Эволюционная изменчивость вирусов гриппа А, циркулировавших в России в 1997-2007 гг.

Коновалова, Надежда Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эволюционная изменчивость вирусов гриппа А, циркулировавших в России в 1997-2007 гг.
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Эволюционная изменчивость вирусов гриппа А, циркулировавших в России в 1997-2007 гг."

На правах рукописи

Коновалова Надежда Игоревна

0034028Б

ЭВОЛЮЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА А, ЦИРКУЛИРОВАВШИХ В РОССИИ В 1997-2007 ГГ.

03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2

Санкт-Петербург 2009

003482855

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте гриппа Северо-Западного отделения РАМН

Научный руководитель: кандидат биологических наук Литвинова Ольга Михайловна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Бичурина Майна Александровна доктор биологических наук Ленёва Ирина Анатольевна Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Защита диссертации состоится « О У » декабря 2009 г. в./т?..ч.£<?.мин. на заседании диссертационного совета Д.001.46.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт гриппа Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. нроф. Попова, 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт гриппа Северо-Западного отделения РАМН.

Автореферат разослан « 2.9 » О/СГЛ&Р-Р 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

В.Ф. Суховецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), несмотря на определенные успехи вакцино- и химиопрофилактики, остаются одной из самых актуальных медицинских и социально экономических проблем. В России на грипп и ОРВИ ежегодно приходится до 90% от всей регистрируемой инфекционной заболеваемости (до 30 млн. больных; из них 45-60% дети). Экономический ущерб, причиняемый гриппом и ОРВИ, составляет около 86% от экономических потерь, наносимых инфекционными болезнями (Слёпушкин А.Н., 2003; Маринич И. Г. с соавт., 2004).

Изменения эпидемиологии и экологии гриппа человека и животных, наблюдаемые в течение последних десяти лет, позволяют ВОЗ прогнозировать появление в ближайшие годы нового антигенного варианта вируса гриппа, что может привести к развитию крупной пандемии с 4-5-кратным ростом заболеваемости и 5-10-кратным ростом смертности. Это связывалось с широким распространением высокопатогенного вируса гриппа субтипа A(H5N1) среди дикой птицы, с эндемичностью данного вируса для домашних животных и птиц, а также с регистрацией случаев инфицирования высокопатогенным штаммом человека (Сох N., 2003; WHO, 2005; Webster R. G. and Govorkova E. A., 2006 ). Уже в 2009 году в мире стал активно распространяться вирус гриппа H1N1 свиного происхождения, представляющий собой тройной реассортант вирусов гриппа человека, птиц и свиней (WHO, 2009; Morens D.M. et all, 2009). Такая смена лидеров пандемического процесса свидетельствует о том, что степень защищенности популяции человека в этой экологической цепи зависит от возможности прогнозирования появления кардинально новых в антигенном отношении вирусов гриппа и от своевременного их выявления.

Предотвратить тяжелые случаи гриппозной инфекции и ее осложнения может гриппозная вакцина при условии соответствия компонентов вакцины и штаммов, циркулирующих в человеческой популяции. Непрерывная изменчивость современных вирусов гриппа определяет необходимость ежегодного обновления штаммового состава гриппозных вакцин (Jong J. С. et all, 2000). Объективное понимание эволюции вирусов гриппа - основа для разработки эффективных вакцин. В связи с этим очень важен этиологический

надзор за антигенной изменчивостью современных вирусов гриппа, а также углублённое изучение эпидемических штаммов, циркулировавших ранее.

Антигенный, генетический и филогенетический анализ российских изолятов в сравнении со штаммами, циркулирующими в мире, позволяет полнее определить основные тенденции изменчивости вирусов гриппа и проследить эволюционные связи между циркулирующими и вновь возникающими антигенными вариантами вирусов гриппа. Данные настоящих исследований имеют не только теоретическое, но и практическое значение как для расшифровки текущих, так и для подготовки к будущим эпидемиям.

Цель исследования:

Целью настоящего исследования является изучение молекулярно -генетических основ антигенной изменчивости вирусов гриппа человека подтипов А(НШ1) и А(НЗЫ2), выделенных в России на протяжении 10 лет (1997-2007 гг.), и выявление закономерностей эволюции вирусов гриппа А.

Задачи исследования:

1. Проанализировать этиологическую ситуацию по гриппу в России за период с 1997 г. по 2007 г. для определения структуры вирусной популяции на территории нашей страны.

2. Изучить в сравнительном аспекте антигенные свойства вирусов гриппа подтипов А(Н11Ч1) и А(НЗЫ2), изолированных в разных регионах России, и установить степень гетерогенности популяций циркулирующих штаммов.

3. Провести молекулярно-генетический анализ субъединицы гемагглютинина (НА1) российских изолятов и определить основные аминокислотные позиции, изменения в которых оказывают влияние на антигенные свойства вируса.

4. На основании антигенного, молекулярно-биологического и филогенетического анализов современных вирусов гриппа типа А определить направленность антигенного дрейфа российских изолятов.

5. Оценить (ретроспективно) эпидемические и эволюционные потенции необычных по антигенной и генетической структуре для того или иного периода изолятов 1997-2007 гг.

Все исследования входили в плановую научную тематику лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа ГУ НИИ гриппа РАМН и были поддержаны международным грантом МНТЦ №3070 «Дальнейшее

усовершенствование надзора за гриппом в России. Вклад в глобальную подготовку к пандемии гриппа».

Научная новизна.

На базе Федерального центра по гриппу проведён анализ этиологии гриппозных эпидемий, возникавших в различных географических зонах РФ в период с 1997 по 2007 гг.

Впервые на большом фактическом материале, включающем результаты изучения около 1500 штаммов вирусов гриппа А(НШ1) и А(НЗК2), установлены основные направления эволюции современных вирусов гриппа А.

Впервые в 1998 г. на территории России зарегистрировано первичное появление и прослежено дальнейшее распространение вирусов гриппа А(НШ1), относящихся к новой эволюционной ветви и имеющих антигенное родство с эталоном А/Пекин/262/96. Была показана реальная возможность обнаружения опережающих вариантов вируса гриппа, которые приобретают эпидемическую значимость на территории страны через 2-3 года после их первичного появления.

На рубеже 2005-2006 гг. впервые зафиксировано выделение штаммов А(НШ1), обладающих существенными дрейфовыми изменениями в гене НА1 и значительно отличающихся от вирусов, циркулировавших ранее. Представителем этой разновидности является вирус А/С.Петербург/7/06. Данные вирусы занимают промежуточное положение между эволюционными клайдами, представителями которых являются штаммы А/Новая Каледония/20/99 и А/Брисбен/59/07.

В сезон 2006-2007 гг. показаны увеличение эпидемической активности вирусов подтипа А(НШ1) и одновременная циркуляция трёх генетических вариантов. Впервые изолированы в России штаммы подобные новому эталону А/Брисбен/59/07. Активный антигенный дрейф вирусов НШ1 в предпандемический период представляется особенно важным с точки зрения последующего вовлечения вирусов этого подтипа в реассортацию и активную селекцию с переходом в шифт в пределах одного подтипа (НШ1).

Выявлены особенности изменчивости вирусов гриппа А(НЗМ2). Вирусы данного подтипа характеризуются активной циркуляцией, постоянным антигенным дрейфом и выраженной гетерогенностью популяции.

Впервые проведённый молекулярно-биологический и филогенетический анализ штаммов А(НШ1) и А(НЗ№), циркулировавших в период с 1997 по

2007 гг. в России, позволил выявить направленность антигенного дрейфа и определить основные детерминанты молекулы гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), ответственные за антигенные отличия.

Установлено частичное несоответствие антигенной и генетической структуры российских изолятов A(H1N1) и A(H3N2) актуальным вакцинным и референс-штаммам, что обуславливает важность локального этиологического мониторинга за гриппом.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. По данным вирусологического обследования населения на территории России в период 1997-2007 гг. установлена циркуляция вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. Удельный вклад каждого типа и подтипа вирусов гриппа в различные эпидемические сезоны был неравнозначным, что свидетельствовало об отсутствии реального лидера эпидемического процесса.

2. Популяция вирусов гриппа А каждого эпидемического сезона отличалась гетерогенностью, как на уровне подтипов, так и на уровне антигенных и генетических вариантов. Антигенный дрейф вирусов гриппа A(H3N2) носил непрерывный поступательный характер, в то время как эволюционные изменения вирусов гриппа A(H1N1) характеризовались сменой активной фазы на длительный период «затишья».

3. Определены и изучены аминокислотные позиции НА1 и NA отечественных изолятов, подверженные антигенному дрейфу. Ключевые позиции, существенно влияющие на антигенные свойства вируса, фиксировались в антигенно значимых областях А, В, С и Е HAI (НЗ) и в антигенных сайтах Ca, Cb и Sb HAI (Hl).

4. Согласно проведённому антигенному, генетическому и филогенетическому анализу дрейфовые изменения вирусов гриппа A(H3N2) и A(H1N1) соответствовали глобальной тенденции молекулярно - генетической эволюции этих вирусов в мире. Однако штаммы, циркулировавшие на территории России, обладали определённым набором оригинальных замен, отличающих их от референс-штаммов, рекомендованных в состав гриппозных вакцин.

этиологическую ситуацию и определить эпидемические потенции различных генетических и антигенных вариантов.

Личный вклад автора в проведение исследований.

Автором выполнен основной объем работ по изоляции, типированию, изучению антигенных свойств вирусов и филогенетическому анализу. Проведен теоретический анализ поведения вирусов H3N2 и H1N1 в предпандемический период.

Практическая значимость работы.

Изоляция и идентификация вирусов гриппа, циркулирующих на территории России (1997-2007 гг.), позволили определить этиологию эпидемий и сезонных подъёмов заболеваемости. На протяжении 10-ти лет осуществлялась помощь практическому здравоохранению в расшифровке гриппозных заболеваний. Выделены и изучены 1476 эпидемических штаммов вируса гриппа А. Все изоляты включены в коллекцию музея вирусов гриппа ГУ НИИ гриппа РАМН.

Данные по изоляции и идентификации вирусов гриппа учтены при составлении методических рекомендаций «Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация», С.Петербург, 2006 г.

Результаты изучения антигенных и генетических свойств эпидемических изолятов позволили определить основные направления эволюции вирусов гриппа А и выявить новые оригинальные штаммы, что важно в практическом плане при прогнозировании эпидемий и вероятных пандемий, а также при выборе кандидатов в вакцинные штаммы и штаммы для производства диагностических препаратов.

Информация о выделении вирусов гриппа и об антигенной характеристике эпидемических штаммов ежегодно отправляется в ВОЗ, Министерство здравоохранения РФ и Центры гигиены и эпидемиологии и органы практического здравоохранения. В рамках сотрудничества с ВОЗ для включения в международный мониторинг за гриппом были переданы в референс-лаборатории (CDC&P, Атланта, Джорджия, США и NIMR, Лондон, Англия) 487 отечественных штаммов вируса гриппа А. Данные штаммы входят в состав коллекций лабораторий ВОЗ, а три из них являются референс-штаммами (MRC., National Institute for Medical Research., WHO Influenza Centre., 1999., 2007., 2008. - http://www.nimr.mrc.ac.uk/wic/report/).

Апробация результатов исследований.

Материалы диссертации были представлены на юбилейной международной научной конференции «Грипп XXI век» 1997г., VII Съезде Всероссийского Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 1997 г., Всероссийской научной конференции «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций» 2001г., 6th annual Meeting European Society for Clinical Virology ESCV 2003, Options for the control of influenza V. Okinawa, Japan 2003, симпозиуме «Повышение готовности к пандемии гриппа на основе военно-гражданского сотрудничества» СПб., 2003 г., юбилейной научной конференции «Современная микробиология в клинической медицине и эпидемиологии» СПб., 2003 г., Международная конференция «Актуальные вирусные инфекции - практические и теоретические аспекты» СПб., 2004г., на международных конференциях "Preparedness to the influenza pandemic - an international outlook", S.-Petersburg, Russia 2007, Options for the Control of Influenza IV, 2007, Toronto, Canada, на конгрессе «Экофорум 2008», на международной конференции 3rd ESWI Conference, Vilamoura, Portugal, 2008.

Публикации.

Результаты диссертации отражены в 31 печатной работе, в том числе в реферируемых журналах, тезисах докладов на Международных и Всероссийских конгрессах, съездах и конференциях, а также методических рекомендациях.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на fffl страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 31 таблицей. Список цитируемой литературы содержит 295 источников, в том числе 22 отечественных и 273 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследований.

Вирусы. В работе использовались вакцинные и референс-штаммы вируса гриппа подтипа A(H1N1) и A(H3N2), полученные из Международных центров по гриппу ВОЗ (CDC&P, Атланта, США и NIMR, Лондон, Англия), а

также эпидемические изоляты A(H1N1) и A(H3N2), циркулировавшие на территории России в период с 1997 по 2007 гг. и депонированные в музей вирусов гриппа НИИ гриппа РАМН.

Сыворотки. При идентификации эпидемических изолятов использовались гипериммунные диагностические сыворотки, присылаемые ежегодно ВОЗ, а так же гипериммунные кроличьи диагностические сыворотки, производства ООО ППДП НИИ гриппа РАМН. Для антигенного анализа были использованы гипериммунные крысиные сыворотки, полученные к эпидемическим и референс-штаммам вируса гриппа разных лет выделения.

Клеточные системы. Изоляция и накопление вирусов гриппа осуществлялись на 10-11 дневных куриных эмбрионах, поставляемых ООО «Племрепродуктор», а так же на перевиваемой клеточной линии MDCK. Посевная клеточная доза составляла 2,5 х 105 кл/мл. Клеточная линия получена из референс лаборатории CDC, Атланта, США.

Животные. Для получения диагностических сывороток были использованы белые беспородные крысы, весом 300-400 г и кролики породы Шиншилла. Животные предоставлены питомником АМН РФ «Рапполово».

Изоляция и идентификация вирусов гриппа. Выделение и идентификацию вирусов гриппа проводили согласно рекомендациям ВОЗ, методу Davies H.W. с соавт., 1978 г. и методическим рекомендациям «Выделение вирусов в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация» (С.Пб, 2006 г.). Материалом, взятым от больного (отделяемое из глубоких отделов носовой полости, зева), а также секционным материалом (ткани легкого или бронхов) заражали 10-11 дневные куриные эмбрионы и клетки культуры ткани MDCK. Определение вирусного агента осуществляли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с набором диагностических сывороток ВОЗ или сывороток производства ООО ППДП НИИ гриппа СЗО РАМН.

Антигенный анализ. Антигенный анализ вирусов гриппа проводили в РТГА с использованием широкого набора гипериммунных крысиных сывороток, полученных к эпидемическим и референс-штаммам разных лет выделения. Реакцию ставили по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ и «Методам определения показателей качества иммунологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа» (28.09.2003г.).

Молекулярно-биологический анализ. Нуклеотидный и аминокислотный состав гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) российских изолятов вируса гриппа А определяли в Институте медицинских исследований (NIMR, Лондон, Англия) и в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа СЗО РАМН. Амплификация фрагментов кДНК с геномной РНК вирусов гриппа А проводили методом ОТ-ПЦР с помощью наборов и реагентов производства ФГУЦ НИИ эпидемиологии, Роспотребнадзора (РФ), согласно рекомендациям фирмы производителя. Секвенирование последовательности выделенных фрагментов проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100-Avant ("Applied Biosystems", USA) с использованием наборов "BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit", согласно протоколу фирмы производителя.

Филогенетический анализ. Филогенетический анализ осуществляли с использованием программы Vector NTI 8,0 (Invítrogen) и MEGA 3.1 (PSU, США) методом «ближайших соседей» или Kimura. Для построения филогенетического дерева использовали фрагменты нуклеотидных последовательностей генов НА и NA референс-штаммов вирусов гриппа А, депонированных в международной базе данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/Gen bank/).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Характеристика процесса антигенного дрейфа вирусов гриппа A(H3N2) 1997-2007 гг. выделения.

С целью расшифровки этиологии эпидемий гриппа и определения направленности антигенного дрейфа проведен детальный анализ 994 эпидемических изолятов A(H3N2), выделенных в период с 1997 по 2007 гг. на территории Российской Федерации. Вирусы гриппа A(H3N2) остаются основным этиологическим агентом гриппозных эпидемий. Выделение вирусов этого подтипа регистрировалось на всём протяжении исследуемого периода, кроме эпидемического сезона 2000-2001 гг. Эпидемия гриппа 2003-2004 гг. характеризовались как моноэтиологичная. В остальные эпидемические сезоны исследуемого периода вирусы гриппа A(H3N2) социркулировали с вирусами гриппа В или A(H1N1), составляя от 1,3% до 79,7% общего количества выделенных вирусов гриппа (рис.1).

■ Ь11Ч1 ПН >N2 ЦБ

Рис.1. Структура популяции вирусов гриппа, выделенных в России в период с 1997 - 2007 гг.

Структура популяций вирусов гриппа А(НЗШ) каждого эпидемического сезона и долевое участие различных антигенных вариантов представлены в табл. 1. За изученный период на территории России была выявлена циркуляция штаммов, принадлежащих к шести эталонным вариантам: А/Йоханнесбург/33/94, А/Сидней/5/97, А/Панама/2007/99. А/Фуцзянь/411/02, А/Калифорния/7/04 и А/Висконсин/67/05. Данные эволюционные группы последовательно сменяли друг друга. Появление новых актуальных вирусов гриппа А(НЗ№) характеризовалось постепенным вытеснением из циркуляции предыдущих антигенных вариантов и сопровождаюсь гетерогенностью популяции в пределах одного эпидемического сезона.

Процентное соотношение антигенных вариантов вирусов гриппа А(НЗ№) распределялось следующим образом. В сезон 1998-1999 гг. были выделены вирусы трёх разновидностей. Первую группу штаммов составляли вирусы, подобные референс-штамму А/Йоханнесбург/33/94 (26,3%). Вирусы, антигенно близкие этому эталону, активно циркулировали в России в 19951996 гг. Вторая группа включала в себя изоляты разновидности А/Сидней/5/97 (42,1%). Данные изоляты (репрезентативный штамм - А/С.Петербург/22/99) характеризовались полной утратой родственных связей со штаммами первой группы. Третья группа вирусов была представлена более актуальными штаммами, родственными эталон) А/Панама/2007/99 (31.6%).

Таблица 1.

Удельный вес различных антигенных вариантов вирусов гриппа А(НЗШ), циркулировавших в России (по данным антигенного анализа).

Эпидемические сезоны Референс- штаммы, рекомендованные в состав вакцин Эпидемические штаммы

Антигенная принадлежность процентное соотношение (%)

1998-1999 А/Сидней/5/97 А/Иоханнесбург/33/94 26,3

А/Сидней/5/97 42,1

А/Панама/2007/99 31,6

1999-2000 А/Сидней/5/97 А/Сидней/5/97 7,7

А/Панама/2007/99 92,3

2000-2001 А/Панама/2007/99 А/Москва/10/99 не выделены -

2001-2002 А/Панама/2007/99 А/Москва/10/99 А/Панама/2007/99 А/Москва/10/99 100

2002-2003 А/Панама/2007/99 А/Москва/10/99 А/Панама/2007/99 32,2

А/Фуцзянь/411/02 67,8

2003-2004 А/Панама/2007/99 А/Москва/10/99 А/Панама/2007/99 13,0

А/Фуцзянь/411/02 87,0

2004-2005 А/Фуцзянь/411/02 А/Калифорния/7/04 А/Веллингтон/1 /04 100

2005-2006 А/Калифорния/7/04 А/Нью-Йорк/55/04 А/Калифорния/7/04 А/Нью-Йорк/55/04 и их дреф-варианты 64,1

А/Висконсин/67/05 35,9

2006-2007 А/В исконсин/67/05 А/Висконсин/67/05 100

Репрезентативные штаммы этой группы (А/С.Петербург/72/99 и А/Москва/1/99), выделенные в основном во второй половине эпидемического сезона 1998-1999 гг., доминировали в России в следующий сезон 1999-2000 гг., составляя 92,3% вирусной популяции А(НЗШ).

Основная доля изученных штаммов А(НЗШ) сезонов 2002-2003 гг. (67,8%) и 2003-2004 гг. (87,0%) значительно отличалась от эталонов предыдущих лет, а также от вакцинных штаммов А/Москва/10/99 и А/Панама/2007/99. Антигенный анализ с широким набором штаммоспецифических сывороток показал, что гемагглютинирующая активность вирусов этого периода нейтрализовалась антителами сыворотки А/Панама/2007/99 до 1/4-1/8 гомологичного титра, а сыворотки А/Москва/10/99 до 1/16-1/32 гомологичного титра. Нами было установлено,

что данные изоляты относятся к новому эволюционному кластеру А/Фудзянь/411/02 (репрезентативный штамм - А/С.Петербург/118/03).

В 2004-2005 гг., 2005-2006 гг. и 2006-2007 гг. наблюдалась циркуляция на территории нашей страны вирусов гриппа А(НЗЫ2) относящихся к вариантам А/Веллингтон/1/04, А/Калифорния/7/04, А/Нью-Йорк/55/04, А/Висконсин/67/05. Нами были изучены вирусы гриппа А(НЗ№), выделенные в 20 городах различных регионах России. Необходимо отметить, что столь широкое географическое распространение (Европейская часть России, Сибирь, Дальний Восток) не сопровождалось выраженной гетерогенностью вирусов. Все изученные нами штаммы отличались от эталона А/Фудзянь/411/02 на 1/8-1/32 гомологичного титра, однако по своим антигенным свойствам были близки друг другу.

В результате детального антигенного анализа вирусов гриппа А(НЗ№) 1997-2007 гг. определены основные направления эволюционной изменчивости российских изолятов. За изученный период нами зарегистрированы значительные изменения антигенных свойств вирусов гриппа А(НЗ№). Направленность антигенного дрейфа отечественных штаммов соответствовала антигенному дрейфу вирусов гриппа А(НЗ№) в мире и проходила в следующей последовательности: А/Йоханнесбург/33/94 —* А/Сидней/5/97 —» А/Панама/2007/99 -> А/Фудзянь/411/02 А/Веллингтон/1/04

А/Калифорния/7/04 —♦ А/Висконсин/67/05.

Было выявлено, что в эпидсезоны 2002-2003, 2003-2004 и 2004-2005 гг. более 60% изученных вирусов, циркулировавших на территории Российской Федерации, отличались в РТГА больше чем на 1/4-1/8 гомологичного титра, от референс-штаммов А(113М2), рекомендованных в состав гриппозной вакцины.

2. Молекулярно-биологический и филогенетический анализ вирусов гриппа А(НЗШ), выделенных в России в 1997-2007 гг.

За исследуемый период нами был проведён анализ аминокислотных последовательностей НА 38 российских эпидемических изолятов в сравнении с референс-штаммами ВОЗ.

Данные генетического анализа позволили определить, что среди штаммов, циркулировавших в период 1996 - 1999 гг., выявлены вирусы, значительно отличающиеся от ранее доминирующего эталона

А/Йоханнесбург/33/94. В HAI эпидемических изолятов А/Хабаровск/2054/96 и А/Москва/41/97 было выявлено 15 и 17 изменённых аминокислотных позиций, соответственно. Эти изменения располагались во всех известных антигенных сайтах и были характерны для НА референс-штамма А/Сидней/5/97. Однако, данные изоляты нельзя в полной мере отнести к разновидности А/Сидней/5/97, так как они не обладали ключевыми аминокислотными заменами в положениях 62 (К—>Е) антигенного сайта Е и положениях 156 (К—>Q) и 158(Е—>К) антигенной области В1. Изменения в этих позициях регистрировались в НА1 штамма А/С.Петербург/22/99, что существенно повлияло на антигенные свойства вируса. По результатам взаимодействия с широким набором поликлональных сывороток эпидемические штаммы А/Хабаровск/2054/96 и А/Москва/41/97 относились к варианту А/Йоханнесбург/33/94, в то время как изолят А/С.Петербург/22/99 был подобен вакцинному штамму А/Сидней/5/97. Кроме вышеперечисленных замен на данном этапе нами зафиксированы изменения РСС (K135N, L194I, Q226I) и появление нового ПСГ в непосредственной близости от рецепторного кармана (133-135).

Изучение аминокислотной последовательности НА вируса А/С.Петербург/186/00, выделенного в сезон 1999-2000 гг., показало наличие 7 аминокислотных замен в антигенных сайтах A (S142R, 1144N), В (T192I) и С (R57Q), а также в области РСС (Y137S, I194L, I226V). Существенных изменений в области В1 выявлено не было, что, вероятно, позволило сохранить близкое родство между штаммами разновидности А/Панама/2007/99 и А/Сидней/5/97.

Последующие мутационные изменения гена НА привели к появлению нового антигенного и генетического варианта А/Фудзянь/411/02. Вирусы, подобные данному эталону, впервые были зарегистрированы в России в эпидемический сезон 2002-2003 гг. Аминокислотные замены, свойственные этим изолятам, наблюдались в антигенных сайтах А (А131Т), В (S186G), С (R50G), D (V202I), Е (H75Q, Е83К) и в РСС (V222R, G225D). Две изменённые позиции находились в области В1. Эти замены характеризовались потерей (155 положение) и приобретением (156 положение) положительно заряженного гистидина. Эпидемические вирусы А/Хабаровск/6/03, А/Москва/48/03 и А/С.Петербург/122/03 обладали всеми значимыми изменениями А/Фудзянь/411/02 - подобных штаммов (филогенетическая группа В) (рис.2).

Особый интерес представляют штаммы А/Чита/1/03 и А/Чита/3/03. По результатам антигенного и филогенетического анализа эти изоляты занимали промежуточное положение между эталонами А/Панама/2007/99 и А/Фудзянь/411/02 (филогенетическая группа А, рис. 2). У Читинских вирусов в НА1 регистрировались 8 из 10 основных аминокислотных замен, свойственных вирусам разновидности А/Фудзянь/411 /02. Однако, важной замены Q156H, расположенной в антигенном сайте В1, не наблюдалось. Кроме того, эти изоляты характеризовались дополнительными изменениями в сайте В(186V), РСС (227Р) и потерей ПСГ (246-248). При молекулярно-биологическом анализе NA изолятов А/Чита/1/03 и А/Чита/3/03 были выявлены все основные аминокислотные замены, свойственные NA А/Фудзянь/411/02. Т.о. данные вирусы обладали НА, отличающимся как от «новых», так и от «старых» генетических вариантов, и NA, характерной для более современных штаммов.

Антигенный дрейф вирусов гриппа A(H3N2) в период 2003-2007 гг. носил постепенный поступательный характер. На эволюционном отрезке А/Фудзянь/411/02 -> А/В ел л и н гтон/1/04 А/Калифорния/7/04 ->

А/Висконсин/67/05 были зарегистрированы замены в антигенном сайте А (K145N), в антигенном сайте В (Y159F, S189N, S193F) и в РСС (D225N, V226I, S227P). Замены в положениях 145 и 226 имели реверсивный характер.

Анализ аминокислотных последовательностей НА1 российских изолятов 2004 г. (А/Тула/16/04) и 2005 г. (А/С.Петербург/8/05 и А/С.Петербург/12/05) показал, что они были подобны референс-штаммам А/Веллингтон/1/04 и А/Калифорния/7/04, соответственно (филогенетические группы С и D, рис. 2).

Гемагглютинины отечественных штаммов эпидемических сезонов 20052006 гг. и 2006-2007 гг. отличались некоторой гетерогенностью. Как в первом, так и во втором сезонах наблюдалась циркуляция вирусов, родственных вакцинному штамму А/Висконсин/67/05 (филогенетическая группа F, рис. 2), обладающих характерными для этого эталона заменами (S193F, D225N). Кроме того в 2005-2006 гг. циркулировали вирусы близкие по антигенным характеристикам референс-штамму А/Калифорния/7/04 (филогенетическая группа Е, рис. 2), но с изменёнными позициями 112 (V—>1), 173 (К—*>Е) и 199 (S—>Р). Группу G (рис.2) составили изоляты 2006-2007 гг. с заменами Т128А, R142G, К173Е и штаммы с изменениями в 50 (G—>Е) и 140 (К—>1) положениях

Г А/Воронеж/04/06

_П-А/Н. Новгород/36/07

I ^А/Воронеж/01/06

'-■-А/Н.Новгород/18/07

рА/С. Петербург/5/06 L^^-А/Ростов-на-Дону/1/06 ^А/С. Петербург/1/06 А/С.Петербург/3/06 А/Ставрополь/7/06 А/Москва/27/06

.j— А/С.Петербург/40/06

Н?

А/Ставрополь/9/06 А/Брисбен/10/2007 А/С.Петербург/100/07 А/ТулаМ 38/07

А/Висконсин/67/06

I А/Кал ининград/4/06

_I I А/Москва/35/06

| А/Н.Новгород/43/06 1рА/Хабаровс к/31/06 JjA/Орел/ЮО/Об Т-А/Орел/02/06

— А/С.Петербург/8/05 А/С.Петербург/12/05

— А/Калифорния/7/04 А/Веллингтон/1/04 А/Тул'а/16/03

" -А/Хабаровск/34/Ш

I I А/Фудзя нь/411/02 4 A/M осква/48/03 jrA/Хабаровск/Об/ОЗ 1— А/С.Петербург/122/03 —А/Чита/6/03 U/Ч ига/1/ОЗ

ЧГ

-А/Панама/2007/9Э

А(С.Петербург/186Ю0

-А/Москва/10/99

г- А/С.Петербург/22/99 "1—А/Сидней/5/97

А/Вайоминг/3/03 А/Кумамото/102/02

■Ü

- А/Москва/41/97

-А/Юж. Африка/1147/96

—— А/Хабаровск/2054/96

А/Юхань/359/95

■ А/С.Петербург/269/95

1 А/Йоханнесбург/33/94

Рис.2. Филогенетическое древо вирусов гриппа A/H3N2, выделенных в России в период с 1997 по 2007 гг.

Жирным шрифтом выделены эталонные штаммы.

НА1. Подобные изменения закрепились в ходе эволюции и являются дифференциальными для современного вакцинного штамма А/Брисбен/10/07.

Т.о. согласно генетическому и филогенетическому анализу нами была определена направленность антигенного дрейфа вирусов гриппа A(H3N2) в России, которая соответствовала эволюционным изменениям вирусов данного подтипа в мире. Среди популяции отечественных штаммов отмечалась генетическая гетерогенность и деление на группы с характерными заменами в НА1.

Изучение и сравнительный анализ аминокислотных последовательностей НА1 российских изолятов 1997-2007 гг. позволили выявить изменения в 45 позициях, 30 из которых оказались существенными и были связаны со сменой заряда или полярности аминокислот. Основная масса замен коснулась антигенных сайтов А и В (19 замен), а также РСС (7 замен). Из 18 кодонов, наиболее подверженных позитивной селекции, согласно работам Bush R. M. 1999, были затронуты 14, причём за последние 5 лет изменения претерпели лишь 6 позиций (142, 145, 156,186, 193, 226). Аминокислотные замены в 142, 145, 226 положениях имели реверсивный характер, а изменения в 186 позиции характеризовались неоднородностью, и в один и тот же эпидемический сезон у вирусов, родственных по антигенным характеристикам, можно было зафиксировать в этой области различные аминокислоты (S, G, V). Кроме того нами были определены дополнительные ПСГ, которые появились у отечественных штаммов на рубеже 1997-1998 гг. (позиции 122-124, 133-135) и 1999 -2000 гг. (позиции 144-146). Сопоставив данные генетического и антигенного анализа российских изолятов мы предполагаем, что основными аминокислотными позициями, изменения в которых были связаны с селективным преимуществом и оказывали непосредственное влияние на антигенные характеристики вируса, являются позиции в антигенных сайтах А (133, 140, 142, 144 и 145), В (155-159, 192, 193 и 197), С (50 и 57) и Е (62).

3. Эволюционная изменчивость современных вирусов гриппа подтипа A(H1N1).

Циркуляция вирусов гриппа подтипа A(H1N1) в России, также как и в других странах, не столь интенсивна по сравнению с вирусами гриппа A(H3N2). Значительные эпидемические события, вызванные этим возбудителем, регистрируются достаточно редко. На современном этапе вирусы гриппа A(H1N1) являются причиной спорадических заболеваний или локальных вспышек. Как показано на рис.1, удельный вес представителей

этого подтипа не превышал 13%, за исключением сезонов 1997-1998 гг. (75,9%), 2000-2001 гг. (92,1%) и 2006-2007 гг. (37,0%). Именно в эти периоды наблюдалась циркуляция штаммов, обладающих кардинально новыми антигенными характеристиками.

За исследуемый период нами были изучены 482 изолята подтипа А(НШ1) и определена их антигенная принадлежность (табл.2). Эпидемия гриппа в 1997-1998 гг. в России была связана с распространением антигенного варианта А/Берн/07/95. Вирусы этой разновидности вызвали эпидемии в Европе и Северной Америке в 1995-1996 гг., а на территории нашей страны были впервые зарегистрированы в сезон 1996-1997 гг. В эпидемию 1997-1998 гг. 96,2% российских изолятов также относились к этой группе (табл.2), реагируя с сыворотками А/Берн/07/95 и А/Иоганесбург/82/92 (более современный антигенный вариант) до 1- 1/4 гомологичного титра. В то же время в указанный сезон в г. Улан-Удэ были зарегистрированы заболевания, вызванные штаммами разновидности А/Пекин/262/96. По своим антигенным характеристикам вирусы, выделенные в Улан-Удэ, значительно отличались от референс- штаммов А/Берн/07/95 и А/Иоханнесбург/82/92. Изоляты А/Улан-Удэ/209/98 и А/Улан-Удэ/207/98, как и референс вирус А/Пекин/262/95, не взаимодействовали с антисыворотками, полученными к указанным вакцинным штаммам и к эпидемическим вирусам сезона 1997-1998 гг. Кроме того, антитела, продуцируемые вирусом А/Улан-Удэ/209/98, нейтрализовали только вирусы разновидности А/Пекин/262/95. Появление на эпидемической арене кардинально новых по своим антигенным свойствам вирусов А/Пекин/262/96 и регистрация их циркуляции на территории России (Улан-Удэ) свидетельствует о динамических мутационных процессах в генах, кодирующих поверхностные белки вируса гриппа, причём данные процессы не всегда являются явными и поступательными.

Вирусы, относящиеся к эволюционной ветви А/Пекин/262/96 (дрейф-вариант А/Н.Каледония/20/99), получили широкое распространение в России в 2000-2001 гг., вытеснив с эпидемической арены штаммы, родственные А/Берн/07/95. Эти результаты полностью согласуются с данными по циркуляции вирусов гриппа А(НШ1) в мире.

Циркуляция вирусов гриппа подтипа А(НШ1) в период 2002 - 2005 гг. в России была не столь интенсивна по сравнению с вирусами гриппа А(НЗ№) и В. Все выделенные в этот период штаммы А(НШ1) по своим антигенным

Таблица 2.

Удельный вес различных антигенных вариантов вирусов гриппа А(НШ1), циркулировавших в России (по данным антигенного анализа).

Эпидемические сезоны Референс-штаммы, рекомендованные в состав вакцин Эпидемические штаммы

Антигенная принадлежность процентное соотношение (%)

1997-1998 А/Берн/07/95 А/Берн/07/95 А/Йоханесбург/82/95 96,2

А/Пекин/262/96 3,8

1998-1999 А/Пекин/262/96 А/Берн/07/95 100

1999-2000 А/Пекин/262/96 А/Н.Каледония/20/99 100

2000-2001 А/Н.Каледония/20/99 А/Н.Каледония/20/99 100

2001-2002 А/Н.Каледония/20/99 А/Н.Каледония/20/99 100

2002-2003 А/Н.Каледония/20/99 А/Н.Каледония/20/99 100

2003-2004 А/Н.Каледония/20/99 не выделены -

2004-2005 А/Н.Каледония/20/99 дрейф-варианты А/Н.Каледония/20/99 100

2005-2006 А/Н.Каледония/20/99 А/Н.Каледония/20/99 40,5

А/С.Петербург/7/06 59,5

2006-2007 А/Н.Каледония/20/99 А/Брисбен/59/07 21,4

А/Н.Новгород/3/07 78,6

свойствам были подобны эталонному штамму А/Н.Каледония/20/99 или являлись его дрейф-вариантами.

В эпидемический сезон 2005-2006 гг. также были зарегистрированы вирусы, относящиеся к разновидности А/Н.Капедония/20/99, в то же время нами была зафиксирована изоляция штаммов (59,5%), значительно отличающихся от вирусов прежних лет выделения и, соответственно, от эталона А/Н.Каледония/20/99 (табл.2). Взаимодействие изолятов этой группы (А/С.Петербург/7/06) с сыворотками, подобными поликлональной сыворотке А/Н.Каледония/20/99, до 1/8-1/16 гомологичного титра свидетельствует о прогрессирующем антигенном дрейфе вирусов А(НШ1) периода 2005-2006 гг.

При антигенном анализе штаммов 2006-2007 гг. были выявлены дальнейшие дрейфовые изменения. Основная масса популяции современных изолятов (78,6%) представляла собой обособленную группу вирусов, отличающуюся не только от эталона А/Новая Каледония/20/99, но и от нового референс-штамма А/Соломоновы Острова/3/О6. Репрезентативный вирус этой группы - А/С.Петербург/10/07. Штаммы, входящие во вторую группу, составили лишь 21,4% (табл.2) от всех изученных изолятов А(Н1 N1), и их

основной отличительной особенностью явилось активное взаимодействие с антисыворотками А/Соломоновы Острова/3/О6 и А/С.Петербург/96/07 (1-1/4 гомологичного титра). Ретроспективный анализ с использованием эпидемических и эталонных вирусов и сывороток 2007-2008 гг. показал, что большинство штаммов второй группы были более близки новому вакцинному штамму А/Брисбен/59/07.

Таким образом за исследуемый период мы наблюдали три активные фазы циркуляции вирусов гриппа A(H1N1): эпидемии гриппа, вызванные штаммами, подобными А/Берн/07/95, А/Н.Каледония/20/99 и начало распространения вирусов, родственных новому вакцинному штамму А/Брисбен/59/07. Кроме того, в последние годы (2005-2007 гг.) регистрировалось усиление гетерогенности популяции вирусов A(H1N1). На территории России в этот период циркулировали вирусы, относящиеся к пяти антигенным вариантам: А/Берн/07/95, А/Н.Каледония/20/99, А/С .Петербург/7/06, А/С. Петербург/10/07 и А/Брисбен/59/07.

4. Характеристика молекулярно-биологических свойств вирусов гриппа A(H1N1)

Изменения аминокислотного состава НА и NA российских изолятов, также как и вирусов гриппа A(H1N1), циркулировавших в мире, носили волнообразный характер и отличались определённой дивергенцией на некоторых эволюционных отрезках.

Наиболее радикальные изменения в молекуле НА1 вирусов гриппа A(H1N1) произошли в 1995-1996 гг., когда на эпидемической арене появились вирусы, подобнь1е штамму А/Пекин/262/96. Аминокислотная последовательность НА вирусов, антигенно близких этому эталону, существенно отличалась от композиции аминокислот НА вирусов, родственных А/Берн/7/95 и А/Йоханнесбург/82/96 (российские изоляты А/Мурманск/840/95, А/Екатеринбург/366/96 и А/Екатеринбург/848/98). Основные дифференциальные изменения коснулись антигенных сайтов Ca, Cb и Sb, а также других областей НА1. Эти аминокислотные изменения затронули позиции 43, 47, 71, 80, 146, 271, 273. Особое внимание следует уделить делеции лизина в 130 положении антигенного сайта Sa. Данная делеция служит своеобразным маркёром нового поколения вирусов. Штаммы Пекинской разновидности, как уже говорилось выше, были впервые зарегистрированы в

России в 1998 г. и обладали всеми изменениями, характерными для вирусов этой эволюционной ветви не только в молекуле НА1, но и в молекуле NA (16 позиций).

Дальнейшие мутации (S69L, T132S, E152G, S182P, I190L, G272D) привели к образованию более современного антигенного варианта А/Н.Каледония/20/99 (филогенетический клайд 1, рис 3.), который входил в состав гриппозной вакцины на протяжении 7 сезонов. После окончательного вытеснения из циркуляции вирусов эволюционной ветви А/Берн/7/95 изменения, произошедшие в НА и NA были незначительными и носили консервативный характер. Российские штаммы, выделенные в этот период (2000-2005 гг.) (А/Калининград/5/00, А/С.Петербург/101/01, А/Калининград/2187/02, А/С.Петербург/10/05), отличались небольшим количеством штаммоспецифических замен, некоторые из которых закрепились в ходе эволюции (V165A, W251R) у последующих вирусов.

Эпидемические события 2005-2007 гг. характеризовались постепенным увеличением доли участия вирусов A(H1N1) в эпидемиях гриппа в России. Для штаммов, выделенных в этот период, характерно появление новых антигенных детерминант и существенная генетическая гетерогенность, что согласуется с данными антигенного анализа.

В сезон 2005-2006 гг. нами зарегистрировано появление кластера вирусов, являющихся промежуточным звеном между вирусами, близкородственными штамму А/Н.Каледония/20/99 и вирусами, относящимися к разновидности А/Соломоновы Острова/3/О6 и А/Брисбен/59/07 (филогенетический клайд 2а, рис.3). Репрезентативный штамм этой группы - А/С.Петербург/7/06. Гемагглютинин подобных изолятов обладал 5 дифференциальными заменами (Т82К, Y94H, R145K, R208K, T266N), характерными для новых референс-вирусов. Замены в позициях 94 и 145 носили реверсивный характер и наблюдались у штаммов разновидности А/Иоханнесбург/82/96. По результатам антигенного анализа вирусы, родственные эпидемическому штамму А/С.Петербург/7/06 демонстрировали слабое взаимодействие с антисывороткой А/Соломоновы Острова/3/О6, что объясняется отсутствием существенной замены К—>Е в 140 положении антигеного сайта Ca.

I— А/Воронеж/1207 А/С.-Петербург/10ГО7

]_>-А/Астрахэ*ЛШ7

■ • А/МосккШ07 I— А/Ростов-на-Дону/1в07 >-АЛверьШШ

А/Челябинск/1/06 МА/Хабаровск/2/06 "л/Хабаровск/ЗЗ/Об иА/С.-Петербург/07/06 А/С.-Пегер6ург/0в06

■ А/Соломоновы о-ва/Ж

IА

—А/Хабаровск/21/06 ■ А/С.-Петербургйй07 -А/БрисбенШ07

А/КраэноярскМ&05 А/Красноярск/ЮТ А/КкснояхкШВ А/Хабароеск/51/05 А/Новосибирск©05 А/С.-Петербург/1СУ05 А/Нжний Новгород/21(У06 А/МоскваШОб 'А/РязалЛЗГОб —А/Хабаровск/6902 —А/С.-Петербург/101/01

_| А/Капининград/900

] I А/Калининград/2187/02 ' А/Новая КаледонияШЭЭ

А/Ула+-УдэИ098

— А/Пекин/262/95

-А/Екатеринбург/42997 -А/Екагеринбург/36СУ97 -/ШшгнжМт - А/Йоханесбург/82/96 -А/Берн/7/95

■АЛезсасШ91

-А/Тай вань/1/86

Рис. 3. Филогенетическое древо вирусов гриппа А/НШ1, выделенных в России в период с 1997 по 2007 гг.

Жирным шрифтом выделены эталонные штаммы.

Продолжающийся интенсивный антигенный дрейф привёл к появлению нескольких новых генетических кластеров в сезон 2006-2007 гг. Основная масса изолятов, что согласуется и с антигеным анализом, отличалась как от старых, так и от новых дрейф-вариантов вируса гриппа A(H1N1). Данная группа штаммов обладала десятью отличительными аминокислотными позициями в отношении НА1 референс-штамма А/Новая Каледония/20/99, восьмью позициями от вакцинных штаммов А/Соломоновы Острова/3/О6 и А/Брисбен/59/07 и пятью от НА штаммов 2006 г. Мутационные изменения, характерные только для данной группы, затрагивали антигенные сайты Са (169) и Sb (188, 189), а также позиции 36 и 183, находящиеся вне антигенно значимых областей. Все названные замены были абсолютно новыми, и ранее изменения в этих аминокислотных позициях не наблюдались.

Репрезентативный штамм этой группы - А/С .Петербург/10/07 (филогенетический клайд 2с, рис.3).

Гемагглютинин вирусов А/С.Петербург/96/07 и А/Хабаровск/515/07 значительно отличался от НА штаммов, описанного выше кластера. Основной отличительной заменой стала замена лизина на глютаминовую кислоту в 140 позиции. Сравнительное изучение НА эпидемического штамма А/С.Петербург/96/07 и референс-вируса А/Брисбен/59/07 выявило их полную идентичность, что доказывает циркуляцию в эпидемический сезон 2006-2007 гг. вирусов, явившихся основным этиологическим агентом эпидемии 2007-2008 гг. (филогенетический клайд 2Ь, рис.3.). Вирус гриппа A(H1N1), выделенный в Хабаровске, не был подобен ни вакцинным штаммам, ни эпидемическим вирусам 2007 г. и характеризовался заменами, свойственными популяции вирусов гриппа, циркулировавшей в азиатских странах (по данным Нау A. et al., 2007).

Таким образом, среди изученных штаммов вируса гриппа, выделенных в эпидемический сезон 2006-2007 гг., были выявлены три генетические группы: вирусы, подобные А/Н.Новгород/3/07, вирусы азиатского происхождения и штаммы родственные новому компоненту A(H1N1) гриппозной вакцины -А/Брисбен/59/07.

Отличия двух эволюционных кластеров А/Пекин/262/96 и А/Брисбен/59/07 были также зафиксированы в молекуле NA. Молекулярно-биологический анализ NA эпидемического штамма А/С.Петербург/96/07 показал, что основные изменения, наблюдаемые у данного изолята, были

характерны для вирусов нового антигенного эволюционного направления, вирусов, подобных референс-штамму А/Брисбен/59/07. Самые существенные изменения произошли в положениях № 214, 222, 234, 249, 287, 354 и 382. Однако стоит заметить, что не все аминокислотные замены характерные для нового вакцинного штамма были обнаружены в NA эпидемического вируса А/С.Петербург/96/07. Так существенные замены в области ствола в позициях 45(Н—>N) и 78 (К—>Е), и в позициях 344 (D->N) и 329 (К^Е) не фиксировались. Интересно также отметить штаммоспецифическую замену аспарагина на серии в положении 70, при которой происходит потеря ПСГ и три замены реверсивного характера в позициях 222,234 и 344.

Таким образом, за десятилетний период был отмечен параллельный дрейф НА и NA. Вышеописанные эволюционные изменения NA российских изолятов были характерны в целом и для эволюции вирусов гриппа в мире. Однако не всегда антигенные и генетические характеристики НА эпидемических штаммов соответствовали таким характеристикам NA.

Суммируя данные генетического и филогенетического анализа, можно констатировать то, что за период 1997-2007 гг. дрейфовые изменения коснулись 31 кодона НА1, 15 из которых находились в антигенно значимых областях НА (Са, Cb, Sa, Sb). Наиболее подвержены эволюционным изменениям оказались сайты Са и Sb, где в процессе эволюционного дрейфа произошло 12 замен. Сопоставляя данные антигенного анализа и структуру НА1 вирусов гриппа A(H1N1) можно предположить, что изменения в позициях 82, 94,130, 140, 152, 169, 188, 193, 270 и 272 определили антигенные особенности вирусов, относящихся к разным эволюционным ветвям и генетическим клайдам.

ВЫВОДЫ

1. На территории России в период с 1997 по 2007 гг. в рамках мониторинга за гриппом выявлена одновременная циркуляция вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. Наиболее активными в эпидемическом плане вирусами являлись вирусы гриппа A(H3N2), составляющие 49,3% от всех изученных штаммов. При этом вирусы подтипа H1N1 активно циркулировали в самом начале XXI века и стали проявлять лидирующие свойства в 2007 году.

2. Установлено, что антигенный дрейф отечественных штаммов A(H3N2) соответствовал эволюционным изменениям вирусов гриппа A(H3N2) в мире и

носил непрерывный поступательный характер. В период 2004-2007 гг. на территории России регистрировалась циркуляция штаммов, не имеющих значимых антигенных и генетических отличий, как между собой, так и от референс-штаммов, что говорит о снижении скорости эволюции вирусов этого подтипа.

3. Выявлена резкая смена антигенного профиля циркулирующих штаммов A(H1N1) в периоды 2000-2001 гг. и 2006-2007 гг. На рубеже 20062007 гг. выявлено три новых в антигенном и генетическом отношении кластера вирусов A(H1N1). Усиление гетерогенности и появление вирусов, имеющих существенные отличия от «старых» вариантов, указывает на начало активной фазы изменчивости для вирусов гриппа A(H1N1) после длительного периода затишья. Высокая гетерогенность и усиление циркуляции вирусов H1N1 в предпандемический период являются, вероятно, основой их вовлечения в процессы реассортации и селекции, что и может рассматриваться в качестве причины появления вируса HINlv с пандемическими свойствами.

4. Определены 45 аминокислотных позиций вирусов гриппа A(H3N2), подвергавшиеся за исследуемый период мутационным изменениям, 16 из которых связаны с селективным преимуществом и оказывают непосредственное влияние на антигенные свойства вируса. Основная масса замен коснулась антигенных сайтов А и В (19 замен), а также РСС (7 замен). Выявлено, что эволюционный дрейф вирусов гриппа A(H1N1) за исследуемый период связан с заменами в 34 позициях НА1.

5. Определены аминокислотные последовательности NA оригинальных отечественных штаммов А/Улан-Удэ/209/98, А/С.Петербург/96/07 A(H1N1) и А/Чита/1/03 A(H3N2). Установлено неполное соответствие характеристик НА и NA отечественных штаммов при параллельном характере дрейфа поверхностных белков вируса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соминина A.A. Этиологическая природа эпидемии гриппа в сезон 1996-1997 гг./ А.А.Соминина, О.М. Литвинова, В. Б. Родионова, H.H. Коновалова и др.// Материалы юбилейной международной научной конференции «Грипп XXI век», С.-Пб., 28 сентября - 2 октября., 1997 г. - С. 23-33.

2. Банников А.И. Моделирование гриппозной инфекции на Т- и В- лимфобластоидных линиях клеток./ А.И. Банников, Т. Д. Смирнова, Т. Г. Лобова, H.H. Коновалова и др.// Тезисы юбилейной международной научной конференции «Грипп XXI век», С.-Пб., 28 сентября - 2 октября, 1997 г.

3. Литвинова О. M. Этиологический надзор в России на базе Федерального Центра по гриппу./ О. М. Литвинова, Л. Г. Юхнова, H.H. Коновалова и др.// Тезисы юбилейной международной научной конференции «Грипп XXI век», С.-Пб., 28 сентября - 2 октября 1997 г.

4. Юхнова Л. Г. Геномный анализ реассортантных штаммов вируса гриппа, выявленных при этиологическом надзоре за гриппом в России в 1988-1989 гг./ Л. Г. Юхнова, О. М. Литвинова, И. Б. Коновапенко, H.H. Коновалова, О. И. Киселёв// VII Съезд Всероссийского Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов,- Москва., 28-31 января 1997 г,-Т. 1.-С. 43-44.

5. Литвинова О. М. Этиологическая характеристика гриппа в России в настоящий период./ О. М. Литвинова, H.H. Коновалова, В. Б. Родионова и др.// VII Съезд Всероссийского Общества эпидемиологов, микробиолгов и паразитологов. Москва. 28-31 января 1997 г.

6. . Банников А.И. Репродукция вирусов на Т- и В- лимфобластощшых линиях клеток./ А.И. Банников, Т. Д. Смирнова, Т. Г. Лобова, Н.И. Коновалова и др.// VII Съезд Всероссийского Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва. 28-31 января 1997 г.

7. Литвинова О. М. Этиология современного гриппа./ О. М. Литвинова, Е.А. Смородинцева, Н.И. Коновалова, Т. Г. Лобова,Э. Г. Деева// Эпидемиология и вакцинопрофилактика,- №1. 2001,-С. 5-9.

8. Литвинова О. М. Динамика эволюции вирусов гриппа с 1977 г. по 2001 г. (по данным Федерального центра по гриппу)./ О. М. Литвинова, H.H. Коновалова, О. И. КиселёвII Материалы Всероссийской научной конференции «Современные аспекты вакцинопрофи-лактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций». С.-Пб, 16-18 апреля, 2001, С.41-45.

9. Коновалова Н.И. Антигенные и биологические свойства вирусов гриппа A(H1N1) 20002001 гг. выделенных в России./ H.H. Коновалова, Н.Е. Белозёрова, Т. Г. Лобова, М М. Баландина//Материалы Всероссийской научной конференции «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций». С.-Пб, 16-18 апреля, 2001, С.46-47.

10. Литвинова О. М. Использование авирулентного штамма A(H5N2) для приготовления гриппозной диагностической сыворотки к гемагглютинину Н5./ О. М. Литвинова, Н.И. Коновалова, Т. Г. Лобова, P.A. Трубникова// Всероссийская научно-практическая конференция «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций » С.-Пб, 16-17 апреля, 2002.

11. Литвинова О. М. Этиология гриппа/ О. М. Литвинова, Е.А.Смородинцева, H.H. Коновалова, Т. Г. Лобова, Э. Г. Деева// В кн. «Грипп и другие респираторные вирусные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия» по ред. О.И. Киселёва, И.Г. Маринича, A.A. Сомининой., СПб., 2003., С. 55-69.

12. Litvinova О.М. The etiological surveillance for influenza in Russia during the 1993-2002 seasons/ O.M. Litvinova, N.I. Konovalova, T.G. Lobova, A. I. Bannikov/^"1 annual Meeting European Society for Clinical Virology ESCV 2003, Lyon Palais des Congres 24-27 August 2003, Abstract № 366.

13. Маринич И.Г. Информация о ситуации по гриппу в мире и в России в 2002-2003 гг./ И.Г. Маринич, A.A. Соминина, Л.С. Карпова, Е.А. Смородинцева, Н.И. Коновалова// Эпидемиология и вакцинопрофилактика 2003. - Т. №6. - С. 13-19.

14. Litvinova О.М. The etiological surveillance for influenza in Russia during the 1993-2003 seasons/ O.M. Litvinova, N.I. Konovalova, T.G. Lobova// Options for the control of influenza V. Okinawa, Japan, 7-11 October, 2003, Abstract WO l-P-23, P. 68.

15. Литвинова О. M. Характеристика эпидемий гриппа в России в 2002-2003 гг./ О. М. Литвинова H.H. Коновалова и др.// Материалы симпозиума «Повышение готовности к пандемии гриппа на основе военно-гражданского сотрудничества» СПб., 9-11 мая 2003 г., С.48.

16. Коновалова Н.И. Особенности антигенных и биологических свойств вирусов гриппа, выделенных в России в эпидемический сезон 1998-1999 гг./ Н.И. Коновалова,

П.М. Анфимов. О. М. Литвинова// Материалы симпозиума «Повышение готовности к пандемии гриппа на основе военно-гражданского сотрудничества» СПб., 9-11 мая 2003 г.,С.49.

17. Литвинова О. М. Феномен реверсии в эволюции вирусов гриппа В в России (1983-2003 гг.)/ О. М. Литвинова, А. М Банников, Н. Ю. Черноокая, Н.И. Коновалова и др.// Материалы юбилейной научной конференции «Современная микробиология в клинической медицине и эпидемиологии» СПб., 21 мая 2003 г., С. 66.

18. Литвинова О. М. Характеристика эпидемии гриппа в России в 2003-2004 гг./ О. М. Литвинова, Н.И. Коновалова, Т. Г. Лобова и др.// Международная конференция «Актуальные вирусные инфекции- практические и теоретические аспекты» СПб., 2-5 ноября 2004г., С. 26-27.

19. Соминина А.А. Анализ эпидемии гриппа, сезон 2004-2005 гг., по результатам исследования выделенных вирусов и дифференциальной лабораторной диагностики ОРВИ/ А.А.Соминина, О.И.Киселев, М.Ю.Еропкин, О.М. Литвинова, Н.И. Коновалова и др.// В сб.: Грипп, гриппоподобные заболевания, их профилактика и лечение (под ред. В.И.Покровского, Г.Г.Онищенко, О.И.Киселева). СПб. 2005. - С. 39-56.

20. Соминина А. А. К вопросу о штаммовой композиции гриппозных вакцин на предстоящий эпидемический сезон 2005-2006 годов / А.А. Соминина, Н.И. Лонская, М.Ю. Еропкин, О.М. Литвинова. Н.И. Коновалова и др.// Эпидемиол. и вакцинопрофилакгика, 2005. - Т.23. - № 4.-С. 3-7.

21. Коновалова Н.И. Характеристика вирусов гриппа А и В человека, циркулировавших в России с 1997 по 2005 годы./ Н.И. Коновалова, Т.Г. Лобова, О.М. Литвинова и др.// МЕДЛАЙН Экспресс, 2005. - № 8 (184). - С. 7-9.

22. Соминина А.А. Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация/ А.А. Соминина, Е.И. Бурцева, Н.И. Коновалова, О.М. Литвинова, А.Н. Слёпушкин, В.Т. Иванова// Методические рекомендации,- М.-2006.-24 С.

23. Konovalova N.I. Etiology of influenza viruses isolated in Russia from 1998 up to present time./ N.I. Konovalova, O.M. Litvinova, T.M. Gudkova et al.// Vaccine. - 2006. - V. 24. - No. 44-46.-P. 6697-6700.

24. Stukova M. HA gene of influenza A viruses isolated in Russian Federation during 2005-2006 epidemic season./ Stukova M., Buzitskaya J., Konovalova N. et al.// Intern. Conf. "Preparedness to the influenza pandemic - an internat. outlook", March 15-17,2007, SPb., P.28-30.

25. Eropkin M.Yu. Divergent pathway of evolution of present-day influenza A (H1N1) viruses in Russia/ Eropkin M.Yu., Konovalova N.I., Grigorieva V.A.et al.// Intern. Conf. "Preparadness to the influenza pandemic - an internat. outlook", March 15-17,2007, SPb., P.52.

26. Zarubaev V.V. Study of susceptibility of influenza isolates of 2004-2006 to antiviral drug rimantadine./ Zarubaev V.V., Guseva V.M., Fedorova O.A., Schtro A.A., Konovalova N.I. et al.// Intern. Conf. "Preparedness to the influenza pandemic - an internat. outlook", March 15-17, 2007, SPb., P. 53.

27. Eropkin M.Yu. Recent features of evolution of influenza A (H1N1) viruses in Russia/ M.Yu. Eropkin, N.I. Konovalova, V.A. Grigorieva et al.// Options of the Control of Influenza IV. -Toronto, Canada. - 2007. - P. 408-409.

28. Еропкин М.Ю. Противовирусное действие некоторых антиоксидантов/антигипоксантов, а также их комбинаций с ремантадином в отношении вирусов гриппа человека A(H3N2) на моделях in vitro// М.Ю. Еропкин, Т.М. Гудкова, Н.И. Коновалова и др.// Эксп. клинич. фармакол. - 2007. - Т. 70. - № 5. - С. 33-37.

29. Писарева М.М. Молекулярно-биологическая характеристика вирусов гриппа А и В, изолированных на территории Российской Федерации в течение эпидемических сезонов 2005-2007 гг./ М.М, Писарева, Н.И. Коновалова, Е.А. Елпаева и др.// «Молекулярная диагностика-2007». Сб. конф., М. -2007. - т. 1. - С. 215-216.

30.Коновалова Н.П. Мониторинг эволюшш вирусов гриппа человека в России как часть системы подготовки к вероятной пандемии/ Н.И.Коновалова, В.А. Григорьева, Т.М., Гудкова// Вестник Рос. Военно-Мед. Академии, 2008, т.23, № 3, приложение 2, часть II. Конгресс «Экофорум 2008». - С.305.

31. Pisareva M. Genetic and antigenic structure of influenza virus A H1N1 strains isolated in Russia in 2005-2008 epidemic seasons/ Pisareva M., Konovalova N., Zadonskaya AM 3rd ESWI Conference, Vikamoura, Portugal, 14-17 Sept. 2008. - P. 183-184.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю кандидату биологических наук Литвиновой О.М., доктору биологических наук Еропкину М.Ю. и всему коллективу лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа. Особую признательность за консультативную помощь автор выражает профессору, академику РАМН Киселёву О.И., а также сотрудникам лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа СЗО РАМН.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НА - гемагглютинин NA - нейраминидаза

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ОТ-ПЦР - обратно-транскриптазная полимеразно- цепная реакция

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РСС - рецептор - связывающий сайт

ПСГ - потенциальный сайт гликозилирования

Отпечатано: ООО «Сан-Принт» Санкт-Петербург, Каменноостовский д. 54, тел. 234-22-22 Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Заказ от 27 октября 2009г. Тираж 50 экз.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Коновалова, Надежда Игоревна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1: ЭВОЛЮЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ ВИРУСОВ ГРИППА А (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Механизмы изменчивости вирусов гриппа А.

1.2 Эволюционная изменчивость вирусов гриппа А(НЗЫ2).

1.2.1 Особенности антигенных свойств вирусов гриппа А(НЗЫ2).

1.2.2. Молекулярная эволюция гемагглютинина вирусов гриппа А(НЗШ).

1.2.3. Аминокислотные изменения белка КА (N2) вирусов гриппа человека.

1.2.4. Изменения рецептор-связывающих свойств современных вирусов гриппа А(НЗК2).

1.3 Этиология вирусов гриппа А (НШ1).

1.3.1 Антигенная структура НА вируса гриппа А(НШ1).

Сходство и отличия НА (Н1) и НА (НЗ).

1.3.2. Особенности антигенного и генетического дрейфа вирусов гриппа А (НШ1).

Глава 2: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.2 Методы.

Глава 3: ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЦЕССА АНТИГЕННОГО ДРЕЙФА

ВИРУСОВ ГРИППА А(НЗШ) 1997-2007 гг. ВЫДЕЛЕНИЯ.

3.1 Выраженная гетерогенность вирусов гриппа А(НЗШ), возбудителей эпидемии 1997-1999 гг. в России.

3.2. Анализ антигенных взаимоотношений вирусов гриппа А(НЗШ), выделенных в эпидемический сезон Л 999-2000 гг.

3.3. Сравнительное изучение антигенных характеристик гемагглютинина представителей эпидемии гриппа А(НЗШ) 2002-2003 гг.

3.4 Антигенная характеристика возбудителей моноэтиологичной эпидемии гриппа А(НЗ№) 2003-2004 гг.

3.5. Продолжающийся антигенный дрейф вирусов гриппа A(H3N2) -возбудителей эпидемии гриппа 2004-2005 гг.

3.6. Антигенная гетерогенность вирусов гриппа A(H3N2) эпидемического сезона 2005-2006 гг.

3.7. Сравнительная антигенная характеристика вирусов гриппа A(H3N2), выделенных в эпидемический сезон 2006-2007 гг.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эволюционная изменчивость вирусов гриппа А, циркулировавших в России в 1997-2007 гг."

Актуальность темы. Грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), несмотря на определенные успехи вакцино- и химиопрофилактики, остаются одной из самых актуальных медицинских и социально экономических проблем. В России на грипп и ОРВИ ежегодно приходится до 90% от всей регистрируемой инфекционной заболеваемости (до 30 млн. больных; из них 45-60% дети). Экономический ущерб, причиняемый гриппом и ОРВИ, составляет около 86% от экономических потерь, наносимых инфекционными болезнями (Слёпушкин А.Н., 2003; Маринич И. Г. с соавт., 2004).

Цель, исследования: Целью настоящего исследования является изучение молекулярно - генетических основ антигенной, изменчивости, вирусов гриппа человека подтипов A(H1N1) и A(H3N2), выделенных в России на протяжении 10 лет (1997-2007 гг.), и выявление закономерностей эволюции вирусов гриппа А.

Задачи исследования:

2. Изучить в сравнительном, аспекте антигенные свойства вирусов гриппа подтипов. A(H1N1) и A(H3N2), изолированных в разных регионах России, и установить степень гетерогенности популяций циркулирующих штаммов.

Научная новизна.

Впервые на большом фактическом материале, включающем результаты изучения около 1500 штаммов вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2), установлены основные направления эволюции современных вирусов гриппа А.

Впервые в 1998 г. на территории России зарегистрировано первичное появление и прослежено дальнейшее распространение вирусов гриппа A(H1N1), относящихся к новой эволюционной ветви и имеющих антигенное родство с эталоном А/Пекин/262/96. Была показана реальная возможность обнаружения опережающих вариантов вируса гриппа, которые приобретают эпидемическую значимость на территории страны через 2-3 года после их первичного появления.

На рубеже 2005-2006 гг. впервые зафиксировано выделение штаммов A(H1N1), обладающих существенными дрейфовыми изменениями в гене НА1 и значительно отличающихся от вирусов, циркулировавших ранее. Представителем этой разновидности является вирус А/С.Петербург/7/06. Данные вирусы занимают промежуточное положение между эволюционными клайдами, представителями которых являются штаммы А/Новая Каледония/20/99 и А/Брисбен/59/07.

В сезон 2006-2007 гг. показаны увеличение эпидемической активности вирусов подтипа A(H1N1) и одновременная циркуляция трёх генетических вариантов. Впервые изолированы в России штаммы подобные новому эталону А/Брисбен/59/07. Активный антигенный дрейф вирусов НШ1 в предпандемический период представляется особенно важным с точки зрения последующего вовлечения вирусов этого подтипа в реассортацию и активную селекцию с переходом в шифт в пределах одного подтипа (НШ1).

Выявлены особенности изменчивости вирусов гриппа А(НЗЫ2). Вирусы данного подтипа характеризуются активной циркуляцией, постоянным антигенным дрейфом и выраженной гетерогенностью популяции.

Впервые проведённый молекулярно-биологический и филогенетический анализ штаммов А(НШ1) и А(НЗ№), циркулировавших в период с 1997 по 2007 гг. в России, позволил выявить направленность антигенного дрейфа и определить основные детерминанты молекулы гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (ЫА), ответственные за антигенные отличия.

Установлено частичное несоответствие антигенной и генетической структуры, российских изолятов А(НШ1) и А(НЗ№) актуальным вакцинным и референс-штаммам, что обуславливает важность локального этиологического мониторинга за гриппом.

Практическая значимость работы.

Изоляция и идентификация вирусов гриппа, циркулирующих на территории России (1997-2007 гг.), позволили определить этиологию эпидемий и сезонных подъёмов заболеваемости. На протяжении 10-ти лет осуществлялась помощь практическому здравоохранению в расшифровке гриппозных заболеваний; Выделены и изучены 1476 эпидемических штаммов вируса гриппа А. Все изоляты включены в коллекцию музея вирусов гриппа ГУ НИИ гриппа РАМН.

Результаты изучения антигенных и генетических свойств эпидемических изолятов позволили определить основные направления-эволюции вирусов гриппа А и выявить новые оригинальные штаммы, что важно в практическом плане при прогнозировании эпидемий и вероятных пандемий, а также при выборе кандидатов в вакцинные штаммы и штаммы для производства диагностических препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту.

3. Определены и изучены аминокислотные позиции НА1 и NA отечественных изолятов, подверженные антигенному дрейфу. Ключевые позиции, существенно влияющие на антигенные свойства вируса, фиксировались в антигенно значимых областях А, В, С и Е НА1 (НЗ) и в антигенных сайтах Ca, Cb и Sb HAI (Hl).

4. Согласно проведённому антигенному, генетическому и филогенетическому анализу дрейфовые изменения вирусов гриппа

А(НЗИ2) и А(НШ1) соответствовали глобальной тенденции молекулярно - генетической эволюции этих вирусов в мире. Однако штаммы, циркулировавшие на территории России, обладали определённым набором оригинальных замен, отличающих их от референс-штаммов, рекомендованных в состав гриппозных вакцин.

5. Раннее выявление штаммов, относящихся к новым эволюционным ветвям, а также вирусов, являющихся промежуточным звеном между различными филогенетическими ветвями, позволяет правильно оценить этиологическую ситуацию и определить эпидемические потенции различных генетических и антигенных вариантов.

Внедрение результатов в практику. Все исследования входили в плановую научную тематику лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа ГУ НИИ гриппа РАМН и были поддержаны международным грантом МНТЦ №3070 «Дальнейшее усовершенствование надзора за гриппом в России. Вклад в глобальную подготовку к пандемии гриппа».

Материалы исследования используются в учебном процессе в курсе тематического усовершенствования; профессиональной переподготовки и сертификационном курсе по специальности «Вирусология» на базе ПДО СПб ГОУВ Государственной Медицинской академии им. И.И. Мечникова совместно с НИИ гриппа СЗО РАМН.

Личный вклад автора в проведение исследований. Автором-выполнен основной объем работ по* изоляции, типированию, изучению антигенных свойств вирусов и филогенетическому анализу. Проведен теоретический анализ поведения вирусов НЗИ2 и НШ1 в предпандемический период.

Апробация результатов исследований. Материалы диссертации были представлены на юбилейной международной научной конференции «Грипп XXI век» 1997г., VII Съезде Всероссийского Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 1997 г., Всероссийской научной конференции «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций» 2001г., 6th annual Meeting European Society for Clinical Virology ESCV 2003, Options for the control of influenza V. Okinawa, Japan 2003, симпозиуме «Повышение готовности к пандемии гриппа на основе военно-гражданского сотрудничества» СПб., 2003 г., юбилейной научной конференции «Современная микробиология в клинической медицине и эпидемиологии» СПб., 2003 г., Международная конференция «Актуальные вирусные инфекции -практические и теоретические аспекты» СПб., 2004г., на международных конференциях "Preparedness to the influenza pandemic — an international outlook", S.-Petersburg, Russia 2007, Options for the Control of Influenza IV, 2007, Toronto, Canada, на конгрессе «Экофорум 2008», на международной конференции 3rd ESWI Conference, Vilamoura, Portugal, 2008.

Публикации. Результаты диссертации отражены в 31 печатной работе, в том числе в 6 реферируемых журналах, а также тезисах докладов на Международных и Всероссийских конгрессах, съездах и конференциях и методических рекомендациях.

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 188 печатных листах, состоит из: введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов-и списка литературы. Работа иллюстрирована 31 таблицей и 5 рисунками: Список литературы содержит 296 источников, в том числе 22 отечественных и 274 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Коновалова, Надежда Игоревна

ВЫВОДЫ:

1. На территории России в период с 1997 по 2007 гг. в рамках мониторинга за гриппом выявлена одновременная циркуляция вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗИ2) и В. Наиболее активными в эпидемическом плане вирусами являлись вирусы гриппа А(НЗИ2), составляющие 49,3% от всех изученных штаммов. При этом вирусы подтипа НШ1 активно циркулировали в самом начале XXI века и стали проявлять лидирующие свойства в 2007 году.

2. Установлено, что антигенный дрейф отечественных штаммов А(НЗ№) соответствовал эволюционным изменениям вирусов гриппа А(НЗШ) в мире и носил непрерывный поступательный характер. В период 2004-2007 гг. на территории России регистрировалась циркуляция штаммов, не имеющих значимых антигенных и генетических отличий, как между собой, так и от референс-штаммов, что говорит о снижении скорости эволюции вирусов этого подтипа.

3. Выявлена резкая смена антигенного профиля циркулирующих штаммов* А(НШ1) в периоды 2000-2001 гг. и 2006-2007 гг. На рубеже 20062007 гг. выявлено три, новых в антигенном и генетическом отношении« кластера^ вирусов* А(НШ1). Усиление гетерогенности и появление вирусов, имеющих существенные отличия от «старых» вариантов, указывает на начало активной' фазы изменчивости для вирусов гриппа А(НШ1) после длительного периода затишья. Высокая гетерогенность и усиление циркуляции вирусов НШ1 в предпандемический период являются, вероятно, основой их вовлечения в процессы реассортации и селекции, что и может рассматриваться в качестве причины появления вируса НШ1у с пандемическими свойствами.

4. Определены 45 аминокислотных позиций вирусов гриппа А(НЗШ), подвергавшиеся за исследуемый период мутационным изменениям, 16 из которых связаны с селективным преимуществом и оказывают непосредственное влияние на антигенные свойства вируса. Основная масса замен коснулась антигенных сайтов А и В (19 замен), а также РСС (7 замен). Выявлено, что эволюционный дрейф вирусов гриппа А(НШ1) за исследуемый период связан с заменами в 34 позициях НА1.

5. Определены аминокислотные последовательности КА оригинальных отечественных штаммов А/Улан-Удэ/209/98, А/С.Петербург/96/07 А(НШ1) и А/Чита/1/03 А(НЗК2). Установлено неполное соответствие характеристик НА и ЫА отечественных штаммов при параллельном характере дрейфа поверхностных белков вируса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярно-биологические исследования НА и ИА российских изолятов показали, что наибольшее количество существенных изменений в структуре поверхностных белков сопровождало появление в циркуляции штаммов, относящихся к новым филогенетическим ветвям.

Изменения, которыми обладали вирусы пекинской разновидности, включали в себя 8 основных позиций НА и 14 позиций КА. Самым важным дифференциальным отличием НА вариантов А/Берн/07/95 и А/Пекин/262/96 стала делеция лизина в 130 положении антигенного сайта 8а. Последующие дрейфовые изменения привели к смене аминокислот ещё в 7 положениях НА и 4 позициях ЫА, характерных для более нового антигенного варианта А/Новая Каледония/20/99. Все вышеперечисленные изменения были характерны для отечественных штаммов вируса гриппа А(НШ1).

Последующие генетические изменения, также как изменения антигенных свойств не были столь значительными. За период 2000-2005 гг. в ходе эволюционного процесса закрепилось только 4 замены в положениях 69, 165,251 и 252 НА1.

Постепенное усиление активизации вирусов гриппа А(НШ1) стало наблюдаться в 2006 г., когда в циркуляции появился новый в генетическом отношении кластер вирусов, обладающий 7 аминокислотными заменами, 5 из которых являются кардинально новыми и характерными для современного вакцинного штамма А/Соломоновы Острова/3/О6 (репрезентативный штамм А/С.Петербург/6/06). Дальнейшее усиление гетерогенности привело к появлению в сезон 2006-2007 гг. трёх различных генетических вариантов: А/Н.Новгород/3/07, А/Хабаровск/515/07 и А/С.Петербург/96/07. Эти группы вирусов значительно отличались как между собой, так и от вакцинного штамма А/Новая Каледония/20/99. Наибольшими потенциями обладали вирусы варианта А/С.Петербург/96/07, НА которых был идентичен референс-вирусу А/Брисбен/59/07. Необходимо отметить, что NA данного изолята не полностью соответствовала характеристикам его НА.

Проанализировав в сравнительном аспекте аминокислотные последовательности НА российских изолятов A(H1N1) мы определили позиции, которые в ходе эволюции претерпели изменения. Из 35 замен, включая делецию в 130 позиции, 18 находились в антигенно значимых областях НА (Са, Cb, Sa, Sb). Наиболее подвержены эволюционным изменениям оказались антигенные сайты Са и Sb, где в процессе антигенного дрейфа произошло 12 замен. Сопоставляя данные антигенного анализа и структуру НА Современных вирусов гриппа A(H1N1) можно предположить, что изменения в позициях 82, 94, 130, 140, 152, 169, 188, 193, 270 и 272 влияли на антигенные отличия вирусов, относящихся к разным эволюционным ветвям и генетическим кластерам.

ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности эпидемического процесса при гриппе, прежде всего, обусловлены характеристиками циркулирующих штаммов и показателями коллективного иммунитета населения, что определяет основные направления борьбы с этим возбудителем, а именно, надзор за распространением инфекции, своевременная диагностика и профилактика заболевания.

Углублённое изучение эпидемических штаммов позволяет проследить основные тенденции изменчивости и направленность антигенного дрейфа вируса гриппа, установить эволюционные связи между, ранее циркулировавшими и вновь появившимися, филогенетическими клайдами вируса.

Данные об эпидемически актуальных штаммах необходимы для проведения профилактических мероприятий, создания противогриппозных вакцин и специфических диагностических препаратов.

В связи с вышесказанным, нами была поставлена цель провести основные исследования и анализ данных этиологического надзора за распространением вирусов гриппа подтипов А(НШ1) и А(НЗ№) в России на протяжении 10 лет (1997-2007 гг.) и выявить закономерности* эволюции вирусов гриппа А с целью обеспечения основных направлений в мониторинге сезонных эпидемий и подготовки диагностических и вакцинных штаммов.

Сложность современной этиологической ситуации в России, как и в мире, заключается в одновременной циркуляции вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗШ) и В. Кроме того, существование множественных подтипов и филогенетических вариантов вирусов гриппа типа А и их активная циркуляция среди различных видов животных является благоприятным фоном для возникновения различных реассортантов с пандемическим потенциалом, что и привело к появлению новых реассотртантов в * пределах подтипа НШ1, вызвавших пандемию 2009 года.

В первую очередь нами была определена структура популяции вирусов гриппа каждого из исследуемых сезонов. На протяжении всего периода изучения мы регистрировали циркуляцию вирусов гриппа А, однако процентное соотношение подтипов A(H1N1) и A(H3N2) в определённые эпидемические сезоны было различным. Большинство эпидемий гриппа на территории нашей страны были связаны с активной циркуляцией вирусов гриппа A(H3N2) и лишь в сезоны 1997-1998 гг. и 2000-2001 гг. выделение штаммов A(H1N1) достигло 75,9% и 92,1%, соответственно.

Эти данные согласуются с данными этиологического мониторинга Центров ВОЗ за гриппом в мире, в соответствии с которыми как в мире, так и в России, в данный период с кратковременными интервалами доминировали вирусы подтипа A(H3N2) [267, 271, 274, 276, 277].

Непрерывная изменчивость современных вирусов гриппа A(H3N2) приводит к постоянному появлению новых антигенных кластеров, а генетическая гетерогенность популяции вирусов, повидимому, является благоприятным фоном для селекции вариантов вируса с поверхностными белками (НА и NA), обладающими новыми антигенными свойствами.

Наиболее существенные антигенные изменения вирусов гриппа A(H3N2) были зафиксированы при появлении в циркуляции штаммов подобных А/Сидней/5/97. В мире вирусы, относящиеся к этой разновидности, вызвали обширные эпидемии во многих странах, в том числе и в США, в 1997-1998 гг., вытеснив такие «старые» варианты вирусов, как А/Йоханнесбург/33/94, и близкие к нему штаммы [11, 129, 175]. В России подобная эпидемия была зарегистрирована в 1998-1999 гг. Однако эпидемические события этого сезона в отношении региональных изолятов отличались отчетливой^ гетерогенностью. В частности, нами были изолированы не только актуальные штаммы А/Сидней/5/97, но и вирусы, антигенно близкие А/Йоханнесбург/33/94 и более современным эталонам А/Панама/2007/99" и А/Москва/10/99. Именно последняя- разновидность вирусов, A(H3N2) стала практически единственным этиологическим фактором сезона 1999-2000тг. в России.

После двухлетнего относительного «затишья» вирусы гриппа A(H3N2) вновь доминировали в эпидемию гриппа в 2002-2003 гг. и обладали абсолютным преимуществом в моноэтиологичную эпидемию 2003-2004 гг. Значительный подъём заболеваемости и широкое распространение вирусов гриппа A(H3N2) в этот период времени в России связаны с появлением на эпидемической арене вирусов подобных А/Фуцзянь/411/02. Данные изоляты широко распространились по всему миру, вызвав обширные эпидемии в Америке, Азии и Европе. Штаммы новой разновидности значительно отличались по своим антигенным свойствам от штаммов близких к А/Панама/2007/99 и именно несоответствие циркулирующих вирусов и компонентов гриппозных вакцин привело к существенному подъёму заболеваемости в эти сезоны [13,117, 184, 274].

Различия в антигенных характеристиках вышеперечисленных вирусов объясняются значительными изменениями структуры их поверхностных белков и, в первую очередь, гемагглютинина Нами была поставлена задача провести молекулярно-генетический анализ НА1 российских изолятов и определить локализацию мутаций, которые привели к аминокислотным заменам, существенно влияющим на антигенные свойства вируса.

Изучению структуры генома вируса гриппа или его части и топографии мутаций в антигенных сайтах, вовлеченных в эволюционные изменения эпидемически актуальных вирусов, посвящено большое количество современных исследований [130, 223, 261, 262, 263]. Изучение структуры генов НА необходимо для прогнозирования направления антигенного дрейфа, а так же для выбора вакцинного штамма [60, 136, 250]. Как известно, для молекулы НА вируса гриппа A(H3N2) определены пять основных антигенных сайтов, изменения в которых коррелируют с изменениями антигенных свойств вируса [40, 61, 261, 262]. В результате секвенации генов НА1 эпидемичесаких изолятов было идентифицировано 18 кодонов, наиболее подверженных позитивной селекции. Эти кодоны локализуются во всех известных антигенных сайтах НА вирусов*гриппа A(H3N2) [48, 81, 83, 141,222].

При сравнительном анализе аминокислотных последовательностей НА1 отечественных штаммов с эталонными вирусами и вирусами предыдущих лет выделения были выявлены замены в 45 позициях, 30 из которых оказались существенными и характеризовались сменой заряда или полярности аминокислот. Из 18 кодонов, наиболее подверженных по нашим данным позитивной селекции, согласно работам Bush R. M. и Fitch W. M. [48], были затронуты 14. Кроме того, нами определены дополнительные ПСГ, которые появились у отечественных штаммов на рубеже 1997-1998 гг. (позиции 122-124, 133-135) и 1999 -2000 гг. (позиции 144-146). Считается, что около 20% общей белковой поверхности НА покрыто боковыми углеводными цепями. Эти сайты рассеяны по молекуле НА, хотя обладают общей тенденцией группироваться вокруг рецептор-связывающего сайта и антигенных сайтов на глобулярной головке НА. Известно, что присутствие или отсутствие олигосахаридных цепей в НА, безусловно, влияет на различные функции белка, в том числе и на антигенные и рецептор-связывающие свойства [128, 218, 238]. Поэтому, можно предположить, что модуляция антигенных свойств эпидемических вирусов в существенной степени определяется мутациями в области сайтов гликозилирования.

Сопоставление антигенных и генетических характеристик российских изолятов различных лет выделения позволило нам сделать вывод, что основными кодонами, изменения в которых были связаны с селективным преимуществом и оказывали непосредственное влияние на антигенные характеристики вируса являются позиции антигенного сайта А (133, 140, 142, 144 и 145), антигенного сайта В (155-159, 192, 193 и 197), а так же антигенных сайтов С (50 и 57) и Е (62). Изменения, которые коснулись РСС, в основном влияли на тропизм вируса и способность размножаться в различных биологических системах. В связи с этим необходимо отметить аминокислотные замены в антигенной области В1 (позиции 150-159). Существенные аминокислотные замены именно в этих положениях приводили к образованию нового антигенного варианта, кардинально отличающегося от своих предшественников! и обладающего» способностью ускользать от иммунной системы хозяина. Считают, что аминокислотные изменения в регионе В1 могут действовать как «триггерные» в появлении нового дрейф-варианта вируса гриппа A(H3N2). Штаммы вирусов с изменениями в сайте В1 молекулы НА1 активнее инфицируют людей ( более контагиозны) в сравнении с мутантами, имеющими изменения в сайтах А, С и В2 [210].

Наши данные так же подтверждают это положение. Например, изоляты А/Хабаровск/2054/96 и А/Москва/41/97 отличаясь от предыдущего вакцинного штамма А/Иоханнесбург/33/94 по 15 и 17 позициям, соответственно, сохранили, однако, антигенное родство с этим эталоном и плохо взаимодействовали с антителами сыворотки к А/Сидней/5/97. Анализ первичной структуры последовательностей НА1 отечественных штаммов показал, что существенные дрейфовые изменения в положениях 156 и 158 антигенной области В1 этих вирусов отсутствуют. Особый интерес в этом отношении представляют штаммы А/Чита/1/03 и А/Чита/3/03. По своим антигенным свойствам эти вирусы более близки к референс-штамму А/Панама/2007/99, но аминокислотная последовательность НА-этих изолятов содержит 8 из 10 известных основных замен, свойственных вирусам разновидности А/Фудзянь/411/02. Однако, ключевой замены Q156H, расположенной в антигенном сайте Bl, у этой группы изолятов, не наблюдается. Интересно, что NA этих изолятов полностью соответствовала NA А/Фудзянь/411/02, что указывает на существование реассортантных вирусов обладающих поверхностными белками, относящимися к различным филогенетическим кластерам. Исследования некоторых авторов с использованием обратной генетики показывают, что именно эти две замены в позициях 155 и 156- могут существенно изменить антигенные свойства* вируса и отвечать за антигенные отличия А/Панама/2007/99 и А/Фуцзянь/411/02 [117,225]. Определяя минимальные изменения, которые отвечали бы за генетический дрейф этих вариантов, авторы обнаружили, что после изменения 2-х из 16 аминокислот (Н155Т, Q156H) НА А/Панама/2007/99 стал антигенно эквивалентен НА А/Фуцзянь/411/02 -подобных штаммов. Действительно, как считают некоторые исследователи, даже одна аминокислотная замена в одном антигеном сайте может вызвать значительные изменения антигенных свойств вируса [117,225] в силу высокой конформационной подвижности молекулы НА.

Дальнейший антигенный дрейф отечественных вирусов гриппа А(НЗЫ2) носил постепенный поступательный характер. На эволюционном отрезке А/Фудзянь/411/02 —> А/Веллингтон/1/04 —»• А/Калифорния/7/04 —» А/Висконсин/67/05 были зарегистрированы замены в антигенных сайтах А, Вив РСС. Часть изолятов, выделенных в РФ в 2007 г., обладала НА подобным новому эталону А/Брисбен/10/07 и именно эта разновидность вирусов А(НЗМ2) вызвала эпидемические события в сезоны 2007-2008 гг. и 2008-2009 гг. в России. Полученные нами данные согласуются с данными других авторов: этот эпидемиологический период характеризуется высокой степенью родства среди вирусов гриппа А(НЗ№), циркулировавших в России, разных странах и на других континетах [12, 104, 194].

Нельзя не обратить внимание на отчетливо выраженную гетерогенность популяции вирусов гриппа А(НЗИ2). Практически в каждый эпидемический сезон на территории России наблюдалась циркуляция нескольких антигенных и генетических вариантов, что, безусловно, затрудняет выбор вакцинного штамма и требует постоянного мониторинга с оценкой антигенных различий изолятов. Возрастание гетерогенности циркулирующих вирусов также может быть одним из признаков предпандемическй ситуации, когда разнообразие вирусов может способствовать их активному взаимодействию с другими штаммами путем рекомбинации и реассортации.

Антигенный дрейф» вирусов гриппа А(НШ1)*не столь интенсивен как у вирусов гриппа А(НЗМ2), однако многолетние наблюдения показали, что постепенное накопление точечных мутаций в гене гемагглютинина (НА) приводит к- смене эпидемически актуального1 варианта вируса гриппа. Эволюционные изменения возбудителей этого подтипа мы проследили на примере штаммов, циркулировавших на территории России в течении 10 лет (1997-2007 гг.).

Считается, что вирусы A(H1N1) часто эволюционируют по так называемому «молчащему пути», когда мутации в гене НА не определяются до тех пор, пока их аккумулирование не приведёт к появлению вируса с антигенными свойствами и геномным набором оптимальными для эпидемического распространения [66, 111, 127]. Роль «молчащих» мутаций в эволюции вирусов, по-видимому, является причиной «импульсных», скачкообразных изменений их антигенной структуры и требует отдельного рассмотрения. Подобные штаммы служат причиной эпидемий гриппа A(H1N1), в отличии от вирусов гриппа A(H3N2). Характерной чертой циркуляции вирусов этого подтипа являются достаточно длительные периоды «затишья» между эпидемиями. По-вимому, это свойство вирусов H1N1 и предопределило их преимущества на исходе эпидемического сезона 2009 года, когда в Мексике и США была зарегистрирована циркуляция нового пандемического штамма H1N1 свиного происхождения.

За исследуемый период мы наблюдали три активные фазы циркуляции вирусов, гриппа A(H1N1): эпидемии гриппа вызванные штаммами, подобными А/Берн/07/95, А/Н.Каледония/20/99 и начало распространения вирусов родственных новому вакцинному штамму А/Брисбен/59/07. В России варианты эталона А/Берн/07/95 доминировали в эпидемии гриппа 1997-1998 г.г. В то же время в этот сезон в Чехии, Франции, России, Сенегале и Южной Африке была зарегистрирована активная циркуляция штаммов разновидности А/Пекин/262/96, которые в некоторых случаях составляли до 20% от общего количества изолятов [12, 189]. Изоляты, обладающие изменёнными антигенными свойствами, нами были обнаружены в эпидемию 1997-1998 гг., позднее именно они» стали предшественниками эпидемических событий в 2000-2001 гг. Из этих наблюдений становится' очевидным, что раннее выявление и изучение -атипичных или более актуальных штаммов вируса гриппа существенно облегчает выбор и подготовку вакцинного-штамма.

Вирусы разновидности А/Новая Каледония/20/99 (Пекинская разновидность) оставались актуальными до 2007 г.[194, 269, 270, 271, 274,

276]. Замена вакцинного компонента А(НШ1) была связана с появлением и широким распространением в мире вирусов гриппа сходных по своим антигенным свойствам с эталоном А/Соломоновы Острова/3/О6. Выделение подобных штаммов фиксировалось в некоторых странах Европы и Азии ещё в 2005-2006 гг., но значительные эпидемические события они вызвали лишь в следующий сезон 2006-2007 гг. [56, 277]. В России изоляты сходные по своим антигенным свойствам с новым эталоном впервые были зафиксированы в 2006-2007 гг., но не имели широкого распространения.

Сопоставляя данные антигенного и генетического анализа сезонных изолятов НШ1, мы определили, что именно в вышеописанные эпидемические сезоны произошло наибольшее количество замен в поверхностных белках, а соответственно и значительное изменение антигенных характеристик вирусов. Например, дистанция между филогенетическими кластерами А/Берн/7/95 и А/Новая Каледония/20/99 включала в себя 13 (включая делецию в 130 позиции) аминокислотных позиций в. НА и 18 аминокислотных позиций в КА< [56, 189, 216, 220]. Интересно, что появление этих вирусов не было разобщено по времени, и в период с 1996 г. по 2000 г. в мире наблюдалась циркуляция штаммов, принадлежащих к обеим филогенетическим линиям [267, 268]. Российские изоляты, относящиеся к новому варианту А/Новая Каледония/20/99 обладали всеми вышеперечисленными изменениями и циркулировали в России до 2006 г.

Период затишья в эпидемической активности вирусов гриппа А(НШ1) с 2002 г. по 2006 г. в России не был связан с отсутствием антигенного дрейфа. Нами было зафиксировано постепенное накопление аминокислотных изменений в, НА1, а также появление нескольких генетических кластеров, в сезоны 2005-2006 гг. и 2006-2007 гг. Эти группы вирусов существенно отличались как между собой, так и от вакцинного штамма А/Новая. Каледония/20/99. Именно значительная, генетическая гетерогенность характеризовала популяцию вирусов гриппа А(НШ1), циркулировавшую в этот период в России. В этот период времени мы наблюдали распространение вирусов, относящихся ко 2-ому филогенетическому клайду и явившихся основным этиологическим агентом эпидемии 2007-2008 гг. (филогенетический клайд 2Ь, рис.3.).

Анализ аминокислотных последовательностей НА1 31 отечественного штамма выявил изменения 31 позиции, 15 из которых находились в антигенно значимых областях НА (Ca, Cb, Sa, Sb). Изучение антигенных свойств и генетических характеристик данных изолятов позволило нам предположить, что изменения в позициях 82, 94, 130, 140, 152, 169, 188, 193, 270 и 272 влияли на антигенные отличия вирусов, относящихся к разным эволюционным ветвям и генетическим кластерам.

Суммируя данные антигенного, генетического и филогенетического анализа мы можем констатировать, что за 10 лет дрейфовые изменения вирусов гриппа A(H1N1) соответствовали эволюционным изменениям вирусов этого подтипа в мире. Однако в определённые эпидемические сезоны на территории России циркулировали штаммы, обладающие оригинальными генетическими характеристиками и отличающиеся референс-штаммов, рекомендованных ВОЗ.

Таким образом, в предпандемический период наблюдалась дивергенция вирусов подтипа H1N1, что могло способствовать его дальнейшей изменчивости путем реассортации и рекомбинации и образованию предшественников пандемического вируса HINlsw. Остановимся более подробно на тех событиях, которые привели к сильному антигенному сдвигу в пределах одного подтипа H1N1 и появлению вируса с высоким пандемическим потенциалом.

Анализ событий в предпандемический период свидетельствует о том, что совместная циркуляция вирусов гриппа H3N2 и H1N1 в период сезонных эпидемий гриппа на отрезке времени от 1997 до 2008 гг. могла привести к развитию нескольких сценариев формирования пандемического штамма: 1. Реасссортация вирусов1 по генам поверхностных антигенов, например, с вирусами H5N1 или H2N2 с полной сменой поверхностных антигенов - антигенным шифтом,

2. Реассортация по другим генам, определяющая степень патогенности и адаптации к человеку.

3. Множественная реассортация с участием дополнительных промежуточных хозяев, включая кроме птиц, например, свиней.

Появление пандемического вируса HINlv произошло по самому сложному сценарию. При получении самых первых данных по структуре генома изолятов в США и Мексике привело к неожиданному выводу: новый вирус A(HlNl)v представлял собой тройной реассортант, включающий гены вирусов человека, птиц и свиней. Более того, этот реассортант появился в конце эпидемического сезона, когда ожидался спад заболеваемости. То есть, совершенно очевидно, что тройная реассортация произошла в течение этого периода, а селективные преимущества нового вируса были настолько велики, что он проявил высокий пандемический потенциал даже в конце эпидемического сезона и быстро распространился в мире [279,294].

Филогенетический анализ по гену гемагглютинина вирусов гриппа А человека, циркулирующих на территории РФ в 2008 и 2009 гг. и вирусов гриппа А свиного происхождения, выделенных в 2009 году позволил заключить, что вирусы гриппа А свиного происхождения образуют самостоятельную группу. Молекулярно-генетический анализ позволил установить, что гомология вирусов гриппа А свиного происхождения, выделенных в 2009 году, со штаммом вируса гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1), рекомендованным ВОЗ в качестве вакцинного штамма на 2008-2009 гг., по последовательности НА составила 79%. Гемагглютинин вируса гриппа A/California/04/2009 относительно вируса гриппа A/Brisbane/59/2007 содержит 103 аминокислотных замены, при этом более 30 из них содержатся в антигенных сайтах, среди которых более 20 замен являются* существенными, т.е. связаны с изменением заряда или полярности. В" гемагглютинине вируса гриппа A/California/04/2009 не обнаружено делеции, характерной для вируса гриппа A/Brisbane/59/2007 (после 129 положения). При анализе аминокислотной последовательности гемагглютинина вирусов гриппа А подобных вирусу гриппа A/Califomia/04/2009. был обнаружен новый сайт гликозилирования в 276 положении Нейраминидаза вируса A(HlNl)v имела высокую гомологию с NA свиных вирусов Евразийской линии, например с NA A/swine/Belgium/1/83 H1N1. [221, 294].

Вирусы, активно циркулировавшие в предпандемический период, фактически, имели небольшой вклад в геном вируса HINlv. Только ген РВ1 имел прямое происхождение от сезонного эпидемического вируса человека A(H1N1). Вирус A(H3N2) внес более значительный вклад и явился источником четырёх генов. Однако этот вирус ранее разделился на две сублинии Евразийскую и Северо - Американскую и относится к свиным вариантам. Ген НА имел прямое происхождение от свиного вируса H1N2, длительно циркулировавшего среди свиней. Из этого следует, что важнейшим звеном в зарождении пандемического вируса гриппа HINlv явилось заражение свиней вирусами человека, длительная циркуляция этих вирусов в популяции свиней и реассортация с вирусом A(H1N1) человека с передачей гена РВ1. При этом вклад свиного * НА можно считать решающим, так как ген РВ1 «доставшийся» пандемическому вирусу от сезонных вирусов' человека, практически лишен рамки считывания для белка PB1-F2.

В качестве основного-вывода данной диссертации можно отметить,, что мониторинг сезонных эпидемий гриппа является важнейшим компонентом надзора за этой инфекцией. Однако, прогноз появления новых вирусов представляет крайне затруднительную задачу и требует глобального взаимодействия системы надзора за гриппом на уровне ВОЗ и ветеринарного мониторинга вирусов, циркулирующих среди домашних животных. Устойчивая циркуляция вирусов в популяции людей и животных с признаками импульсной эволюции должны быть предметом пристального' внимания с точки зрения возможностей появления вирусов с новыми свойствами. Такие последние события, как. появление и широкое распространение, пандемических вирусов A(HlNl)v предполагают более-детальное изучение, циркулирующих вирусов, гриппа А в России и чёткий контроль за возникновением изменений поверхностных и внутренних белков вируса, а таюке за появлением возможных реассортантов между эпидемическими вирусами гриппа А. Вместе с тем, следует еще раз подчеркнуть, что признаки нарастающей гетерогенности популяций вирусов НЗИ2 и НШ1 следует рассматривать в качестве характерных особенностей предпандемического периода, повышающих вероятность возникновения пандемических вирусов типа вируса А(НШ1)у — этиологического агента пандемии 2009 года.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Коновалова, Надежда Игоревна, Санкт-Петербург

1. Блинов В. М., Киселёв О. И., Ресенчук С. М. и др. Анализ участков рекомбинации в генах гемагглютинина вирусов гриппа птиц и животных в отношении их адаптации к новому хозяину — человеку.// Вопросы вирусологи.- 1993,- № 6.- С. 263-268.

2. Бурцева Е. И., Иванова В. Т., Окаренко Т. А., Слёпушкин А. И. Свойства вирусов гриппа А и В, выделенных на куриных эмбрионах и в культуре клеток МОСК.// Вопросы вирусологии. 2001.- №1.- С. 29-33.

3. Гендон Ю. 3. Молекулярные основы изменчивости эпидемических штаммов вирусов гриппа человека.// Мол. генет., микробиол. и вир. -1985.-№8.-С. 3-12.

4. Гендон Ю. 3. Пандемия гриппа: можно ли с ней бороться?// Вопросы вирусологии. 1998. - № 2. - С. 43-46.

5. Гендон Ю. 3. Пандемия гриппа: предположения и факты.//Микробиология, эпидемиология и иммунология,- 2008.- № 5.- С. 109-118.

6. Говоркова Е. А. Селекция клетками хозяина антигенных вариантов гемагглютинина вируса гриппа и выбор оптимальных систем для культивирования.//Вопросы вирусологии.- 1999,- № 5.- С. 199-206.

7. Иванова В. Т., Бурцева Е. И., Оскаренко Т. А., Колобухина JI. В., Слёпушкин А.И. Изменчивость и особенности распростронения вирусов гриппа A(H1N1) в период 1990-1998 г.// Вопросы вирусологии.- 2000.- № 5.- С. 18-22.

8. Иванова В. Т., Бурцева Е. И., Слёпушкин А.Н., Оскаренко Т. А., Вартанян Р. В. Изменчивость гемагглютинина штаммов вируса гриппа A(H3N2), изолированных в России с 1989 по 1999 г.// Вопросы вирусологии.- 2000.- № 3.- С. 28-31.

9. Иванова В. Т., Матюшина P.O., Слёпушкин А.Н., Бурцева Е. И., Оскаренко Т. А., Шевченко Е. С. и др. Эпидемические штаммы вирусов гриппа А и В в сезоне 2005-2006 гг. в России.// Вопросы в'ирусологии.-2008.-№4.- С.13-18.

10. Кильбурн Е. Д. Вирусы гриппа и грипп.// Пер. с англ. М., 1978.- 580* С.

11. Литвинова О. М., Юхнова Л. Г., Родионова В. Б. Характернистика вирусов гриппа A(H1N1) 1997-1998 гг. выделения.// Тез. 2-й

12. Международной конф.: Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. С.Петербург. 1998. - С. 39.

13. Петров Н. А., Василенко С. К. Современное разнообразие вирусов гриппа А человека на молекулярном уровне.// Молек. генетика.- 1990.- № 12.-С. 3-10.

14. Слёпушкин А. Н., Львов Д. К., Маринич И. Г., Беляев A. JI., Бурцева Е. И., Иванова В. Т. Эпидемиологические особенности гриппа последних лет.// Вопросы вирусологии.- 1998.- № 2.- С. 59-62.

15. Смородинцев А. А. Гипотезы и факты о происхождении пандемических штаммов вируса гриппа А.// Вопросы вирусологии. 1975. - № 1.-С. 105-113.

16. Смородинцев А. А. Перспективы отдалённого прогнозирования гриппозных пандемий.// Эпидемиология гриппа и других острых респираторных заболеваний: Сб. науч. тр. ВНИИ гриппа. Л., 1983. — С. 21-24.

17. Abed Y., Hardy I., Li Y., Boivin G. Divergent evolution of hemagglutinin and neuraminidase genes in recent influenza A: H3N2 viruses isolated in Canada.//J. Med. Virol.- 2002.- V.67.- P.589-595.

18. Air G. M., Laver W. G. The neuraminidase of influenza vims proteins: structure, function, and genetics.// Proteins.- 1989.- V. 6.- P. 341-356.

19. Anders E. M., Hartley C. A., Jackson D- C. Bovine and mouse serum beta inhibitors influenza A viruses are mannose-binding lectins.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1990.- V. 87.- P: 4485-4489.

20. Anders E. M., Hartley C. A., Reading P. C., Ezekowitz R. A. Complement-dependent neutralization of influenza virus by a serum mannose binding lectin.// J. Gen. Virol.- 1994.- V. 75.- P. 615-622.

21. Andreasen V. Dynamics of annual influenza epidemics with immunoselection.// J. Matth Biol.- 2003.- V. 46(6).- P. 504-536.

22. Aytay S., Schulse I. T. Single amino acid substitutions in the hemagglutinin can alter the host range and receptor binding properties of HI strains of influenza A virus.// J. Virol.-1991.- V.65.- P.3022-3028.

23. Barr I. G., Komadina N., Hurt A., Shaw R., Durrant C., Iannello P., Tomasov C., Sjogren H., Hamson A. W. Reassortants in recent human influenza A and B isolates from South East Asia and Oceania.// Virus. Res.-2003,-V. 98.- p. 35-44.

24. Barr I. G., Komadina N., Hurt A., Iannello P., Tomasov C., Shaw R., et al. An influenza A(H3) reassortant was epidemic in Australia and New Zealand in 2003.//J. Med. Virol.- 2005.- v. 76.- P. 391-397.

25. Basak S., Compans R. W. Studies on role of glycosylation in the functions and antigenic properties of influenza virus glycoproteins.// Virology.- 1983.- V. 128.- P. 77-91.

26. Baum L. G., Paulson J. C. Sialyloligosaccharides of the respiratory epithelium in the selection of human influenza virus receptor specificity.// Acta Histochemica suppl.- 1990.- V. 40.- P. 35-38.

27. Baum L. G., Paulson J. C. Sialyloligosaccharides of the respiratory epithelium in the selection of human influenza virus receptor specificity.// Acta Histochem. (Jena).- 1990.- V.89 suppl. 40, P. 35-38.

28. Baum L. G., Paulson J. C. The N2 neuraminidase of human influenza virus has acquired a substrate specificity complementary to the hemagglutinin receptor, specificity.//Virology.- 1991.-V. 180.- P. 10-15.

29. Bean W. J., Cox N. J., Kendal A. P. Recombination of human influenza A viruses in nature.// Nature.- 1980.- V.284.- P.638-640.

30. Bean W. J., Schell M., Katz Ji, Kawaoka Y., Naeve C., Gorman O., Webster R. G., Evolution of H3 influenza virus hemagglutinin from human and nonhuman hosts.// J. Virol.-1992.- V. 66.- P. 1129-1138.

31. Beare A. S., Kendal A. P., Cox N. J., Scholtissek C. Human trials with wildtype H1N1 and recombinant H3N4 H1N1 influenza A virus of 1977-1978.// Infect. Immun.- 1980.- V.28.- P.753-761.

32. Bergmann M., Garcia-Sastre A., Palese P. Transfection-mediated recombination influenza A viruses.// J. Virol.- 1992.- V. 12.- P.7576-7580.

33. Boni M. F., Gog J. R., Andreasen V., Chritiansen F. B. Influenza drift and epidemic size: the race between generating and escaping immunity.// theor. Popul. Biol.- 2004.- V. 65(2).- P. 179-191.

34. Both G. M., Sleigh M., Cox N. J., Kendal A. P. Antigenic drift in influenza virus hemagglutinin from 1986 to 1980: multiple evolutionary pathways and sequential amino acid changes at key antigenic sites.// J. Virol. 1983. - V. 48. -P. 52-60.

35. Bragstad K., Nielsen L. P., Fomsgaard A. The evolution of human influenza A viruses from 1999 to 2006: a complete genome study.// Virology J.- 2008.- V. 5.-P. 1-19.

36. Breschkin A. M., AhernJ., White D. O. Antigenic determinants of influenza virus hemagglutinin determined by competitive radioimmunoassay with monoclonal antibodies.//Virology. 1981.- V. 113.- P. 130-140.

37. Brown I. H., Chakraverty P., Harris P. A., Alexander D. J. Disease outbreaks in pigs in Great Britain due to an influenza A viruses of HIN2 subtype.// Vet. Rec.- 1995.- V.136.- P 328-329.

38. Buonagurio D. A., Nacada S., Parvin J. D., Krystal M., Palese P., Fitch'W. M. Evolution of human influenza A virus over 50 years: Rapid uniform rate of change in the NS gene.// Science. 1986. - V. 232. - P.980-982.

39. Bush R. M., Bender C. A., Subbarao K., Cox N. J., Fitch W. M. Predicting the evolution human influenza A.// Science.- 1999.- V. 286,- P. 1921-1925.

40. Bush R. M., Fitch W. M., Bender C. A., Cox N. J. Positive selection on the H3 hemagglutinin gene of human influenza virus A.// Mol. Biol. Evol.- 1999.-V. 16.- P. 1457-1465.

41. Bush R. M., Smith C. B., Cox N. J., Fitch W. M. Effects of passage histoiy and sampling bias on phylogenetic reconstruction of human influenza A evolution.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA .- 2000.- V. 97.- P. 6974-6980.

42. Carrat F., Flahault A. Influenza vaccine: the challenge of antigenic drift.// Vaccine.- 2007.- V. 25.- P. 6852-6862.

43. Caton A. S., Brownlee G. G., Yewdell J. W., Gerhard H. The antigenic structure of the influenza virus A/PR/8/34 hemagglutinin (HI subtype).// CelL-1982.-V.31 .-P.417-427.

44. Centers for Disease Control and Prevention. Update: Influenza activity: United-States and worldwide, 2001-2002 season, and composition of the 20022003 influenza vaccine.// MMWR 2002.- V. 51.- P. 503-506.

45. Centers for Disease Control and Prevention. Update: influenza activity -United States, season.// Morb. Mortal. Wkly Rep. 2002. - V.51. - P. 78-80. '

46. Chen M.-J., La T., Zhao P., Tam J. S., Rappaport R., Cheng S.-M. Genetic and phylogenetic analysis of multi-continent human influenza A(H1N1) reassortant viruses isolated in 2001 through 2003.// Virus Research.- 2006.- V. 122.-P: 200-205.

47. Claas E. C., Kawaoka Y., deJong J. C., Masurer N., Webster R. G. Infection of children with avian-human reassortant influenza virus from pigs in Europe.// Virology. 1994. - V. 204, № 1. - P.453-457.

48. Claas E. C., Osterhaus A. D. New clues to the emergence of flu pandemics. //NatureMed. 1998.-V. 4,№ 10.-P. 1122-1123.

49. Cleveland S. M., Taylor H. P., Dimmock N. J. Selection of neutralizing antibody escape mutants with type A influenza virus HA-specific polyclonal antisera: possible significance for antigenic drift.// Epidemiol. Infect.- 1997.- V. 118.-P. 149-154.

50. Colman P. M., Varghese J. N., Laver W. G. Structure of the catalytic and1 antigenic sites in influenza virus neuraminidase.// Nature. 1983.- V. 303.- P.41.44.

51. Colman P. M. Influenza virus neuraminidase: structure, antibodies, and1 inhibitors.// Protein Sci.- 1994.- V. 3.- P. 1687-1696.

52. Connor R. J., Kawaoka Y., Webster R. G., Paulson J. C. 1994. Receptorspecificity in human, avian, and equine H2 and H3 influenza virus isolates.// Virology.-1994.-V.205 .-P. 17-23.

53. Cox N. J., Bai Z. S., Kendal A. P. Laboratory-based surveillance of influenza A(H1N1) and'A(H3N2) viruses in 1980-1981: antigenic and genomic analyses.//Bull WHO.- 1983.-V. 61.-P. 143-152.

54. Cox N. J., Black R. A., Kendal A. P. Pathways of evolution of influenza A(H1N1) viruses from 1977 to 1986 as determined by oligonucleotide mapping and sequencing studies.// J. Gen. Virol.- 1989.- V. 70.- P. 299-313.

55. Cox N. J., Bender C. A. The molecular epidemiology of influenza virus.// Semin. Virol.- 1995.- V. 6.- P. 359-370.

56. Cox N. J., Kawaoka Y. Orthomyxoviruses: Influenza.// In Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, ed. Mahy W. W. J., Collier L.-1998.- V. 1.-P. 385-433.

57. Cox N. J., Fukuda K. Influenza.// Infect. Dis. Clin. N. Amer.- 1998.- V. 12.-P.27-37.

58. Cox N. J., Subbarao K. Global epidemiology of influenza: past and present.// Ann. Rev. Med.-2000.- V. 51.- P.407-421.

59. Daniels R., Jeffries S., Yates P. et al. The receptor binding and membrane fusion properties of influenza virus variants selected using anti- hemagglutinin monoclonal antibodies.// EMBO J.- 1987.- V. 6.- P. 1459-1465.

60. Daum L. T., Canas L. C., Smith C. B., Klimov A., Huff W., Barnes W., Lohman K. L. Genetic and antigenic analisis of the first A/New Caledonia/20/99-like H1N1 influenza isolates reported in the Americas.// Emerg. Infect. Dis.- 2002.-'V. 8.- P. 408-412.

61. Domingo E., Holland J. J., Biebricher C. K. Quasi species and RNA virus evolution; principles and consequences.// Austin, TX; Landes, 2002.

62. Drescher J., Aron R. Influence of the amino acid differences between the hemagglutinin HA1 domains of influenza virus H1N1 strains on their reaction with antibody.//J. Med. Virol.- 1999.- V. 57.- P. 397-404.

63. Ellis J.S., Chakraverty P., Clewley J.P. Genetic and antigenic variation in the hemagglutinin of recently circulating human influenza A(H3N2) viruses in United Kingdom.// Arch. Virol.- 1995.- V.140.- P. 1889-1904.

64. Ellis J.S., Alvares-Aguero A., Zambon M. C. Impact influenza A(H1N2) viruses isolated during the 2002-2003 influenza season in the United Kingdom.// The 1-st European Influenza Conference: Program and Abstracts.-St. Julians, Malta.- 2002.-P. 48.

65. Fanning T. G., Taubenberger J. K. Phylogenically important regions of the influenza A HI hemagglutinin protein.// Virus Research.- 1999.-V.65.-P.33-42.

66. Fanning T. G., Reid A. H., Taubenberger J. K. Influenza A virus neuraminidase: regions of the protein potentially involved in virus-host interations.// Virology.- 2000.- V.276.- P. 471-423.

67. Fanning T. G., Slemons R., Reid A. H. et al. 1917 avian influenza A virus sequences suggest that the 1918 pandemic virus did not acquire its hemagglutinin directory from birds.// J. Virol.- 2002.- V. 76.- P. 7860-7862/

68. Ferguson N. M., Anderson R. M. Predicting evolutionary change in the influenza A virus.// Nature Med.- 2002.- V. 8., № 6.- P.562-563.

69. Ferguson N. M., Galvani A. P. Bush R. M. Ecological and immunological determinants of influenza evolution.// Nature.- 2003.- V. 422.- P. 428-433.

70. Fitch W. M., Leiter J. M. E., Li X., Palese P. Positive Darwinian evolution in human influenza A viruses.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA-1991.- V. 88,- P. 4270-4274.

71. Fitch W. M., Bush R. M., Bender C. A., Cox N. J. Long term trends in the evolution of H(3) HA1 human influenza type A.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1997.- V. 94.-P. 7712-7718.

72. Fouchier R. A., Munster V., Wallensten A., Bestebroer T. M., Herfst S., Smith D. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls.// J. Virology.- 2005.- V. 79 (5).- P. 2814-2822.

73. Gambaryan A. S., Robertson J: S., Matrosovich M. N. Effects of eggadaptation receptor-binding properties of human influenza A and B viruses.// Virology. 1999. - V.258. - P.232-239.

74. Gerhard W., Yewdell J., Frankel M. E., Webster R. Antigenic structure of influenza virus hemagglutinin defined by hybridoma antibodies.// Nature. -1981.-V. 290.-P. 713-717.

75. Gibbs M. J., Armstrong J. S., Gibbs A. J. Recombination in the hemagglutinin gene of the 1918 «Spanish flu».// Science.- 2001.- V. 64.- P. 1842-1845.

76. Goddard N. L., Joseph C. A., Watson J. M., Zambon M. Epidemiological features of new strain of the influenza A virus influenza A(H1N2) circulating in England and its public health implications.// Virus Research.- 2004.- V. 103.-P. 53-54.

77. Gorman O. T., Bean W. J., Webster R. G., Evolutionary processes in influenza viruses: divergence, rapid evolution, and stasis.// Microbiol. Immunol.- 1992.- V.176.- P. 75-97.

78. Govorkova E. A., Matrosovich M. N., Tuzikov A. B., Bovin N. V., Gerdil

79. G., Fanget B., Webster R. G. Selection of receptor-binding variants of human influenza A and B viruses in baby hamster kidney cells.// Virology.-1999.-V.262.- P.31-38.

80. Gregory V., Lim W., Cameron K., Bennet M., Marozin S., Klimov A., Hall

81. H., Cox N., Hay A., Lin Y. P. Infection of child in Hong Kong by an influenza A H3N2 virus closely related to viruses circulating in European pigs.// J. Gen. Virol.-2001.-V. 82.-P. 1397-1406.

82. Guan Y., Shortrige K. F., Krauss S., Webster R. G. Molecular characterization of H9N2 influenza viruses: were they the donors of the "internal" genes of H5N1 viruses in Hong Kong?// Prot. Nat. Acad. Sci. USA.-1999.- V. 96, № 16.- P. 9363-9367.

83. Gubareva L. V., Wood J. M., Meyer W. J., Katz J. M., Robertson J. S., Major D., Websater R. G. Codominant mixtures of viruses in reference strains of influenza virus due to host cell variation.// Virology.- 1994.- V. 199.- P. 8997.

84. Gulati U., Wu W., Gulati S., Kumari K., Waner J. L., Air G. M. Mismatched hemagglutinin and neuraminidase specificities in recent human H3N2 influenza viruses.// Virology.- 2005.- V.339.- P. 12-20.

85. Guo Y., Xu X., Cox N. J., Human influenza A (H1N2) viruses isolated from China.// J. Gen. Virol.- 1992.- V.73.- P.383-388.

86. Gunther I., Glatthaar B., Doller G., Garten W. A HI hemagglutinin of human influenza A virus with a carbohydrate-modulated receptor binding site and an unusual cleavage site.// Virus Res. 1993. - V. 27. - P. 147-160.

87. Hardy C. T., Young S. A., Webster R. G., Naeve C. J., Owens R. J. Egg fluids and cells of the chorioallantoic membrane of embryonated chicken eggs can select different variants of influenza A(H3N2) viruses.// Virology.- 1995.-V. 211.- P. 302-306.

88. Hardy L, Li Y., Coulthart M. B., Goyette N., Boivin G. Molecular evolution of influenza A/H3N2 viruses in the province of Quebec (Canada) during the 1997-2000 period.// Virus Res.- 2001.- V. 77.- P.89-96.

89. Harper S., Klimov A., Uyeki T., Fukuda K. Influenza.// Clin. Lab. Med.-2002.- V. 22.- P.863-882.

90. Hay A. J., Douglas A. R., Sparrow D. B., Cameron K. R., Skehel J. J. Antigenic and genetic characterization of current influenza strains.// Eur. J. Epidemiol.- 1994.- V. 10.- PI 465-466.

91. Hay A. J., Gregory V., Douglas A. R., Lin Y. P. The evolution of human influenza viruses.// Phil. Trans. R. Soc. Lond.- 2001.- V. 356.- P. 1861-1870:

92. Hayashida H., Toh Hi, Kikuno Evolution-of influenza virus« genes.// Mol: Biol: Evol.- 1985.- V.2.- P. 289.

93. He C-Q., Han G-Z., Wang D., Liu W., Li G-R., Liu X-P., Ding N-Z. Homologous recombination evidence in human and swine A viruses.// Virology.- 2008.- V. 380.- P. 12-20.

94. Hope-Simpson R. E., Golubev D. A. A new concept of the epidemic process of influenza A virus.// Epidemiol. Infect. 1987. - V. 99. - P. 5-54.

95. Horimoto T., Kawaoka Y. Influenza: lessons from past pandemics warnings from current incidens. Nature review.// Microbiology.- 2005.- V. 3.- P. 591600.

96. Hungnes O. Early detection of A/California/7/04-like A(H3N2) strains in Norway during the 2004-2005 season, and emergence of a novel H3N2 genetic sub-variant toward the end.// Vaccine.- 2006.- V.24.- P. 6694-6696.

97. Ina Y., Gojobori T. Statistical analysis of nucleotide sequences of the hemagglutinin gene of human influenza A viruses.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994.-V. 91.- P. 8388-8392.

98. Iorio A. M., Zei T., NerifM:, Alatri A. Possible correlation between:low antigenic drift of A(H1N1) influenza viruses and induction of HI antibodies.// Gen. J. Epidemiol.- 1997.- V. 12.- P. 589-594.

99. Katz J. M., Naeve C.W., Webster R. G. Host cell-mediated variation in H3N2 influenza viruses.// Virulogy.- 1987.- V. 156.- P. 386-395.

100. Katz J*. M., Wang M., Webster R. G. Direct sequencing of the HA gene of influenza A(H3N2) virus in original clinical samples reveals sequence identity with mammalian cell-grown virus.// L. Virol.- 1990,- V. 64.- P. 1808-1811.

101. Katz J. M., Webster R. G. Amino acid sequence identity between the HA1 influenza A(H3N2) viruses grown in mammalian and primary chick kidney cells.// J. Gen. Virol.- 1992.- V. 73.- P. 1159-1165.

102. Kawaoka Y., Krauss S., Webster R. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in-1957 and.1968 pandemics.// J. Virol.- 1984.-V.63.- P.4603-4608.

103. Kendal A. P., Cox N. J. Forecasting the epidemic potential of influenza virus variants based on their molecular properties.// Vaccine. 1985. — V. 3. — P. 263-266.

104. Kendal A. P. Epidemiologic implications of changes in the influenza virus genome.//Amer. J. Med.- 1987.- V. 82., suppl. 6A.- P. 4-14.

105. Kendal A. P., Cox N. J., Harmon M. Antigenic and genetic variation of influenza A(H1N1) viruses.// Applied virology research. Plenum Publishing Corporation. 1990.-V. 2.- P. 131-141.

106. Klenk H.-D., Wagner R., Heuer D., Wolff T. Importance of hemagglutinin glycosylation for the biological function of influenza virus.// Virus Research.-2002.- V.82.- P.73-75.

107. Klimov A., Simonsen L., Fukuda K., Cox N. Survellance and impact of influenza in the United States.// Vaccine.- 1999.- V. 17.- P. S42- S46.

108. Knossow M., Lewis M., Rees D., Wilson I. A., Wiley D. S. The refinement of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus.// Acta Crystallog. 1986. - V. B42. - P. 627-632.

109. Koelle K., Cobey S., Grenfell B., Pascual M. Epochal evolution shapes the phylodynamics of interpandemics influenza(H3N2) in humans.// Science.-2006.-V. 314.-P. 1898-1903.

110. Krizanova O., Rathova V. Serum inhibitors of myxoviruses.// Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 1969.- V. 47.- P. 125-151.

111. Krystal M., Elliot R. M., Benz E. W., Young J. F., Palese P.// Evolution of influenza A and B viruses: Conservation of structural features in the hemagglutinin genes.//Proc. Natl Acad. Sci. USA.- 1982.- V.79.- P:4800-4804.

112. Kurtz J.,.Manvell R. G., Banks J. Avian influenza virus isolated from a woman with conjunctivitis.// Lancet.- 1996.- V.348.- P. 901-902.

113. Lambkin R., Dimmock N. J. All rabbits immunized with type A influenza virions have a serum hemagglutination-inhibition antibody response biased to a single epitope in antigenic site B.// J. Gen. Virol.- 1995.-V. 76.- P. 889-897.

114. Lavanchy D. The importance of global surveillance of influenza.// Vaccine.-1999.-V. 17.-P. S24- S28.

115. Laver W. G., Valentine R. C. Morphology of the isolated hemagglutinin and neuraminidase subunits of influenza virus.// Virology. 1969. - V. 38. - P. 105.

116. Lazarowitz S. G., Choppin P. W. Enhancement of the infectivity of influenza A and B viruses by proteolytic cleavage of hemagglutinin polypeptide.// Virology. 1975. -V. 68. - P. 440-454.

117. Lee M. S., Chen J. S. Predicting antigenic variants of A/H3N2 viruses.// Emerg. Infect. Dis. 2004.- V.10.- P. 1385-1390.

118. Lee M. S., Chen J. S., Liao Y. C., Hsiung C. A. Identifying potential immunodominant positions and predicting antigenic variants of influenza A/H3N2 viruses.// Vaccine.- 2007.- V. 25.- P. 8133-8139.

119. Lentz M. R., Air G. M., Laver W. G., Webster R. G. Sequence of the neuraminidase gene of influenza virus A/Tokyo/3/67 and previously uncharacterized monoclonal variants.// Virology.- 1984.- V. 135.- P. 257-265.

120. Lentz M. R., Webster R. G., Air G. M. Site-directed mutation of the active site of influenza neuraminidase and implications for the catalytic mechanism.// Biochemistry.- 1987.- V. 26.- P. 5351-5358.

121. Li X., Zhao C., Gao H., Zhang Y., Ishida M., Kenegal Y. Origin and evolutionary characteristics of antigenic reassortant influenza A(H1N2) viruses isolated from man in China.// J.' Gen: Virol.- 1992.- V.73.- P.1329-1337.

122. Lin Y. P., Gregory V., Bennett M., Hay A. Recent changes among human influenza viruses.// Virus. Res.- 2004.- V. 103,- P.47-52.

123. Lindstrom S., Sugita S., Endo A. Evolutionary characterization of recent human H3N2 influenza A isolates from Japan and China: novel changes in the receptor binding domain.// Arch. Virol.- 1996.- V. 141.- P.1349-1355.

124. Lindstrom S., Cox N., Klimov A. Genetic analysis of human H2N2 and early H3N2 influenza viruses, 1957-1972: evidence for genetic divergence andmultiple reassortment events.// Virology. 2004.- V.328.- P.101-119.

125. Lu B., Zhou H., Ye D., Kemble G., Jin H. Improvement of influenza

126. Ludwig S., Stilz L., Planz O. European swine virus as a possible source for the next influenza pandemic?// Virology.- 1995.- V.212.- P. 555-561.

127. Luo C., Nobusawa E., Nakajima K. An analysis of the role neuraminidase in the receptor-binding activity of influenza B virus: the inhibitory effect of Zanamivir on haemadsorption.// J. Gen. Virol.- 1999.- V.80.- P. 2969-2976.

128. Luo, C., Morishita T., Satou K., Tateno Y., Nakajima K., Nobusawa E. Evolutionary pattern of influenza B virus based on HA and NS genes- during1940 to 1999: origing of the № genes after 1997.// Arch Virol.- 1999.- V. 144.1. P. 1881-1891%

129. Marozin S., Gregory V., Cameron K. et al. Antigenic and genetic diversity among swine influenza A H1N1 andfHIN2'viruses in Europe.// J: Gen: Virol.-2002.- V. 83.-P;735-745.

130. Martin J., Wharton S. A., Lin Y. P., Takemoto D. K., Skehel J. J. Wiley D. C., Steinhauer D. A. Studies of the binding properties of influenza hemagglutinin receptor-site mutant.// Virology.- 1998.- V. 241.- P. 101-111.

131. Matrosovich M. N., Gao P., Kawaoka Y. Molecular mechanisms of serum resistance of human influenza H3N2 vims and their involvement in virus adaptation in a new host.// J. Virol.- 1998.- V.72.- P.6373-6380.

132. Matrosovich M. N., Zhou N., Kawaoka Y., Webster R. The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens and wild aquatic birds have distinguishable properties.//.!. Virol.-1999.- V.73.- P. 11461155.

133. Medeiros R., Escriou N., Naffakh N., Manuguerra J.-C., van der Werf S. Hemagglutinin residues of recent' human- A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.// Virology.-2001.- V. 289.- P. 74-85.

134. Meyer W. J., Wood J. M., Major D., Robertson J. S., Webster R. G., Katz J. M. Influence of host cell-mediated variation on the international surveillance of influenza A(H3N2) viruses.//Virology.- 1993.-V. 196.-P.130-137.

135. Mochalova L., Gambaryan A., Romanova J., Tuzikov A., Chinarev A., Katinger D. Receptor-binding properties of modern human influenza viruses primarily isolated in- Vero and MDCK and chicken embryonated eggs.// Virology.- 2003.- V. 313.- P: 473-480.

136. Monto A. S. Epidemiology and virology of influenza illness.// Am. Managed Care:- 2000.-V.6(5).- P: 255-264.165*. Monto-A. S. The threat of an avian influenza pandemic.// New England J. Medicine.- 2005 V. 352.- P. 323-325.

137. Morens D. M., Taubenber J. K. and Fauci A. S. The persistent legancy of the 1918 influenza virus.//New England J. Medicine.- 2009.- V.361.- P. 225-229.

138. Morishita T., Kobayashi S., Miyake T., Ishihara Y., Nakajima K., Nakajima S. Host-specific hemagglutination of influenza A(H1N1) virus.// Microb. Immunol.- 1993.- V. 37.- P. 661-665.

139. Morishita T., Nobusawa E., Nakajima K., Nakajima S. Studies on the molecular basis for loss of the ability of recent influenza A(H1N1) virus strains to agglutinate chicken erythrocytes.// J. Gen. Virol.- 1996.- V.77.- P. 24992506.

140. Mounts A. W., Kwong H., Izurieta H. S., Ho Y., Au T., Lee M. et al. Case-control study of factors for avian influenza A (H5N1) disease, Hong Kong, 1997.//J. Infect. Dis.- 1999.- V.180.- P.505-508.

141. Naeve C. W., Hinshaw V. S., Webster R. G. Mutatations in the hemagglutinin receptor-binding site can change the biological properties of an influenza virus.// J. Virol.- 1984.- V. 51.- P. 567-569.

142. Nakajima S., Cox N. J., Kendal A. P. Antigenic and genomic analyses of influenza A(H1N1) viruses from, different regions of the world, February- 1978 to March 1980.// Infect. Immun.- 1981.- V. 32.- P. 287-294.

143. Nakajima S., Nakajima K., Kendal A. P. Identification of the binding sites to monoclonal antibodies on A/USSR/90/77 (111 N1) hemagglutinin and their involvement in antigenic drift in HlNl influenza virus.// Virology. 1983. - V. 131.-P. 116-127.

144. Nelson M. I., Holmes E. C. The evolution of epidemic influenza.// Nat. Rev. .genet.- 2007.- V. 8 (3).- P. 196-205.

145. Nerome R., Nerome N., Tanabe N., .Lindstrom S. E., Shinijo M;, Taniguchi Si, Kasai" K. Perspectives characteristics and: achievements of recent, surveillance of influenza activity in Japan.// Vaccine.- 2002.- V. 20., suppl.- P. S36-S43.

146. Nishikawa F., Sugiyama T. Direct isolation of H1N2 recombinant virus from a throat swab of a patient simultaneously infected with H1N1 and H3N2 influenza A viruses.// J. Clin Microbiol.- 1983.- V. 18.- P.425-427.

147. Nobusawa E., Aoyama T., Kato h., Suzuki y. Tateno Y., Nakajima K. Comparison of complete amino acid sequences and receptor-binding properties among 13 serotypes of hemagglutinins of influenza A viruses.// Virology. -1991.-V. 182.-P. 475-485.

148. Ohuchi M., Ohuchi R., Feldmann A., Klenk H. D. Regulation of receptor binding affinity of influenza virus hemagglutinin by its carbohydrate moiety.// J. Virol.- 1997.- V.71.- P.8377-8384.

149. Orlich M., Gottwald H., Rott R. Nongomologous recombination between the hemagglutinin gene and the nucleoprotein gene of an influenza A virus.// Virology.- 1994.- V. 204 (1).- P.462-465.

150. Osterhaus A. D. M. E., Rimmelzwaan G. F., Martina B. E. E., Bestebroer T. M., Fouchier R. A. M. Influenza B virus in seals.// Science. 2000. - V. 288. -P. 1051-1053.

151. Okuno Y., Isegawa Y., Sasao F., Ueda S. A common neutralizing epitope conserved between the hemagglutinin of influenza A vims HI and H2 strains.// J. Virol.- 1993.- V. 67.- P. 2552-2558.

152. Paget W. J., Meerhoff T. J., Goddard N. L. Mild to moderate influenza activity in Europe and the detection of novel A(H1N2) and B viruses during the winter of2001-02.// Eurosurveill. 2002. - V. 7. - P. 147-157.

153. Paget W. J-., Meerhoff T. J., Rebelo de Andrade H. Heterogeneous influenza activity across Europe during the winter of 2002-2003.// Euro Surveill.- 2003.-V. 8.- P. 230-239.

154. Peiris M., Yuen K. Y., Leung C. W., Chan K. H., Ip P. L. S., Lai R. W. M., Orr W. K., Shortridge K. F. Human infection with influenza H9N2.// Lancet-1999.- V. 354.- P.919-617.

155. Plotkin J. B., Dushoff J., Levin S. A. Hemagglutinin sequence clusters and the antigenic evolution of influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.2002.-V. 99.- P. 6263-6268.

156. Plotkin J. B., Dushoff J. Codon bias and frequency-dependent selection on the hemagglutinin epitopes of influenza A virus.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2003.-V. 100.-p. 1385-1390.

157. Potter C. W. A history of influenza.// J. appl. Microbiol.- 2001.- V. 91(4).-P. 572-579.

158. Pritchett T. J., Paulson J. C. Basis for the potent inhibition of influenza virus infection by equine and guinea pig a2-macroglobulin.// J. Biol. Chem.- 1989.-V. 264.- P. 9850-9858.

159. Pyhala R., Ikonen N., Forsten T. Evolution of the HA1 domain of human influenza A(H1N1) virus: loss of glycosylation sites and-occurrence of herald and conserved strains.// J. Gen. Virol.-1995.- V. 76.- P. 205-210.

160. Raymond F. L., Caton A. J., Cox N. J., Kendal A. P., Brownlee G. G. The antigenicity andievolution-of influenza HI* hemagglutinin, from 1950-1957 and-1977-1983: two pathways from one gene.// Virology.- 1986.- V. 148.- P: 275287.

161. Reid A. H., Fanning T. G., Hultin J. V., Taubenberger J. K. Origin and evolution of the 1918 «Spanish» influenza virus hemagglutinin gene.// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 1999.- V.96 (4).- P.1651-1656.

162. Roberts P. C., Garten W., Klenk H-D. Role of conserved glycosylation sites in maturation and transport of influenza A vims hemagglutinin.// J. Virol.-1993.- V. 67.-P. 3048-3060.

163. Robertson J. S., Bootman J. S., Newman R., Oxford J. S., Daniels R. S., Webster R. G., Schild G. C. Structural changes in the hemagglutinin which accompany egg adaptation of an influenza A(H1N1) virus.// Virology.- 1987.-V.160.-P. 31-37.

164. Robertson J>. S. Clinical influenza vims and the embryonated hen's egg.// Rev. Med. Virol. 1993. - V. 3. - P. 97-106.

165. Rogers G. N., Paulson J. C. Receptor determinants of human and animal influenza isolates: differences in receptor specificity of H3 hemagglutinin based on species of origin.// Virology. 1983. - V. 127. - P. 361-373.

166. Rogers G. N., D'Souza B. L. Receptor binding properties of human and animal HI influenza virus isolates.// Virology. 1989. - V. 173. - P. 317-322.

167. Rota P. A., Wallis T. R., Harmon M. W., Rota J. S., Kendal A. P., Nerome K. Cocirculation of two distinct evolutionary lineages of influenza type B virus since 1983.//Virology. 1990. -V. 175. - P. 65-68.

168. Russell R. J., Gamblin S. j., Haire L. F., Stevens D. J., Xiao B., Ha Y., Skehel J. J. HI and H7 influenza hemagglutinin structures extend a structural classification of hemagglutinin subtypes.// Virology.- 2004.- V. 325,- P. 287296.

169. Ryan-Poirier K. A., Kawaoka Y. Distinct glycoprotein inhibitors of influenza A virus in different animal sera.// J. Virol. 1991 .- V.65.- P.389-395.

170. Ryan-Poirier K. A., Kawaoka Y. a2-Macroglobulin is the major neutralizing inhibitor of influenza virus hemagglutination.// Virology.- 1993.- V.193.- P. 974-976.

171. Ryan-Poirier K. A., Suzuki Y., Bean W. S., Kobasa D., Takada A., Ito T., Kawaoka Y. Changes in H3 influenza A virus receptor specificity during replication in humans.// Virus Research. 1998. - V. - 56. - P. 169-176.

172. Scholtissek C., Rohde W., Von Hoyningen V., Rott R. On the origin of the human influenza virus subtype H2N2 and H3N2.// Virology. 1978. - V. 87. -P. 13-20.

173. Scholtissek C., Burger H., Bachmann P. A., Hannoun C. Genetic relatedness of hemagglutinins of the HI subtype swine and birds.// Virology.- 1983. V. -129.-P. 521-523.

174. Scholtissek C. Molecular evolution of influenza viruses.// Virus. Genes.-1996.-№ 11.-P. 209-215.

175. Schweiger B., Zadow I., Heckler R. Antigenic drift and variability of influenza viruses.// Med. Microbiol. Immunol.- 2002.- V.191.- P. 133-138.

176. Schweiger B., Bruns L., Mexixenberger K., Reassortment between human A(H3N2) viruses is important evolutionary mechanism.// Vaccine.- 2006.- V. 24.- P. 6683-6690.

177. Schulze I. T. Effects of glycosylation on the properties and functions of influenza vims hemagglutinin.// J. Infec. Dis. 1997. - V. 176. - P. S24-S28.

178. Shaw M. W., Cooper L., Xu X. Molecular changes associated with the transmission, of avian influenza A H5N1' and H9N2 vimses to humans.// J. of Medical Virology. 2002. - V.66. - P. 107-114.

179. Shih S.-R., Chen G.-W., Yang C.-C., Yang W.-Z., Liu D.-P. et al. Laboratory-Based surveillance and molecular epidemiology of influenza vims in Taiwan.// J. of Clinical Microbiology.- 2005.- V. 43.- P. 1651-1661/

180. Shinde-V., Bridges C. B., Uyeki T. M. et al. Triple-reassortant swine influenza A(H1) in humans in the United States, 2005-2009.// N. Engl J. Med.-2009.-V. 360.-P. 2616-25.

181. Skehel J. J: and Wiley D. C. Receptor binding and membrane fusion in vims entry: the influenza hemagglutinin.// A. Rev. Biochem. 2000: - V. 69.- P. 531. 569,.

182. Skehel J: J: and Wiley D: C. Influenza-hemagglutinin.// Vaccine.-2002.- V. 20.-P. 551-554.

183. Smith C. B., Cox N. J., Subbarao K., Taber L., Glezen P. Molecular epidemiology of influenza A(H3N2) virus reinfections.// J. Infect. Dis. 2002. -V. 185.-P. 980-985.

184. Smith D. J., Lapedes A. S., de Jong J. C., Bestebroer T. M., Rimmelzwaan G. F., Osterhaus A. D., Fouchier R. A. Mapping the antigenic and genetic evolution of influenza virus.// Science.- 2004.- V. 305.- P. 371-376.

185. Stohr K. Avian influenza and pandemics research needs and opportunities.//New England J. Medicine.- 2005 V. 352.- P. 405-407.

186. Suarez D. L., Perdue M. L., Cox N. J. Comparisons of highly virulent H5N1 influenza A virus isolated from humans and chickens from Hong Kong.// J. Gen. Virol. 1998. - V. 72. - P. 6678-6688.

187. Subbarao K., Katz J. Avian influenza viruses infecting humans.// Cell; Mol. Life Sci. 2000. - V. 57. - P. 1770-1784.

188. Sugrae R. J., Hay A. J. Structural characteristics of the M2 protein of influenza A virus: evidence that it forms a tetrameric channel.// Virology. -1991. V. - 180. - P. 617-624.

189. Suzuki Y., Kato H., Naeve C. W. Single-amino-acid substitution in an antigenic site of influenza virus hemagglutinin can altered the specificity ofbinding to cell membrane-associated gangliosides.// J. Virol. 1989. - V. 63.-P. 4298-4302.

190. Suzuki Y., Ito T., Holland Jr. R. E., Chambers T. M., Kiso M., Ishida H., Kawaoka Y. Sialic acid species as a determinant of the host range of influenza A viruses.// J. Virol. 2000. - V. 74.- P. 11825-11831.

191. Taubenberger J. The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza A virus.//Proc. Amer. Phil. Soc.- 2006.- V. 150.- P. 86-112.

192. Tong N., Nobusawa E., Morishita M., Nakajima S., Nakajima K. M protein correlates with the receptor-binding specificity of hemagglutinin protein of reassortant influenza A(H1N1).// J. Gen. Virol. 1998. - V. 79.- P. 2425-2434.

193. Treanor J. Influenza vaccine outmaneuvering antigenic shift and drift.// N. Engl. J. Med.-2004.- V. 350(3).- P. 218-220.

194. Tsuchiya E., Sugawara K., Hongo S. et al. Antigenic structure of the hemagglutinin of human influenza A/H3N2 virus.//J. Gen. Virol. 2001. - V. 82. - P. 2475-2484.

195. Underwood P. A. Mapping of antigenic changes in- the hemagglutinin of Hong Kong influenza (H3N2) strains using a large panel of monoclonal antibodies.// J. Gen. Virol. 1982. - V. 62. - P. 153-169.

196. Underwood P. A., Skehel J.J., Wiley D. S. Receptor-binding characteristics of monoclonal antibody-selected antigenic variants of influenza virus.// J. Virol. 1987.-V. 61.-P. 206-208.

197. Wagner R., Wolff T., Herwig A., Pleschka S., Klenk H.-D: Interdependence of hemagglutinin glycosylation and neuraminidase as regulators of influenzavirus growth a study by reverse genetics.// J. Virol. - 2000. - V. 74. - P. 63166323.

198. Waechter C. J. Lennarz W. J. The role of polyprenol-linked sugars in glycoprotein synthesis.// Ann. Rev. Biochem. 1976. - V. 45. - P. 95-112.

199. Ward C. W., Dopheide T. A. Completion of amino acid sequence of a Hong Kong influenza hemagglutinin heavy chain; Sequence of cyanogens bromide fragment CNI.// Virology. 1980. - V. 103. - P. 37-53.

200. Ward C. W. Structure of the influenza virus hemagglutinin.// Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1981. -V. 94/95. - P. 1-74.

201. Ward C. W., Murray J. M., Roxburg C. M., Jackson D. S. Short communications: Chemical and antigenic characterization of the carbohydrate site chainsof an Asian (N2) influenza virus neuraminidase.// Virology. 1983. -V. 126.-P. 370-375.

202. Webby R. J. and Webster R. G. Emergence influenza A viruse.// Phil. Trans. R. Soc. Lond. 2001. - V. 356. - P. 1815-1826.249! Webby R. J. and Webster R. G. Are we ready for pandemic influenza?//Science;- 2003.- V. 302.- P. 1519-1522.

203. Webster R. G. Predictions for future human influenza pandemics.// J. Infect.Dis. 1997. - V. 176, suppl. 1.- P. S14- S19.

204. Webster R. G. A molecular whodunit.// Science. 2001. - V. 293, № 5536. -P. 1773-1774.

205. Webster R. G. and Govorkova E. A. H5N1 influenza: continuing evolution and spread.// N. Engl. J. Med. 2006. - V. 355 (21). - P. 2174-2177.

206. Weis W., Brown J. H., Cusack S., Paulson J. C., Skehel J. J., Wiley D. C. Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid.//Nature. 1988. - V. 333. - P. 426-431.

207. Weis W., Brunger A. T., Skehel J. J., Wiley D. S. Refinement of the influenza virus hemagglutinin by simulated annealing.// J. Mol. Biol. 1990. -V. 212.-P. 737-761.

208. Widjaja L., Ilyushina N., Webster R. G., Webby R. J. Molecular changes associated with adaptation of human influenza A virus in embryonated chicken eggs.//Virology.- 2006.- V. 350.- P. 137-145.

209. Wiley D. S., Wilson I. A., Skehel J.J. Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza hemagglutinin and their involvement in antigenic variation.// Nature. 1981. - V. 289. - P. 373-378.

210. Wiley D. S., Skehel J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycol protein of influenza virus.// Ann.Rev. Biochem. 1987. - V. 56. - P. 365-394.

211. Wilson I. A., Skehel J. J., Wiley D.! G. Structure of" the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A^resolution.// Nature.- 1981'.- V. 289.! P. 366-373.

212. Wilson I". A., Cox N. J. Structural basis of immune recognition of influenza virus hemagglutinin.// Annu. Rev. Immonol. 1990. - V. 8. - P. 737-771.

213. Winter G., Fields S., Brownlee G. G. Nucleotide sequence of the human influenza virus HI subtype.// Nature. 1981. - V. 292. - P. 72-75.

214. World Health Organization. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 1989-90 season.// Wkly Epidemiol. Rec. 1989. - V. 8. -P. 53-56.

215. World Health Organization. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 1999-2000 season.// Wkly Epidemiol. Rec. 1999. - V. 14.-P. 111.

216. World Health Organization. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2000-2001 season.// Wkly Epidemiol. Rec.-2001.- V. 75.- P. 61-68.

217. World Health Organization. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2002-2003 season.// Wkly Epidemiol. Rec. -2002. -V. 77. P. 62-66.

218. World Health Organization. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2002-2003 season.// Wkly Epidemiol. Rec. -2002. -V. 77. P. 344-348.

219. World Health Organization. Influenza in the world.// Wkly Epidemiol. Rec. -2002.-V. 77.-P. 358-362.

220. World Health Organization. Influenza A (H1N2) viruses (update).// Wkly Epidemiol. Rec. 2002. - V. 77. - P. 77-80.

221. World Health Organization. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2003-2004 season.// Weekly Epidemiol. Rec. 2003. -V. 78.-P. 73-188.

222. World Health Organization. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2004-2005 influenza season.// Wkly Epidemiol. Rec. -2004. -V. 79. P. 88-92., P. 369-373

223. World Health Organization. Global Influenza' Program Surveillance Network. Evolution of H5N1 avian influenza virus in Asia.// Emerg. Infect Dis.- 2005. -V. 11.-P. 1515-1521.

224. World Health Organization. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2005-2006 influenza season.// Wkly Epidemiol. Rec. -2005.-V. 80.-P. 71-75.

225. World Health Organization. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2007-2008 influenza season.// Wkly Epidemiol. Rec. -2007. -V. 82. P. 69-76.

226. World Health Organization. 2009.// http://www.who.int/csr/disease/avianinfluenza/en/index.html.

227. World Health Organization. Update: swine influenza A(H1N1) infections -California and Texas, April 2009.// Wkly Epidemiol. Rec. -2009. -V. 58. P. 435-437.

228. Worobey M., Holmes E. C. Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses.// J. of General Virol.- 1999.- V. 80.- P. 2535-2543.

229. Wrigley N. G., Skehel J. J., Charlwood P. A., Brand C. M. The size and shape of influenza virus neuraminidase.// Virology. 1973 V. 51. - P. 525-529.

230. Xu X., Rocha E., Regnery H. L., Kendai A., Cox N. J. Genetic and antigenic analyses of influenza A(H1N1) viruses, 1986-1991.// Virus. Res. 1993. - V. 28.-P. 37-45.

231. Xu X., Cox N. J., Bender C. A., Regnery H. L., Shaw M. W. Genetic variation in neuraminidase genes of influenza A(H3N2) viruses.// Virology. -1996.-V. 224.-P. 175-183.

232. Xu X., Lindstrom S. E., Shaw M. W., Smith C. B., Hall H. E., Mungall B. A., Subbarao, K., Cox N. J., Klimov A. Reassortment and evolution of current human influenza A and B viruses.// Virus Research.- 2004.- V. 103.- P. 55-60;

233. Yamashita M., Kiystal M., Fitch W. M., Palese P. Influenza B virus evolution: co-circulating lineages and comparison of evolutionary pattern with those of influenza A and C viruses.// Virology. 1988. - V. 163. - P. 112-122.

234. Yates P. J., Bootman J. S., Robertson J. S. The antigenic structure of a human influenza A(H1N1) virus isolate grown exclusively in MDCK cells.// J. Gen. Virol. 1990. - V. 71. - P. 1683-1688.

235. Yewdell J. W., Gerhard W., Bach T. Monoclonal anti-hemagglutinin antibodies detect irreversible antigenic alterations that coincide with the acid activation of influenza virus A/PR8/34- mediated hemolysis.// J. Virol.- 1983. -V. 48. P. 239-248.

236. Yewdell J. W., Caton A. J., Gerhard W. Selection of influenza A virus adsorptive mutants by growth in the presence of a mixture of monoclonal antihemagglutinin antibodies.// J. Virol. 1986. -V. 57. - P. 623-628.

237. Yuanji G. Influenza activity in China: 1998-1999.// Vaccine.- 2002.- V.20.-P. 28-35.

238. Yuen K. Y., Chan P. K.5 Peiris M., Tsang D. N., Que T. L., Shortridge K. F. et al. Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1* virus.// Lancet. 1998. - V. 351. - P. 467-471.

239. Zambon M. C. Epidemiology and pathogenesis of influenza.// J: Antimicrob Chemother.- 1999.- v. 44.-P.3-9.

240. Zambon M. C. The pathogenesis of influenza humans.// Virus Genes. -2001.-V. 14.-P. 181-185.

241. Zhou N. N., Senne D. A., Landgraf J. S., Swenson S. L., Erickson G., Rossow K., Liu L., Yoon K. J., Krauss S., Webster R. G. Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs.// J. Virol. -1999.-V. 73.-P: 8851-8856.

242. Zimmer S. M. and Burke D. S. Historical perspective emergence of influenza A(H1N1) viruses.// N. Engl. J. Med.- 2009.- V.361.- P. 279-285.

243. Zou S., Prud'homme I., Weber J. M. Evolution of the hemagglutinin gene of influenza B virus was driven by both positive and negative selection pressures.// Virus Genes. 1997.-V. 14.-P. 181-185.

Информация о работе

Коновалова, Надежда Игоревна
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Эволюционная изменчивость вирусов гриппа А, циркулировавших в России в 1997-2007 гг. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы