУ - кроличья антисыворотка к БО ВТМ дикого типа; Аэ М2е - мышиная сыворотка к БНРЯ-М2е. Цифрами перед стрелками указаны молекулярные массы белковых маркеров в кДа.

Помимо зоны, соответствующей БО-М2е, при электрофорезе в ПААГ была выявлена

дополнительная полоса, приблизительно совпадающая по молекулярной массе с БО без М2е-

эпитопа - около 20 кДа. Взаимное соотношение белков, соответствующих этим полосам,

различалось в инокулированных и системных листьях. Вестерн блот анализ показал, что данная

зона взаимодействует с антителами к БО ВТМ, но не реагирует с антителами к ВНРЯ-М2е. Таким

образом, можно заключить, что эта область соответствует укороченному варианту БО без М2е-

эпитопа (рис.6). Уровень накопления модифицированного БО-М2е не зависит от способа

8

инокуляции растений (агроинфильтрация, механическое заражение препаратом выделенного вируса или экстрактом листьев инфицированных растений) (данные не показаны).

При анализе экстрактов других растений рода Nicotiana было показано, что развитие системных симптомов вирусной инфекции также сопровождается накоплением модифицированных БО в соответствующих листьях. В системных листьях растений Chenopodium múrale БО TMV-M2e-ser не был обнаружен (рис.7, дорожка 9). По приблизительным оценкам, уровень синтеза БО-М2е-а1а в Nicotiana excelsior можно сопоставить с уровнем накопления в Nicotiana benthamiana (около 5 г/кг свежего растительного материала) на день проведения анализа (рис.7, дорожки 7,8).

M1Z3456789

55—» W * Э-------

34—« щт — — —

25—» Ф ——...... mm"

20—» т

Рис.7. Электрофоретический анализ в 15% ПААГ экстрактов из листьев растений, зараженных рекомбинантными вирусами TMV-M2e. 21 д.п.и., окраска по Кумасси. Обозначения: М - белковые маркеры, цифрами перед стрелками указаны молекулярные массы в кДа; 1 - Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-ala, системный лист 2-ого яруса; 2 - Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-ala, системный лист 1-ого яруса; 3 -Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-ser, системный лист 2-ого яруса; 4 - Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-ser, системный лист 1-ого яруса; 5 - Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-cys, системный лист 2-ого яруса; 6 - Nicotiana clevelandii, заражение TMV-M2e-cys, системный лист 1-ого ярус; 7 - Nicotiana excelsior, заражение TMV-M2e-ala, системный лист 2-ого яруса; 8 - Nicotiana excelsior, заражение TMV-M2e-ala, системный лист 1-ого яруса; 9 - Chenopodium murale, заражение TMV-M2e-ser, системный лист 2-ого яруса. Ярусы системных листьев отсчитывались от инокулированного листа (0 ярус). На каждую дорожку геля наносили по 5 мг растительного материала.

БО-Гр. При анализе экстрактов листьев с различными симптомами вирусной инфекции была обнаружена фракция белка с молекулярной массой около 22 кДа, которая взаимодействовала с антителами к БО-ВТМ дикого типа и не выявлялась в отрицательном контроле (экстракт незараженного растения). Согласно подвижности в ПААГ, молекулярная масса данной белковой фракции превосходила размер БО ВТМ дикого типа на 2 кДа, что совпадает с предсказанным размером йшоп-пептида (14 аа). Как и в случае вирусов ТМУ-М2е, в каждой пробе инфицированных растительных экстрактов наблюдалась зона белка, по размеру совпадающая с БО без эпитопа (20 кДа) (рис.8). Можно заключить, что рекомбинантный вирус ТМУ^р также способен к репликации и системному транспорту в инфицированном растении. Так как модифицированный белок удалось обнаружить с помощью Вестерн блоттинга при нанесении на одну пробу большого количества растительного материала, можно сделать вывод, что, несмотря

на ярко выраженные симптомы вирусной инфекции, БО с fusion-пептидом накапливается менее эффективно, чем БО-М2е.

Вплоть до настоящего времени задача эффективной экспрессии fusion-пептида оставалась нерешенной. Следует упомянуть успешный синтез in vitro 14-ти N-концевых аминокислотных остатков fusion-пептида вируса гриппа и его последующее присоединение к белку-носителю (Chun et al., 2008). Таким образом, химерные частицы TMV-fp, полученные в настоящей работе при заражении Nicotiana benthamiana, являются первой созданной системой экспрессии fusion-пептида вируса гриппа в растениях.

Рис.8. Анализ эспрессии Ы) (р в растительных экстрактах листьев с системными симптомами вирусной инфекции ТМУ-Гр. 22 д.п.и. Сверху: Вестерн блот анализ с мышиными антителами к БО-ВТМ (АЯ СР ТМУ Снизу: Вестерн блот анализ с мышиными антителами к ОНРЯ^р (АБ ОНРИ-Гр). 1 - экстракт некротизированных листьев. 5 мг; 2 - экстракт верхних деформированных листьев, 6.25 мг (проба 1); 3 - экстракт верхних деформированных листьев, 6.25 мг (проба 2); 4 - экстракт верхних деформированных листьев, 5 мг (16 д.п.и.); -К - отрицательный контроль, экстракт незараженного растения N. ЬепМат1апа, 5 мг; К -положительный контроль - БО ВТМ, 0.4 мкг. Фигурными стрелками обозначены соответствующие фракции белков (БСМр и БО-^). Цифры у стрелок указывают молекулярные массы белковых маркеров в кДа.

AS CP TMVwt (1:5000 mouse)

5. Динамика накопления рекомбинантных вирусов ТМУ-Же-вег и ТМУ-М2е-а1а в растениях АПсойапа ЬеМкатшпа.

При исследовании динамики накопления ТМУ-М2е-зег и ТМУ-М2е-а1а было показано, что модификации БО не влияют на репликацию рекомбинантных вирусов, что подтверждается одинаковым накоплением БО-М2е в инокулированных листьях (рис.9А). Основные отличия ТМУ-\12e-ser и ТМУ-М2е-а1а были обнаружены при системной инфекции. Вирусспецифические белки эффективно накапливались в системных симптомных листьях к 12-19 д.п.и., при этом количество БО-М2е-а1а значительно превышало количество БО-М2е-зег (рис.9С). В бессимптомных листьях экспрессия модифицированного БО наблюдается на более поздних стадиях вирусной инфекции (20-22 д.п.и.) (рис.9ВД)). Кроме того, после 20 д.п.и. уровень накопления БО-М2е-зег снижается, а к 24-25 д.п.и. растение гибнет. На поздних стадиях развития вирусной инфекции высокий уровень экспрессии БО-М2е-а1а наблюдается как в симптомных, так и бессимптомных системных листьях (рис.90), при этом рост и развитие растения не нарушаются. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что две аминокислотных замены в чужеродной последовательности М2е в составе БО ВТМ существенным образом влияют не только на развитие внешних симптомов

вирусной инфекции (см.выше), но и на уровень накопления модифицированных БО. Количество БО-М2е-зег можно приблизительно оценить как 1 г/кг свежего растительного материала, а БО-М2е-а1а - как 4 г/кг свежего растительного материала.

А.

4 dpi 7 dpi 12 dpi

jL

liasepl ala ser ' lâiâ ser I К -К

Симптомные листья

8 dpi 12dpi 16dpi J__I _1_

1

3426-

I alaser 11 ala ser 1 ' ala ser l К -К

--i —

Инокулированные листья

12 dpi 16 dpi 19 dpi

I ala serl ' ala ser' ' ala ser > К -К

Листья без симптомов

Симптомные листья

Рис.9. Динамика накопления БО-М2е в растениях Nicotiana benthamiana при заражении рекомбинантными вирусами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala. Электрофоретический анализ в 15% ПААГ экстрактов инокулированных (А) и системных (В, С, D) листьев (окраска по Кумасси). На каждую дорожку гелей нанесено по 3,33 мг соответствующего растительного материала. Цифры перед стрелками указывают молекулярные массы в кДа. Обозначено: ser - TMV-M2e-ser; ala - TMV-M2e-ala; dpi - days post inoculation (дни после инокуляции); К - БО ВТМ, 1 мкг; -К - отрицательный контроль - экстракт из незараженного листа N. benthamiana. Фигурная стрелка указывает на предполагаемый БО-М2е.

6. «Конкурентоспособность» рекомбинантных вирусов TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala между собой.

Предыдущие эксперименты показали заметную разницу в развитии вирусной инфекции, вызываемой рекомбинантными вирусами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala (см.3,4). Далее проводили опыты по определению степени «конкурентноспособности» этих двух вирусо в друг с друго м Одно растение Nicotiana benthamiana одновременно заражали двумя агробактериальными культурами, кодирующими TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala. Вне зависимости от способа инокуляции растений, наблюдали характерные системные симптомы, которые варьировали даже в рамках одного растения: желтые листья, крапчатость и хлорозы, а также деформация верхних листьев (рис.10).

Рис.10. Смешанная инфекция растений 1Ч1соИапа ЬеШЬат^апа рекомбинантными вирусами ТМУ-М2е-5ег и ТМУ-М2е-а1а (32 д.п.и.). Стрелками указаны выраженные симптомы.

Для того чтобы выяснить, какой из двух рекомбинантных вирусов преобладает в верхних системных листьях, выделяли тотальную РНК из листьев с разными симптомами, которую анализировали методом обратной транскрипции с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР) с праймерами, специфичными к участкам ДНК ВТМ, фланкирующим область клонирования последовательности эпитопа. Все полученные ПЦР-продукты были секвенированы, в каждой из проб обнаружили рекомбинантные вирусы ТМУ-М2е-зег и ТМУ-М2е-а1а в разных соотношениях, при этом вируса дикого типа обнаружено не было. Анализ полученных в результате секвенирования хроматограмм показал, что пики, соответствующие триплетам серина и аланина в положениях 17 и 19 М2е-пептида накладываются друг на друга; высота пиков на хроматограмме позволяет судить о преобладании того или иного рекомбинантного вируса в пробе. Стоит отметить, что соотношение мутантных вирусов может варьировать в разных симптомных листьях: например, в пробе из хлорозных и деформированных листьев пик «в» в триплете аланина (вСТ) преобладает над пиком «С» в триплете серина (ТСТ) (рис.11В), то есть доминирует ТМУ-М2е-а1а, а в пробе из желтых листьев величины соответствующих пиков для обоих триплетов практически совпадают (рис.11А), что свидетельствует о примерно одинаковом соотношении рекомбинантных вирусов.

Таким образом, можно сделать вывод, что при совместной инфекции рекомбинантные вирусы ТМУ-М2е-5ег и ТМУ-М2е-а1а одновременно обнаруживаются в системных листьях растениях N. ЬемИат^апа, при этом ни один из мутантов не может вытеснить другой в ходе совместного заражения, а скорость их распространения по сосудистой системе растения примерно одинакова. Можно предположить, что существенная разница в уровнях накопления ТМУ-М2е-зег и ТМУ-М2е-а1а в верхних листьях (рис.9) обусловлена процессами, происходящими на стадии выхода вируса из флоэмы в клетки мезофилла.

А. т G G G G '

145 1 50 1 55 160

G G G G A G С T\GAGCAAА

145

15d

155

Tct=Gct

TctcGct

Рис.11. Хроматограммы, полученные при секвенированин продуктов ОТ-ПЦР анализа тотальной РНК, выделенной из разных листьев растений, одновременно зараженных двумя рекомбинантными вирусами ТМУ-М2е-5ег и ТМУ-М2е-а1а (смешанная инфекция). Красная рамка обозначает последовательность М2е-пептида в БО ВТМ. Желтыми рамками указаны триплеты, у которых наблюдалось наложение разных пиков (ТсС=5ег; Сс!:-а1а). А. Равное соотношение пиков. В. Преобладание одного из вариантов (в данном случае пик «в» в триплете аланина превышает пик «С» в триплете серина).

Для определения стабильности вирусных векторов в ходе инфекции, а также объяснения возможного механизма образования укороченного варианта БО без эпитопа, из полученных вирусных препаратов TMV-M2e (Cys, Ser, Ala) и TMV-fp была выделена РНК. Кроме того, из системных листьев растений, зараженных рекомбинантными вирусами, была выделена фракция тотальной РНК. Полученные препараты РНК были использованы для ОТ-ПЦР с праймерами, использованными ранее (см. раздел 6). Анализ подтвердил наличие последовательностей, кодирующих все варианты М2е-эпитопа и fusión-пептид как в геномной, так и в тотальной РНК (рис.]2). Разница в подвижности между кДНК фрагментами TMV-M2e-cys, TMV-M2e-ser, TMV-M2e-ala, TMV-fp и ВТМ дикого типа соответствует длинам последовательностей введенных эпитопов (69 нт для всех вариантов М2е-эпитогн и 42нт в случае fusion-пептида) (рис.12). Все ОТ-ПЦР продукты были выделены, очищены и секвенированы, при этом не было обнаружено ни одной мутации ни в одной из исследуемых последовательностей. Эти данные указывают на то, что все варианты вектора TMV-M2e, а также TMV-fp генетически стабильны; реверсии к дикому типу вируса не происходит. Следовательно, укороченный вариант БО, не взаимодействующий, в частности, с сывороткой к М2е, появляется в результате посттрансляционных изменений, например, протеолиза свободного белка или сформированных вирусных частиц. Повторная инфекция выделенными препаратами химерных вирусных частиц приводит к появлению таких же

7. Стабильность рекомбинантных вирусных геномов.

белковых продуктов, что и заражение растения с помощью агроинфильтрации исходной бинарной плазмидой (данные не показаны).

Рис.12. Электрофоретический анализ в 2% агарозном геле ОТ-ПЦР продуктов ТМУ-Гр. ОТ-ПЦР анализ выделенных РНК: 1 - ТМУ-Гр (РНК из вирусного препарата); 2 - ТМУ^р (тотальная РНК); 3 - ТМУ-Ш-уЛ (РНК из вирусного препарата); 4 - ТМУ-М2е-а1а (тотальная РНК). М - маркеры, цифры перед стрелками указывают молекулярные массы в нт. Фигурными стрелками указаны зоны, соответствующие кДНК ТМУ-М2е, ТМУ-Гр и ВТМ дикого типа.

10. Характеристика химерных вирусных частиц.

Наличие остатка цистеина в чужеродном пептиде, независимо от положения в аминокислотной последовательности, существенно влияло на морфологию и стабильность рекомбинантного ВТМ (Ы е/ о/., 2007). Наши исследования подтверждают данный феномен: несмотря на то, что модифицированный белок БО-М2е-суз в достаточно больших количествах обнаруживался в системных зараженных листьях Ы^соНапа ЬеМкат^апа, выделить химерные частицы ТМУ-М2е-суэ без потери эпитопа так и не удалось (рис.13, дорожка 1). В препаратах вирусных частиц ТМУ-М2е-эег и ТМУ-М2е-а1а были обнаружены два белка с электрофоретической подвижностью в ПААГ около 20 и 24 кДа; такие размеры белков соответствуют рассчитанным молекулярным массам БО-«! и БО-М2е соответственно (рис.1 ЗА, дорожки 1-3). С помощью Вестерн блот анализа вирусных препаратов было показано, что 24К белок является единственным, способным реагировать с сывороткой к М2е-пептиду. Сыворотка к БО ВТМ взаимодействовала с обоими вариантами белка (рис. 13В). Таким образом, препараты химерных вирусных частиц, выделенные из растений, зараженных рекомбинантными вирусами ТМУ-М2е-эег и ТМУ-М2е-а1а, содержат оба варианта БО: с М2е-эпитопом и без него. Минимальная доля модифицированного БО-М2е составляла около 50% (рис.1 ЗА, дорожка 2), в то время как стандартное содержание БО с эпитопом достигало 80-90% от общего количества белка в препарате (рис. 1 ЗА, дорожки 4,5). Мы не обнаружили значительной разницы между ТМУ-М2е-зег и ТМУ-М2е-а1а с точки зрения соотношения белков 24:20 кДа. Ни один из выделенных препаратов не содержал только 24 кДа белок без его укороченного варианта. Можно предполагать, что некоторое количество БО без эпитопа необходимо для эффективной сборки химерных вирионов. С другой стороны, с помощью иммуноэлектронной микроскопии было показано, что в препаратах

присутствуют отдельные вирусные частицы, которые не реагируют с первичными антителами к М2е-эпитопу (рис. 15В, см. ниже), то есть, по-видимому, содержат только укороченную форму БО. Время от времени электрофорез в ПААГ выявлял присутствие дополнительных минорных белковых продуктов, расположенных между маркерами 20 и 24 кДа (рис.13, дорожки 4,5). Наиболее вероятным объяснением их появления является частичный протеолиз М2е-пептида и/или С-концевых аминокислотных остатков БО ВТМ (аа 156-159 для использованного в данной работе изолята ТМУ-Ц1).

Рис.13. Характеристика белков в препаратах химерных вирусных частиц TMV-M2e, выделенных из системных листьев N. benthamiana. А. Электрофоретический анализ в 15% ПААГ препаратов химерных вирусных частиц (окраска по Кумасси). В. Вестерн блот анализ выделенных препаратов химерных вирионов с соответствующими сыворотками к БО ВТМ дикого типа (кроличья антисыворотка CP TMV) и М2е-эпитопу (мышиная антисыворотка к DHFR-M2e). Сверху приведены названия препаратов соответствующих химерных вирионов. Цифры со стрелками указывают молекулярные массы белковых маркеров в кДа.

11. Электронная микроскопия химерных вирусных частиц.

Для вектора, созданного на основе полноразмерного генома ВТМ, существуют ограничения в размере вставки последовательности в ген БО, что затрудняет использование БО для экспрессии длинных пептидов (Beach et al., 1996; Wu et al., 2003). Длина М2е-пептида (23 аа) превышает ранее утверждавшийся предел размера вставляемой чужеродной последовательности (20 аа) в изначальную ОРТ БО ВТМ без С-концевых делеций или использования дополнительных пептидных линкеров (Jiang et al., 2006; Werner et al., 2006; Wu et al., 2003). Насколько нам известно, M2e-ser и M2e-ala являются самыми длинными чужеродными пептидами, экспрессированными в растениях с использованием исходной последовательности поверхностной петли БО 155/156 (154/155 для некоторых изолятов ВТМ) и вектора на основе ВТМ. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии было показано, что все химерные вирионы ВТМ, несущие на своей поверхности как эпитоп из 14 аа (fusion-пептид) (рис.14), так и состоящий из 23 аа М2е-антиген (рис.15), не отличались по морфологии от ВТМ дикого типа, что говорит об отсутствии проблем при сборке химерных вирусных частиц.

Рис.14. Электронные микрофотографии препарата вирусных частиц ТМУ-ф. А. Увеличение 100,000 раз. В. Увеличение 60,000 раз. Масштаб линейки указан в верхнем левом углу. Контрастирование с использованием 1,5% фосфовольфрамовой кислоты.

Исходя из данных иммуноэлектронной микроскопии, не удалось оценить распределение и количество М2е-эпитопа на поверхности вирионов TMV-M2e-cys в растительных экстрактах, так как слой первичных антител к М2е-пептиду на поверхности частиц был неравномерным, взаимодействие носило частичный характер, что подтверждалось небольшим содержанием вторичных антител, коньюгированных с золотом (данные не представлены). Это может свидетельствовать о том, что содержание субъединиц БО, несущих слитый пептид, незначительно, что подтверждают данные о возможном влиянии цистеинов в чужеродной последовательности на сборку химерных вирионов (Li et ah, 2007). При анализе препаратов TMV-M2e удалось показать, что чужеродные М2е-эпитопы равномерно расположены и плотно упакованы на поверхности химерных частиц. Оказалось возможным отличить морфологию комплексов TMV-M2e-ser и TMV-М2е-а1а с антителами друг от друга (рис. 15В,С). Комплексы TMV-M2e-ser выглядели «неряшливо», боковые поверхности были неровными и связывали большее количество фосфовольфрамовой кислоты. Предположительно, данный эффект проявляется из-за разницы в поверхностном заряде вирусных частиц TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala: дополнительные остатки серинов в М2-пептиде на поверхности вирионов TMV-M2e-ser могут быть фосфорилированы. Вирионы ВТМ дикого типа, использованные как отрицательный контроль, не взаимодействовали ни с первичными, ни со вторичными антителами (pnc.l5D).

12. Соотношение антител к эпитопу и носителю в сыворотках, полученных при иммунизации мышей химерными частицами TMV-M2e.

Иммунизацию мышей BALB/c (п=11/группа) вирусными препаратами TMV-M2e-ser или TMV-M2e-ala проводили внутрибрюшинно в присутствии неполного адьюванта Фрейнда на 0, 14, 28 дни. В качестве отрицательного контроля использовали фосфатно-буферный солевой раствор (phosphate buffered saline, PBS). Полученные данные показывают, что внутрибрюшинное введение препарата TMV-M2e-ala не влияет на массу тела животных опытной группы (различия с контрольной группой статистически не достоверны, р>0.05), что может свидетельствовать о безопасности препарата (данные не представлены).

А

В

X

Рис.15. Электронные микрофотографии препаратов вирусных частиц ТМУ-М2е с использованием антител, коньюгированных с золотом (6 нм]. Первичные антитела - к М2е-эпитопу (А5 1)Н1к М2е). А, С,

ТМУ-М2е-а1а; В. ТМУ-М2е-5ег; О. ТМУ-Ш-мЯ: (отрицательный контроль). Масштаб линейки указан в нижнем левом углу. Контрастирование с использованием 1.5% фосфовольфрамовой кислоты. Увеличение: А - 80,000 раз; В - 200,000 раз; С - 150,000 раз; Э - 100,000 раз.

Вестерн блот анализ. Сыворотки, полученные при иммунизации мышей химерными частицами ТМУ-М2е-зег и ТМУ-М2е-а1а, были использованы в Вестерн блот экспериментах для определения разницы во взаимодействии антител с экспонированными М2е-эпитопами и их носителем (БО ВТМ). Белки ИНге и ОНРК-М2е служили контролем. Три пула сыворотки, специфичной к ТМУ-М2е-зег или ТМУ-М2е-а1а, полученных после третьей (последней) иммунизации мышей, были смешаны и исследовались при разведении 1:15000. Для электрофореза в ПААГ использовали по 200 нг белков и вирусных препаратов (рис.16А). При взаимодействии сывороток с белком ОНРК-М2е был зарегистрирован интенсивный сигнал, сравнимый с сигналом при реакции с каждой из версий БО ТМУ-М2е. Оба варианта химерного белка БО-М2е эффективно взаимодействовали с соответствующими сыворотками, в то время как БО ВТМ дикого типа вызывал слабый сигнал; видимо, основная часть эпитопов носителя (БО ВТМ) в составе химерных вирионов ТМУ-М2е «спрятана» от иммунной системы за счет экспонированных на поверхности М2е-антигенов. Кроме того, частично данный эффект может быть связан с более высокой аффинностью М2е-специфических антител. Также можно предположить, что химерные частицы ТМУ-М2е-$ег и ТМУ-М2е-а1а сохраняют стабильность после инъекции, в том числе в крови и лимфоидных органах. Необходимо отметить, что слабый дополнительная сигнал,

проявляющийся при Вестерн блотгинге препарата ТМУ-М2е-а1а между 20 и 25 кДа белковыми маркерами (рис. 16А), вероятнее всего соответствует минорному белку, который выявляется при электрофорезе в ПААГ с окраской по Кумасси препарата частиц ТМУ-М2е-а1а (рис.1 ЗА, дорожка 5). Денситометрия Вестерн блотов показала, что соотношение антител к эпитопу и носителю составляет примерно 7:1 (результаты не представлены).

ии(к инн< М2е- ЦН-Р, РИРК М20-

-к М2е ¡ее -К М2е а|а

Моизе АБ Ю ТМУ-М2е-5ег

Моизе АБ № ТМУ-М2е-а1а

|| - -I

окрн ОПРР.-М:.

ОНРЯ ОНРВ-М2с Л|

Рис.16. Соотношение титров антител к эпитопу и носителю в сыворотках после иммунизации мышей химерными частицами ТМУ-М2е. А. Анализ содержания антител с помощью Вестерн блоттинга химерных вирионов и контрольных белков. Цифры перед стрелками указывают молекулярные массы белковых маркеров в кДа. В. Характеристика антител, специфичных к М2е-эпитопу и носителю (вириону ВТМ) с помощью непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). Разведение обеих сывороток к соответствующим химерным частицам (АБ ТМУ-М2е-зег и АЭ ТМУ-М2е-а1а) равно 1:15000. Показаны типичные результаты нескольких повторных экспериментов. Ось ординат указывает значения абсорбции, измеренной при 405 нм.

Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА). Сыворотки к 1МУ-М2е-8ег и ТМУ-М2е-а1а, были исследованы с помощью непрямого ИФА с целью сравнения иммунологических свойств химерных БО-М2е в нативном (ИФА) и денатурированном состоянии (Вестерн блоттинг). Белки ВНРК, Пда11-М2е, химерные вирионы ВТМ и вирус ВТМ дикого типа (по 200 нг каждого) наносились в лунки планшета для ИФА и инкубировались с мышиными сыворотками, полученными при иммунизации химерными вирусными частицами ТМУ-М2е-зег и ТМУ-М2е-а1а (рис. 16В), а также с сыворотками к ОИРЯ-М2е и к ВТМ дикого типа (использовались в качестве контролей; результаты не представлены). Все сыворотки исследовали в разведении 1:15000. Инкубацию со вторичными антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена, проводили в течение 60 мин. Уровни значений фонового (неспецифического) сигнала (антиген без первичных

18

антител) вычитались из полученных опытных значений. На рис. 16В показано, что химерные частицы эффективно реагируют с сывороткой, специфичной к соответствующим вирионам (TMV-M2e-ser или TMV-M2e-ala), а вирионы дикого типа умеренно взаимодействуют с обеими сыворотками. Соотношение TMV-M2e/TMV-wt варьировало от 2.7:1 (в случае TMV-M2e-ser) до 5:1 (в случае TMV-M2e-ala). Данные наблюдения согласуются с результатами Вестерн блот анализа (рис.16А) и подтверждаются различиями в структурах комплексов антиген-антитело, наблюдаемыми при иммуноэлектронной микроскопии (рис. 15В,С). Можно предположить, что аминокислотные остатки апанинов, расположенные на поверхности частиц TMV-M2e, обеспечивают более эффективный иммунный ответ на чужеродный пептид в составе химерных вирионов.

В предыдущих работах, описывающих химерные частицы ВТМ, за некоторыми исключениями (Fitchen et al., 1995; Коо et al., 1999), не проводили сравнения иммуногенной активности чужеродного эпитопа и ВТМ-платформы. Очевидно, что такие данные важны как с фундаментальной, так и с практической точки зрения. В частности, наши исследования показывают, что TMV-M2e-ala и TMV-M2e-ser обеспечивают выработку значительно большего количества антител, специфичных к М2е-пептиду, чем к БО ВТМ, поэтому перспективы практического применения кандидатных вакцин, основанных на химерных частицах TMV-M2e, выглядят многообещающими. В работе Palmer et al., 2006 были сформулированы несколько возможных критериев «для признания химерных частиц в качестве вакцины»: (1) более 90% субъединиц капсида должны содержать чужеродный пептид, экспонированный на поерхности химерных вирионов; (2) чистота вирусного препарата должна превышать 95%. В дополнение, мы предлагаем принимать во внимание сравнение иммуногенной активности эпитопа и носителя с помощью Вестерн блоттинга и/или иммуноферментного анализа (ИФА) (предположительно, приемлемое соотношение должно превышать 1:1).

13. Иммуногенность TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala.

Уже на 28 день после иммунизации мышей частицами TMV-M2e-ala было показано интенсивное взаимодействие М2е-специфичных IgG с гомологичной последовательностью синтетического М2е-пептида (G-18; совпадает с последовательностью М2е A/PR/8/34 (H1N1)), уровень которого был значительно выше, чем у мышей, иммунизированных с TMV-M2e-ser (р<0.05) (рис.17А). На 28 и 42 день взаимодействие IgG к М2е с гетерологичной последовательностью другого синтетического М2е-пептида (G-26, 4 аа замены; соответствует последовательности М2е A/California/04/09 (H1N1)) было в 4 и 1.5 раз слабее у мышей, иммунизированных с TMV-M2e-ser, ив 10 и 3 раза слабее у мышей, иммунизированных с TMV-М2е-а1а (рис. 17В).

А

■ TMV-M2e-ser BTMV-MZe-ala

В

И TMV-M2e-ser lTMV-M2e-ala

600000 500000 ï 400000 м 300000 200000 100000 о

post first boost post second boost 1_1

p 0.05

post first boost post second boost

I IgGl

I lgG2a

Day 211

600000 sooooo

400000 300000 200000 100000

li

TMV-M2e-ser TMV-M2e-ala

p 0.05

Reciprocal Serum Dilution

Рис.17. Иммуиогенность химерных вирусных частиц TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala. Мыши BALB/c (п=11/группа) были иммунизированы внутрибрюшинно на 0, 14, 28 дни инъекцией 50 мкг вирусных препаратов TMV-M2e-ser или TMV-M2e-ala. PBS буфер служил в качестве отрицательного контроля. Через две недели после второй и третьей иммунизаций титры М2е-специфических IgG оценивались методом ИФА с использованием синтетических пептидов G-18 (A) G-26 (В). Титры специфических IgG к М2е-пептиду составляли 1:200 в контрольной группе мышей (иммунизация с FBS). Представлены средние величины из четырех пулов сыворотки в каждой группе. (С) Анализ субклассов IgG, специфических к М2е-эпитопу, против G-18 в сыворотках мышей, иммунизированных TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala методом ИФА, через две недели после третьей иммунизации. Представлены средние величины из четырех пулов сыворотки в каждой группе. (D) Продолжительность иммунного ответа. Содержание IgG в М2е-специфической сыворотке, полученной при иммунизации группы мышей с TMV-M2e-ala, определялось по взаимодействию с G-18 на 42, 176 и 211 дни после третьей (последней) иммунизации. Необходимо отметить, что линии графика для 176 и 211 дней перекрываются по ходу серий разведений.

Кроме того, исследовали профили субклассов М2е-специфичных IgG у мышей после третьей иммунизации химерными вирионами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala (рис.17С). Сравнимые уровни IgGl и IgG2a наблюдали у мышей, иммунизированных с TMV-M2e-ser (IgGl/IgG2a = 0.7, достоверность р<0.05). Уровень иммуноглобулинов субкласса IgGl в сыворотке был заметно выше уровня IgG2a у мышей, иммунизированных с TMV-M2e-ala (IgGl/IgG2a = 3.2). Титры IgGl у мышей при иммунизации химерными вирионами TMV-M2e-ala были примерно в 4 раза выше,

чем у мышей, иммунизированных вирусным препаратом TMV-M2e-ser, при этом титры иммуноглобулинов субкласса IgG2a были практически одинаковыми. Наши результаты демонстрируют незначительное снижение уровня М2е-специфических IgG на протяжении семимесячного периода наблюдения (рис.170).

14. Взаимодействие сывороток, полученных при иммунизации мышей химерными частицами TMV-M2e, с белком М2 на поверхности эпителиальных клеток, зараженных вирусом гриппа.

Анти-М2е антитела, образующиеся при иммунизации мышей препаратами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala, эффективно связываются с синтетическим пептидом, соответствующим консенсусной человеческой последовательности М2е (G-18). Для того чтобы определить, способны ли такие антитела распознавать тетрамер белка М2 в ходе природной инфекции, был использован метод ИФА целых эпителиальных клеток Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), зараженных вирусом гриппа A/PR/8/34 (H1N1).

л В

10 100 1000 10000 юоооо Serum Dilution

10 100 1000 10000 100000 Serum Dilution

Рис.18. Распознавание эпителиальных клеток MDCK, зараженных вирусом гриппа, сывороткой мышей, полученной после иммунизации TMV-M2e-ser (А) и TMV-M2e-ala (В). Линия PBS на графике подразумевает контрольную группу мышей, иммунизированных внутрибрюшинно буфером PBS. Через две недели после третьей иммунизации сыворотка была проверена на способность к связыванию с незараженными (контроль) и инфицированными вирусом A/PR/8/34 клетками MDCK in vitro. Результаты представлены как разница в измерениях OD4so при ИФА целых клеток (инфицированные клетки минус контрольные).

Сыворотки к TMV-M2e-ser (рис.18А) и TMV-M2e-ala (рис.18В) специфично взаимодействовали с инфицированными клетками, при этом не связываясь с клетками, инокулированными буфером PBS (отрицательный контроль). Таким образом, можно заключить, что антитела к М2е, полученные при иммунизации мышей рекомбинантными вирусами TMV-

М2е-вег и ТМУ-М2е-а1а, способны распознавать как линейный синтетический М2е-пептид, так и нативный тетрамерный М2е-эпитоп, расположенный на поверхности клеток млекопитающих, зараженных вирусом гриппа.

15. Протективное действие кандидатных вакцин ТМУ-М2е-8ег и ТМУ-М2е-а1а при заражении мышей гомологичным и гетерологичным штаммами вируса гриппа А.

Для изучения протективных свойств кандидатных рекомбинантных вакцин ТМУ-М2е были использованы модели сублетальной (11Л5/5о) и летальной (5ЬБ/5о) гриппозной инфекции. Как видно из рис.19А, все мыши (100%), иммунизированные ТМУ-М2е-зег, выжили при заражении 11Х>/5о гомологичного вируса гриппа А/РК/8/34 (Н11М1) и 90% животных выжило после заражения 51ЛЭ/50 этого же вируса (различия мышей опытной группы с контрольными животными были достоверными, р<0.05). Полученные результаты демонстрируют, что у иммунизированных мышей наблюдались значительно более слабые симптомы заболевания и меньшая потеря массы тела, чем у мышей в контрольной группе (р<0.05) (данные не представлены).

В

-TMV-M2e-ser 1LD —TMV-M2e-ser 5LD -PBS1LD ~О—PBS5LD

-ТМУ-М2е-а1з 110

- TMV-M2e-ala 5LD -PBS1LD

20 О

□ □□□□ оооооо

2 4 6 8 10 12 14 Days post challenge

120 100 •Я 80 | 60 S5 40 20 0

0123456789 1011121314 Days post challenge

Рис.19. Эффективность иммунизации мышей частицами ТМУ М2емт (А) и ТМУ-М2е-а1а (В) при заражении гомологичным вирусом гриппа А/Р11/8/34 (Н1М). Мыши ВАЬВ/с (п=11/группа) были иммунизированы 50 мкг ТМУ-М2е-5ег на 0, 14, 28 дни. На 42 день иммунизированные мыши интраназально заражались 1Ю/5о и 5ЬО/бо дозами вируса гриппа А/РЯ/8/34 (НШЦ. Динамика гибели мышей (по оси ординат - % выживших мышей, по оси абсцисс - дни наблюдения); процент выживших животных в опытных группах был значительно выше, чем в контрольных (р<0.05).

При заражении гомологичным вирусом гриппа А/РЯ/8/34 (НШ1) мышей, иммунизированных рекомбинантным ТМУ-М2е-а1а, были получены сходные результаты (рис. 19В). Процент выживших мышей при заражении 1ЬО/50 дозой гомологичного вируса гриппа составил 100%, в то время как при заражении 51Х>/5о гетерологичного вируса гриппа выжило 84% мышей. Данные результаты демонстрируют высокую степень выживаемости иммунизированных мышей по сравнению с контрольными животными (р<0.05). Мыши, иммунизированные

рекомбинантным TMV-M2e-ala, также проявляют значительно более слабые клинические симптомы заболевания и меньшую потерю массы тела при заражении ILD/50 дозой вируса по сравнению с контрольной группой (р<0.05), однако, различия в потере веса и проявлении симптомов заболевания после заражения дозой 5LD/so дозой вируса были статистически недостоверными (р>0.05) (данные не представлены). Это может быть связано с преобладанием IgGl иммунного ответа, который является менее эффективным, чем IgG2a иммунный ответ при антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC).

Несмотря на существенные различия в последовательностях человеческого консенсусного М2е и М2е-пептида вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1) (4 аминокислотных остатка из 23, без учета двух замен цистеинов), заражение дозой 5LD/50 гетерологичного вируса гриппа показало, что у вакцинированных мышей наблюдается высокий уровень защиты против инфекции при иммунизации кандидатными вакцинами TMV-M2e-ser (46% выживаемости) и особенно TMV-М2е-а1а (70% выживаемости) (рис.20). Различия в процентах выживаемости иммунизированных животных и контрольной группы были статистически достоверными (р<0.05), чего нельзя сказать о разнице в потере веса мышей (данные не представлены).

В.

-TMV-M2e-ser5LD •

120 100 -80

□ □ □ □ □ □ □

- TMV-M2e-ala 5LD

-PBS5LD

120 100 80 60 40 20 0

14

—!-1---1-1-1-Г-!-Г—!-i-1-S-1-1-i

0 2 4 6 8 10 12 14

Days post challenge

0 2 4 6 8 10 12

Days post challenge

Рис.20. Эффективность иммунизации мышей частицами TMV-M2-ser (А) и TMV-M2e-ala (В) при заражении гетерологичным вирусом гриппа A/California/04/09 (H1N1). Мыши BALB/c были иммунизированы 50 мкг TMV-M2e-ser или TMV-M2e-ala на 0,14, 28 дни. На 42 день иммунизированные мыши интраназально заражались дозой 5LD/so вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1). Динамика гибели мышей (по оси ординат - % выживших мышей, по оси абсцисс - дни наблюдения); процент выживших животных в опытных группах был значительно выше, чем в контрольных (р<0.05).

Выводы

1. Получены рекомбинантные вирусы TMV-M2e-cys, TMV-M2e-ser, TMV-M2e-ala и TMV-fp, несущие в гене белка оболочки (БО) последовательности консервативных антигенов М2 белка (М2е) и гемагглютинина (fp) вируса гриппа А. Вирусы TMV-M2e отличаются друг от друга заменами аминокислотных остатков цистеина в положениях 17 и 19 на остатки серина или апанина, соответственно. Доказана системная экспрессия данных антигенов в растениях Nicotiana benthamiana, Nicotiana excelsior, Nicotiana sylvestris, Nicotiana clevelandii.

2. В экспериментах на растениях, обеспечивающих гиперчувствительный ответ на заражение вирусом табачной мозаики (ВТМ), было показано, что модификация гена БО за счет различных вариантов М2е не влияет на межклеточный транспорт рекомбинантных вирусов.

3. Накопление БО-М2е-а1а в растениях Nicotiana benthamiana (>4 г/кг верхних листьев) превышает содержание EO-M2e-ser (>1 г/кг) без нарушения роста и развития растений. При совместной инфекции оба вируса одновременно обнаруживаются в системных листьях.

4. Доказана генетическая стабильность рекомбинантных вирусов TMV-M2e-cys, TMV-M2e-ser, TMV-M2e-ala и TMV-fp.

5. Химерные вирусные частицы TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala состоят из двух структурных белков, содержание БО с эпитопом достигает 90% от общего количества белка.

6. Вирионы TMV-M2e и TMV-fp представляют собой жесткие палочковидные структуры. Методом иммуноэлектронной микроскопии было показано, что М2е-эпитоп в составе химерных частиц равномерно распределен на поверхности вирионов, при этом морфология комплексов TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala с антителами отличалась друг от друга.

7. Показана высокая иммуногенность химерных вирионов TMV-M2e-ser и TMV-M2e-ala. Профили субклассов иммуноглобулинов существенно отличались: для TMV-M2e-ser соотношение IgGl/IgG2a составляло 0.7; для TMV-M2e-ala IgGl/IgG2a - 3.2. Высокий уровень титра специфических иммуноглобулинов у мышей, иммунизированных TMV-M2e-ala, сохранялся в течение 7 месяцев. Обе сыворотки взаимодействуют с белком М2 на поверхности эпителиальных клеток, зараженных вирусом гриппа А.

8. Количество антител, специфичных к М2е-эпитопу, значительно превышает содержание антител к носителю (частицы ВТМ). Соотношение TMV-M2e-ser/TMV-wt равно 2.7:1, a TMV-M2e-ala/TMV-wt — 5:1.

9. Мыши, вакцинированные частицами TMV-M2e-ser и TMV-M2e-aIa, были устойчивы к заражению пятью летальными дозами (5LDso) гомологичного вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1). При инфекции 5LD50 гетерологичного вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1) (четыре аминокислотных замены в последовательности М2е без учета мутаций цистеинов) уровни выживаемости мышей составляли 46% и 70%, соответственно.

24

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Petukhova N.V., Gasanova T.V., Stepanova L.A., Rusova O.A., Potapchuk M.V., Korotkov A.V., Skurat E.V., Tsybalova L.M., Kiselev O.I., Ivanov P.A. and Atabekov J.G. Immunogenicity and protective efficacy of candidate universal influenza A nanovaccines produced in plants by tobacco mosaic virus-based vectors. // Current Pharmaceutical Design. 2013. V. 19. E-pub Feb 1; doi: 10.2174/13816128113199990337. P. 1-14.

2. Петухова H.B., Иванов П.А., Мигунов А.И. Вирусоподобные частицы - новая стратегия для создания противогриппозных вакцин. // Вопросы вирусологии. 2013. Т.58. №2. С. 10-15.

3. Иванов П.А., Гасанова Т.В., Петухова Н.В. Получение кандидатных универсальных противогриппозных вакцин на основе химерных частиц вируса табачной мозаики. // Юбилейная научная конференция «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» к 45-летию НИИ гриппа. Санкт-Петербург. Россия. 2012. С. 4.

4. Stepanova L., Potapchuk М., Kupriyanov V., Kotlyarov R., Petukhova N., Ivanov P., Rusova O., Repko I., Korotkov A., Tsybalova L. Candidate M2e-based vaccines against human and avian influenza viruses, produced in plant: immune response and protection. // The 4th ESWI Influenza Conference. Malta. Section SPA2 "Vaccines: Current and novel approaches", 2011. A203P.

5. Petukhova N., Gasanova Т., Skurat E., Ivanov P., Atabekov J. Modifications of conservative Influenza antigen expressed on the surface of chimeric virions do not affect the immunogenic properties of epitopes but dramatically increase their production by plant viral vector. // 36th FEBS Congress "Biochemistry for Tomorrow's Medicine". Torino. Italy. FEBS Journal. 2011. V. 278. Supplement 1. P. 161.

6. Petukhova N.V., Gasanova T.V., Skurat E.V., Ivanov P.A., Atabekov J.G. Systemic expression of Influenza epitope in plants on the surface of chimeric nanoparticles of tobacco mosaic virus. // III International Forum "Rusnanotech - 2010". Moscow. Russia. 2010. З-7-Nanobiotechnology, f29, P.l-3.

7. Петухова H.B., Гасанова T.B., Скурат E.B., Иванов П.А., Атабеков И.Г. Системная экспрессия М2е-эпитопа вируса гриппа в растениях в составе химерных вирионов на основе ВТМ. // Сборник статей по материалам международной конференции «Биотехнология, нанотехнология и физико-химическая биология». Алма-Ата. Казахстан. 2010. С.76-78.

Заказ № 92-П/04/2013 Подписано в печать 22.04.2013 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 1,2

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петухова, Наталья Витальевна, Москва

Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова Биологический факультет, кафедра вирусологии

На правах рукописи

04201356624

Петухова Наталья Витальевна

Экспрессия консервативных антигенов вируса гриппа А в растениях на поверхности химерных частиц ВТМ: иммуногенные и протективные свойства кандидатных вакцин.

вирусология - 03.02.02.

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук

ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук-Иванов Петр Алексеевич

Москва, 2013 год

Содержание:

Список сокращений.............................................................................................5

Введение...............................................................................................................7

Глава Т. Химерные частицы ВТМ как основа для создания «универсальной» вакцины против вируса гриппа А (обзор литературы).............................................12

Грипп: прошлое, настоящее, будущее.....................................................................12

Вирус гриппа: структура и морфология........................................................................................13

Антигенная вариабельность и эволюция вируса гриппа А.........................................................17

Молекулярные детерминанты патогенности вируса гриппа А.................................................20

Иммунный ответ на гриппозную инфекцию................................................................................24

Вакцины для контроля и профилактики вируса гриппа А.........................................................27

Новые технологии производства противогриппозных вакцин...................................................29

Промежуточные подходы к улучшению существующих вакцин..............................................29

Вакцины нового поколения против вируса гриппа.....................................................................31

«Универсальная» вакцина против вируса гриппа.......................................................................38

Консервативные эпитопы гемагглютинина вируса гриппа А...................................................39

Эктодомен белка М2 вируса гриппа А (М2е-эпитоп)................................................................43

Химерные вирионы в биотехнологии растений.........................................................................47

Основные принципы создания химерных вирусных частиц....................................................50

Химерные частицы вируса табачной мозаики (ВТМ)...............................................................52

Глава 2. Материалы и методы.................................................................................................57

Реактивы........................................................................................................................................57

Методы исследования......................................................................................57

Экспрессия белка в E.coli при помощи микроиндукции..........................................................57

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)........................................................................................58

ПЦР с перекрывающимися фрагментами..................................................................................59

Конструирование субклонов для вирусных векторов и оптимизация нуклеотидных последователь н ос тей э п и го п ов................................................................................................................59

Клонирование рекомбинантных вирусных векторов TMV-M2e............................................62

Клонирование рекомбинантного вирусного вектора TMV-fp................................................64

Выделение и анализ плазмидпой ДНК......................................................................................64

Выделение плазмидпой ДНК......................................................................................................64

Электрофорез в агарозном геле..................................................................................................65

Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами...........................................................65

Цитирование ДНК........................................................................................................................66

Агроинфильтрация растений......................................................................................................66

Условия выращивания экспериментальных растений.............................................................66

Трансформация клеток Agrohacterhim tumefaciens..................................................66

Агроиифильтрация листьев Nicotiana benthamiana..................................................67

Выделение и анализ белков...............................................................................67

Выделение белков из растений..........................................................................67

Электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле

(ПААГ).........................................................................................................67

Веетерн-блот анализ.......................................................................................67

Выделение препарата вируса.............................................................................68

Электронная микроскопия...............................................................................69

Использование антител, коньюгированных с золотом............................................70

Анализ РНК из вирусных частиц и зараженных растений........................................70

Выделение РНК методом фенольной депротеинизации вирусных частиц....................70

Выделение тотальной РНК из листьев растений...................................................70

Обратная транскрипция и ПЦР-анализ................................................................71

Изучение «конкурентоспособности» рекомбинантных вирусов TMV-M2e-ser

и TMV-M2e-ala..............................................................................................71

Определение круга хозяев рекомбинантных вирусов TMV-M2e................................72

Метод непрямого иммуноферменгного анализа (ИФА)...........................................72

Имунизация животных...................................................................................73

Синтетические пептиды.................................................................................73

Определение титров специфических сывороточных антител к синтетическим

пептидам М2е..............................................................................................74

Взаимодействие антител с белком М2 на поверхности эпителиальных клеток............................................................................................................74

Определение репродукции вируса в легких мышей...............................................75

Вирусы гриппа А и заражение мышей...............................................................75

Статистическая обработка данных....................................................................76

Глава 3. Результаты....................................................................................77

Создание экспериментальной системы презентации М2е-эиитопа и fusion-пептида в составе

генома TMV-U1...........................................................................................77

Экспрессия слитых белков DHFR-M2e и DHFR-fp в Е. coli и получение соответствующих антисывороток................................................................................................78

Клонирование РНК 7 (М) вируса гриппа А в бинарный вектор для экспрессии в растениях....................................................................................................80

Характер развития вирусной инфекции при заражении растений Ик-оИапа Ьемкат'шпа ре-

комбинантными вирусами..................................................................................83

Анализ экспрессии модифицированного БО ВТМ..................................................88

Анализ экспрессии БО ВТМ, содержащего М2е-эпитоп вируса гриппа А.....................88

Анализ экспрессии БО ВТМ. содержащего И^юп-пептид вируса гриппа А (БО-Гр)..........93

Динамика накопления рекомбинантных вирусов ТМУ-М2е-8ег и ТМУ-М2е-а1а в растениях

ШсоНапа Ьеп/Ьаппапа..................................................................................................95

Анализ развития инфекции рекомбинантных вирусов ТМУ-М2е в растениях, обеспечивающих гиперчувствительный ответ.........................................................................96

Анализ крута растений-хозяев, у которых рекомбинантные вирусы ТМУ-М2с вызывают

системную инфекцию......................................................................................99

«Конкурентоспособность» рекомбинантных вирусов ТМУ-М2е-$ег и ТМУ-М2е-а1а между

собой..........................................................................................................103

Стабильность рекомбинантных вирусных геномов.................................................105

Характеристика химерных вирусных частиц.........................................................107

Электронная микроскопия химерных вирусных частиц...........................................110

Соотношение антител к эпитопу (М2е) и носителю (БО ВТМ) в сыворотке, полученной при

иммунизации мышей химерными частицами ТМУ-М2е..........................................113

Иммуногенность ТМУ-М2е-8ег и ТМУ-М2е-а1а для мышей......................................116

Взаимодействие сывороток, полученных при иммунизации мышей химерными частицами ТМУ-М2е, с белком М2 на поверхности эпителиальных клеток, зараженных

вирусом гриппа.............................................................................................117

Определение репродукции вируса в легких мышей, иммунизированных ТМУ-М2е-Бег и

ТМУ-М2е-а1а................................................................................................118

Протективное действие кандидатных вакцин ТМУ-М2е-зег и ТМУ-М2е-а1а при заражении

мышей гомологичным и гетерологичным вирусами гриппа А...................................119

Глава 4. Обсуждение результатов....................................................................123

Выводы.......................................................................................................133

Список литературы........................................................................................136

Список сокращений:

ADCC - antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (антитело-зависимая клеточная цитоток-

сичность)

АТР - аденозинтрифосфат

CMV - Cucumber mosaic virus (вирус мозаики огурца)

CPMV - cowpea mosaic virus (вирус мозаики коровьего горошка)

CPV - canine parvovirus (парвовирус собак)

CVP - chimeric virus particle (химерная вирусная частица)

DHFR - dihydrofolate reductase (дигидрофолатредуктаза)

FMDV - foot- and- mouth disease virus (вирус ящура)

fp - fusion-пептид (пептид слияния вируса гриппа)

gp - glycoprotein (гликопротеин)

НА - hemagglutinin (гемагглютинин вируса гриппа )

HBcAg - hepatitis В core protein (коровый белок вируса гепатита В)

HIV - human immunodeficiency virus (вирус иммунодефицита человека)

HPV - human papillomavirus (вирус папилломы человека)

IFN-y - интерферон-у

lg — иммуноглобулин

IL - интерлейкин

JGM V - Johnson grass mosaic virus

M1 - матриксный белок вируса гриппа

М2 - внутренний мембранный белок вируса гриппа

М2е - М2 external domain (экгодомен белка М2 вируса гриппа (М2е-эпитоп))

МНС 1 // МНС 11 - major histocompatibility complex (молекулы главного комплекса гистосов-

местимости)

NA - neuraminidase (нейраминидаза вируса гриппа)

NK - natural killers (натуральные киллеры)

NP - nonstructural protein (неструктурный белок вируса гриппа)

PapMV - papaya mosaic virus (вирус мозаики папайи)

PPV - plum pox virus (вирус шарки сливы)

PVX - potato virus X (X вирус картофеля)

TBSV - tomato bushy stunt virus (вирус карликовой кустистости томатов)

ThO - предшественник лимфоцита Т-хэлпера (T-helper)

TMV - tobacco mosaic virus (вирус табачной мозаики)

TVCV - turnip vein- clearing virus (вирус просветления жилок турнепса)

АГ - аппарат Гольджи

АПК - антиген-презентирующие клетки

БО - белок оболочки

ВТМ - вирус табачной мозаики

Д.п.и. - день после инокуляции

кДа - килоДальтоны

ит - нуклеотид

НТО - нетранслируемая область

ОРТ - открытая рамка трансляции

сгРНК - субгеномная РНК

ТБ - транспортный белок

тРНК - транспортная РНК

ХВК - X вирус картофеля

ЦТЛ - цитоксический Т-лимфоцит

шЭР - шероховатый эндоплазматический ретикулум

ВВЕДЕНИЕ.

Несмотря на наличие большого количества разнообразных противовирусных препаратов и профилактических вакцин, вирус гриппа остается одним из наиболее опасных респираторных заболеваний человека и животных. Сезонные штаммы вируса гриппа А (в настоящее время это H1N1, H3N2) и вируса гриппа В ускользают от иммунной системы за счет постоянно меняющейся структуры иммуногенных поверхностных белков гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Сезонный грипп вызывает около 600 миллионов заболеваний человека и 400 тысяч смертей каждый год. Еще более усложняет ситуацию то. что штаммы вируса гриппа, содержащие 16 различных антигенных субтипов НА (Hl - Н16) и 9 антигенных суб-тииов NA (N1-N9), циркулируют по всей планете в диких водоплавающих птицах (в меньшей степени присутствуют у свиней и лошадей). Реассортация человеческих, птичьих и свинных штаммов может дать начало новой пандемии, то есть всегда существует риск возникновения абсолютно новых, ранее не существовавших штаммов вируса гриппа А. Таковой была пандемия 1918 года («Испанка»), которая унесла, по разным оценкам, от 20 до 50 миллионов человеческих жизней во всем мире (Russell, 2012).

Вакцинация является единственным научно обоснованным, эффективным и безопасным способом массовой профилактики против гриппа (Киселев и др., 2012). Существующие в настоящее время вакцины индуцируют протективный иммунный ответ против сезонных и близкородственных антигенных штаммов, но не защищают от новых разновидностей сезонных штаммов вируса гриппа А. Большинство коммерческих вакцин содержит НА (гемагглю-тинин) и NA (нейраминидазу) в качестве защитных антигенов. Эти гликопротеины являются высоко иммуногенными, но, одновременно, и высоко вариабельными, что обусловлено дрейфом геном между различными штаммами. Поэтому поиски «Священного Грааля» (Rudolph and Ben-Yedidia, 2011) в изучении вируса гриппа сосредоточены на разработке «универсальной» вакцины широкого спектра действия, содержащей консервативные вирусные антигены. Такими перспективными кандидатными белками вируса считаются М2, НА2, Ml и NP (Stanekova and Vareckova, 2010).

В последнее время при создании противогриппозных вакцин нового поколения наибольшее внимание уделяется эктодомену минорного поверхностного белка М2 вируса гриппа (М2е) в качестве основного элемента «универсальной» вакцины. Как правило, белок М2 содержится в количестве 16-84 субъединиц на один вирион гриппа А и формирует тет-рамерные ионные каналы вириона. Отличительными особенностями М2е являются высокая консервативность его аминокислотной последовательности и достаточно низкая иммуноген-ность в процессе природной инфекции; антитела к М2е практически не обнаруживаются в

человеческой сыворотке (Feng et al, 2006). Последовательность M2e остается практически неизменной у всех изолятов вируса гриппа человека, известных с 1933 года. В последнее время было установлено, что антитела к М2е обеспечивают защиту против субтипов вируса гриппа со сходной последовательностью пептида (Ito et al, 1991; Mozdzanovska et al, 1999; Neirynck et al, 1999; Fan et al, 2004). В настоящее время разрабатывается множество различных стратегий для эффективной продукции М2е-пептида и увеличения его иммуногенности: экспрессия полноразмерного белка М2 (Slepushkin et al, 1995) или М2-содержащих гриппозных вирусоподобных частиц (ВПЧ) в бакуловирусной системе (Latham and Galarza, 2001; Matassov et al., 2007; Song et al., 2011); ДНК-вакцины (Tompkins et al., 2007: Park et al., 2011;); синтетические мульти-антигенные пептиды, включающие последовательность М2е (Mozdzanovska et al., 2003; Wolfe/ al., 2011); М2е-пеитид, слитый с иммуногенным белком-носителем, экспрессированным в Escherichia coli (Huleatt et а/., 2008: Turley et al., 2011). ВПЧ «негриппозного» происхождения, несущие на своей поверхности М2с (Fiers et al., 2004; De Filetie et al.. 2005; De Filetie et al., 2006; Bessa et al, 2008; Ameiss et al.. 2010; Matic et al.. 2011; Ravin et al, 2012). I фаза клинических испытаний вакцины на основе М2е доказала ее безопасность и иммуногенность для человека (Fiers et al., 2009; Du et al., 2010; Ebrahimi et al, 2011; Rudolph and Ben-Yedidia, 2011).

Существующие противогриппозные вакцины обеспечивают сильный защитный иммунитет человека (Gross et al, 1995; Gerhard et al., 2006; Regoes et al, 2006). Однако, нейтрализующие антитела, которые они индуцируют, по большей части штаммо-специфичные (Epstein et al, 2005; Gerhard et al., 2006;). Основное количество протективных антител вырабатывается на высоко вариабельные иммунодоминантные области рецептор-связывающего домена НА, поэтому данные антитела не способны вызывать гетеросубтипичный иммунитет (Gerhard et al, 2006; Sui et al, 2009). Всегда считалось, что подобный иммунитет, в основном, опосредован действием кросс-реактивных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) (Rimmelzwaan et al, 2007), мишенью которых являются консервативные эпитопы внутриви-рионных белков, таких как нуклеопротеин (NP) и матриксный белок (М) (Gerhard et al, 2006; Epstein, 2003; Epstein, 2005): при этом уже достаточно давно были известны кросс-рективные антитела к НА (Russ et al, 1987: Sanchez-Fauquier et al, 1987; Sanchez-Fauquier et al, 1991); однако, у большинства этих антител отсутствовала нейтрализующая активность. Недавно были обнаружены нейтрализующие антитела, обладающие реактивностью против штаммов группы 1 вируса гриппа, и узнающиеся конформационные эпитопы, включающие аминокислотные остатки (аа), как минимум, трех отдельных локусов НА: HAI, НА2 и так называемого «пептид слияния» (fusion peptide, fp) на N-конце субъединицы НА2 (Sui et al. 2009; Ekiert et al, 2009). Недавно было показано, что такие нейтрализующие антитела широкого спектра

действия образовывались при иммунизации НА некоторых приматов (Wei et al., 2010), что позволяет предполагать возможность индукции таких «универсальных» антител у человека.

Высоким консерватизмом отличаются 14 аа пептида-слияния (fusion-пептид) (Chun et ai, 2008; Hashem et al., 2010), расположенный в N-терминальной части домена НА2 ге-маплютинина, который в кислой среде (рН<7) обеспечивает прикрепление вируса к мембране эндосомы клетки и проникновение нуклеопротеина из эндосом в цитоплазму (Cross et al., 2009). Было показано, что моноклональные антитела к fusion-пептиду могут взаимодействовать практически со всеми вирусными НА (Li et al., 2010), а также способны распознавать НА, ассоциированный с другими вирусными белками и ингибировать вирус гриппа при инфекции культуры клеток млекопитающих (Hashem et al., 2010). Кроме того, fusion-пептид, коньюгированный с белковым носителем, является достаточно иммуногенным, чтобы обеспечить защиту мышей от смертельных доз вирусов гриппа А и В (Adar et al, 2009; Bianchi et al., 2005; Prabhu et al., 2009). Таким образом, использование данного антигена может быть перспективным направлением для создания на его основе «универсальной» вакцины противогриппозной вакцины.

Генно-инженерные технологии являются эффективным методом производства фармакологически важных белков и ферментов, в том числе для разработки качественных и безопасных вакцин (Lico et al., 2008). Существующие на данный момент экспрессионные си