Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование круга хозяев, полиморфизма и клонирование генома Х вируса шалота

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калошин, Алексей Алексеевич, Москва

61: <М-'6/?У0-о

ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ РАСН

На правах рукописи

КАЛОШИН Алексей Алексеевич

ИССЛЕДОВАНИЕ КРУГА ХОЗЯЕВ, ПОЛИМОРФИЗМА И КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОМА X ВИРУСА ШАЛОТА.

03.00.03.-молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Завриев С.К. кандидат биологических наук, Вишниченко В.К.

Москва 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Список сокращений...................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................6

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика вирусов, поражающих культурные виды рода Allium...............................................................................................8

1.1. Потивирусы...................................................................................8

1.1.1. Вирус желтой карликовости лука...........................................9

1.1.2. Вирус желтой штриховатости лука-порея............................10

1.1.3. Предполагаемые члены группы потивирусов......................10

1.1.4. Нуклеотидные последовательности РНК потивирусов, выделенных из растений рода Allium.....................................................11

1.2. Карлавирусы.................................................................................12

1.2.1. Латентный вирус шалота.......................................................13

1.2.2. Латентный вирус чеснока......................................................13

1.3. Вирусы других групп, обнаруженные в растениях рода Allium.. 13

2. X вирус шалота и ХВШ-подобные вирусы.....................................15

2.1. Морфология и физико-химические свойства вирусных частиц.. 15

2.2. Симптоматика и круг хозяев.........................................................15

2.3. Серологические свойства..............................................................16

2.4. Цитопатология...............................................................................17

2.5. Характеристика геномной РНК.....................................................17

3. Организация генома и сравнительная характеристика генов карла-, потеке- и ХВШ-подобных вирусов.......................................................18

4. Инфекционные кДНК копии геномных РНК фитовирусов.............23

4.1 .Конструкция и экспрессия инфекционных вирусных кДНК..........24

4.2. Определение инфекционности к ДНК копий..................................26

4.3. Исследование полноразмерных кДНК копий геномных РНК вирусов...........................................................................................................27

И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Выделение ХВШ и вирусной РНК.....................................................29

2. Синтез и клонирование кДНК............................................................30

3. Получение однонаправленных делеций.............................................32

4. Определение нуклеотидной последовательности..............................33

5. Отбор полноразмерных кДНК копий геномной РНК ХВШ............34

6. Получение протопластов....................................................................34

7. In vitro транскрипция..........................................................................35

8. In vitro трансфекция протопластов.....................................................35

9. Электрофорез в сочетании с ИФА (Western blot).............................35

10. Электронная микроскопия...............................................................36

11. Иммуносорбентная электронная микроскопия..............................36

12. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и вторичной структуры РНК..........................................37

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

1. Род Allexviruses: поиск новых видов и предложения по классификации и номенклатуре................................................................................38

2. Моновирусная инфекция растений X вируса шалота: герерогенность нуклеотидной последовательности геномной РНК и морфологическая гетерогенность вирионов.......................................................................43

2.1. Морфологическая гетерогенность вирионов..................................43

2.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей..46

2.2.1. 42К белок...................................................................................50

2.2.2. 28К белок...................................................................................52

2.2.3. 15К белок...................................................................................55

3. Полноразмерная кДНК-копия геномной РНК X вируса шалота: получение, клонирование, структура, in vitro транскрипция и тестирование инфекционности..............................................................................58

3.1. Клонирование полноразмерной кДНК-копии ХВШ.....................58

3.2. Определение инфекционности кДНК-копий ХВШ........................59

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................64

ВЫВОДЫ.......................................................................................................65

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................66

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Ас антисыворотка

А-, В-, С-, О- ВЧ А-, В-, С-, О-вирусы чеснока

БВК Б - вирус картофеля

БВХ Б вирус хелениума

ВАТ вирус аспермии томата

ВЖКЛ вирус желтой карликовости лука

ВЖКР вирус желтой крапчатости риса

ВЖМК вирус желтой мозаики клевера

ВЖШЛП вирус желтой штриховатости лука-порея

ВКПЦ вирус кольцевой пятнистости цимбидиума

вмк вирус мозаики костра

ВМЦК вирус мозаики цветной капусты

вмч вирус мозаики чеснока

вмчпк вирус мозаики чеснока переносимый клещом

внмкк вирус некротической мозаики красного клевера

вог вирус опаленности голубики

впт вирус погремковости томата

ВРПГ вирус раннего побурения гороха

ВСМЯ вирус штриховатой мозаики ячменя

втм вирус табачной мозаики

лвг латентный вирус гвоздики

лвч латентный вирус чеснока

лвш латентный вирус шалота

мвк М вирус картофеля

нвпк нитевидный вирус переносимый клещом

онм олигонуклеотид - направленный мутагенез

ОРС открытая рамка считывания

ПЦР полимеразная цепная реакция

ПЭГ полиэтилен гликоль

хвк X вирус картофеля

ХВЧ X вирус чеснока

ХВШ X вирус шалота

ВВЕДЕНИЕ.

Практически все растения подвержены вирусной инфекции. В результате нескольких десятилетий исследований было охарактеризовано несколько сот фитовирусов, которые по своей морфологии и серологическим свойствам были объединены в несколько семейств и более 30 групп.

Наиболее интенсивно фитовирусология стала развиваться когда появились первые данные о структуре и организации вирусных геномов. Именно эти результаты легли в основу современного представления о механизмах репликации и экспрессии вирусных геномов, взаимодействии вируса с растениями-хозяевами и переносчиками, транспорте вирусной инфекции и т.д. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномных РНК вирусов дал возможность выяснить филогенетические отношения между отдельными группами фитовирусов и некоторые аспекты их эволюционного развития. Работы направленные на изучение структуры и экспрессии геномов фитовирусов имеют не только фундаментальное, но и очевидное прикладное значение, поскольку на их основе ведутся разработки принципиально новых методов защиты растений от вирусной инфекции.

Тем не менее, вирусы, поражающие некоторые семейства растений, остаются недостаточно изученными. В их число входят и вирусы растений рода Allium. Растения этого рода, в особенности размножающиеся вегетативно, как правило, в природных условиях поражаются одновременно несколькими вирусами. Выделение и изучение отдельных компонентов вирусных комплексов из таких растений осложняется тем, что вирусы сложно разделить традиционными методами, поскольку зачастую вирусные частицы практически неразличимы по морфологии и физическим свойствам.

Современные молекулярно-биологические исследования РНК-содержащих вирусов растений все чаще базируются на подходах, связанных с клонированием полноразмерных кДНК-копий вирусных геномов, РНК-транскрипты которых способны инициировать вирусную инфекцию. Такие технологии, в частности, позволяют выявить функциональную значимость не только тех или иных вирусспецифических белков, но и отдельных их доменов.

Настоящая работа посвящена молекулярно-биологическому исследованию сравнительно недавно открытого в лаборатории молекулярной вирусологии ВНИИСБ фитовируса - X вируса шалота (ХВШ), ставшего типовым представителем новой группы ХВШ-подобных фитовирусов, получившей название Аллексивирусы (Allexiviruses). Структура генома ХВШ-подобных вирусов наиболее близка к потеке- и карлавирусам. Характерной особенностью ХВШ-подобных вирусов является наличие уникального 42К белка.

Основными задачами настоящей работы было следующее: выявление спектра хозяев ХВШ-подобных вирусов и проведение для этого серологического скрининга в растениях филогенетически близких роду Allium; исследование влияния аминокислотной последовательности вирусспецифических ХВШ белков на морфологию вирусных частиц; синтез полноразмерной кДНК-копии геномной РНК ХВШ и ее клонирование в составе рекомби-нантных плазмид; исследование инфекционности транскриптов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ, ПОРАЖАЮЩИХ КУЛЬТУРНЫЕ

РАСТЕНИЯ РОДА ALLIUM.

Род, Allium относится к семейству Liliaceae, классу Monocoty и включает более 600 видов. Хозяйственное значение имеют выращиваемые как овощные культуры, широко распространенные в сельском хозяйстве: А.сера -репчатый лук, A.sativum - чеснок, А.сера var. ascalonicum - лук-шалот (шалот), A.ampeloporassum var. porrum - лук-порей (порей), а так же ряд декоративных культур.

Культурные растения рода Allium в природных условиях поражены, как правило, не одним, а одновременно несколькими вирусами, различающимися по своей морфологии и принадлежности к той или иной группе фи-товирусов (Bos, 1982а; Van Dijk et al, 1991).

1.1. Потивирусы.

Одними из часто встречающихся в растениях рода Allium фитовирусов являются потивирусы - наиболее обширная из известных в настоящее время групп. Потивирусы получили свое название от типичного представителя этой группы Y вируса картофеля (YBK, potato virus Y) (Гиббс и Харрисон, 1978). Группа содержит более 200 различных вирусов, имеющих форму палочковидных или нитевидных частиц, построенных по принципу спиральной симметрии (Gibbs, 1969). Одни представители этой группы обладают достаточно широким спектром растений-хозяев, другие, особенно передаваемые семенами (например, вирус мозаики фасоли и вирус мозаики салата), ограниченным. Потивирусы поражающие растения рода Allium являются высоко патогенными, вызывая на растениях-хозяев сильные повреждения в виде штриховатой мозаики, некрозов и хлорозов.

Как правило, наиболее ясно выраженные характерные симптомы у луковых возникают при поражении потивирусами. Именно благодаря этому обстоятельству потивирусы репчатого лука и лука-порея были обнаружены

еще в 30-е и 50-е годы (Henderson, 1935, Кирке, 1957). Тем не менее, принадлежность ряда поражающих растения рода Allium вирусов к семейству по-тивирусов остается не доказанной. В настоящее время только вирус желтой карликовости лука (ВЖКЛ, onion yellow dwarf virus) и вирус желтой штри-ховатости лука-порея (ВЖШЛП, leek yellow stripe virus) идентифицированы как потивирусы совершенно четко и корректно.

1.1.1. Вирус желтой карликовости лука.

Первые исследования ВЖКЛ относятся к 30-м годам. Так, было установлено (Henderson, 1935), что заболевание, известное под названием «желтая карликовость» репчатого лука, передается при инъекции сока зараженного растения в точку роста луковицы. Было установлено также, что это заболевание передается тлями. При заражении возникали первичные мозаичные симптомы. В дальнейшем, у пораженных растений репчатого лука выращиваемых на семена, развивалась желтая штриховатость, переходящая в полное пожелтение и искривление цветоносных побегов. Урожайность инфицированных растений значительно снижалась, а выход семян падал на 50-70%. Отмечено, что заражение ВЖКЛ снижало степень сохранности луковиц.

Сходные симптомы наблюдались при инокуляции растений шалота, Narcissus taretta и N .jonqulla. Основным источником инфекции являются перезимовавшие луковицы репчатого лука (Henderson, 1935).

Установлено, что ВЖКЛ может передаваться более чем 50 видами тлей. Поскольку растения рода Allium не являются облигатными хозяевами тлей, распространение вируса происходит во время миграции насекомых (Drake et al., 1933; Tate et ah, 1940). Отмечено появление внутриклеточных включений, характерных для потивирусной инфекции (Tate, 1935; MacWharter, 1937). Как и все потивирусы, вирионы ВЖКЛ представляют собой слегка изогнутые частицы длиной около 700 нм, молекулярная масса бежа оболочки составляет 30 кДа (Bos, 1976; Bos et al., 1978a).

1.1.2. Вирус желтой штриховатости лука-порея.

Первые сообщения о поражении лука-порея ВЖШЛП относятся к 1957 году (Kupke, 1957). Детальные исследования этиологии заболевания лука-порея, проявляющейся в возникновении желтой штриховатости, которая развивалась при круглогодичном выращивании этой культуры, начались в 70-е годы (Bos, 1972).

Симптомы (развитие желтой штриховатости, скрученности и потеря упругости листьев, снижение содержания воды в растениях и значительное увеличение предрасположенности зимующих растений к гниению) были идентичны описанным для инфекции ВЖКЛ как в репчатом луке, так и в луке-порее. Вирус, вызывающий эту симптоматику и был назван вирусом желтой штриховатости лука-порея (Bos, 1976; Bos et al., 1978a). В пораженных растениях легко обнаруживались характерные для потивирусной инфекции фибриллярные внутриклеточные включения, а в соке присутствовали частицы с характерной дня потивирусов морфологией (Bos et al., 1978а). Вирионы ВЖШЛП представляют собой гибкие частицы длиной около 770 нм и диаметром около 16 нм, молекулярная масса белка оболочки составляет 34 кДа (Bos etal, 1978а; Bos, 1981).

Позже было показано, что в отличие от ВЖКЛ, ВЖШЛП не инфицирует растения репчатого лука и шалота. ВЖШЛП образует местные поражения у Ch. amar anticolor и Ch.quinoa, появляющиеся после пожелтения ино-кулированного листа (Bos, 1981).

1.1.3. Предполагаемые члены группы потивирусов.

Довольно часто растения чеснока поражены вирусом, который серологически родственен ВЖКЛ (Ploate et al., 1978; Walkey et al., 1987). Этот вирус называют «вирусом мозаики чеснока» (ВМЧ) и он так же имеет типичную для потивирусов морфологию и может переносится тлями (Meassiaen & Marrou, 1965; Graichen et al., 1985). Другой вирус названный «вирусом мозаики лука» (ВМЛ), имеющий вирионы длинной 675 нм, переносится клещом Acería tulipae и вызывает мозаику у растений лука-порея (Прозенко и др., 1961, 1966; Развязкина и др, 1969, 1971; Черемушкина 1974, 1975; Галуш-

кина и Иващенко, 1981). Так называемый «вирус желтой полосчатости лука» описан в Новой Зеландии как вирус, переносимый тлями (Mohamed & Young, 1981). Этот вирус серологически родственен ВЖШЛП и ВЖКЛ (сыворотка к ВЖПЛ хорошо декорирует вирионы ВЖШЛП и ВЖКЛ, однако обратное декорирование не описано). Молекулярная масса белка оболочки ВМЧ и ВМЛ составляет 33 и 30,5 кДа, соответственно, что близко к молекулярной массе белка оболочки ВЖШЛП и ВЖКЛ.

1.1.4. Анализ нуклеотидных последовательностей потивирусов растений

рода Allium.

До сих пор отсутствуют данные о последовательностях геномных РНК ВЖКЛ и ВЖШЛП. Отсеквенированы фрагменты геномов потивирусов поражающих шалот (Zavriev et al., 1991) и чеснок (Sumi et al., 1993), PHK-полимеразные домены которых обладают значительным сходством. Установленные последовательности нельзя однозначно отнести к какому либо вирусу, ранее идентифицированному серологически или биологически. Возможно, шалотный потивирус у которого определена последовательность генов протеазы и РНК зависимой РНК-полимеразы и N-концевой части белка оболочки, является штаммом ВЖКЛ. Данный потивирус накапливается в побегах вегетативно размножаемых линий шалота в чрезвычайно малом количестве: РНК обнаруживается только Nothern блотом, при этом белок оболочки ВЖКЛ не выявляется серологически.

Нуклеотидные последовательности генов РНК зависимой РНК-полимеразы и белка оболочки чесночного потивируса выделенного в Японии, как полагают авторы (Sumi et al., 1993), также может относиться к ВЖКЛ. Возможно, эти нуклеотидные последовательности относятся к достаточно отдаленным штаммам ВЖКЛ или к разным потивирусам.

1.2. Карлавирусы.

Карлавирусы (carlaviruses) получили свое название от типового представителя данной группы - латентного вируса гвоздики (ЛВГ) - carnation latent virus (Harrison et ah, 1971).

Бессимптомное заражение и отсутствие подходящих растений-индикаторов (Wetter & Milne, 1981) являются причинами, затрудняющими обнаружение карлавирусов. В связи с этим, для тестирования карлавирусов большое значение имеют серологические и электронно-микроскопические методы, а также основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) моле-кулярно - биологические подходы детекции вирусных РНК (Tsueyoshi & Sumi, 1996).

Вирионы карлавирусов представляют собой слегка изогнутые палочки с модальной длиной около 610 - 700 нм и диаметром около 12 нм (Wetter & Milne, 1981). Коэффициент седиментации одного из наиболее изученных карлавирусов - М вируса картофеля - равен 157S. Плавучая плотность (по данным равновесного центрифугирования в градиенте CsCh) - 1.322 г/см2 (Tavantzis, 1984). Температура инактивации для большинства карлавирусов находится в интервале 55 и 71°С. Вирусные частицы в большинстве случаев стабильны в соке растений при комнатной температуре в течении 2-5 дней (Wetter & Milne, 1981).

Распределение карлавирусных частиц в зараженном растении не является тканеспецифичным. Вирусные частицы выявляются в основном в цитоплазме клеток различных тканей растения. Карлавирусы не вызывают выраженного цитопатологического эффекта. Заражение большинством карлавирусов не приводит к накопле