Молекулярно-генетическая характеристика пандемического вируса гриппа А подтипа H1N1, циркулировавшего на территории Российской Федерации на протяжении сезонов 2009-2011гг.

Журавлева, Марина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая характеристика пандемического вируса гриппа А подтипа H1N1, циркулировавшего на территории Российской Федерации на протяжении сезонов 2009-2011гг.
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика пандемического вируса гриппа А подтипа H1N1, циркулировавшего на территории Российской Федерации на протяжении сезонов 2009-2011гг."

На правах рукописи

00500377Э

Журавлева Марина Михайловна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАНДЕМИЧЕСКОГО ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА H1N1, ЦИРКУЛИРОВАВШЕГО НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НА ПРОТЯЖЕНИИ СЕЗОНОВ

2009-2011ГГ.

03.02.02 - вирусология 03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук.

- 8 ДЕК 2011

Москва 2011.

005003775

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор медицинских наук, профессор

кандидат биологических наук

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: академик РАМН,

доктор медицинских наук Каверин Николай Вениаминович

доктор биологических наук,

доцент Ильина Елена Николаевна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

Защита состоится «26» декабря 2011г. в 12 часов

На заседании диссертационного Совета Д.208.131.01 при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России (адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д.16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « »_2011г.

Дерябин Петр Григорьевич Прилипов Алексей Геннадьевич

Учёный секретарь Диссертационного Совета,

доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы.

Грипп остаётся одной из наиболее актуальных проблем последнего столетия. Вирус гриппа типа А является одним из наиболее распространённых вирусов, имеет широкий круг хозяев и, за счёт своей уникальной способности к антигенной изменчивости в результате мутационного - «дрейф» и реассортантного - «шифт» процессов, отличается значительной вариабельностью [Каверин Н.В. 2008].

В связи с тем, что вирус гриппа в процессе эволюции приобретает значительные изменения, молекулярно-генетеческие методы являются основным звеном методов диагностики заболевания. Проведение ПЦР и дальнейшего секвенирования позволяют не только определить наличие генетического материала вируса в исследуемой пробе, но и детектировать принадлежность вируса к тому или иному подтипу, а также проследить эволюционную изменчивость циркулирующего штамма.

В апреле 2009 года в Мексике и США были зарегистрированы случаи инфицирования человека ранее не описанным вирусом гриппа A(HlNl)v, подобного свиному [Dawood F.S. 2009]. На протяжении следующих нескольких месяцев произошёл подъём заболеваемости в вышеупомянутых странах, а также распространение нового вируса гриппа А в страны Европы, Азии и Австралию. 21 мая 2009 года из носоглоточного смыва больного, прибывшего из США в Россию, была выделена РНК вируса гриппа, и методом ПЦР в реальном времени был детектирован пандемический вариант вируса гриппа A(HlNl)pdm2009. Это был первый лабораторно подтверждённый случай инфицирования на территории Российской Федерации [Львов Д.К. 2009].

Изучение нового варианта вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 молекулярно-генетическими методами показало наличие в геноме вируса уникальных комбинаций генов различного происхождения. Было доказано, что вирус пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 мигрировал из популяции свиней и является тройным реассортантом [C.Kingsford 2009]. Также генетический

анализ показал, что гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и белки (NP, NS), произошли от вирусов классического гриппа свиней, нейраминидаза (NA) и ген М, кодирующий два белка, - от вирусов гриппа свиней евроазиатской линии, полимеразные белки РВ2 и РА - от вирусов гриппа птиц, а белок РВ1 - от вирусов гриппа человека [Garten R.J. 2009].

Современные методы анализа нуклеотидной последовательности участка гена НА (рецепторсвязывающего сайта гемагглютинина) позволяют получить данные об изменении сродства исследуемого вируса к сиаловым рецепторам а2'3 или а2'6.

Анализ нуклеотидной последовательности участка гена М, кодирующего трансмембранный белок М2 штамма A/IIV-Moscow/01/2009(HlNl)swl, выявил резистентность вируса к римантадину, а молекулярно-генетический анализ частичной нуклеотидной последовательности гена NA - чувствительность к озельтамивиру.

Современные методы позволяют получить полную нуклеотидную последовательность из клинического материала без предварительной подготовки. Данные, полученные таким способом, являются наиболее значимыми, поскольку в случае подготовки образцов для получения полноразмерных геномов вирус пассируют на клетках (MDCK, КЭ), что ведёт к накоплению мутаций.

Изучение молекулярно-генетических характеристик штаммов вируса гриппа, циркулирующих на территории Российской Федерации, является основным звеном системы мониторинга эволюционных изменений вируса на территории нашей страны за определённый период.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении изменчивости штаммов пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009, циркулирующих на территории Российской Федерации в период 2009-2011гг.

Для достижения вышеописанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить частичную нуклеотидную последовательность гена НА пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, провести

сравнительный анализ и выявить аминокислотные замены, способные влиять на рецепторную специфичность.

2. Определить частичную нуклеотидную последовательность гена NA, провести сравнительный анализ и проверить чувствительность штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 к озельтамивиру.

3. Определить частичную нуклеотидную последовательность гена М, кодирующего трансмембранный белок М2 и проверить чувствительность штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 к препаратам адамантанового ряда.

4. Определить полную нуклеотидную последовательность 8 штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, циркулировавших на территории России в период 2009-2011гг. и провести сравнительный анализ с первым появившимся в России пандемическим вирусом гриппа A(HlNl)pdm2009.

Научная новизна.

Впервые были выявлены и проанализированы аминокислотные замены в трёх белках (М2, NA и НА) пандемического вируса гриппа A(H1N1) 20092011гг. на большой выборке проб из Российской Федерации.

Впервые были подобраны праймеры и разработана собственная схема амплификации, позволяющая получить фрагменты генов для детектции маркеров чувствительности к противовирусным препаратам (для генов М и NA) и рецепторной специфичности (для гена НА) пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, а также получать полные нуклеотидные последовательности всех 8 сегментов генома вируса. Следует отметить, что разработанная схема амплификации позволяет использовать не только пробы вируса с высоким титром, но и РНК, выделенную из клинического материала.

Впервые был проведён сравнительный анализ рецепторсвязывающего сайта гемагглютинина в первичной пробе (носоглоточный смыв) и в пробе, взятой после смерти, на примере двух случаев заболевания.

Впервые в международную базу ОепВапк были заложены реперные штаммы для дальнейшего анализа изменчивости вируса гриппа А(НШ1)рс1т2009 на территории России.

Впервые в России проведена исследовательская работа по сравнению полных геномов вируса гриппа А(НШ1)рёш2009, выделенных из разных органов одного человека.

Практическая значимость.

Разработанная схема амплификации и определения нуклеотидной последовательности участков генов, кодирующих синтез трансмембранного белка М2 и фермента нейраминидазы, используется для мониторинга чувствительности пандемического вируса гриппа А(НШ1)рс1т2009 к противовирусным препаратам: блокаторам белка М2 и ингибиторам нейраминидазы. Полученные данные следует учитывать при составлении рекомендаций по лечению больных, инфицированных пандемическим вирусом гриппа А(НШ1)рс1т2009.

Мониторинг аминокислотных замен в генах М, ЫА и НА штаммов пандемического вируса гриппа А(НШ1)рскп2009, циркулировавших на территории Российской Федерации на протяжении 2009-2011гг., позволяет определить направление изменчивости вируса и использовать полученные данные при составлении рекомендаций по составу гриппозных вакцин, а также диагностических препаратов.

Полные нуклеотидные последовательности штаммов вируса пандемического гриппа А(НШ1)рс1т2009, исследуемые в работе, были депонированы в базу данных ОепВапк. Также данные молекулярно-генетического исследования были учтены при депонировании штаммов пандемического гриппа А(НШ1)р<1ш2009 в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития- России. Последовательности данных штаммов могут быть использованы как реперные точки для мониторинга направления изменчивости вируса на территории России.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Популяция пандемического вируса, циркулировавшего на территории Российской Федерации в период 2010-2011гг. более вариабельна, чем в период 2009-2010.

2. Проанализированы частичные нуклеотидные последовательности гена НА 546-ти образцов клинического материала пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 для оценки изменения рецепторной специфичности вируса.

3. На протяжении двух пандемических сезонов сохраняется чувствительность вируса A(HlNl)pdm2009 к противовирусным препаратам римантадин и амантадин и резистентность к озельтамивиру.

4. Проведён сравнительный анализ 8 штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, циркулировавших на территории России в период 2009-2011гг. с первым появившимся в России штаммом A(HlNl)pdm2009 по полной нуклеотидной последовательности геномов.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации в журналах, рекомендованных ВАК, опубликовано 2 научные статьи и 1 тезис. Часть работы была представлена на 3-ей Конференции Молодых Учёных в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России в 2010 году.

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и экологии вирусов и апробационного Совета ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России 1 ноября 2011 года.

Структура и объём диссертации.

Материалы работы изложены на 151-й страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, их обсуждения, выводов, приложения и библиографического списка, включающего в себя 147 источников. Диссертация иллюстрирована 20-ю рисунками, 27-ю таблицами и 8-ю схемами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор клинического материала для исследования.

Клинический материал для выявления или подтверждения инфекции, вызванной новым пандемическим гриппом A(HlNl)pdm2009 у пациентов с выраженными симптомами респираторной инфекции, поступал в лаборатории ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России из больниц и поликлиник, а также из вирусологических лабораторий региональных ФГУЗ Центров гигиены и эпидемиологии. Клинический материал представлял собой носоглоточные смывы от больных с диагнозом ОРВИ или пневмония (различного генеза и степени тяжести) и секционный материал тканей трахеи, бронхов, лёгких и селезёнки от умерших пациентов. В период 2009-2011гг. на анализ в лабораторию поступило 1246 образцов носоглоточных смывов и 290 образцов секционного материала. Клинический материал для исследования поступал из разных регионов Российской Федерации:

• Европейской части (Москва, Липецк, Брянск, Элиста, Владимир, Марий Эл, Великий Новгород, Тверь, Ярославль, Тула);

• Урал (Челябинск, Оренбург);

• Дальний Восток (Благовещенск, Биробиджан, Хабаровск, Владивосток, Сахалин, Магадан, Анадырь, Чукотка).

Молекулярно-генетические методы исследования.

Выделение РНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Реакцию обратной транскрипции, для получения кДНК, проводили с помощью праймера Uni. Двухраундовую полимеразную цепную реакцию, для получения полной нуклеотидной последовательности генома пандемического вируса гриппа, проводили с помощью праймеров, рекомендованных ВОЗ. Для амплификации и определения нуклеотидной последовательности (для дальнейшей детектции замен) в генах M, NA и НА использовали специфические праймеры, подобранные с помощью программы Primer Premier

5.00. Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 (Applied Biosystem, США). Для построения алайментов использовали алгоритмы Clustal V и Clustal W из пакета программ DNASTAR 7 (Lasergene Inc., США).

В качестве штаммов сравнения использовали полные нуклеотидные последовательности штаммов A/IIV-Moscow/01/2009(HlNl)swl и A7Califomia/07/2009(HlNl), взятые из международной базы данных GenBank.

II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В ходе проведённой работы были проанализированы клинические образцы, взятые от больных, находящихся в разной степени тяжести заболевания гриппом. Также исследованию подвергся секционный материал, полученный от умерших пациентов. В качестве секционного материала в лабораторию поступали фрагменты лёгких, бронхов, трахеи и селезёнки (Табл.1).

2009-2010 гг. 2010-2011гг.

Носоглоточные смывы Секцион. материал Носоглоточные смывы Секцион. материал

Общее кол-во обр. 415 110 831 180

Положительные no RT 315 81 348 65

проанализировано НА 242 73 216 15

NA 118 12 281 16

М 27 15 293 20

Таблица 1. Общее количество поступивших на исследование образцов и образцов, исследованных в данной работе по генам НА, ЫА и М.

Молекулярно-генетический анализ участка гена НА.

До октября 2009 года в лабораторию молекулярной генетики института

ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России

поступали пробы от больных с благоприятным исходом заболевания

пандемическим гриппом A(HlNl)pdm2009. В этот период все исследуемые

образцы в 222 позиции аминокислотной последовательности вирусного белка

содержали аспарагиновую кислоту. В последних числах октября 2009 года в

лабораторию на исследование поступила проба от пациента с тяжёлой

пневмонией, а чуть позднее штамм вируса, выделенный из этой пробы (A/IIV-

Elista/64/2009(HlNl)swl) и прошедший два пассажа в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ).

Первичный материал содержал аспарагиновую кислоту в 222-й позиции аминокислотной последовательности гемагглютинина, а штамм A/IIV-Elista/64/2009(HlNl)swl - эквимолярную смесь аспарагиновой кислоты и глицина в 222-м положении аминокислотной последовательности вирусного белка. Было сделано предположение о том, что в первичной пробе вариант вируса содержащего глицин в 222-м положении присутствует, но в очень низкой концентрации, а при пассировании вируса в развивающихся куриных эмбрионах популяция мутантного вируса нарастает. Начиная с ноября 2009 года, в России резко участились случаи тяжёлых пневмоний с летальным исходом. Причём, достоверно известно, что во всех случаях этиологический диагноз при жизни не был поставлен, из чего следует, что этиотропная терапия до попадания больного в стационар не проводилась. В это время в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России стали поступать секционные материалы от пациентов с летальной пневмонией. В период 2009 - 2010 гг. молекулярно-генетическими методами было проанализировано 315 образцов. Из них 73 пробы были получены от пациентов, умерших в результате тяжёлой пневмонии, 10 из которых были беременные.

После выделения вируса и последующего проведения ПЦР, а затем и определения первичной нуклеотидной последовательности гена был проведён молекулярно-генетический анализ полученных проб, который выявил наличие разных вариантов мутаций в 222-м положении аминокислотной последовательности гемагглютинина (нумерация по зрелому НА1).

Нуклеотидные последовательности участка гена выравнивали относительно полной нуклеотидной последовательности гена НА штамма дикого типа A/IIV-Moscow/01/2009(HlNl)swl. Среди всех исследуемых проб встречались три варианта мутаций. В 264-х случаях мутация отсутствовала, и в 222-м положении аминокислотной последовательности белка находилась аспарагиновая кислота (D). В 17-ти случаях в данном положении присутствовала аминокислота - глицин (G). Для 6-ти исследуемых образцов в

222-м положении аминокислотной последовательности вирусного белка находился аспарагин (N). Лишь в двух случаях была выявлена глутаминовая кислота (Е). Для остальных случаев достоверно определить мутацию можно только после клонирования данного участка в плазмиду и последующего анализа индивидуальных клонов.

В декабре 2009 года молекулярно-генетическим методом был выявлен первый случай наличия смеси (D/G/N) в 222-м положении аминокислотной последовательности вирусного белка гемагглютинина в клиническом материале носоглоточного смыва в России. Клонирование фрагмента гена НА в плазмиду и последующий анализ 16-ти клонов выявил: 8 вариантов D, 4 варианта G и 4 варианта N. Затем поступила информация о смерти пациента. После проведения исследований секционного материала, в 222-м положении гемагглютинина была обнаружена аминокислота G. Аналогичный случай был выявлен в январе 2010 года. В первичной пробе носоглоточного смыва в 222-м положении аминокислотной последовательности вирусного белка гемагглютинина была обнаружена аминокислотная смесь D/N. После смерти пациента от двусторонней пневмонии в секционном материале легкого в 222-м положении гемагглютинина была детектирована аминокислота аспарагин (N).

В январе 2010 года молекулярно-генетическим методом был выявлен первый случай мутации (G) в 222-м положении аминокислотной последовательности вирусного белка гемагглютинина в клиническом материале носоглоточного смыва.

В период 2010-2011гг. молекулярно-генетическим методом было проанализировано 216 образцов первичного материала, вместе с ними в анализ вошли 15 образцов секционного материала.

Из 216-ти проанализированных образцов лишь один содержал смесь мутантного вируса и вируса дикого типа (D222D/G). В течение дальнейшей работы был выделен штамм MIV-Cheboksary/92/201 1(H1N1)v, в котором вместо смеси в 222-м положении аминокислотной последовательности вирусного белка находилась аминокислота глицин. Во всех остальных случаях (215) в исследуемом положении присутствовала аспарагиновая кислота (D222).

Результаты молекулярно-генетического анализа 15-ти проб секционного материала отличались от таковых за предыдущий пандемический сезон 2009 -2010гг. В двух случаях мутация в 222-м положении аминокислотной последовательности белка гемагглютинина была представлена глицином (в), в одном - аспарагином (Ы). Семь из 15-ти образцов содержали смесь различного характера:

• САТЛЗСТ ф222ШЗ) - 3 образца;

• вАТ/ААТ (02220/М) - 1 образец;

• ОСТ/ААТ (П2220/Ы) - 3 образца.

В пяти случаях из 15-ти проанализированных секционных материалов в 222-м положении аминокислотной последовательности белка гемагглютинина была выявлена аспарагиновая кислота (О) (Табл. 2).

& О

<± =

о г*

Секц. мат.

носогл. см.

Секц. мат.

носогл. см.

Секц. мат.

Общее кол-во образцов

242

216

458

239

215

454

Смесь а.к.

Таблица 2. Сводная таблица учета вариантов аминокислот, встречающихся в исследованных образцах в 222 положении гемагглютинина (нумерация по HI).

Также в гене НА были выявлены, ранее не описанные в литературе, мутации. Все мутации являются единичными и обычно не вызывают повышенного интереса исследователей. Однако, в случае замены в позиции S202T (нумерация по НО), носившей в период 2009-2010гг. единичный характер, было отмечено скачкообразное увеличение частоты встречаемости в период 2010-2011гг. (Табл.3).

№ позиции в полипептиде 2009-2010 гг. 2010-2011гг.

242 носогл. смыв. 73 обр. секц. мат. 216 носогл. смыв. 15 образца секц. мат.

145 S (3 Р) S (ЗР) S S

146 N (1S) N N N

149 V (1 Е) V V(1I) V

151 А А А (2Т) А

153 C(ls) С С С

155 Н н Н (1 R; 2Q) н

156 А (2 D) А А А (IV)

158 А (4 S) А (6Т) А (1 S; И) А

"160" S S S (38 G, 2 R) S (2 G)

166 I I (1М) I I

177 К K(1R) К К

179 S (3 N) S (2N) S (1N) S

180 К К К (1R) к

187 G (1 R) G G G

188 К К К (1 R) К

189 Е (1D) Е Е Е

190 V (11) V V V

200 S S (1Р) S (2 Р) S

"202" S (1 Т) S T (14 S) Т (2 S)

203 А А А (ЗТ) А

207 S S S (11) S

208 L (1 1,р) L L L

"214" А А А (39 T) А (1 Т)

215 Y Y V (1 С) Y

216 V (1 А) V V V

219 G(1E) G G G

220 T (1 S) Т (2 S) т Т

222 R R R (9 К) R

225 KOR) К (1R) К К

226 К К (1Т) К К

233 I I I (9 V) I

"239" D (1 G,1 D/G, 1D/G/N) D (6N, 17 G, 2 Е) D (1 D/G) D (1 N, 2 G, 3D/G, 1D/N, 1G/N)

247 Y (1Н) Y Y Y

252 Е Е (2 К) Е (5 V) Е (1 D)

257 I (IV) 1 I

266 V (1 L) V V (10 L) V

267 V (11) V V V

277 N (1 К) N N (ЗК) N

281 G G G G (1 D)

283 I (3V) I (IV) I

287 т т Т(1К) Т

289 V(1 А) v (1 F) V (11) V

291 D (1 G) D D (1 G, 1 N) D

300 К (1 N) К (2 N) К (3N) К

303 I I (1 М) I I

310 Q(1H) Q (2 Н) Q О

312 I I I (IV) I

319 К (1 Т, 1 Е) К к К

324 V (21) V V(1E) V

326 S О I) S S S

327 т Т (11) Т т

"338" V (29 I) V (271) V V

Таблица 3. Аминокислотные замены, выявленные при сравнительном анализе участка гена НА. Нумерация по НО от первой аминокислоты - метионин (М).

В позициях 160 и 214 в период 2009-2010гг. находятся аминокислоты серин (Б) и аланин (А), соответственно, причём как в исследуемых образцах

носоглоточных смывов, так и в образцах секционного материала. В период 2010-2011гг. наблюдается накопление вариантов вируса, содержащих в этих позициях аминокислоты глицин (в) и треонин (Т), соответственно.

В позиции 338 наблюдается обратная ситуация. В первый пандемический период в этом положении находилась аминокислота валин (V), при этом 18% всех исследуемых образцов (315) содержали в данном положении другую аминокислоту - изолейцин (I). В период 2010-2011гг. не было выявлено ни у одного образца в 338-м положении гена НА аминокислоты изолейцин (I). Все проанализированные образцы содержали в вышеописанном положении аминокислоту валин (V).

Молекулярно-генетический анализ участка гена NA.

В настоящей работе также показано, что все исследуемые образцы, как носоглоточные смывы (399 образцов), так и пробы секционного материала (28), в положении 275 аминокислотной последовательности белка (нумерация по N1 от первой аминокислоты - метионин) содержат аминокислоту гистидин (Н), что свидетельствует о чувствительности исследуемых штаммов к озельтамивиру.

Исходя из этого, можно сказать, что летальный исход, скорее всего, был вызван несвоевременным обращением таких пациентов за квалифицированной медицинской помощью.

В гене нейраминидазы были найдены ранее не описанные в литературе замены, которые, возможно, влияют на чувствительность к препаратам последнего поколения (Табл.4). Полученные данные являются статистически значимьми.

Наиболее интересны аминокислотные замены в 241-м и 369-м положениях. Аминокислота валин (V) присутствует у представителей дикого типа А/ПУ-Мозсо\\г/01/2009(НШ1^1 и А/СаН&ппа/07/2009(НШ1) и во всех исследуемых образцах пандемического периода 2009-2010гг.

№ позиции Аминокислота, встречающаяся у дикого типа Аминокислотная замена Количество образцов с заменой

2009-2010 2010-2011 2009-2010 (138 обр.) 210-2011 (279 обр.)

228 Е Е Е 228 К 0 1

232 А А А 232 V 0 1

**241** V V 1241 V 0 9

242 м м M242I 0 1

247 S S S247N 0 5

257 R R257K R257K 5 1

260 К K260R К 1 0

262 к К K262R 0 10

263 I 1263 V I 3 0

264 V V V 264 АД 0 1; 1

270 N N N2701 0 14

272 Р Р P272L 0 1

273 N N273 D N 2 0

299 S S S 299 А 0 3

309 N N 309 D N 1 0

313 Q 0 0 313 R 0 2

314 I I I 314 К 0 1

329 N N N 329 D 0 2

331 К К К331 R 0 4

340 S S S 340 F,T 0 2; 2

341 N N N341H 0 1

354 G G354D G354D 1 1

359 I I 1 359 V 0 1

365 I 1 I 365 N 0 1

**369** N N К 369 N 0 9

378 N N N 378 К 0 1

Таблица 4. Аминокислотные замены, выявленные при сравнительном анализе участка гена NA. Нумерация по N1 от первого метионина (М).

В пандемический период 2010-2011 гт. в вышеуказанном положении находится аминокислота изолейцин (I), а валин встречается в единичных случаях (в 9-ти из 279-ти случаях). Аналогичная ситуация с 369-м положением в белке нейраминидазы. В пандемический период 2010-2011гг. в данном положении находится аминокислота лизин, в то время как в предыдущий пандемический период в 369-м положении белка нейраминидазы, как и у представителей дикого типа, находилась аминокислота аспарагин. Эти данные свидетельствуют об изменчивости пандемического вируса, циркулировавшего в России в период 2009-2010гг., по сравнению с вирусом, циркулировавшим в период 2010-2011гг.

Молекулярно-генетический анализ участка гена М, кодирующего трансмембранный белок М2.

Проделанная работа и анализ полученных результатов позволяют утверждать, что все исследуемые вирусы пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 были резистентны к препарату римантадин, так как все

проанализированные аминокислотные последовательности трансмембранного белка М2 в 31 положении содержали аминокислоту аспарагин (N). Также была идентифицирована аминокислотная замена D21G белка М2, которая уже описывалась в литературе при изучении сезонного гриппа A(H1N1), и все образцы с мутацией D21G являлись чувствительными к препаратам адамантанового ряда, в частности, к римантадину. В нашем случае все образцы римантадин резистентны. И следует отметить, что все 70 образцов, имеющих замену D21G, относятся к пандемическому сезону 2010-2011гг., что свидетельствует об изменчивости вируса. Возможно, даже к снижению его вирулентности или замещению сезонного гриппа A(H1N1). (Рис.1).

21 31

RHTFI.KXCRPTftSEVffiCRCSDSSDPlVIAKailSIbHLILWITDRLFPKC KMEFLKICRPTKEElüECRCSDSSDPLVXAAKXieiLHLILHIIDRLFFKC KKTFLKICBPTRSEWECRCSßSSDPLVIÄAJ{IIGILHLILalTDRI,FFü:t K»TFLKICRPTRS2MECRci'Sä8DPLVIAAlJIieiLHLILSITDRLFFKC »rrPbK:CRP5SSeMECRCgG.?SDPbVIAftN;iGILKl.Xb!<»TDRLFFK<: KMTFLKICRPTRSE>iECRCSt;SSDPLVIAAI-IIIGILKbXI,KIADRI.FFKC KMTFLKICRPTRSEi'JECRCZ'iäSSDPLVIÄANIXGILKLILWITDRLFFKC KMTFLKrCRPTRSEWECRCfeGäSDPLvIAaiilXGXLHblLKITDRLFFKC SKTFLKX CRPTRSEWECRCpGgSDPlVI AAKIIGI LHLILWITBRX, F'FKC ittiSFbKICRP'fRSEWECRcäDSSDPLVISAHIXeiX.HKI.WXTDRI.FFKC KMTFXKXCRPTRSEWECRCSDSSDPL\'iaAN::GILHLILWXTDRX.FFKC

Рисунок 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей относительно 2 штаммов A/IIV-Moscow/01/2009(HlNl)swl и A/California/07/2009(H1N1). Наличие в 31 позиции аспарагина (N) свидетельствует о резистентности к препаратам адамантанового ряда (амантадин, римантадин).

В других положениях были выявлены единичные замены, и утверждать влияют ли они на вирулентность вируса или изменяют какие-либо его другие

свойства, можно только после более детальных исследований (Табл. 5).

№ позиц ии Аминокислота, встречающаяся у дикого типа Аминокислотная замена Количество образцов с заменой

12 Аргинин Лизин 6 из 355

13 Серин Аспарагин 4 из 355

18 Аргинин Лизин 1 из 355

21 Аспарагиновая кислота Глицин 70 из 355

43 Треонин Алании 3 из 355

52 Тирозин Гистидин 3 из 355

54 Аргинин Гистидин 3 из 355

Таблица 5. Аминокислотные замены, встречающиеся в участке гена М, которые, возможно, влияют на устойчивость вируса к лекарственным препаратам.

Анализ полной нуклеотидной последовательности генома вируса пандемического гриппа А(НШ1)рс!п12009.

^ Штамм А/ПУ-Туег/183/2009(НШ1)8\у1 был выделен из секционного материала ткани бронха. Пациент 38-ми лет скончался на восьмой день болезни с диагнозом двусторонняя тотальная пневмония. •/ Штамм А/ПУ-Туег/2969/2009(Н 1N1 )б\у1 был получен из секционного материала ткани лёгкого. Пациент 26-ти лет из города Тверь скончался на восьмые сутки болезни в стационаре, где был поставлен диагноз двусторонняя бронхопневмония. ✓ Штаммы АЛ I У-ОгепЬиг^13/2010(Н1 N1 )уВ и А/ИУ-

ОгепЬиг§/13/2010(Н 1N1 )уЬ были получены из секционного материала бронхов и лёгкого одного человека. Пациент 56-ти лет умер на восьмой день заболевания. При жизни ему был поставлен диагноз двусторонняя полисегментарная пневмония, вызванная вирусом гриппа А(НШ1)рс1т2009. Последние два штамма представляют интерес с точки зрения проверки гипотезы о том, что в процессе инфицирования дистальных отделов респираторного тракта вирус мутирует, а, следовательно, и увеличивается способность вируса связываться с а2'3-сиаловыми рецепторами. В свою очередь, снижается способность вируса к распространению воздушно-капельным путём, но увеличивается риск поражения альвеолярных клеток и клеток бронхиол, что без своевременного лечения может привести к тяжелой пневмонии, а, возможно, даже с летальным исходом. Также в исследование были включены штаммы вирусов гриппа А(НШ1)рёш2009:

Штамм АЛ1У-Мо5со\у/03/2009(НШ1)з\у1, который был выделен из носоглоточного смыва больного и изолирован на культуре клеток МОСК. ^ Штамм А/ПУ-Мо5со\у/33/2010(НШ1)у был получен из носоглоточного смыва больной 26-ти лет, контактировавшей с инфицированным человеком. ^ Штамм АЛ1У-У1ас11уо51;ок/7/2010(НШ1)у был получен из носоглоточного

смыва больного 19-ти лет и изолирован на культуре клеток МОСК. ^ Штамм А/ПУ-СЬеЬокзагу/92/201 1(Н1Ш)у получен из носоглоточного смыва больного 29-ти лет и был изолирован на культуре клеток МОСК. (Табл.6).

Название штамма Идентификационные номера Название в GenBank

A/IIV-Moscow/03/2009(HlN 1 )swl »3330645 -<3(2330652 A/Moscow/II V03/2009(H 1N1)

А/lIV-Tver/183/2009 (HlNl)swl НМ 101145 -НМ 101152 A/Tver/IIV-183/2009 (H1N1)

А/11 V-Tver/2969/2009(H 1N1 )swl Ои 451253-ви 451260 A/Tver/IIV2969/2009(H INI)

A/nV-Orenburg/13/2010(HlNl)vB НМ 124380 - НМ 124387 A/Orenburg/IIV-13/2010B

A/irV-Orenburg/l 3/2010(H1N l)vL НМ 569737 - НМ 569744 A/IlV-Orenburg/13/2010L

A/HV-Moscow/33/2010(HlNl)v Н<3834743 - Н(}834750 A/II V-Moscow/33/2010(H 1N1)v

A/IlV-Vladivostok/7/2010(H1N l)v НС>891279-Н0891286 A/IIV-Vladivostok/7/2010(HlNl)v

A/lIV-Cheboksary/92/2011 (IIlNl)v М703379,М703380,Ж704790-Ж704795 A/IIV-Cheboksary/92/2011 (HlNl)v

Таблица 6. Название штаммов, исследованных в работе, и их идентификационные номера в базе данных ОепВапк.

В тексте использованы названия штаммов, использованные при закладке в базу данных ОепВапк. Клинический материал, из которого были получены полные

нуклеотидные последовательности генома вируса пандемического гриппа А(НШ1)рёт2009, представлен в таблице 7.

Название штамма Материал Система изоляции Полная нуклеотидная последовательность получена из

А/ ИУ-Мо5СО\м/03/2009(НШ1^1 носоглот. смыв МБСК носоглот. смыв

А/ НУ-Ттег/183/2009 (НШ1>№1 ткань бронхов КЭ ткань бронхов

А/ ПУ-Тгег/2969/2009(НШ1)81»1 ткань лёгкого кэ ткань лёгкого

А/ II У-ОгепЬиг^ 13/2010(НШ1 )уВ ткань бронхов КЭ ткань бронхов

А/ НУ-ОгепЬиг^13/2010(НШ1)уЬ ткань лёгкого кэ ткань лёгкого

А/ II У-Мобсои/З 3/2010(Ш N1) v носоглот. смыв моек носоглот. смыв

АЛ1У-УЫптааок/7/2010(НШ1>> носоглот. смыв моек МОСК

АЛ1У-СЬеЬок5агу/92/2011 (НШ1)у носоглот. смыв МЛСК носоглот. смыв

Таблица 7. Штаммы, исследованные в работе.

Максимальный процент идентичности показали две группы вирусов: А/МоБсои'/П УО1/2009(Н 1N1) и А/Мозсо\у/ИУ03/2009(НШ1), а также А/ОгепЬиг^ПУ-13/2010В и АЮгепЬиг§/ИУ-13/2010Ь. Процент идентичности составил 99,9%. Чуть меньший процент идентичности (99,8%) был у А/Туег/ПV-183/2009(Н 1N1 )В и А/ТуегЯ1У-183/2009 (НШ1)Ь (Табл. 8).

Percent Identity

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 нн 99.0 996 99.8 997 99.6 S9.6 Э9.5 99.3 1 Moscow 01 2009.seq

2 0.1 99.5 99.8 99 6 99.6 S9.5 99.5 99.2 2 Moscow 03 2009.seq

3 0.4 0.5 994 99.3 99.2 99.2 99.6 99.7 3 Moscow 33 20l0.seq

4 0.2 0 2 OS 99 8 99.7 99.6 99.5 99.1 4 Tver 183J2009 Lung.seq

S 0.3 0.4 0.7 0.2 т 99.7 99.6 99.4 99.1 5 Tver_183_2009_Bfonh.seq

6 0.4 04 08 03 0.3 99.9 99.3 98.9 6 Orenburg 13_2£>10 Lung.seq

7 0.4 05 08 0.4 0.4 0.1 ШШ 99.2 38.9 7 Orenburg 13 2010 Bronh.seq

е 03 0.5 0.4 0.5 0.7 0.7 0.8 99.3 8 Cheboksary 92 2011.seq

9 0.7 03 0.3 0.9 0.9 1.1 1.1 0.7 н 9 Vladivostok 7 2010.seq

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Таблица 8. Генетическая дистанция исследуемых штаммов, рассчитанная по полой нуклеотидной последовательности гена НА.

Максимальный процент дивергенции (1,1%) наблюдался среди двух штаммов, выделенных от одного человека (A/Orenburg/IIV-13/2010B и A/Orenburg/IIV-13/2010L) и A/Vladivostok/7/2010(HlNl)v.

Филогенетический анализ второго поверхностного белка - нейраминидазы показал другую картину расхождения между исследуемыми штаммами. Из нижеприведённой таблицы видно, что штаммы A/Moscow/IIV-33/2010(HlNl), A/Vladivostok/7/2010(Н1 N1 )v и A/IIV-Cheboksary/92/201 i(HlNl)v образуют отдельную группу. После анализа таблицы генетического сходства, а также сопоставления результатов филогенетического анализа, можно сказать, что штаммы вирусов A/Moscow/IIV-33/2010(HlNl), A/Vladivostok/7/2010(HlNl)v и A/IIV-Cheboksary/92/201 l(HlNl)v являются самыми генетически удалёнными от других вирусов исследуемых в данной работе. Но при изучении генетического сходства можно увидеть, что они достаточно отличимые друг от друга, о чём свидетельствует приведённая ниже таблица 9.

Moscow_01_2009.SEQ Moscow. 03_200S.SEQ Uoscow_33_20iase() Tver_133_2009_Lljng.seq Tver_183_2009_BronH.seQ 0ren0urg_13J30"1tLLung.SEQ Orenoufg_13_2010_Brcntl SEQ Ctiet>0Ksary_92_2011.seq V1at£w5toit_7_2010-SEQ

Таблица 9. Генетическая дистанция исследуемых штаммов, рассчитанная по полой нуклеотидной последовательности гена ИА.

Процент идентичности между штаммом А/Мо5со-\¥/ПУ-33/2010(НШ1) и штаммом А/УЫпю81:ок/7/2010(НШ1)у составляет 99,6%. Между АЯ1У-СЬеЬокзагу/92/2011 и А/УЫгго81ок/7/2010(НШ1)у процент идентичности 99,4%. Все эти штаммы, как видно из дендрограммы, образуют отдельную ветвь. Процент идентичности между, например, А/УМгуо8Юк/7/2010(НШ1)у и штаммом дикого типа А/ПУ-Мо8со\¥/01/2009(Н1Ш)8\у1 составляет 99,3%, что всего на 0,1% отлично от сравнения АЛГУ-СЬеЬокзагу/92/2011 и А/УЫшюЮкШО10(НШ1)у (99,4%).

Процент генетического расхождения между штаммом, впервые

появившимся в России в 2009 году (A/IIV-Moscow/01/2009(HlNl)swl), и

штаммом пандемического вируса гриппа 2011 года, полная нуклеотидная

1 2 3 4 Ь в 1 8 9

1 99.9 99.5 99.7 99.7 99.8 99.8 99.4 99.3 1

2 0.1 шл 99.5 99.7 99.7 99.8 99.8 99.4 99.3 2

3 0.5 0.5 99.4 99.4 99.4 99.4 99.6 99.6 3

4 0.3 0.3 0.6 99.7 99.8 99.8 99.3 99.1 4

5 0.3 0.3 0.6 0.3 99.9 99.9 99.3 99.1 5

6 0.2 0.2 0.6 0.2 0.1 ш 99.9 99.4 99.2 6

7 0.1 0.1 0.5 0.1 0.1 0.0 — 99.4 99.2 7

8 0.6 0.6 0.4 0.7 0.7 0.6 0.6 ■1 99.4 8

9 0.7 0.7 0.4 0.9 0.9 0.8 0.7 0.8 ■I 9

последовательность которого была получена в августе 2011 года (АЛ1У-СЬеЬокзагу/92/2011), составляет 0,6%.

Так же у всех исследуемых штаммов был проанализирован ген М как его полная нуклеотидная последовательность, так и нуклеотидная последовательность, в результате трансляции которой получается белок трансмембранный М2. Филогенетический анализ полной нуклеотидной последовательности гена М (Рис. 2) показал разделение всех исследуемых штаммов на две группы.

1 МО5СО\»_03_2009.8ЕС! 1 Ыозот_01_2009 БЕО

А yiadwo.StGfc_7_2010.SEO 1 СеЬокзэгу_92_2011.8ер

- Мо5со«_33_2010.5ед

' Tvef_183_2009_.Bronh.seq

_) 0renSur5_13_2010J.ung.SEQ ' 0геп0игд_13_2010_вгоп|1 ЭЕй

- Туег_18Э_2009_Ыпд.зед

ЫиОеоМе ЭиозИгиУопз (хШ>

Рисунок 2. Генетическая дистанция исследуемых штаммов, рассчитанная по полой нуклеотидной последовательности гена М.

В первую группу вошли четыре штамма А/ОгепЬш£/ПУ-13/2010В, А/ОгепЬиг^ПУ-13/201ОЬ и А/Туег/Ш/-183/2009(НШ1)В, А/ТуегЛ1У-183/2009 (НШ1)Ь.

Процент генетического сходства между А/ОгепЬиг§/ИУ-13/2010В и А/ОгепЬиг|*/ПV-13/2010Ь составляет 100%, между А/Туег/ПУ-183/2009(НШ1)В и А/Туег/НУ-183/2009 (НШ1)Ь - 99,6% (Табл.10).

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 100.0 99.6 99,5 99.6 99.5 99.5 99.9 99.9 1

2 0.0 1ЙИ 99.6 199 5 99.6 99.5 99.5 99.9 99.9 2

3 04 0.4 99,1 99.2 99.1 99.1 99.7 99.7 3

4 0.5 0.5 0.9 № 99.6 99.5 99.5 99.3 993 4

5 0.4 0.4 0.8 0.4 ■■■99.9 99.9 99.5 99.5 5

6 0.5 0.5 0.5 0.5 0.1 100.0 99.3 99.3 6

7 0.5 0.5 0.9 0.5 0.1 0.0 ев 99.3 99.3 7

8 0.1 0.1 0.3 0.7 05 0.7 0.7 9В ЮО.О 8

9 0.1 0.1 0.3 0.7 0.5 0.7 0.7 О.О т 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Мозсош_01_2009.3ЕО

М«со»г_03_2009.3Еа

Moscow._33_2010.seq

Tver._183_20C9_Lung.seq

Т'.'ег_^83_20С&_ЕгопЬ.£еч

ОгепЫ1гд_13_2010_ип2.вЕа

ОгепЬигд_13_20Ю_ВгопГ1.5ЕО

СеЬо1гаагу_92_2011.5еч

У1а®»8Йк_7_20Ю.ЗЕО

Таблица 10. Генетическая дистанция исследуемых штаммов, рассчитанная по полой нуклеотидной последовательности гена М.

Наиболее удалённым штаммом по полной нуклеотидной последовательное^

гена М оказался штамм А/Мо8со\у/ИУ-33/20Ю(Н1Ш). Процент дивергенцш

этого штамма по сравнению с другими составлял 0,9% - 0,8%. Минимальны

значения дивергенции штамма А/Мо8«т/ПУ-33/2010(НШ1) наблюдались ::

сравнении со штаммом А/У1асНуо81;ок/7/2010(НШ1)у и составили 0,3%.

Поскольку белок М2 является более консервативным, а его длина составляет всего 97 аминокислот, при сравнении всех аминокислотных последовательностей белка М2 все исследуемые штаммы попали в одну группу. Исключение составляет штамм А/Мозсо\уЛ1У-33/2010(НШ1), он попал в другую группу, в которой являлся единственным представителем. Это объясняется тем, что штамм А/Мозсо\уЛ1У-33/2010(НШ1) имеет нуклеотидную замену в 229-м положении (нумерация, начиная с первого нуклеотида), которой нет у других сравниваемых вирусов. Но этот нуклеотид не меняет аминокислоту, поэтому достоверно можно сказать, что у всех исследуемых штаммов трансмембранный белок М2 идентичен.

Анализ генетического сродства пятого сегмента вируса гриппа, который кодирует вирусный белок нуклеопротеин, показал полное совпадение нуклеотидного состава штаммов АЛ1У-Мозсо\у/01/2009(НШ1)з\у1 и А/Мозсо\у/ПУ03/2009(НШ1), а также между двух штаммов, изолированных от одного человека из разных отделов дыхательного тракта: А/ОгепЬищ/ПУ-13/2010В, А/ОгепЬиг§/11 V-13/2010Ь (Табл. 11).

1 2 3 i 4 5 6 I 7 8 9

1 100.0 99.6 95.9 99.7 99.9 99.9 99.8 99.6 1

2 0.0 н 59.6 99.9 99 7 999 99 9 99.8 99.6 2

3 0.4 0.4 SI 99.5 99.5 995 99.5 99.5 99.7 3

4 0.1 01 о-5 ЩЩ 99.7 99.9 99.9 99.7 99.5 4

5 0.3 03 0.5 0.3 ^■¡99.7 99.7 99.7 99.6 5

6 0.1 0.1 05 0.1 0.3 ШЛ 100.0 99.9 99.5 6

7 0.1 0.1 0.5 0.1 0.3 0.0 99.9 99,5 7

8 0.2 02 0.5 0.3 0.3 0.1 0.1 ж 99.5 8

9 0.4 0.4 0.3 0.5 0.4 0.5 0.5 0.5 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 !

MoscowJ}1_2009.SEQ MOSCOW_03_2009.SEQ !doscow_33_2010.seq Tver_183_2009_Luno.seq Tver_183_2009J3ronh.seq огельига_13_20io_'.jngSEG OranburgJ 3J2û10_Bronh.SEQ Cfia&ateL92_2ïl1 î.seq VladM>stoK_7_2010.SEC!

Таблица IX. Генетическая дистанция исследуемых штаммов, рассчитанная по полой нуклеотидной последовательности гена NP.

Аналогичные результаты наблюдались при изучении генетической дистанции неструктурных генов (NS1 и NEP). Процент идентичности штаммов A/Orenburg^IIV-13/2010В, A/Orenbur^IV-13/2010L, как и штаммов АЛ1У-Moscow/01/2009(HlNl)swl и A/MoscowЛIV03/2009(HlNl) составляет 100% (Табл. 12). Максимальный процент дивергенции, который составлял 1,2%, наблюдался между штаммом A/Moscow/IIV-33/2010(HlNl), изолированным из носоглоточного смыва больного, и штаммом A/Tver/IIV-183/2009(HlNl)B, выделенным из секционного материала ткани бронхов. Поскольку

неструктурный белок NEP (NS2) является более консервативным по сравнению с вирусным белком NS1, то все исследуемые штаммы были идентичны по своему аминокислотному составу.

1 2 3 4 5 6 7 8 ; 9

1 на 100.0 99.2 99.8 99.5 99.7 99.7 99.5 i 99.5 1

2 0.0 99.2 99.8 99.5 99.7 99.7 99.5 99.5 2 3

3 0.8 0.8 ВИИ 99.1 98.8 98.9 98.9 99.4 99.4 99.7

4 0.2 0.2 0.9 ■■ 99.7 99.8 99.8 99.4 4

5 0.5 0.5 1.2 0.3 99.8 ÔÔ.Ô 99.1 99.1 5

6 0.3 0.3 1.1 0.2 0.2 100.0 99.2 99.2 6

7 0.3 0.3 1.1 0.2 0.2 0.0 ыш 99.2 99.2 7

8 0.5 0.5 0.6 0.6 09 0.8 0.8 99.7 8

9 0.5 0.5 0.3 0.6 0.9 0.8 0.8 0.3 шш 9

1 2 3 4 5 6 7 8 ! 9

MQSCOW_01_20ÛS.SEQ Hoscow_03„2009.S£Q Mt>scow_33_2010.seq TVerjlB3_2009J_img.seq

Tvs'_1B3_2ûi}9_Eion:ij«q

OrentHjrg^13_2010_Lilîig.SEQ Oienburg_13_2ÔW_Bronh.seq Ctie6oc3afy_92_2011 .seq VladuostoK_7_2010.SEQ

Таблица 12. Генетическая дистанция исследуемых штаммов, рассчитанная по полой нуклеотидной последовательности гена NS1.

При анализе нуклеотидной последовательности неструктурного вирусного белка NEP была обнаружена нуклеотидная замена у трёх штаммов: A/Tver/ÏÏV-183/2009(Н1 N1 )В, A/Orenburg/IIV-13/2010В и A/Orenburg/IIV-13/2010L.

При анализе полимеразного гена РА полная идентичность наблюдалась между штаммами A/Moscow/IIV03/2009(HlNl), A/Tver/IIV-183/2009(HlNl)B, A/Tver/IIV-183/2009 (H1N1)L и A/Moscow/IIV01/2009(HlNl). Между штаммами A/Orenburg/IIV-13/2010В, A/Orenburg/IIV-13/2010L также не было никаких различий (Табл. 13).

Percent Identity

i 2 3 4 5 6 7 е 9

1 m 100.0 99.3 100.0 100.0 99.9 99.9 99.6 993 1 :

2 0.0 ВЦ 99.3 100.0 100.0 99.9 99.9 99.6 993 2

3 0.7 0.7 99.3 99-3 99.2 99.2 99.3 99.7 3 j

4 0.0 0.0 0.7 99.9 99.9 99.9 99.5 99.3 4

S 0.0 о.о 0.7 0.1 — 99.9 99.9 99.5 993 5 i

6 0.1 0.1 0.8 0.1 0.1 100.0 99.5 99.3 6 i

7 0.1 0.1 0.3 0.1 0.1 0.0 НИ 99.5 99.3 7

8 0.4 04 0.7 0.5 0.5 0.5 0.5 IB! 99.4 0

9 0.7 0.7 0.3 0.7 0.7 0.7 0.7 0.6 ШЯ 9

1 г 3 4 5 6 7 S 9

Moscow_01_2009.SEQ

Moscow_03_2009.SEQ

fsktscow_33_2010.seQ

Tver_183_2009_ung.seq

Tver_te3_2009_Bronn.seq

Orenburg_13_2010_Uing.SEG

Orenburg_13_2010_Bronh.SEQ

Ctieboks_92_2011.seq

VtaOivostok_7_201O.SEQ

Таблица 13. Генетическая дистанция исследуемых штаммов, рассчитанная по полой нуклеотидной последовательности гена РА.

При анализе другого полимеразного гена (РВ1) полное генетическое

сходство наблюдалось только между первыми штаммами, попавшими на

территорию Российской Федерации: А/ПУ-Мозсо\у/01/2009(НШ1)8\у1 и

А/Мозсо\у/ПУ03/2009(НШ1). Максимальный процент дивергенции был

выявлен между штаммами А/ОгепЬищ/ПУ-13/2010В и

A/Vladivostok/7/2010(HlNl)v и

MJHK"J.< 8

Uoscnw_01,2039.SEQ

Iytr_183_2009_Lunj.ee<i

TyeM83_2009_BlOrih.Stq

Or5ntut9_13_20WJ.un}SEQ

Qr«nburj|_l3_20liLBfCrn.seO

СПеоО>ЗЗГ>'_92_2011.5М

vact/ostoKjjo lo.seo

составлял

_Perce« tae.nfr

0,8% (Табл. 14A).

Ш 0.0 0.6 igojijea.* j 98.7 iii 9S.4 j 99.7" o.a ШШяё* Й.8ТЭ8.6~ ЭЭ.З ] 99 9 89.8199.» 7 99 6 ЯМ5 SSI 8_ 9 39.4

S9.4 99.7

4 0.2 99.6 58.1 99.3

5 0.2 02 ! 0.8 | ОД _о.з Г0.9 I 04^ "аз i 0.9Tо.з аг j o.a 99.8 100.0 93.2 9S.0 ¿52 952 ip

J?_ 0.4 0.4

8__ 5 о.е о.е Toe ! 0.8 0.8 I 1.0 1.0 «9.4

0.6 0.5 | 0.3 i 0.7 0.7] 0.8 0.8 9.6

1 2 i 3 j < 5 L e T.J 8 9

MM«w_01_200S seo

HosMw„03J»OS5£O TvtJI.ieajOOS.Luns.s^ 0rwiwO3_i0l0_LinsSEQ ChefcMssiy_ei_20' 1 Beq

Таблица 14. А.Генетическая дистанция исследуемых штаммов, рассчитанная по полой нуклеотидной последовательности гена РВ1. ».Генетическая дистанция исследуемых штаммов, рассчитанная по полой нуклеотидной последовательности гена РВ2.

Штаммы А/П У-Мозсоту/О 1 /2 О 09(Н 1N1 и

A/Moscow/IIV03/2009(HlNl), так же как штаммы А/ОгепЬш^/ИУ-13/2010В и АУОгепЬиг£Я1У-13/2010Ь при анализе генетического сродства показали полную идентичность аминокислотной последовательности полимеразного белка РВ2(Табл. 14Б).

Максимальный процент дивергенции наблюдался между штаммом А/ПУ-СЬеЬокзагу/92/2011 (НШ1)у и двумя идентичными между собой штаммами АУОгепЬиг^ПУ-13/2010В и А/ОгепЬиг^ПУ-13/2010Ь.

Со всеми аминокислотными последовательностями всех исследуемых штаммов, выровненных относительно штамма, впервые проникшего на территорию России - А/ПУ-Мо5со\у/01/2009(НШ1)81у1, можно ознакомиться в приложении данной работы.

При проведении молекулярно-генетического анализа были получены подтверждения о резистентности исследуемых вирусов к римантадину, а также их чувствительности к озельтамивиру. Был проведён дополнительный анализ для проверки чувствительности к препарату занамивир, к которому все исследуемые штаммы были чувствительны.

выводы.

1. Молекулярно-генетический анализ штаммов пандемического вируса гриппа А(НШ1)рс1т2009, циркулировавших на территории России в период 20092011гг., показал увеличение вариабельности вирусов сезона 2010-2011гг. по сравнению с вирусами, циркулирующими в сезоне 2009-2010гг.

2. У всех пациентов с лёгким и среднетяжёлым течением заболевания в 222-м положении рецепторсвязывающего сайта белка гемагглютинина выявлена аспарагиновая кислота. В тяжёлых случаях заболевания и у пациентов с летальным исходом в 222 положении были выявлены аминокислотные замены на аспарагин, глицин и глутаминовую кислоту.

3. Наличие в 275 позиции белка нейраминидазы аминокислоты гистидин подтверждает чувствительность штаммов вируса пандемического гриппа А(НШ1)рс1т2009 к противовирусному препарату озельтамивир. Выявлены дополнительные аминокислотные замены в гене ОД У24II и №69К, которые не встречались у вирусов, циркулировавших в пандемический период 20092010гг.

4. Наличие.в 31 позиции трансмембранного белка М2 аминокислоты аспарагин подтверждает устойчивость штаммов вируса пандемического гриппа А(Н1Ш)рс1т2009 к препаратам адамантанового ряда. Выявление дополнительных мутаций в гене М (Ю2К, 81311, Б2Ю, Т43А, У52Н, Я54Н) свидетельствует об увеличении изменчивости вируса.

5. Сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей пандемического вируса гриппа А(НШ1)рдш2009, изолированных из разных органов одного больного, показал идентичность всех генов, кроме гена НА, где была обнаружена единичная аминокислотная замена К136И (нумерация по НО).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Львов Д. К., Яшкулов К. Б., Прилипов А. Г., Бурцева Е. И., Щелканов М. Ю., Шляпникова О. В., Поглазов А. Б., Садыкова Г. К., Джамбинов С. Д., Федякина И. Т., Бушкиева Б. Ц., Львов Д. Н., Журавлева М. М.. и др. // Обнаружение аминокислотных замен аспарагиновой кислоты на глицин и аспарагин в рецепторсвязывающем сайте гемагглютинина в вариантах пандемического вируса гриппа A/H1N1 от больных с летальным исходом и со среднетяжелой формой заболевания.// Вопросы вирусологии , 2010г., №3,С.15-18.

2. Львов Д. К., Бурцева Е. И., Прилипов А. Г., Богданова В. С., Щелканов М. Ю., Бовин Н. В., Самохвалов Е. И., Федякина И. Т., Дерябин П. Г., Колобухина Л. В., Штыря Ю. А., Шевченко Е. С., Малышев Н. А., Меркулова Л. Н., Базарова М. В., Маслов А. И., Ищенко Н. М., Исхакова Е. А., Альховский С. В., Гребенникова Т. В., Садыкова Г. К., Львов Д. Н., Журавлева М. М. и др. // Возможная связь летальной пневмонии с мутациями пандемического вируса гриппа A/H1N1 swl в рецепторсвязывающем сайте субъединицы НА1 гемагглютинина.// Вопросы вирусологии 2010, №4, С. 4-9.

3. Lvov D.K., Bovin N.V.,Prilipov A.G.,Bogdanova V.S.,Kolobukhina L.V.,Shchelkanov M.Yu.,Burtseva E.I.,Samokhvalov E.I.,Alkhovsky S.V.,Lavrishcheva V.V.,Malyshev N.A.,Malikov V.E.,Bazarova M.V.,Fedyakina I.T.,Deryabin P.G.,Aliper T.I.,Zaberezhny A.D., Zhuravleva M.M. //HAI recthtor-binding site of A/HlNl/v among patients with lethal and not-lethal outcome in Russia (2009-2011).//Международный союз общества микробиологов 2011, Саппоро.

4. Прилипов А.Г., Журавлева М.М.. Усачев Е.В. // Полная нуклеотидная последовательность генома штамма вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 A/IIV-Moscow/03/2009(HlNl)swl депонирована в GenBank. www.ncbi.nlm.nih.gov. GQ330645 -GQ330652 (28.06.2009).

5. Журавлева М.М.. Прилипов А.Г. // Полная нуклеотидная последовательность генома штамма вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 A/IIV-Tver/2969/2009(HlNl)swl депонирована в GenBank. www.ncbi.nlm.nih.gov. GU451253 -GU451260 (13.01.2010).

6. Журавлева М.М.. Прилипов А.Г. // Полная нуклеотидная последовательность генома штамма вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 A/IIV-Tver/183/2009(HlNl)swl депонирована в GenBank. www.ncbi.nlm.nih.gov. НМ101145 -НМ101152 (12.04.2010).

7. Журавлева М.М.. Прилипов А.Г. // Полная нуклеотидная последовательность генома штамма вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 A/IIV-

Orenburg/13/2010(HlNl)vB депонирована в GenBank. wmv.ncbi.nlm.nih.gov. НМ124380 -НМ124387 (16.04.2010).

8. Шидловский K.M., Журавлева М.М.. Прилипов А.Г. // Полная нуклеотидная последовательность генома штамма вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 A/IIV-C)renburg/l3/2010(HlNl)vL депонирована в GenBank. www.ncbi.nlm.nih.gov. HM 569737 -HM 569744 (17.06.2010).

Журавлева М.М., Прилипов А.Г. // Полная нуклеотидная последовательность генома штамма вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 A/IIV-Moscow/33/20I0(H1N1)v депонирована в GenBank. www.ncbi.nlm.nih.gov. HQ834743 - HQ834750 (28.12.2010).

10. Шидловский K.M., Журавлева М.М.. Прилипов А.Г. // Полная нуклеотидная последовательность генома штамма вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 A/llV-Vladivostok/7/2010(НIN1 )v депонирована в GenBank. www.ncbi.nlm.nih.gov. HQ891279 -HQ891286 (18.01.2011).

Журавлева М.М., Прилипов А.Г. // Полная нуклеотидная последовательность генома пггамма вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 A/iiV-Cheboksary/92/2011 (HlNl)v депонирована в GenBank. ww>v.ncbi.nlm.nih.gov. JN703379, JN703380, JN704790-JN704795 (21.09.2011).

12. в Государственную коллекцию вирусов в соавторстве с Журавлевой М.М. депонировано 55 оригинальных авторских штаммов вирусов пандемического гриппа: №2633-2647; 2661; 2662; 2666; 2671; 2673; 2674; 2676-2684; 2686-2692; 2694-2701; 27032705; 2707-2711; 2714; 2716.

Благодарности.

Благодарю своих научных руководителей: заведующего лабораторией к.б.н. Прилипова А.Г. и д.м.н, профессора Дерябина П.Г. за всестороннюю помощь и внимание к работе. Выражаю благодарность и признательность директору ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России академику РАМН Львову Д.К. за предоставленную возможность проведения исследований и руководство данной работой. Отдельную благодарность автор выражает д.м.н. Бурцевой Е.И. за помощь и сотрудничество при выполнении работы, а также ценные замечания и рекомендации при оформлении диссертации. Автор приносит благодарность своим коллегам: Самохвалову Е.И., Альховскому C.B., Колобухиной Л.В. и Щелканову М.Ю. , а также всему коллективу лаборатории молекулярной генетики, в тесном сотрудничестве с которым была выполнена данная работа.

Заказ № 296. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.(499)250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Журавлева, Марина Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРОЕНИЯ ВИРУСНОЙ ЧАСТИЦЫ.

I 1 1 Классификация

I 1 2 Строение вирусной частицы

I 1 3 Структура генома вируса гриппа А

I 1 4 Репликация вируса гриппа

I 1 5 Белки вируса гриппа и их функциональные особенности

1.1.5.1 РНК-полимеразный комплекс.

1.1.5.2 РВ1.

1.1.5.3 РВ2.

1.1.5.4 РА.

1.1.5.5 Гемагглютинин.

1.1.5.6 Нуклеопротеин.

1.1.5.7 Нейраминидаза.

1.1.5.8 Матриксный (М1) и трансмембранный белок (М2).

1.1.5.9 Неструктурные белки: NS1 и NS2.

1.2 ХАРАКТЕРИСТИКА ПАНДЕМИЧЕСКОГО ГРИППА А ПОДТИПА H1N1.

I 2 1 Происхождение пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm

122 Эпидемиологические особенности вируса гриппа А подтипа H1N

123 Клиническая картина пандемического гриппа A(H1N1)pdm

1.3 ПРОТИВОВИРУСНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА.

I 31 Арбидол

I 3 2 Амантадин и римантадин

I 3 3 Занамивир и озельтамивир

I 3 4 Чувствительность пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm2009 к противовирусным лекарственным препаратам

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

11.1 Сбор клинического материала для исследования.

11.2 Выделение РНК.

11.3 Реакция обратной транскрипции.

11.4 Олигонуклеотиды, использованные в экспериментах.

11.5 Проведение полимеразной цепной реакции.

Н.6 Клонирование фрагментов концевых областей генома.

II 6 1 Получение рекомбинантных плазмид

II 6 2 Приготовление компетентных клеток

II 6 3 Трансформация клеток плазмидной ДНК

II 6 4 Селекция плазмид, несущих последовательности фрагментов гена гемагглютинина

II 6 5 Выделение плазмидной ДНК

11.7 Электрофорез ДНК.

11.8 Приготовление ДНК для секвенирования.

11.9 Секвенирование ДНК.

11.10 Построение алайнментов и филогенетический анализ.

11.11 Анализируемые штаммы из базы данных GenBank.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

111.1 ИССЛЕДОВАНИЕ УЧАСТКОВ ГЕНОВ.

III 1 1 Молекулярно-генетический анализ участка гена НА 73 III 1 2 Анализ последовательностей участка гена НА и выявление дополнительных мутаций 81 III 1 3 Молекулярно-генетический анализ участка гена NA 84 III 1 4 Анализ последовательностей участка гена NA на предмет выявления потенциальных маркеров устойчивости к противовирусным лекарственным препаратам 89 III 1 5 Молекулярно-генетический анализ участка гена М 91 III 1 6 Анализ последовательностей участка гена М на предмет выявления потенциальных маркеров устойчивости к противовирусным лекарственным препаратам

111.2 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПАНДЕМИЧЕСКОГО ВИРУСА ГРИППА A(H1N1)pdm2009.

III 2 1 Анализ полной нуклеотидной последовательности генома вируса пандемического гриппа A(H1N1)pdm

III 2 2 Филогенетические взаимоотношения исследуемых вирусов

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

V. ВЫВОДЫ.

VI. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИИ СПИСОК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая характеристика пандемического вируса гриппа А подтипа H1N1, циркулировавшего на территории Российской Федерации на протяжении сезонов 2009-2011гг."

В связи с тем, что вирус гриппа в процессе эволюции приобретает значительные изменения, молекулярно-генетеческие методы являются основным звеном методов диагностики заболевания. Проведение ПНР и дальнейшего секвенирования позволяют не только определить наличие генетического материала вируса в исследуемой пробе, но и детектировать принадлежность вируса к тому или иному подтипу, а также проследить эволюционную изменчивость, циркулирующего штамма.

В апреле 2009 года в Мексике и США были зарегистрированы случаи инфицирования человека ранее не описанным вирусом гриппа А(НШ1)рёт2009, подобному свиному [39]. На протяжении следующих нескольких месяцев произошёл подъём заболеваемости в вышеупомянутых странах, а также распространение нового вируса гриппа А в страны Европы, Азии и Австралию. 21 мая 2009 года из носоглоточного смыва больного, прибывшего из США в Россию, была выделена РНК вируса гриппа, и методом ПЦР в реальном времени был детектирован пандемический вариант вируса гриппа А(Н1Ш)рс1т2009. Это был первый лабораторно подтверждённый случай инфицирования на территории Российской Федерации [18].

Изучение нового варианта вируса гриппа А(НШ1)рс1т2009 молекулярно-генетическими методами показало наличие в геноме вируса уникальных комбинаций генов различного происхождения. Было доказано, что вирус пандемического гриппа А(НШ1)рёш2009 мигрировал из популяции свиней и является тройным реассортантом [68] Также генетический анализ показал, что гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и белки (1МР, N8), произошли от вирусов классического гриппа свиней, нейраминидаза (ИА) и ген М, кодирующий два белка, - от вирусов гриппа свиней евроазиатской линии, полимеразные белки РВ2 и РА - от вирусов гриппа птиц, а белок РВ1 - от вирусов гриппа человека [68].

Анализ нуклеотидной последовательности участка гена М, кодирующего трансмембранный белок М2 штамма А/ПУ-Мо8со\у/01/2009(Н1Ш)8ш1, выявил резистентность вируса к римантадину, а молекулярно-генетический анализ частичной нуклеотидной последовательности гена ЫА - чувствительность к озельтамивиру.

Современные методы позволяют получить полную нуклеотидную последовательность из клинического материала без предварительной подготовки. Данные полученные таким способом являются наиболее значимыми, поскольку в случае подготовки образцов для получения полноразмерных геномов вирус пассируют на клетках МБСК или РКЭ, что ведёт к накоплению мутаций.

Для достижения вышеописанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить частичную нуклеотидную последовательность гена НА пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, провести сравнительный анализ и выявить аминокислотные замены, способные влиять на рецепторную специфичность.

4. Определить полную нуклеотидную последовательность 7 штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, циркулировавших на территории России в период 2009-2011гг. и провести сравнительный анализ с первым появившимся в России пандемическим вирусом гриппа A(HlNl)pdm2009.

Научная новизна.

Впервые были выявлены и проанализированы аминокислотные замены в трёх белках (М2, NA и НА) пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm 2009-2011 гг. на большой выборке проб из Российской Федерации.

Впервые были подобраны праймеры и разработана собственная схема амплификации, позволяющая получить фрагменты трёх генов для детекции маркеров чувствительности к противовирусным препаратам (для генов М и 8 ~

NA) и рецепторной специфичности (для гена НА) пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, а также получать полные нуклеотидные последовательности всех 8 сегментов генома вируса. Следует отметить, что разработанная схема амплификации позволяет использовать не только пробы вируса с высоким титром, но и РНК, выделенную из клинического материала.

Впервые был проведён сравнительный анализ рецепторсвязывающего сайта гемагглютинина в первичной пробе (носоглоточный смыв) и в пробе, взятой после смерти на примере двух случаев заболевания.

Впервые в международную базу GenBank были заложены реперные штаммы для дальнейшего анализа изменчивости вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 на территории России.

Впервые в России проведена исследовательская работа по сравнению полных геномов вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, выделенных из разных органов одного человека.

Практическая значимость.

Разработанная схема амплификации и определения нуклеотидной последовательности участков генов, кодирующих синтез трансмембранного белка М2 и фермента нейраминидазы, используется для мониторинга чувствительности пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009 к противовирусным препаратам: блокаторам белка М2 и ингибиторам нейраминидазы. Полученные данные следует учитывать при составлении рекомендаций по лечению больных, инфицированных пандемическим вирусом гриппа A(HlNl)pdm2009.

Мониторинг аминокислотных замен в генах М, NA и НА штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, циркулировавших на территории Российской Федерации на протяжении 2009-2011гг., позволяет определить направление изменчивости вируса и использовать полученные данные при составлении рекомендаций по составу гриппозных вакцин, а также диагностических препаратов.

Полные нуклеотидные последовательности штаммов вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009, исследуемые в работе, были депонированы базу данных GenBank. Также данные молекулярно-генетического исследования были учтены при депонировании штаммов пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. Последовательности данных штаммов могут быть использованы как реперные точки для мониторинга направления изменчивости вируса на территории России.

Основные положения, выносимые на защиту.

3. На протяжении двух пандемических сезонов сохраняется резистентность вируса A(HlNl)pdm2009 к противовирусным препаратам римантадин и амантадин и чувствительность к озельтамивиру.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Журавлева, Марина Михайловна

V. выводы.

1. Молекулярно-генетический анализ штаммов пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, циркулировавших на территории России в период 2009-2011гг., показал увеличение вариабельности вирусов сезона 2010-2011гг. по сравнению с вирусами, циркулирующими в сезоне 20092010гг.

3. Наличие в 275 позиции белка нейраминидазы аминокислоты гистидин подтверждает чувствительность штаммов вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 к противовирусному препарату озельтамивир. Выявлены дополнительные аминокислотные замены в гене NA V241I и N369K, которые не встречались у вирусов, циркулировавших в пандемический период 2009-2010гг.

4. Наличие в 31 позиции трансмембранного белка М2 аминокислоты аспарагин подтверждает устойчивость штаммов вируса пандемического гриппа A(HlNl)pdm2009 к препаратам адамантанового ряда. Выявление дополнительных мутаций в гене М (R12K, S13R, D21G, Т43А, Y52H, R54H) свидетельствует об увеличении изменчивости вируса.

5. Сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей пандемического вируса гриппа A(HlNl)pdm2009, изолированных из разных органов одного больного, показал идентичность всех генов, кроме гена НА, где была обнаружена единичная аминокислотная замена K136N (нумерация по НА0).

Благодарности.

Благодарю своих научных руководителей: заведующего лабораторией к.б.н. Прилипова А.Г. и д.м.н, профессора Дерябина П.Г. за всестороннюю помощь и внимание к работе. Выражаю благодарность и признательность директору ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России академику РАМН Львову Д.К. за предоставленную возможность проведения исследований и руководство данной работой. Отдельную благодарность автор выражает д.м.н. Бурцевой Е.И. за помощь и сотрудничество при выполнении работы, а также ценные замечания и рекомендации при оформлении диссертации. Автор приносит благодарность своим коллегам: Самохвалову Е.И., Альховскому C.B., Колобухиной J1.B. и Щелканову М.Ю., а также всему коллективу лаборатории молекулярной генетики, в тесном сотрудничестве с которым была выполнена данная работа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Журавлева, Марина Михайловна, Москва

1. Букринская А.Г. // Вирусология.// Москва. Изд. «Медицина». -1986, С. 274288.

2. Бурцева Е.И., Шевченко Е.С., Ленева И.А. и др. // Чувствительность к ремантадину и арбидолу вирусов гриппа, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в России в сезоне 2004-2005 г.г. // Вопросы вирусологии.-2007.-№2.-С. 24-29.

3. Гагаринова В.М., Игнатьева Г.С., Синицкая Л.В. и др. // Новый химиопрепарат арбидол: профилактическая эффективность во время эпидемии гриппа. // ЖМЭИ. 1993. - №5. - С. 40 - 43.

4. Глушков Р.Г., Фадеева Н.И., Ленева И.А. и др. // Молекулярно -биологические особенности действия арбидола нового противовирусного препарата. // Хим. - фарм. журн. - 1992. - №2. - С. 8 - 15.

5. Гуськова Т.А., Глушков Р.Г. // Арбидол (иммуномодулятор, индуктор интерферона, антиоксидант) // УХЛС — ВНИХФИ. М.,-2001. С.28.

6. Жданов В. М. // Эволюция вирусов.// М.: Медицина, -1990. - С.356.(2).

7. Каверин Н.В., Львов Д.К. // Ортомиксовирусы (Orthomyxoviridae).// Медицинская вирусология: Руководство / Под. ред. Д.К.Львова. М.ЮОО «Медицинское информационное агентство», -2008. - С.176 - 183.

8. Карпухин Г.И., Швецова Е.Г., Малышева A.M. // Итоги многолетнего опыта изучения эффективности экстренной профилактики гриппа ремантадином в эпидемиологических наблюдениях. // Проблемы гриппа и ОРЗ. — Л., -1979. — С. 24-28.

9. Колобухина Л.В., Львов Д.К., Бурцева Е.И. // Грипп.// Медицинская вирусология: Руководство / Под. ред. Д.К.Львова. М.ЮОО «Медицинское информационное агентство», -2008, - С.382 - 393.

10. Кубарь О.И., Степанова Л.А., Сафонова Л.С. и др. // Клиническая аппликация иммуномодулирующих свойств арбидола при ОРВИ. // Тезисы доклада IV Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство», 1997. -С.269.

11. Ленева И.А., Глушков Р.Г., Гуськова Т.А. Лекарственные средства для химиотерапии и химиопрофилактики гриппа: особенности механизма действия, эффективность и безопасность (обзор)//Химико-фармацевтический журнал.-2004. -Т.38. -№11. -С.8-14.

12. Ленева И.А., Гуськова Т.А. //Арбидол эффективный препарат для лечения и профилактики гриппа и ОРВИ: обзор результатов клинических исследований// Рус.мед.жерн.-2008.-Т.16,№29. - С. 1972-1976.

13. Ленева И.А., Федякина И.Т., Еропкин М.Ю. и др. // Изучение противовирусной активности отечественных противогриппозных химиопрепаратов в культуре клеток и на модели животных // вопр. Вирусологии // -2010г., №3, С. 19-27.

14. Львов Д. К., Бурцева Е. И., Колобухина Л. В., Прилипов А. Г., Щелканов М. Ю. // Новая пандемия 2009 года и её контроль. // Вопросы вирусологии -2009, №3 С.54-56.

15. Львов Д.К. // Рождение и становление вирусологии. // Медицинская вирусология: Руководство / Под. ред. Д.К.Львова. М.ЮОО «Медицинское информационное агентство», -2008. - С. 15 - 20.

16. Малый В.П., Романцов М.Г., Сологуб Т.В. // Грипп, пособие для врачей // -2007, С. 84.

17. Минздравсоцразвития РФ // Письмо от 30 июня 2009. // Интернет ресурс №240/10/1-4053http://base.consultant.ru/cons/cgi/online. cgi?req=doc;base=EXP;n=467562

18. Обросова-Серова Н. П., Бурцева Е. И., Невский И. М. и др. // Изучение защитного действия арбидола во время подъема респираторных заболеваний в 1990 г. // Вопросы вирусол. 1991. - № 5. - С.380 - 381.

19. Онищенко Г.Г., Шестопалов A.M., Терновой В.А., Евсеенко В.А., Дурымацов

20. A.Г., Рассадкин У.Н., Зайковская А.В., Золотых С.И., Юрлов А.К., Михеев

21. B.Н., Нетесов С.В., Дроздов И.Г. // Изучение высокопатогенных вирусов гриппа H5N1 изолированных от больных и мертвых птиц в Западной Сибири. // Микробиол. Эпидемиол. и Биотехнол. -2006, №5, С. 47-54.

22. Чучалин А.Г. // Опыт лечения пневмоний в эпидемический сезон заболевания гриппом A/H1N1. // Внебольничная пневмония у взрослых. Под ред. Чучалина А.Г., Синопальникова А.И. М.: Атмосфера,- 2010.

23. Abed Y., Baz М., Bovin G. // Impact of neuraminidase mutations conferring influenza resistance to neuraminidase inhibitors in the N1 and N2 genetic backgrounds. // Antivir. Ther. 2006. - Vol. 11.- P.971 - 976.

24. Ali A., Avalos R.T., Ponimaskin E. et al. // Influenza virus assembly: effect of influenza virus glycoproteins on the membrane association of Ml protein. // J. Virol. 2000. - Vol. 74. - P. 8709-8719.

25. Area E., Martín-Benito J., Gastaminza P., Torreira E., Valpuesta J.M., Carrascosa J.L., Ortín J. // 3D structure of the influenza virus polymerase complex: localization of subunit domains. // Proc Natl. Acad. Sci. -2004, Vol. 101, P. 308-313.

26. Biswas S.K, Nayak D.P. // Mutational analysis of the conserved motifs of influenza A virus polymerase basic protein 1. // J Virol -1994; Vol. 68(3), P. 1819-1826.

27. Blaas D., Patzelt E., Kuechler E. // Identification of the cap binding protein of influenza virus. //Nucleic Acids Res. -1982, Vol.10, P.4803-4812.

28. Braam J, Ulmanen I, Krug R.M. // Molecular model of a eucaryotic transcription complex: functions and movements of influenza P proteins during capped RNA-primed transcription.// Cell. -1983, Vol.34, P.609-618.

29. Brand C.M., Skehel J.J. // Crystalline antigen from the influenza virus envelope. // -Nat. New Biol. -1972, Vol.238, P.145-147.

30. Bukrinskaya A.G., Vorkunova N.K., Kornilayeva G.V. // Influenza virus uncoating in infected cells and effect of rimantadine.// J. Gen. Virol. 1982. - Vol.60. - P. 49 -59.

31. Chen G. and Shih S. // Genomic Signatures of Infl uenza A Pandemic (H1N1) 2009 Virus, Emerging Infectious Diseases. // -2009, Vol. 15, No. 12, P. 1897-1903.

32. Chen W, Calvo P.A, Malide D, et al. // A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. //Nat Med -2001; Vol. 7(12), P. 1306-1312.

33. Colman P.M. // Influenza virus neuraminidase: structure, antibodies, and inhibitors. // Protein Sci. -1994, Vol.3, P.1687-1696.

34. Compans R.W., Content J., Duesberg P.H. // Structure of the ribonucleoprotein of influenza virus. // J. Virol. -1972, Vol. 10, P.795-800.

35. Cross K. J., Burleigh L. M., Steinhauer D. A. // Mechanism of cell entry by influenza viruses // Expert review in molecular medicine. 2001. Available at http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk.

36. Crumpacker C. // Antiviral therapy. // In: Knipe D.M., Howley P.M., eds. Fields virology.4th ed.Philadelphia: Lippincott Williams&Williams, 2001

37. Dawood F.S., Jain S., Finelli L., et all. // Emergence of a novel swine-original influenza A(H1N1) virus in humans. // N. Engl. J. Med. -2009.-Vol.360. P.2605-2615.

38. Deng T., Sharps J., Fodor E., Brownlee G.G. // In vitro assembly of PB2 with a PB1-PA dimer supports a new model of assembly of influenza A virus polymerase subunits into a functional trimeric complex. // J. Virol. -2005, 79, P.8669-8674.

39. Deyde V.M., Xu X., Bright R.A. et al. // Surveillance of resistance to adamantanes among influenza A(H3N2) and A(H1N1) viruses isolated worldwide // J. Infect. Dis.- 2007. -Vol. 196.-P.249-257.

40. Dias A., Bouvier D., Crepin T., McCarthy A.A., Hart D.J., Baudin F., Cusack S., Ruigrok R.W. // The cap-snatching endonuclease of influenza virus polymerase resides in the PA subunit. // Nature. -2009, Vol.458, P.914-918.

41. Dowdle W.R. //Influenza A virus recycling revisited. // Bull. World Health Organ. -1999. Vol.77.-P.820- 8.

42. Fauquet C. M., Mayo M. A., Maniloff J., et al. // Virus taxonomy, eighth report // Elsevier. 2005. - P. 681 -693.

43. Fodor E., Smith M. // The PA subunit is required for efficient nuclear accumulation of the PB1 subunit of the influenza A virus RNA polymerase complex. // J. Virol. -2004, Vol.78, P.9144-9153.

44. Fräser C., Donnelly C.A., Cauchemez S. et all // Pandemic potential of a strain of influenza A(H1N1): early findings. // Science.-2009. Vol.324. P. 1557-1561.

45. Gambarian F.,yamnikova S., Lvov D. et all Receptor specificity of influenza virus from birds and mammalians: new data in involvement of the inner fragments of the carboxylate chain //Virology. 2005. Vol.3334 -P.276-283.

46. Gerhard W., Yewdell J., Frankel M. In. //Structure and Variation in Influenza Virus.//N. Y. Elsevier. 1980, P.273-280.

47. Gibbs M.J., Gibbs A.J.// Molecular virology: was the 1918 pandemic caused by a bird flu // Nature. 2006. - Vol. 440. P. 9-10.

48. Goldsmith C. S., Balish A.// CDC Atlanta //(http://www.cdc.gov/media/subtopic/library/diseases.htm.

49. Gomez-Puertas P., Albo C., Perez-Pastrana E., Vivo A., Portela A. //Influenza virus matrix protein is the major driving force in virus budding.// J. Virol. 2000, Vol. 7, 11538-11547.

50. Gonzalez S., Ortin J. //Characterization of influenza virus PB1 protein binding to viral RNA: two separate regions of the protein contribute to the interaction domain.// J. Virol. 1999, Vol. 73, P.631-637.

51. Hagen M., Chung T.D., Butcher J.A., Krystal M. //Recombinant influenza virus polymerase: requirement of both 5'and 3' viral ends for endonuclease activity.// J. Virol. 1994, Vol. 68, P.1509-1515.

52. Harper D. //Influenza. Online Etymology Dictionary // 2001.Available at http://www.etymonline.com/index.php?search=influenza&searchmode=none

53. Hay den F. //WHO guidelines on the use of vaccines and antivirals during influenza Annex 5-Considerations of the use of antivirals during influenza pandemic.// Geneva 2002, 2-40ct.

54. Hirsch A. //Handbook of Geographical and Historical Pathology.// London: New Sydenham Society, 1883.http://www.etymonline.com/index.php?search=influenza&searchmode=none

55. Hoffman F. -La Roche Ltd. //Product Monograph: Tamiflu.// Ontario (Canada), 2004.

56. Huang R.T., Wahn K., Klenk H.D., Rott R. //Fusion between cell membrane and liposomes containing the glycoproteins of influenza virus. //Virology. 1980, Vol. 104, P.294-302

57. Huarte M., Falcon A., Nakaya Y., Ortin J., Garcia-Sastre A., Nieto A. //Threonine 157 of influenza virus PA polymerase subunit modulates RNA replication in infectious viruses. //J. Virol. 2003, Vol. 77, P.6007-6013.

58. Hurt AC, Holien JK, Parker M, Kelso A, Barr IG. //Zanamivir-Resistant Influenza Viruses with a Novel Neuraminidase Mutation. //J Virol. 2009; Vol. 83:10366-73.

59. Ilyushina N. A, Khalenkov A. M., Seilerl J. P, Forrest H. L., Bovin N. V., Jefferson T., Deeks J.J., Demicheli V. //Amantadine and rimantadine for preventing and treating influenza A in adults. // Cochrane Database Syst. Rev. 2006. - Vol.2.

60. Kawaoka Y., Webster R.G. //Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1988, Vol. 85, 324-328.

61. Kell W., Niemann H., Schwars R.T., Klenk H.D. //Carbohydrates of influenza virus. V. Oligosaccharides attached to individual glycosylation sites of the hemagglutinin of fowl plaque virus. //Virology. 1984, Vol. 133, P.77-91.

62. Kingsford C., N.Nagarajan, S.L. Salzberg. //2009 Swine-Origin Influenza A (H1N1) Resembles Previous Influenza Isolates.// -2009, Vol. 4, Is. 7.

63. Kiso M., Mitamura K., Sakai-Tagama Y. et al. //Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study // Lancet.- 2004.-Vol.364, P.759-765.

64. Klenk H.D., Compans R.W., Choppin W.P. //An electron microscopic study of the presence or absence of neuraminic acid in enveloped viruses. //Virology. 1970, Vol. 42,P. 1158-1162.

65. Klenk H.D., Garten W. //Host cell proteases controlling virus pathogenicity.// Trends. Microbiol. 1994, Vol. 2, 39-43.

66. Klenk H.D., Rott R., Orlich M., Biodorn J. //Activation of influenza A viruses by trypsin treatment. //Virology. 1975, Vol. 68, 426-439.

67. Klumpp K., Ruigrok R.W.H., Baudin F. //Roles of the influenza virus polymerase and nucleoprotein in forming a functional RNP structure // The EMBO Journal. -1997.- Vol.16.-P.1248-1257.

68. Krug R.M., Etkind P.R. //Cytoplasmic and nuclear virus-specific proteins in influenza virus-infected MDCK cells. //Virology. 1973, Vol. 56, P.334-348.

69. Krug R.M., Soeiro R. //Studies on the intranuclear localization of influenza virus-specific proteins. //Virology. 1975, Vol. 64, P.378-387.

70. Lamb R.A., Choppin P.W. //The gene structure and replication of influenza virus. //Ann. Rev. Biochem. 1983, Vol. 52, P.467-506.

71. Lamb R.A., Krug R.M. //Orthomyxoviridae. In: Fields Virology. Section 2, Specific Virus Families. //Eds B.N. Fields and D.M. Knipe, Lippincott, Williams & Wilkins, 2001, P.1091-1137.

72. Lamb R.A., Lai C.J. //Conservation of the influenza virus membrane protein (Ml) amino acid sequence and an open reading frame of RNA segment 7 encoding a second protein (M2) in H1N1 and H3N2 strains. //Virology. 1981, Vol. 112, P.746-751.

73. Laver W.G., Air G.M., Webster R.G. //Mechanism of antigenic drift in influenza virus. Amino acid sequence changes in an antigenically active region of Hong Kong (H3N2) influenza virus hemagglutinin. //J. Mol. Biol. 1981, Vol. 145, P.339-361.

74. Lazarowitz S.G., Compans R.W., Choppin P.W. //Influenza virus structural and nonstructural proteins in infected cells and their plasma membranes.// Virology. 1971, Vol.46, P.830-843.

75. Li M.L., Ramirez B.C., Krug R.M. //RNA-dependent activation of primer RNA production by influenza virus polymerase: different regions of the same protein subunit constitute the two required RNA-binding sites. //EMBO J. 1998, Vol. 17, P.5844-5852.

76. Li M.L., Rao P., Krug R.M. //The active sites of the influenza cap-dependent endonuclease are on different polymerase subunits. //EMBO J. 2001, Vol. 20, P.2078-2086.

77. Lu Y., Qian X.Y., Krug R.M. //The influenza virus NS1 protein: a novel inhibitor of pre-mRNA splicing.// Genes. Dev. 1994, Vol. 8, P. 1817-1828.

78. Maeda Y., Horimoto T., Kawaoka Y. //Classification and genome structure of influenza virus. //Nippon Rinsho. 2003, Vol.61, P. 1886-1891.

79. Marjuki H., Barman S., Webster R. G. and Webby R. J. //Adaptation of Pandemic H1N1 Influenza Viruses in Mice// JOURNAL OF VIROLOGY, 2010.P. 86078616.

80. Marra F., Marra C.A., Stiver H.G. //A case for rimantadine to be merketed in Canada for prophylaxis of influenza A virus infection. // Can. Respir. J. 2003. -Vol. 10(7).- P. 381 -388.

81. Martin K., Helenius A.// Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (Ml) promotes export and inhibits import. //Cell. 1991, Vol. 67, P.117-130.

82. Meindl P., Bodo G., Palese P. et.al. //Inhibition of neuraminidase activity by derivatives of 2-deoxy-2,3-dehydro-A^-acetylneuraminic acid. // Virology. 1974. -Vol.58(2). - P. 457-463.

83. Monto A.S., McKimm-Breschin J., Macken C. et al. //Detection of influenza viruses resistant to neuraminidase inhibitors in global surveillance during the first 3years of their use//Antimocbob. Agents Chemother.-2006.-Vol.50(7).-P.2395-2402.126 ~

84. Mosley V. M., and Wycoff R. W. G. //Electron microscopy of the virus of influenza // Nature. 1946. - Vol. 157. - P. 263.

85. Naffakh N., Massin P., van der Werf S. //The transcription/ replication activity of the polymerase of influenza A viruses is not correlated with the level of proteolysis induced by the PA subunit. //Virology 2001, Vol. 285, P.244-252.

86. Nakajima K. //Influenza virus genome structure and encoded proteins. //Nippon Rinsho. 1997, Vol. 55, P.2542-2546.

87. Oxford J.S., Lambkin R. //Targeting influenza virus neuraminidase a new strategy for antiviral therapy // Drug Discover Today. - 1998. - N 3. - P. 448-456.

88. Ozawa M., Basnet S., Burley L. M., Neumann G., Hatta M. and Kawaoka Y.

89. Impact of Amino Acid Mutations in PB2, PB1-F2, and NS1 on the Replication127 ~and Pathogenicity of Pandemic (H1N1) 2009 Influenza Viruses// J. OF VIROLOGY -2011, Vol. 85, № 9, P. 4596-4601.

90. Palache A.M. //Influenza vaccines. A reappraisal of their use // Drugs. 1997. -V. 54,-N6.-P. 841-856.

91. Palese P., Tobita K., Ueda M., Compans R.W. //Characterization of temperature sensitive influenza virus mutants defective in neuraminidase. //Virology. 1974, Vol.61, P.397-410.

92. Paul M.V., Estelle Martin-Granel //500-year Evolution of the Term Epidemic // Emerging Infectious Diseases.- 2006.-Vol. 12.-P.976-980.

93. Pinto L., Holsinger L.J., Lamb R.A. //Influenza virus M2 protein has ion channel activity. // Cell. 1992. - Vol.69. - P. 517 - 528.

94. Pinto L.H., Lamb R.A. //Controlling influenza virus replication by inhibiting its proton channel.//Mol.BioSyst.- 2007,- Vol.3.- P. 18-23.

95. Potdar V. A., Chadha M. S., Jadhav S. M., Mullick J.,. Cherian S. S, Mishra A. C.// Genetic Characterization of the Influenza A Pandemic (H1N1) 2009 Virus Isolates from India// www.plosone.org, -2010.V. 5,1. 3.

96. Potter C.W. //A history of influenza.//Journal of Applied Microbiology.-2001.-Vol.91.-P.572-579.

97. Privalsky M.L., //Penhoet E.E. The structure and synthesis of influenza virus phosphoproteins. //J. Biol. Chem. 1981, Vol. 256, P.5368-5376.

98. Pyle G.F. //The Diffusion of Influenza: Patterns and Paradigms.// New Jersey: Rowan & Littlefield, 1986.

99. Qian X.Y., Alonso-Caplen F., Krug R.M. //Two functional domains of theinfluenza virus NS1 protein are required for regulation of nuclear export of mRNA.

100. J. Virol. 1994, Vol.68, P.2433-2441.128 ~

101. Qiu Y., Krug R.M. //The influenza virus NS1 protein is a poly(A)-binding protein that inhibits nuclear export of mRNAs containing poly(A). //J. Virol. 1994, Vol.68, P.2425-2432.

102. Qiu Y., Nemeroff M., Krug R.M. //The influenza virus NS1 protein binds to a specific region in human U6 snRNA and inhibits U6-U2 and U6-U4 snRNA interactions during splicing. // RNA. 1995, Vol. 1, P.304-316.

103. Saito R., Sakai T., Sato I. et al. // Frequency of amantadine-resistant influenza A viruses during two seasons featuring cocirculation of H1N1 and H3N2. // J.Clin.Microbiol.-2003.-Vol.41, P.2164-2165.

104. Sakaguchi T., Laser G.P., Lamb R.A. // The ion channel activity of the influenza virus M2 protein affects transport through the Golgi apparatus. // J. Cell Biol. 1996. - Vol.133. - P. 733 - 747.

105. Sanz-Ezquerro J.J., de la Luna S., Ortin J., Nieto A. // Individual expression of influenza virus PA protein induces degradation of coexpressed proteins. // J. Virol. 1995, Vol. 69, P.2420-2426.

106. Schmitt A.P., Lamb R.A. //Influenza virus assembly and budding at the viral budozone. // Adv. Virus. Res. 2005. Vol. 64. - P. 383-416.

107. Schulman J.L., Palese P. // Virulence factors of influenza A viruses: WSN virus neuraminidase required for plaque production in MDBK cells. //J Virol. 1977, Vol. 24, P.170-176.

108. Shinde V, Bridges CB, Uyeki TM, Shu B, Balish A, et al. (2009) // Triple-Reassortant Swine Influenza A (HI) in Humans in the United States, 2005-2009. // N Engl J Med -2009; Vol.360, P.2616-2625.

109. Skehel J.J. // Polypeptide synthesis in influenza virus-infected cells. //Virology. 1972, Vol. 49, P.23-36.

110. Skehel J.J., Waterfields M.D. // Studies on primary structure of the influenza virus hemagglutinin. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1975, Vol. 72, P.93-97.

111. Smith W., Andrewes C.H., Laidlaw P.P. // A virus obtained from influenza patients.//Lancet. -1933.-Vol. 1 -P.266-68.

112. Sreta D, Kedkovid R, Tuamsang S, Kitikoon P, Thanawongnuwech R // Pathogenesis of swine influenza virus (Thai isolates) in weanling pigs: an experimental trial. // Virol J 2009, Vol. 6.

113. Sugiura A., Ueda M. // Neurovirulence of recombinants between virulent and avirulent virus strains. // Virology. 1980, Vol. 101, P.440-449.

114. Taubenberger J.K., Reid A.H., Krafft A.E. et al. // Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus. //Science 1997.-Vol.275.-P.1793-1796.

115. Taubenberger J.K., Reid AH, Lourens R.M., Wang R. et.al. // Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes.// Nature. 2005. - Vol.437. - P.889-893.

116. Update: Novel influenza A (H1N1) virus infections world-wide, May 6, -2009. // Morbid. Mortal. Wkly Rep. (MMWR). // -2009. -Vol. 58, N 17. P.453-457.

117. Varghese J.N., Laver W.G., Colman P.M. // Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9 A resolution.// Nature. 1983, Vol. 303, P.35-40.

118. Veit M., Kretzschmar E., Kuroda K., Garten W., Schmidt M.F., Klenk H.D.,

119. Rott R. // Site-specific mutagenesis identifies three cysteine residues in the130 ~cytoplasmic tail as acylation sites of influenza virus hemagglutinin. // J. Virol. 1991, Vol. 65, P.2491-2500.

120. Walsh E.E., Cox C., Falsey A.R. // Clinical features of influenza A virus infection in older hospitalized persons. // J. Am. Geriatr. Soc. 2002. - Vol.50. - P. 1498 - 1503.

121. Wang C., Lamb R. A., Pinto L. H. // Activation of the M2 ion channel of influenza virus: a role for the transmembrane domain histidine residue. // Biophys. J. 1995.-Vol. 69. - P.1363-1371.

122. Weaver E. A, Rubrum A. M., Webby R. J., Barry M. A. // Protection against Divergent Influenza H1N1 Virus by a Centralized Influenza Hemagglutinin// -2011, Vol. 6, Is. 3.

123. Wiley D.C., Wilson I.A., Skehel J.J. // Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza hemagglutinin and their involvement in antigenic variation. //Nature. 1981, Vol. 289, P.373-378.

124. Wilson I.A., Skehel J.J., Wiley D.C. // Structure of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A resolution. // Nature. 1981, Vol. 289, P.366-373.

125. World Health Organization. // Fact sheet Avian Influenza. 2006 February; Available at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/avianinfluenza/en/

126. World Health Organization. // Fact sheet №211// March 2003, document available at. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/

127. World Health Organization. // WHO consultation on priority public health interventions before and during an influenza pandemic.//WHO, Geneva, March 2004, document available at http ://www. who. int/csr/disease/avianinfluenza/ final .pdf

128. Yen H., Herlocher L.M., Hoffman E. et al. // Neuraminidase inhibitor-resistant influenza viruses may differ substantially in fitness and transmissibility//Antimicro. Agents and Chemother.-2005.-Vol.49(10).-P.4075-4084.

129. Zhang Y., Lin X., Zhang F., Wu J., Tan W., Bi Sh, Zhou J, Shu Y., Wang Y. //Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics// Virology.-2010, Vol.5 (2).

130. Zhirnov O.P. // Isolation of matrix protein Ml from influenza viruses by acid -dependent extraction with nonionic detergent. // Virology. 1992. - Vol.186. - P. 324-330.

131. Zhou NN, Senne DA, Landgraf JS, Swenson SL, Erickson G, et al. // Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs. // J Virol 1999, Vol. 73, P. 8851-8856.

Информация о работе

Журавлева, Марина Михайловна
кандидата медицинских наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.02

Диссертация

Молекулярно-генетическая характеристика пандемического вируса гриппа А подтипа H1N1, циркулировавшего на территории Российской Федерации на протяжении сезонов 2009-2011гг. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы