Изучение формирования сывороточных антител к нейраминидазе пандемического, потенциально пандемического и сезонных вирусов гриппа А в эксперименте и клинических наблюдениях

Смолоногина, Татьяна Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение формирования сывороточных антител к нейраминидазе пандемического, потенциально пандемического и сезонных вирусов гриппа А в эксперименте и клинических наблюдениях
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение формирования сывороточных антител к нейраминидазе пандемического, потенциально пандемического и сезонных вирусов гриппа А в эксперименте и клинических наблюдениях"

На правах рукописи

00500434.5

СМОЛОНОГИНА Татьяна Анатольевна

ИЗУЧЕНИЕ ФОРМИРОВАНИЯ СЫВОРОТОЧНЫХ АНТИТЕЛ К НЕЙРАМИНИДАЗЕ ПАНДЕМИЧЕСКОГО, ПОТЕНЦИАЛЬНО ПАНДЕМИЧЕСКОГО И СЕЗОННЫХ ВИРУСОВ ГРИППА А В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И КЛИНИЧЕСКИХ НАБЛЮДЕНИЯХ

03.02.02 - Вирусология

- 1 ДЕК 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2011

005004343

Работа выполнена в отделе вирусологии им. A.A. Смородинцева Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, Санкт-Петербург

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук Дешева Юлия Андреевна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Еропкин Михаил Юрьевич

доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

оо

Защита диссертации состоится ИЪ декабря 2011 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 001.043.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоцразвития России (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова 15/17).

Автореферат разослан « ноября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

В.Ф. Суховецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Антитела к поверхностным антигенам вируса гриппа - гемагглютинину (НА) и нейраминидазе (NA) - являются одними из основных факторов, определяющих восприимчивость человека к гриппозной инфекции. Защитное действие антител к NA заключается в снижении частоты инфицирования и доли клинически выраженных форм при естественной инфекции дрейфовыми и шифтовым вариантами вируса гриппа A (Naikhin A.N., 1983; Найхин А.Н., 1986; Monto A.S., 1973). Однако неразрешенным остается вопрос о возможном вкладе антинейраминидазных антител наряду с Т-клетками памяти в гетеросубтипическую защиту в условиях смены подтипа НА, к примеру, при прогнозируемой адаптации и внедрении в циркуляцию высокопатогенных штаммов A(H5NI). Исследования в области перекрестной защиты и представленности в человеческой популяции антинейраминидазных антител, перекрестно реагирующих с NA пандемических и потенциально пандемических штаммов вируса гриппа, на настоящий момент немногочисленны (Sandbulte M.R., 2007; Pichyangkul S., 2009; Marcelin G., 2010).

Традиционно иммуногенность гриппозных вакцин оценивается исключительно по формированию сывороточных антигемагглютинирующих антител. Оценка поствакцинальных титров антинейраминидазных антител в сыворотке крови проводится редко. Работы датируются в основном 70-80 годами 20 века и были выполнены с привлечением имевшихся на тот момент методик, не предоставлявших возможности инструментального учета результатов или предполагавших использование токсичных реагентов в сложном каскаде химических реакций (Jennings R., 1981; Naikhin A.N., 1983; Кустикова Ю.Г., 1983; Найхин А.Н.,1986; Иванова В.Т., 1991). На совещаниях Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2004, 2007 и 2008 гг. была отмечена немаловажность разработки новых либо усовершенствования и стандартизации уже существующих методов выявления гуморального иммунного ответа к NA вируса гриппа. Указанный класс методик может быть перспективен в качестве дополнительного критерия оценки иммуногенности вакцинных штаммов, что особенно актуально в случае апробации вакцинных препаратов против потенциально пандемических вирусов гриппа.

Цель исследования: изучить продукцию антинейраминидазных антител при иммунизации волонтеров живыми вакцинами против сезонного, пандемического и потенциально пандемического гриппа А.

Задачи исследования: 1. Подготовить и охарактеризовать диагностические реассортантные штаммы, содержащие NA пандемического и потенциально пандемического вирусов гриппа А, для использования в тестах, направленных на выявление антинейраминидазных антител.

2. Отработать методики определения сывороточных антител к нейраминидазе дрейфовых и шифтовых вирусов гриппа А с применением диагностических реассортантов.

3. С помощью адаптированной твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности (РИНА), модификации теста постадсорбционной микронейтрализации и иммуноферментного анализа оценить выработку гомологичных антинейраминидазных антител у волонтеров, привитых различными живыми гриппозными вакцинами (ЖГВ).

4. Охарактеризовать фон и поствакцинальную продукцию перекрестно-реагирующих антинейраминидазных антител к пандемическому штамму вируса гриппа А(Н 1N1) и вирусу гриппа птиц Л(Н5Ы1) у лиц различного возраста.

5. На модели экспериментальной гриппозной инфекции определить протективные свойства сывороточных антинейраминидазных антител.

Научная новизна работы.

1. Впервые проведена оценка иммуногенности пандемической ЖГВ подтипа А(НШ1) и ЖГВ потенциально пандемического подтипа Н5 по интенсивности выработки антинейраминидазных антител. Выдвинуто положение о целесообразности использования предложенных тестов для дополнительной характеристики иммуногенности вакцинных препаратов.

2. Впервые изучено формирование сывороточных антител, специфичных к ЫА пандемического штамма А(НШ1) и потенциально пандемического вируса птичьего гриппа А(Н5>Л), в клинических испытаниях сезонной трехвалентной ЖГВ. Показано, что выраженная стимуляция продукции иммуноглобулинов, перекрестно реагирующих с NA шифтовых вариантов вируса гриппа, у молодых людей 18-20 лет при однократном введении препарата отсутствует.

3. Впервые выявлен фон сывороточных перекрестно-реагирующих антител к ИЛ вируса А(Н5М1), а также к КА пандемического штамма А(НШ1) до его внедрения и на момент начала циркуляции в человеческой популяции по результатам обследования волонтеров различного возраста, проживающих на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области.

Практическая значимость работы. В результате выполнения работы автором подготовлен ряд оригинальных диагностических реассортантных штаммов, предназначенных для выявления сывороточных антител к NA дрейфовых и шифтовых вариантов вирусов гриппа, включая вирусы гриппа птиц А(П5Ы1) и пандемические штаммы А(НШ1) 2009 г. С учетом биологических свойств диагностических реассортантов модифицированы реакция постадсорбционной микронейтрализации (РПН) и твердофазная РИНА. Эти методы могут быть использованы для количественной характеристики индукции сывороточных антинейраминидазных антител у людей, привитых различными гриппозными вакцинами, а также для

определения уровня предсуществующего в человеческой популяции иммунитета к предполагаемым пандемическим штаммам вируса гриппа А.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Подготовленные и охарактеризованные диагностические реассортантные штаммы на основе вируса гриппа лошади А(Н7Ш), обладающие NA вирусов гриппа человека, птиц и пандемического штамма 2009 г., позволяют специфично оценивать сывороточные антинейраминидазные антитела в разработанных модификациях твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности и реакции постадсорбционной микронейтрализации, а также в иммуноферментном анализе.

2. Иммунизация сезонной, пандемической и прототипом пандемической ЖГВ в 1,2-2,4 раза увеличивает продукцию антител к нейраминидазе вакцинного вируса у волонтеров 18-60 лет.

3. Часть волонтеров отвечает на иммунизацию ЖГВ достоверным приростом гомологичных сывороточных антинейраминидазных антител в отсутствие сероконверсий антител к гемагглютинину вакцинного штамма. Определение антинейраминидазных антител в сыворотке крови предоставляет дополнительную информацию об эффективности стимуляции гуморального иммунного ответа гриппозными вакцинами против сезонного, пандемического и потенциально пандемического гриппа А.

4. Перекрестно-реагирующие антинейраминидазные антитела к штамму АУКапифорния/07/09(НШ1) обнаруживаются в сыворотках крови волонтеров 18-20 лет, обследованных еще до вступления пандемического вируса А(НШ1) в активную циркуляцию. Антинейраминидазные антитела к вирусу гриппа птиц А/Вьетнам/ 1203/04(Н5>11) выявляются у обследованных лиц 1820 лет, не имевших контакта с указанным штаммом.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов. Вклад соавторов заключается в проведении вакцинации и сборе материалов в клинических испытаниях с участием волонтеров. Автор выражает благодарность Гореву Н.Е. за подготовку диагностического реассортанта КМ1/99-Иитап А(Н7Ы1) и Дониной С.А. за постановку реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с сыворотками крови клинически здоровых в отношении респираторных заболеваний волонтеров в возрасте 1-82 лет, собранными в августе-сентябре 2010 г. Научно-исследовательской лабораторией «Диагностика».

Внедрение результатов работы. Авторские диагностические реассортантные штаммы депонированы в Государственной коллекции вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России (номера депонентов: ГКВ № 2473, 2474, 2475). По теме работы получен 1 патент на изобретение. Подана 1 заявка на патент.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены на Международной конференции «New Cells for New Vaccines IV — Changing the Vaccine Landscape: Recombinant Systems» (Уилмингтон, штат Делавэр, США, 11-14 октября 2009), IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 25-26 февраля 2010 г.), Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г), Международной конференции «Options for the control of influenza VII» (Гонконг, Китай, 3-7 сентября 2010), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2010 года), Международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодёжь — медицине будущего» (Одесса, Украина, 28 - 29 апреля 2011 года).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах и сборниках научных статей (из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК), 1 патент РФ и 5 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 190 страницах текста, включая 22 таблицы и 22 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 197 источников. Из них 20 отечественных и 177 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

предоставленные Центром по контролю и предупреждению заболеваний (Атланта, Джорджия, США), а также реассортантные вакцинные штаммы для ЖГВ на основе донора аттенуации Lenl7: 7:1 реассортант А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2) [Lenl7/H5N2] и штамм

А/17/Калнфорния/09/38(Н INI) из коллекции отдела вирусологии НИИЭМ СЗО РАМН. Диагностический штамм RNl/99-human A(H7N1), содержащий NA от эпидемического вируса А/Новая Каледония/20/99(Н IN 1) [A(H1N1)1999], был передан из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ.

Также в работе использовали вирус А/Пуэрто Рико/8/34(НШ1) [PR8] и реассортантные вакцинные штаммы для ЖГВ А/17/Кшшфорния/04/06(НЗ№), H/32/5(HlNl), A/17/Новая Каледония/99/145(H1N1), A/17/Соломоновы острова/06/9(НШ1) и А/17/Брисбен/07/28(НШ1), полученные из коллекции отдела вирусологии НИИЭМ СЗО РАМН.

Культивирование вирусов. Все вирусы культивировали в 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) при температуре 34°С в течение 24-48 часов. Культивирование диагностических реассортантов и родительских штаммов также производилось на перевиваемой клеточной линии MDCK (NBL-2), полученной из Центра по контролю и предупреждению заболеваний (Атланта, Джорджия, США), с последующим определением 50%-ой культуральной инфекционной дозы (КИД50) по протоколу ВОЗ (2002). Учет результатов проводился по наличию вируса в культуральной среде согласно данным реакции гемагглютинации (РГА); цитопатическому действию вируса, ■ оцениваемому по окрашиванию 0,5% раствором кристаллического фиолетового, или связыванию моноклональных антител к NP-белку вируса гриппа A (Rowe, 1999).

Получение диагностических реассортантиых штаммов на основе вируса гриппа лошади А/лошадь/Прага/1/56(Н7Ш) проводили в РКЭ по описанным Г.И. Александровой методикам (1977). Анализ состава генома реассортантов осуществляли посредством обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции с применением специфичных праймеров, разработанных А.И. Климовым (1995) и лично автором с помощью компьютерной программы FastPCR, и последующей рестрикции.

Лабораторные животные. Самцы линейных мышей CBA/J в возрасте 10-12 недель (питомник «Рапполово» РАМН, Ленинградская область).

Репродукция вирусов в дыхательных путях мышей. Мышам под легкой эфирной анестезией интраназально вводили 50 мкл аллантоисной жидкости с содержанием вируса Ю'-107 50% эмбриональных инфекционных доз (ЭИД50). Эвтаназию проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.03.1977 г.). Титры вирусов определяли в легких подопытных животных на 3-й сутки по результатам титрования суспензии органов в РКЭ. 50% мышиную инфекционную дозу (МИД50) рассчитывали по методу Reed-Muench (1938).

Моделирование иммунного ответа kNA. Мышам под легкой эфирной анестезией двукратно внутримышечно вводили 1 мкг рекомбинантной мультимерной NA штамма A(HlNl)pdm2009' в смеси с неполным адъювантом Фрейнда в объеме 100 мкл. Отдельным группам интраназально двукратно вводили 300 МИДзо/0,05мл реассортантных штаммов RN1/04-

1 Препарат предоставлен B.J. Bosch, Университет г. Утрехта, факультет ветеринарной медицины, отдел инфекционных заболеваний и иммунологии, г. Утрехт, Нидерланды.

avian A(H7N1), RNl/09-swine A(H7N1). Интервал между прививками составлял 21 сутки. В качестве препарата плацебо использовали фосфатно-солевой буфер. Отбор проб крови у подвергнутых наркозу и обездвиженных подопытных животных производился на 21 сутки после повторной иммунизации посредством вскрытия подключичного сосудистого пучка.

Реинфекция иммунизированных лабораторных животных одним из указанных вирусов: 1) 103,5 МИД50/0,05мл штамма A(HlNl)pdm2009, 2) 50 МИД5о/0,05мл штамма PR8/H5N1-RG, 3) 30 МИД5о/0,05мл штамма PR8 производилась на 21-е сутки после ревакцинации. Уровень репродукции заражающего вируса в легких определяли на 3-й сутки после инфицирования.

Образцы сывороток крови волонтеров. В исследование были взяты сыворотки крови клинически здоровых добровольцев 18-60 лет с неизвестным анамнезом в отношении заболевания гриппом и противогриппозной вакцинации, участвовавших в клинических испытаниях а) сезонной трехвалентной ЖГВ 2005 г., включавшей аттенуированные штаммы A/17/Новая Каледония/99/145(H1N1), А/17/Калифорния/04/06(НЗ№) и В/60/Джилин/01/1 (п=56); б) моновалентной пандемической ЖГВ на основе вируса А/17/Калифорния/2009/38(111N1) (п=60); в) прототипа пандемической ЖГВ, подготовленного из штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5М2) (1-я и 2-я фазы клинических испытаний, п=66). Вакцина производства ФГУП «Микроген» и плацебо (физиологический раствор) в виде шифрованных препаратов вводились интраназально по 0,25 мл в каждый носовой ход по следующим схемам: однократно (сезонная ЖГВ) или двукратно с интервалом 10 (пандемическая ЖГВ) и 21 (ЖГВ подтипа A(H5N2)) день. Образцы капиллярной крови волонтеров были получены до вакцинации, перед ревакцинацией и на 21 день после последней прививки. Уровень коллективного иммунитета к NA вируса гриппа осенью 2010 г. оценивали по результатам тестирования 68 образцов капиллярной крови, полученных от волонтеров 18-76 лет, предоставивших письменное добровольное информированное согласие об участии в иммунологических исследованиях, и 95 сывороток крови лиц от 1 года до 82 лет, переданных директором Научно-исследовательской лаборатории «Диагностика» Суворовой М.А. (г. Санкт-Петербург, Россия).

Иммуногенность ЖГВ и прототипов субъединичных вакцин оценивалась в РТГА, реакции микронейтрализации (РН) с сыворотками крови по описанным методикам (Kendal, 1982; ВОЗ, 2002). Ряд дополнительных методик использовали для выявления сывороточных антител к NA.

Реакция постадсорбционной микронейтрализации повторяла протокол РН на монослое клеток MDCK за исключением того, что двукратные разведения сывороток крови, присутствовавшие в среде на протяжении всего срока инкубации (72 часа) планшетов при 34°С, вносили в лунки уже после сорбции 10 КИД5о/0,1мл диагностического штамма на

клеточных рецепторах в.течение 1 часа и удаления не связавшихся вирусных частиц.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Для сенсибилизации планшетов использовали препараты NA или очищенные диагностические штаммы а, концентрации 0,5 мкг/мл и 100 агглютинирующих единиц (АБ). Постановка реакции осуществлялась по протоколу Т. Rowe (1999) с выделением этапа блокировки неспецифической сорбции антител добавлением 4% раствора эмбриональной бычьей сыворотки в отдельную стадию.:

Твердофазная . реакция ингибирования нейраминидазной активности проводилась по протоколу, основанному на опубликованной ранее методике (Lambre G.R., 1990), включая стадии десиализации натурального субстрата (фетуина), сорбированного на полимерном носителе, в присутствии активной NA диагностических штаммов; специфического связывания лектина арахиса, конъюгированного с пероксидазой хрена, на демаскированных сахаридах; определения количества связавшегося конъюгата по выходу продукта пероксидазной реакции и оценки степени ингибирования сиалидазной активности в присутствии антител к NA. Модификация метода касалась его адаптации для полученных диагностических штаммов. Титр антинейраминидазных антител рассчитывался как величина, обратная разведению образца, дающего 50%-ое ингибирование активности NA.

Для постановки серологических тестов, за исключением РН и твердофазной РИНА, использовали обработанные экстрактом холерного вибриона (RDE, Denka Seiken СО) сыворотки крови. Требуемый для ИФА и твердофазной РИНА очищенный препарат вируса получали при помощи ультрацентрифугирования на ступенчатом градиенте сахарозы (Beckman coulter OptimaTM L-100 XP Ultracentrifuge) по протоколу M. Gallagher (1984). За достоверную сероконверсию для ИФА и твердофазной РИНА был принят 2-хкратный и более прирост титра антител (Cate T.R., 2010), для прочих серологических тестов - увеличение титра в 4 и более раз.

Оценка эволюционных изменений аминокислотных последовательностей и построение филогенетических деревьев осуществлялось при помощи программ GeneDoc (версия 2.6.002) и MEGA (версия 4) с применением дистанционного метода ближайшего соседства.

Статистическая обработка данных производилась с помощью статистического пакета «Statistica» (версия 6,0) с использованием параметрических тестов (t-тест Стьюдента, дисперсионный анализ) или непараметрических критериев (Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова, знаковых рангов Уилкоксона, ранговый дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса/Фридмана, корреляционный анализ Спирмена). В случае номинальных данных применяли критерии хи-квадрат Пирсона, двусторонний вариант точного критерия Фишера, критерий Мак-Нимара, Q-

критерий Кокрена. Для представления полученных данных использовали следующие показатели описательной статистики: среднегеометрические титры (СГТ); для данных, не подчиняющихся нормальному распределению, -медиана (Me) и квартили (Ql; Q3).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Отработка методик выявления сывороточных антител к NA эпидемического, пандемического и потенциально пандемического вирусов гриппа с использованием диагностических реассортантов.

Известен целый ряд методик определения антител к NA вируса гриппа: реакция ингибирования элюирования вируса с эритроцитов (Appleyard G., 1977), лектин-тест (Luther P., 1983), радиальная диффузия и одномерный радиальный гемолиз в агарозном геле (Schild G.C., 1972; Callow К.А., 1976), классическая и твердофазная РИНА (Aymard-Henry M., 1973; Lambre C.R., 1990), реакция постадсорбционной нейтрализации (Dowdle W.R., 1974) и ИФА (Khan M.W., 1982). Указанные тесты основаны на количественной оценке аффинного связывания антител с антигеном; выявлении оказываемого антителами эффекта на ферментативную активность NA по отношению к натуральному субстрату in vitro или на ее функционирование в естественном цикле репродукции вируса в клеточной системе. Для исследования нами были выбраны 3 последних метода, поскольку они, во-первых, обладали наибольшей чувствительностью и лучшей воспроизводимостью в своем подклассе и требовали наименьших временных затрат, во-вторых, предоставляли возможность инструментального учета результатов, в-третьих, не предполагали использование вредной реагентики.

Методики по выявлению в иммунных сыворотках антител к NA основываются на использовании очищенного антигена или особых штаммов вируса гриппа с нерелевантным НА во избежание искажения результатов из-за присутствия в исследуемых образцах антител к главному поверхностному антигену вируса гриппа. В связи с чем были подготовлены диагностические реассортантные штаммы на основе вируса А/лошадь/Прага/1/56(H7N7) с наследованием его НА, имеющего низкий процент гомологии в аминокислотной последовательности с соответствующим гликопротеином современных эпидемических и предположительно пандемических штаммов. Полученные реассортанты RN2/57-human A(H7N2), RNl/04-avian A(H7N1) и RNl/09-swine A(H7N1) содержали NA штаммов А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), А/Вьетнам/1203/04(H5N 1 ) и А/Калифорния/07/09(НШ1) соответственно.

Модификация теста постадсорбционной микронейтрализации заключалась в адаптации диагностических реассортантов к репродукции в культуре клеток MDCK, чего удалось добиться 5-6 пассажами вирусов в указанной системе, и последующем подборе метода инструментального учета результатов. Так, окрашивание кристаллическим фиолетовым клеточного

монослоя показало, что даже после серии пассажей в культуре клеток МПС К реассортант КМ1/04-ау1ап А(Н7М1) практически не обладал цитопатическим действием, хотя его репродукция и была подтверждена в РГА с культуральными надосадками. В то же время, отсутствие выраженной деструкции клеточного монослоя обосновывало применение ИФА с моноклональными антителами к ЫР-белку, по чувствительности сопоставимого с РГА, для выявления репродукции диагностических штаммов в указанной системе.

Модификация твердофазной РИНА касалась подбора оптимальных условий протекания ферментативной реакции для 1ЧА диагностических штаммов с целью увеличения чувствительности метода; определения дозы вирусов и ее стандартизации для обеспечения возможности прямого сопоставления титров сывороточных антител к различным вариантам Для реассортантов подтипа А(Н7>П) максимальное накопление продукта сиалидазной реакции за 1 час инкубации с субстратом наблюдали при рН фосфатно-солевого буфера в интервале 6,90-7,15 со сдвигом в сторону слабокислых значений (рН = 6,5-7,0) в случае N1 пандемического штамма. N2 штамма I ,еп 17 в составе диагностического реассортанта, напротив, демонстрировала минимум активности в указанном диапазоне рН, которая повышалась в 1,6 и 2,0 раза при закислении (до рН = 6,0) и защелачивании (до рН = 8,0) среды соответственно. За оптимальную для постановки твердофазной РИНА была принята доза вируса 128 АЕ/50 мкл (рис. 1).

RNl/99-human A(H7N1) рН = 6,9

RNl/04-avian A(H7N1) рН = 6,9

RNl/09-swine A(H7N1) рН = 6,9

RN2/57-human A(H7N2) рН = 7,9

4 6 S 10 доза вируса, ^¿(АЕ)

Рисунок 1. Накопление продукта сиалидазной реакции за 1 час инкубации при оптимальном рН буферного раствора для различных концентраций диагностических реассортантиых штаммов

Выбранная рабочая доза вируса, во-первых, принадлежала к диапазону линейной зависимости выхода продукта сиалидазной реакции при оптимуме рН буферного раствора от концентрации вируса, во-вторых, обеспечивала достаточный уровень сигнала (оптическая плотность (ОП) = 0,4-0,6) при считывании результатов на спектрофотометре ELx800. Однако для этого длительность контакта штаммов RNl/04-avian A(H7N1) и RNl/99-human

А(Н7М1), унаследовавших наименее активные ЫА вирусов А/Вьетнам/1203/04(Н5ТЧ1) и А/Новая Каледония/20/99(НШ1), с субстратом была увеличена до 2 часов.

Применение модифицированных методик при изучении иммуногенности ЖГВ и уровня коллективного иммунитета.

Оценка уровня антинейраминидазных антител у волонтеров 18-20 лет, привитых сезонной трехвалентной ЖГВ осенью 2005 г. Объективность оценки антинейраминидазных антител с применением диагностических реассортантов на основе вируса гриппа лошади А(Н7Ш) была подтверждена отсутствием реагирования его НА в РТГА с парными сыворотками крови 56 участвовавших в клинических испытаниях волонтеров. Тестирование в твердофазной РИНА образцов сывороток крови, полученных до вакцинации, показало наличие у 23 обследованных добровольцев (41,1%) антител, специфичных к ЫА актуального на тот момент эпидемического штамма А/Новая Каледония/20/99(НШ1), в титрах >1:20 (рис. 2). У 9 (16,1%) и 4 (7,1%) молодых людей также были обнаружены перекрестно-реагирующие антитела к NA вируса птичьего гриппа А(115Ы1) и пандемического штамма А(НШ1) в указанных титрах в отсутствие антигемагглютинирующих антител к двум шифтовым вариантам вируса гриппа. Значение 1:40 титр перекрестно-реагирующих антинейраминидазных антител к штаммам А/Вьетнам/1203/04(Н5Ы1) и А/Калифорния/07/09(НШ1) превысилу4-х (Ме=Т:74,1)и 1-го волонтера соответственно.

I з 8 80

О. х - ■ !- т ^ 60 г 0 л

? о £ 20

? И £ _

А(Н11\11)1999 РК8уН5И1-Ке А(Н11Ч1)рс1т2009

Вантигемагглютинирующие антитела Вантинейраминидазные антитела

Рисунок 2. Донривнвочный уровень сывороточных антител к НА и штаммов А/Новая Калединия/20/99(НINI), А/Вьетнам/1203/04(1151\1) и А/КалнфорнияЛ)7/09(ШМ) среди 56 волонтеров 18-20 лет (осень 2005 г.). По данным РТГА и твердофазной РИНА.

Вертикальными отрезками обозначены 95% доверительные интервалы (ДИ).*,** - р < 0,001

Различия в долях серопозитивных лиц, выявленных в твердофазной РИНА с тремя антигенами, согласовывались с данными проведенного филогенетического анализа первичных последовательностей КА, взятых из базы данных вирусов гриппа Национального центра биотехнологической информации. Так, птичьи вирусы А(Н5Ы1) периода 2003-2010 гг. обладали большей степенью гомологии аминокислотной последовательности КА с эпидемическими штаммами А(Н11Ч1) 1999-2009 гг. выделения (83,3% без учета делеции 20 аминокислот в положении 49-68), чем пандемические вирусы А(НШ1)- 80,9%.

46,4 *

1 141,1

ипв у 16,1 **

■ 1 1 1 ■ 0.0

Согласно данным традиционной методики оценки иммунологической эффективности противогриппозной вакцинации (РТГА), однократная иммунизация ЖГВ стимулировала среди серонегативных волонтеров (с титром антигемагглютинирующих антител <1:20 до прививки) увеличение СГТ антител, специфичных к А(Н1Ы1) компоненту ЖГВ, в 1,7 раз (р=0,01; п=15) при 26,7% сероконверсий. В отличие от антител к НА, 100% сероконверсий которых приходилось на долю лиц, серонегативных к штамму А/17/Новая Каледония/99/145(Н ПчП), статистически значимое увеличение СГТ антинейраминидазных антител (твердофазная РИНА) к вакцинному компоненту подтипа А(НШ1), наблюдалось не только среди серонегативных (п=15), но и у серопозитивных (п=14) по данным РТГА волонтеров (рис. 3). В связи с этим оценку иммуногенности ЖГВ по формированию антител к N1, гомологичной и антигенно удаленной от КА вакцинного штамма А/17/Новая Каледония/99/ 145(Н1Ж), проводили в расширенных группах привитых и плацебо.

Препарат: вакцина (п=29)

Препарат: плацебо (п=27)

6,2 5,0 4,8

5 5 N 4,6 < I о>

-154,4

5 J | 4,2

5 к Е 4,о I я

" £ 1 я

а ° 38 г- 5

£ 3 з,б

3,4

до вакцинации

после вакцинации

до вакцинации

после вакцинации

—fr- серонегативные по данным РТГА волонтеры (титр <=1:20) серопозитивные по данным РТГА волонтеры (титр >=1:40)

Рисунок 3. Формирование антииейраминидазных антител после вакцинации 56 волонтеров 18-20 лет трехвалентной ЖГВ 2005 г. в зависимости от исходного титра антигемагглютинирующих антител к штамму А/17/11овая Каледония/99/145(Н1Ш). По данным твердофазной PI1IIA. Многофакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями: F(l, 46) = 0,02, р = 0,89; * - р = 0,02; ** - р < 0,001 (критерий Тьюки). Вертикальные отрезки обозначают 95% ДИ для среднеквадратичного среднего (LS mean).

По данным твердофазной РИНА с диагностическими реассортантами A(H7N1) исходный уровень антинейраминидазных антител в группах плацебо и вакцинированных лиц совпадал. Через 3 недели после прививки в группе вакцинированных титр антител к NA эпидемического вируса A(H1N1) 1999 г. (Me (Q1;Q3) = 4,0 (3,4;5,3) log2) был статистически значимо (критерий Уилкоксона: р = 0,0002) выше соответствующего показателя до прививки (Me (Q1;Q3) = 3,7 (3,0;4,8) log2) при проценте достоверных приростов - 20,7%. Иммунизация сезонной ЖГВ не приводила к статистически значимому

увеличению титров перекрестно-реагирующих антинейраминидазных антител к вирусу гриппа птиц A(H5N1) и пандемическому штамму A(H1N1) в среднем по группе (р>0,85). Хотя достоверные приросты титров указанных антител все же были зафиксированы в 2-х (6,9%) и в одном случае (3,5%) соответственно. В группе плацебо изменения серологического показателя, оцениваемого в твердофазной РИНА как с гомологичной,,так и антигенно удаленной N1, отмечено не было (р>0,15); сероконверсии отсутствовали.

Применение для количественной оценки содержания антинейраминидазных антител в сыворотке крови РПН с диагностическими реассортантами A(H7N1) позволило выявить перед прививкой титры антител >1:20 к NA эпидемического вируса A(H1N1) у 82,1% (46 из 56), к NA птичьего вируса A(H5N1) - у 19,6% (11 из 56) волонтеров. При этом титры, превышавшие значение 1:40, были обнаружены у 37 (Ме=1:160) и 5 (Ме=1:80) обследованных лиц соответственно, что свидетельствовало в пользу большей чувствительности и меньшей специфичности указанного метода по сравнению с твердофазной РИНА в полном согласии с данными литературы (Dowdle W.R., 1976).

По результатам реакции постадсорбционной микронейтрализации кратность прироста СГТ антител к гомологичной N1 для серонегативных (согласно данным РТГА) вакцинированных волонтеров составила 2,0 (р = 0,03) при СГТ после прививки, равном 1:176, и 46,7% (7 из 15) 4-хкратных и более приростов. В то же время увеличение СГТ антител к гетерологичной нейраминидазе N1 птичьего происхождения с 1:16,6 до 1:20,9 не являлось статистически значимым (р = 0,17), а процент сероконверсий достигал лишь 13,3% (2 из 15). В группе плацебо статистически значимых изменений в титрах антител к NA вакцинного штамма A(H1N1) или вируса гриппа птиц A(H5N1) не наблюдалось (р>0,3), достоверные приросты к гомологичной и антигенно удаленной NA были выявлены в 6,7% (1 из 15) и 0% случаев.

Таким образом, два используемых серологических теста, направленных на выявление антинейраминидазных антител, согласуются в суждениях о характере иммунологических изменений в группе привитых волонтеров. Вариации в конкретных значениях оцениваемых с их помощью параметров могут быть объяснены различием выявляемых субпопуляций антинейраминидазных антител (Webster R.G., 1984).

Оценка антинейраминидазных антител у волонтеров, привитых осенью 2009 г. моновалептной ЖГВ против пандемического гриппа A(H1N1), проводилась в твердофазной РИНА с диагностическим реассортантом RNl/09-swine A(H7N1). Исходное распределение титров сывороточных антител к NA штамма A(HlNl)pdm2009 среди 60 добровольцев в возрасте 18-20 лет, участвовавших в клинических испытаниях, не отличалось от фона перекрестно-реагирующих антител к пандемическому вирусу, выявленного задолго до начала его циркуляции при тестировании 56 образцов сывороток крови, собранных в 2005 г. (р>0,05).

Действительно, к осени 2009 г. лишь небольшая часть обследованных волонтеров, по всей вероятности, имела контакт с новым вариантом вируса A(H1N1): процент серопозитивных лиц по отношению к НА штамма A(HlNl)pdm2009 составил 5% (3 из 60), из них 1,7% (1 из 60) обладали титром антигемагглютинирующих антител >1:40.

Иммуногенность пандемической моновалентной ЖГВ оценивалась по итогам двукратной вакцинации 17 серонегативных по данным РТГА добровольцев. Интраназальное введение аттенуированного штамма А/17/Калифорния/09/38(НШ1) эффективно стимулировало выработку как антинейраминидазных, так и антигемагглютинирующих антител (табл. 1). У лиц, перенесших естественную инфекцию пандемическим штаммом A(H1N1)2 (п=5), антитела к его НА и NA присутствовали в сыворотке крови в СГТ 1:183,8 и 1:155,2, превышавших соответствующие показатели после прививки ЖГВ в 14,4 (р=0,01) и 8,7 (р < 0,001) раз.

Таблица 1. Формирование сывороточных антител к поверхностным гликопротеинам штамма Л(111М1)р(1т2009 у волонтеров 18-20 лет, привитых моновалеитиой ЖГВ А/17/Калифорния/09/38(Ш1У1). По данным РТГА и твердофазной 1'ИИЛ_

Группа Число лиц Антигемагглютинирующие антитела Антинейраминидазные антитела

%4-кратных и более приростов титра СГТ до прививки СГТ после прививки %2-кратных и более приростов титра СГТ до прививки СГТ после прививки

ЖГВ двукратно 17 47,1 6,1' 12,8' 23,5 11,72 17,82

Плацебо 6 0,0 6,3* 6,3J 0,0 9,14 9,54

р = 0,008;2 - р = 0,01; •4 - р > 0,7

Формирование антинейраминидазных антител в ответ на прививку ЖГВ или естественную инфекцию было подтверждено в ИФА с очищенным вирусом 1Ш1/09-з\уте А(Н7М1). Так, возрастание СГТ в 1,4 раза (р = 0,041) и 29,4% достоверных приростов титров сывороточных к КА

пандемического штамма ' было отмечено в группе двукратно иммунизированных лиц, но не среди волонтеров, получивших препарат плацебо (р = 0,3). Объективность метода в свою очередь была обоснована корреляцией данных, полученных с использованием в качестве антигена цельного реассортанного" штамма и очищенной NA вируса А(НШ1)рёт20 093: коэффициент корреляции Спирмена г8 = 0,403 (р < 0,001, п = 84).

Оценка антинейраминидазных антител в клинических испытаниях ЖГВ «Орвакс» подтипа А(Н5Ю). Дополнительная информация об иммуногенности вакцинного препарата на основе штамма

Образцы сывороток крови были предоставлены Е.М. Войдеховской, ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ, лаборатория биотехнологии и диагностических препаратов, г. Санкт-Петербург, Россия

3 Препарат подготовлен A.A. Шалджяном и М П: Грудининым, ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ,

лаборатория молекулярной вирусологии и генной инженерии, г. Санкт-Петербург, Россия.

А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш) на каждой стадии клинических испытаний была получена с помощью твердофазной РИНА с диагностическим реассортантом ГШ2/57-Ьитап А(Н7Ы2) после того, как было показано отсутствие взаимодействия НА вируса гриппа лошади А(Н7Ш) с исследуемыми сыворотками крови в РТГА, что обосновывало объективность результатов серологического теста. ■: . ..

Двукратная прививка .с интервалом, в. 21 день различными дозами атгенуированного вируса А(Н5Ы2) не только эффективно стимулировала выработку сывороточных нейтрализующих антител к штамму Ьеп17/Н5Ы2 (табл. 2), но также привела к статистически значимому увеличению титров антител к вакцинного вируса, унаследованной им от донора Ьеп17 и имевшей 95% и 83-84% гомологии аминокислотной последовательности с КА родительского апатогенного птичьего штамма и современных изолятов А(НЗК2) соответственно. В группе вакцинированных было отмечено 19,533,3% достоверных приростов антинейраминидазных антител. Какие бы то ни было изменения оцениваемых серологических параметров в группе плацебо отсутствовали.

Таблица 2. Формирование сывороточных антител к поверхностным гликопротсинам штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5^) у волонтеров 18-60 лет, двукратно привитых моиовалентной ЖГВ «Орвакс» подтипа А(Н5№). По данным РН и твердофазной РИНА

Препарат Нейтрализующие антитела к шпату Ьеп 17/115Ы2 Антитела к ЫА штамма Ьеп17/Н5№

Число лиц Титр до вакцинации Ме(01;03) 10§2 -г Титр после ревакцинации Ме(<21;(33) 1о§2 Число (%) 4- кратных и более приростов титра Титр до вакцинации Ме(<31;(33) 1о§2 Титр после ревакцинации Ме(С)1;(33) !og2 Число (%) 2-кратных и более приростов титра

Вакцина (6,9 ^ ЭИДч/0,5мл) 18 2,3' (2,3;2,3) 4,3' (3,3;4,3) 9(50) 2,32 (2,3;3,4) 3,32 (2,3;6,7) 6 (33,3)

Вакцина (8,3 ^ ЭИД5о/0,5 МЛ) 41 2,33 (2,3;2,3) з,з3 (2,3;4,3) 13(31,7) 2,84 (2,3;6,2) 4,14 (2,3;6,3) 8(19,5)

Плацебо 7 2,35 (2,3;3,3) 2,35 (2,3;3,3) 0(0) 3,36 (2,3;7,1) 2,96 (2,3 ;6,6) 0(0)

__-.,-),-у _

1 - р = 0,001;2 - р = 0,016;3'4 - р < 0,001;5'6 - р > 0,05

Имела место обратная зависимость интенсивности антителообразования к ИЛ атгенуированного вируса от исходного уровня антинейраминидазных антител. Так, статистически значимое увеличение титра антител к КА через три недели после ревакцинации дозой вируса 8,3 ^ ЭИД5о/0,5 мл было характерно для исходно серонегативных (титр <1:20, п = 26) по данным твердофазной РИНА волонтеров (р = 0,002), но не для серопозитивных лиц (п = 15) с медианой титра 1:123,3 (р = 0,13).

Вопрос о согласованности сероконверсий антител к НА и 1УА вакцинных штаммов у привитых добровольцев был рассмотрен на массиве

полученных данных по иммуногенности различных ЖГВ (рис. 4). Процент совпадения результатов двух тестов, направленных на выявление иммуноглобулинов к двум поверхностным гликопротеинам вируса, (РТГА и реакции микронейтрализации, с одной стороны, твердофазной РИНА, реакции постадсорбционной микронейтрализации и ИФА, с другой) колебался в пределах от 53% до 73%. При этом только в случае иммунизации волонтеров ЖГВ подтипа А(Н5№) между сероконверсиями нейтрализующих и антинейраминидазных антител присутствовала статистическая взаимосвязь средней силы (критерий Фишера: р = 0,084; критерий V Крамера = 0,33). Доля лиц, ответивших на вакцинацию достоверным приростом гомологичных сывороточных антинейраминидазных антител без сероконверсий антигемагглютинирующих или нейтрализующих антител, составила 17-33% при однократной прививке сезонной трехвалентной ЖГВ, 6-7% при двукратном интраназальном введении пандемической и прототипа пандемической ЖГВ (рис. 4).

70 60 50 40 30 20 10 О

33,3

20,0

17,3

шй идИ " Ни

— . шзтт ■ мяям

70 60 50 40 30 20 10 0

• - 5,9 —

■—

70 60 50 40 30 20 10 О

РТГА/РИНА РТГА/РПН РТГА/ИФА а - к NA □ -

РТГА/РИНА к НА и NA га - к НА

7,3

РН/РИНА

Рисунок 4. Согласованность сероконверсий антител к НА и NA при иммунизации волонтеров А, сезонной трехвалентной ЖГВ 2005 г. (оценка иммуногенности A(fUNl) компонента препарата) Б. моновалентной ЖГВ против пандемического гриппа A(H1N1) В. моновалентной ЖГВ «Орвакс» подтипа A(H5N2)

Оценка уровня коллективного иммунитета к нейраминидаче эпидемического и пандемического вирусов гриппа A(HIN1) проводилась по результатам тестирования 163 сывороток крови лиц в возрасте от 1 года до 82 лет с неизвестным анамнезом в отношении заболевания гриппом и противогриппозной вакцинации, обследованных осенью 2010 г. Прежде всего, для подтверждения специфичности твердофазной РИНА с диагностическими реассортантами часть образцов была параллельно протестирована со штаммом RNl/09-swine A(H7N1) и рекомбинантной мультимерной NA вируса A(HINl)pdm2009. Наличие сильной статистической взаимосвязи между полученными значениями титров сывороточных антител (коэффициент ранговой корреляции Спирмена 0,72; п=83; р<0,0001) позволило провести дальнейшее изучение уровня коллективного иммунитета kNI с использованием цельных вирусов.

По прошествии немногим более года с момента внедрения в циркуляцию среди человеческой популяции штаммов, подобных А/Калифорния/07/09(Н IN1), титры антигемагглютинирующих антител к пандемическому вирусу среди обследованных волонтеров все еще были ниже, чем титры соответствующих антител к штамму А/Новая Каледония/20/99(НШ1), долгое время (до 2006 г.) находившемуся в циркуляции без значительных антигенных изменений (р<0,0001) (рис. 5).

Титр антител к НА Титр антител к NA

<1:20 >1:20- >1:40- >1:80 <1:20 >1:20- >1:40- >1:80

<1:40 <1:80 <1:40 <1:80

@ А/Новая Каледония/20/§9(Н11Ч1) 0 А/КалифорнияА)7Д)9(Н1М1)

Рисунок 5. Распределение титров антител к поверхностным гликопротеинам эпидемического и пандемического штаммов подтипа A(H1N1) среди ¡63 волонтеров от 1 года до 82 лет (осень 2010 г.). По данным PTI'A и твердофазной РШ1А

Антитела к NA указанного эпидемического вируса также присутствовали в популяции в статистически значимо более высоких титрах по сравнению с антинейраминидазными антителами к штамму А(Н 1N1 )pdm2009 (р<0,0001).

Наивысший уровень антител к поверхностным гликопротеинам штамма А/Новая Каледония/20/99(НINI) наблюдался в группе волонтеров, родившихся в 1977-1999 гг. (р < 0,001), т. е. в период, когда вирусы A(H1N1) после долгого перерыва вновь начали социркулировать со штаммами A(H3N2) (табл. 3). Проценты лиц с высокими титрами (>1:40) антител как к НА (76,9%), так и NA (67,9%) эпидемического вируса A(HINI) 1999 г. в этой группе были выше, чем среди родившихся после 2000 года (р<0,001). Данный факт можно объяснить большей социальной активностью и кратностью инфицирования старшей группы в период доминирования штамма А/Новая Каледония/20/99(НШ1), а также формированием перекрестно-реагирующих антител в результате праймирования ранее циркулировавшими вариантами вирусов A(H1N1).

Наибольшее число лиц с титром антигемагглютинирующих антител >1:40 (32,1%) к пандемическому штамму также наблюдалось в группе волонтеров 1977-1999 гг. рождения, наименьшее (8,3%) - среди лиц, родившихся до 1957 г. У лиц старшего возраста (до 1957 г. рождения) превышение уровня антинейраминидазных антител над уровнем антител к НА в сыворотке крови свидетельствовало о наличии перекрестно-реагирующих с NA штамма A(HlNl)pdm2009 иммуноглобулинов,

приобретенных вследствие контакта с ранее циркулировавшими вирусами А(НШ1), возможно даже штаммами, подобными вызвавшему пандемию 1918 г. Минимальный процент лиц с высокими титрами антител к ИА пандемического штамма был обнаружен среди волонтеров, родившихся в 1957-1977 гг., т.е. в период циркуляции вирусов гриппа А(Н2№) и А(НЗЫ2). Максимальный процент - среди обследованных 1977-1999 гг. рождения, как одной из наиболее подверженных гриппозной инфекции в пандемию А(НШ1) 2009 г. возрастных групп.

Таблица 3. Уровень сывороточных антител к поверхностным гликопротеинам пандемического и эпидемического штаммов А(Н1!Ч1) среди обследованных лиц различных возрастных групп (осень 2010 г.)_

Год рождения Число лиц А(Н11\11)р(1т2009 А(Н1Ы1)1999

РТГА РИНА РТГА РИНА

Титр, Ме (01 «3) ^ % (число) лице титрами >1:40 Титр, Ме % (число) лице титрами >1:40 %(число) лице титрами >1:40 % (число) лице титрами >1:40

до 1957 24 2,32 (2,3;2,3) 8,3 (2)' 3,52 (2,3:5,3) 29,2(7) 4,2(1) 25,0 (6)

19571977 24 2,3 (2,3;5,3) 29,2 (7) 2,3 (2,3;3,3) 8,3(2)3 16,7 (4) 16,7 (4)

19771999 78 4,3 (3,3;5,3) 32,1 (25)1 4,3 (3,4;5,3) 32,1(25)3 76,9 (60) 67,9 (53)

2000 и после 37 2,3 (2,3;5,3) 27,0 (10) 2,9 (2,3;5,3) 27,0(10) 27,0(10) 27,0 (10)

' - р = 0,032;2 - р = 0,001,3 - р = 0,032

Для оценки вклада перекрестно-реагирующих антител в общий фон антител к НА штамма А(НШ1)рёш2009 все добровольцы были разделены на группы на основании их иммунологического статуса согласно данным РТГА: 1) лица с низкими титрами антигемагглютинирующих антител к пандемическому штамму А(Н1Ш) 2009 г. (<1:20) и одновременно серонегативные (<1:20) к эпидемическим вирусам гриппа А(НШ1); 2) волонтеры, обладавшие низкими титрами антител к НА только пандемического штамма и при этом являвшиеся серопозитивными по отношению хотя бы к одному эпидемическому вирусу А(НШ1) из перечисленных в разделе «Материалы и методы»; 3) лица с титрами антигемагглютинирующих антител к пандемическому штамму А(НШ1) 2009 г. >1:20 (табл. 4).

15,2% (14 из 92) обследованных, серонегативных к НА штамма А(НШ1)рс1т2009 (группы 1 и 2), обладали антинейраминидазными антителами к указанному вирусу в титрах, превышающих значение 1:20. Титры антител к нейраминидазе штамма А(НШ1)рс1т2009 в сыворотках крови лиц, не иммунных к НА только пандемического вируса гриппа А(НШ1), (группа 2) выявлялись на более высоком уровне в сравнении с таковым для волонтеров, серонегативных в РТГА со всеми исследованными антигенами (группа 1). Отсутствие статистически значимых различий в

титрах антигемагглготинирующих антител к штамму А(НШ1)рс1т2009 для 1-ой и 2-ой групп добровольцев свидетельствует о том, что контакт с эпидемическими вирусами А(НШ1) во 2-ой группе имеет прямое отношение к обнаружению перекрестно-реагирующих антител к ИА пандемического штамма. Показательно, что у двоих волонтеров 64 и 56 лет были выявлены титры антигемагглютинирующих антител 1:40 только к вирусу гриппа А/Хабаровск/1/77(НШ1), при этом антитела к ЫА пандемического штамма А(НШ1) 2009 г. присутствовали в сыворотке крови в титрах 1:695,6 и 1:180,2 соответственно. Тем не менее, процент лиц с высокими титрами антител к ЫА штамма А(НШ1)рс1т2009 в группе 2 был в 3,2 раза ниже, чем в группе обследованных, контактировавших с пандемическим вирусом (табл. 4).

Таблица 4. Гомологичные и перекрестно-реагирующие антитела к ОД пандемического штамма А(Н11У1) среди волонтеров от 1 года до 82 лет (осень 2010 г.)_

№ группы* Возраст Ме Ю1ЯЗ) Число лиц Антитела к поверхностным антигенам А(НШ1)р(1т2009

РТГА Твердофазная РИНА

Число (%) лиц с титрами >1:40 Титр Ме((31;(23) 10^2 Число (%) лиц с титрами > 1.40 Титр Ме (01,03) 1оВг

1 45 (6;58) 41 0(0) 2,3' (2,3; 2,3) 2 (4,9) 2,32 (2,3; 3,2)

2 17 (10;26) 51 0(0) 2,31 (2,3; 3,3) 8(15,7)" 3,4^ (2,3; 4,3)

3 15 (12;20) 67 44 (65,7) 5,3 (4,3; 6,3) 34 (50,7)4 5,33 (3,9; 5,6)

* расшифровку см. в тексте;1 - р = 1,0;2 - р = 0,048,3 - р < 0,001;4 - р < 0,001

Среди серонегативных к НА штамма А(НШ1)рс1т2009 волонтеров (группы 1 и 2), родившихся до 1957 г., в 1977-1999 гг. и после 2000 г., в 5 случаях из 22 (22,7%), 4 из 31 (12,9%) и 1 из 26 (3,8%) соответственно были обнаружены перекрестно-реагирующие антитела к ИА штамма А(НШ1)рёш2009 в титрах >1:40, в отличие от лиц 1957-1977 гг. рождения. Таким образом, уровень перекрестно-реагирующих антинейраминидазных антител к штамму А(НШ1)рс1т2009 в отсутствие прямого контакта с пандемическим вирусом нелинейным образом зависит от возраста, определяясь, вероятно, анамнезом лиц в отношении праймирования и кратности инфицирования эпидемическими вирусами гриппа А.

Защитная эффективность сывороточных антинейраминидазных антител при моделировании гриппозной инфекции на мышах.

Двукратное внутримышечное введение 1,0 мкг рекомбинантной мультимерной ИА штамма А(НШ1)рс1т2009 в смеси с неполным адъювантом Фрейнда стимулировало у подопытных животных выработку антинейраминидазных антител в достаточно высоких титрах: Ме = 1:64,0 по данным ИФА со штаммом А(НШ1)рс1т2009 и Ме = 1:42,2 для твердофазной РИНА с диагностическим реассортантом 11М1/09-$\уте А(НШ1), в 5,7 и 5,3 раза превышавших соответствующие показатели для контрольной группы

(табл. 5). Согласно данным твердофазной РИНА рекомбинантный препарат не уступал однократному интраназальному введению 6,2 ^ ЭИД50/0,05мл аттенуированного штамма А/17/Калифорния/09/38(НШ1) в стимуляции антителообразования к ЫА. При последующей реинфекции 103,5 МИД5о/0,05мл штамма А(НШ1)рс1т2009 показано в среднем 10-кратное снижение репродукции «дикого» вируса в легких мышей, иммунизированных рекомбинантной ЫА, в сравнении с группой интактных животных. В то же время защитная эффективность моновалентной ЖГВ была более выражена: средний титр вируса в легких привитых мышей был на 1,7 ^ ЭИД50/1мл ниже соответствующего показателя для непраймированных животных.

Таблица 5. Иммуногенность и защитная эффективность рекомбинантпой мультимерной NA штамма А(НШ1)р(1т2009 в сопоставлении с моновалентной ЖГВ на основе аттенуированного вируса А/17/Калифорния/09/38(1П1У1)_

Группа NA штамма A(HlNl)pdm2009 Штамм для ЖГВ А/17/Калифорния/ 09/38(HlNl) Фосфатно-солевой буфер

Число животных в группе 10 7 11

Серология

Титр вирусспепифических IgG к штамму A(HlNl)pdm2009 в ИФА, Me(Ql;Q3) log, 6,01,4 (4,9; 7,6) 6,б4 (5,6; 7,4) 3,5' (3,3; 3,7)

Титр антинейраминидазных антител в РИНА со штаммом RNl/09-swine A(H7N1), Me(Ql;Q3) log2 5,42'5 (5,0; 6,5) 5,0s (4,2; 6,0) 3,02 (2,8; 3,2)

Реинфекция мышей 1015МИД5и/0,05млштаммаА(Н1Ы1)рёш2009 на 21-е сутки после второй иммунизации

Инфицированы/всего 5/5 3/3 5/5

Титр вируса в легких, Ме((}1; <33) ЭИД,»/1мл 7,5J (7,5; 8,0) 6,86 (5,5; 7,0) 8,53,6 (8,0; 8,5)

2 - р = 0,006;J - р = 0,020;4 - р = 0,46;J - р = 0,33; 6 - р = 0,021.

В опытах по иммунизации мышей реассортантами, содержащими Н7 вируса гриппа лошади и ЫА различного происхождения, 12,5-20,0% привитых подопытных животных оказались невосприимчивыми к реинфекции штаммами А(Н5М1) и А(НШ1) с гомологичной и антигенно удаленной NA; титр вируса в легких праймированных мышей в среднем по группе снизился в 10,0-31,6 раз. Однако поскольку интраназальное введение цельного вируса стимулирует более широкий спектр механизмов защиты, наблюдаемый защитный эффект нельзя было объяснить исключительно наличием у иммунизированных животных сывороточных антинейраминидазных антител даже при отсутствии перекрестно-реагирующих антител к НА.

ВЫВОДЫ

1. Специфичность оценки антинейраминидазных антител с применением диагностических реассортантов на основе вируса гриппа лошади А(Н7Ы7), содержащих ЫА штаммов человека, птиц и свиного происхождения,

основывается на антигенной удаленности Н7 от гемагглютинина эпидемических, пандемических и потенциально пандемических вирусов гриппа А и подтверждается хорошей корреляцией данных, полученных с использованием цельного вируса и препаратов NA.

2. Разработанные на основе авторских реассортантных штаммов модификации твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности и реакции постадсорбционной микронейтрализации способствуют увеличению чувствительности и стандартизации указанных методик выявления сывороточных антител к NA.

3. Иммунизация трехвалентной сезонной, моновалентной пандемической и прототипом пандемической ЖГВ стимулирует выработку гомологичных антинейраминидазных антител у 20-47% вакцинированных волонтеров 18-60 лет. Сочетанное применение РТГА или реакции микронейтрализации с модифицированными методиками количественной оценки антител к NA более полно характеризует иммуногенность вакцинных препаратов.

4. В сыворотках крови 7-15% лиц в возрасте от 1 года до 82 лет и 16-20% невакцинированных волонтеров 18-20 лет, обследованных в период с 2005 г. по 2010 г., присутствуют перекрестно-реагирующие антитела к NA пандемического штамма А/Калифорния/07/09(НШ1) и вируса гриппа птиц А/Вьетнам/1203/04(H5N 1) соответственно.

5. При моделировании на мышах гриппозной инфекции штаммом А/Калифорния/07/09(НШ1) подтверждена защитная эффективность антинейраминидазных антител, проявляющаяся в снижении репродукции заражающего вируса в легких.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дешева, Ю.А. Биологические свойства холодоадаптированного реассортантного штамма вируса гриппа подтипа H7N3 / Ю.А. Дешева, Т.А. Смолоногина, М.В. Сергеева [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2009,-№ 1.-С.31-36.

2. Desheva, J. A. Experimental modeling of antibody response to influenza virus neuraminidase / J.A. Desheva, T.A. Smolonogina. L.G. Rudenko // New Cells for New Vaccines IV -Changing the Vaccine Landscape: Recombinant Systems, Wilmington, Delaware, 11-14 Oct. 2009,- P. 26.

3. Смолоногина. T.A. Изучение роли сывороточных антител к нейраминидазе вируса гриппа в иммунном ответе на живую гриппозную вакцину / Т.А. Смолоногина // Четырнадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов : Аннотации работ победителей конкурса грантов Санкт-Петербурга 2009 года для студентов, аспирантов, молодых ученых и молодых кандидатов наук,- СПб. : Изд-во Политехнического университета, 2009.- С. 68.

4. Смолоногина. Т.А. Детекция антител к нейраминидазе вируса гриппа в тесте микронейтрализации с реассортантными штаммами на основе Л/лошадь/ПрагаЛ/56(Н7Ы7) / Т.А. Смолоногина, Ю.А. Дешева, Л.Г. Руденко // Материалы IV междунар. науч. конф. молодых ученых-медиков, г. Курск, 25-26

февраля 2010 г. / Под ред. В.Л. Лазаренко. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2010. -Том III.-С. 192-195.

5. Смолоногина. Т.Д. Тест ингибировапия сиалидазной активности для детекции антител к нейраминидазе вируса гриппа / Т.Л. Смолоногина, Ю.А. Дешева, Л.Г. Руденко // Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями: Материалы междунар. конф., СПб, 18-20 мая 2010 г. / Под. ред. А.Б. Жебруна.- СПб.: ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, 2010.- С. 76-77.

6. Desheva, Y. Detection of anti-neuraminidasc antibody in preclinical and clinical studies of live influenza vaccine / Y. Desheva, T. Smolonogina. L. Rudenko // Influenza and other respiratory viruses.- 2011.- Vol. 5.- P.370-372.

7. Патент 2428476 Российская Федерация, МПК8 С 12 N 7/00, А 61 К 39/145. Реассортантный штамм вируса гриппа RN1-swine A(H7N1) для определения антител к нейраминидазе при гриппозной инфекции и вакцинации / Дешева Ю.А., Смолоногина Т.А.. Рудснко Л.Г. [и др.] ; заявитель и патентообладатель НИИЭМ СЗО РАМН,- № 2010125452/10 ; заявл. 21.06.2010 ; опубл. 10.09.2011, Бюл. № 25,- 7 с.

8. Смолоногина. Т.Д. Разработка диагностических штаммов для выявления антител к нейраминидазе вируса гриппа / Т.А. Смолоногина, Ю.А. Дешева, Л.Г. Руденко // Медицинский академический журнал.- 2010.- Том 10,- № 5.- С. 148.

9. Смолоногина. Т.А. Оценка антинейраминидазных антител у волонтеров после иммунизации живой гриппозной вакциной против пандемического штамма A(H1N1) / Т.А. Смолоногина // Молодежь - медицине будущего: тез. докл. междунар. науч. конф. студентов и молодых ученых, посвященной 135-летию со дня рождения Н.Д. Стражеско, г. Одесса, Украина, 28-29 апреля 2011 г. / Под. ред. В.М. Запорожан -Одесса: ОНМедУ, 2011,- С.46.

10. Смолоногина. Т.А. Оценка антинейраминидазных антител у волонтеров, привитых сезонной трехвалентной живой гриппозной вакциной / Т.А. Смолоногина, Ю.А. Дешева, Н.Е. Горев, Л.Г. Руденко // Медицинский академический журнал.- 2011,- № 3.- в печати.

11. Смолоногина. Т.А. Определение антител к нейраминидазе вируса гриппа А/Калифорния/07/2009(НШ1) / Т.А. Смолоногина, Ю.А. Дешева, A.A. Шалджян, М.П. Грудинин, Л.Г. Руденко // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии,- 2011,- № 6.- в печати.

12. Дешева, Ю.А. Реассортантный штамм вируса гриппа RN2/57-human A(H7N2) для определения антител к нейраминидазе при гриппозной инфекции и вакцинации / Ю.А. Дешева, Л.Г. Руденко, Т.А. Смолоногина // Заявка на изобретение № 2011 124663/10 от 16.06.2011.

Подписано в печать 14.11.2011 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,75 Тираж 100 экз. Заказ 548

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199048, Санкт-Петербург, В.О., 6-я линия, д. 59 корпус 1, оф. 40

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смолоногина, Татьяна Анатольевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Современные представления о строении и функции нейраминидазы вируса гриппа.

1.1.1. Структурная организация и антигенные сайты нейраминидазы вируса гриппа.

1.1.2. Ферментативная активность нейраминидазы вируса гриппа и ее роль в репликативном цикле вируса.

1.1.3. Патогенез гриппозной инфекции, сопряженный с вирусной нейраминидазой, и факторы его упреждающие.

1.2. Методы определения антинейраминидазных антител.

1.2.1. Реакция ингибирования нейраминидазной активности.

1.2.2. Реакция ингибирования элюирования вируса с эритроцитов и лектин-тест.

1.2.3. Реакция постадсорбционной нейтрализации.

1.2.4. Радиальная диффузия.

1.2.5. Одномерный радиальный гемолиз в агарозном геле.

1.2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ.

1.3. Защитные свойства антител к NA вируса гриппа при экспериментальной инфекции лабораторных животных и птиц.

1.4. Роль антинейраминидазных антител в восприимчивости и развитии гриппозной инфекции у людей.

1.5. Гетеросубтипический иммунитет, опосредованный антителами к NA.

1.6. Формирование иммунного ответа к нейраминидазе вируса гриппа после противогриппозной вакцинации.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Вирусологические методы.

2.2. Методы работы с мышами.

2.3. Исследуемые образцы сывороток крови волонтеров.

2.4. Серологические методики.

2.5. Оценка эволюционных изменений аминокислотных последовательностей и молекулярная филогения.

2.6. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Отработка методик выявления сывороточных антинейраминидазных антител к дрейфовым и шифтовым вирусам гриппа А.

3.1.1. Подготовка диагностических реассортантных штаммов на основе вируса А/лошадь/Прага/1/56(Н7Ю), содержащих ЫА эпидемического, пандемического и потенциально пандемического вирусов гриппа.

3.1.2. Изучение биологических свойств диагностическихреассортантов на основе вируса гриппа А/лошадь/Прага/1/56(Н7Ю).

3.1.3. Модификация методик, предназначенных для выявления антител кИА в сыворотке крови, с учетом биологических свойств диагностических реассортантов.

3.1.4. Апробирование модифицированных методик количественной оценки содержания антинейраминидазных антител на сыворотках крови лабораторных животных '. ^

3.2. Применение модифицированных методик выявления антинейраминидазных антител при изучении иммуногенности живой гриппозной вакцины и уровня коллективного иммунитета.

3.2.1. Оценка антинейраминидазных антител у волонтеров, привитых сезонной трехвалентной ЖГВ осенью 2005 г.

3.2.2. Оценка антинейраминидазных антител в клинических испытаниях моновалентной ЖГВ против пандемического гриппа А(НШ1).

3.2.3. Оценка антинейраминидазных антител в клинических испытаниях ЖГВ «Орвакс» подтипа А (Н5И2).

3.2.4. Оценка антинейраминидазных антител к пандемическому штамму А (НШ1) у волонтеров, привитых сезонной трехвалентной ЖГВ осенью 2010 г.

3.2.5. Уровень коллективного иммунитета к нейраминидазе эпидемического и пандемического вирусов гриппа А(НШ1) осенью 2010 г.

3.3. Защитная эффективность сывороточных антинейраминидазных антител при моделировании гриппозной инфекции на мышах.

Глава 4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение формирования сывороточных антител к нейраминидазе пандемического, потенциально пандемического и сезонных вирусов гриппа А в эксперименте и клинических наблюдениях"

Актуальность работы. Антитела к поверхностным антигенам вируса гриппа -гемагглютинину (НА) и нейраминидазе (NA) - являются одними из основных факторов, определяющих восприимчивость человека к гриппозной инфекции. Защитное действие антител к NA заключается в снижении частоты инфицирования и доли клинически выраженных форм при естественной инфекции дрейфовыми и шифтовым вариантами вируса гриппа А [10, 131, 137]. Однако неразрешенным остается вопрос о возможном вкладе антинейраминидазных антител наряду с Т-клетками памяти в гетеросубтипическую защиту в условиях смены подтипа НА, к примеру, при прогнозируемой адаптации и внедрении в циркуляцию высокопатогенных штаммов A(H5N1). Исследования в области перекрестной защиты и представленности в человеческой популяции антинейраминидазных антител, перекрестно реагирующих с NA пандемических и потенциально пандемических штаммов вируса гриппа, на настоящий момент немногочисленны [122, 144, 157].

Традиционно иммуногенность гриппозных вакцин оценивается исключительно по формированию сывороточных антигемагглютинирующих антител. Оценка < \ 1 Ч поствакцинальных титров антинейраминидазных антител в сыворотке -крови ' Li " проводится редко. Работы датируются в основном 70-80 годами 20, века и были

А. iг п, * выполнены с привлечением имевшихся на тот момент методик, не предоставлявших возможности инструментального учета результатов или предполагавших использование токсичных реагентов в сложном каскаде химических реакций [4, 7, 10, 81, 137]. На совещаниях Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2004, 2007 и 2008 гг. была отмечена немаловажность разработки новых либо усовершенствования и стандартизации уже существующих методов выявления гуморального иммунного ответа к NA вируса гриппа. Указанный класс методик может быть перспективен в качестве дополнительного критерия оценки иммуногенности вакцинных штаммов, что особенно актуально в случае апробации вакцинных препаратов против потенциально пандемических вирусов гриппа.

Задачи исследования:

1. Подготовить и охарактеризовать диагностические реассортантные штаммы, содержащие ИА пандемического и потенциально пандемического вирусов гриппа А, для использования в тестах, направленных на выявление антинейраминидазных антител.

4. Охарактеризовать фон и поствакцинальную продукцию перекрестно-реагирующих антинейраминидазных антител к пандемическому штамму вируса гриппа А(НШ1) и вирусу гриппа птиц А(Н5Ш) у лиц различного возраста.

5. На модели экспериментальной гриппозной инфекции »определить * « V р протективные свойства сывороточных антинейраминидазных антител., ,.> г" < <■

Научная новизна. % -I

2. Впервые изучено формирование сывороточных антител, специфичных к ЫА пандемического штамма А(НШ1) и потенциально пандемического вируса птичьего гриппа А(Н5Ш), в клинических испытаниях сезонной трехвалентной ЖГВ. Показано, что выраженная стимуляция продукции иммуноглобулинов, перекрестно реагирующих с ЫА шифтовых вариантов вируса гриппа, у молодых людей 18-20 лет при однократном введении препарата отсутствует.

3. Впервые выявлен фон сывороточных перекрестно-реагирующих антител к ЫА вируса А(Н5Ш), а также к ИА пандемического штамма А(НШ1) до его внедрения и на момент начала циркуляции в человеческой популяции по результатам обследования волонтеров различного возраста, проживающих на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области.

Практическая значимость работы. В результате выполнения работы автором подготовлен ряд оригинальных диагностических реассортантных штаммов, предназначенных для выявления сывороточных антител к ЫА дрейфовых и шифтовых вариантов вирусов гриппа, включая вирусы гриппа птиц А(Н5Ш) и пандемические штаммы А(НШ1) 2009 г. С учетом биологических свойств диагностических реассортантов модифицированы реакция постадсорбционной микронейтрализации (РПН) и твердофазная РИНА. Эти методы могут быть использованы для количественной характеристики индукции сывороточных антинейраминидазных антител у людей, привитых различными гриппозными вакцинами, а также для определения уровня предсуществующего в человеческой популяции иммунитета к предполагаемым пандемическим штаммам вируса гриппа А;

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Подготовленные и охарактеризованные диагностические реассортантные штаммы на основе вируса гриппа лошади А(Н7Ш), обладающие КА вирусов гриппа, человека, птиц и пандемического штамма 2009 г., позволяют'специфично оценивать і

1 > „ * < « " - ' - ' " »і* С <> Г'' , сывороточные антинеираминидазные антитела в разработанных модификациях, твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности и реакции постадсорбционной микронейтрализации, а также в иммуноферментном анализе.

4. Перекрестно-реагирующие антинейраминидазные антитела к штамму А/Калифорния/07/09(НШ1) обнаруживаются в сыворотках крови волонтеров 18-20 лет, обследованных еще до вступления пандемического вируса A(H1N1) в активную циркуляцию. Антинейраминидазные антитела к вирусу гриппа птиц А/Вьетнам/1203/04(H5N1) выявляются у обследованных лиц 18-20 лет, не имевших контакта с указанным штаммом.

Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов. Вклад соавторов заключается в проведении вакцинации и сборе материалов в клинических испытаниях с участием волонтеров. Автор выражает благодарность Гореву Н.Е. за подготовку диагностического реассортанта RN1/99-human A(H7N1) и Дониной С.А. за постановку реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с сыворотками крови клинически здоровых в отношении респираторных заболеваний волонтеров в возрасте 1-82 лет, собранными в августе-сентябре 2010 г. Научно-исследовательской лабораторией «Диагностика».

Внедрение результатов работы. Авторские диагностические реассортантные штаммы депонированы в Государственной коллекции вирусов ФГБУ /«НИИ Л'"t ' ' t- , , "i > , вирусологии «им. :Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития .-России с(номера , *'>' ' Ч', , '••и*''"' ' ^ ' ' депонентов: ГКВ № 2473, ,2474, 2475); По теме работы получен <1. ¡ патент на i \ изобретение. Подана 1 заявка на патент.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены на Международной конференции «New Cells for New Vaccines IV - Changing the Vaccine Landscape: Recombinant Systems» (Уилмингтон, штат Делавэр, США, 11-14 октября 2009), IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 25-26 февраля 2010 г.), Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г), Международной конференции «Options for the control of influenza VII» (Гонконг, Китай, 3-7 сентября 2010), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2010 года), Международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодёжь — медицине будущего» (Одесса, Украина, 28 - 29 апреля 2011 года).

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Смолоногина, Татьяна Анатольевна

169 ВЫВОДЫ

1. Специфичность оценки антинейраминидазных антител с применением диагностических реассортантов на основе вируса гриппа лошади А(Н7И7), содержащих ИА штаммов человека, птиц и свиного происхождения, основывается на антигенной удаленности Н7 от гемагглютинина эпидемических, пандемических и потенциально пандемических вирусов гриппа А и подтверждается хорошей корреляцией данных, полученных с использованием цельного вируса и препаратов ИА.

Сочетанное применение РТГА или реакции микронейтрализации с модифицированными методиками количественной оценки антител к ЫА более полно" характеризует иммуногенность вакцинных препаратов.

4. В сыворотках крови 7-15% лиц в возрасте от 1 года до 82 лет и 16-20% невакцинированных волонтеров 18-20 лет, обследованных в период с 2005 г. по 2010 г., присутствуют перекрестно-реагирующие антитела к ЫА пандемического штамма А/Калифорния/07/09(НШ1) и вируса гриппа птиц А/Вьетнам/1203/04(Н5Ш) соответственно.

Заключение

На настоящий момент имеются обширные данные, свидетельствующие о защитной эффективности антител к нейраминидазе вируса гриппа, проявляющейся по крайней мере в снижении тяжести переносимого заболевания при инфекции гомологичным или дрейфовым вариантом штамма, а также описывающие формирование иммунного ответа к минорному поверхностному гликопротеину вируса после прививки сезонными гриппозными вакцинами. Однако сложившаяся эпидемиологическая ситуация, характеризующаяся широким распространением штаммов свиного происхождения A(H1N1) в человеческой популяции и не исключающая внедрение вирусов гриппа птиц A(H5N1), имеющих низкий процент гомологии в аминокислотной последовательности НА и более выраженное антигенное сходство с NA современных эпидемических штаммов, открывает новые аспекты в проблематике. Актуальность приобретает изучение уровня предсуществующих в человеческой популяции антинейраминидазных антител, перекрестно реагирующих с соответствующим поверхностным антигеном предположительно пандемических штаммов вируса гриппа; их формирования в ответ т * « * ■ , 1 на иммунизацию сезонной гриппозной вакциной и потенциала в качестве защитного фактора в условиях смены подтипа НА. Исследования в данном русле немногочисленны, что объясняется недоработкой методологической базы: в первую очередь отсутствием актуальных тестовых антигенов (диагностических штаммов вируса гриппа с нерелевантным гемагглютинином или доступных препаратов NA), способных обеспечить специфичность оценки антинейраминидазных антител; отсутствием единого стандартного протокола методики, которая бы отвечала современному уровню технического прогресса, исключала фактор субъективности при учете результатов, в то же время являлась бы приемлемой с точки зрения личной безопасности исследователя, временных затрат и трудоемкости, принципиальных для проведения масштабной серологической диагностики. Совершенствование методологической базы имеет также важное прикладное значение для более полной оценки иммуногенности нового поколения гриппозных вакцин - вакцин против пандемического гриппа.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Вирусологические методы

Вирусы. Для выявления антинейраминидазных антител использовали диагностические реассортантные штаммы, подготовленные на основе вируса гриппа лошади А/лошадь/Прага/1/56(H7N7): RN2/57-human A(H7N2), RNl/04-avian A(H7N1) и RNl/09-swine A(H7N1), содержащие NA от холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2), высокопатогенного вируса гриппа А/Вьетнам/1203/2004(H5N1) и пандемического штамма А/Калифорния/07/09(НШ1) [A(HlNl)pdm2009], соответственно. Для их подготовки использовали вирус гриппа А/лошадь/Прага/1 /5 6(H7N7) и полученный методами обратной генетики вакцинный штамм А/Вьетнам/1203/2004xPR8 IBCDC-RG(H5N1) [PR8/H5N1-RG], содержащий НА и NA от вируса птичьего гриппа А/Вьетнам/1203/2004(H5N1) и 6 генов внутренних и неструктурных белков от высокопродуктивного донора А/Пуэрто Рико/8/34(НШ1) [PR8], предоставленные Центром по контролю и предупреждению заболеваний (Атланта, Джорджия, США), а также реассортантные вакцинные г» штаммы для ЖГВ на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(НШ2): 7:1 реассортант А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш) [Lenl7/H5N2] и штамм А/17/Калифорния/2009/38(НШ1) из коллекции отдела вирусологии им. A.A. Смородинцева НИИЭМ СЗО РАМН. Еще один реассортантный штамм подтипа A(H7N1) - RNl/99-human A(H7N1), содержащий NA от эпидемического вируса А/Новая Каледония/20/99(НШ1) [A(H1N1)1999], был подготовлен и передан из коллекции ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ ведущим научным сотрудником лаборатории гриппозных вакцин, Н.Е. Горевым.

Помимо этого в работе были использованы реассортантные вакцинные штаммы для ЖГВ на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2): А/17/Калифорния/04/06(НЗЫ2); H/32/5(HlNl), обладающий поверхностными антигенами вируса гриппа А/Хабаровск/1/77(НШ1); A/17/Новая Каледония/99/145(НШ1); A/17/Соломоновы острова/06/9(НШ1) и А/17/Брисбен/07/28(НШ1). Перечисленные атгенуированные штаммы, а также вирус

А/Пуэрто Рико/8/34(НШ1) были получены из коллекции отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева НИИЭМ СЗО РАМН.

Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Культивирование использовавшихся в работе вирусов производилось в аллантоисной полости 10-дневных развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) (ООО «Племрепродуктор Назия», пос. Приладожский, Кировский район, Ленинградская обл.). РКЭ заражали в аллантоисную полость 200 мкл вируссодержащей жидкости и инкубировали при оптимальной температуре (34°С) в течение 24-48 часов.

Для определения 50%-ой эмбриональной инфекционной активности предварительно делали ряд 10-кратных падающих разведений исследуемого вирусного материала, которыми впоследствии производилось заражение из расчета 100 мкл на один РКЭ. После инкубации в течение 48 часов при температуре 32°С 50%-ую эмбриональную инфекционную дозу, выражаемую в lg ЭИД50/мл, рассчитывали по методу Reed-Muench [149].

Концентрирование и очистка вируса в ступенчатом градиенте сахарозы. Для ряда серологических тестов требовался концентрированный и очищенный препарат вируса. В связи с чем вируссодержащая жидкость из аллантоисной .полости ' ' \ инфицированных куриных эмбрионов сначала «осветляли» центрифугированием при ' , * г < і

7! с

3000 об/мин в течение 20 мин (центрифуга Rotina 38R, Hettich-zentrifugen). Затем

N J надосадки переносили во флаконы для ультрацентрифугирования и центрифугировали при 17000 об/мин в течение 3-х часов (ультрацентрифуга Beckman coulter Optima™ L-100 XP Ultracentrifuge, ротор Type 19). Надосадок удаляли, осадок ресуспендировали в 2,0 мл ледяного кальциево-боратного буфера (рН = 7,2). Ресуспендированный вирус наносили на ступенчатый 30/60% градиент сахарозы, приготовленный на кальциево-боратном буфере, с последующим центрифугированием при 20000 об/мин в течение 2,5 часов (ротор SW 40 Ті). Вируссодержащий слой на границе фаз сахарозы с различной плотностью отбирали и очищали от сахарозы в кальциево-боратном буфере ультрацентрифугированием при 20000 об/мин в течение 2,5 часов (ротор SW 40 Ті). Осадок ресуспендировали в 1,0 мл кальциево-боратного буфера.

Культивирование вирусов в культуре клеток MDCK. Для работы использовали перевиваемую клеточную линию MDCK NBL-2, полученную из Центра по контролю и предупреждению заболеваний (Атланта, Джорджия, США). Культивирование вируса производилось в присутствии 2 мкг/мл трипсина ТРСК (трипсин бычьей поджелудочной железы, обработанный L-l-Tosylamide-2-Phenylethyl Chloromethyl Ketone, Sigma-Aldrich) на двухдневном монолое клеток, выращенном в полистироловых флаконах для адгезивных клеточных культур Т-25 фирмы «Sarstedt» (кат № 83.1810) в питательной среде DMEM (ООО «Биолот») с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки до концентрации 10% (ООО «Биолот») при посевной дозе 2*105 клеток/мл. Доза вируса, вносимая во флакон для адсорбции на клеточном монослое в течение 1 часа (1,0-5,0 lg КИД50/0,1мл), а также время последующей инкубации при температуре 34°С (3-4 суток) в термостате с подачей СОг зависели от степени его адаптации к репродукции в указанной системе.

Для определения 50%-ой культуральной инфекционной дозы клетки инкубировали в плоскодонных 96-луночных полистироловых планшетах для адгезивных культур фирмы «Sarstedt» (кат № 83.1835) в течение 2 суток при 37°С и 5% содержании СО2. Посевная доза составляла 2*105 клеток/мл. После удаления поддерживающей среды и двукратной отмывки монослоя фосфатно-солевым буфером (0,01 M раствор с pH = 7,3-7,5, ООО «Биолот») в лунки планшета вносили по 100 мкл образцов, представляющих собой падающие 3- или 10-кратные разведения исследуемых штаммов вируса гриппа в питательной среде DMEM с добавлением трипсина ТРСК (концентрация 2 мкг/мл). Планшеты инкубировали в термостате с подачей С02 при температуре 34°С, 72 часа. Учет результатов проводился по следующим показателям:

1) наличие вируса в культуральной среде согласно реакции гемагглютинации (РГА) с 1% взвесью куриных эритроцитов;

2) наличие цитопатического действия вируса гриппа, оцениваемого по окрашиванию 100 мкл 0,5% раствора кристаллического фиолетового (Sigma) в 50% этаноле на фосфатно-солевом буфере (ФБ) с добавлением глутарового альдегида (Рапгеас) в конечной концентрации 0,25% при экспозиции в течение 30 минут с последующей спектрофотометрией монослоя, отмытого от несвязавшегося красителя, при длине волны 630 нм (Universal microplate reader ELX800, BIO-ТЕК INSTRUMENTS, INC.);

3) связывание моноклональных антител к NP-белку вируса гриппа А [154]. Для постановки ИФА монослой клеток предварительно фиксировали холодным 80% раствором ацетона (10 мин при комнатной температуре). После удаления фиксатора и 3-хкратной отмывки 0,05% раствором твин-20 (ООО «Биолот») в ФБ (ФБ-Т) в лунки планшета вносили по 100 мкл мышиных моноклональных антител (А-3) к NP-белку вируса гриппа A (CDC # VS2370, Центр по контролю и предупреждению заболеваний, Атланта, Джорджия, США), разведенных 1/4000 в блокирующем буфере (4% раствор эмбриональной бычьей сыворотки в ФБ-Т). После часовой инкубации при комнатной температуре и 4-хкратной отмывки ФБ-Т добавляли по 100 мкл пероксидазного конъюгата козьих антител к IgG мыши (кат. номер A3673, Sigma), разведенных 1/2000 в блокирующем буфере. Затем следовали инкубация при комнатной температуре в течение 1,5 часов, 6-тикратная отмывка ФБ-Т и добавление 100 мкл субстрата для пероксидазы хрена - 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (кат. № 555214, ТМВ Substrate Reagent Set, BD Biosciences,). Спустя 5 минут ферментативную реакцию останавливали 100 мкл 1Н серной кислоты (ЗАО «Вектон»), результаты считывали на спектрофотометре при длине волны 450 нм.

В случае окрашивания кристаллическим фиолетовым положительной по * « - / - 'i < репродукции вируса считалась проба, дающая оптическую плотность при указанной t , > •« V „ длине волны ниже порогового значения, рассчитанного как среднее (М) минус три среднеквадратичных отклонения (СКО) ОП для лунок с монослоем клеток, не подвергавшимся воздействию вируса. При учете результатов по связыванию моноклональных антител к NP-белку вируса гриппа А - проба, ОП которой превышала порог, равный М+3*СКО значений ОП для лунок клеточного контроля. 50% культуральную инфекционную дозу рассчитывали по методу Reed-Muench [149].

Для определения 50%-ой культуральной инфекционной дозы также использовалась модификация изложенного выше протокола, согласно которой планшеты с подготовленным клеточным монослоем инкубировали с 3- или 10-кратными падающими разведениями исследуемых штаммов вируса гриппа в питательной среде DMEM (в объеме 100 мкл) в течение 1 часа при 34°С. После адсорбции вирусных частиц на клеточных рецепторах образцы удаляли, планшеты подвергали однократной отмывке ФБ, а в лунки вносили среду DMEM с трипсином

ТРСК (концентрация 2 мкг/мл). В дальнейшем планшеты также помещались на 72 часа в СОг-инкубатор, поддерживающий температуру 34°С.

Получение диагностических реассортантных штаммов на основе вируса гриппа лошади А/лошадь/Прага/1/56(H7N7). Диагностические штаммы для тестов, направленных на выявление антинейраминидазных антител в образцах сывороток крови, содержащие НА вируса гриппа А/лошадь/Прага/1/5 6(H7N7) и унаследовавшие нейраминидазу от вирусов гриппа птиц, человека и штамма свиного происхождения, были получены методом классической генетической реассортации по описанным ранее методикам [1]. Для этих целей было произведено скрещивание вируса гриппа лошади подтипа A(H7N7) и штаммов А/Вьетнам/1203/2004xPR8 IBCDC-RG(H5N1), А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5К2), А/17/Калифорния/2009/38(НШ1) в РКЭ. В качестве селективных факторов для отбора клонов с нужными свойствами из множества полученных для каждой пары родительских штаммов реассортантов использовали соответственно моноклональные антитела, взаимодействующие с НА штамма А/Вьетнам/1203/2004(Н5Ш) (CDC # VS2722), моноклональные антитела СР62 и 364/1 к НА вирусов гриппа птиц А/курица/Пенсильвания/1370/83(H5N2) и А/курица/Пенсильвания/8125/83(Н5№) (CDC # VS2347), моноклональные антитела, специфичные к НА штамма А/Новая Каледония/20/99(НШ1), (СБС # VS2454) из * * г * ' ' ' * диагностического набора Центра по контролю и предупреждению заболеваний (Атланта, Джорджия, США). В случае, когда один из родительских вирусов был представлен холодоадаптированным вакцинным штаммом на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ш), дополнительным селективным фактором служила пониженная температура инкубации (25°С).

Подтип гемагглютинина отобранных клонов был определен в реакции торможения гемагглютинации, полный анализ состава генома проводился с помощью методов молекулярной генетики.

Анализ состава генома реассортантных штаммов. Анализ состава генома реассортантых штаммов осуществлялся с помощью обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с применением специфичных праймеров и обработкой полученных ДНК-копий фрагментов РНК эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами). Выделение вирусной РНК производилось из 140 мкл вируссодержащей жидкости (культуральной среды или жидкости аллантоисной полости РКЭ) с использованием набора реактивов QIAamp Viral RNA Kit (QIAGEN) согласно указаниям производителя. ДНК-копии участков генов были получены с помощью обратной транскриптазы мышиного вируса лейкемии Молони (кат.№ ЕЗ18, M-MulV RT, НПО «СибЭнзим»), а затем амплифицированы Taq-полимеразой (кат. № E332L, НПО «СибЭнзим») в ПЦР. Для анализа амплифицированных ДНК-копий фрагментов РНК проводился электрофорез в 1,7% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (ООО «Лаборатория Медиген») из расчета 5 мкл 1% раствора на 100 мл геля, в IX ТБЭ буфере, в состав которого входили трис(оксиметил)аминометан, борная кислота и этилендиамин тетрауксусная кислота (ЗАО «Вектон»).

Для определения происхождения генов поверхностных гликозилированных белков у полученных реассортантов использовались следующие прямые (F) и обратные (R) праймеры, специфичные к участкам нуклеотидных последовательностей НА-гена штаммов А/утка/Потсдам/1402-6/86(Н5Ш) [3], А/Калифорния/07/09(НШ1) и NA-гена ряда штаммов, обладающих подтипом N2, в том числе А/Ленинград/134/17/57(Н2Ш) [94], а также праймеры для амплификации участка гена Н5 с 915 по 1278 н.к. по нумерации последовательности для штамма v /

А/Вьетнам/1203/2004(Н5Ш) [182]: H5Dk-F6 (5' GAA ААТ AGT GCT ТСТ ТСТ TG 3'), H5Dk-R353 (5' TTC AGT ТСТ ТСА TAG TCG TT 3'), Hlsw-F315 (5' AAC GTG TTA CCC AGG AGA TTT CA 3'), Hlsw-R871 (5' CGT GGA CTG GTG TAT CTG AAA TGA 3'), N2-F14 (5' GTG AAG ATG AAT CCA AAT CAA 3'), N2-R677 (5' GAG ACC ATG AAC CAA TAC TGT С 3'), H5-F (5' GCC ATT CCA CAA CAT АСА CCC 3'), H5-R (5' TAA ATT CTC TAT CCT CCT TTC AA 3').

Помимо приведенных выше олигонуклеотидов для тех же целей применялись праймеры, разработанные нами с помощью программы FastPCR по нуклеотидным последовательностям генов, кодирующих поверхностные гликозилированные белки штаммов А/лошадь/Прага/1 / 5 6(H7N7), А/Вьетнам/1203/2004(Н5Ш) и А/Калифорния/07/09(НШ1), взятых из базы данных вирусов гриппа Национального центра биотехнологической информации (The Influenza Virus Resource at the National Center for Biotechnology Information) [28]: H7eq-F21 (5' ATT AGC CAC TTC GGC ATT CTT СТА 3'), H7eq-R338 (5' TCA TTG TCA AAT TTG CCT GG 3'), N7eq-F25 (5' TGA АТС СТА АТС AGA AAC ТС 3'), N7eq-R396 (5' AAC TTA GAG GAT CAC ATG

AG 3'), Nlav-F592 (5' AGT TGG AGG AAC AAC ATA CT 3'), Nlav-R943 (5' AAC TAC CTG TTC CAT CAT TG 3'), Nlsw-F673 (5' AGA АСА CAA GAG TCT GAA TG 3'), Nlsw-R963 (5' AAT CCC ACT GCA TAT GTA ТС 3'), синтезированные компанией «Бигль».

Молекулярно-генетический анализ генов внутренних и неструктурных белков реассортантов, предположительно унаследовавших соответствующие сегменты РНК от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ш), проводился с использованием праймеров и рестриктаз, разработанных А.И. Климовым [94]. Для определения принадлежности генов внутренних и неструктурных белков диагностического штамма на основе вируса гриппа А/Вьетнам/1203/2004хРК8 IBCDC-RG(H5N1) был дополнительно разработан и синтезирован набор специфичных праймеров: PB2PR8-F653-672 (5' GAG AAC TGG ТСС GCA AAA CG 3'); PB2PR8-R877-897 (5' ACC AAT CTG TGT GCT GTG GCA 3'); PBlPR8-F356-377(5' TGG AGG TTG TTC AGC AAA CAC G 3'); PB1PR8-R591-612 (5' AGT CAT ATT GTC TCT CAC CCG T 3'); PAPR8-F308-327 (5' GCA АСА СТА CAG GGG CTG AG 3'); PAPR8- R565-584 (5' AGG CCT CTG CTG GCC ATT TC 3'); NPPR8-F 1042-1061 (5' TGC CAT TCT GCC GCA TTT GA 3'); NPPR8-R1196-1215 (5' GGT CCT TAT GGC CCA GTA CC 3'); MlPR8-F347-366 (5' ACAJTC CAT GGG GCC AAA GA 3'); MlPR8-R568-589 A

5' AGC CTT AGC TGT AGT GCT GGC T 3'); NSPR8-F38-57 (5' CAC TGT GTC AAG CTT TCA GG 3'); NSPR8-R266-285 (5' ACG CAG GTA CAG AGG CCA TG 3') («Бигль»). Специфичность амплификации с указанными праймерами подтверждалась рестрикцией ДНК-копий участков генов РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS эндонуклеазами BstMB I, BstF5 I, Tru9 I, Hind III, BstC8 I и Tru91 (НПО «СибЭнзим»), соответственно.

Секвенировнание. Для стадий выделения вирусной РНК, получения ДНК-копий участков РНК, очистки проб от легкоплавкой агарозы после разделения амплифицированных фрагментов ДНК при помощи электрофореза, терминирующей ПЦР в процессе секвенирования отдельных сегментов РНК диагностического реассортнантного штамма RNl/04-avian A(H7N1) до и после прохождения им адаптационных пассажей в культуре клеток MDCK использовались диагностические наборы QIAamp Viral RNA Kit (кат. № 52904, QIAGEN), One-step RT-PCR Kit (кат. № 210210, QIAGEN), QIAquick Gel Extraction Kit (кат. № 28706, QIAGEN) и BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (кат. № 4337455, Applied Biosystems) согласно указаниям производителей. Очистка образцов от не включившихся меченных дидезоксинуклеотидов осуществлялась гельфильтрацией через приготовленные самостоятельно колонки с сорбентом Sephadex G-100 Fine DNA grade (GE Healthcare) по протоколу, предложенному Межинститутским центром секвенирования ДНК (г. Новосибирск) [16], после чего 25 мкл пробы смешивали с 15 мкл формамида (ЗАО «Вектон»), смесь прогревали в течение 5 мин при температуре 95°С, затем охлаждали до 4°С и проводили капиллярный электрофорез со считыванием флюоресценции на приборе 3130x1 Genetic Analyzer (Model: 628-0040, Applied Biosystems, Hitachi).

Использовались следующие праймеры в концентрации 20мкМ: универсальные праймеры для НА, NA и NS генов вируса гриппа [75] A FluAHA-UniF (5' GAT CGC ТСТ ТСА GGG AGC AAA AGC AGG GG 3'), FluAHA-UniR (5' ACT GGC TCT TCT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT 3'), FluANA-UniF (5' GAT CGC TCT TCA GGG AGC AAA AGC AGG AGT 3'), FluANA-UniR (5' ACT GGC TCT TCT ATT AGT AGA AAC AAG GAG TTT TTT 3'), FluANS-UniF (5' GAT CGC TCT TCA GGG AGC AAA AGC AGG GTG 3'), FluANS-UniR (5' ACT GGC TCT TCT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TTT 3'); праймеры, разработанные нами по последовательностям НА-гена штамма А/лошадь/Прага/1/5 6(H7N7) и NS-гена штамма А/Пуэрто Рико/8/34(НШ1), H7-F393 (5' TGG GAT TCA CAT ATA CCG GAG TG 3'), H7-F723 (5' TTC ACT GGC TGA TGC TAG АТС С 3'), H7-F1067'(5' GCA GGA TTC ATT GAA AAT GGG TGG 3'), H7-F1334 (5' GCA GAA TTC CTC GTA GCA GTG GA 3'), H7-R575 (5' GGA TTC CCC AGA TTA TCA GAG CTG 3'), H7-R961 (5'CTG CTT CAC GTA TCT GGG GCA 3'), H7-R1340 (5' GAT TCT CCA CTG СТА CGA GGA A 3'), PR8NS-F284 (5' GTC GCG TTA CCT AAC CGA CAT GAC 3'), PR8NS-R266 (5' GGT CAT TTT AAG TGC CTC АТС GGA 3'), PR8NS-R671 (5' AGT GAG TGG AGG TCT CCC ATT CTC 3'), a также праймеры, специфичные к NA штаммов подтипа A(H5N1), H5N1NA-F293 (5' GGG GGA TGT GTT TGT TAT 3'), H5N1NA-F615 (5' TGG AGG AAC AAC ATA CTG А 3'), H5N1NA-F1033 (5' GGA TCG GGA GAA CCA AAA G 3'), H5N1NA-R401 (5' CCC ATT GGA GTG CTT GTC 3'), H5N1NA-R936 (5' GAT TGT CTC CGA AAA CTC CA 3'), H5N1NA-R1195 (5' AGT TCT GGA TGC TGG АСА 3').

2.2. Методы работы с мышами

Для воспроизведения экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации использовали линейных мышей СВАЛ (самцов) в возрасте 10-12 недель, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» РАМН (Ленинградская область).

Репродукция вирусов в дыхательных путях мышей. Мышам под легкой эфирной анестезией интраназально (и/н) вводили 50 мкл аллантоисной жидкости с

1 7 содержанием вируса 10-10 ЭИД50. Эвтаназию проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» [17]. Титры вирусов определяли в легких подопытных животных на 3-й сутки по результатам титрования в РКЭ суспензии органов, приготовленной в 1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера, начиная с разведения 1:1. 50% мышиную инфекционную дозу определяли по методу Кееё-МиепсЬ [149].

Иммунизация мышей. Иммунные сыворотки для апробации модифицированных методик по выявлению антинейраминидазных антител получали на 21-й день после однократного интраназального введения лабораторным животным 50 мкл аллантоисной жидкости, содержащей 1) 6,5 ^ ЭИД50/5О мкл реассортантного штамма для ЖГВ А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш); 2) 4,0 ЭИД50/50 мкл реассортантного штамма для ИГВ А/Вьегнам/1203/2004хРЯ8 1ВСОС-1Ю(Н5Ш). Для тех же целей; использовали сыворотки крови мышей, однократно привитых 7,0 ЭИД50/5О мкл реассортантного штамма для ЖГВ А/17/Калифорния/2009/38(НШ1), предоставленные старшим научным сотрудником отдела вирусологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, А.Р. Рекстиным.

Для моделирования иммунного ответа к минорному поверхностному антигену вируса гриппа группам мышей под легкой эфирной анестезией двукратно внутримышечно (в/м) вводили 5,0 мкг очищенной ИА штамма А/Калифорния/07/09(НШ1)2; 10 мкг очищенной ЫА штамма А/Вьетнам/1203/2004 хРЯ8 1ВСОС-11С(Н5Ш)2 или 1 мкг рекомбинантной мультимерной ИА штамма А/Калифорния/07/09(НШ1)3 в смеси с неполным

2 Препарат подготовлен A.A. Шалджяном и М.П. Грудининым, ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» МЗ РФ, лаборатория молекулярной вирусологии и генной инженерии, г. Санкт-Петербург, Россия.

3 Препарат предоставлен B.J. Bosch, Университет г. Утрехта, факультет ветеринарной медицины, отдел инфекционных заболеваний и иммунологии, г. Утрехт, Нидерланды. адъювантом Фрейнда (Sigma, кат. номер F5506-6X10ML) в пропорции 2:1 в объеме 100 мкл. Дополнительно по описанной выше схеме группа мышей была иммунизирована инактивированной субъединичной гриппозной вакциной, подготовленной на основе реассортантного вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5М2) с добавлением адъюванта (2% суспензия гидроокиси алюминия), с концентрацией НА 3 мкг/100 мкл (ФГУП "НПО "Микроген"). Для сопоставления характеристик гуморального иммунного ответа на субъединичные вакцины с таковыми, полученными при вакцинации штаммом для ЖГВ или развитии гриппозной инфекции, в рамках одного опыта отдельным группам мышей и/н двукратно вводили 1,5 МИД50/0,05мл А/17/Калифорния/09/38 (H1N1), 300 МИД50/0,05мл реассортантных штаммов RNl/09-swine A(H7N1), RNl/04-avian A(H7N1) или однократно инфицировали 25 МИД5о/0,05мл штамма для ИГВ PR8/H5N1-RG. В качестве препарата плацебо использовали стерильный фосфатно-солевой буфер. В случае двукратной иммунизации интервал между прививками составлял 21 день. Забор крови у подвергнутых наркозу и обездвиженных подопытных животных производился на 21 сутки после повторной иммунизации посредством вскрытия подключичного сосудистого пучка. Образцы , крови отстаивались 1 час при комнатной температуре. Затем следовали центрифугирование » ^ j f ( проб на 3 тыс. оборотов 15 минут (микроцентрифуга MiniSpin PLUS,' Eppendorf), отбор сыворотки и ее прогрев при 56°С в течение 30 минут.

Реинфекцш иммунизированных лабораторных животных. Реинфекция иммунизированных мышей производилась на 21-е сутки после последней прививки одним из указанных вирусов: 1) 30 МИД50/0,05мл штамма А/Пуэрто Рико/8/34(НШ1); 2) 50 МИД5О/0,05мл штамма PR8/H5N1-RG; 3) 103'5 МИД50/0,05мл штамма А/Калифорния/07/09(НШ1) в зависимости от использовавшегося для праймирования антигена. Концентрацию заражающего вируса в легких определяли на 3-й сутки после инфицирования по результатам титрования суспензии органов в РКЭ, начиная с разведения 1:10.

2.3. Исследуемые образцы сывороток крови волонтеров

Формирование сывороточных антинейраминидазных антител в ответ на иммунизацию оценивалось у 56 молодых людей в возрасте 18-20 лет, привитых в 2005 г. сезонной коммерческой трехвалентной ЖГВ, включавшей рекомендованные ВОЗ реассортантные вакцинные штаммы A/17/Новая Каледония/99/145(НШ1), А/17/Калифорния/04/06(НЗК2), В/60/Джилин/01/1 (серия 501); у 66 добровольцев в возрасте 18-60 лет, участвовавших в 2006-2007 гг. в клинических испытаниях экспериментальной серии ЖГВ «Орвакс» на основе аттенуированного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5К2); у 23 волонтеров в возрасте 18-20 лет, получивших прививку моновалентной пандемической ЖГВ (экспериментальная серия) на основе штамма А/17/Калифорния/09/38(НШ1) осенью 2009 г.; у 47 волонтеров школьного возраста, вакцинированных осенью 2010 года различными сериями коммерческой сезонной трехвалентной ЖГВ, включавшей рекомендованные на тот период вакцинные штаммы А/17/Калифорния/2009/38(НШ1), А/17/Перт/09/87(НЗШ) и В/60/Брисбен/08/83.

Во всех клинических испытаниях участвовали клинически здоровые; волонтеры с неизвестным анамнезом в отношении заболевания гриппом и противогриппозной' i г ¿ч* ^ ST * * С Ц! ' Т вакцинации, не имевшие противопоказаний к прививке ЖГВ, предоставившие письменное добровольное информированное согласие. Вакцина и плацебо в виде шифрованных препаратов вводились интраназально с помощью индивидуального распылителя по 0,25 мл в каждый носовой ход по следующим схемам: однократно (сезонная ЖГВ) или двукратно с интервалом 10 и 21 день при клинических испытаниях пандемической и прототипа пандемической ЖГВ подтипов A(H1N1) и A(H5N2), соответственно. Моно- и трехвалентная гриппозная аллантоисная живая интраназальная вакцины были выпущены Иркутским предприятием по производству иммунобиологических препаратов (ФГУП «Микроген»). В качестве препарата плацебо использовали стерильный физиологический раствор. Образцы капиллярной крови волонтеров были получены до вакцинации, перед ревакцинацией (в случае двукратного введения препарата) и на 21 день после последней прививки.

Проведение вакцинации и сбор материалов в клинических испытаниях с участием волонтеров является вкладом соавторов (с.н.с. С.А. Дониной, с.н.с. Е.П.

Григорьевой, н.с. Д.А. Коренькова, н.с. Г.Д. Петуховой, н.с. Е.М. Дорошенко -сотрудников отдела вирусологии НИИ Экспериментальной медицины СЗО РАМН) в настоящую диссертационную работу.

Для оценки уровня коллективного иммунитета к нейраминидазе вируса гриппа осенью 2009 г. и 2010 г. в исследование были взяты дополнительно собранные образцы капиллярной крови 37 (возраст: 18-20 лет) и 21 (возраст: 18-76 лет) клинически здорового добровольца с неизвестным анамнезом в отношении заболевания гриппом и противогриппозной вакцинации. 95 образцов сывороток крови обследованных в августе-сентябре 2010 г. лиц в возрасте от 1 года до 82 лет были предоставлены директором Научно-исследовательской лаборатории «Диагностика» (г. Санкт-Петербург), Суворовой М.А.

В исследовании были использованы также сыворотки крови лиц (п = 5), перенесших естественную инфекцию пандемическим вирусом A(H1N1), предоставленные старшим научным сотрудником Лаборатории биотехнологии и диагностических препаратов ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ Е.М. Войцеховской.

Все образцы до проведения серологических тестов хранили при температуре ', 20°С. " - . С 1

• ■ * " * , ' V' Ч ' * " " s , v ' , t * * » - 4 4 +

- 2.4. Серологические методики r 1 '

Обработка сывороток крови. Для разрушения термолабильных ингибиторов гемагглютинации сыворотки прогревали при 56°С в течение 30 мин. Для удаления NA-чувствительных ингибиторов гемагглютинации один объем цельной сыворотки инкубировали 18-20 часов при 37°С в присутствии 3 объемов экстракта нейраминидазы холерных вибрионов (RDE-receptor destroying enzyme, Denka Seiken CO) с последующей инактивацией фермента прогреванием проб на водяной бане при 56°С в течение 1 часа. Второй этап обработки сывороток крови не проводился, если образцы предполагалось использовать для постановки реакции микронейтрализации или твердофазной реакции ингибирования нейраминидазной активности.

Реакция торможения гемагглютинации. РТГА выполнялась по описанной ранее методике [99] с 0,75 % взвесью куриных или человеческих эритроцитов 0-группы в 96-луночных полимерных планшетах для иммунологических реакции с «и»-дном

ОАО «Фирма Медполимер»). Достоверной сероконверсией считался прирост титра антигемагглютиниррующих антител в 4 и более раз.

Реакция микронейтрализации (РН). Для постановки РН в плоскодонных 96-луночных полистироловых планшетах для адгезивных культур выращивали монослой клеток MDCK, следуя протоколу, приведенному в разделе 2.1. После удаления поддерживающей среды и двукратной отмывки планшетов фосфатно-солевым буфером вносили 50 мкл падающих двукратных разведений (начиная с разведения 1:10) образцов сывороток крови в среде DMEM с содержанием трипсина ТРСК в концентрации 2 мкг/мл. Затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл стандартной дозы вируса 200 КИД50/0,05мл (= 100 КИД50/0,1мл), разведенного до указанной концентрации той же средой. Планшеты инкубировали в термостате с подачей СО2 при температуре 34°С в течение 72 часов. Степень деструкции клеточного монослоя оценивали по окрашиванию 0,5% раствором кристаллического фиолетового согласно приведенному в разделе 2.1. протоколу. Титр сыворотки определяли как величину, обратную наивысшему разведению образца, дающему при длине воины 630 нм оптическую плотность, превышающую пороговое значение X, рассчитанное по следующей формуле: \ сс -vc U

1)Х= +ГС , w 2 » I где СС (cell control) - среднее значение оптической плотности для лунок клеточного контроля (монослоя клеток, не подвергавшегося воздействию вируса); VC (virus control) - среднее значение оптической плотности для лунок вирусного контроля (монослоя клеток, подвергшегося воздействию вируса в отсутствие иммунной сыворотки).

За достоверную сероконверсию был принят 4-х и более кратный прирост титра нейтрализующих антител.

Реакция постадсорбционной микронейтрализации. Реакция представляет собой воплощение идеи метода постадсорбционной нейтрализации, предложенного еще в 70-х годах 20 века [55, 56], на базе современной методики микронейтрализации в культуре эпителиальных клеток почки собаки. Подготовка монослоя клеток MDCK осуществлялась согласно приведенному в разделе 2.1. протоколу. После удаления поддерживающей среды и двукратной отмывки 96-луночных планшетов для адгезивных культур фосфатно-солевым буфером в каждую лунку вносили по 100 мкл вируса, разведенного в среде DMEM до концентрации 10 КИД50/0,1мл, причем последняя определялась по результатам титрования исходного вируссодержащего раствора по протоколу с отмывкой не связавшихся на клеточных рецепторах вирусных частиц (см. раздел 2.1.). Сорбция вируса на клеточном монослое протекала в течение 1 часа при температуре 34°С, затем образцы удаляли, планшеты подвергали однократной отмывке ФБ, а в лунки вносили 100 мкл предварительно раститрованных (начиная с разведения 1:20) в среде DMEM с содержанием трипсина ТРСК в концентрации 2 мкг/мл сывороток крови. Планшеты помещались в СО2-инкубатор, поддерживающий температуру 34°С, на 72 часа. Учет результатов проводился с помощью реакции гемагглютинации с культуральными надосадками и 1% взвесью куриных эритроцитов, а также в иммуноферментном анализе с моноклональными антителами к NP-белку вируса гриппа А на фиксированном монослое (см. раздел 2.1.). В последнем случае титр сыворотки определялся как величина, обратная наивысшему разведению образца, дающему при длине волны 450 нм оптическую плотность, ниже порогового значения X, рассчитанного по следующей формуле: VC-CC « 1 ' %

2)Х = +СС , 2 ч где CC/VC - среднее значение оптической плотности для лунок клеточного/вирусного контролей соответственно.

Достоверной сероконверсией считался прирост титра антител в 4 и более раз.

Твердофазный иммуноферментный анализ. Лунки 96-луночных планшетов для иммунологических реакций («Sarstedt», кат. номер 82.1581.001) покрывали 100 мкл препарата HA/NA в концентрации 0,5 мкг/мл или 100 АЕ очищенного вируса в том же объеме фосфатно-солевого буфера. Для выявления антинейраминидазный антител в качестве антигена, помимо диагностических реассортантных штаммов и описанных в разделе 2.2. препаратов NA, была использована также рекомбинантная NA штамма A/Bervig Mission/l/18(HlNl) производства R&D systems (кат. номер 4858-NM, лот номер RJJ0108101). Адсорбция антигена протекала при температуре 4°С в течение ночи. Затем следовали 3-хкратная промывка планшетов ФБ-Т и контакт с 200 мкл блокирующего буфера (4% раствор эмбриональной бычьей сыворотки в ФБ-Т) в течение 1 часа при комнатной температуре для предотвращения неспецифической сорбции добавляемых на следующей стадии антител на не занятых антигеном участках поверхности твердофазного носителя. После двукратной промывки планшетов в лунки вносили серии 2-х или 4-хкратных падающих разведений сывороток крови в ФБ-Т буфере, содержащем 1% эмбриональной бычьей сыворотки, в объеме 100 мкл (начальное разведение 1:10). Инкубация происходила при температуре 37°С в течение 1,5 часов. По окончании процедуры трехкратной промывки в каждую лунку добавляли по 100 мкл одного из перечисленных конъюгатов - меченных пероксидазой хрена козьих антител к мышиным IgG (кат. номер А3673, Sigma), к мышиным IgA (кат. номер А4789, Sigma), к IgG человека (кат. номер А6029, Sigma), разведенных с помощью ФБ-Т буфера с 1%-ым содержанием эмбриональной бычьей сыворотки в 2000, 1000 и 4000 раз соответственно, и оставляли для контакта при комнатной температуре на 1 час. Затем планшеты 6 раз отмывали и вносили по 100 мкл ТМВ субстрата для пероксидазы хрена. Спустя 5 минут ферментативную реакцию останавливали 100 мкл 1Н серной кислоты, результаты считывали на спектрофотометре при длине волны 450 нм.

Титр иммунной сыворотки крови определяли как разведение образца, дающее ,при указанной длине волны оптическую плотность, равную пороговому; значению. В ; > * i > * / * 7 I качестве такового выбиралось либо среднее плюс три стандартных отклонения, высчитанные по ОП для лунок контроля, в которые вносили нормальную сыворотку крови, в случае исследования образцов, полученных от лабораторных животных, либо значение ОП = 0,4 при выявлении вирусспецифических иммуноглобулинов в сыворотках крови волонтеров, среди которых затруднительно найти полностью серонегативных лиц, способных послужить отрицательным контролем. Сероконверсией считался прирост титра антител в 2 и более раз. Обоснование такого допущения приведено в подразделе 3.1.3.

Твердофазная реакция ингибирования нейраминидазной активности. Проводилась по протоколу, основанному на опубликованной ранее методике C.R. Lambre et al. [100], включавшему стадии десиализации натурального субстрата (фетуина), сорбированного на полимерном носителе, в присутствии активной NA диагностических штаммов; специфического связывания лектина арахиса, конъюгированного с пероксидазой хрена, на демаскированных сахаридах; определения количества связавшегося конъюгата по выходу продукта пероксидазной реакции и оценки степени ингибирования сиалидазной активности в присутствии антител к NA.

Для постановки реакции 96-луночные плоскодонные планшеты для ИФА, обладающие высоким связыванием (кат. номер FEP100096, «Jet Biofil»), покрывали 150 мкл раствора фетуина эмбриональной сыворотки теленка (кат. номер F3004, «Sigma») в концентрации 50 мкг/мл в 0,1 M карбонатном/бикарбонатном буфере (рН = 9,6, кат. номер 2.1.5., ООО «БиолоТ»). Адсорбция субстрата протекала при температуре +4°С в течение ночи. Перед использованием планшеты подвергались двукратной отмывке ФБ.

65 мкл двукратных падающих разведений сывороток крови (начиная с разведения 1:10) в ФБ-БСА, т.е. ФБ с 1% содержанием бычьего сывороточного альбумина (кат. номер А7030, «Sigma»), инкубировали в лунках 96-луночных планшетов для иммунологических реакций (ОАО «Фирма Медполимер») в течение 30 мин при 37°С с эквивалентным объемом стандартной дозы вируса, разведенного до нужной концентрации в том же буфере. В качестве контролей использовали вирус в отсутствие сыворотки (вирусный контроль), RDE в разведении 1:10, а также ФБ-БСА * - ¿>v ' дг ;, отрицательный контроль). По 100 мкл смеси переносили на покрытые фетуином^

• * ' < t , и" , , *>\ -, > -;(>' I планшеты. Сиалидазная реакция протекала при 37°С в течение 1-2 часов. После чего ч • » планшеты 4 раза отмывали ФБ с добавлением твин-20 до концентрации 0,5%, в лунки вносили по 100 мкл меченного пероксидазой лектина арахиса Arachis hypogaea (кат. номер L7759, «Sigma») в концентрации 2,5 мкг/мл в ФБ-БСА. По истечении срока инкубации (1 час при комнатной температуре) планшеты 4 раза отмывали ФБ с 0,5% твин-20. Проявление пероксидазной реакции проводилось с ТМВ субстратом согласно приведенному выше протоколу.

Для разведения сывороток и вируса использовался подготовленный из стоковых растворов Na2HP04, КН2РО4 и NaCl 0,05М фосфатно-солевой буфер с ионной силой 0Д5М, оптимальный уровень рН которого для активности NA каждого из диагностических штаммов был определен в предварительных экспериментах. Для всех прочих стадий твердофазной РИНА использовался стандартный ФБ (0,01 M раствор с рН = 7,3-7,5, ООО «Биолот»). Доза вируса и время инкубации фермента с субстратом были подобраны в предварительных экспериментах таким образом, чтобы

ОП для вирусного контроля лежала в диапазоне 0,4-0,6 или составляла 25-40% от характеризуемого указанным параметром выхода продукта сиалидазной реакции, осуществляемой RDE в стандартных условиях (ФС с рН = 7,4, время инкубации при 37°С-1 час).

Полученный для серии разведений каждой сыворотки крови набор ОП служил для построения графика зависимости остаточной ферментативной активности NA в присутствии антинейраминидазных антител, рассчитываемой по формуле (3), от разведения образца иммунной сыворотки.

3) активность = ~°ПфБ-БСАУпп пп s х 100%, \U11 ВК UU ФВ-БСА ) где ОПвк И ОПфБ-бса ■ среднее значение оптической плотности для лунок вирусного и отрицательного контролей соответственно.

Титр сывороточных антинейраминидазных антител определяли как величину, обратную разведению образца, дающего 50%-ое ингибирование активности NA. Сероконверсией считалось увеличение титра антител в 2 и более раз. Такое определение достоверного прироста титра сывороточных антител проистекало из хорошей воспроизводимости и разрешающей способности метода [100] и уже было обосновано другими исследователями [39]. , . »,

- * » г ч f Т < ' s

2.5. Оценка эволюционных изменений аминокислотных последовательностей и молекулярная филогения

Выравнивание аминокислотных последовательностей, взятых из базы данных вирусов гриппа Национального центра биотехнологической информации (The Influenza Virus Resource at the National Center for Biotechnology Information) [28], производилось при помощи программы GeneDoc (версия 2.6.002); для построения филогенетических деревьев использовалось программное обеспечение MEGA (версия

4).

Для реконструкции филогенетических деревьев применялся дистанционный метод ближайшего соседства (neighbor joining) на основе матрицы эволюционных дистанций с поправкой Пуассона, учитывающих многократные замены в одних и тех же аминокислотных сайтах, и попарным исключением гэпов. Стабильность топологии дерева оценивалась с помощью бутстреп теста (bootstrap analisys) по итогам построения и сопоставления филогенетических деревьев для 1000 новых наборов аминокислотных последовательностей, сгенерированных на основе исходного выравнивания.

2.6. Статистическая обработка данных

Обработка результатов исследования проводилась с помощью статистического пакета «Statistica» (версия 6,0). Для представления полученных данных использовали следующие показатели описательной статистики: среднее арифметическое, среднегеометрические титры, среднеквадратичное отклонение; для данных, не подчиняющихся нормальному распределению, - медиана (Me) и квартили (Ql; Q3).

Для сравнения двух независимых выборок, которые подчинялись закону нормального распределения, применялся t-критерий Стьюдента для непарных выборок с предварительной проверкой условия равенства дисперсий. В случае связанных выборок сравнение проводили с помощью парного критерия Стьюдента.

При невыполнении предпосылок о нормальности распределения переменной, внутри 4 '> к 4 I К* ^ ' ^ < * <, каждой группы использовались непараметрические аналоги: критерии Манна-Уитни,

Колмогорова-Смирнова или критерий знаковых рангов Уилкоксона. Для тех же целей f f в случае номинальных данных применяли критерии хи-квадрат Пирсона, двусторонний вариант точного критерия Фишера или критерий Мак-Нимара. При проведении множественных попарных сравнений на одном массиве данных учитывали поправку Бонферрони для критического уровня значимости.

Кроме того, сопоставление нескольких независимых выборок осуществлялось с помощью однофакторного дисперсионного анализа при выполнении предпосылок о нормальности распределения зависимой переменной внутри каждой группы и однородности дисперсии или рангового дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса с последующим множественным попарным сравнением с использованием критерия Тьюки или множественными сравнениями, основанными на суммах рангов Краскела-Уоллиса (критерий Данна), соответственно. Для анализа более сложных планов применяли однофакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями после проверки выполнения необходимых предпосылок. Сопоставление нескольких зависимых выборок, не подчинявшихся закону нормального распределения, выполнялось с помощью рангового дисперсионного анализа Фридмана с последующими множественными сравнениями, основанными на одноименных ранговых суммах. В случае номинальных данных для тех же целей использовали критерии хи-квадрат Пирсона или (^-критерий Кокрена.

О наличии статистической взаимосвязи между переменными судили по результатам корреляционного анализа с расчетом коэффициента корреляции Спирмена/Кендалла. Мерой силы статистической взаимосвязи при анализе номинальных данных служил критерий V Крамера.

Проверяемые критериями нулевые гипотезы отвергались при уровне значимости р < 0,05.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Отработка методик выявления сывороточных антинейраминидазных антител к дрейфовым и шифтовым вирусам гриппа Л

Методики по выявлению в иммунных сыворотках антител к ЫА предполагают использование очищенного антигена или особых штаммов вируса гриппа, имеющих низкий процент гомологии в аминокислотной последовательности НА с современными эпидемическими, пандемическими и предположительно пандемическими штаммами, во избежание искажения результатов из-за присутствия в исследуемых образцах антител к главному поверхностному антигену. Поэтому первым этапом нашей работы стала подготовка диагностических реассортантов на основе вируса гриппа лошади А/лошадь/Прага/1/1956(Н7Ш), отличающегося по первичной последовательности НА от штаммов А/Перт/16/2009(НЗШ) А/Брисбен/59/2007(НШ1), А/Калифорния/7/2009(НШ1) и А/Вьегнам/1203/2004 (Н5Ш) на 53-60%.

3.1.1. Подготовка диагностическихреассортантных штаммов на основе вируса А/лошадъ/Прага/1/56(Н7Ю), содержащих N.А эпидемического, пандемического и потенциально пандемического вирусов гриппа

Методом классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах были подготовлены штаммы вируса гриппа 1Ш2/57-Ьишап А(Н7Ы2), КК1/04-аУ1ап А(Н7Ш) и КШ/09-з\уте А(Н7Ш), унаследовавшие ген НА от родительского вируса А/лошадь/Прага/1 /5 6(Н7Ы7), а гены ЫА - от вирусов гриппа человека, птиц и пандемического штамма подтипа А(НШ1) 2009 г., о чем свидетельствовали данные РТГА (табл. 1) и ОТ-ПЦР-анализа с парами праймеров, специфичными к последовательностям НА/ЫА-гена только одного из родительских вирусов.

Так, на рисунке 1 представлен ОТ-ПЦР-анализ гена нейраминидазы реассортантного штамма 1Ш1/09-з\уте А(Н7Ш). Амплификация с праймерами, специфичными к последовательности ЫА-гена вируса А/Калифорния/07/09(НШ1), и отсутствие таковой при использовании олигонуклеотидов, гомологичных исключительно N7 штамма лошади, свидетельствует о наследии реассортантом минорного поверхностного гликопротеина от пандемического штамма 2009 г.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смолоногина, Татьяна Анатольевна, Санкт-Петербург

1. Александрова, Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа / Г.И. Александрова // Вопросы вирусологии.- 1977,- № 4.- С. 387-395.

2. Бурцева, Е.И. Антинейраминидазная активность инактивированных гриппозных вакцин у лиц пожилого возраста / Е.И. Бурцева и др. // Вопросы вирусологии.- 2002.-Т. 47.- № 5.- С. 21-25.

3. Дешева, Ю.А. Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии : дис. . докт. мед. наук : защищена 31.03.2009 / Ю.А. Дешева,- СПб, 2009.- 328 с.

4. Иванова, В.Т. Использование лектин-теста для выявления антинейраминидазных антител в сыворотках вакцинированных / В.Т. Иванова и др. // Вопросы вирусологии.-1991,- № 6.- С. 469-471.

5. Исаева, Е.С. Каталитическая активность нейраминидазы / Е.С. Исаева, З.К. Чувакова, В.Э. Березин // Гликопротеиды ортомиксовирусов- Алма-Ата : Наука, 1988.-Гл. 2.- С. 21-33.

6. Карпович, Л.Г. Исследование клеточного и гуморального иммунитета послеv /противогриппозной вакцинации / Л.Г. Карпович и др. // Вопросы вирусологии.-1982.- Т. 27.- № 2.- С. 34-37.

7. Кустикова, Ю.Г. Изучение иммуногенной активности вирусного гемагглютинина и нейраминидазы живых и инактивированных гриппозных вакцин / Ю.Г. Кустикова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1983.- № 4.- С. 79-84.

8. Молибог, Е.В. Штаммовая специфичность антинейраминидазных антител серотипа N2 штаммов вируса гриппа у переболевших / Е.В. Молибог и др. // Вопросы вирусологи.- 1979.- № 6.- С. 631-634.

9. Найхин, А.Н. Антинейраминидазные сывороточные антитела при естественном инфицировании гриппом А и иммунизации гриппозными вакцинами / А.Н. Найхин и др. // Вопросы вирусологии.- 1983.- № 2.- С. 154-159.

10. Найхин, А.Н. Закономерности формирования коллективного иммунитета к гриппу и принципы сероэпидемиологического надзора за этой инфекцией : дис. . докт. мед. наук / А.Н. Найхин.- Л., 1986.- 368 с.

11. Найхин, А.Н. Комплексное изучение популяционного иммунитета к трем антигенам вируса гриппа А / А.Н. Найхин и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1981.- № 2,- С. 77-81.

12. Найхин, А.Н. Роль антинейраминидазных антител в иммунологическом ответе людей на введение живых гриппозных вакцин типа А / А.Н. Найхин, Н.В. Топурия, Г.М. Денисов // Микробиологический журнал.- 1980.- Т. 42.- № 5.- С. 642645.

13. Найхин, А.Н. Стимуляция гриппозными вакцинами антител к различным вариантам вируса гриппа А / А.Н. Найхин и др. // Вопросы вирусологии.- 1985.- Т. 30.-№3.- С. 290-296.

14. Найхин, А.Н. Формирование и защитные функции антител к нейраминидазе вируса гриппа А / А.Н. Найхин и др. // Вопросы вирусологии.- 1985.- № 1.- С.35-39.

15. Неклюдова, Л.И. О корреляции антинейраминидазных антител и антигемагглютининов при гриппозной инфекции и после введения живой гриппозной вакцины / Л.И. Неклюдова, Ю.Б. Фёдорова, Н.Г. Орлова // Вопросы вирусологии.-; 1974.-№2.-С. 173-176.

16. Очистка реакций секвенирования ДНК от невключившихся BigDye-ddNTP Электронный ресурс. : Рекомендации сотрудников Центра / Межинститутский центр секвенирования ДНК.- Режим доступа: http://sequest.niboch.nsc.ru/reaction clean up.html, свободный.

17. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных // Приказ Министерства здравоохранения СССР № 755 от 12.08.1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных»

18. Руденко, Л.Г. Основные характеристики живой гриппозной вакцины для детей из штаммов вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) при раздельном и совместном применении / Л.Г. Руденко и др. // Вопросы вирусологии 1989.- Т. 34.- № 1.- С. 2934.

19. Штыря, Ю.А. Изучение олигоеахаридной специфичности нейраминидазы вируса гриппа : автореф. дис. . канд. биол. наук : защищена 25.03.2009 / Ю.А. Штыря.- Москва: ООО «Цифровичок», 2009.- 24 с.

20. Штыря, Ю.А. Нейраминидаза вируса гриппа: структура и функция / Ю.А. Штыря, Л .В. Мочалова, Н.В. Бовин // Acta Naturae.- 2009,- № 2.- С. 28-34.

21. Air, G.M. Individual antibody and T cell responses to vaccination and infection with the 2009 pandemic swine-origin H1N1 influenza virus / G.M. Air et al. // Journal of clinical immunology.- 2011.- DOI 10.1007/s 10875-011-9563-1.

22. Air, G.M. Location of antigenic sites on the three-dimensional structure of the influenza N2 virus neuraminidase / G.M. Air et al. // Virology.- 1985.- Vol. 145.- № 2.- P. 237-248.

23. Aminoff, D. Methods for the quantitative estimation of N-acetyl neuraminic acid and their application to hydrolysates of sialomucoids / D. Aminoff // The Biochemical journal.- 1961.- Vol. 81.- P. 384-392.

24. Baker, N.J. Effect of Ca ++ on the stability of influenza virus neuraminidase / N. J. Baker, S.S. Gandhi // Archives of Virology.- 1976.- Vol. 52.- P. 7-18.

25. Bandaranayake, D. Risk factors and immunity in a nationally representative population following the 2009 influenza A(H1N1) pandemic / D. Bandaranayake et al. // PLoS One.- 2010,- Vol. 5.- № 10.- el3211.

26. Bao, Y. The influenza virus resource at the national center for biotechnology information / Y. Bao et al. // J. Virol.- 2008.- Vol. 82.- № 2.- P. 596-601.

27. Beigel, J. Current and future antiviral therapy of severe seasonal and avian influenza / J. Beigel, M. Bray // Antiviral research.- 2008.- Vol. 78.- № 1.- P. 91-102.

28. Beutner, K.R. Evaluation of a neuraminidase-specific influenza A virus vaccine in children: antibody responses and effects on two successive outbreaks of natural infection

29. K.R. Beutner et al. // The Journal of infectious diseases.- 1979.- Vol. 140.- № 6.- P. 844850.

30. Broberg, E. Seroprevalence to influenza A(H1N1) 2009 virus Where are we? / E. Broberg, A. Nicoll, A. Amato-Gauci // Clinical and Vaccine Immunology.- 2011,- Vol. 18.-№8.-P. 1205-1212.

31. Bui, H.H. Ab and T cell epitopes of influenza A virus, knowledge and opportunities / H.H. Bui et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2007.- Vol. 104.- № 1.- P. 246-251.

32. Burmeister, W.P. Calcium is needed for the thermostability of influenza B virus neuraminidase / W.P. Burmeister, S. Cusack, R.W. Ruigrok // Journal of General Virology.-1994.-Vol. 75.- P. 381-388.

33. Buxton, R.C. Development of a sensitive chemiluminescent neuraminidase assay for the determination of influenza virus susceptibility to zanamivir / R.C. Buxton et al. // Analytical biochemistry.- 2000.- Vol. 280.- № 2.- P. 291-300. . , ^.

34. Callow, K.A. A re-examination of the single radial haemolysis technique for the assay of influenza anti-neuraminidase antibodies in human sera / K.A. Callow, A.S. Beare // Archives of Virology.- 1980.- Vol. 65,- № 1,- P. 25-35.

35. Callow, K.A. Measurement of antibodies to influenza virus neuraminidase by an enzyme-linked immunosorbent assay / K.A. Callow // Infection and immunity.- 1983,- Vol. 41.-№2.- P. 650-656.

36. Callow, K.A. Measurement of antibody to influenza virus neuraminidase by single radial hemolysis in agarose gels / K.A. Callow, A.S. Beare // Infection and immunity.- 1976.- Vol. 13.- № 1.- P. 1-8.

37. Cate, T. R. A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects / T. R. Cate et al. // Vaccine.- 2010.- Vol. 28.- № 9. p. 2076-2079.

38. Chen, Z. Cross-protection against a lethal influenza virus infection by DNA vaccine to neuraminidase / Z. Chen et al. // Vaccine.- 2000.- Vol. 18.- № 28.- P. 32143222.

39. Chen, Z. Enhanced protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with both hemagglutinin- and neuraminidase-expressing DNAs / Z. Chen et al. //Vaccine.- 1999.- Vol. 17.- P. 653-659.

40. Chi, C.Y. Pre-existing antibody response against 2009 pandemic influenza H1N1 viruses in Taiwanese population / C.Y. Chi et al. // Clinical and vaccine immunology 2010.- Vol. 17.- № 12.- P. 1958-1962.

41. Clements, M.L. Serum and nasal wash antibodies associated with resistance to experimental challenge with influenza A wild-type virus / M.L. Clements et al. // Journal of Clinical Microbiology.- 1986.- Vol. 24.- № 1.- P. 157-160.

42. Colman, P.M. Influenza virus neuraminidase: Structure, antibodies, <■ andinhibitors / P.M. Colman // Protein Science.- 1994.- Vol. 3.- № 10.- P. 1687-1696.- Y i,t \ ' , * ; < ' '

43. Colman, P.M. Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virusneuraminidase / P.M. Colman, J.N. Varghese, W.G. Laver // Nature.- 1983.- Vol. 303.- № 5912.- P. 41-44.

44. Colman, P.M. Three-dimensional structure of a complex of antibody with influenza virus neuraminidase / P.M. Colman et al. // Nature.- 1987,- Vol. 326.- №6111.-P. 358-363.

45. Couch, R.B. Correlated studies of a recombinant influenza-virus vaccine. 3. Protection against experimental influenza in man / R.B. Couch RB et al. // The Journal of infectious diseases.-1971.- Vol. 124.- № 5.- P. 473-480.

46. Couch, R.B. Induction of partial immunity to influenza by a neuraminidase-specific vaccine / R.B. Couch et al. // The Journal of Infectious Diseases.- 1974.- Vol. 129.-№4.- P. 411-420.

47. Deroo, T. Recombinant neuraminidase vaccine protects against lethal influenza / T. Deroo, W.M. Jou, W. Fiers // Vaccine.- 1996.- Vol. 14.- № 6.- P. 561-569.

48. Deshairs, C. Catalytic properties of the A/H3N2 influenza neuraminidases: influence of antigenic variations / C. Deshairs et al. // The Journal of General Virology.-1986.- Vol. 67.- № 3.- P. 409-418.

49. Dowdle, W.R. Antigenic relationships among influenza virus A neuraminidase

50. N2) antigens by immunodiffusion and postinfection neutralization tests / W.R. Dowdle et»al. // Journal of clinical microbiology.- 1976.- Vol. 3.- № 3.- P. 233-238.

51. Dowdle, W.R. Inhibition of virus release by antibodies to surface antigens of influenza viruses / W.R. Dowdle, J.C. Downie, W.G. Laver // Journal of Virology.- 1974.-Vol.l3.-№2.- P. 269-275.

52. England, R.J. Nasal pH measurement: a reliable and repeatable parameter / R.J. England et al. // Clinical otolaryngology and allied sciences.- 1999.- Vol. 24.- № 1.- P. 67-68.

53. Feltquate, D.M. Different T helper cell types and antibody isotypes generated by saline and gene gun DNA immunization / D.M. Feltquate et al. // Journal of Immunology.-1997.- Vol. 158.- № 5.- P. 2278-2284.

54. Fischer, H. Mechanisms of acid and base secretion by the airway epithelium / H. Fischer, J.H. Widdicombe // The Journal of membrane biology.- 2006.- Vol. 211.- № 3.- P. 139-150.

55. Frobert, E. Anti N1 cross-protecting antibodies against H5N1 detected in H1N1 infected people / E. Frobert et al. // Current microbiology.- 2010.- Vol. 61.- № 1.- P. 2528.

56. Gilbert, G.L. Influenza A (H1N1) 2009 antibodies in residents of New South Wales, Australia, after the first pandemic wave in the 2009 southern hemisphere winter / G.L. Gilbert et al. // PLoS One.- 2010.- Vol. 5.- № 9.- el2562.

57. Gioia, C. Cross-subtype immunity against avian influenza in persons recently vaccinated for influenza / C. Gioia et al. // Emerging infectious diseases.- 2008.- Vol. 14.-№1.-P. 121-128.

58. Goto, H. A novel mechanism for the acquisition of virulence by a human influenza A virus / H. Goto, Y. Kawaoka // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.- Vol. 95.- № 17.-P. 10224-10228.

59. Goto, H. Plasminogen-binding activity of neuraminidase determines the pathogenicity of influenza A virus / H. Goto et al. // Journal of Virology.- 2001.- Vol. 75.-№19.- P. 9297-9301.

60. Greenbaum, J.A. Pre-existing immunity against swine-origin H1N1 influenza viruses in the general human population / J.A. Greenbaum et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2009.- Vol. 106.- № 48.- P. 20365-20370.

61. Gubareva, L.V. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-Guanidino-Neu5Ac2en / L.V. Gubareva et al. // Journal of Virology.- 1997.- Vol. 71.- № 5.- P. 3385-3390

62. Gulati, U. Antibody epitopes on the neuraminidase of a recent H3N2 influenza virus (A/Memphis/31/98) / U. Gulati et al. // Journal of Virology.- 2002.- Vol. 76.- № 23.-P. 12274-12280.

63. Hancock, K. Cross-reactive antibody responses to the 2009 pandemic H1N1 influenza virus / K. Hancock et al. // The New England journal of medicine.- 2009.- Vol. 361.- №20.- P. 1945-1952.

64. Hardelid, P. Assessment of baseline age-specific antibody prevalence and incidence of infection to novel influenza A/H1N1 2009 / P. Hardelid et al. // Health technology assessment (Winchester, England).- 2010.- Vol. 14.- № 55.- P.l 15-192.

65. Hennessy, A.V. Reproducibility of a neuraminidase inhibition test employed to measure anti-influenza neuraminidase antibody / A.V. Hennessy, F.M. Davenport // Applied Microbiology.- 1972.- Vol. 23.- № 4,- P. 827-828.

66. Henrissat, B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities / B. Henrissat // The Biochemical journal.- 1991.- Vol. 280.- P. 309316.

67. Hervio, L.S. Negative selectivity and the evolution of protease cascades: the specificity of plasmin for peptide and protein substrates / L.S. Hervio et al. // Chemistry &

68. Biology.-2000.-Vol. 7.-№ 6.-P. 443-453. r, ' > *> ~

69. Hoffmann, E. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses / E. Hoffmann et al. // Archives of virology.- 2001,- Vol. 146.- № 12.-P.2275-2289.

70. Hughes, M.T. Influenza A viruses lacking sialidase activity can undergo multiple cycles of replication in cell culture, eggs, or mice / M. T. Hughes et al. // Journal of Virology.- 2000.- Vol. 74.- № 11.- P. 5206-5212.

71. Ito, T. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection / T. Ito et al. // Journal of Virology.- 1997.- Vol. 71.- № 4,- P. 3357-3362.

72. Jameson, J. Human CD8+ and CD4+ T lymphocyte memory to influenza A viruses of swine and avian species / J. Jameson et al. // Journal of immunology.- 1999.-Vol. 162.- № 12.- P. 7578-7583.

73. Jennings, R. Responses of volunteers to inactivated influenza virus vaccines / R. Jennings et al. // The Journal of hygiene.-1981.- Vol. 86.- № 1.- P. 1-16.

74. Johansson, B.E. Infection-permissive immunization with influenza virus-vneuraminidase prevents weight loss in infected mice / B.E. Johansson, B. Grajower, E.D. Kilbourne // Vaccine.- 1993.- Vol. 11.- № 10.- P. 1037-1039. • » "

75. Kaiser, L. Impact of oseltamivir treatment on influenza-related lower respiratory tract complications and hospitalizations / L. Kaiser et al. // Archives of internal medicine.2003.-Vol. 163.-№ 14.-P. 1667-1672.

76. Katinger, D. Specificity of neuraminidase activity from influenza viruses isolated in different hosts tested with novel substrates / D. Katinger et al. // Archives of Virology.2004.-Vol. 149.-№ n. p. 2131-2140.

77. Kendirgi, F. Novel linear DNA vaccines induce protective immune responses against lethal infection with influenza virus type A/H5N1 / F. Kendirgi et al. // Human Vaccines.- 2008.- Vol. 4.- № 6,- P. 410-419.

78. Khan, M.W. Detection of influenza virus neuraminidase-speciflc antibodies by an enzyme-linked immunosorbent assay / M.W. Khan et al. // Journal of Clinical Microbiology.- 1982.-Vol. 16.-№ 1.- P. 115-122.

79. Kilbourne, E.D. Comparative efficacy of neuraminidase-specific and conventional influenza virus vaccines in induction of antibody to neuraminidase in humans / E.D. Kilbourne // The Journal of Infectious Diseases.- 1976.- Vol.134.- № 4.- P. 384-394.

80. Kilbourne, E.D. Influenza Pandemics of the 20th Century / E.D. Kilbourne // Emerging Infectious Diseases.- 2006.- Vol. 12,- № 1.- P. 9-14.

81. Kilbourne, E.D. Protection of mice with recombinant influenza virus neuraminidase / E.D. Kilbourne et al. // The Journal of Infectious Diseases.- 2004.- Vol. 189.-№3.- P. 459-461.

82. Klimov, A.I. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines / A.I. Klimov, N.J. Cox // Journal of , virological methods.- 1995.-Vol. 52.-P.41-49. 1 '< < /

83. Kobasa, D. Amino acid resides contributing to the substrate specificity of the influenza A virus neuraminidase / D. Kobasa et al. // Journal of Virology.- 1999.- Vol. 73.-№8.- P. 6743-6751.

84. Kreijtz, J.H. Cross-recognition of avian H5N1 influenza virus by human cytotoxic T-lymphocyte populations directed to human influenza A virus / J.H. Kreijtz et al. //Journal of Virology.- 2008.- Vol. 82.- № 11.- P. 5161-5166.

85. Kwon, M. S100A10, annexin A2, and annexin a2 heterotetramer as candidate plasminogen receptors / M. Kwon et al. // Frontiers in bioscience: a journal and virtual library.- 2005.- Vol. 10.- P. 300-325.

86. Lambre, C.R. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates / C.R. Lambre et al. // Journal of immunological methods.- 1990.- Vol. 135.- P. 49-57.

87. Lazarowitz, S.G. Proteolytic cleavage by plasmin of the HA polypeptide of influenza virus: Host cell activation of serum plasminogen / S.G. Lazarowitz, A.R. Goldberg, P.W. Choppin // Virology.- 1973.- Vol. 56.- № 1.- P. 172-180.

88. LeBouder, F. Plasminogen promotes influenza A virus replication through an annexin II-dependent pathway in absence of neuraminidase / F. LeBouder et al. // Journal of General Virology.- 2010.- Vol.91.- P. 2753-2761.

89. Lee, L.Y. Memory T cells established by seasonal human influenza A infection crossreact with avian influenza A (H5N1) in healthy individuals / L.Y. Lee et al. // The Journal of clinical investigation.- 2008.- Vol. 118.- № 10.- P. 3478-3490.

90. Lee, V.J. Inactivated trivalent seasonal influenza vaccine induces limited cross-reactive neutralizing antibody responses against 2009 pandemic and 1934 PR8 H1N1 strains / V.J. Lee et al. // Vaccine.- 2010.- Vol. 28.- № 42.- P. 6852-6857.

91. Lentz, M.R. Sequence of the neuraminidase gene of influenza virus A/Tokyo/3/67 and previously uncharacterized monoclonal variants / M.R. Lentz et al. // Virology.- 1984.- Vol. 135.- № 1.- P. 257-265.

92. Lentz, M.R. Site-directed mutation of the active site of influenza neuraminidase and implications for the catalytic mechanism / M.R. Lentz, R.G. Webster, G.M. Air // Biochemistry.- 1987.- Vol. 26.- № 17.- P. 5351-5358.

93. Li, C. Compatibility among polymerase subunit proteins is a restricting factor in reassortment between equine H7N7 and human H3N2 influenza viruses/ C. Li et al. // Journal of Virology.- 2008.- Vol. 82.- № 23.- P. 11880-11888.

94. Li, S. Glycosylation of neuraminidase determines the neurovirulence of influenza A/WSN/33 virus / S. Li et al. // Journal of Virology.- 1993.- Vol. 67.- № 11.- P. 66676673.

95. Lin, Y.P. Adaptation of egg-grown and transfectant influenza viruses for growth in mammalian cells: selection of hemagglutinin mutants with elevated pH of membrane fusion / Y.P. Lin et al. // Virology.- 1997.- Vol. 233,- № 2.- P. 402-410.

96. Liu, C. Influenza type A virus neuraminidase does not play a role in viral entry, replication, assembly, or budding / C. Liu et al. // Journal of Virology.- 1995,- Vol. 69.- № 2.-P. 1099-1106.i

97. Liu, C. Selection and characterization of a neuraminidase-minus mutant of influenza virus and its rescue by cloned neuraminidase genes / C. Liu, G.M. Air // Virology.- 1993.- Vol. 194.- № 1,- P. 403-7

98. Liu, S. CL-385319 inhibits H5N1 avian influenza A virus infection by blocking viral entry / S. Liu et al. // European Journal of Pharmacology.- 2011.- Vol. 660.- P. 460467.

99. Luo, G. Characterization of a hemagglutinin-speciflc inhibitor of influenza A virus / G. Luo, R. Colonno, M. Krystal // Virology.- 1996.- Vol. 226.- № 1.- P. 66-76.

100. Luo, G. Molecular mechanism underlying the action of a novel fusion inhibitor of influenza A virus / G. Luo et al. // Journal of Virology.- 1997.- Vol. 71.- № 5.- P. 40624070.

101. Luther, P. The lectin neuraminidase inhibition test: a new method for the detection of antibodies to neuraminidase / P. Luther et al. // Journal of biological standardization.- 1983.- Vol. 11.-№2.- P. 115-121.

102. Lynch G.W. Cross-reactive anti-avian H5N1 influenza neutralizing antibodies in a normal 'exposure-naive' Australian blood donor population / G.W. Lynch et al. // The Open Immunology Journal.- 2008,- Vol. 1.- P. 13-19.

103. Matrosovich, M.N. Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection in human airway epithelium / M.N. Matrosovich et al. // Journal of Virology.- 2004.- Vol. 78.- № 22.- P. 12665-12667.

104. McShane, D. Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis / D. McShane et al. // The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory.- 2003.- Vol. 21.- № 1.- P. 37-42.

105. McVernon, J. Seroprevalence of 2009 pandemic influenza A(H1N1) virus in Australian blood donors, October December 2009 / J. McVernon et al. // Euro surveillance: European communicable disease bulletin.- 2010.- Vol. 15.- № 40.- pii=19678.

106. Miller, E. Incidence of 2009 pandemic influenza A H1N1 infection in England: a cross-sectional serological study / E. Miller et al. // Lancet.- 2010.- Vol. 375.- № 9720.- P. 1100- 1108.

107. Miyazono, K. Role for carbohydrate structures in TGF-bl latency / K. Miyazono, C.H. Heldin // Nature.- 1989.- Vol. 338.- № 6211.- P. 158-160.

108. Mochalova, L. Oligosaccharide specificity of influenza H1N1 virus neuraminidases / L. Mochalova et al. // Archives of Virology.- Vol. 152.- № 11.- P. 20472057.

109. Monto, A.S. Effect of neuraminidase antibody on Hong Kong influenza / A.S. Monto, A.P. Kendal // Lancet.- 1973.- Vol. 1.- № 7804,- P. 623-625.

110. Morley, P.S. The effect of changing single radial hemolysis assay method when quantifying influenza A antibodies in serum / P.S. Morley et al. // Veterinary microbiology.- 1995.- Vol. 44.- № 1.- P. 101-110.

111. Morris, S.J. Role of neuraminidase in influenza virus-induced apoptosis / S.J. Morris et al. // Journal of General Virology.- 1999.- Vol. 80.- P. 137-146. :

112. Naikhin, A.N. The importance of antineuraminidase antibodies in resistance to influenza A and immunologic memory for their synthesis / A.N. Naikhin et al. // The Journal of hygiene.- 1983.- Vol. 91.- № 1.- P. 131-138.

113. Nath, D.M. Antigenic comparison of swine influenza virus isolates / D.M. Nath, L.S. Rodkey, H.C. Minocha // Archives of Virology.- 1975.- Vol. 48.- № 3.- P. 245-252.

114. Nayak, B. Contributions of the avian influenza virus HA, NA, and M2 surface proteins to the induction of neutralizing antibodies and protective immunity / B. Nayak et al. // Journal of Virology.- 2010.- Vol. 84,- № 5.- P. 2408-2420.

115. Ogra, P.L. Clinical and immunologic evaluation of neuraminidase-specific influenza A virus vaccine in humans / P.L. Ogra et al. // The Journal of Infectious Diseases.- 1977.- Vol. 135.- № 4.- P. 499-506.

116. Palese, P. Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuralninidase / P. Palese et al. // Virology.- 1974,- Vol. 61.- № 2.- P. 397410.

117. Peters, B. The immune epitope database and analysis resource: from vision to blueprint / B. Peters et al. // PLoS biology.- 2005.- Vol. 3.- № 3.- P. e91.

118. Pichyangkul, S. Cross-reactive Antibodies against avian influenza virus A (H5N1) / S. Pichyangkul et al. // Emerging infectious diseases.- 2009.- Vol. 15.- № 9.- P.1537-1539.- < • , • '' ' '7 \Ai ' t i /*

119. Potier, M. Fluorometric assay of neuraminidase with a sodium (4-methylumbelliferyl-alpha-d-N-acetylneuraminate) substrate / M. Potier et al. // Analytical biochemistry.- 1979.- Vol. 94.- № 2.- P. 287-296.

120. Price, G.E. Differential induction of cytotoxicity and apoptosis by influenza virus strains of differing virulence / G.E. Price, H. Smith, C. Sweet // Journal of General Virology.- 1997.- Vol. 78.- P. 2821-2829.

121. Reece, P.A. Treatment options for H5N1: lessons learned from the H1N1 pandemic / P.A. Reece // Postgraduate medicine.- 2010.- Vol. 122.- № 5.- P. 134-141.

122. Reed, L.J. A simple method of estimating fifty percent endpoints / L.J. Reed, H. Muench // The American Journal of Hygiene.- 1938.- Vol. 27.- № 3.- P. 493-497.

123. Reed, M.L. Amino acid residues in the fusion peptide pocket regulate the pH of activation of the H5N1 influenza virus hemagglutinin protein / M.L. Reed et al. // Journal of Virology.- 2009.- Vol. 83.- № 8.- P. 3568-3580.

124. Rizzo, C. Cross-reactive antibody responses to the 2009 A/HlNlv influenza virus in the Italian population in the pre-pandemic period / C. Rizzo et al. // Vaccine.-2010.- Vol. 28.- № 20.- P. 3558-3562.

125. Roti, M. Healthy human subjects have CD4+ T cells directed against H5N1 influenza virus / M. Rori et al. // Journal of immunology.- 2008.- Vol. 180,- № 3.- P. 1758-1768.

126. Rowe, T. Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays / T. Rowe et al. // Journal of clinical microbiology.- 1999.- Vol. 37.- № 4.- P. 937-943.

127. Rudenko, L. Development of pandemic live attenuated influenza vaccine (LAIV)in Russia / L. Rudenko et al. // Influenza and other respiratory viruses.- 2011.-, Vol. 5.t ' f1. Suppl. 1.-P. 333-337.

128. Rudenko, L. Safety and immunogenicity of live attenuated influenza reassortant H5 vaccine (phase I—II clinical trials) / L. Rudenko et al. // Influenza and Other Respiratory Viruses.- 2008.- Vol. 2.- № 6.- P. 203-209.

129. Sandbulte, M.R. Cross-reactive neuraminidase antibodies afford partial protection against H5N1 in mice and are present in unexposed humans / M.R. Sandbulte et al. // PLoS medicine.- 2007.- Vol. 4.- № 2.- P. 265-272.

130. Schanen, B.C. Coupling sensitive in vitro and in silico techniques to assess cross-reactive CD4(+) T cells against the swine-origin H1N1 influenza virus / B.C. Schanen et al. // Vaccine.- 2011.- Vol. 29.- № 17.- P. 3299-3309.

131. Schild, G.C. Antibody against influenza A2 virus neuraminidase in human sera / G.C. Schild // The Journal of hygiene.- 1969.- Vol. 67,- № 2.- P. 353-365.

132. Schild, G.C. A quantitative, single-radial-diffusion test for immunological studies with influenza virus / G.C. Schild, M. Henry-Aymard, H.G. Pereira // Journal of General Virology.- 1972.- Vol. 16.- № 2.- P.231-236.

133. Schulman, J.L. Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice / J.L. Schulman, M. Khakpour, E.D. Kilbourne // Journal of Virology.- 1968.- Vol. 2.- № 8.- P. 778-786.

134. Schulman, J.L. Virulence factors of influenza A viruses: WSN virus neuraminidase required for plaque production in MDBK cells / J.L. Schulman, P. Palese // Journal of Virology.- 1977.- Vol. 24.-№ 1.- P. 170-176.

135. Schultz-Cherry, S. Influenza virus neuraminidase activates latent transforming growth factor beta / S. Schultz-Cherry, V.S. Hinshaw // Journal of Virology.- 1996.- Vol. 70.-№ 12.- P. 8624-8629.

136. Shibata, S. Characterization of a temperature-sensitive influenza B virus mutant defective in neuraminidase / S. Shibata et al. // Journal of Virology.- 1993.- Vol. 67.- № 6.- P. 3264-3273.

137. Slepushkin, A.N. Neuraminidase and resistance to vaccination with live influenza A2 Hong Kong vaccines / A.N. Slepushkin et al. // The Journal of hygiene.-1971.- Vol. 69.- № 4.- P. 571-578.

138. Smith, A.J. Natural infection with influenza A (H3N2). The development, persistence and effect of antibodies to the surface antigens / A.J. Smith, J.R. Davies // The Journal of hygiene.- 1976.-Vol. 77.- № 2.- P. 271-282.

139. Smith, B.J. Structure of a calcium-deficient form of influenza virus neuraminidase: implications for substrate binding / B.J. Smith et al. // Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography.- 2006.- Vol. 62.- P.947-952.

140. Stray, S.J. Apoptosis by influenza viruses correlates with efficiency of viral mRNA synthesis / S.J. Stray, G.M. Air // Virus Research.- 2001.- Vol. 77.- № 1.- P. 3-17.

141. Sugaya, N. Very low pandemic influenza A (H1N1) 2009 mortality associated with early neuraminidase inhibitor treatment in Japan: Analysis of 1000 hospitalized children / N. Sugaya et al. // The Journal of infection.- 2011.

142. Sugiura, A. Neurovirulence of influenza virus in mice I. Neurovirulence of recombinants between virulent and avirulent virus strains / A. Sugiura, M. Ueda // Virology.- 1980.- Vol. 101.- № 2- P. 440-449.

143. Sun, X. Modifications to the hemagglutinin cleavage site control the virulence of a neurotropic H1N1 influenza virus / X. Sun et al. // Journal of Virology.- 2010.- Vol. 84.-№ 17.- P. 8683-8690.

144. Suzuki, T. Sialidase activity of influenza A virus in an endocytic pathway enhances viral replication / T. Suzuki et al. // Journal of Virology.- 2005.- Vol. 79.- № 18.-P. 11705-11715.

145. Suzuki, Y. Sialic acid species as a determinant of the host range of influenza A viruses / Y. Suzuki et al. // Journal of Virology.- 2000.- Vol. 74,- № 24.- P. 11825-11831.

146. Sylte, M.J. Influenza neuraminidase antibodies provide partial protection for chickens against high pathogenic avian influenza infection / M.J. Sylte, B. Hubbyb, D.L.

147. Suarez // Vaccine.- 2007.- Vol. 25.- № 19.- p. 3763-3772. , > vf < x 1 i>r' ?

148. Takahashi, T. A molecular mechanism for the low-pH stability of sialidase activity of influenza A virus N2 neuraminidases / T. Takahashi et al. // FEBS Letters.-2003.-Vol. 543.- P. 71-75.

149. Takahashi, T. Duck and human pandemic influenza A viruses retain sialidase activity under low pH conditions / T. Takahashi et al. // Journal of biochemistry.- 2001.-Vol. 130.-№2.- P. 279-283.

150. Takahashi, T. The low-pH stability discovered in neuraminidase of 1918 pandemic influenza A virus enhances virus replication / T. Takahashi et al. // PLoS One.-2010.- Vol. 5,- № 12.- el5556.

151. Thoennes, S. Analysis of residues near the fusion peptide in the influenza hemagglutinin structure for roles in triggering membrane fusion / S. Thoennes et al. // Virology.- 2008.- Vol. 370.- № 2.- P. 403-414.

152. Throsby, M. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells / M. Throsby et al. // PloS One.- 2008.- Vol. 3.- № 12.- e3942.

153. Tran, T.H. Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam / T.H. Tran et al. // The New England journal of medicine.- 2004.- Vol. 350,- № 12.- P. 1179-1188.

154. Tumpey, T.M. Mucosal delivery of inactivated influenza vaccine induces B-cell-dependent heterosubtypic cross-protection against lethal influenza A H5N1 virus infection / T.M. Tumpey et al. // Journal of Virology.- 2001.- Vol. 75.- № 11,- P. 5141-5150.

155. Varghese, J.N. Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9 A resolution / J.N. Varghese, W.G. Laver, P.M. Colman // Nature.-1983.- Vol. 303.- № 5912.- P. 35-40.

156. Viboud, C. Multinational impact of the 1968 Hong Kong influenza pandemic: evidence for a smoldering pandemic / C.Viboud et al. // The Journal of Infectious Diseases.- 2005.-Vol. 192.- № 2.- P. 233-248.

157. Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids / L. Warren // The Journal of biological chemistry .-1959.- Vol. 234.- № 8.- P. 1971-1975.

158. Washington, N. Determination of baseline human nasal pH and the effect of intranasally administered buffers / N. Washington et al. // International journal of pharmaceutics.-2000.-Vol. 198.-№2.-P. 139-146.

159. Webster, R.G. Antigenic and biological characterization of influenza virus neuraminidase (N2) with monoclonal antibodies / R.G. Webster, L.E. Brown, W.G. Laver // Virology.- 1984.- Vol. 135.- № 1.- P. 30-42.

160. Webster, R.G. Antigenic structure and variation in an influenza virus N9 neuraminidase / R. G. Webster et al. // Journal of Virology.- 1987.- Vol. 61.- № 9.- P. 2910-2916;

161. Xie, H. Immunogenicity and cross-reactivity of 2009-2010 inactivated seasonal influenza vaccine in US adults and elderly / H. Xie et al. // PLoS One.- 2011.- Vol. 6.- № l.-el6650.

162. Xu, X. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase / X. Xu et al. // Journal of Virology.- 2008.- Vol. 82.- № 21.- P. 1049310501.

163. Yamane, N. Effect of specific immunity to viral neuraminidase on subsequent influenza virus infection in man / N. Yamane et al. // Microbiology and immunology.-1979.- Vol. 23.- № 6.- P. 565-567.

164. Zimmer, S.M. Seroprevalence following the second wave of Pandemic 2009 H1N1 influenza in Pittsburgh, PA, USA / S.M. Zimmer et al. // PLoS One.- 2010.- Vol. 5.-№7.-el 1601.190

165. Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Юлии Андреевне Дешевой за бесценную помощь и поддержку, оказанную в ходе выполнения диссертационной работы.

166. Искренне признательна рецензентам Анатолию Нойевичу Найхину и Вере Зорьевне Кривицкой за бесценные советы, замечания и деятельное участие в шлифовании диссертации.

167. Выражаю глубокую благодарность руководителю отдела вирусологии НИИЭМ СЗО РАМН Ларисе Георгиевне Руденко за предоставленную возможность обучения в аспирантуре, всестороннюю помощь и поддержку.А

Информация о работе

Смолоногина, Татьяна Анатольевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.02.02

Диссертация

Изучение формирования сывороточных антител к нейраминидазе пандемического, потенциально пандемического и сезонных вирусов гриппа А в эксперименте и клинических наблюдениях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы