Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование вирусоподобных частиц на основе корового белка вируса гепатита B и M2 белка вируса гриппа как основы новых противогриппозных вакцин

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование вирусоподобных частиц на основе корового белка вируса гепатита B и M2 белка вируса гриппа как основы новых противогриппозных вакцин"

005537841

На правах рукописи

Блохина Елена Александровна

Конструирование вирусоподобных частиц на основе корового белка вируса гепатита В и М2 белка вируса гриппа как основы новых противогриппозных вакцин

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискаїше ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2013

1 4 НОЯ ^

005537841

Работа выполнена в лаборатории систем молекулярного клонирования Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Куприянов Виктор Васильевич

Официальные оппоненты:

Колесанова Екатерина Федоровна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича" Российской академии медицинских наук, заведующая лабораторией пептидной инженерии. Иванов Петр Алексеевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова", Биологический факультет, кафедра вирусологии, ведущий научный сотрудник.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН Российской академии наук

Защита диссертации состоится «12» декабря 2013 г. в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр.12, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.ВЛомоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан «11» ноября 2013г. Ученый секретарь диссертацион----------

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Вакцинация является одним из наиболее эффективных способов профилактики инфекционных заболеваний. «Классические» вакцины предполагают использование для иммунизации ослабленного или инактивированного возбудителя заболевания. Преимуществами вакцин, основанных на «целом» патогене, является высокая иммуногенность, поскольку они представляют патоген иммунной системе в его естественной форме, но они имеют и серьезные недостатки, в том числе возможность реверсии к патогенной форме или неполной инактивации, аллергические реакции и нежелательные побочные эффекты, обусловленные сложным составом препарата, содержащего полный набор белков патогена, а не только основные иммуногенные белки. Следующим этапом в разработке вакцин стало создание белковых вакцин, использующих только один или несколько основных высокоиммуногенных белков патогена (антигенов), как правило, поверхностных, или даже их коротких участков (эпитопов), распознающихся антителами. Белковые вакцины могут быть получены на основе патогена в результате выделения из него отдельного белка(ов); альтернативой является получение рекомбинантного белка в стандартных организмах-продуцентах. Однако вследствие отличий в генерации иммунного ответа против целого патогена и против отдельных белков, подобные вакцины в большинстве случаев вызывают более слабый иммунный ответ.

Решением этой проблемы может являться направленное конструирование нанострзтстур, имитирующих структуру патогена и содержащих отдельные высокоиммуногенные белки патогена на своей поверхности («нановакцины»). Такой подход позволяет использовать преимущества белковых вакцин и нивелировать их недостатки, имитируя структуру патогена и, следовательно, его взаимодействие с иммунной системой.

Грипп является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний человека и животных. Используемые в настоящее время противогриппозные вакцины основаны на получаемых в куриных эмбрионах вирусе гриппа или его компонентах. Однако, высокая изменчивость основных поверхностных антигенов вируса гриппа, гемагглютинина и нейраминидазы, приводит к возникновению нового эпидемического штамма каждые 1-2 года, что требует столь же частого обновления состава вакцины. Кроме того, возможна рекомбинация между вирусами гриппа человека и животных, при этом возникают вирусы с новыми антигенными свойствами, не узнаваемые иммунной системой человека и,

следовательно, обладающие пандемическим потенциалом. Создание и наработка традиционной вакцины, специфичной к новому штамму, занимает, как правило, несколько месяцев, в течение которых распространение инфекции может привести к гибели большого количества людей.

Поэтому актуальной является задача создания рекомбинантных противогриппозных вакцин широкого спектра действия, которые «перекрывают» антигенные свойства различных актуальных штаммов гриппа за счет использования консервативных белков вируса. Перспективным объектом для создания такой рекомбинантной «универсальной» вакцины является внеклеточный домен трансмембранного белка М2 вируса гриппа, М2е. Особенностью М2е, имеющего длину всего 23 а.о., является его консервативность: у абсолютного большинства вирусов гриппа, выделенных у человека начиная с 1933г., последовательность М2е практически неизменна, у штаммов животного происхождения она отличается по нескольким аминокислотам. Однако, задача создания вакцины на основе М2е осложняется тем, что этот белок низкоиммуногенен и при инфекции иммунный ответ против него практически не активируется. Решением этой проблемы является присоединение М2е к вирусоподобной наноразмерной частице-носителю.

Способность биологических макромолекул к самосборке и самоорганизации предоставляет широкие возможности для использования биомолекул для направленного создания новых наноархитектур с заданными пространственными и функциональными свойствами. Одним из наиболее ярких примеров таких структур, обладающих четкой симметрией и возможностями направленной модификации являются вирусные частицы и имеющие сходную структуру вирусоподобные частицы (ВПЧ), образуемые в результате самосборки капсидных белков вирз'сов. Представление антигенов на поверхности ВПЧ обеспечивает их высокую иммуногенность за счет высокой плотности и упорядоченного симметричного расположения эпитопов.

Предметом данной работы является дизайн и получение рекомбинантных вирусоподобных частиц - носителей М2е пептида вируса гриппа типа А. В качестве основы для создания рекомбинантных ВПЧ был использован ядерный (коровый) антиген вируса гепатита В (НВс антиген), мономеры которого собираются в наноразмерные вирусоподобные НВс частицы. Мы сконструировали рекомбинантные НВс частицы, представляющие на своей поверхности антигены вируса гриппа, разработали методы их получения и очистки. Иммунологические характеристики и протективность рекомбинантных НВс частиц были определены в экспериментах на лабораторных животных.

Цель it задачи исследования

Целью настоящей работы является конструирование вирусоподобных наноразмерных частиц на основе НВс антигена вируса гепатита В и М2 белка вируса гриппа, разработка методов их получения и очистки. Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Конструирование рекомбинантных вирусоподобных частиц на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащих вставку нескольких копий внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа (М2е) в район иммунодоминантной петли НВс антигена.

2. Разработка нового способа презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс-часгиц, основанного на специфическом нековалентном связывании чужеродных пептидов с НВс частицами in vitro, и получение белковых комплексов на основе НВс частиц и М2е пептидов двух различных штаммов вируса гриппа.

3. Оптимизация метода получения вирусоподобных НВс частиц в результате сборки из мономеров НВс белка in vitro.

4. Характеристика иммуногенности и протекгивного действия препаратов вирусоподобных частиц, содержащих М2е, на лабораторных животных.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые получены рекомбинантные белки НВс, в район иммунодоминантной петли которых включено несколько копий М2е пептидов вируса гриппа. Установлено, что увеличение числа копий М2е в НВс с одной до четырех повышает как иммуногенность, так и протективность соответствующих вирусоподобных частиц. Эксперименты на лабораторных животных показали высокую иммуногенность и протективное действие полученных НВс частиц, одержащих 4 копии М2е пептида.

Разработан новый способ презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс частиц, основанный на специфическом нековалентном связывании целевого пептида с немодифицированными НВс частицами in vitro за счет включения в состав пептида специфической последовательности, взаимодействующий с экспонированными на поверхности НВс частиц иммунодоминантными петлями. Получены белковые комплексы, содержащие М2е пептиды различных штаммов вируса гриппа и НВс частицы. Установлено, что иммунизация мышей этим препаратом обеспечивает 100% защиту от заражения штаммами вируса гриппа, М2е пептиды которых входят в его состав. Предлагаемый метод, с одной стороны, позволяет решить проблему возможного нарушения структуры частиц в результате вставки целевого пептида, поскольку он связывается с уже собранной немодифицированной частицей. С

другой стороны, он позволяет получать комплексы, в которых с одной НВс частицей могут быть связаны одновременно разные целевые пептиды, что может оказаться полезным для создания вакцин, основанных на нескольких эпитопах, а также для включения в состав препарата различных иммуномодуляторов.

Практическая значимость работы обусловлена перспективами использования рекомбинантных вирусоподобных частиц - носителей внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа в качестве основы новых рекомбинантных противогриппозных вакцин, эффективных в отношении различных штаммов вируса гриппа типа А, в том числе новых потенциально пандемических штаммов животного происхождения. Апробация работы

Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: "Virus-Like Particle And Nano-Particle Vaccines - VLPNPV 2012" (Канны, Франция, 2012), Международной школе «Наноматериапы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Московская область, 2011), Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2012), Научно-практической конференции «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» (Санкт-Петербург, 2012).

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Иммунологические характеристики и протективность рекомбинантных НВс частиц определены в экспериментах на лабораторных животных в ФГБУ «НИИгриппа» Минздрава России. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ. Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и включают 49 рисунков и 5 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Цель и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит 9 отечественных и 163 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Конструирование вирусоподобных НВс частиц на основе генетически слитых последовательностей М2е и НВс антигена

Одной из наиболее привлекательных мишеней для создания «универсальной» противогриппозной вакцины является трансмембранный белок М2. Он с высокой плотностью экспонируется на поверхности инфицированной клетки, а последовательность его внеклеточного домена (М2е) высоко консервативна у штаммов гриппа А человека, что делает перспективным его применение при разработке «универсальной» вакцины. Проблема низкой иммуногенности М2е пептида может быть решена использованием вирусоподобных частиц в качестве иммуногенного носителя.

В качестве основы для создания вирусоподобных частиц - носителей М2е был использован ядерный антиген вируса гепатита В (НВс антиген). Мономеры этого белка, состоящие из 183 а.о., собираются в икосаэдрические частицы диаметром 34 нм, состоящие из 240 субъединиц, организованных в димерные блоки. Три района НВс могут быть использованы для презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс частиц, - N и С концы белка и экспонированная на поверхности частиц «иммунодоминантная» петля (MIR), расположенная между 75 и 85 а.о. остатками НВс. Поскольку именно вставки в MIR обеспечивают наиболее сильный иммунный ответ против целевого эпитопа, этот район был выбран в качестве места вставки М2е пептида. Известно, что С-концевой аргинин-богатый домен НВс антигена не требуется для сборки частиц, но может связывать нуклеиновые кислоты при экспрессии в Е. coli. Поэтому для создания ВПЧ мы использовали укороченный вариант НВс из 148 а.о.

Ранее были описаны рекомбинантные НВс белки, содержащие в районе иммунодоминаитной петли вставку одной копии М2е. Однако, известно, что увеличение числа копий М2е с одной до трех на N-конце НВс усиливает иммунный ответ. Поэтому первой задачей работы было получение НВс частиц, содержащих множественные вставки М2е пептида в MIR (1, 2 или 4 копии), и определение зависимости иммуногенности и протективного действия от числа копий М2е.

Для создания вирусоподобных частиц использовали М2е пептид (М2ек), последовательность которого (SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSD) соответствовала М2 белку вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), для которого ранее были отработаны методики тестирования иммуногенности и протективного действия на мышах. Для предотвращения хаотичного образования дисульфидных связей и, как следствие, агрегации белков, цистеины в позициях 16 и 18 последовательности М2е пептидов были заменены серинами. Однако, экспрессированный в клетках Escherichia

coli рекомбинантный белок НВс, содержащий М2ек в MIR, оказался нерастворим. Возможной причиной этого является нарушение фолдинга гибридного белка, поэтому мы ввели в точки «стыков» последовательностей НВс и М2ек дополнительные глицин-богатые «гибкие» линкеры длиной 19 а.о. (GTSGSSGSGSGGSGSGGGG). С использованием методов генетической инженерии получены три искусственных гена, кодирующие гибридные М2ек-НВс белки, содержащие 1, 2 или 4 копии М2ек пептида, вставленные в MIR. Эти гены были клонированы в векторе pQE60 (Qiagen) для продукции соответствующих рекомбинантных белков НВс/М2ек, НВс/2М2ек и НВс/4М2ек в Е. coli (Рис.1).

Рисунок 1. Схема векторов, BamHI Ее И 3611 EcoRV Apal позволяющих экспрессировать

.1._,1___.1._,1._, белки НВс/М2ек, НВс/2М2ек и

Н^ша^^ВЧ^ШрЧ^КЖ^-^ , 1Вс/4М2ек со вставК0й, 2

I_1,2 или 4 копии_J jijij^ 4-х копий М2ек пептида.

Все три рекомбинантных белка экспрессировались в клетках Е. coli DLT1270 на уровне 10-15% общего белка, большей частью находились в растворимой фракции и выявлялись в Вестерн-блоттинге моноклонапьными антителами к М2ек (Рис. 2).

kDa 1 2 3 4 5 kDa

1 2

130 » ¡їді ■ , 95 - 77-

72 шиж 55 43

1

■

34 " • - , . 26 —

26 ® і!! Яі'ЯНР:

■MB 17 _ -: ■: -

А 17 fei — Б І

Рисунок 2.

(А) SDS-PAGE анализ белковых препаратов, выделенных из штаммов-продуцентов гибридных М2ек-НВс белков.

1 - маркер мол. веса;

2 - белковый препарат из штамма-продуцента НВс/М2ек до индукции;

3 - белковый препарат из штамма-продуцента НВс/М2ек после индукции;

4 - белковый препарат из штамма-продуцента НВс/2М2ек после индукции;

5 - белковый препарат из штамма-продуцеигта НВс/4М2ек после индукции. Положения НВс/М2ек, НВс/2М2ек и НВс/4М2ек указаны стрелками.

(Б) Вестерн-блот анализ белковых препаратов, выделенных из клеток штаммов-продуцентов рекомбинантных белков НВс/М2ек, НВс/2М2ек и НВс/4М2ек.

1 - белковый препарат из штамма-продуцента НВс/М2ек;

2 - белковый препарат из штамма-продуцента НВс/2М2ек;

3 — белковый препарат из штамма-продуцента НВс/4М2ек.

Синтезированный в Е. coli и других системах экспрессии НВс антиген может собираться in vivo в вирусоподобные частицы. Выделение ВПЧ из растворимой фракции клеточного лизата проводили с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахароза - хлористый цезий. Вирусоподобные частицы, образованные целевыми белками, распределялись обособленно от бактериальных белков в определенной области градиента плотности, что давало возможность их очистки. После диализа фракций, содержащих ВПЧ, полученные препараты рекомбинантных белков НВс/М2ек, НВс/2М2ек и НВс/4М2ек тестировали на иммуногеииость и протективность.

Исследования иммуногенности и протективного действия рекомбинантных белков были проведены в ФГБУ «НИИгриппа» Минздрава России. Группы опытных мышей (линия Balb/c) трехкратно иммунизировали препаратами очищенных вирусоподобных частиц в дозе 50 мкг на мышь с адьювантом Деринат (50 мкг/мышь). Контрольной группе мышей трехкратно вводили фосфатно-солевой буфер. Для оценки иммуногенности препаратов отбирали сыворотки пяти опытных мышей из каждой группы после второй и третей иммунизации. Способность иммуноглобулинов сывороток связываться с М2е пептидом оценивали с помощью ИФА с использованием синтетического пептида G-11-1 (SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD), соответствующего использованному в препаратах М2е вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005.

Проведенные исследования показали (Табл.1), что все три препарата НВс/М2ек, НВс/2М2ек и НВс/4М2ек после третьей иммунизации индуцировали образование специфических антител к М2ек. Наибольшие титры антител наблюдались в сыворотках мышей, иммунизированных НВс/4М2ек. Таким образом, при увеличении числа копий М2е пептидов, включенных в район иммунодоминантной петли, иммуногенность рекомбинантных НВс частиц повышается.

Таблица 1. Титры антител к синтетическому пептиду 0-11-1 в сыворотках мышей после иммунизации рекомбинантными белками НВс/М2ек, НВс/2М2ек, и НВс/4М2ек.

Группы иммунизированных мышей Титр IgG после 2-ой иммунизации Титр IgG после 3-ей иммунизации

НВс/М2ек + 100 мкг деринат, в/м 33 280 134 400

НВс/2М2ек + 100 мкг деринат, в/м 53 760 128 000

НВс/4М2ек + 100 мкг деринат, в/м 148 480 532 480

Контроль, PBS 200 200

Протективное действие рекомбинантных белков оценивали на модели летальной гриппозной инфекции при заражении мышей вирусом гриппа штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в дозе 5LDso. Установлено, что уровень защиты коррелирует с числом копий М2е пептида в рекомбинантном белке (Рис. 3). Так, иммунизация мышей препаратом НВс/4М2ек с 4-я копиями М2е обеспечивала 100% защиту, а для препарата с 2-я копиями М2е выживаемость составила около 60%. Наименьшую защиту (42%) обеспечила иммунизация препаратом НВс/М2ек с одной копией М2е, что также согласуется с наименьшими титрами специфичных антител к М2е в сыворотках этих мышей.

Рисунок 3. Динамика гибели мышей, иммунизированных кандидатными вакцинами после заражения вирусом A/Chicken/Kurgan/05/ 2005 (H5N1) в дозе 5LD30.

Таким образом, из этой части работы можно сделать вывод о том, что для создания эффективной вакцины на основе НВс частиц, несущих М2е, необходимо включить в состав иммунодоминантной петли 4 копии М2е пептида.

В описанных выше экспериментах в качестве модельного целевого антигена был использован М2е пептид вируса «птичьего» гриппа. Однако, предназначенная для человека противогриппозная вакцина должна быть, в первую очередь, направлена против «человеческих» штаммов вируса гриппа и, следовательно, обязательно должна содержать «человеческий» М2е. Мы сконструировали два типа рекомбинантных вирусоподобных частиц - носителей М2е пептида.

В первом гибридном НВс белке мы включили в состав иммунодоминантной петли 4 копии консенсусной последовательности М2е пептида вируса гриппа человека (M2eh). Поскольку консервативные последовательности М2е пептида вирусов гриппа человека и птиц различаются, для создания «универсальной» вакцины, которая была бы эффективна как против «человеческого», так и «птичьего» гриппа, мы использовали M2eh (SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD) и М2ек вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005, отличающиеся на три аминокислотных остатка в позициях 10, 15 и 19. Во втором рекомбинантном НВс белке мы включили в состав иммунодоминантной петли НВс антигена 2 копии M2eh и 2 копии М2ек (в последовательности M2ek-M2eh-M2ek-M2eh).

-НВс/М2ек -НВс/2М2ек — НВс/4М2ек -контроль

10 11 12 13 14

Сутки после заражения

Как и в описанных выше гибридных белках, цистеины в позициях 16 и 18 М2е пептидов были заменены на серины, а в места «стыков» между последовательностями НВс антигена и М2е были введены глицин-богатые гибкие линкеры. Конструирование химерных генов и рекомбинантных векторов экспрессии проводили с использованием генно-инженерных подходов, в результате были получены искусственные гены и векторы, позволяющие экспрессировать рекомбинантные белки HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh с четырьмя повторами М2е (два «птичьих» М2е, два «человеческих» М2е), и рекомбинантный белок HBc/4M2eh со вставкой четырех копий M2eh (Рис. 4).

BamHI ЕеИЗбД EcoRV Apal

тУ M2ek И MÍeti li M2ekl M2eh линкер tV

И1»

линкер p

r

BamHI Ecll36II EcoRV Apal

M2eh H VGeiTU \I2eh I M2eh линкер

Шс/ WlÜMKeF

(А)

(В)

Рисунок 4. Схемы векторов, позволяющих экспрессировать рекомбинантные белки HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh (А) и HBc/4M2eh (В).

Для получения штаммов-продуцентов рекомбинантных белков HBc/4M2eh и HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh соответствующие векторы, полученные на основе pQE60, вводили в клетки Е. coli штамма DLT1270. Уровень синтеза целевых белков после индукции оценивали с помощью SDS-PAGE. Лизис клеток проводили путем обработки лизоцимом с последующим замораживанием-оттаиванием клеточной суспензии. Несмотря на достаточный уровень экспрессии (10-15% общего белка), после разрушения клеток оба гибридных белка HBc/4M2eh и HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh практически полностью находились в нерастворимой фракции. Для решения этой проблемы проводили подбор условий культивирования штаммов. Наибольшее количество белка HBc/4M2eh в растворимой фракции наблюдали при индукции 0,5 мМ IPTG и культивировании при 28°С. Оптимальные условия для продукции белка HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh наблюдали при индукции синтеза белка 1 мМ IPTG и культивировании при комнатной температуре 20°С (Рис. 5а). В обоих случаях в растворимом виде присутствовало около половины рекомбинантного белка.

Растворимую фракцию белков после разрушения клеток тестировали на способность связываться с антителами к М2е (Рис. 56). Вестерн-блот анализ показал, что белок HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh, в последовательности которого есть две копии

М2ек пептида, хорошо детектируется моноклональными антителами, полученными на синтетическую последовательность М2ек. Однако, HBc/4M2eh, содержащий только М2е пептиды вируса гриппа человека, не детектировался теми же антителами. Вероятно, это объясняется отличием трех аминокислот в последовательности М2ек и консенсусной последовательностью М2е вируса гриппа человека, что, по-видимому, вызвало изменения антитело распознаваемого эпитопа.

(А) (Б)

kDa 1 2 з 4 5 kDa 1 2

130

95 - 72 —

72 <Мм» -- *» 55 —

55 «*» 43 —

4, «ш» Шшт 5= _

34 26

А 17 Б

26

17

Рисунок 5.

(А) ЭВБ-РАОЕ анализ белковых препаратов, выделенных из штаммов-продуцентов гибридных белков НВс/4М2е11 и НВс/М2ек-М2еЬ-М2ек-М2е11 при оптимальных условиях культивирования. Положения целевых белков указаны стрелками

1 - маркер мол. веса;

2 - белковый препарат из штамма-продуцента НВс/4М2е11 после индукции, растворимая фракция;

3 - то же, что на дор. 2, нерастворимая фракция;

4 - белковый препарат из штамма-продуцента НВс/М2ек-М2е11-М2ек-М2е)1 после индукции, растворимая фракция;

5 - то же, что на дор. 4, нерастворимая фракция.

(Б) Вестерн-блот анализ белковых препаратов (растворимая фракция), выделенных из штаммов-продуцентов НВс/4М2еЬ (дор. 1) и НВс/М2ек-М2еЬ-М2ек-М2е11 (дор. 2). Для иммунодетекции использованы моноклональные антитела к М2ек.

Очистку ВПЧ проводили ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахароза - хлористый цезий. Образование ВПЧ было подтверждено электронно-микроскопическим анализом очищенного препарата (Рис. 6).

Исследования иммуногенности и протективного действия рекомбинантных белков НВс/М2ек-М2еЬ-М2ек-М2еЬ и НВс/4М2е11 были проведены в ФГБУ «НИИгриппа» Минздрава России. Мышей трехкратно иммунизировали препаратами очищенных химерных ВПЧ в дозе 50 мкг на мышь с адъювантом деринат (100 мкг/мышь). Контрольной группе трехкратно вводили препарат очищенных НВс частиц

в такой же дозе. Иммуногенность оценивали по способности специфичных сывороточных антител распознавать линейные и нативные эпитопы М2е пептида.

Рисунок 6. Анализ структуры ВПЧ, образованных химерными белками НВс с вставкой четырех копий М2е пептида в MIR методом электронной микроскопии, (а) - частицы HBc/4M2eh; (б) - частицы HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh; (в) -немодифицированные частицы НВс.

Определение титра антител к линейным элитопам М2е в сыворотках мышей проводили методом ИФА с использованием синтетических пептидов G-11 (соотв. М2ек) и G-37 (соотв. M2eh). Установлено (Табл. 2), что иммунизация мышей препаратом HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh инициирует образование иммуноглобулинов IgG, специфичных как к М2е вируса гриппа птиц, так и к консенсусной «человеческой» М2е. Образование меньшего титра антител к М2ек, чем к M2eh, можно объяснить разной конформационной доступностью соответствующих копий М2е в составе химерных ВПЧ. В сыворотках мышей, иммунизированных HBc/4M2eh (не содержащим М2ек), титр антител, связывающих G-11-1, был намного ниже, чем в сыворотках мышей, иммунизированных HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh. Это указывает на влияние отличий в последовательностях М2е пептидов на специфичность индуцируемых антител.

Таблица 2. Титры антител к синтетическим пептидам 0-11-1, 0-37 и НВс антигену в сыворотках мышей после третьей иммунизации препаратами вирусоподобных частиц НВс/М2ек-М2еЬ-М2ек-М2е1і и НВс/4М2еЬ.

Образцы сывороток иммунизированных мышей Титры иммуноглобулинов IgG*

G-11-1 (M2ek) G-37 (M2eh) НВс

НВс/М2ек-М2еЬ-М2ек-М2еЬ + 100 мкг деринат, в/м 92 160 133 120 194 560

НВс/4М2е11 + 100 мкг деринат, в/м 5 120 235 520 163 840

НВс + деринат 100 мкг, в/м 200 200 491 520

сыворотка не иммунизированных животных 200 200 200

* средние значения по сывороткам 5 мышей

Сравнение титров анти-НВс антител в опытных и контрольной (мыши, иммунизированные НВс антигеном) группах показало, что включение 4-х копий М2е в состав MIR более чем вдвое снижает иммунный ответ против самого носителя. Кроме того, иммунизация как HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh, так и HBc/4M2eh индуцирует образование суммарного титра антител против М2е выше, чем против НВс.

Для определения специфических сывороточных антител изотипа IgG к «нативному» М2е был проведен ИФА с использованием клеток MDCK, инфицированных вирусами гриппа человека A/PR/8/34(HlNl) и птиц A/Chicken/ Kurgan/05/2005. Белок М2 экспонируется на поверхности инфицированных клеток MDCK в его «естественной» конформации. Было установлено, что иммунизация мышей ВПЧ как HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh, так и HBc/4M2eh вызывает образование высокого титра антител к нативным М2 белкам вируса гриппа человека (Рис. 7). Иммунизация препаратом HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh вызывает образование более низкого титра специфичных антител к М2 белку вируса A/Kurgan/05/05(H5N 1), чем к A/PR/8/34(HlNl) что может быть связано с менее выгодным конформационным положением соответствующего пептида в HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh частице.

MDCK, инфицированные A/PR/8/34

■ MDCK. инфицированные A/Kurgan/05/05

■ MDCK, инфицированные A/PR/8/34 (контроль, сыворотка мышей, иммунизированных НВс)

■ MDCK, инфицированные A/PR/8/34

■ MDCK, инфицированные A/PR/8/34 (контроль сыворотка мышей, иммунизированных НВс)

V3 № &

Обратные значения разведений сывороток

-<Р „сР -о"

Обратные значения разведений сывороток

Рисунок 7. Распознавание клеток МОСК, инфицированных вирусами гриппа А/РЯ/8/34 (Н1Ы1) и А/Киг§ап/05/2005 (Н5Ы1) сыворотками мышей, иммунизированных НВс/М2ек-М2еЬ-М2ек-М2еЬ (А) и НВс/4М2еЬ (Б).

Протективное действие рекомбинантных белков HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh и HBc/4M2eh оценивали на модели летальной гриппозной инфекции при заражении мышей вирусами гриппа человека A/PR/8/34 (H1N1) и A/Aichi (H3N2), а также вирусом гриппа птиц A/Kurgan/05/2005 (H5NI). Полученные результаты (Рис. 8) показывают, что трехкратная иммунизация мышей препаратом HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh, содержащих М2е пептиды вируса гриппа птиц и человека, обеспечивает 83% защиту

при заражении вирусом гриппа человека A/PR/8/34, но лишь 25% защиту при заражении вирусом гриппа птиц A/Kurgan/05/2005 (H5N1). Более низкие титры антител, специфичных к М2ек пептиду и нативному М2 белку вируса гриппа птиц A/Kurgan/05/2005(H5Nl), коррелируют со слабой защитой при заражении этим штаммом. При заражении вирусом гриппа человека A/PR/8/34 мышей, иммунизированных препаратом HBc/4M2eh частиц, наблюдали 92% защиту. Высокий уровень защиты (87%) наблюдали и при заражении вирусом A/Aichi (H3N2), последовательность М2е которого совпадает с консенсусной «человеческой» М2е.

| 100 ******** I 80

X

а бо

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Сутки после заражения мышей вирусом А/РЯ/8/34 |Н1Щ) в дозе 5Ш50

12 3 J S 6 7 а 9 10 11 12 13 14 Сутки после заражения мышей вирусом A/KuTg3n\05\05 |H5N1) вдозе5Ю50

- HBc/4M2eh

- HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh Контроль, НВс

2 3 -1 5 6 7 S 9 10 11 12 13 14 Сутки после заражения мышей вирусом А/Afehl (H3N2) в дозе 5LD50

Рисунок 8. Динамика гибели мышей, иммунизированных препаратами вирусоподобных частиц НВс/М2ек-М2еЬ-М2ек-М2еЬ и НВс/4М2е]1 после заражения вирусами гриппа А/Кигёап/05/2005 (Н5Ы1), А/РЯ/8/34 (НШ1) и АМлсЫ (НЗШ) в дозе 5ЬО50.

Таким образом, из этой части работы можно сделать заключение о том, что включение нескольких копий М2е в иммунодоминантную петлю НВс антигена позволяет получать высокоиммуногенные ВПЧ, обладающие протективным действием. Однако, положение М2е в пределах вставки имеет важное значение - против некоторых копий М2е пептида генерируется сильный иммунный ответ, а против других - более слабый. Поэтому создание «универсальной» вакцины за счет включения в иммунодоминантную петлю нескольких разных копий М2е, соответствующих как «человеческому» гриппу, так и различным штаммам животного происхождения, может оказаться проблематичным. Для решения этих задач может быть использован другой разработанный нами подход — присоединение различных М2е пептидов к немодифицированной НВс частице in vitro.

2. Новый способ презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс частиц, основанный на нековалентном связывании пептидов с НВс частицами in vitro

Встраивание чужеродных пептидов в состав НВс антигена на «генетическом» уровне, на N или С конец молекулы, либо в район иммунодоминантной петли, является традиционньм способом направленной модификации НВс частиц. Однако, введение длинных или обладающих определенными амфифильными свойствами последовательностей зачастую приводит к нарушению сборки частиц и/или их стабильности. Так, значительная доля экспрессированных в Е. coli гибридных М2е-НВс белков (см. выше) была нерастворима. Чтобы избежать этих трудностей мы разработали новый способ презентации чужеродных пептидов на поверхности немодифицированных НВс частиц. Он основан на нековалентном взаимодействии специфических пептидов с MIR, выступающими на поверхности НВс частиц.

Вирус гепатита В имеет сферическую липид-белковую внешнюю оболочку, под которой располагается внутренняя часть (ядро), образованное НВс антигеном. Компонентом липидной мембраны является поверхностный антиген L-HBs, который и играет ключевую роль во взаимодействии внешней оболочки с ядром при сборке вируса. Пре-S регион полипептида L-HBs нековалентно связывается с MIR, выступающими на поверхности НВс частиц. Показано, что подобранные с помощью фагового дисплея пептиды, конкурирующие с npe-S регионами, способны блокировать эти взаимодействия и, как следствие, ингибировать сборку вируса. Наиболее высокой аффинностью к НВс частицам обладает пептид GSLLGRMKGA (Böttcher et al., 1998).

Мы решили использовать этот пептид в качестве «связывающего модуля» при

получении частиц, несущих на своей поверхности таргетные белки (Рис. 9). Принцип

разработанного подхода состоит в отдельном получении in vivo в бактериальной

системе экспрессии немодифицированных НВс частиц и целевого пептида со

«связывающим модулем», с последующим получением белкового комплекса in vitro в

результате нековалентного связывания пептида с НВс частицами (Рис. 9).

Рисунок 9. Схема получения комплекса из вирусоподобных НВс частиц и содержащего НВс-связывающий пептид белка.

1 - сборка немодифицированных НВс частиц из мономеров in vivo;

2 - нековаленоное связывание НВс частиц и белка, содержащего НВс-связывающий пептид in vitro.

<3-% \ f

1 in vivo

in vitro ^m

<¿J< НВс антиген «- НВс-связывающий пептид

таргетная последовательность

і \

Мы сконструировали ген химерного белка ЗМР, включающего последовательность 6 HIS на N-конце, две копии М2е вируса гриппа птиц штамма A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (М2ер, SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD), одну копию М2е пептида вируса гриппа птиц штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (M2ek) и «связывающий модуль» GSLLGRMKGA на С-конце (Рис. 9). Для этого использовали синтетическую последовательность, кодирующую три копии М2е пептида с НВс-связывакмцей последовательностью на 3'-конце. Соответствующий фрагмент ДНК клонировали в pQE30. Для контроля специфичности связывания последовательности GSLLGRMKGA с НВс частицами был создан вектор pQ30 ЗМ, обеспечивающий экспрессию пептида ЗМ, содержащего три копии М2е без НВс-связывающей последовательности (Рис. 9). Оба рекомбинантных белка, ЗМ и ЗМР. экспрессировались в клетках Е. coli DLT1270 на уровне 30-40% общего белка и в основном находились во фракции растворимых белков после разрушения клеток.

Kpul

М2ер I M2ek I М2ер

_PQE30 ЗМР_

I Kpnl

Рисунок 9. Схемы экспрессионных векторов PQE30 ЗМР и pQE30 ЗМ. Р - «связывающий модуль» GSLLGRMKGA

Г

М2ер

М2ер

i

pQI£30 ЗМ

Для получения НВс частиц в клетках Е. coli экспрессировали рекомбинантный НВс антиген без С-концевого аргинин-богатого домена (150-183 а.о. нативного НВс), обеспечивающего связывание нуклеиновых кислот, но не влияющего на сборку НВс-часгиц (Zheng et al., 1992). На С-конец молекулы НВс был включен аминокислотный остаток цистеина, что способствует повышению стабильности частиц (De Filette et al., 2005). НВс синтезировался в клетках Е. coli на уровне около 20% общего белка и, в основном, находился во фракции растворимых белков. Способность рекомбинантного НВс формировать ВПЧ была подтверждена электронной микроскопией.

Чтобы проанализировать способность рекомбинантного белка ЗМР взаимодействовать с немодифицированными НВс частицами, объединяли соответствующие клеточные лизаты. Рекомбинантный белок ЗМР, в отличие от НВс, содержал на N-конце 6-HIS таг, что обеспечивало возможность его очистки на Ni-NTA сорбенте. Возможность совместной очистки сформированных in vivo вирусоподобных НВс частиц и содержащего НВс-связывающий пептид ЗМР белка свидетельствует о связывании пептида GSLLGRMKGA с НВс (Рис. 10а, дор. 5).

а б

Рисунок 10. НВс-связывающий пептид обеспечивает специфичное взаимодействие рекомбинантного белка ЗМР с НВс частицами. Представлены результаты SDS-PAGE анализа белковых препаратов.

(а) - очистка комплекса ЗМР-НВс с помощью метал-аффинной хроматографии:

1 - маркер молекулярного веса;

2 - препарат растворимых белков из штамма DLT1270/pQE30 ЗМР;

3 - препарат растворимых белков из штамма JM109/pQE60 НВс;

4 - смесь лизатов, содержащих ЗМР и НВс до очистки на Ni-NTA сорбенте;

5 - очищенный на Ni-NTA сорбенте препарат комплекса ЗМР-НВс;

6 - очищенный на Ni-NTA сорбенте препарат белка ЗМР;

7 - фракция, полученная при очистке белка НВс на Ni-NTA сорбенте.

(б) - очистка белков с помощью металл-аффинной хроматографии на Ni-NTA сорбенте из смеси клеточных лизатов, содержащих рекомбинантные белки НВс и ЗМ:

1 - маркер молекулярного веса;

2 - препарат, полученный после очистки смеси лизатов, содержащих белки ЗМ и НВс;

3 - смесь клеточных лизатов, содержащих белки ЗМ и НВс до очистки.

Перед электрофорезом белковые препараты с М2е подвергали ацетилированию для предотвращения агрегации.

В качестве контроля того, что связывание ЗМР с НВс частицами является специфическим и зависит от наличия пептида GSLLGRMK.G, мы провели очистку приготовленной аналогичным образом смеси клеточных лизатов, содержащих НВс частицы и белок ЗМ, лишенный С-концевой НВс-связывающей последовательности. Результаты электрофореза белковых препаратов, показали наличие в элюатах только белка ЗМ (Рис. 106), что подтверждает избирательность взаимодействия НВс частиц с пептидом GSLLGRMKGA.

Чтобы подтвердить то, что молекулы НВс в очищенном препарате комплекса ЗМР-НВс собраны в ВПЧ, мы проводили анализ комплекса с помощью ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы (10-60%). Результаты SDS-PAGE анализа полученных после ультрацентрифугирования фракций градиента подтвердили, что НВс в препарате НВс-ЗМР действительно находится в виде ВПЧ. Однако после

центрифугирования наблюдали разрушение комплекса НВс-ЗМР и разделение белка ЗМР и НВс частиц по фракциям с различной плотностью сахарозы. Так, белок ЗМР находился в верхних фракциях с плотностью сахарозы до 10%, а НВс - в фракциях с плотностью 22-25%, что соответствует положению ВПЧ при центрифугировании клеточных лизатов, содержащих НВс частицы (Рис. 11). По-видимому, диссоциация комплекса происходила во время центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Видимо, именно сахароза является дестабилизирующим агентом, поскольку при очистке в присутствии 10% сахарозы смеси лизатов, содержащих НВс и ЗМР, с помощью металл-аффинной хроматографии в элюатах выявлялся только белок ЗМР.

кОа N1 I 2 3 4 5 б 7 8

118 — ЩШШШШ

85

47

36 26 ■т

20

а

118 м 1 2 3 4 5 6 7 8

85 і! р' ш

47 36 ■Ии зі» Яж'

26 » "4Ї

20 "

кРа і

118 -

85 -

47 ~ **

36

26 "

20 -

6 7

_НВс

— лизоцим

Рисунок 11. БОЗ-РАСЕ и вестерн-блот анализ белковых препаратов, полученных при ультрацентрифугировании в градиенте плотности сахарозы.

(а) - препарат очищенного комплекса ЗМР-НВс (БОБ-РАОЕ);

(б) - препарат очищенного комплекса ЗМР-НВс (вестерн-блот анализ с моноклональными анти-М2е антителами);

(в) - клеточный лизат, содержащий НВс частицы (БОБ-РАСЕ), м - маркер молекулярного веса;

1-8 - фракции градиента плотности сахарозы после ультрацентрифзтирования от минимальной (1) до максимальной (8);

9 - препарат очищенного комплекса ЗМР-НВс до ультрацентрифугирования. Образцы не подвергались ацетилированию перед электрофорезом вследствие чего М2е аггрегировал и мигрировал в виде диффузной полосы меньшей подвижностью.

Электронно-микроскопический анализ препарата очищенного комплекса ЗМР-НВс также подтвердил наличие частиц диаметром около 30 нм (Рис. 12).

Рисунок 12. Электронно-микроскопический анализ комплекса ЗМР-НВс, очищенного с помощью металл-аффинной хроматографии на КГА сорбенте.

Иммунологические исследования, проведенные в ФГБУ «НИИгриппа» Минздрава России, показали, что препарат комплекса НВс частиц с ЗМР является значительно более иммуногенным, чем рекомбинантный белок ЗМР (Рис. 13). Для этого Balb/c мыши были двукратно подкожно иммунизированы препаратами очищенного белка ЗМР или комплекса ЗМР-НВс (по 10pg белка).

Определение титра сывороточных IgG антител к М2е проводили с помощью ИФА с использованием синтетических пептидов G19 и G11-1, аминокислотные последовательности которых соответствуют М2е штаммов вируса гриппа A/Duck/Potsdam 1402-6/1986 (две копии в ЗМР) и А/Chicken/ Kurgan/05/2005 (одна копия в ЗМР), соответственно. Полученные результаты (Рис. 11) показывают, что комплекс ЗМР-НВс является высокоиммуногенным, а иммунный ответ против ЗМР белка, не связанного с НВс частицами значительно слабее, что говорит об адьвантных свойствах НВс частиц.

Разведен не сыворотки Разведение сыворотки

—- ЗМР+НВс -і- ЗМР —— контроль

Рисунок 13. Титры антител к синтетическим пептидам Б19 и 0-11 -1 в сыворотках мышей, иммунизированных препаратами белка ЗМР и комплекса ЗМР-НВс (после второй иммунизации).

Значимость физического связывания М2е с НВс частицей-носителем (а не просто ее наличия в препарате) анализировали во втором эксперименте, в котором проводили иммунизацию мышей препаратами, содержащими смесь очищенных белков

ЗМ и НВс частиц (они неспособны взаимодействовать), и комплексом ЗМР-НВс. Было установлено, что иммунизация смесью ЗМ и НВс частиц вызывала образование более низкого титра антител к синтетическому пептиду 0-11-1, чем при использовании комплекса ЗМР-НВс (Рис. 14). Эти результаты подтверждают важность связывания целевого белка с НВс частицами для обеспечения его иммуногенности.

.1.2000

О 10000

н

о

CL О 8000

3

со ЫХУО

УЗ

сю

4000

О.

1-

• ¿000

0

ЗМР+НВс

ЗМ+НВс

контроль

Рисунок 14. Титры ^0 антител к синтетическому пептиду 0-11-1 в сыворотке мышей после внутримышечной иммунизации препаратами ЗМР-НВс и ЗМ+НВс.

2-я иммунизация 3-я иммунизация

Для достижения наиболее эффективного иммунного ответа при иммунизации мышей в состав белкового комплекса ЗМР-НВс дополнительно вводили рекомбинантный мышиный интерлейкин-2 (IL2), который является эффективным иммуностимулятором и 5'силивает Thl клеточный иммунный ответ. Полученный в Е. coli рекомбинантный IL2 содержал полигистидиновый таг и НВс-связывающий пептид GSLLGRMKGA. Наличие этого пептида позволяет использовать рекомбинантный IL2 в качестве дополнительного компонента в комплексе с ЗМР и НВс частицами. Подобным образом в состав комплексов с НВс частицами могут быть включены и другие функциональные белки и пептиды. Для образования тройного комплекса к препарату комплекса ЗМР-НВс перед иммунизацией добавляли рекомбинантный IL2 до 30% общего белка.

Полученным препаратом (3MP-HBc-IL2) трехкратно вакцинировали Balb/c мышей в дозе 50 pg белка на мышь, используя TiterMax Gold Adjuvant (Sigma) для первой подкожной иммунизации и неполный адьювант Фрейнда (Sigma) для двух последующих внутримышечных иммунизаций. Индуцированные антитела эффективно связывались с синтетическими пептидами G19 (М2ер) и Gl 1-1 (M2ek), соответствующими М2е пептидам, включенным в состав ЗМР белка (Рис. 15). Хорошее связывание наблюдалось и с пептидом G26 (SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSD), соответствующему М2е вируса гриппа «свиного» происхождения A/California/04/2009, отличающемуся на одну аминокислоту от Gl 1 -1

mm

День после иммунизации

Рисунок 15. Титры IgG к синтетическим пептидам G19, G-11-1, G26 и G18 (M2eh) в пулах сывороток

■ G"-i(«ypf»H) мышей, иммунизированных □ G19 (Потсдам) препаратом ЗМР-НВс в

Я 526(Калифорния) К0МПЛЄКСЄ С МЫШИНЫМ 1L2. a G18 (Пуэрто-Рико) 3 качестве контроля

■ «°нтр°'"' использовали сыворотку

неиммунизированных мышей.

Динамика гибели и изменения массы тела мышей после заражения штаммами вируса гриппа A/Duck/Potsdam/1402-б /1986 (H5N2) и A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) «птичьего» происхождения, и «свиным» штаммом A/Califomia/04/2009 (H1N1) показаны на рисунке 16. Полученные результаты свидетельствуют о 100% защите иммунизированных мышей от летальной инфекции штаммами A/Duck/Potsdam/1402-6/1986 и A/Chicken/Kurgan/05/2005, последовательности М2е пептидов которых были включены в состав вакцинных белков. Кроме того, вакцинация комплексом ЗМР-НВс-IL2 на 90% защищала мышей при заражении вирусом гриппа «свиного» происхождения A/California/04/2009(H1N1), последовательность М2е которого на 1 аминокислоту отличается от М2е, включенного в состав вакцины.

A/Duck/Potsdam/1402-6/1986

A/Cliicken/Kurgan/05/2005

100

80

сх- 60

CJ

с S 40

ED 20

-0 СО 0

2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 День после заражения

3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 День после заражения

A/Ca)ifornia/04/2009

Рисунок 16. Протективное действие препарата ЗМР-НВс в комплексе с 1Ь2 при заражении мышей вирусами гриппа АЛЭиск/Ро1зёат/1402-6/1986, А/СЫскеп/Кш^ап/05/2005 и А/СаНГогша/04/2009 в дозе 5 ЬО50.

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 День после заражения

Предлагаемый нами новый метод, с одной стороны, позволяет решить проблему возможного нарушения структуры частиц в результате вставки целевого пептида,

20

поскольку он связывается с уже собранной ^модифицированной частицей. С другой стороны, он позволяет получать комплексы, в которых с одной НВс частицей могут быть связаны одновременно разные целевые пептиды, что может оказаться полезным для создания вакцин, основанных на нескольких эпитопах, и/или для включения в состав препарата различных иммуномодуляторов.

В результате изучения протективного действия препарата было установлено, что в отличие от препарата, основанного на «генетической» вставке 4-х копий М2е двух разных штаммов в иммунодоминантную петлю НВс антигена, иммунизация комплексом ЗМР-НВс обеспечивала 100% защиту от инфекции обоими штаммами вируса гриппа, М2е пептиды которых входят в его состав. Таким образом, нековалентное связывание М2е пептидов с НВс, в отличие от «генетической» вставки в иммунодоминантную петлю, не приводит к «эффекту положения» т.е. разной доступности разных копий М2е иммунной системе и вызывает выраженный иммунный ответ против всех М2е, включенных в состав препарата. Это свойство может быть полезным при разработке реально «универсальных» вакцин, направленных против штаммов человеческого и животного происхождения, различающихся последовательностями их М2 белков.

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы химерные гены и получены в клетках Escherichia coli рекомбинантные вирусоподобные частицы на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащие вставку одной, двух или четырех копий внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа (М2е) в район иммунодоминантной петли НВс антигена. Препарат с четырьмя копиями М2е обладает наиболее высокой иммуногенностью и обеспечивает защиту иммунизированных мышей от летальной гриппозной инфекции.

2. Разработан способ презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс частиц, основанный на специфическом нековалентном связывании с НВс частицами in vitro.

3. Получены белковые комплексы, содержащие рекомбинантные белки, включающие М2е пептиды двух различных штаммов вируса гриппа, нековалентно связанные с НВс частицами. Показано, что иммунизация мышей этим белковым комплексом обеспечивает защиту от летальной инфекции обоими штаммами вируса гриппа.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в рецензируемых научных журналах, определенных

ВАК РФ:

1. Blokhina Е.А., Kuprianov V.V., Tsybalova L.M., Kiselev O.I., Ravin N.V., Skryabin K.G. A molecular assembly system for presentation of antigens on the surface of HBc virus-like particles // Virology. 2013. V. 435. P. 293-300.

2. Блохина E.A., Куприянов B.B., Равин H.B., Скрябин КГ. Метод нековалентного связывания целевых белков in vitro с вирусоподобными наноразмерными частицами, образуемыми ядерным антигеном вируса гепатита В // Доклады академии наук. 2013. Т. 448. № 6. С. 719-721.

3. Степанова JI.A., Ковалева А.А., Потапчук М.В., Короткое А.В., Куприянов В.В., Блохина Е.А., Котляров Р.Ю., Цыбалова Л.М. Иммуногенные свойства рекомбинантных белков, включающих эктодомен М2 белка вируса гриппа // Вопросы вирусологии. 2013. №3. С. 21-25.

Материалы конференции:

1. Kotlyarov R.Y., Blokhina Е.А., Kuprianov V.V., Migunov A.I., Stepanova L.A., Tsybalova L.M., Kiselev O.I., Ravin N.V., Skryabin K.G. Development of plant-produced recombinant influenza vaccines based on the M2 protein // Abstracts of the 2011 Viruses and Cells Gordon Research Conference. Italy. Lucca. 2011. P. 59.

2. Блохина E.A., Куприянов В.В. Конструирование вирусоподобных наночастиц на основе ядерного белка вируса гепатита Б и М2 белка вируса гриппа // 2-ая Международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина». Московская область. 2011. С. 54.

3. Блохина Е.А., Куприянов В В., Котляров Р.Ю., Марданова Е С., Равин Н.В. Разработка рекомбинантных противогриппозных вакцин нового поколения на основе М2 белка // Тезисы Научно-практической конференции «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение». Санкт-Петербург. 2012. С. 36.

4. Блохина Е.А., Куприянов В.В. Коровый (ядерный) белок вируса гепатита В как носитель чужеродных эпитопов // XXIV Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва 2012. С. 86.

5. Blokhina Е.А., Kuprianov V.V., Ravin N.V. Development of recombinant influenza vaccine based on the M2 protein non-covalently linked to virus-like particles formed from the hepatitis В core antigen // Abstracts of the international conference "Virus-like particle and nano-particle vaccines - VLPNPV 2012". France. Cannes. 2012. P. 119.

Подписано в печать:

05.11.2013

Заказ № 9031 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \vww.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Блохина, Елена Александровна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» Российской академии наук

На правах рукописи

04201365680

БЛОХИНА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

Конструирование вирусоподобных частиц на основе корового белка вируса гепатита В и М2 белка вируса гриппа как основы новых

противогриппозных вакцин

(03.01.03 - молекулярная биология)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

В.В. Куприянов

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1. Основы создания противогриппозных вакцин 7

2. Использование вирусоподобных частиц в качестве высокоиммуногенных ^ носителей вакцинных белков

3. Пептидные аптамеры - новый инструмент молекулярной медицины 40 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46 РЕЗУЛЬТАТЫ 54

1. Конструирование вирусоподобных НВс частиц на основе генетически слитых ^ последовательностей М2е и НВс антигена

2. Новый способ презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс частиц, ^ основанный на нековалентном связывании пептидов с НВс частицами in vitro

3. Получение вирусоподобных НВс частиц в результате сборки in vitro 90 ОБСУЖДЕНИЕ 94

1. Вирусоподобные НВс частицы на основе генетически слитых ^ последовательностей М2е и НВс антигена

2. Метод нековалентного связывания целевых пептидов с вирусоподобными НВс ^g частицами in vitro

ВЫВОДЫ юз

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 104

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 105

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

GFP - зеленый флуоресцентный белок НА - гемагглютинин

НВс - ядерный антиген (коровый белок) вируса гепатита В HBs - поверхностный антиген вируса гепатита В IgG - иммуноглобулин G

М2е - внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа

MIR - иммунодоминантная петля (major immunodominant region)

NA - нейраминидаза

a.o. - аминокислотный остаток

ВПЧ - вирусоподобная частица

ЖГВ - живая гриппозная вакцина

ИГВ - инактивированная гриппозная вакцина

ВВЕДЕНИЕ

Вакцинация является одним из наиболее эффективных способов профилактики инфекционных заболеваний человека и животных. «Классические» живые вакцины предполагали использование для иммунизации ослабленной формы возбудителя заболевания. Позднее были разработаны способы физической и/или химической инактивации патогенных микроорганизмов, которые позволяли их обезвредить, но сохранить основные иммуногенные свойства. Преимуществами живых и инактивированных вакцин, основанных на «целом» патогене, является высокая иммуногенность, поскольку такие вакцины представляют патоген иммунной системе в его естественной форме. Однако, недостатками таких вакцин является возможность реверсии к высокопатогенной форме или неполной инактивации возбудителя. Кроме того, возможны аллергические реакции и нежелательные побочные эффекты, обусловленные сложным составом препарата, содержащего полный набор белков патогена (а не только основные иммуногенные белки), особенно у людей с ослабленным иммунитетом. Наконец, основанные на целом патогене вакцины содержат генетический материал возбудителя заболевания, что создает возможность рекомбинации при инфекции, которая может привести к образованию новых форм патогена.

Поэтому следующим этапом в разработке вакцин стало создание белковых вакцин, использующих только один или несколько основных высокоиммуногенных белков патогена (антигенов), как правило, поверхностных, или даже их коротких участков (эпитопов), распознающихся антителами. Такие вакцины полностью безопасны, поскольку не содержат ни патогенный организм, ни его генетический материал. Белковые вакцины могут быть получены на основе патогена в результате выделения из него отдельного белка(ов), альтернативой является получение рекомбинантного белка в стандартных организмах-продуцентах с помощью методов генетической инженерии. Однако вследствие значительных отличий в генерации иммунного ответа против целого структурированного патогена и против отдельных белков, подобные вакцины в большинстве случаев вызывают более слабый иммунный ответ, чем основанные на цельных аттенуированных или инактивированных патогенах.

Решением этой проблемы может являться направленное конструирование наноструктур, имитирующих структуру патогена и содержащих отдельные высокоиммуногенные белки патогена на своей поверхности («нановакцины»). Такой подход позволяет использовать преимущества белковых вакцин и нивелировать их недостатки, имитируя структуру патогена и, следовательно, его взаимодействие с иммунной системой. Наиболее эффективным этот подход оказывается при создании

вакцин против вирусных патогенов, поскольку вирусы являются природными наноструктурами, которые можно достаточно хорошо имитировать.

В качестве наночастиц-носителей антигенов могут быть использованы как искусственные структуры, так и наноструктры природного происхождения. Способность биологических макромолекул к самосборке и самоорганизации является одной из отличительных характеристик живых систем и дает возможность их использования для направленного создания новых наноструктур с заданными пространственными и функциональными свойствами. Одним из ярких примеров таких наноразмерных структур, обладающих пространственной симметрией и возможностями направленной модификации являются вирусы и вирусоподобные частицы (ВПЧ), образуемые в результате самосборки капсидных белков вирусов. Вирусоподобные частицы не содержат генетического материала вируса, на основе которого они созданы, и являются полностью безопасными.

Направленная модификация поверхности ВПЧ для презентации на ней антигенов может проводиться как путем «химической» пришивки, так и методами генетической инженерии. С использованием методов генетической инженерии можно получить «химерные» капсидные белки, к которым присоединен целевой антиген. В результате самосборки таких гибридных белков могут быть получены рекомбинантные ВПЧ, на поверхности которых представлен целевой антиген. Представление антигенов на поверхности ВПЧ обеспечивает их высокую иммуногенность. Такие химерные капсидные белки могут быть получены в стандартных организмах-продуцентах (бактерии, дрожжи и др.) с высоким выходом и легко очищены благодаря своему размеру. Эффективность такого подхода иллюстрируется примерами создания на основе ВПЧ вакцин против таких инфекционных заболеваний как малярия, бешенство, вирусные гепатиты и т.д.

Предметом настоящей работы является дизайн и получение рекомбинантных вирусоподобных частиц — носителей антигенов вируса гриппа. В качестве основы для создания рекомбинантных ВПЧ был использован ядерный (коровый) антиген вируса гепатита В (НВс антиген), мономеры которого собираются в наноразмерные вирусоподобные НВс частицы. Мы сконструировали рекомбинантные НВс частицы, представляющие на своей поверхности антигены вируса гриппа, разработали методы их получения и очистки. Иммунологические характеристики и протективность рекомбинантных НВс частиц были определены в экспериментах на лабораторных животных в ФГБУ «НИИгриппа» Минздрава России.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью работы является конструирование вирусоподобных наноразмерных частиц на основе НВс антигена вируса гепатита В и М2 белка вируса гриппа, разработка методов их получения и очистки.

При этом были поставлены следующие основные задачи:

1. Конструирование рекомбинантных вирусоподобных частиц на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащих вставку нескольких копий внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа (М2е) в район иммунодоминантной петли НВс антигена.

2. Разработка нового способа презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс-частиц, основанного на специфическом нековалентном связывании чужеродных пептидов с НВс частицами in vitro, и получение белковых комплексов на основе НВс частиц, представляющих М2е пептиды двух различных штаммов вируса гриппа.

3. Оптимизация метода получения вирусоподобных НВс частиц в результате сборки из мономеров НВс белка in vitro.

4. Характеристика иммуногенности и протективного действия препаратов вирусоподобных частиц, содержащих М2е, на лабораторных животных.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Основы создания противогриппозных вакцин

Грипп является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний и продолжает представлять значительную угрозу для здоровья населения. Сезонные эпидемии являются причиной ежегодного заражения миллионов людей во всем мире, а также связаны со значительными экономическими потерями (Molinari et al., 2007). Пандемии же гриппа могут носить разрушительные глобальные последствия, приводя к миллионам смертей (Johnson et al., 2002). При этом основная тяжесть и опасность смертельного исхода во время сезонных инфекций связаны в большей степени с осложнениями (бактериальная суперинфекция, обострения имеющихся заболеваний), а не с первичной гриппозной инфекцией (Thompson et al., 2003).

1.1. Общее представление и классификация вирусов гриппа

Вирусы гриппа принадлежат к группе Myxoviruses, семейства Orthomyxoviridae и являются оболочечными, однонитевыми (-) РНК вирусами. В основе подразделения на типы (А, В и С) лежат антигенность, видоспецифичность, патогенность, трансмиссия и сезонность. Стандартная номенклатура вирусов гриппа человека включает такие параметры как тип, географическая локализация, номер и год выделения. Например, вирус гриппа А, изолированный в Панаме в 1999 под номером 2002 должен называться как A/Panama/2002/1999.

Наиболее распространенными среди всех типов вирусов гриппа являются вирусы гриппа А, способные заражать не только человека, но и птиц, свиней, лошадей и многих других животных, хотя тропизм каждого отдельного штамма вируса гриппа главным образом высоко адаптирован к конкретному хозяину. Клинические проявления включают системные и респираторные заболевания, редко сопряженные с нарушениями центральной нервной системы, токсикологическим шоком или множественным повреждением органов (Studahl 2003, Sion et al., 2001). Именно штаммы вируса гриппа А являются основными мишенями для ежегодных вакцинаций. В основе подразделения вирусов гриппа А на субтипы лежит тип гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), которые являются основными поверхностными иммунологическими антигенами. На сегодняшний день выделяют 16 типов НА и 9 типов NA.

Вирусы гриппа В главным образом циркулируют среди людей, хотя и известны редкие случаи заражения тюленей (Osterhaus et al., 2000), и могут являться существенной причиной ежегодных эпидемий гриппа. Клинические симптомы заболеваний гриппом В менее тяжелые по сравнению с заболеваниями, вызванными вирусами гриппа А. В

настоящий момент два основных типа вируса гриппа В представлены штаммами B/Yamagata/16/1988 и B/Victoriа/2/1987 (Chen et al, 2007). Повторное появление последнего после десяти лет «молчания» вызвало вспышки заболевания сезона 2001-2002 гг., при этом основному риску подвергались иммунологически нативные дети (Hite et al. 2007). По этой причине вирусы гриппа В также включены в состав инактивированных и живых аттенуированных сезонных вакцин.

Грипп С, который заражает человека и свиней, редко считается причиной инфекций и эпидемий у человека. В отличие от гриппа А и В, вирусы гриппа С не содержат нейраминидазы и характеризуются единственньм поверхностным антигеном гемагглютинин-эстеразо-слитым гликопротеином (HEF, hemagglutinin-esterase-fusion). Этот вирус не показывает явной сезонности и не включен в состав ежегодных противогриппозных вакцин, хотя и может быть причиной случающихся время от времени вспышек заболевания, главным образом, у детей (Matsuzaki et al., 2007). Заболевание проходит без острой фазы и заключается в инфекции верхних дыхательных путей.

1.2. Структурная и геномная организация вирусов гриппа А

Вирусы гриппа А являются плеоморфными по природе и могут быть как сферическими, так и образовывать филаментные структуры, достигая размеров от 100 до 300 нм и более. Вирусные частицы покрыты липидным бислоем, представляющим собой участок клеточной мембраны, захваченный при выходе вируса из зараженной клетки путем почкования. В вирусную оболочку встроены гликопротеины гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), образующие выступы на поверхности вириона в соотношении приблизительно 4:1. Здесь же расположены тетрамерные ионные каналы, сформированные матриксным белком М2 (matrix protein 2). Под липидным бислоем находятся белковые структуры, окружающие генетический материал вируса. Матриксный белок Ml непосредственно связывает внутренние компоненты вируса (нуклеокапсид) с мембранной оболочкой вируса (Рис. 1) (Harris et al., 2006).

Геном вируса гриппа А состоит из восьми одноцепочечных (-) РНК фрагментов, которые кодируют 11 белков. Ядерный экспортный белок NEP (nuclear export protein), также известный как NS2, и антагонист антивирусного ответа хозяина неструктурный белок NS1 (non-structural protein 1) кодируются сегментом NS. Матриксный белок Ml и белок М2 ионного канала кодируются сегментом М. Рецептор связывающий белок гемагглютинин (НА), нейраминидаза (NA), нуклеопротеин (NP), и компоненты РНК-зависимого РНК полимеразного комплекса (РВ1, РВ2 и РА) экспрессируются с соответствующих сегментов генома. Позднее была открыта вторая рамка считывания

фрагмента РВ1, кодирующая про-апоптический фактор вирулентности PB1-F2. Однако по последним данным, сегмент РВ1 кодирует еще один белок N40 с неизвестными функциями (Wise et al., 2009).

В вирионе каждый из восьми вирусных сегментов формирует рибонуклеопротеиновый комплекс RNP (ribonucleoprotein). Вирусная РНК закручена вокруг нуклеопротеина NP, и такая структура в свою очередь связана с полимеразным комплексом вируса. Вирусные гены, генные продукты и первичные функции представлены в таблице 1.

Липидный бислой

Неструктурные белки

Полимеразный комплекс

Рисунок 1. Структурная организация вируса гриппа A (Medina and Garcia-Sastre, 2011).

Таблица 1. Генные сегменты вируса гриппа А и первичные функции кодируемых ими белков.

Генный сегмент Длина в нуклеотидах Кодируе мые белки Размер белков, а.о. Функция

1 2341 РВ2 759 Полимеразная субъединица, отвечающая за распознавание 5'-концевого кэпа мРНК

2 2341 РВ1 757 Полимеразная субъединица, обладающая эндонуклеазной активностью и обеспечивающая элонгацию РНК

PB1-F2 87 Виропорин - вызывает образование пор в митохондриях и индуцирует апоптоз.

3 2233 РА 716 Полимеразная субъединица, обладающая протеазной активностью

4 1778 НА 550 Гемагглютинин - поверхностный гликопротеин, связывающийся с клеточными рецепторами, основной

вирусный антиген

5 1565 NP 498 Нуклеопротеин - РНК связывающий компонент 1ШР комплекса, необходим для репликации, участвует в контроле транспорта РНК в ядро

6 1413 NA 454 Нейраминидаза - поверхностный гликопротеин, отщепляет остатки сиаловых кислот, обеспечивая освобождение от мембранных рецепторов и выход вирусов из зараженной клетки

7 1027 Ml 252 Матриксный белок, взаимодействующий с КИР комплексами и гликопротеинами, обеспечивает контроль экспорта РНК из ядра и почкование вируса

М2 97 Интегральный мембранный белок, формирующий ионный канал, обеспечивающий закисление эндосомы и раздевание вируса

8 890 NS1 230 Неструктурный белок регулирует экспрессию генов хозяина, контрллирует сплайсинг и полиаденилирование

NEP/NS2 121 Ядерный экспортный белок контролирует ядерно-цитоплазматический транспорт мРНК

1.3. Жизненный цикл вируса гриппа

На первой стадии инфекции находящиеся на поверхности вируса молекулы НА прикрепляются к мембранным рецепторам инфицируемой клетки (Рис. 2), содержащим на терминальных участках сиаловые кислоты. Специфичность НА к рецепторам, содержащим а-2,6- или а-2,3-сиаловые кислоты, определяет тропизм вируса к хозяину и путь распространения. Так, у человека основным является воздушно-капельный путь распространения вирусов гриппа, характеризующийся связыванием с а-2,6-сиаловыми кислотами клеточных рецепторов, распространенных на поверхности эпителиальных клеток респираторного тракта человека. Тогда как поражаемые птицы, включающие водоплавающих и домашних птиц, содержат рецепторы с а-2,3 сиаловыми кислотами, распространенными в желудочно-кишечном тракте, что подтверждает модель орально-фекального распространения штаммов вируса гриппа птиц (Medina and Garcia-Sastre, 2011). Таким образом, за связывание вируса с мембранными рецепторами отвечает молекула НА, состоящая из трех субъединиц.

После проникновения в клетку за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза, вирусная частица оказывается включенной в состав эндосомы. Затем через ионные каналы, образованные М2 белком, внутрь вирусной частицы проникают протоны и понижается рН среды. Молекула НА изменяет свою конформацию, при этом становится

доступным пептид НА, ответственный за слияние вирусной оболочки и эндосомальной мембраны. Затем происходит «раздевание» вирусной частицы и высвобождение ге�