Генетическая изменчивость и антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1), циркулировавшего в 2009–2010 годах на территории Российской Федерации

Шиков, Андрей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическая изменчивость и антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1), циркулировавшего в 2009–2010 годах на территории Российской Федерации
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая изменчивость и антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1), циркулировавшего в 2009–2010 годах на территории Российской Федерации"

На правах рукописи

Шиков Андрей Николаевич

Генетическая изменчивость и антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа А (Н11Ч1), циркулировавшего в 2009-2010 годах на территории Российской Федерации

03.02.02 — вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005538210 1 Д ОЯШ

Кольцово-2013

005538210

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Научный руководитель: Агафонов Александр Петрович,

доктор биологических наук

Официальные оппоненты: Яшина Людмила Николаевна,

доктор биологических наук, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующая лабораторией разработки средств ПЦР-идентификации возбудителей 1-2 групп патогенности

Беклемишев Анатолий Борисович,

доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Научно-исследовательский институт биохимии» СО РАМН, заведующий лабораторией генной инженерии

Ведущая организация: ФГБУН Институт цитологии и генетики

Сибирского отделения Российской академии наук

Защита состоится «Об» декабря 2013 г. в 09-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: 630559, Новосибирская область, Новосибирский район, р.п. Кольцово, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», тел. (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан «Ь> ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Г.П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирус гриппа А обладает механизмами генетической изменчивости, благодаря которым вновь появившиеся варианты способны преодолевать коллективный иммунитет, сформировавшийся к прежде циркулировавшим вариантам вируса гриппа А, что выражается в периодически возникающих пандемиях гриппа. Кроме того, в настоящее время быстрому распространению вируса способствует развитие международных деловых и туристических связей между государствами (Chen, Wilson, 2008).

О новом реассортантном варианте вируса гриппа A (H1N1) стало известно в конце апреля 2009 года, когда в Мексике и США были зафиксированы первые случаи вызванного им заболевания (CDC, 2009). Распространение заболевания быстро приобрело глобальные масштабы, в связи с чем ВОЗ 11 июня 2009 года объявила о начале пандемии гриппа (WHO, 2009). Пандемия охватила более 200 стран мира, новым вариантом вируса гриппа в некоторых регионах было инфицировано от 20 до 40% населения (WHO, 2010). В августе 2010 года, на основании данных о заболеваемости, поступавших из различных регионов мира, было объявлено об окончании пандемии и начале постпандемического периода (WHO, 2010).

Молекулярно-генетические исследования, наряду с изучением биологических (антигенных) свойств вируса гриппа, являются важной составляющей мониторинга вирусной изменчивости, поскольку позволяют отслеживать появление мутаций, отвечающих за изменение антигенных, функциональных свойств вирусных белков, а также за чувствительность к противовирусным препаратам.

Цель исследования: изучение генетической изменчивости и биологических свойств штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09, циркулировавшего в 2009-2010 годах на территории Российской Федерации.

Задачи исследования:

1. Исследовать клинические и секционные образцы на наличие генетического материала пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm09 методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2. Выделить штаммы пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm09 из клинических и секционных образцов и изучить их антигенные свойства.

3. Определить нуклеотидные последовательности генов, кодирующих вирусные белки выделенных штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей и анализ соответствующих им аминокислотных последовательностей.

4. Провести анализ генетической гетерогенности вирусной популяции отдельных штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09.

Научная новизна и практическая значимость. Из клинического и секционного материала в период пандемии гриппа 2009-2010 годов выделены 40 штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, из которых 11 штаммов депонированы в Государственную коллекцию возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ГНЦ ВБ «Вектор».

Проведен анализ антигенных свойств 4 штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенных на территории РФ в период пандемии 2009-2010 годов.

Определены нуклеотидные последовательности полноразмерных геномов у 10 штаммов вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенных в период пандемии, а также последовательности генов НА и NA клинического изолята вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенного в постпандемический период в 2011 году, проведен их молекулярно-генетический анализ. В международную базу данных GeneBank депонировано 96 нуклеотидных последовательностей сегментов генома выделенных штаммов вируса гриппа А (H1N1) pdm09.

Проведен детальный анализ аминокислотных последовательностей вирусных белков штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенных в период пандемии 2009 года, на наличие у них детерминант патогенности и устойчивости к противовирусным препаратам.

Проведен анализ генетической гетерогенности вирусной популяции отдельных штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенных в период пандемии 2009-2010 годов.

Предложены и апробированы праймеры, послужившие основой для разработки средств диагностики в рамках выполнения Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 годы)».

Положения, выносимые на защиту:

1. В период пандемии гриппа 2009-2010 годов на территории Российской Федерации циркулировал вирус гриппа А (H1N1), филогенетически подобный штамму вируса гриппа A/California/04/2009(H1N1).

2. Антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, циркулировавшего на территории РФ в период с апреля 2009 года по февраль 2010 года, не изменялись.

3. В гене НА штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm09 преобладает положительный отбор (частота несинонимичных нуклеотидных замен выше частоты синонимичных), а большинство аминокислотных замещений в НА регистрируются в антигенных эпитопах.

4. Исследованные штаммы пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09 не имеют мутаций, формирующих устойчивость к препаратам из группы ингибиторов NA, но содержат аминокислотное замещение, приводящее к резистентности к препаратам адамантанового ряда.

5. Популяции выделенных штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09 являются генетически гетерогенными.

Вклад автора. Первичная обработка образцов, выделение штаммов вируса гриппа из диагностического материала проводились совместно с научными сотрудниками отдела эпидемиологии ООВИ Сергеевым Ар.А. и Деминой O.K. Постановки реакции гемагглютинации и реакции торможения гемагглютинации осуществлялись совместно с научным сотрудником отдела эпидемиологии ООВИ Деминой O.K. Штаммы A/Habarovsk/01/2009(HlNl),

A/Bishkek/02/2009(HlNl) и A/Omsk/04/2009(H1N1) были выделены сотрудниками отдела зоонозных инфекций и гриппа Дурымановым А.Г. и к.б.н. Шаршовым К.А. и предоставлены для молекулярно-генетических и вирусологических исследований. Выделение РНК, реакция обратной транскрипции, полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени» проводились автором, сотрудниками отдела эпидемиологии ООВИ Берилло С.А. и Сергеевой Е.И., а также сотрудницей отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов Семенцовой А.О. Все остальные эксперименты, включая постановку ПЦР, очистку полученных продуктов ПЦР, секвенирование и очистку продуктов секвенирования, депонирование полученных нуклеотидных

последовательностей геномов вируса гриппа, их теоретический анализ, выполнены автором лично и в соавторстве с к.б.н. Терновым В.А. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов молекулярно-генетических исследований оказывали к.б.н. Терновой В.А. и к.б.н. Бакулина А.Ю. Общее руководство работой осуществлялось Агафоновым А.П.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, включает 17 таблиц и 13 рисунков и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, приложение, а также список литературы, состоящий из 201 источника отечественных и зарубежных авторов.

Апробация результатов диссертации и публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные статьи в журналах, рекомендованных

ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации, 1 методические рекомендации. Получен патент Российской Федерации на изобретение (№2457242 от 27 июля 2012 года).

Результаты исследований были представлены на 2-й международной конференции «Астана-Биотех 2011» (Астана, Республика Казахстан, 2011) и на конференции «Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения» (Новосибирск, 2012).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Образцы для исследования и выделения вирусных штаммов. Для

исследования использовались носоглоточные смывы от больных и аутопсийный материал (фрагменты легочной ткани и трахеи). Все образцы были направлены в ГНЦ ВБ «Вектор» из Центров гигиены и эпидемиологии в субъектах РФ в соответствии с приказом Роспотребнадзора от 17.03.2008 года №88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней» в рамках противодействия пандемии гриппа 2009-2010 годов. Все образцы были взяты с согласия пациентов или их законных представителей, исследование одобрено этическими комитетами при лечебно-профилактических учреждениях, где осуществлялся забор клинического материала.

Выделение вируса из клинического и секционного материала. Штаммы вируса гриппа были выделены путем инокуляции 100 мкл вируссодержащего материала в аллантоисную полость 9-суточных РКЭ (Мейхи, 1988).

Получение иммунных сывороток. Мышей стока ICR массой 15-17 г использовали для заражения выделенными штаммами пандемического вируса гриппа A(HlNI)pdm09 для получения иммунных сывороток. Сыворотки забирали на 21 сутки после интраназального введения животным под эфирным наркозом вируса в дозе 4,0-4,5 lg ЭИД50/ЗОмкл/мышь.

Определение титра противовирусных антител в сыворотке крови инфицированных мышей в РТГА. Титры антител к пандемическому вирусу гриппа A(HlNl)pdm09 в сыворотке крови инфицированных мышей определяли традиционным методом в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (Мейхи, 1988; WHO, 2002).

ОТ-ПЦР. Выделение РНК проводили с использованием коммерческих наборов реагентов «РИБО-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием коммерческих наборов реагентов «PEBEPTA-L» (ФГУН ЦНИИЭ, Россия) согласно инструкции производителя. Для ПЦР «в реальном времени» использовали наборы реагентов «АмплиСенс® Influenza virus A/Hl-swine-FL» (ФГУН ЦНИИЭ, Россия) и собственные наборы праймеров и флуоресцентно-меченых зондов (таблица 1), специфичных к генам НА и NA пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09.

Для определения нуклеотидных последовательностей генов выделенных штаммов ПЦР проводили с праймерами, рекомендованными ВОЗ (http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/sequencing_primers/en/).

Таблица 1

Последовательности праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для детекции генетического материала пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09

Ген-мишень Название праймерови зондов Последовательность праймеров и зондов <5'-3')

НА F 111 GAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTG

R 390 CTTTCAAATGATGACACTGAGCTCAA

Z 231 FAM-ATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTC-BHQ1

NA F 1232 GAACTAACAGGGCTGGATTGTATAAGA

R 1409 TACTTGTCAATGGTAAATGGCA

Z 1348 R6G-CAGTGACACTGTGGGTTGGTCTTGGCC-BHQ1

Секвенирование ДНК. Секвенирование проводили с наборами реагентов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, США). Продукты секвенирующей реакции анализировали методом капиллярного электрофореза в автоматическом секвенаторе ABI PRISM® 3130*/ (Applied Biosystems/Hitachi, Япония).

Анализ нуклеотидных последовательностей. Филогенетический анализ проводили методами минимальной эволюции, максимального правдоподобия и присоединения соседей. Построение филогенетических деревьев выполняли в программах MEGA 5 и Lasergene 7.

Для оценки генетической неоднородности исследуемых штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm09 определяли частоту однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в генах НА и NA. ОНП были представлены на электрофореграммах двойными пиками флуоресценции во фрагменте ДНК, синтезируемого с одного праймера (Bourret et al., 2013). Частота ОНП была рассчитана на 1000 нуклеотидных сайтов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09

С мая 2009 года по май 2010 года проанализировано 1119 проб от 386 пациентов из 22 регионов России с подозрением на заболевание, вызванное пандемическим вирусом гриппа A (H1N1) pdm09. Методом ПЦР «в реальном времени» диагноз был подтвержден у 262 пациентов.

С мая 2009 по май 2010 года выделено 40 штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm09 (таблица 2), из них 18 штаммов выделены в период с мая по октябрь 2009 года. Все они были связаны с завозными случаями гриппа на территорию РФ из других стран. Остальные штаммы выделены от тяжелобольных и умерших в период с октября 2009 года по март 2010 года, когда пандемический вирус гриппа начал циркулировать непосредственно на территории РФ.

Таблица 2

Характеристика использованных в работе штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09

к» п/п Название штаммов Секвенированные нуклеотидные последовательности Дата поступления материала Материал для исследования/течение/исход Кол-во пассажей в РКЭ Титр в РГА

1. A/Moscow/22S/2009(H1N1) * — 25.05.2009 нс/л/в 4 1 128

2. A/Moscow/226/2009(H 1N1) НА,ЫР,М, N5 04.06.2009 НС/Л/В 4 1 64

3. A/Moscow/227/2009(H 1N1) — 09.06.2009 нс/л/в 3 1 16

4. A/Moscow/228/2009(H 1N1) — 17.07.2009 нсшв 3 1 8

5. A/Moscow/229/2009(H 1N1) — 17.07.2009 нс/л/в 3 1 8

6. A/Tomsk/01/2009(HlNl) Полный геном 18.07.2009 нс/л/в 2 1 32

7. А/Almati/01/2009(H 1N1) Полный геном 29.07.2009 нс/л/в 4 1 16

8. A/Irkutsk/02/2009(H 1N1) Полный геном 02.08.2009 нс/л/в 2 1 32

9. A/Ekatermburg/01/2009(H 1N1) Полный геном 03.08.2009 нс/л/в 2 1 64

10. А/Yakutsk/01/2009(H 1N1) — 03.08.2009 нс/л/в 2 1 128

11. A/Chelyabinsk/O1/2009(H 1N1) — 06.08.2009 нс/л/в 2 1 64

12. A/Novgorod/01/2009(H 1N1) НА, ЫА 06.08.2009 нс/л/в 2 1 32

13. A/Orenburg/01/2009(H 1Ы1) Полный геном 06,08.2009 нс/л/в 2 1 32

14. A/Kurgan/01/2009(H1N1) Полный геном 10.08.2009 нс/л/в 2 1 128

15. A/Omsk/01/2009(HlNl) Полный геном 12.08.2009 нс/л/в 2 1 128

16. A/Chelyabinsk/02/2009(H 1N1) Фрагменты НА и К А 04.09.2009 нс/л/в 2 1 64

17. A/Tula/01/2009(H1N1) Фрагменты НА и \Л 04.09.2009 нс/л/в 2 1 128

18. A/Abakan/01/2009(H 1N1) Фрагменты НА и \ Л 03.10.2009 нс/л/в 2 1 128

19. A/Chita/01/2009(H1N1) Полный геном 31.10.2009 тл/т/с 2 1 32

20. A/Chelyabinsk/05/2009(H1N1) Фрагменты НА и ЫА 10.11.2009 тл/т/с 2 1 64

21. A/Chita/02/2009(HlNl) Фрагменты НА и ХЛ 10.11.2009 тл/т/с 2 1 32

22. A/Chita/03/2009(H Ш1) Фрагменты НА и ЫА 10.11.2009 тл/т/с 2 1 32

23. A/Abakan/02/2009(HlNl) НА, ЫА 17.11.2009 тл/т/с 2 1 256

24. A/Krasnoyarsk/01/2009(H 1N1) Фрагменты НА и ЫА 17.11.2009 тл/т/с 2 1 128

25. A/Chelyabinsk/03/2009(H 1N1) Фрагменты НА и ЫА 20.11.2009 тл/т/с 2 1 256

26. A/Chelyabinsk/04/2009(H 1N1) Фрагменты НА и ЫА 20.11.2009 тл/т/с 2 1 256

№ п/п Название штаммов Секвенированные нуклеотидные последовательности Дата поступления материала Материал для исследования/течение/исход Кол-во пассажей в РКЭ Титр в РГА

27. A/Habarovsk/01/2009(Н INI)** НА, NA, М, N5 23.11.2009 тл/т/с 2 1 128

28. А/Тomsk/07/2009(HlNl) Полный геном 24.11.2009 тля/с 2 1 256

29. A/Tomsk/08/2009(H INI) НА, ЫА 27.11.2009 тл/т/с 2 1 128

30. A/Tomsk/09/2009(H1N1) Фрагменты НА и NA 27.11.2009 тл/т/с 2 1 64

31. A/Bishkek/02/2009(H IN 1)* * Полный геном 28.11.2009 нся/в 2 1 128

32. MSalekharM 1/2009( H1N1) Полный геном 01.12.2009 тл/т/с 1 1 128

33. A/BarnauV02/2009(H INI) Фрагменты НА и NA 04.12.2009 нся/в 2 1 64

34. A/Bamaul/03/2009(H1N1) Фрагменты НА и ЫА 04.12.2009 тл/т/с 2 1 128

35. A/Chelyabinsk/07/2009(H INI) Фрагменты НА и NA 11.12.2009 тля/с 2 1 64

36. A/Chelyabinsk/08/2009(H INI) Фрагменты НА и NA 11.12.2009 тл/т/с 2 1 64

37. A/Kyzyl/03/2009(H INI) Фрагменты НА и NA 28.12.2009 нся/в 2 1 128

38. A/KMAO/03/2009(H INI) Фрагменты НА и NA 20.01.2010 нся/в 2 1 128

39. A/KMAO/04/2009(H INI) Фрагменты НА и NA 20.01.2010 нся/в 2 1 64

40. A/Ekaterinburg/09/2009(HlN I) Фрагменты НА и NA 21.01.1200 тля/с 2 1 128

41. А/Ekaterinburg/10/2009(H INI) Фрагменты НА и NA 21.01.2010 тля/с 2 1 128

42. AJOmskJM/2010(4INI) * * Фрагменты НА и NA 17.02.2010 нся/в 2 1 128

43. A/Chelyabinsk/09/2009(H INI) Фрагменты НА и NA 25 03.2010 нся/в 2 1 64

44. A/Novosibirsk/01/2011 (H IN 1) НА, NA 23.03.2011 нся/в — —

Примечание: Информация, обозначенная прописными буквами: НС - носоглоточный смыв, ТЛ - ткань легкого, Л - легкое течение заболевания, Т - тяжелое течение заболевания, В - выздоровление, С - смерть; далее цифрами - количество пассажей/титр в РГА). * Полужирным курсивом обозначены штаммы, использованные для анализа антигенных свойств вируса.

** Штаммы А/НаЬагоувк/01/2009(Н 1N1), А/ШзЬкек/02/2009(НШ1) и А/Ош5к/04/2010(НШ1) прошли по 2 пассажа на культуре клеток МОСК.

Изучение антигенных свойств штаммов пандемического вируса гриппа А (НШ1) рс1т09 методом РТГА

Антигенные свойства штаммов оценивали перекрестным определением титра антигемагглютинирующих антител методом РТГА в сыворотках крови мышей, инфицированных штаммами, выделенными в разные сроки в период пандемии. Титры антител в РТГА (таблица 3), полученные в результате перекрестных реакций между мышиными сыворотками к выделенным штаммам и самими штаммами, также как и со штаммом А/СаНГогта/04/2009(НШ1), не имели достоверно различающихся между собой значений. В то же время значения титров антигемагглютинирующих антител в РТГА, проведенной с использованием сывороток к штаммам пандемического вируса гриппа А(НШ1)рс1т09 и штаммом «сезонного» вируса гриппа, Достоверно отличались от значений титров антител в этих же сыворотках в РТГА, проведенной со штаммами пандемического вируса гриппа А (НШ1) рс1т09. Аналогичные данные были получены при постановке РТГА с сывороткой к «сезонному» вирусу гриппа и со штаммами пандемического вируса гриппа: значения титров антигемагглютинирующих антител в сыворотке к «сезонному» вирусу гриппа А(НШ1) в РТГА с выделенными штаммами пандемического вируса гриппа достоверно отличались и были меньше того же значения в РТГА, проведенной со штаммом А/Моуоз1Ыгек/01/2009(НШ1) «сезонного» вируса гриппа.

Таким образом, полученный результат свидетельствует о близком антигеном родстве изучаемых штаммов между собой, их близком антигеном родстве со штаммом А/СаНАэгша/04/ 2009(НШ1) и в то же время об их отличии от циркулировавшего ранее вируса «сезонного» гриппа А(НШ1). Изменений антигенных свойств штаммов, выделенных в разные сроки после начала пандемии, не зарегистрировано.

Таблица 3

Антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа А (НШ1) рс!т09

Специфичность сыворотки Время выделения штамма Титр антител в РТГА (Хер геом (I у используемый в РТГА антиген

A/Califomia/0 4/ 2009 A/Moscow/225/ 2009(H1N1) A/Kurgan/01/2 009(H1N1) A/Tomsk/07/2 009(H1N1) A/Omsk/04/ 2010(H1N1) A/Novosibirsk/ 01/2009(H1N1)*

Сыворотка против штамма A/California/04/2009 апрель 2009 w^iSrimM (324.4-X45.67i 348,2 (236,97-511,7) 303,14 (189,2—185,7) 348,2 (236,97-511,7) 527,8 (329,4-845,67) 32,99' (20,59-52,85)

Сыворотка против штамма A/Moscow/225/2009(H INI) май 2009 348,2 (236,97-511,7) 303,14 (189,2-485,7) 303,14 (189,2-485,7) 303,14 (189,2-485,7) 43,532 (29,62-63,96)

Сыворотка против штамма A/Kurgan/01 /2009(Н 1N1) август 2009 263,9 (164,7-422,8) 303,14 (189,2-485,7) 348,2 303,14 (189,2-485,7) 303,14 (189,2-485,7) 37,89* (23,65-60,71)

Сыворотка против штамма A/Tomslt/07/2009(H1N1) ноябрь 2009 263,9 (164,7-422,87) 263,9 (164,7-122,87) 303,14 (189,2-485,7) Ж:*34 8,2fliS (236,97-511,7) 263,9 (164,7—422,87) 37,894 (23,65-60,71)

Сыворотка против штамма A/C)msk/04/2010(HlNl) февраль 2010 459,47 (312,69-675,19) 348,2 (236,97-511,7) 348,2 (236,97-511,7) 303,14 (189,2-485,7) ¡(2|Ö:97-5l|,7)l 32,99* (20,59-52,85)

Сыворотка против штамма A/Novosibirsk/01/2009(H INI)* февраль 2009 37,89 (23,65-60,71) 43,53 (29,62-63,96) 37,89 (23,65-60,71) 37,89 (23,65-60,71) 37,89 (23,65-60,71) 151,57* MPSÄWa

*Штамм «сезонного» вируса гриппа. 1 Достоверное отличие от A/Califomia/04/2009 при р = 0,0001. Достоверное отличие от A/Moscow/225/2009(HlNl) при р = 0,0001. ' Достоверное отличие от A/Kurgaji/01/2009(H1N1) при р = 0,0001.

4 Достоверное отличие от A/Tomsk/07/2009(H1N1) при р = 0,0001.

5 Достоверное отличие от A/Orask/04/2010(Н 1 N1) при р = 0,0001.

6 Достоверное отличие от других антигенов при р = 0,001.

Филогенетический анализ генов НА и NA штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09

Филогенетический анализ гена НА (рисунок 1) показал, что исследуемые штаммы и изолят A/Novosibirsk/01/2011(H1N1), выделенный в постпандемический период, не связаны с циркулировавшими ранее «сезонными» вариантами вируса гриппа A(H1N1), а также с вирусом «испанского» гриппа, которые по гену НА имеют большую степень родства с евразийскими изолятами вируса свиного гриппа A(H1N2) (субклада 2.3). Идентичность генов НА исследуемых штаммов с аналогичным геном штамма A/California/04/2009(H1N1) и между собой составляет 99%.

Сравнение нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов в субкладе 1.1с последовательностями штаммов A/California/04/2009(H1N1) и A/swine/4/Mexico/2009(HlNl) свидетельствует об их идентичности и о том, что они имеют общее происхождение с вариантами вируса гриппа субклады 1.2, которая представлена нуклеотидными последовательностями гена НА североамериканских изолятов свиного гриппа (классический вирус свиного гриппа A (H1N1) и вирус гриппа A (H1N2)).

Филогенетический анализ гена NA (рисунок 2) показал, что исследуемые штаммы, как и штамм A/California/04/2009(H1N1), локализуются в субкладе 1.1 вместе со штаммами вируса свиного гриппа A(H1N1), выделенными в 2009 году в разных странах. Идентичность между нуклеотидными последовательностями в этой субкладе составляет больше 99%. Родственную ей субкладу 1.2 составляют евразийские изоляты вируса свиного гриппа A(H1N1).

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, MP и NS штаммов, выделенных в период пандемии 2009 года, с аналогичными последовательностями референс-штамма A/California/04/2009(H1N1) показал их более чем 99% идентичность.

A/Habarovsfc/01/2009tH1 N1)

»/Qm$K/01/2Q09(H1N1)

ft/Efcater1nbura/01/2009(H1N1)

ft/Chita/01/2009<H1NH

A/Oren bura/01 /2009Ж1 N11

АЛоггчкютътн 1 N n

A/Toms fc/07/2009(H1 N11

A/lrKutSk/02/2009(H1N1) A/Novoorod/01/2009iH1NH

A/AlmaWQ1/2009iH1NH A/AbaKan/02/2009(H1N1>

-A/Salgkhard/01/2009(H1N1)

A/Kuman/Q1/200S(H1N1)

A/MQ8Cow/226/2009fH1 N11

L A/Califomia/04/2009(H1N1) L A/swin e/4/Mexi co/2009{ H1 N1) —A/Novoslblrsfc/01/2011fH1NH -A/swine /Mi sso и ri/46519-S/2009(H1 N1)

1.1

- A/Swine/I llinois/100034/2001 (H1 N2) - A/S wwe/Obio/891/2001 (H1N 2) - A/South Carolina/1/1918(H1N1) Ш 2 1

r A/New Yorfu05/200e(H 1N t) i- A/Georgia/06/2008(H1 N1) - A/New York/03/2008(H1 N1) . A/FloridaЯЙ/2008(H1 N1) L- A/Colorado/01/2008(H1Nl)

E-A/Novosibirsk/7/2009(H1N1) A/Novo sibi rs k/4/2009( H1 N1) • A/No vosrbirsk/3/2009(H 1N1) A/Moseow/13/1998(H1 N1) A/New York/643/1995(H1 N1)

1.2

100

I-p

H r~A

«4

gjl p A/New YorW607/1995(H1N1) 9вТ-A/Shengzhertf227/1995(H1N1) 100 f—A/New Zealand/7/1983(H1N1) I L A/M e mphis/4/1983( H1 N1) 96 Ip A/Tentsi rv78/1977(H) N1) эГТ— A/USSR/90/1977(H1 N1)

-A/swine/E n g I and/002295/2002( H1 N2)

I-A/swine/Cotes dArmor/1190/2002(H1 N2)France

2.2

- A/swine/Bakum/1832/2000(H1 N2)Germany

-A/swtne/Engl a nd/1131/2004{H1 N1)

-A/swine/Belgorod/2R/2009(H1N1)

- A/swtne/Cotes dArmor/1624/2002(H1 N1 )Franee

Рисунок 1. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей гена НА. Исследуемые штаммы выделены подчеркиванием. Топология дерева восстановлена при помощи метода присоединения соседей (Neighbor-Joining method) (Saitou, Nei, 1987). Матрица генетических расстояний рассчитана с применением метода Maximum Composite Likelihood (Tamura et al., 2004). Указаны индексы статистической поддержки узлов, бутстреп-тест рассчитан для 1000 реплик (Felsenstein, 1985). Филогенетический анализ проведен в программе MEGA5 (Tamura et al., 2011)

002

Рисунок 2. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей гена NA. Исследуемые штаммы выделены подчеркиванием. Топология дерева восстановлена при помощи метода присоединения соседей (Neighbor-Joining method) (Saitou, Nei, 1987). Матрица генетических расстояний рассчитана с применением метода Maximum Composite Likelihood (Tamura et al., 2004). Указаны индексы статистической поддержки узлов, бутстреп-тест рассчитан для 1000 реплик (Felsenstein, 1985). Филогенетический анализ проведен в программе MEGA5 (Tamura et al., 2011)

Изучение генетической изменчивости штаммов пандемического вируса гриппа А (НШ1) рс1т09

В таблице 4 представлены результаты вычисления частоты нуклеотидных замен в генах НА и КА исследуемых штаммов в сравнении с аналогичными генами штамма АУСаНГогта/04/2009(Н 1Ш).

Таблица 4

Частота нуклеотидных замен в генах НА и ЫА изолятов пандемического вируса

гриппа А (НШ1) рс1т09 в сравнении с аналогичными последовательностями _штамма А/Са»й>гша/04/2009(Нт1) (Г.1966082, Р.1966084)_

Изоляты вируса гриппа Частота нуклеотидных замен'ген вируса1

HA NA

всего синоним. несиноним. всего синоним. несиноним.

A/Moscow/226/2009(H INI) 2,35 0,59 1,76 - - -

A/Habarovsk/01/2009(Н INI) 3,53 1,18 2,35 2,84 2,13 0,71

A/Tomsk/01/2009(HlNl) 4,12 1,18 2,94 1,42 1,42 -

A/Almati/01/2009(H 1N1) 5,29 2,35 2,94 2,13 1,42 0,71

A/Ekaterinburg/01/2009(H1 N1) 4,12 1,18 2,94 3,55 2,13 1,42

A/Orenburg/01/2009(H INI) 4,12 1,77 2,35 3,55 2,13 1,42

A/Irkutsk/02/2009(H INI) 4,70 1,18 3,53 2,84 1,42 1,42

A/Novgorod/01/2009(H IN 1) 4,70 1,18 3,53 4,26 2,13 2,13

A/K.urgan/01/2009(H1N 1) 4,70 1,76 2,94 3,55 1,42 2,13

A/Omsk/01/20Q9(H INI) 4,12 1,18 2,94 2,84 1,42 1,42

A/Chita/01/2009(H1N1) 4,12 1,18 2,94 2,84 2,13 0,71

A/Abakan/02/2009(HlNl) 6,47 2,35 4,12 5,67 2,84 2,84

A/Tomsk/07/2009(H INI) 6,47 1,76 4,70 4,26 2,13 2,13

A/Tomsk/08/2009(H INI) 5,29 1,76 3,53 3,55 1,42 2,13

A/Salekhard/01/2009(HlN 1) 7,64 2,35 5,29 4,96 2,13 2,84

A/Novosibirsk/01/2011 (H IN 1) 11,76 5,88 5,88 6,38 2,13 4,25

Частота нуклеотидных замен рассчитана на 1000 нуклеотидов.

У каждого из исследуемых штаммов и изолята А/МоуозШгек/01/2011(НШ1) частота нуклеотидных замен в гене НА была выше частоты нуклеотидных замен в гене ЫА. При этом частота возникновения несинонимичных нуклеотидных замен в гене НА в 1,25-2,99 раза выше, чем частота синонимичных замен, что свидетельствует о доминировании положительного отбора в данном участке генома. Для гена ЫА такая закономерность не прослеживается: для этого гена частота появления синонимичных нуклеотидных замен либо выше частоты несинонимичных, либо эти значения равны. Исключение составили штаммы

A/Kurgan/01/2009(H1N1), A/Tomsk/08/2009(H1N1), A/Salekhard/01/2009(H1N1) и A/Novosibirsk/01/2011(H1N1).

Максимальная частота нуклеотидных замен у исследованных штаммов в генах белков полимеразного комплекса РВ2, РВ1 и РА, а также в гене NP не превышает 3,3 замены на 1000 нуклеотидов. Для гена NS этот показатель достигает 4 нуклеотидных замен (длина гена 838 и.о.). В сегменте MP частота нуклеотидных замен может достигать 4-8 замен (длина гена 982 и.о.), однако в большинстве своем эти замены являются синонимичными. Анализ аминокислотных последовательностей вирусных белков

выделенных штаммов Сравнение аминокислотных последовательностей НА и NA исследуемых штаммов с аналогичными последовательностями штамма A/California/04/2009(H1N1) выявило замещения аминокислотных остатков. Как показал анализ аминокислотных замещений в НА исследуемых штаммов (таблица 5), большинство их расположено в субъединице НА1 и локализуется в антигенных эпитопах А, В, D и Е (Deem, Pan, 2009).

В рецептор-связывающем домене НА у штаммов A/Novgorod/01/2009(Н IN 1) и A/Almati/01/2009(H1N1), относящихся к случаям завоза инфекции из стран Западной Европы летом 2009 года, обнаружена мутация D222E. У штаммов A/Abakan/02/2009(HlNl), A/Tomsk/07/2009(H1N1), A/Tomsk/08/2009(H1N1), A/Salekhard/01/2009(H1N1) в этой же позиции выявлена мутация D222G, которую ряд исследователей связывает с тяжелым течением заболевания (Kilander et al., 2010; Potdar et al., 2010). Как было показано в работе Chutinimitkul S. и соавт. на мутантах пандемического вируса гриппа A (H1N1) с замещениями D222E и D222G в НА, данные мутации не приводят к повышению вирулентности вируса у мышей и хорьков, не влияют на антигенные свойства НА в РТГА с антисыворотками хорька и кролика (Chutinimitkul et al., 2010). Мутация D222G приводит к появлению двойной специфичности НА — к а-(2-6)- и к а-(2-3)- сиаловым рецепторам, что также подтверждалось сохранением у

данных мутантов способности передаваться аэрозольно у хорьков и морских свинок (Chutinimitkul et al., 2010).

Все четыре штамма, содержащие замену D222G, были выделены от пациентов, заболевание у которых закончилось летально. Однако все эти пациенты входили в группу риска, имея отягощенный анамнез (сопутствующая патология, пожилой возраст или беременность). Два штамма с мутацией D222E выделены от пациентов с легким течением заболевания.

Наибольшее количество аминокислотных замещений в НА было выявлено у штамма A/Salekhard/01/2009(H1N1). Этот штамм отличался по вирусологическим характеристикам. Он был выделен уже после первого пассажа в 9-суточных РКЭ с высокой гемагглютинирующей активностью (1:256 ГАЕ/мл), остальные используемые в работе изоляты прошли 1-\ пассажа до достижения активности 1:64-1:128 ГАЕ/мл. В аминокислотной последовательности НА штамма A/Salekhard/01/2009(HlNl) обнаружена мутация G155E, которая, согласно литературным данным, приводит к увеличению темпа репродукции вируса при культивировании в РКЭ, но в то же время снижает антигенную специфичность вируса, что делает такие мутанты непригодными для использования в качестве вакцинных штаммов (Chenetal., 2010).

В НА у всех исследованных штаммов отсутствует сайт расщепления, состоящий из нескольких основных аминокислотных остатков, отвечающий за полиорганный тропизм у высокопатогенных вирусов гриппа птиц субтипов Н5 и Н7.

Замещения аминокислотных остатков в NA исследуемых штаммов в большинстве своем расположены в субъединице, формирующей головку NA (91^470 а.о.). У двух штаммов замещения расположены в гипервариабельном регионе, формирующем стебель NA: N44S —у A/Novosibirsk/01/2011(HlNl) hN44D - у A/Salekhard/01/2009(H1N1).

Таблица 5

Аминокислотные замещения в НА штаммов пандемического вируса гриппа А (НШ1) рс!т09 в сравнении с аналогичной последовательностью штамма А/СаНГогша/04/2009(НШ1)

Позиция аминокислотного остатка

Название штамма(изолята) Сигнальный пептид НА1 НА2

3 83 86 128 143 155 162 185 195 197 203 211 222 223 234 260 321 374 441 451

А/СаИГогша/04/2009(Н1М) А Р Б в в в в Я А Т в к 0 О V N I Е N 8

А/МО5сож/226/2009(Н 1N1) Б А V

А/НаЬаптк/О1/2009(Н 1Ы1) Б Р А Т

А/Тсншк/О1/2009(Н 1N1) Б А Т О V

А/А1таП/01/2009(НШ1) Б А т Е V

А/Ека1еппЬигв/01/2009(Н IN1) А т Я V

А/ОгепЬиг^О 1/2009(Н Ш1) А т V

А/1гки1зк/02/2009(Н 1N1) Б А т Я I V

A/Novgoгod/01/2009(Н 1N1) в А т Е я V

А/Кигвап/01/2009(Н 1N1) в А т Е V

А/Отйк/01/2009(Н 1Ы1) 8 А т я V

А/СЬНа/01/2009(Н 1Ы1) Б Р А т V

А/АЬакап/02/2009(Н 1N1) А т в

А/Топкк/07/2009(Н1т) Б Р в А т О V

А/То1шк/08/2009(НШ1) Р А т в V

А/8а1екЬагс1/01/2009(НШ1) Б N Е N А т О V Б

А/№жшЫкк/01/2011 (Н1Ы1) Т Б в Т А т 11 V К. N

Все исследованные штаммы не содержат аминокислотных замещений в NA, приводящих к лекарственной устойчивости к ингибиторам NA (озельтамивиру и занамивиру). Таким образом, можно предположить, что все они обладают чувствительностью к препаратам из этой группы противовирусных лекарственных средств.

В других белках у исследованных штаммов в сравнении со штаммом A/California/04/2009(H1N1) выявлено несколько аминокислотных замещений. У штаммов A/Tomsk/01/2009(HlNl), A/Chita/01/2009(H1N1) и A/Ekaterinburg/01/2009(Н IN 1 ) в белках РВ2 и РВ1 были обнаружены сцепленные мутации: в РВ1 - K353R и Т566А, в РВ2 - Т471М, которые, по литературным данным, могут увеличивать скорость репликации вируса в культуре клеток MDCK и повышать вирулентность и патогенность вируса при заражении мышей (Xu et al., 2011).

В белке NP штамма A/Salekhard/01/2009(H1N1) обнаружено замещение VI861, расположенное на поверхности РНК-связывающей борозды молекулы NP. Согласно данным литературы эта мутация является значимой и может возникать при адаптации вируса гриппа человека к легким мыши (Ping et al., 2011).

Другие обнаруженные замещения встречаются с разной частотой у изолятов, выделенных в других странах. При этом в литературе нет данных, которые бы подтверждали влияние этих мутаций на патогенность и вирулентность вируса гриппа.

У всех исследованных штаммов синтез полноразмерного белка PB1-F2 невозможен, т.к. в альтернативной +1 открытой рамке считывания сегмента РВ1, кодирующей белок PB1-F2, имеются три стоп-кодона: 12 (ТАА), 58 (TAG) и 88 (TAG).

Все исследуемые штаммы, как и штамм A/California/04/2009(H1N1), в белке М2 имеют мутацию S31N, которая приводит к устойчивости к противовирусным препаратам адамантанового ряда: амантадину и римантадину (Abed et al., 2005).

Изучение генетической гетерогенности выделенных штаммов

Проанализирован характер генетической неоднородности каждого из исследованных штаммов по генам НА и ЫА, где определялись ОНП -полиморфные сайты, в которых на электрофореграммах регистрировались минорные нуклеиновые основания. Самым генетически неоднородным штаммом из 11 исследуемых по этим двум генам оказался А/Тотэк/О1 /2009(Н 1N1), в гене НА которого частота ОНП составила 2,94 на 1000 нуклеотидов, а в гене N А - 2,12 на 1000 нуклеотидов.

Часть минорных нуклеотидных замен являются несинонимичными и приводят к аминокислотным замещениям. В результате ОНП в молекуле ^'А появляются замещения: 1149Р у штамма А/№Ькск/02/2009(НIN1), И49Ь - у А/1гкШ5к/02/2009(Н1Ы1) и Б259Е - у А/Ека1егтЬиг&'01/2009(Н 1N1).

В рецептор-связывающем домене НА у штаммов А/А1шаИ/01/2009(НШ1) и А/Тош5к/01/2009(НШ1) полиморфизм на уровне аминокислотной последовательности обнаружен в 222-й позиции (таблица 6). При реализации минорных нуклеотидных замен некоторые из аминокислотных замещений в молекуле НА2 возникают в позициях, мутации в которых потенциально могут влиять на стабильность разных конформаций белка (1Л е! а1., 2008). Как следует из литературных данных, если замещения в позициях 45, 103 и 114 в НА2 происходят со сменой заряда, то они оказывают влияние на конформацию белка. Замещения 145У у штамма А/А1таП/01/2009(Н1М1) и 145Р у штамма А/Ки^ап/01/2009(Н 1N1) являются компенсаторными. Аминокислотное замещение N1140 в НА2 у штаммов А/8а1еЫ1агс)/01/2009(НШ1) и А/Тогшк/07/2009(111N1) происходит со сменой заряда аминокислоты, а, следовательно, может оказывать влияние на рН перехода между конформациями белка. Замещение Е103К у штаммов А/СЫ1а/01/2009(НШ1) и А/Тотзк/07/2009(НШ1), также происходящее со сменой заряда, может приводить к некоторой дестабилизации структуры белка.

Таблица 6

ОНП в гене НА, выявленные у штаммов пандемического вируса гриппа А (HIN 1) pdm09, и замещения аминокислот, возникающие при реализации минорных нуклеотидных замен

Участки гена НА Сигнальный пептид HAI НА2

Позиция нуклеотида 28 384 687 716 717 774 1119 1165 1339 1372 1550 1554 1559 1665

A/Califomia/04/2009(H INI) (ЕГ966082) T T G А ТА GAG А Т Т ТС

А/Almati/O 1/2009(Н INI) Т/с A/g А АЛ 222E/G D222E A/g 45I/V

A/Bishkek/02/2009(H INI) Т/с

A/Chita/01/2009(H1N1) G/a C/t ЮЗЕ/К

A/Ekaterinburg/01/2009(HlN 1) Т/с 10 V/H АЛ Т/а Т/а T/g 173I/K 174D/E 176V/G

A/Irkutsk/02/2009(H1N1)

A/Kurgan/01/2009(H INI) А/1 45I/F

A/Omsk/O1/2009(H INI) Т/с 1 OY/II

A/Salekhard/01/2009(HlNl) G/c G D222G G N114D

A/Tomsk/01/2009(H INI) Т/а 222D/E G/a Т/а Т/а T/g 1731/К 174D/E 176V/G

A/Tomsk/07/2009(H1N1) G D222G А G/a A/g V ЮЗЕ/К 114N/D

A/Orenburg/01/2009(HlNl) А

Примечание: ОНП обозначены двумя буквами: прописной буквой обозначено мажорное нуклеиновое основание, строчной буквой — минорное нуклеиновое основание. Аминокислотные замещения, возникающие при реализации ОНП, обозначены жирным шрифтом: цифрой обозначена позиция аминокислотного остатка, буквой до косой черты обозначен мажорный аминокислотный остаток, буквой после косой черты — минорный аминокислотный остаток.

Большинство аминокислотных остатков, которые появляются у исследуемых штаммов в НА и NA в результате ОНП, совпадают в тех же позициях с аминокислотными остатками в НА и NA других изолятов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09, штаммов вируса гриппа A (H1N1), выделенных в разные годы от свиней, и вируса гриппа A (H6N1), выделенного от птиц (таблица 7). Совпадения аминокислотных замещений, возникающих при реализации ОНП у исследуемых штаммов, с аминокислотными остатками в тех же позициях у различных штаммов вируса гриппа А могут являться результатом конвергентной эволюции нуклеотидных последовательностей вирусных геномов (Cuevasa et al., 2002; Remold et al., 2008). В то же время такие совпадения с другими изолятами пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 свидетельствуют о способности этих мутаций в определенных условиях закрепляться в вирусной популяции.

Таблица 7

Аминокислотные замещения, возникающие в НА и NA у исследованных штаммов при реализации ОНП, и известные штаммы вируса гриппа А, имеющие эти замещения (по данным ресурса NCBI / The Influenza Virus Resource http://www.ncbi.nlrn.nih.gov/genomes/FLU/).

Вирусный белок Аминокислотные замещения, возникающие при реализации ОНП, в исследованных штаммах Штаммы вируса гриппа А, содержащие аминокислотные замещения

NA I149F A/chickeiVTaiwan/0824/97(H6N 1 ), A/swine/England/WVL 14/1996(Н INI), A/swine/Iowa/46519-1/2007(H1N1), A/Ohio/04/2006(H1N1)

I149L Нет

К259Е A/Ekaterinburg'01 /2009(Н INI) Influenza A virus H3N2

Сигнальный пептид Y10H A/Texas/30/2009(H INI), A/swine/Thailand/CU-RP3/2010(H1N1 ), A/South Carolina/ AF2554/2009(H1N1), A/swine/Korea/SC JO 1 /2009(Н 1 N1 ) и другие изоляты из Южной Кореи

НА1- D222G A/Abakan/02/2009(H1N1), A/Tomsk/07/2009(H 1 N1 ), ATomsk/08/2009(HlNl), A/Salekhard/01/2009(H 1N1 ), A/Rio de Janeiro/7455/2009(HINI) и многие другие изоляты пандемического вируса гриппаА (H1N1) pdm09

НА D222E A/Thailand/CU-C1070/2010(HlNl), A/Almati/01/2009(Н INI), A/Novgorod/01 /2009(Н IN 1 )

I45V A/swine/Costa Rica/ООО 125-20/2010(HlNl), A/swine/Costa Rica/ООО 125-16/2010(H 1N1 ) и другие изоляты из Коста-Рики

I45F A/HuZhou/01/2010(H1N1)

Е103К A/Shanghai/60T/2009(H INI)

НА2 N114D A/Salekhard/01/2009(HlNl)

I173K Нет

D174E A/Australia/35/2009(HlNl), A/swine/North CaroIina/9647/2003(HlNl)

V176G Нет

выводы

1. Установлено антигенное родство между штаммами вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенными в период с мая 2009 года по февраль 2010 года, и штаммом A/California/04/2009(H1N1), а также их отличие по антигенным свойствам от «сезонного» вируса гриппа A(H1N1), циркулировавшего в предпандемический период.

2. Анализ нуклеотидных последовательностей полноразмерных геномов 10 штаммов вируса гриппа А (H1N1) pdm09, циркулировавшего на территории РФ в 2009 году, показал, что по каждому из 8 сегментов генома они идентичны штамму A/California/04/2009(H1N1) более чем на 99%.

3. В геномах исследованных штаммов вируса гриппа A(HlNl)pdm09 частота нуклеотидных замен в гене НА выше частоты нуклеотидных замен в гене NA. При этом частота возникновения несинонимичных нуклеотидных замен в гене НА выше частоты синонимичных, что свидетельствует о доминировании положительного отбора в данном участке генома.

4. В результате анализа аминокислотных последовательностей вирусных белков установлено:

а). У всех исследованных штаммов отсутствуют в NA мутации резистентности к препаратам из группы ингибиторов NA и в белке М2 имеется замещение S31N, приводящее к резистентности к препаратам адамантанового ряда.

б). Большинство аминокислотных замещений в НА исследованных штаммов, по сравнению с НА штамма A/California/04/2009(H1N1), расположено в субъединице НА1, в антигенных эпитопах А, В, D и Е.

в). У штаммов: A/Abakan/02/2009(HlNl), A/Tomsk/07/2009(H1N1), A/Tomsk/08/2009(H INI), A/Salekhard/01/2009(H1N1) в рецептор-связывающем домене НА выявлено аминокислотное замещение D222G,

которое приводит к появлению двойной специфичности НА к а-(2-6)- и к а-(2-3)-сиаловым рецепторам.

5. У всех исследованных штаммов в альтернативной +1 открытой рамке считывания сегмента РВ1, кодирующей белок PB1-F2, установлено наличие трех стоп-кодонов, вследствие чего у них невозможен синтез полноразмерного белка PB1-F2, являющегося одним из факторов патогенности вируса гриппа А.

6. Обнаружена генетическая неоднородность внутри каждого исследуемого штамма. Анализ однонуклеотидных замен в полиморфных сайтах генов НА и NA показал, что часть из них приводит к аминокислотным замещениям, влияющим на конформацию белков. В рецептор-связывающем домене НА обнаружен полиморфизм у штамма A/Almati/01/2009(H1N1) — 222E/G и у штамма A/Tomsk/01/2009(HlNl) — 222D/E.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Онищенко Г .Г., Агафонов А.П., Демина O.K., Сергеев A.A., Терновой В.А., Шишкина JI.H., Бормотав Н.И., Кабанов A.C., Скарнович М.О., Шиков А.Н., Семенцова А.О., Шестопалов A.M., Шпынов С.Н., Ставский Е.А., Дроздов И.Г. Свойства штаммов пандемического вируса гриппа, выделенных на территории России // Проблемы особо опасных инфекций. 2009. — № 101. - С. 5-9.

2. Агафонов А.П., Шестопалов A.M., Шиков А.Н.. Демина O.K., Дурыманов А.Г., Сергеев A.A., Агафонова П.А., Винокурова A.B., Шаршов К.А., Берилло С.А., Скарнович М.О., Семенцова А.О., Терновой В.А., Малкова Е.М., Ставский Е.А., Дроздов И.Г. Изучение свойств пандемического вируса гриппа A (H1N1), циркулировавшего на территории РФ в 2009-2010 гг. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. -№ 4. - С. 24-27.

3. Шиков А.Н., Семенцова А.О., Демина O.K., Сергеев A.A., Берилло С.А., Сергеева Е.И., Винокурова A.B., Ишенина A.B., Терновой В.А., Агафонов А.П., Дроздов И.Г. Генетическая изменчивость изолятов вируса гриппа A H1N1, выделенных на территории России в 2009 году // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. - № 4. - С. 23-29.

4. Шиков А.Н., Сергеева Е.И., Демина O.K., Терновой В.А., РябининВ.В., Костина Е.В., Малкова Е.М., Синяков А.Н.,

Агафонов А.П. Разработка ДНК-биочипа для выявления субтипов вируса гриппа А // Проблемы особо опасных инфекций. 2012. -№2(112).-С. 89-94.

Тезисы конференций:

1. Шиков А.Н.. Терновой В.А., Агафонов А.П., Демина O.K., Демина A.B., Семенцова А.О., Берилло С.А., Сергеева Е.И., Ишенина A.B., Винокурова А.В, Сергеев А.Н. Изучение генетического полиморфизма пандемического вируса гриппа A H1N1 // Материалы 2-й международной конференции «Астана Биотех-2011»: Сборник научных трудов. - Астана, 2011. - С. 84.

2. Шиков А.Н.. Терновой В.А., Демина O.K., Семенцова А.О., Берилло С.А., Сергеева Е.И., Пьянков О.В., Михеев В.Н., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. Анализ изменчивости генов НА и NA изолятов пандемического вируса гриппа A H1N1 // Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия человека: Сборник научных трудов. - Новосибирск, 2012.-С. 408-414.

3. Сергеева Е.И., Шиков А.Н., Демина O.K., Демина A.B., Корнеев Д.В., Пьянков О.В., Терновой В.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. Разработка набора для детекции вирусов, вызывающих острые респираторные заболевания у людей, на основе мультиплексного варианта ОТ-ПЦР в режиме реального времени // Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия человека: Сборник научных трудов. - Новосибирск, 2012. - С. 365-371.

Патент:

Патент RU 2 457 242 С1. Штамм A/Salekhard/01/2009(HlNl)v вируса гриппа для изучения лечебно-профилактической эффективности препаратов против пандемического варианта вируса гриппа А. Авторы: Агафонов А.П., Терновой В.А., Шишкина JI.H., Булычев Л.Е., Сергеев Ар.А., Скарнович М.О., Демина О. К., Кабанов A.C., Шиков А.Н., Семенцова А.О., Сергеев A.A. Опубликован в БИ №21 от 27.07.2012. (Заявка №2011124677/10, 16.06.2011).

Методические рекомендации:

Методические рекомендации «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высокопатогенными штаммами вируса гриппа A (H1N1), у людей», Москва, 2009.

Автор благодарен коллегам, участвовавшим в проведении данных исследований. Особую благодарность автор выражает к.б.н. Владимиру Александровичу Терновому и своему научному руководителю д.б.н. Александру Петровичу Агафонову.

Подписано в печать 28.10.2013 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 3 Тираж 100 экз. Заказ № 183

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Шиков, Андрей Николаевич, Кольцово

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и

благополучия человека

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ «ВЕКТОР»

0420*1 365529

Шиков Андрей Николаевич

Генетическая изменчивость и антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа А (НШ1), циркулировавшего в 2009-2010 годах на территории Российской Федерации

03.02.02 - вирусология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: д.б.н. Агафонов А.П.

Кольцово - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ..........................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................13

1.1. Классификация вирусов гриппа................................................................13

1.2. Морфология вируса гриппа А...................................................................14

1.3. Сегменты генома и кодируемые ими белки.............................................16

1.4. Репликативный цикл вируса гриппа.........................................................25

1.5. Генетическая и антигенная изменчивость вируса гриппа А..................27

1.6. Молекулярные детерминанты патогенности, рецепторной специфичности и лекарственной резистентности вируса гриппа А.............31

1.7. Особенности пандемии, вызванной вирусом гриппа А (НШ1)рс1т09.... 38 Заключение по обзору литературы..................................................................42

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................45

2.1. Материалы...................................................................................................45

2.1.1. Реактивы и наборы реагентов, использованные в работе................45

2.1.2. Культуры клеток...................................................................................46

2.1.3. Развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ)........................................46

2.1.4. Оборудование........................................................................................46

2.1.5. Образцы для исследования и выделения вирусных штаммов.........46

2.2. Методы.........................................................................................................47

2.2.1. Выделение вируса из клинического и секционного материала.......47

2.2.2. Реакция гемагглютинации...................................................................48

2.2.3. Получение иммунных сывороток.......................................................49

2.2.4. Определение титра противовирусных антител в сыворотке крови инфицированных мышей в реакции торможения гемагглютинации........50

2.2.5. Выделение вирусной РНК из исследуемых образцов.......................51

2.2.6. Реакция обратной транскрипции.........................................................52

2.2.7. Полимеразная цепная реакция.............................................................52

2.2.8. Электрофоретический анализ и выделение из агарозного геля фрагментов ДНК.............................................................................................57

2.2.9. Секвенирование ДНК...........................................................................57

2.2.10. Анализ нуклеотидных последовательностей...................................58

2.2.11. Визуализация позиций аминокислотных остатков.........................59

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............................................60

3.1. Выделение штаммов пандемического вируса гриппа A (HlNl)pdm09... 60

3.2. Изучение антигенных свойств штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 методом РТГА..........................................................65

3.3. Филогенетический анализ генов НА и NA штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09........................................................................68

3.4. Изучение генетической изменчивости штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09....................................................................................75

3.5. Анализ аминокислотных последовательностей вирусных белков штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09..........................82

3.6. Изучение генетической гетерогенности выделенных штаммов............99

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................108

ВЫВОДЫ.............................................................................................................113

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ........................................115

Приложение......................................................................................................137

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

ВАЖ - вируссодержащая аллантоисная жидкость

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

вРНК - вирусная рибонуклеиновая кислота

ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФН - интерферон

кРНК - комплементарная рибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

н.о. - нуклеиновое основание

ОНП - однонуклеотидный полиморфизм

ОРДС - острый респираторный дистресс-синдром

ОТ - обратная транскрипция

ОТ-ПЦР - обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РТА - реакция гемагглютинации

РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

ЭИД50 - 50% эмбриональная инфицирующая доза

CDC - Center for Disease Control and Prevention (Центр по контролю и предотвращению заболеваний)

CPSF4 - cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 4 (фактор специфичности связывания и полиаденилирования, субъединица 4)

ddNTP - дидезоксирибонуклеозидтрифосфат

DNA - deoxyribonucleic acid (дезоксирибонуклеиновая кислота)

dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат

НА - гемагглютинин

Ml - матриксный белок М2 - мембранный белок

MDCK - Madin Darby canine kidney (культура клеток эпителия почки собаки) NA - нейраминидаза

NCBI - National Center for Biotechnological Information (Национальный центр биотехнологической информации США)

NP - нуклеопротеин

NS - неструктурный белок

ORF - open reading frame (открытая рамка считывания)

РА - полимеразный белок РВ1 - полимеразный белок 1 РВ2 - полимеразный белок 2

PCR - polymerase chain reaction (полимеразная цепная реакция) RBS - receptor-binding site (рецептор-связывающий участок) RNP - ribonucleoprotein complex (рибонуклеопротеиновый комплекс) TNF - tumor necrosis factor (фактор некроза опухоли)

WHO - World Health Organization (Всемирная организация здравоохранения)

ВВЕДЕНИЕ

Грипп - острое респираторное вирусное заболевание, вызываемое РНК-содержащими вирусами, относящимися к родам Influenzavirus А, В и С семейства Ortomyxoviridae. Способность вируса гриппа типа А к эпидемическому и пандемическому распространению вызывает особую обеспокоенность международного сообщества.

В связи с этим Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) проводит ряд мероприятий, направленных на усиление контроля за распространением гриппа, которые включают в себя: глобальный мониторинг гриппа с целью оптимизации состава вакцин, работу по развитию и усилению национальных и региональных систем противодействия распространению заболевания, поддержку государств в их усилиях по разработке стратегий профилактики и борьбы с гриппом (ВОЗ, 2009 (б)).

Оправданность этих мероприятий подтверждена предыдущими пандемиями и ежегодными эпидемиями гриппа, которые приводят к 3-5 миллионам случаев заболевания с тяжелым течением и в среднем к 250 000-500 000 случаев смерти (ВОЗ, 2009 (б)).

О новом варианте вируса гриппа A (H1N1) стало известно в конце апреля 2009 года, когда в Мексике и США были зафиксированы первые случаи вызванного им заболевания (CDC, 2009 (Ь)). Обеспокоенность вызывало то, что появившийся вирус был реассортантным, как и возбудители трех предыдущих пандемий гриппа (Garten et al., 2009; WHO, 2009 (d)), и ранее никогда не циркулировал среди людей. Распространение заболевания быстро приобрело глобальные масштабы, в связи с чем ВОЗ 11 июня 2009 года объявила о начале пандемии гриппа (WHO, 2009 (i)). Пандемия охватила более 200 стран мира, новым вариантом вируса гриппа в некоторых регионах было инфицировано от 20 до 40% населения (WHO, 2010 (b)).

Однако к августу 2010 года эксперты на основании данных, поступающих из различных регионов мира, отметили явные признаки того, что характер распространения гриппа во всем мире стал сезонным, а заболеваемость

была ниже уровня, регистрируемого в 2009 году и начале 2010 года. Все это дало основание объявить об окончании пандемии и начале постпандемического периода (WHO, 2010 (b)).

Благодаря своевременному проведению мер по противодействию пандемии гриппа ее последствия оказались не столь катастрофичными: пандемия унесла жизни более 18 тыс. человек, но худший вариант ожидаемого сценария развития пандемии не подтвердился (WHO, 2009 (f)).

Новый вариант вируса гриппа A (H1N1), вызвавший пандемию 20092010 годов, генетически отличался от всех известных штаммов. Установлено, что изменчивость вируса гриппа типа А связана с молекулярными событиями, происходящими по двум механизмам. Один из них - шифт генов, представляющий собой обмен сегментами генома между различными субтипами вируса гриппа типа А, что приводит к появлению нового реассортантного варианта, к которому еще не существует коллективного иммунитета в популяции хозяев. Именно этот механизм изменчивости вируса и привел к возникновению пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 (Garten et al., 2009).

Другой механизм изменчивости - дрейф генов - заключается в возникновении точечных замен (транзиций и трансверсий) в нуклеотидной последовательности генов, кодирующих вирусные белки. Вирусы гриппа, как и другие РНК-содержащие вирусы, являются генетически нестабильными структурами. Процесс репликации вирусов, как правило, сопровождается возникновением ошибок в нуклеотидной последовательности генов, что приводит к гетерогенности гомологичных последовательностей вирусного генома внутри популяции вируса (Watanabe et al., 2011; Kuroda et al., 2010). Постоянно возникающие в их геноме точечные мутации могут приводить к возникновению не способных к полноценному репликативному циклу дефектных вирионов. Закрепляющиеся в популяции мутации чаще носят нейтральный характер (Кимура, 1985), т.е. не приводят к изменению общей структуры полипептидной цепи и функциональных или антигенных свойств белка (Murphy, Webster, 1996).

В ряде случаев результатом несинонимичных замен нуклеиновых кислот являются такие аминокислотные замещения, которые приводят к конформа-ционным и функциональным изменениям вирусных белков, в результате чего могут изменяться свойства самих вирусов, например, чувствительность к действию противовирусных препаратов или скорость репродукции вируса в организме хозяина. Возникновение точечных мутаций, или дрейф генов, лежит в основе механизма ускользания вируса от иммунной системы организма-хозяина, а также является механизмом адаптации при смене вида хозяина (Murphy, Webster, 1996; Ilyushina et al., 2010). Кроме того, есть данные о прямой зависимости адаптации к новым условиям и выживания вирусной популяции от степени ее гетерогенности и количества возникающих при репликации вирусной РНК ошибок (Vignuzzi et al., 2006).

Таким образом, молекулярно-генетические исследования, наряду с изучением биологических (антигенных) свойств вируса гриппа, являются важной составляющей мониторинга вирусной изменчивости, поскольку позволяют отслеживать появление мутаций, отвечающих за изменение антигенных, функциональных свойств вирусных белков, а также за чувствительность к противовирусным препаратам.

Цель и задачи исследования

Целью работы явилось изучение генетической изменчивости и биологических свойств штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09, циркулировавшего в 2009-2010 годах на территории Российской Федерации.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать клинические и секционные образцы на наличие генетического материала пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2. Выделить штаммы пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 из клинических и секционных образцов и изучить их антигенные свойства.

3. Определить нуклеотидные последовательности генов, кодирующих

вирусные белки выделенных штаммов пандемического вируса гриппа

A (H1N1) pdm09, провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей и анализ соответствующих им аминокислотных последовательностей.

Научная новизна и практическая значимость работы

Из клинического и секционного материала в период пандемии гриппа 2009-2010 годов выделены 40 штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, из которых 11 штаммов депонированы в Государственную коллекцию возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ГНЦ ВБ «Вектор».

Проведен детальный анализ аминокислотных последовательностей вирусных белков штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, выделенных в период пандемии 2009 года, на наличие у них детерминант па-тогенности и устойчивости к противовирусным препаратам.

Предложены и апробированы праймеры, послужившие основой для разработки средств диагностики в рамках выполнения Федеральной целевой

программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 годы)».

Положения, выносимые на защиту

1.В период пандемии гриппа 2009-2010 годов на территории Российской Федерации циркулировал вирус гриппа A (H1N1) филогенетически подобный штамму вируса гриппа A/California/04/2009(H1N1).

2. Антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09, циркулировавшего на территории РФ в период с апреля 2009 года по февраль 2010 года, не изменялись.

3. В гене НА штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 преобладает положительный отбор (частота несинонимичных нуклеотидных замен выше частоты синонимичных), а большинство аминокислотных замещений в НА регистрируются в антигенных эпитопах.

5. Популяции выделенных штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09 являются генетически гетерогенными.

Вклад автора

Первичная обработка образцов, выделение штаммов вируса гриппа из диагностического материала проводились совместно с научными сотрудниками отдела эпидемиологии ООВИ Сергеевым Ар.А. и Деминой O.K. Постановки реакции гемагглютинации и реакции торможения гемагглютинации осуществлялись совместно с научным сотрудником отдела эпидемиологии ООВИ Деминой O.K. Штаммы A/Habarovsk/01/2009(HlNl), A/Bishkek/02/2009(HlNl) и A/Omsk/04/2009(H1N1) были выделены сотрудниками отдела зоонозных инфекций и гриппа Дурымановым А.Г. и к.б.н. Шаршовым К.А. и предоставлены для молекулярно-генетических и вирусологических исследований.

Выделение РНК, реакция обратной транскрипции, полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени» проводились автором, сотрудниками отдела эпидемиологии ООВИ Берилло С.А. и Сергеевой Е.И., а также сотрудницей отдела молекулярной вирусологии флавиви-русов и вирусных гепатитов Семенцовой А.О.

Все остальные эксперименты, включая постановку ПЦР, очистку полученных продуктов ПЦР, секвенирование и очистку продуктов секвенирова-ния, депонирование полученных нуклеотидных последовательностей геномов вируса гриппа, их теоретический анализ, выполнены автором лично и в соавторстве с к.б.н. Терновым В.А.

Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов молекулярно-генетических исследований оказывали к.б.н. Терновой В.А. и к.б.н. Бакулина А.Ю.

Общее руководство работой осуществлялось Агафоновым А.П.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены: на 2-й международной конференции «Астана-Биотех 2011» (Астана, Республика Казахстан, 2011); на конференции «Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения» (Новосибирск, 2012).

Работа выполнена в 2009-2012 годах в ГНЦ ВБ «Вектор» в рамках научных тем организации; выполнения приказов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 01.03.2010 г. №70 «О проведении верификации ПЦР-диагностики гриппа типа А, включая грипп птиц Н5ТЧ1 и пандемический грипп А/НШ1(зш2009)» и от 17 марта 2008 г. N 88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней»; выполнения тем в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 годы)»; выполнения тем в рамках Координационного научного совета по санитарно-

эпидемиологической охране территории Российско

Информация о работе

Шиков, Андрей Николаевич
кандидата медицинских наук
Кольцово, 2013
ВАК 03.02.02

Диссертация

Генетическая изменчивость и антигенные свойства штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1), циркулировавшего в 2009–2010 годах на территории Российской Федерации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы