Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Доклиническая и клиническая безопасность и иммунологическая эффективность инактивированной вакцины для специфической профилактики пандемического гриппа типа А/Н1N1

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Доклиническая и клиническая безопасность и иммунологическая эффективность инактивированной вакцины для специфической профилактики пандемического гриппа типа А/Н1N1"

На правах рукописи

РОМАНОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

«Доклиническая п клиническая оценка безопасности и иммунологической эффективности инактивированноп вакцины для

специфической профилактики пандемического гриппа типа А/НШ1»

ч

03.02.02 «Вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005001389

1 О НОЯ 2011

Москва - 2011

005001389

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Научно-производственное объединение «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской

Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Миронов Алексапдр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Воробьева Мая Сергеевна

доктор медицинских наук Маркушин Станистлав Георгиевич

Ведущая организация:

филиал Федерального государственного учреждения «33 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации» - «Вирусологический Центр», Московская область, г. Сергиев-Посад

Защита состоится «_»_2011 года в_часов на заседании

Диссертационного Совета Д.001.020.01 в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 123098, г. Москва, ул Гамалеи, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ

Автореферат разослан «_»_2011 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

Е.И. Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В течение весьма длительного времени грипп

является серьёзной проблемой для здоровья людей, вызывая ежегодные эпидемии, во время которых заболевает от 5 до 15 % всего населения планеты. Развитие современных средств скоростного транспорта, тесные международные контакты, массовые миграции, паломничество и туризм способствуют быстрому распространению гриппа по всему миру. Эпизодически возникают пандемии гриппа, во время которых заболеваемость может возрастать в 4-6 раз [Simonsen L. и др., 1999]. В июне 2009 г., после 40 лет относительного эпидемического благополучия по гриппу, ВОЗ объявила о начале пандемии, вызванной вирусом гриппа A/H1N1 [WHO, 2009; Seth J. Sullivan, 2010]. Возникновение пандемии гриппа связано с появлением генетически нового штамма вируса гриппа А, который представляет собой реассортант, имеющий в своей структуре гены возбудителей североамериканского гриппа свиней (НА, NP, NS), евроазиатского гриппа свиней (NA, М), гриппа птиц (РВ2, РА) и человека (РВ1). На территории РФ вирус выделен в мае 2009 г. от больного, вернувшегося из США. Уже летом 2009 года пандемический вирус гриппа почти полностью доминировал над сезонными, вызывая тяжелые осложнения в виде пневмоний в возрастной группе от 30 до 50 лет. Всего по официальной информации, представленной ВОЗ на 30 мая 2010 г., количество летальных случаев от пандемического гриппа (лабораторно подтвержденных) в мире (более чем в 214 странах) составляло более 18 499. Наиболее пострадавшими регионами являлись: Американский (более 8,4 тыс. случаев смерти) и Европейский (более 4,8 тыс. случаев смерти)

Для снижения заболеваемости тяжелыми формами гриппа и создания иммунной прослойки населения необходима вакцинация. На протяжении 60-ти с лишним лет разрабатываются и успешно применяются различные типы противогриппозных вакцин [АЛ. Беляев, А.Н. Слепушкин, 2004]. В связи с возникшей угрозой были предприняты необходимые международные меры, включая производство новых пандемических вакцин, наряду с обычными «сезонными», и уже к октябрю 2009 года апробированы несколько пандемических вакцин («Pandemrix», «Celvapan», «Focetria», «Humenza» и др.). По данным ЕМА во время пандемии, в период с 2009

по 2010 г. было привито примерно 46,2 миллиона населения европейского континента (около 9 % населения).

На филиале предприятия ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ г. Уфа «Иммунопрепарат» разработана вакцина «ПАНДЕФШО» на основе технологии приготовления, отработанной на препандемической вакцине «ОрниФлю», зарегистрированной в РФ (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009) и используемой для профилактики вируса гриппа птиц (ВГП) типа А/Н5Ы1 [А.Н. Миронов, 2010].

Цель настоящей работы - доклиническая и клиническая оценка безопасности и иммунологической эффективности инактивированной вакцины «ПАНДЕФЛЮ» для специфической профилактики пандемического гриппа типа А/НШ1.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить безопасность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» на лабораторных животных;

2. Провести сравнительное изучение иммуногенных и протективных свойств вакцин «ПАНДЕФЛЮ» и «ВГИПС»;

3. Оценить переносимость, реактогенность, безопасность и иммуногенность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» при иммунизации добровольцев 18-60 лет;

4. Исследовать переносимость, реактогенность, безопасность и иммуногенность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» при иммунизации добровольцев в возрасте от 60 лет и старше;

5. Изучить переносимость, реактогенность, безопасность и иммуногенность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» при иммунизации детей;

6. Обеспечить внедрение вакцины «ПАНДЕФЛЮ» в практику здравоохранения Российской Федерации.

Научная новизна. Впервые экспериментально изучены свойства пандемической вакцины «ПАНДЕФЛЮ» - вакцины гриппозной инактивированной субъединичной адсорбированной моновалентной, штамм

А/СаН&гп1а/7/2009(Н1Ы1)у.

В ходе проведенных исследований:

- Экспериментально доказана безопасность, иммуногенность и протективность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» на лабораторных животных.

- По результатам клинических исследований показана ареактогенность, безопасность и иммуногенность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» на здоровых добровольцах.

- Отработана схема и тактика применения вакцины «ПАНДЕФЛЮ» при массовой вакцинации населения РФ.

Практическая значимость. Результаты экспериментально-клинических исследований отражены в следующих документах:

- фармакопейная статья предприятия (ФСП);

- инструкция по применению, утвержденная Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.

Результаты работы обеспечили внедрение и применение инактивированной субъединичной адсорбированной моновалентной вакцины «ПАНДЕФЛЮ» (регистрационное удостоверение ЛСР-007988/09 от 13.10.2009) в практическом здравоохранении с целью специфической профилактики гриппа типа A/H1N1 в условиях пандемии в период с 2009 по 2010 г.

Положения, выносимые па защиту.

1. В рамках доклинических исследований на лабораторных животных показано, что двукратное внутримышечное с интервалом в 28 сут введение вакцины «ПАНДЕФЛЮ» не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не оказывает негативного влияния на морфологические и биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безопасности препарата, вызывает формирование стойкого иммунного ответа (величина титра антител в РТГА/РМН - 1:160/1:160) и защищает от заражения диким штаммом вируса гриппа A/California/7/2009(HlNl) 100 % иммунизированных животных.

2. Проведенные клинические исследования показали, что вакцина «ПАНДЕФЛЮ» ареактогенна, хорошо переносится привитыми, при двукратной с интервалом 28 сут иммунизации индуцирует развитие выраженного гуморального

иммунитета: у добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет уровень сероконверсии составил 87 % и уровень серопротекции - 68 %, фактор сероконверсии - 7,3; У добровольцев в возрасте от 60 лет и старше уровень сероконверсии составил 80 % и уровень серопротекции - 67 %, фактор сероконверсии - 6,8 и у детского контингента уровень сероконверсии составил 77 % и уровень серопротекции - 100 %, фактор сероконверсии - 5,7.

3. Вакцина «ПАНДЕФЛЮ» - вакцина гриппозная инактивированная субъединичная адсорбированная моновалентная, полученная методом классической реассортации на основе донора аттенуации PR/8 (H1N1), ареактогенна, безопасна и обладает высокими иммуногенными свойствами, что позволяет проводить массовую вакцинацию против гриппа A/H1N1 в условиях пандемии.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 8-й Российско-Итальянской конференции «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций» (г. Санкт-Петербург, 17-18 декабря 2009 г.), первой встрече ведущих экспертов по гриппу «Эпидемиология и иммунопрофилактика гриппа: предварительные уроки сезона 2009/2010 в условиях пандемии» (г. Москва, 26 февраля 2010 г.), научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» (г. Иркутск, 15-17 сентября 2010г.), 9-ой Российско-Итальянской конференции «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций» (г. Вологда, 30 сентября-2 октября 2010 г.), Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (г. Санкт-Петербург, 5-6 октября 2010 г.), первом конгрессе Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням (г. Санкт-Петербург, 1-3 декабря 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 6 в изданиях, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах текста, включая 51 таблицу и 7 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 194 источник, из них 72 отечественных и 122 - иностранных.

Личный вклад автора. Автор, в составе рабочей группы, принимал участие в планировании, организации, проведении и мониторировании доклинических и клинических исследований вакцины «ПАНДЕФЛЮ», подготовке и разработке дизайна и материалов исследований (протокол доклинических/клинических исследований, брошюра для исследователя, индивидуальная регистрационная карта, информация для добровольца, информированное согласие добровольца), согласовании с регуляторными органами, сбором первичных данных. Результаты исследований проанализированы и обобщены лично автором, проведена статистическая обработка полученных данных, по результатам исследований подготовлена нормативная документация для регистрации препарата.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вакцинные штаммы

При конструировании вакцины «ПАНДЕФЛЮ» использован штамм A/California/7/2009(HlNl)v (New York Medical College, США), полученный методом классической реассортации на основе донора агтенуации PR/8 (H1N1), применяемого при создании безопасных и иммунологически эффективных сезонных (H1N1 и H3N2) гриппозных вакцин, и дикого вируса A/California/7/2009 (H1N1) 5:3 (НА, NA, РВ1).

Исследуемая вакцина против пандемического гриппа

Вакцина «ПАНДЕФЛЮ» представляет собой поверхностные гликопротеины, выделенные из очищенных вирионов вируса гриппа типа A/California/7/2009 (HlNl)v, выращенного на развивающихся куриных эмбрионах, сорбированные на алюминии гидроксиде.

Состав: В 1 дозе (0,5 мл) вакцины

- гемагглютинин вируса гриппа типа А - 15±2,2 мкг;

- алюминия гидроксид («Brenntag Biosector», Дания) - 0,475±0,075 мг;

- консервант - тиомерсал (мертиолят) - 50±7,5 мкг.

Препарат представляет собой суспензию белого цвета без посторонних включений, разделяющуюся при отстаивании на прозрачную надосадочную жидкость и рыхлый осадок, полностью разбивающуюся при встряхивании.

Для проведения экспериментально-клинических исследований на филиале ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Уфа «Иммунопрепарат» были наработаны серии вакцины «ПАНДЕФЛЮ» (1-0809,2-0809,3-0809).

«ВГИПС» - Вакцина гриппозная моновалентная полимер-субъединичная жидкая, раствор для внутримышечного и подкожного введения представляет собой поверхностные гликопротеины, выделенные из очищенных вирионов вируса гриппа типа A/California/7/2009 (HlNl)v, выращенного на куриных эмбрионах, в комплексе с водорастворимым высокомолекулярным иммуностимулятором N-оксидированным производным поли-1,4-этиленпиперазин (Полиоксидоний).

Состав: В 1 дозе (0,5 мл) вакцины:

- гемагглютинин вируса гриппа типа А -10±1,5 мкг и 5±0,7 мкг,

- полиоксидоний - 500 мкг.

Описание: препарат представляет собой бесцветную или слегка желтоватую прозрачную жидкость.

Плацебо - вода для инъекций, производства ФГУН «НПО «Микроген» МЗ РФ

Вирулентные штаммы гриппа типа A/H1N1

Дикий вирулентный штамм вируса гриппа A/California/7/2009(HlNl) (филиал ФГУ «33 ЦНИИ Минобороны - ВЦ») использовали в экспериментальных исследованиях на хорьках для оценки протективных свойств вакцины «ПАНДЕФЛЮ».

Лабораторные животные

Лабораторные животные Количество Задачи исследования

Белые половозрелые беспородные мыши обоего пола, массой 18-20 г 40 особей Изучение острой токсичности, аллергизирующих свойств

Белые половозрелые мыши линии ВАЬВ/с обоего пола, массой 18-22 г 80 особей Изучение иммунотоксичности

Белые половозрелые беспородные крысы обоего пола, массой 160-180 г 200 особей Изучение острой токсичности, местно-раздражающего действия, аллергизирующих свойств

Беременные нелинейные белые крысы-самки, массой 180-200 г 140 особей Изучение репродуктивной токсичности

Белые нелинейные крысята-сосунки двухнедельного возраста, массой 13-15 г 60 особей Изучение острой токсичности на неполовозрелых животных

Морские свинки обоего пола, массой 200-250 г 108 особей Изучение аллергизирующих свойств

Беспородные половозрелые собаки обоего пола, массой 10-15 кг 16 особей Изучение хронической токсичности

Беспородные хорьки, массой до 2000 г 13 особей Изучение иммуногенных и протективных свойств

Животные были получены из сертифицированных питомников РАМН и РАН и

содержались при свободном доступе к воде и брикетированному комбикорму. Доклинические исследования проводили согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19.06.2003), утвержденным письменным протоколам.

Лабораторные базы/Исследовательские иентры

Доклиническое исследование острой токсичности и безопасности проведены на лабораторной базе ФГУН «Институт токсикологии» ФМБА г. Санкт-Петербург, изучение иммуногенных и протективных свойств на филиале ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны - ВЦ», МО, г. Сергиев-Посад.

Клинические исследования добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет (п=140) проведены на базах НИИ гриппа СЗО РАМН, НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Клинические исследования на детях (п=25) и на добровольцах в возрасте от 60 лет и старше (п=30) проведены на базах: МЛПУ «Клиническая больница №1», областной центр аллергологии и иммунологии», г. Смоленск; ГОУ ВПО ПГМА им. академика Е.А. Вагнера, г. Пермь. На базе НИИ гриппа СЗО РАМН проводили изучение сывороток крови добровольцев.

Биоматериалы

В рамках доклинических исследований изучали кровь и сыворотки крови, а также материал для гистологических исследований, иммунизированных животных

(кожа и мышцы в местах инъекций, сердце, легкие с бронхами, тимус, пищевод, желудок, поджелудочная железа, печень, селезенка, почки, надпочечники, щитовидная железа, головной мозг, яички и яичники).

В рамках клинических исследований изучали кровь и сыворотки крови и мочу привитых добровольцев. Получение и обработку клинических материалов проводили согласно МУ 3.3.2.1758-03 «Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа».

Доклинические исследования

В основе дизайна исследований лежали рекомендации следующих руководств:

1. Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения. РД 42-28-8-89. Москва -1989.

2. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов. Санитарные правила. СП 3.3.2.561-96.

3. Методические рекомендации Управления государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники Минздрава РФ от 29 декабря 1997 г.

4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ Минздрава РФ. М., 2005 г.

5. Токсикология лекарственных средств. Издание второе дополненное /Т.А. Гуськова/ - М.: МДВ, 2008 г.

6. Annex 1, WHO guidelines on nonclinical evaluation of vaccines, WHO Technical Report Series, No. 927,2005.

В рамках доклинических исследований оценивали острую токсичность, хроническую токсичность, местно-раздражающее действие, гиперчувствительность немедленного и замедленного типов, иммунотоксичность, репродуктивную токсичность, острую токсичность на неполовозрелых животных.

Изучение иммуногенных свойств вакцины «ПАНДЕФЛЮ» включало определение величины титра антител в сыворотках крови привитых в РМН, РТГА; для изучения протективных свойств вакцины иммунизированных животных инфицировали вирулентным штаммом A/California/7/2009(HlNl).

Клинические исследования Для проведения клинических исследований вакцины «ПАНДЕФЛЮ» были разработаны протоколы, одобренные Комитетом по этике, ученым советом ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитетом МИБП, исследования проводились в соответствие с Федеральным законом о лекарственных средствах №86-ФЗ от 22 июня 1998 г., приказом Минздрава РФ №266 от 19.06.2003 «Правила клинической практики в Российской Федерации», национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р52379-2005 «Надлежащая клиническая практика», согласно Европейским Предписаниям по ССР и Хельсинской Декларации и протоколам. На все клинические исследования были получены разрешения Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.

В соответствии с утвержденными протоколами клинических исследований изучали реактогенность и безопасность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» по витальным показателям (АД, ЧСС, Ь0 тела), результатам неврологического осмотра, данным лабораторных анализов (ОАМ, АОК, б/х крови) и нежелательным явлениям (местные и системные реакции). Оценку местных и системных реакций проводили согласно МУ 3.3.2.1758-03 «Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа». Оценка иммуногенности вакцины включала определение гуморального иммунного ответа.

Определение 1еЕ

Определение ^Е проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), набора «^Е-Вектор-Бест» (г. Новосибирск), с целью изучения возможного аллергизирующего действия вакцины. За норму принималось значение 20-100 МЕ/мл.

Оценка гуморального иммунного ответа Гуморальный иммунитет оценивали в РТГА и РМН в сыворотках крови привитых по следующим показателям:

- уровень сероконверсии - процент лиц, у которых величина титра антител после вакцинации повышается более чем в 4 раза;

- уровень серопротекции - процент лиц, у которых величина титра антител после вакцинации составляет 1:40 и выше;

- фактор сероконверсии - кратность прироста среднегеометрического значения титров антител (СГТ) после вакцинации относительно исходного СГТ.

Постановка реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Реакция торможения гемагглютинации выполнялась с куриными эритроцитами в соответствии с МУ 3.3.2.1758-03 и международными требованиями.

Постановка реакции микронейтрализации (РМН)

Согласно требованиям ВОЗ, при постановке РМН использовали культуру клеток МОСК. Суть метода заключалась в заражении клеточной культуры МЭСК, выращенной в 96-луночных планшетах, смесями двукратных разведений исследуемых сывороток привитых с вирусом гриппа А/Н1Ш, взятых в дозе 100 ТИД50, с последующей инкубацией инфицированных культур. За титр антител принималось последнее разведение сыворотки, при котором отмечалась отчетливая ингибиция вирусной репродукции (Методические рекомендации «4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы»).

Статистическая обработка данных

При анализе полученных результатов определяли средние величины и стандартное отклонение. Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи компьютерной программы 81а^з11са (версия 6,0) с использованием теста распределения Стьюдента для выборок с нормальным распределением или непараметрических критериев Уилкоксона-Манна-Уитни. Сравнение долей (пропорций) в двух соотносящихся группах оценивали при помощи непараметрического критерия Мак-Немара в модификации Лидделла, в других случаях использовали точный критерий Фишера. Различия считались достоверными при р<0,05.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Доклиническая оценка безопасности вакцины.

В рамках острой токсичности изучали острую летальность, путем внутримышечного введения вакцины «ПАНДЕФЛЮ» лабораторным животным обоего пола в прививочной дозе (0,5 мл) один раз в час на протяжении 5 часов, в результате - ни в одной из экспериментальных групп не отмечалось гибели животных в течение 14 дней наблюдения. Не выявлено влияния на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не обнаружено негативного воздействия на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, при вскрытии не наблюдалось патоморфологических изменений. Полученные результаты свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности вакцины в дозах, до 20 раз превышающих прививочные для человека (табл. 1).

Таблица 1

Результаты 5-кратного в/м введения вакцины «ПАНДЕФЛЮ» мышам и крысам на протяжении 5 часов

Режим введения Суммарная доза, мл (количество прививочных доз) Эффект, пало/всего

Самцы | Самки Самцы | Самки

Мыши

1 прививочная доза (0,5 мл) 5-кратао 2,5(5) 2,5(5) 0/5 0/5

2 прививочные дозы (1,0 мл) 5-кратно 5,0(10) 5,0(10) 0/5 0/5

Крысы

1 прививочная доза (0,5 мл) 5-кратно 2,5 (5) 2,5 (5) 0/5 0/5

2 прививочные дозы (1,0 мл) 5-кратно 5,0(10) 5,0(10) 0/5 0/5

4 прививочные дозы (2,0 мл)5-кратно 10,0 (20) 10,0(20) 0/5 0/5

Полученные результаты согласуются с данными наблюдений, выполненных на крысятах-сосунках. Применение вакцины в прививочной дозе при внутримышечном введении не влияет на внешний вид, общее состояние, не оказывает токсического

действия на организм крысят. Не зафиксировано отклонений массы тела животных и изменения их поведенческих реакций.

Хроническую токсичность оценивали в экспериментах, предусматривающих ежедневное внутримышечное введение вакцины собакам в дозах 1, 5 и 10-ти кратных прививочной дозе для человека в течение 30 дней. В результате проведенных исследований не выявлено значимых различий между опытными и контрольной группами животных по всему спектру регистрируемых показателей. Животные не теряли в весе, ректальная температура не превышала физиологической нормы. Не было отмечено изменений ЭКГ, автоматизма и проводимости сердца. Уровень артериального давления у всех животных был стабильным в течение всего периода наблюдения. Не установлено существенных сдвигов показателей общего и биохимического анализов крови и мочи. Вакцина не вызывала развития патологических, в том числе воспалительных, дистрофических и некротических изменений во внутренних органах животных.

В параллельных сериях экспериментов, выполненных на белых беспородных крысах и морских свинках, показано, что вакцина не вызывает развития реакций гиперчувствительности немедленного и замедленного типа, а также анафилактических реакций.

Для исключения возможности развития иммунологических нарушений в организме после введения вакцины «ПАНДЕФЛЮ», проводили изучение иммунотоксичности. Оценка гуморального иммунного ответа изучалась методом определения числа АОК в селезенке мышей (табл. 2).

Таблица 2

Влияние вакцины на формирование антителообразующих АОК в селезенке мышей, (М±т)

Эксперимента;! ьная группа Число АОК на 106 ядросодержащих клеток селезенки Число АОК на весь орган

Плацебо 9,6 (12,4-5-7,2) 1103 (1286^920)

Вакцина 15,2 (17,0+13,4) 3344 (3620-=-3028)

При внутримышечном введении вакцина увеличивает образование АОК в селезенке приблизительно в 1,7 раза. Таким образом, вакцина «ПАНДЕФЛЮ» стимулирует развитие неспецифического гуморального иммунного ответа.

В ходе изучения иммунотоксичности не выявлена чрезмерная активация или супрессия отдельных звеньев иммунитета, введение вакцины «ПАНДЕФЛЮ» не приводит к нарушению иммунологического гомеостаза организма. Вакцина не обладает иммунотоксическими свойствами, выявляемыми по оценке фагоцитарной активности макрофагов, стимулирует развитие неспецифического гуморального иммунного ответа.

Доклиническое исследование иммупогенных и протективных свойств вакцины.

В сравнительном наблюдении, на восприимчивых к вирусу гриппа лабораторных животных - хорьках, вакцину «ПАНДЕФЛЮ» и Вакцину инактивированную противогриппозную с полиоксидонием с антигенной нагрузкой 5 мкг НА/доза («ВГИПС») - аналога вакцины МоноГриппол, вводили по схеме: двукратно внутримышечно с интервалом введения 28 суток. До первой иммунизации проводили забор крови у хорьков из сердца для определения уровня серопротекции к исследуемому штамму, в последующем забор крови животных проводили перед второй иммунизацией и на 14 сут после второй иммунизации. Двукратная вакцинация индуцировала развитие гуморального иммунитета в группе животных, получавших вакцину «ПАНДЕФЛЮ», величина титра антител в РТГА/РМН достигала 1:160/1:160, а в группе сравнения лишь 1:20/1:20. В опытной группе СГТ составил 1:80/1:91, в группе сравнения СГТ - 1:13/1:13 (табл. 4).

Для определения протективных свойств вакцины, животных на 14 сутки после второй иммунизации интраназально инфицировали вирулентным штаммом вируса гриппа А/СаН&гша/7/2009(НШ1) с активностью не менее 7,0 ЭИД50. В группе животных, получавших «ВГИПС», показатель защиты составил 40 %, при этом в группе сравнения и контрольной группе отмечали адинамию, вялость, повышение температуры тела с сопровождающейся клинической симптоматикой, характерной

для гриппа (чихание, снижение аппетита и истечение из носа), что свидетельствовало о проявлении инфекционного процесса у хорьков.

Таблица 4

Результаты оценки уровня антител в крови хорьков иммунизированных

вакцинными препаратами

Препарат Величина титра вирусспецифических антител в РТГА/РМН, X Наличие гистолог ических изменени н Показатель защиты, %

до первой иммунизации перед второй иммунизацией 14 суток после второй иммунизации

Вакцина «ПАНДЕФЛЮ» с антигенной нагрузкой 15 мкг НА/доза <1:10/< 1:10 1:23/1:26 1:80/1:91 нет 100

«ВГИПС» с полиоксндонием с антигенной нагрузкой 5 мкг НА/доза <1:10А 1:10 <1:10/<1:10 1:13/1:13 есть 40

Плацебо -физ, раствор <1:10/< 1:10 <1:10/<1:10 <1:10/<1:10 есть 0

Органы, полученные от хорьков в группе сравнения и контрольной группе после инфицирования вирулентным штаммом гриппа, содержали морфологические и гистологические изменения, носившие воспалительный, дистрофический и деструктивный характер. К тому же вирус гриппа А, штамм А/СаП1огша/7/2009(НШ1), был выделен из селезенки, легких, головного мозга, обонятельных луковиц и носовых раковин. Наиболее эффективным препаратом в ходе наблюдения показала вакцина «ПАНДЕФЛЮ», обеспечивающая защитой 100 % животных от заражения вирулентным штаммом. При гистологическом изучении органов животных патологических изменений в группе животных, получавших изучаемый препарат, зарегистрировано не было, репродукции вируса не было выявлено (рис. 1).

Группа сравнения

Миокард - изменений соединительнотканной стромы миокарда не определяется

Рисунок 1 - Результаты гистологических исследований внутренних органов хорьков

При изучении иммуногенности показано, что вакцина «ПАНДЕФЛЮ» индуцирует развитие протективного гуморального иммунитета, и превосходит по эффективности и безопасности препарат сравнения «ВГИПС», аналог вакцины «МоноГриппол». Таким образом, проведенные доклинические исследования свидетельствовали о безопасности и иммунологической эффективности инактивированной субъединичной вакцины «ПАНДЕФЛЮ», что позволило рекомендовать ее для проведения клинических исследований на ограниченном контингенте добровольцев по наиболее оптимальной схеме 2-кратно с интервалом в 28 суток в дозе 15 мкг НА/доза.

Миокард - сосуды расширены, полнокровные, умеренный межмышечный отек

Селезенка - белая и красная пульпа выражены отчетливо. Трабекулы тонкие. Синусоиды заполнены эритроцитами. Белая пульпа представлена скоплениями лимфоцитов и фолликулами разной степени зрелости и величиной центров размножения

Селезенка - строма с умеренными явлениями фиброза. Фолликулы редки, просматриваются не в каждом поле зрения, различных размеров. Зародышевые центры в некоторых фолликулах просматриваются, в некоторых нет, занимают от 1/3 до половины объема фолликула

Опытная группа

Полученные результаты составили основу для разрешения на проведение клинических исследований Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (№ 331 от 12 августа 2009 г) и организации клинических исследований вакцины «ПАНДЕФЛЮ».

Результаты клинических исследований

В соответствии с утвержденными протоколами было проведено три независимых самостоятельных клинических исследований вакцины «ПАНДЕФЛЮ» в различных возрастных группах по схеме: 2-кратно с интервалом в 28 суток в дозе 15 мкг Н А/доза.

I. «Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности Вакцины гриппозной инактивированной субъединичной адсорбированной моновалентной, штамм A/California/7/2009(HlNl)v па добровольцах в возрасте 18-60 лет»

Исследование проводилось в сентябре-октябре 2009 г. на базах НИИ гриппа СЗО РАМН, НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН на 140 добровольцах в возрасте от 18 до 60 лет в рамках проведения рандомизированных контролируемых клинических исследований.

Побочных реакций сильной и средней степени выраженности отмечено не было ни у одного добровольца. Зарегистрированные местные реакции субъективно выражались в болезненности в месте введения вакцины у 21 % добровольцев, объективно отмечали гиперемию у 2 % и припухлость у 3 %. Все местные реакции носили слабовыраженный характер и не оказывали существенного влияния на общее состояние добровольцев (рис. 2). Представленные реакции допустимы для вакцин, сорбированных на алюминия гидроксиде геле [Ott, G. and Van Nest, G., 2006]. Алюминия гидроксид практически нерастворим, а гель структурирован в частицы, которые могут лишь постепенно резорбироваться гранулоцитами, гистиоцитами и макрофагами из места инъекции, поэтому часто возникают реакции в месте введения.

Повторное введение вакцины «ПАНДЕФЛЮ» через 28 суток не вызвало поствакцинальных осложнений и непредвиденных реакций. В 94 % процесс вакцинации сопровождался нормальной температурой, у 5 % добровольцев отмечали повышение температуры до 37,5 °С, у 1 добровольца была

зарегистрирована температура 37,8 °С. Среди других системных реакций отмечали симптомы катаральных явлений у 7 % (кашель, першение в горле, фарингит, ринит), а также головную боль у 3 % добровольцев. Все отмеченные реакции регистрировались, главным образом, после 1 прививки и продолжались не более 3 суток (рис. 2).

воч> 70% во% 30% лоъ 30% 20% 10*5»

в 12%

21% СИ

704 в Г*

(ив

:.....___Ш

Рисунок 2 - Процент добровольцев, у которых были отмечены местные и системные реакции на введение вакцины «ПАНДЕФЛЮ»

При изучении иммуногенности вакцины были получены следующие результаты: после двукратной вакцинации с интервалом введения 28 суток процент привитых, у которых наблюдался четырехкратный прирост гомологичных антител в сыворотке крови составил 87,0 %, у 68,0 % вакцинированных противогриппозные антитела определялись в защитных титрах антител, фактор сероконверсии составил 7,3, СГТ - 42,3 (рис. 3).

87%

69 % 67%

4,4 ' гтэ Шн

VI [ У2 1 VI | Ю 1 VI | VI 1 Уровень сероконверсии ) уровень серопротекции | Фактор сероконверсии (

Рисунок 3 - Оценка иммуногенных свойств вакцины «ПАНДЕФЛЮ»

В результате проведенного исследования была показана хорошая переносимость, низкая реактогенность, безопасность и выраженные иммуногенные свойства вакцины после двукратной вакцинации, что позволило рекомендовать к использованию вакцину в практике для специфической профилактики пандемического гриппа типа А/НINI у лиц 18-60 лет.

II «Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности Вакцины гриппозной инактивированной субъединичной адсорбированной моновалентной, штамм A/California/7/2009(HlNl)v, на добровольцах в возрасте от 60 лет и старше»

На базах ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава и МЛПУ «Клиническая больница №1», областной центр аллергологии и иммунологии» проводилось исследование на добровольцах в возрасте от 60 лет и старше, в результате которого было показано, что после двукратной иммунизации регистрировались местные реакции слабой степени выраженности у 6,7 % привитых. Они выражались в виде болезненности при пальпации, и системные реакции у 3,3 % привитых, проявляющиеся повышением температуры тела до 37,5 °С (Рис. 4).

45* ?

га% Ь

с* 4.............................¿ШшшШ...........................................................ШИИШ.............................;

Местные р»4(М1>к С«к*ви#ь.-г мам***

; «аОпхуТС«*» шсплъьа

Рисунок 4 - Процент добровольцев, у которых были отмечены местные и системные реакции на введение вакцины «ПАНДЕФЛЮ»

Изучение иммуногенности вакцины «ПАНДЕФЛЮ» на добровольцах в возрасте от 60 лет и старше показало, что доля лиц, получавших вакцину «ПАНДЕФЛЮ», с защитным уровнем титров антител после вакцинации составила 66,7 %, увеличение титра антител в 4 и более раз было зарегистрировано у 80,0 % привитых, фактор сероконверсии составил 6,8 (Рис. 5).

Рисунок 5 - Оценка иммуногенных свойств вакцины «ПАНДЕФЛЮ» III «Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности Вакцины гриппозной инактивированной субъединичной адсорбированной моновалентной, штамм A/California/7/2009/(HlNl)v на детях»

В третьем клиническом исследовании, проведенном на базах ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава, г. Пермь и МЛПУ «Клиническая больница №1», областной центр аллергологии и иммунологии», г. Смоленск, было показано, что введение вакцины детям (12-18 лет) не сопровождалось развитием негативных явлений в поствакцинальном периоде. Дети отлично переносили прививку, жалоб на ухудшение в общем состоянии не предъявляли. Были зарегистрированы лишь единичные местные и системные реакции после 1 вакцинации, у 4 % добровольцев наблюдали головную боль и у 4 % - болезненность в месте введения. Отмеченные реакции носили доброкачественный характер - исчезали без применения лекарственных средств, в течение 3 суток (рис. 6).

it04 0D4-

во1*

30^ 10%

MWJINW» рвйкн*

Рисунок 6 - Процент добровольцев, у которых были отмечены местные и системные реакции на введение вакцины «ПАНДЕФЛЮ»

При оценке иммуногенности процент лиц, имевших защитный уровень антител (серопротекция) в РТГА после первой вакцинации составил 95,0 %, после второй вакцинации 100,0 %. После однократной иммунизации уровень сероконверсии составил 77,0 %, после двукратной иммунизации увеличился до 100,0 %. Фактор сероконверсии после однократной вакцинации составил 4,3, после двукратной - 5,7 (Рис. 7).

Рисунок 7 - Оценка иммуногенных свойств вакцины «ПАНДЕФЛЮ»

Через 9 месяцев после проведения в сентябре 2009 года клинического исследования «Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности Вакцины гриппозной инактивированной субъединичной адсорбированной моновалентной, штамм А/СаН6эгша/7/2009(НШ1)у на добровольцах в возрасте 18-60 лет» на базе НИИ гриппа СЗО РАМН были проведены выборочные серологические обследования 16 взрослых, привитых вакциной «ПАНДЕФЛЮ» с целью оценки напряженности иммунитета. В результате было показано, что у 7 добровольцев (44%) отмечены защитные титры антител - 1:40 и выше (1:40 - 1:640), что свидетельствует о длительности сохранения поствакцинального иммунитета.

В ходе проведенных поэтапных клинических исследованиях на различных возрастных категориях были выявлены определенные тенденции: непредвиденных/серьезных поствакцинальных осложнений отмечено не было ни в одном из исследований, а зарегистрированные местные и системные реакции были слабой степени выраженности и возникали в основном на первые сутки после 1 иммунизации. Зарегистрированные местные поствакцинальные реакции проявлялись, в основном, в виде болезненности при пальпации в месте инъекции;

системные - повышением температуры, головной болью, продолжительностью не более 3 суток, исчезавшие без применения терапии. Процент зарегистрированных реакций после вакцинации детей и добровольцев старше 60 лет был значительно ниже, чем лиц в возрасте от 18 до 60 лет. Таким образом, рандомизированные клинические наблюдения по оценке реактогенности и безопасности показали, что вакцина характеризуется низкой реактогенностью, хорошей переносимостью и безопасностью.

Оценка иммуногенности вакцины «ПАНДЕФШО» в различных возрастных группах показала, что как после однократного, так и после двукратного введения с интервалом 28 сут, обладает высокими иммуногенными свойствами по всем изучаемым критериям (уровень сероконверсии, уровень серопротекции, фактор сероконверсии) во всех возрастных группах. Особенно выраженные иммунологические свойства были показаны при введении вакцины детям, где уже после однократной вакцинации показатель защиты составил 95,0 %, а при двукратной вакцинации наблюдали 100,0 % серопротекцию.

На основании результатов исследований, оформленных в отчетах, была разработана нормативно-техническая документация на вакцину «ПАНДЕФЛЮ»: фармакопейная статья предприятия (ФСП) - инструкция по применению, утвержденная Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.

Полученные результаты составили доказательную базу по безопасности и эффективности вакцины, необходимую для ее внедрения в практику здравоохранения при массовой вакцинации населения РФ.

24

ВЫВОДЫ:

1. Вакцина «ПАНДЕФЛЮ» для специфической профилактики гриппа A/H1N1 в доклинических исследованиях на лабораторных животных нетоксична, хорошо переносится, не обладает местно-раздражающим действием, не оказывает аллергизирующего и иммунотоксичного действия, не влияет на патоморфологические, гистологические и гематологические показатели.

2. Экспериментально обоснована необходимость проведения двукратной иммунизации с интервалом 28 сут с антигенной нагрузкой 15 мкг НА для формирования эффективной 100 % защиты хорьков после интраназального заражения вирулентным штаммом A/California/7/2009(HlNl) с активностью не менее 7,0 lg ЭИД50.

3. Внутримышечная двукратная иммунизация с интервалом 28 сут вакциной «ПАНДЕФЛЮ» в дозе 15 мкг НА на добровольцах в возрасте 18-60 лет хорошо переносится, низкореактогенна (местные реакции развивались у 21 % привитых, системные - у 13 %), безопасна и индуцирует образование гуморального иммунного ответа (уровень сероконверсии - 87 %, уровень серопротекции - 68 %, при этом фактор сероконверсии - 7,3).

4. При иммунизации вакциной «ПАНДЕФЛЮ» у детей были зарегистрированы реакции (местные реакции у 4 % и системные реакции у 4 % добровольцев), при этом уровень серопротекции составил 100 %, уровень сероконверсии - 77 %, фактор сероконверсии - 5,7, что свидетельствует о безопасности и высокой иммуногенности препарата.

5. Вакцинация добровольцев в возрасте от 60 лет и старше привела к развитию местных реакций у 6,7 % и системных реакций у 3,3 % добровольцев, при этом уровень серопротекции составил 66,7 %, уровень сероконверсии - 80 %, фактор сероконверсии - 6,8.

6. Проведенные клинические исследования подтвердили целесообразность применения схемы вакцинации (двукратная с интервалом 28 сут в дозе 15 мкг НА), доказав хорошую переносимость, безопасность и высокую эффективность препарата, разработанного с целью специфической профилактики гриппа H1N1 и массового применения в пандемический период для защиты населения РФ.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Результаты доклинического изучения гриппозной инактивированной субъединичной адсорбированной моновалентной вакцины «ПАНДЕФЛЮ»/А.Н. Миронов, A.A. Романова, Н.В. Дылдина, Д.С. Бушменков, A.A. Цаан, М.М. Алсынбаев, Н.В. Загидуллин, С.Е. Колбасов .//Журнал микробиологии, эпидемиологии и нммунологии.-2010.-№3-с. 27-32.

2. Оценка переносимости и реактогенности пандемических вакцин против гриппа типа A/H1N1/A.H. Миронов, Д.С. Бушменков, Н.В. Дылдина, A.A. Романова, A.A. Цаан, О.И. Киселев, М.К. Ерофеева, М.А. Стукова.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-2010.-№3-с. 32-35.

3. Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности инактивированной моновалентной вакцины у детей/А.Н. Миронов, A.A. Романова, Р.Я. Мешкова, И.В. Фельдблюм, Н.В. Купина, Д.С. Бушменков, A.A. Цаан.//Научно-практический журнал Союза педиатров России Вопросы современной педиатрии.-2010.-том 9-№4-с. 106-109.

4. Результаты клинических исследований безопасности и реактогенности гриппозной вакцины (штамм A(HlNl)/California/7/2009) ПАНДЕФЛЮ//В.В. Зверев, А.Н. Костинов, H.A. Михайлова, С.Н. Жирова, O.A. Теркачева, Н.В. Дылдина, A.A. Романова, Д.С. Бушменков, A.A. Цаан.//Научно-практнческий журнал Эпидемиология и Вакцинопрофилактика.-2010.-4(53)-с. 86-90.

5. Клиническое исследование пандемической вакцины «ПАНДЕФЛЮ» на добровольцах в возрасте от 18 до 60 лет/ А.Н. Миронов, A.A. Романова, Н.В. Купина, Д.С. Бушменков, A.A. Цаан, М.К. Ерофеева, М.П. Костинов .//Сибирский медицинский журнал.-2011.-№1- с. 100-103.

6. Клинические исследования пандемических гриппозных вакцин «ИНФЛЮВИР» и «ПАНДЕФЛЮ» на детях/А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, Н.В. Купина, A.A. Романова, A.A. Цаан.//Журнал инфектологии.-2010.-Том 2-№3-с. 127-128.

7. Доклинические и клинические исследования гриппозной инактивированной пандемической вакцины «ПАНДЕФЛЮ»/А.Н. Миронов, A.A. Романова, Н.В. Дылдина, Д.С. Бушменков, A.A. Цаан.//Инфекционные и паразитарные болезни в практике клинициста: современное состояние диагностики, лечения и их профилактики.- г. Харьков-2010.-с. 230-231.

8. Доклинические исследования гриппозной инактивированной пандемической вакцины «ПАНДЕФЛЮ»/А.Н. Миронов, A.A. Романова, Н.В. Дылдина, Д.С. Бушменков, A.A. Цаан, В.А. Меркулов, H.H. Степанов, С.Е. Колбасов.//Журнал инфекционной патологии.-2010.-Том 17-№3-с. 180-181.

9. Клинические исследования гриппозной инактивированной пандемической вакцины «ПАНДЕФЛЮ»/А.Н. Миронов, A.A. Романова, Н.В. Дылдина, Д.С. Бушменков, A.A. Цаан.// Журнал инфекционной патологии.-2010.-Том 17-№3-с. 181.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю доктору медицинских наук Миронову Александру Николаевичу за научное руководство.

Автор выражает глубокую благодарность высококвалифицированным руководителям и специалистам с доклинических и клинических баз академику РАМН, д.б.н., профессору Киселеву О.И., д.м.н. Ерофеевой М.К., д.м.н., профессору Сомининой A.A., к.б.н. Войцеховской Е.М. (ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития России), д.м.н. Фельдблюм И.В., к.м.н. Перминовой O.A. (ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава), РАМН, д.м.н., профессору Звереву В.В., д.м.н., профессору Михайловой Н.А, д.м.н., профессору Костикову М.П., к.м.н. Жировой С.Н. (НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН), д.м.н. Бондареву В.П., д.м.н., профессору Меркулову В.А., к.б.н. Степанову H.H. (филиал ФГУ «33 ЦНИИ Минобороны - ВЦ»), д.м.н., профессору Мешковой Р.Я. (МЛПУ «Клиническая больница №1», областной центр аллергологии и иммунологии»), д.м.н., профессору Нечипоренко С.П., к.м.н. Колбасову С.Е., к.м.н. Степанову C.B. (ФГУН «Институт токсикологии» ФМБА), к.м.н. Ельшиной Г.А., д.м.н. Горбунову М.А. (ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича Минздравсоцразвития России).

Автор выражает признательность руководству и сотрудникам ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России, которые оказывали неоценимую помощь в процессе работы над диссертацией и предоставили возможность суммировать и воспользоваться полученными данными. Кроме того автор выражает особую благодарность к.м.н. Купиной Н.В., Бушменкову Д.С., Цаану A.A. за постоянное внимание и ценные консультации при выполнении работы, а также Авериной Е.В., Катаеву A.B., моей семье за моральную поддержку во время выполнения диссертационной работы.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ЕМА European Medicines Agency, Европейское медицинское агентство

РМН Реакция микронейтрализации

РТГАРеакция торможения гемагглютинации

PR/8 (H1N1) штамм вируса гриппа A/PuertoRiсо/8/34 (H1N1)

ВАК Высшая аттестационная комиссия

ВГИПС Вакцина инактивированная противогриппозная с полиоксидонием ГОСТ Государственный стандарт

GCP Good Clinical Practice, Надлежащая клиническая практика

АД Артериальное давление

ЧСС Частота сердечных сокращений

OAK Общий анализ крови

ОАМ Общий анализ мочи

Б/х крови Биохимический анализ крови

Ig Е Иммуноглобулин Е

СГТ Среднегеометрический титр антител

МУ Методические указания

MDCK Перевиваемая культура клеток почек собаки ЭКГ Электрокардиография АОК Антителобразующие клетки

Подписано в печать:

29.06.2011

Заказ № 5987 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Романова, Анна Александровна, Москва

ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ

На правах рукописи

04.2.01 2 51 054-

РОМАНОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

«Доклиническая и клиническая безопасность и иммунологическая эффективность инактивированной вакцины для специфической профилактики пандемического гриппа типа А/НШ1»

03.02.02 «Вирусология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук Миронов А.Н.

Москва 2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ...................................................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................................................3

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................................................5

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................10

ГЛАВА 1. Клшшко-эпидемиологическая характеристика вируса гриппа....................10

ГЛАВА 2. Современное состояние разработки инактивированных пандемических

гриппозных вакцин в мире......................................................................................................33

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................................48

ГЛАВА 1. Материалы и методы..............................................................................................48

Материалы................................................................................................................................48

Методы......................................................................................................................................51

ГЛАВА 2. Доклинические исследование вакцины «ПАНДЕФЛЮ» на лабораторных

животных..........................................................................................................................................61

2.1 Изучение безопасности........................................................................................................61

2.2. Изучение иммуногенных и протективных свойств вакцины «ПАНДЕФЛЮ».....88

ГЛАВА 3. Клинические исследования вакцины «ПАНДЕФЛЮ»............................................100

3.1. Клинические исследования на добровольцах в возрасте 18-60 лет........................100

3.1.1. Изучение реактогенности, безопасности и иммуногенности вакцины «ПАНДЕФЛЮ».................................................................................:......................................100

3.1.2. Изучение иммуногенности...........................................................................................104

3.2. Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности вакцины «ПАНДЕФЛЮ» на детях........................................................................................................106

3.2.1. Изучение реактогенности и безопасности.................................................................106

3.2.2. Изучение иммуногенности...........................................................................................110

3.3. Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности вакцины «ПАНДЕФЛЮ» на добровольцах в возрасте от 60 лет и старше...................................113

3.3.1. Изучение реактогенности и безопасности.................................................................113

3.3.2. Изучение иммуногенности...........................................................................................117

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................................................121

ВЫВОДЫ:.......................................................................................................................................130

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................132

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД Артериальное давление

АОК Антителобразующие клетки

ACT Аланинаминотрансфераза

ACT Аспартатаминотрансфераза

Б/х крови Биохимический анализ крови

ВГИПС Вакцина инактивированная противогриппозная с

полиоксидонием

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения ВИЧ Вирус иммунодефицита человека

ГИСК им. JI.A. Тарасевича Государственный институт стандартизации

и контроля им. JI.A. Тарасевича

ГОСТ Государственный стандарт

ДН Дыхательная недостаточность

ЕС Европейский союз

Ig - англ. immunoglobulin Иммуноглобулин

ИР Индекс реакции

ИРК Индивидуальная регистрационная карта КЭ Куриный эмбрион ЛОР Оториноларинголог

ЛД50 Доза вируса, вызывающая 50 % гибель животных

МИБП Медицинский иммунобиологический препарат

МУ Методические указания

НД Нормативная документация

НИИ Научно-исследовательский институт

OAK Общий анализ крови

ОАМ Общий анализ мочи

ОРВИ Острая респираторная инфекция

ОРДС Острый респираторный дистресс-синдром

РКЭ Развивающийся куриный эмбрион

РМН Реакция микронейтрализации РТТА Реакция торможения гемагглютинации РНК Рибонуклеиновая кислота СГТ Средняя геометрическая титра СДА Спонтанная двигательная активность СП Санитарные правила

ФГУП «НПО» Микроген» МЗ РФ Федеральное государственное

унитарное предприятие «Научно-производственное объединение

«Микроген» Министерства здравоохранения Российской Федерации

ФСП Фармакопейная статья предприятия

ЧСС Частота сердечных сокращений

ЦТД Цитотоксическое действие

ЦЭЭГ Центр экологии и эпидемиологии гриппа

ЭБ Эритроциты барана

СНМР Committee for Medicinal Products for Human Use, Комитет no лекарственным средствам для использования у человека СРМР Committee for Proprietary Medicinal Products, Комитет по патентованным лекарственным препаратам GlaxoSmithKline

Good Laboratory Practice, Надлежащая лабораторная практика Good Clinical Practice, Надлежащая клиническая практика European Medicines Agency, Европейское медицинское агентство Гемагглютинин Нейраминидаза MDCK Перевиваемая культура клеток почек собаки Vero В Перевиваемая культура клеток почек зеленых мартышек М Самцы F Самки

CSK

GLP

GCP

ЕМА

НА

NA

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В течение весьма длительного времени грипп является серьёзной проблемой для здоровья людей, вызывая ежегодные эпидемии, во время которых заболевает от 5 до 15 % всего населения планеты. Развитие современных средств скоростного транспорта, тесные международные контакты, массовые миграции, паломничество и туризм способствовали быстрому распространению гриппа по всему миру. Время от времени возникают пандемии гриппа, во время которых заболеваемость может возрастать в 4-6 раз [Simonsen L. и др., 1999]. В июне 2009 г., после 40 лет относительного эпидемического благополучия по гриппу, ВОЗ объявила о начале пандемии, вызванной вирусом гриппа A/H1N1 [WHO, 2009; Seth J. Sullivan, 2010]. Возникновение пандемии гриппа связано с появлением генетически нового штамма вируса гриппа А, который представляет собой реассортант и имеет в своей структуре гены возбудителей североамериканского гриппа свиней (НА, NP, NS), грипп свиней евроазиатской линии (NA, М), гриппа птиц (РВ2, РА) и человека (РВ1), и его активному распространению среди людей в странах разных континентов. На территории РФ вирус был выделен в мае 2009 г. от больного, вернувшегося из США. Уже летом 2009 года пандемический вирус гриппа почти полностью доминировал над сезонными, вызывая тяжелые осложнения в виде пневмоний в возрастной группе от 30 до 50 лет. Всего по официальной информации, представленной ВОЗ на 30 мая 2010 года, количество летальных случаев от пандемического гриппа (лабораторно подтвержденных) в мире (более чем в 214 странах) составляет более 18 499. Наиболее пострадавшими регионами являются: Американский (более 8,4 тыс. случаев смерти) и Европейский (более 4,8 тыс. случаев смерти)

Для снижения заболеваемости тяжелыми формами гриппа и создания иммунной прослойки населения необходима вакцинация. На протяжении 60-ти с лишним лет разрабатываются и успешно применяются различные типы противогриппозных вакцин [A.JI. Беляев, А.Н. Слепушкин, 2004]. В связи с

возникшей угрозой были предприняты необходимые международные меры, включая производство новых пандемических вакцин, наряду с обычными «сезонными», и уже к октябрю 2009 года были апробированы несколько пандемических вакцин («Рапёетпх», «Се1уарап», «Бос^па», «Нитепга» и др.). По данным ЕМА во время пандемии, в период с 2009 по 2010 г. было привито примерно 46,2 миллиона населения европейского континента (около 9 % населения).

На филиале предприятия ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ г. Уфа «Иммунопрепарат» была разработана вакцина «ПАНДЕФЛЮ» на основе технологии приготовления, отработанной на препандемической вакцине «ОрниФлю», зарегистрированной в РФ (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009) и используемой для профилактики вируса гриппа птиц (ВГП) типа А/Н5№ [А.Н. Миронов, 2010].

Цель настоящей работы - доклиническая и клиническая оценка безопасности и иммунологической эффективности инактивированной вакцины «ПАНДЕФЛЮ» для специфической профилактики пандемического гриппа типа А/НШ1.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить безопасность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» на лабораторных животных;

2. Провести сравнительное изучение иммуногенных и протективных свойств вакцин «ПАНДЕФЛЮ» и «ВГИПС»;

3. Оценить переносимость, реактогенность, безопасность и иммуногенность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» при иммунизации добровольцев 1860 лет;

4. Исследовать переносимость, реактогенность, безопасность и иммуногенность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» при иммунизации добровольцев в возрасте от 60 лет и старше;

5. Изучить переносимость, реактогенность, безопасность и иммуногенность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» при иммунизации детей;

6. Обеспечить внедрение вакцины «ПАНДЕФЛЮ» в практику здравоохранения Российской Федерации.

Научная новизна. Впервые экспериментально изучены свойства пандемической вакцины «ПАНДЕФЛЮ» - вакцины гриппозной инактивированной субъединичной адсорбированной моновалентной, штамм А/СаИй>пиа/7/2009(Н 1N1 )у.

В ходе проведенных исследований:

Экспериментально доказана безопасность, иммуногенность и протективность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» на лабораторных животных.

- По результатам клинических исследований показана ареактогенность, безопасность и иммуногенность вакцины «ПАНДЕФЛЮ» на здоровых добровольцах.

- Отработана схема и тактика применения вакцины «ПАНДЕФЛЮ» при массовой вакцинации населения РФ.

Практическая значимость. Результаты экспериментально-клинических исследований отражены в следующих документах:

- фармакопейная статья предприятия (ФСП);

- инструкция по применению, утвержденная Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.

Результаты работы обеспечили внедрение и применение инактивированной субъединичной адсорбированной моновалентной вакцины «ПАНДЕФЛЮ» (регистрационное удостоверение ЛСР-007988/09 от 13.10.2009) в практическом здравоохранении с целью специфической профилактики гриппа типа А/НШ1 в условиях пандемии в период с 2009 по 2010 г.

Положения, выносимые на защиту.

1. В рамках доклинических исследований на лабораторных животных показано, что двукратное внутримышечное с интервалом в 28 сут введение вакцины «ПАНДЕФЛЮ» не влияет на внешний вид, общее состояние и

поведение животных, не оказывает негативного влияния на морфологические и биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безопасности препарата, вызывает формирование стойкого иммунного ответа (величина титра антител в РТГА/РМН -1:160/1:160) и защищает от заражения диким штаммом вируса гриппа А/СаНГогша/7/2009(НШ1) 100 % иммунизированных животных.

2. Проведенные клинические исследования показали, что вакцина «ПАНДЕФЛЮ» ареактогенна, хорошо переносится привитыми, при двукратной с интервалом 28 сут иммунизации индуцирует развитие выраженного гуморального иммунитета: у добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет уровень сероконверсии составил 87 % и уровень серопротекции - 68 %, фактор сероконверсии - 7,3; у детского контингента уровень сероконверсии составил 77 % и уровень серопротекции - 100 %, фактор сероконверсии - 5,7, и у добровольцев в возрасте от 60 лет и старше уровень сероконверсии составил 80 % и уровень серопротекции - 67 %, фактор сероконверсии - 6,8.

3. Вакцина «ПАНДЕФЛЮ» - вакцина гриппозная инактивированная субъединичная адсорбированная моновалентная, полученная методом классической реассортации на основе донора аттенуации РК/8 (НШ1), ареактогенна, безопасна и обладает высокими иммуногенными свойствами, что позволяет проводить массовую вакцинацию против гриппа А/НШ1 в условиях пандемии.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 8-й Российско-Итальянской конференции «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций» (г. Санкт-Петербург, 17-18 декабря 2009 г.), первой встрече ведущих экспертов по гриппу «Эпидемиология и иммунопрофилактика гриппа: предварительные уроки сезона 2009/2010 в условиях пандемии» (г. Москва, 26 февраля 2010 г.), научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и

клинические аспекты инфекционных болезней» (г. Иркутск, 15-17 сентября 2010г.), 9-ой Российско-Итальянской конференции «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций» (г. Вологда, 30 сентября-2 октября 2010 г.), Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (г. Санкт-Петербург, 5-6 октября 2010 г.), первом конгрессе Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням (г. Санкт-Петербург, 1-3 декабря 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 6 в изданиях, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах текста, включая 51 таблицу и 7 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 194 источник, из них 72 отечественных и 122 - иностранных.

Личный вклад автора. Автор, в составе рабочей группы, принимал участие в планировании, организации, проведении и мониторировании доклинических и клинических исследований вакцины «ПАНДЕФЛЮ», подготовке и разработке дизайна и материалов исследований (протокол доклинических/клинических исследований, брошюра для исследователя, индивидуальная регистрационная карта, информация для добровольца, информированное согласие добровольца), согласовании с регуляторными органами, сбором первичных данных. Результаты исследований проанализированы и обобщены лично автором, проведена статистическая обработка полученных данных, по результатам исследований подготовлена нормативная документация для регистрации препарата.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Клинико-эпидемиологическая характеристика вируса гриппа.

Грипп (от французского grippe) — острое инфекционное заболевание дыхательных путей, вызываемое вирусом гриппа. Входит в группу острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ). Грипп и ОРВИ занимают первое место по частоте и количеству случаев в мире, и составляет 95 % всех инфекционных заболеваний. Практически каждый человек хотя бы раз в жизни болел гриппом. Ежегодно в мире заболевает до 500 млн. человек, 2 миллиона из которых умирают [12, 14, 42, 115, 161, 177, 194]. В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. заболевших гриппом и другими ОРВИ (Заболеваемость острыми инфекциями верхних дыхательных путей в январе-декабре 2009 г. увеличилась на 21,6 % и составила 23430,6 на 100 тысяч населения против 19269,3 за аналогичный период 2008 года).

Вирусы гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae [13, 32, 193]. Они патогенны для человека, некоторых млекопитающих и многих птиц. У человека и млекопитающих вирус поражает верхние дыхательные пути, а у птиц -кишечник. Поскольку эпителий носоглотки, трахеи и крупных бронхов человека обогащен сиалогликопротеидами типа 2'-6', а легкие и бронхиолы -гликопротеидами типа 2'-3', сезонные вирусы гриппа человека инфицируют преимущественно верхние отделы и легко передаются от человека к человеку. Вирусы гриппа А, выделенные от птиц, имеют сродство к нижнему отделу респираторного тракта, вызывая, как правило, бронхопневмонию и затрудняя при этом аэрозольный тип передачи от человека к человеку. В организме свиньи содержатся клетки с альфа-2,3- и альфа-2,6-связанными рецепторами, поэтому они подвержены заболеваниям гриппа всех трех видов (свиной, птичий, грипп человека) [74, 120, 123, 137, 163, 167]. Два (или более) вируса гриппа, одновременно инфицирующих клетку одного организма свиньи, во время репликации могут обмениваться сегментами РНК, в результате

реассортации получаются новые виды вируса гриппа с отличными от родительских комбинациями генов.

Частицы вируса гриппа плеоморфны, однако наиболее распространены частицы сферической формы. Их размеры варьируют в пределах от 80 до 120 нм [110]. Снаружи частицы покрыты липидной мембраной, сформированной из мембраны зараженной клетки. В нее включены белки — гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), ответственные за узнавание клетки-мишени, проникновение внутрь и распространение вновь образованных частиц. Также мембрана вирусной частицы гриппа содержит белковые каналы (М2), необходимые для распаковки вируса внутри клетки. Под оболочкой вирусной частицы находятся белковые структуры, окружающие генетический материал вируса. Внутренние компоненты вирусной частицы (нуклеокапсид) с мембранной оболочкой и поверхностными белками связывает белок М1 (Рис. 1). Белок NP связан непосредственно с 8 молекулами РНК генома. Белки РВ1, РВ2 и РА необходимы для копирования генетического материала вируса. Помимо этого, вирус гриппа синтезирует два белка, отвечающие за противодействие интерфероновой системе противовирусной защиты (белок NS1) и за транспорт генети