Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунодиагностика вирусов растений рода Allium

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Иммунодиагностика вирусов растений рода Allium"

На правах рукописи

(03.00.03, - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва - 1996

Работа выполнена в лаборатории; молекулярной вирусологии ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ЕАСХН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Ззвриев С.К.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Добров E.H.

кандидат биологически наук Вров-Г.К.

Ведущая организация: Биологический фзк-тет МГУ.

Защита диссертации состоится " "_1Э9Бг.

в_час. на заседании Диссертационного Совета Д.020.40.01.

при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г.Москва, ул.Тимирязевская, д.42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " "_1ЭЭ6г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат биологических наук ß Ыеликова С.А.

ОНШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Воздеднваемне виды луковых занимают эдно из ведущих каст среда овощвнх растений. Из них наиболее щюкое распространение подучили репчатый лук, чеснок, лук-шалот и шрей. Большинство представителей данных видов в значительной степени подвержены вирусным заболеваниям. Обычно растения порвхаздгся несколькими вирусами, что связано с особенностями репродукции хозяев и латентным течением инфекции. Наделение и изучение отдельных компонентов вирусного комплекса затруднено из-за того,, что вти вирусы обладают чрезвычайно узким и перзкрцващзмся спектром хозяев в пределах рода Älllim (Barg et al., 1993; Воз et al., 1982). Один из наименее изученных компонентов этого комплекса - X вирус шазюта (ХВШ). В настоящэй работе проведена серологическая идентификация этого вируса, а токзе представлении данные о распространении других вирусов, порБжащт: растения рода Älllvm.

Вирусная инфекция снижает урожайность луков, ухудшает их товарные качества и сохранность. Использование зараженных селекционных образцов приводит к тому, что новые сорта изначально находятся под угрозой вырождения. В связи с этим особенно остро стоит вопрос об освобождении селекционного и посадочного материала от вирусной инфекции. Эффективность этой работы обусловлена возможностью ранней и достоверной диагностики. В настоящее время наиболее популярным методом диагностики фитотшрусов является иммунофериентшй анализ (ИФА). Благодаря успехам биотехнологии, он . интенсивно развивается, принимая на вооружение достижзния генной н клеточзой шаенеривг, молекулярной биологии к пр. Одно из нанравяеннй развития иммуноферментЕогс анализа связано с использованием рекокбинантшх антигенов. В предлагаемой работе на примере ХВШ проанализирована возможность использования антисывороток к реномбинантным белкам оболочек фитовирусов для их диагностики с помощью различных методов ЕМ. Кроме этого, в ЕФА-тестзх использован неструктурный рекомбинавтный вирусный белок.

Цели и задачи исследования:

í .Нденатфшхщия X бгхруса шзлсша, как предствителя группы, нитевидных вирусов, переносимых эриофиидныяи гиещзма. В ходе исследования решались следушцде специфические задаче: получение очищенного .препарата ХВШ, его спектрофотокатрическая и электрошошнроскошгаеская характеристики, получение специфической антпснворотки к ХВШ, серологическая вдентЕфиквцн;. ХВШ, как представителя новой, группы вирусов, и анализ ег; серологического родства с другими представителями зтоа грушш и, наконец, изучение распространения ХВШ в растениях рода Allium и др. родах семейства liliaceaa.

2.Проверка возлстюсш исполъво&сния антисыВорагжи к реумак'лсосглому схрующрно^у йему оболочки ХВШ для диагностики бируоаа заволе&х-шО, расхяний рода Allium. Для достижения данной цела бил получен рекомбпнантшй белок оболочки ХВ1П и соответствующая высокоспецифическая антисшюротка, a тйкхе проведен сравнительный анализ антисыворотак к вирионам ХВШ и рекомбинантнону БО ХВШ.

3.Обнаружение неструктурного 42К Оемса 6 зараженных ХВШ растениях. Для этого были получены рекомбннвнтшй 42К балок и соответственная антисиворотка.

4.Изучение распространения различных Вирусов, поразащих растения рода Allium. Исследование проводилось иммунологическими методами.

Научная новизна работы. В диссертационной работе проведена серологическая вдентгфшация X Бируса шалота, как представителя новой группы нитевидных вирусов, переносимых-клещода, и изучено его распространение. Опробированно испольвоваше рекоыбшантных белков и антисышроток к ним для иммуноферментной диагностики вирусов рода Alliuzi, а таюге для обнаружения неструктурных вирусных белков. Представлены данные о распространении вирусов, шраяащих культурные растения рода ЛШш, на территория Западной частя России.

Практическая ценность работы. Антисшзоротшх, полученные к рекомбинвнтным 42К белку и белку оболочки ХЕШ могут быть использованы для создания систем тестирования ХВШ-дадобных вирусов.

Апробация работы. Основные результаты робота отражены в четырех печатных работах, список которых приводится в конце автореферата. Результаты работы докладывались на гируоологическом семинаре Института Макса Планкз (Кельн, 1995) и школе УВВ5 "Фундаментальные и прикладные проблемы фитопатологии" (Ялта, 19Э4).

Структура работа. Диссертация состоит из введения, глав

"Обзор литературы"., "Материалы в метода", "Результаты и

обсуждения", заключения, выводов и списка использованной

литература, включающего 126 библиографических ссылок. Работа

изложена ва 110 страницах, содержит 33 рисунка. 4

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. Характеристика ХВШ.

1.1 .Получение очищенного препарата ЗВШ.

Задача биологического разделения шалотшго вирусного комплекса и идентификация его отдельных компонентов весьма проблематична из-за того, что эти вируса облвдвят чрезвычайно узким и перехршшщамся спектром хозяев в пределах рода А111ш, вне которого не обнаружено да№рэнцирущш: растений-хозяев, которые можно было бы использовать для накопления только одного из вирусов комплекса.

Выделение вирусов проводилась при +4°С (У1зЬп1оЬепко еЪ аХ., 1993)'. Предварительно закороченные листья растений сначала механически разрушали, пользуясь ступкой н пестиком, в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 8,2, содержащем 5ей ЭДТА и 0,2% Надвей. 'Дяя удаления клеточных оболочек, волокон и т.п.

гошгенат фильтровали сначала через три слоя марли, затем через МггасХо^ (Са1Ъ1ооЬеш). Крупные компоненты сока растений удалялись кратковременным низкоскоростным центрифугированием (15 мин при ЮОЩ*). К полученному суперяатанту добавляли неионный детергент Сй-зЛоп х-юо до конечной концентрации \%), после чего раствор центрифугировали при 1700С^ 15 мин. Из осветвленного экстракта вирус осаждали длительны?.! высокоскоростным дэнрафугированавм (3 часа, 40000 об/мин) через слой раствора сахарозы плотностью 1,2 г/см3. При атом большинство растворимых растительных белков и шюкоголекулярных веществ оставалось в надосадочной нидкоста. Впруссодераащий осадок ресусшндировали в небольшом объеме бадасталлированной води.

В' раде случаев мы ограничивались получением частично очищенного вирусного препарата по описзнной выше методике. Однако, полученный таким образом вирус, еще недостаточно чист для большинства биохимических к биофизических исследований. Дополнительная очистка проводилась равновесным (изопикяическим) центрифугированием в растворах СвС1.

Для атого вяруснув суспензии, смешивали с насыщенным раствором СзС1 до конечной плотности 1,26 г/см3 (плотность частиц большинства фятовирусов лежит в интервале от 1,3 до 1,45 г/см®). Ультрацентрифугированае проводили в течение 26-28 часов, при температуре +4 С и скорости 55000 об/мин. В процессе центрифугирования СзС1 образует градиент и вирусные частицы остаются в слое, плотность которого равна их собственной:

1) материал, извлеченный из зоны с плотностью 1,33 г/см3, согласно элет^онномикроскопическим исследованиям, содержал частицы разной морфологии: незначительное количество жестких палочковидных частиц, и подавляющее болыпенство гибких. Электрофэретаческий анализ этого материал показал, что он почти не отличается от частично очищенного вируса за исключением зоны на уровне 55К, вероятно предстввляшцей собой клеточные белки растения-хозяина.

2) материал, извлеченный из зоны с шютностьв 1,38-1,39 г/см3, содергал ,только гибкие частицы с модальной длинной 750

нм. В ДСН-злектрофорезе ета фракция представляла собой одну зону на уровне 37К. В ишуноблотинге реагировала только с ШП-Ас и ВО ХВШ-Ас и не реагировала, в отличие от фракции с р-1,33 r/ci.i3 и -частично очищенного вирусного препарата, с сывороткой против карлавируса (ЛВЧ-Ас) (Вианиченяо и др., 1996).

1.2. Спектрофотонетрдческая характеристика ХВШ.

Чистоту подученного вирусного препарата оценивали спектрофотометрнчески. Очищенный препарат ХВШ характеризуется типичны!,? УФ-спектром поглощения. Величина отношения Е260/Е280 составляет \ ,2, что > позволяет закличить,. что содержание нуклеиновой кислота в вирусе около 5%.

1.3. Электронно-микроскопическое исследование ¡залотвого вирусного к01яшекса.

Первыми объектами в работе по изучению вирусов, инфицирующих растения рода All Um, быж шалоты сорта Тагар (Монголия) и сортообразца Тч83 (ВНИИ ССОК), тгокулированного экстрактом иалота сорта Тагар. Выделенный из них вирусный комплекс представлял собой смесь палочковидных вирконов с модальной - длинной 650-700 вм и гибких нитевидных вирионоз длиной около 800 им. Первоначально все вирусы первого типа по морфологическим признакам были отнесены к группе карлавирусов, а второго - к группе нотивирусов (Развязкния и др., 1969; Черемушкина и др.,1986).

С помощью методов шлмуноблотинга и щунноанектронной гякроскошш нами било показано, что карлввирусный компонент шалотного вирусного комплекса представлен двумя вирусаш: латентным парусом шалота (ЛВШ) и/или латентным вирусом чеснока (ЛВЧ). Из известных потивирусов Allium обнаружен вирус келтой карликовости лука (БЖКЛ).

Однако, наибольший интерес представил факт, основанный на результатах алектронно?,шкроскопических исследований, которые свидетельствовали: о заметной г«зрфолагнческоа гетерогенности фракции гибких взрионов (Вишшгсенко и др., 1996). Эти

исследования показали, что наряду с частидаш потоварусного типа в препаратах в значительных количествах присутствовал! очень гибкие вяриони, длина которых составляла 750 нм. Более того, серологический анализ шалотов других сортообразцов из ВНИИ COOK (NN 65 , 77 , 83 не инок., 107 и даже N 83 шок. спустя несколько лет после его инокуляции) не обнаружил присутствия и этой фракции на ВЖКЛ,, ни' какого либо 'другого из известны:, потивирусов All. im. На основании этих результатов был сделан вывод, что обнаруживаемые наш как в экстрактах растений шалота, так и в очищенных вирусных препаратах гибкие вприоны, представляют собой частицы ранее неизвестного вируса растений рода AlUwi (Араава и др.,. S9£S£n ; Tishniohenko et al., 1993). Этот вирус не был вдантафицировая как потивирус, т.к. анализ тонких: срезов не обнаружил присутствия характерных для потишруснэй ивфекцяи щтаашшзмзтических включений. В последствии для обнаруженных частиц било предложено название X вирус шалота (ХВШ). На рисунке 1 представлена электронная микрофотография очищенного препарата ХВШ. С помощьи целого ряда серологических методов исследования (см. низ®) показано, что ХВШ явялется основным компонентой вирусного иалотного комплекса, а соотношение вирионов карла- и потивирусного типов варьирует в широких пределах, до полного исчезновения последних.

Рис. 1.Элекгронномикроскопическая фотография вирионов , ХВШ, внделенннх та лукв-шалота (сортообразец N83inok) (1995). Контрастирование \% уранилацетатом. Увеличение 50000.

2. Выделение и очистка рекогдЗинантного Редка ободочки ХВШ.

Поставлешая наш задача серологического изучения ХВШ потребовала применения антисывороток (Ас) очень высокой специфичности, т.е. имеющих антитела (Ат) только против ХВШ. и не имеющих Ат против других вирусных антигенов (Аг) или клеточных компонентов растения-хозяина. В связи с этим ракомбинантнне Аг обладают преимуществом по сравнению с Аг, выделенными из растений..

Ген белка оболочки ХВШ был клонирован в плазмиде рQE11. Трансформацию рекомбинантнши плазмидами клеток E.coll штамма М15, отбор клонов, индукцию экспрессии рекомбинвнтного белка и его хрома тографическуй очистку проводили согласно протоколу "DIAGBN" (Diagen, GrrM). Полученные белоксодергащие фракции анализировали в ДСН-злектрофорезе и иммуноблотинге: в клетках E.coll, несущих плазмиду рХ34, содержащую ген БО ХВШ, индуцировался синтез белка с подвижностью около 37 К. Фракции с рекомбинаятнш БО ХВЗЗ, специфично прореагировавшим с Ас к вирионам ХВШ, объединяла, диализовали против 4M мочевины и использовали для иммунизации животных (Zavriev et al., 1994; Аршава и др., 1995).

3- Антасывороткй: ' "

Для успешного и эффективного применения в КМ Ас должны обладать как высокой специфичностью, так г достаточной чувствительностью, т.е. высоким титром специфических Аг.

В работе использовались четыре аятасксорбтки, подученные в нашей лаборатории: против шрусншс частиц ХШ (ХВШ-Ас), рекомбиэантгого' белка оболочки ХВШ (БО ХВШ-Ас), комплекса вирусов, персистируищ: в растениях лука-шалота {ХВШ-Ас N88), а также против рекомбинантного 42К белка ХВШ (4ZR-AC). Кроме того, мы использовали енворопси против вирусов растений рода Allium, полученные из различных лабораторий мара (табл.1 ).

Для получения антиснюроток m иммунизировали шестимесячных ново-зеландских кроликов. Первуи иммунизацию проводили внутрикожно в область спины (в 10-20 точек) смесью соответствующего антигена и полного вдазпванта Фрейнда в

соотношении 1:1 (конечный объем 1.5-2.0 мл). Вторув иммунизации проводили через десять дней после первой путем подкожной инъекции смзси антигена и неполного адьиванта Фрейнда (1:1). Еще через 10 дней кролика иммунизировали в третий раз -внутримышечно, используя неполный адашвант Фрейнда.

Таблица 1. Антисишроткн.

Название вируса Анта-снворотка Источник

Вирус настой карликовости луке ЕШ-Ас-Голландая ВЖКЛ-Ас-Япония Голландия, д-р. Ван Дейк Япония, д-р. Фуками

ВШЛ-Ас-Германия Германия, д-р. Феттен

Латентный вирус шалота ЛВШ-Ас-Голландия Голландия, д-р. Ван Дейк

ЛВШ-Ас-' Германия Германия, д-р. Феттен

Вирус желтой штриховатости порея ВШП-Ас-ВШЦч)-Ас Германия, д-р. Феттен Германия, д-р Феттен

Латентный вирус чеснока ■ ЛВЧ-Ас-Япония Япония, д-р. Фуками

Вирус нитевидный переносимый клещем ВШЖ-Ас Германия, д-р. Феттен

Латентный обычный ЛОВЧ-Ас Германия, д-р. Феттен

вирус чеснока

Количество антигена, вводимого в течении трех иммунизаций, составляло 200, 300, и 400 мкг, соответственно. Кровь брали через каждые 7-8 дней после третьей иммунизации в течение трех месяцев (Аршава и др., 1995).

с с

Все Ас характеризуются высоким титром (10 -10 ), не реагирует с гетерологичннми Аг, БО ХВШ-АС не содержит, а ХВШ-АС почти не содержит Ат к клеточным компонентам здоровых растений (сыворотки анализировались "непрямым" методом ИФА).

"Непрямой" метод иммунноферментного анализа, проводимый с помощь® полученных наш сывороток против ХЕШ ж БО ХВШ, обладает достаточно высокой чувствительности. .. Так, минимальная концентрация вируса, определяемая при использовании ХВШ-Ас в разведении 1:10 , составила 0,03 мкг/мл, а при использовании БО ХВШ-Ас - 0,1мкг/мл.

4. Серологическое изучение ХВШ.

4.1. КдентиЗрикация ХВШ. как представителя новой группы вирусов, переносимых эриофаидным клешем.

Серологический анализ {ЕШЭА, икмуноблотинг, шмуноэлектронная • микроскопия) не обнаружил в экстрактах растений ж в очищенных препаратах шалотного вирусного комплекса присутствия известных потивирусов А1Иьт (ВШИ или ВЯШП). На тонких срезах листьев шалота отсутствали характерные для потивирусной инфекции цнтоплазматические включения.

Дашке результаты позволили предположить, что обнаруживаемые гибкие вирионы представляет собой частицы ранее неизвестного вируса рода АТЫш, названного нами ХВШ. Присутствие в составе шалотного комплекса ХВШ коррелировало с наличием в исследуемой системе нового типа капсидного белка с подвижностью в ДСН-ПААГ, соответствующей мол. массе 37кД.

Серологический анализ этого белка проводился с помощью ишуноблотинга, еыба и иммувноэлектронной микроскопии.

Ишуноблотинг. Электрофоретически разделенные в ДСН-ПААГ и перенесенные • на \ нотроцеллвдозные фильтры, белки вирусного шалотного комплекса подвергались последовательной

иммунофермзнтвой обработке. На рис.2,А представлен фильтр, обработанный сывороткой против вирусного препарата ХВШ, а на рис 2,Б - сквороткой против рекомбинантвого белка оболочки ХВШ. Из результатов анализа видно, что белок с молекулярной массой 37кД одинаково хорошо выявляется как первой, так и второй сыворотками. Следует отметить, что зтот же белок н;-обнаруживается с помощью других антисывороток к вирусам, инфацирувщин растения рода АШш (рис.4 "и 5). Исключение составляет антисыворотка из Японии к чесночному изоляту вируса желтой штраховатости порея (ВЯЕП(ч)-Ас). однако, сыворотка против того ш вируса, полученная из Германии (ВНШ-Ас), вирусспецифаческий антиген в области 37К не выявляет. Столь большие различия в специфичности антискюроток, полученных в Японш и Германии к двум изолятам одного и того же вируса, можно объяснить либо неправильной идентификацией одного из вирусов, либо наличием в нем примзси другого вируса (ХВШ).

кгд5а. Результаты иммуноблотингов и кыва на плашках, не всегда коррелируют. Во-первых, это связано с невозможностью в ЕЫВА. тестах отделить специфический, сигнал от неспецифического (особенно в "непрямом" методе ЙФА). Кроме этого; при использовании Ас к рекомбинантному БО ХВШ для тестирования растительных вкстрактов отмечалось уменьшение интенсивности специфического сигнала по сравнению с интенсивностью реакции того же растительного Аг с Ас к интактвым вирионам. По всей видимости, это связано с тем, что конформация рекомбинантного вирусного Аг не соответствует натившй конформации в структуре иятактного нариона. Таким образом, выявлние вирусов методом иммуноблота дает более четко итерпретируемую и адекватную картину, чем иетод ЙФА на плашках.

Иммунноздектронная микроскопия. Сорбированные Н8 сетке-подложке вирусные частицы, выделенные из лука-шалота сортообразца К83инок., инкубировались с ХВШ-Ас. После негативного контрастирования в пале зрения электронного микроскопа различались гибкие, нитевидные частицы, кфуаенные "шубой" антител, которая увеличила их диаметр по сравнении с, сорбированными палочковидными вирусными частицами (рис.3).

ÔfiMl: -Ш

i Î 3 4 *5 6 7 <r 9 to rrtz

i г з a s 6 7 a s to a /г

67 -4S "

30 -

' fâs. » . л... L ' «u» —в»-."-" "

QU

Рис.2. Анализ различных сортов репчатого лука а лука-шалота методом Еммуноблотинга с использованием ХВШ-Ас (А), ВО ХВШ-Ас (Б) и ВНПК-Ас (В): дорожка 1 - маркерные белки окрашены амидршварцем, дорожка 2 - экстракт шалота N55, дорожка 3 -экстракт шалота N77, дорожка 4 - экстракт шалота е83, дорожка 5

- экстракт шалота N83inok, дорожка ь - экстракт шалота N107, дорожка 7 - экстракт из сеянцев шалотв Атлас, дорожка 8 -экстракт из листьев репчатого лука сорта Арзамасский, дорожка 9

- экстракт из 'Листьев лука. Бессоновский,' дорогое 10 - экстракт из листьев лука Даниловский, дорожка 11 - препарат, выделенный из лука сорта Спасский, дорожка 12 - вирусный препарат,

? 1': т' \

3*^/ 1 • -РПлТ"' ''"- V- *. ; Ч

У

V- • '

•л» . /

Рис.3.Элвктронномжкроскопическая фотография вирионов ХВШ, выделенных из лука-шалота (сортооОразец N83шок) (1995), "декорированных" ХВШ-Ас.

Установление полной нухлеотидной последовательности геномной РНК ХВШ подтвердило гипотезу о его принадлежности новой груше вирусов. Последовательность содержит шесть открытых рамок считывания (ОРС). Белок, кодируемый 5'-концевой 0РС1, 'обладает высокой степенью' гомологии -с РНК-репликезой потексвирусов; белки, кодируемые 0РС2, ОРСЗ, 0РС5 и 0РС6, также гомологичны соответствующим белкам карла- и/или потексвирусов; и, наконец, кодируемый 0РС4 42К белок не имеет аналогов не только среди вирусных белков, но и среди всех белков, последовательности которых имеются'в современных банках данных (Хаута&г et а1., 1994; Рябов и др., 1996). Недавно появились данные по структуре 3'-концевых областей геномов нескольких вирусов чеснока (СГУ-А, СУ-В, СУ-С), в которых тоже установлено наличие аналогичного гена (Била et а1., 1993).

4.2. Анализ серологического родства ХВШ и нитевидного

вируса переносимого клещем (НВПК). Недавно в литературе были описаны. обнаруженные в репчатом. луке нитевидные вирусы переносимые клещем (НВПК), близкие но

морфологии частиц и серологическим свойствам латентным вирусам лука, шалота и чеснока, описанным ранее (Tan Di^k et al., 1991). По полученным в нашей лаборатории данным, структура генома НВПК сходна с таковой ХВШ (Zavriev et al., 1994). Поэтому вместе с изучением • распространения ХВШ и ВНПК, было проведена исследование серологического родства этих вирусов.

На Рис.2 приведены тмуаоблотшгя экстрактов из различных растений шалота и репчатого лука, которые анализировались с помощью сывороток против ХВШ (ХВШ-Ас) (Рис. 2-А) и ВНПК (ВНПК-Ас) (Рис. 2-В). Первая антисыворотка получена в нашей лаборатории, вторая предоставлена д-ром Феттеном (Германия). На инмуноблотингах, обработанных XBIff-Ac, видно,- что белок оболочки ХВШ, мигрирующий в геле как белок с мал. массой 37К, присутствует во всех анализируемых сортообразцах шалота (Рис. 3,А, дорожки 1-5, табл.2) и отсутствует в растениях репчатого лука (Рис. 2,А дорожки 7-9, табл.2). Аналогичные в отношении вирусспецифнческого антигена результаты были получены с использованием ВНПК-Ас (Рис. 2,В и табл.2). Из этих результатов видно, что серологически ХВШ и ВНПК родственны и, возможно, представляют если не один и тот же вирус, то различные его изоляты.

4.3- Распространение ХВШ в растениях рода АШхля и др. родах семейства ЫИасеае.

После идентификации ХВШ, как представителя новой группы фитовирусов, и анализа его серологического родства с другими предполагаемыми представителями этой же группы, возникла необходимость изучить распространение ХВШ в растениях.

В таблице 2 суммированы результаты го серологическому исследованию распространения вирусов в растениях рода АШит, полученных методом иммугоблотинга с использованием всего спектра имевшихся в нашем распоряжении антисывороток.

ТАБЛИЦА 2

Результаты серологического исследования распространения вирусов в растениях рода All im.

Вид, сорт, сортообразец Происхождение Антисыворотки

ВО ХВШ ХВШ ВНПК Герм. " ЛВЩ Таиланд. лвш Герм. ЛВЧ Япония

1.Лук-шалот

Ко.аз - • ВНИИ ССОК +++ +++ +++ . + + ++ .

Ко.83 злой ВНИИ CGOK ■ +-Н- +++ +4+ +

Ко.77 ВНИИ ССОК -н- -н- + +

Ко! 1.07 ВНИИ ССОК +++ +++ ' + +

N0.65 ВЙШ ССОК -н- ++ ' ++ | + 1 * + |

сеянцы сорта Атлас Голландия - - - ■ - не -анализ

2.дук репнаг. сорта!.

Бессоновский Чувашия - - ■ - - -

Тимирязевский Чувашия - ' • - - - - -

СтригуновскЕй Чувашия - - - - - -

Одинцовский Чуваязя - - - - - -

Мстерский Кострома ... ... - - - -

Арзамасский Н.Новгор. ... ... - - - -

Штудтгарский Чуваяия + + + - - -

Спасский Рязань ++ -н- не анал. - яе анализ

Даниловский Кострома ■ ++ ++ не анал. - - не анализ

3.Чеснок ВШИ ССОК - - - - - ++

Вид, сорт, сортообразец Происхождение Антисывороткн

ЛОВЧ Герм. ВШГ Герм. ВШГ Япония вшп Герм. ВЖШПч Герм.

1.Лук-шалот

Ко. 83 ВНШ COOK . + ... ... - +

No.83inoo ВНИИ.COOK - - -

No. 77 ВНИИ COOK - - - - - - +

lío.107 ВНЩ COOK + ... - + .

N0.65 ВНИИ COOK - - - +

сеянцы с.Атлас Голландия - - не анал. не анализ. - +

Лук ренчат. -сорта: ■ , . • , ■

Бессоновский Чувашия + - ; ++ ++ - ■ -

Тимирязевский Чувзшя - ' - - - -

Стригуновский Чуввтая - - ' ■ -• -

Одинцовский , ЧувааЕЯ - - -

Мстерский Кострома - ++ ++ - -

Арзамасский Н.Новгород - ... ... - -

Штудтгарский Чувашия - - . - -

Спасский Рязань - ++ ++ - -

Даниловский Кострома - ++ ++ - -

3.Чеснок ВНШ ссок +++ - - - -

Примечания: +++-, -н- и + сильная, средняя и слабая иммунологическая реакция, соответственно; ... следовое присутствие АГ (на границе чувствительности метода); - отсутствие реакции; н.анализ. - образцы не анализировались.

Для анализе распространения ХВШ нема были использованы две вирусспецифические антисыворотки: одна - против вирусных частиц ХВШ (ХВШ-Ас), вторая - против рекомбинантного белка оболочки ХВШ (ВО ХВШ-Ас).

Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствует-, что ХВШ присутствует во всех проанализированных сортообразцах шалота селекции ВНИИ ССОК (рис.2), в растениях репчатого лука, сортов Штудтгарский (Чувашия), Спасский (Рязань) (рис 2 и 4) и Даниловский (Кострома); небольше количества вируса отмечены в сортах МстерскиЙ (Кострома) и Арзамасский (Н.Новгород). ХВШ отсутствует в проростках из семян шаюта сорта Атлас (Голландия) (Рис.2), в растениях репчатого лука сортов Вессоновский, Тимирязевский, " Стригуновский и Одинцовец (Чувашия) (Рис.2), в чесноке селекции ВНИИ ССОК, а также в ряде декоративных растений сем. Liliaceas (крокус синий, крокус желтый, пролеска, нарцисс, тшьпан).

С помощью ВО ХВШ-Ас наш были проанализированы также экстракты нескольких индивидуальных растений репчатого лука сортов Даниловский и Спасский. Использовались листья проросших луковиц. Результаты представлены на рис.Б,А. Видно, что в растениях обоих .сортов антиген ХВШ присутствует, но в отдельных растениях значительно варьирует количественно.

Анализ сеянцев >(проростков семян) нескольких сортов репчатого лука (Погарский, Краснодарский, Даниловский, Стригуновский, Спасский, Штудтгардский и Одинцовец) показал отсутствие в них антигена ХВШ (Рис.4).

Приведённые результаты в основном хорошо коррелируют с аналогичными .данными, полученными "сэндвич" и . "непрямым" методами ИФА. Снижения высокого уровня нвспецщического сигнала последних мы добивались обработкой Ас соком незараженных растений, в качестве которых использовали проростки из семян репчатого лука сорта Стригуновский. Вывод об отсутствии в них вирусной инфекции делали по результатам иммуноблотингов.

30

20 14

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11-А

67 43 «St

30 Г

20 V

'Ж

• - ' ' ."-VU

»»•-<-». ' -¿Ci«—

-¿¿.-«sr? '■ i-saii -

. - -, fi

/ж V

14 M

1 23456 789 10 11

67 1

43 У -г —' — ~ —

30 — — — — —

20 •

14 С

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

В

Рис.4. Анализ вирусных препаратов» выделенных из растений различных сортообрвзцов лука-шалотв (селекции ВНИИ СВДК) и из сеянцев нескольких сортов репчатого лука: дорожка 1 - маркерные белки, окрашенные змидошварцем, дорожка 2 - препарат, выделенный из шалота N65, дорожка 3 - препарат из шалота N77, дорожа 4 - из N83, дорожка 5 - из H83inok, дорожка G - из N107; дорожка 7 - препарат из листьев репчатого лука сорта Спасский. На остальные- треки нанесены препараты, выделенные из сеянцев следующих сортов репчатого лука: Спасский •(дор.8), Даниловский (дор.9), Краснодарский (дор. 10) и Погарский (дор.11).

Блот А обработан ХВШ-Ас, Б - ЛВЧ-Ас, В - ЛВШ-Ас.

5. Серологическое исследование распространения карлавярусов в растениях рода А~1Иш и др. родах сем. Llliaceae.

ЛВЩ идентифицировался, нами с помощью двух вирусспецифичных антисывороток голландского (ЛВШ-Ас, Голл.) и германского (ЛВШ-Ас, Герм.) происховдения. Во всех цроанализирванных растениях шалота (сортообразцы NN 65 , 77, 83 , 83инок. и 107) выявлено наличие небольших количеств этого вируса, причем никаких различий в специфичности двух сывороток не обнаружено, что указывает на серологическую идентичность голландского и германского изолятов ЛВШ (рис.4). Ни в одном из остальных растительных объектов ЛВШ,не идентифицирован (табл. 2).

ЛВЧ идентифицируется во всех сортообразцах шалота, полученного из ВНИИ CCQK, вирусспецифичной антисывороткой японского происхоздения (ЛВЧ-Ас) (Рис.4), в то время как латентный обычный вирус чесноке (ЛОВЧ) в очень небольших количества обнаруживается соответствующей антисывороткой германского происхоздения (ЛОВЧ-Ас) только в двух сортообразцах шалота - No 77 и 107. В чесноке подмосковной селекции, а также в чесноке селекции ВШИ ССОК, выявлены как ЛВЧ, так и ЛОВЧ (табл.2).

-• -.во всех исследованных сортах репчатого лука (при анализе-проростков луковиц)_ ЛВШ отсутствует, в Бессоновском выявлен ЛОВЧ, в Даниловском - ЛВЧ. В проростках из семян (сеянцах) карлавирусы обнаружены не были (табл.2).

6. Серологическое исследование распространения потивирусов в растениях рода ЛШш и др. родах сем. ЫИасеае.

Результаты по выявлению двух -наиболее хорошо изученнх л широко распространенных в природе потивирусов, инфицирующих растения рода ЛШш - ВЖКЛ и ВЖШП (Воз е-Ь а1., 76, 78,-81), приведены в последней части таблицы.

■Для обнаружения • ВККЛ в наших образцах мы использовали антисыворотки против немецкого и японского изолятов ВККЛ.

Еелок-аптиген, мигрирущий в геле с мол. массой около 34К, серологически идентичный белку оболочки ВЖКЛ. обнаруживался в шалотах сорта Тагар (Монголия) и сортообразда N 83 в первый год после его инокуляции соком шалота Тагар (Бис.5, дор.З). Серологичесготй анализ других сортообразцов из ВНИИ ССОК и даже инокулированного шалота N 83 (спустя десять лет вегетативного размножения после его первичной инокуляции) не обнаружил присутствия в этой фракции ВЖЛ (Рис.5, дор. 15).

Исследование экстрактов из проростков луковиц различных сортов А111ш сера позволил выявить присутствие белка-антигена ВЖКЛ в сортах Спасский (рис.5, дор.4), Даниловский, Мстерский, Бессоновский и его .следовые количества в сорте Арзамасский (табл.2).

б? -43 а

30

20

П'з 4 .5-6 ? а э ю 11 12 <Ъ м

Рис.5. Анализ различных сортов репчатого лука и лука-шалота методом иммуноблотинга с использованием ВЖК1-Ас (Япония).

Маркерные белки (дор.1) и препарат ХВШ (дор.2) окрашены амидошварцем.

На дор.З нанесен частично очищенный вирусный препарат, выделенный в 1988г. из шалота N83, инокулированного экстрактом из листьев шалота Тогар; на дор. 15 - аналогичный препарат из того же соргообразца шалота, но выделенный через 8 лет после инокуляции.

Дорожки 4, 5, 6, 7, 8 - экстракты из листьев репчатых луков сортов Спасский, Арзамасский, Бессоновский и Даниловский; .дорожки -9, 10, 11, 12, 13 - экстракты шалотов N65 , 77 , 83 , 83 инок, и 107 соответственно.

На дор.14 - препарат, выделенный из лука сорта Спасский.

Анализ распространение в растениях шалота и лука ШЕЛ, с помощью антисыворотки к порейному изоляту вируса, полученной из Германии, не выявил вирусспецифичного антигена ни в одном из экстрактов исследованвых растений (табл. 2). Прокрашиваемая зона в области 45К связана, по всей видимости, с присутствием в антисывороткв ТШШ-Ас антител против антигенов растительного происхождения. Антисыворотка из Японии к чесночному пзоляту ВЖШП (ВНШП(ч)-Ас) выявляет антиген в области 37К во всех образцах шалота, включая сеянцы сорта Атлас, в то время как в образцах репчатого лука этот антиген не выявляется. Столь больше различия в специфичности двух антксывороток, полученных в Японии к Германии к двум изолятам одного и того se вируса объяснить трудно. Нонно предположить, что на самом деле природа этих различий лехит в неправильной идентификации одного из вирусов, вероятно порейного изолята.

7. Обнаружение 42К белка в зараженных ХВШ растениях.

Одной из основных черт генома ХВШ, отличавдей его от близких по структуре карла- и потексвирусоБ, является наличие .гена, .локализованного кеаду..генами- тройного, блока и белка-оболочки, и кодирущего белок с мол. массой 42К (Zavriev et al.,1994). Информации об зкспресси этого белка и его функциях в процессе вирусной инфекции пока нет. В настоящей работе сделаны первые попытки функционального исследования 42К белка ХВШ и его экспрессии в зараженных растениях, получена 42К-Ас, с помощью которой проводЕлось обнаружение этого белка ln vivo.

7.1 .Хроматографическая очистка рекоглбинантного белка 42К и его использование в качестве антигена для получения Ас. Ген 42К белка ХВШ был клонирован в илазмиде pQE30. Трансформацию рекомбшантныда плазмидаш клеток E.coll Ы15 [рЕЕ4],' отбор клонов, индукцию экспрессии рекомбинантного белка и его хроматографическув очистку проводили согласно протоколу

"DIAGETJ" (Dingen, GribU). Полученные белоксодерхащие фракции анализировали в ДСН-злектрофорезе и использовали для иммунизации кроликов (Аршава и др., 1995).

Анализ специфячности и чувствительности 42K-AC проводился непрямым методом ИФА на плашках. Титр сыворотки определялся на 10 мкг очищенного рекомбинантного белка, он оказался достаточно высоким - 10~3-10"4.С гетерологичными антигенами 42К-Ас не реагирует Чувствительность "непрямого" метода ИФА с использованием 42К-Ас в разведении 1:103 определялась на гомологичном антигене, раститрованном от 100 до 3x10-4 мкг/мл. Антисыворотка в названном разведении улавливает антиген в концентрации 0,3 мкг/мл.

7.2. Обнаружение 42К белка в растениях» зараженных ХВШ.

На Рис.Б приведены результаты идаунохимического анализа экстрактов из листьев индивидуальных растений шалота N107 и 83, а также репчатого лука сортов Даниловский и Спасский с помощью БО ХВШ-Ас (Рис.6,1) и 42К-АС (Рис.б,Б). Из рисунка видно, что 42К белок ХВШ обнаруживается во всех растениях, в которых присутствует вирусный белок оболочки. Электрофоретическая подвижность белков, выявляемых в иммуноблоте антисывороткой к 42К белку несколько меньше подвижности рекомбинантного белка, что по всей видимости сзязано с наличием полигистидинового "хвоста" на N-конце молекулы. Природа выявляемых антисывороткой к 42К белку ХВШ двух зон, соответствующих белкам с мол. массаж в районе 25-30К не вполне ясна. Наиболее вероятно, что это продукты частичной деградации 42К белка. Такое предположение хорошо коррелирует с данными In vitro трансляция 42К белка с РНК-матрицы, синтезированной с шшзмиды, содержащей полную кДНК копию гена 42К белка в системе лизата ретикулоцитов кролика, где также четко выявляются аналогичные зоны (Kanyuka et al.', 92).

К сожалению, нам не удалось обнаружить растения шалота, которые давали бы отрицательный результат в реакции с антисывороткой к белку оболочки ХЕШ. Для более четкой демонстрации того, что 42К белок присутствует только в тех растениях, которые заражены ХВШ, нам пришлось провести опыты на

различных растениях, подвержены! инфицировании ХВШ и/или серологически родственными ему вирусами. Результаты экспериментов, в которых анализировалась экстракты листьев индивидуальных растений лука сортов Даниловский и Спасский приведены на рис.6 (дор.4,5,7-13).

67.

43, _

¡о- I

- : I

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 А

67 43"

30—

2.0 ~~ "

12" 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Б

Рис.6. ЕммуноОлотинги экстрактов из листьев индивидуальных растений иалота N107 (дор.2,3), репчатого лука сорта Даниловский (дор.4,5) и Спасский (дор.7-13); шалота Н83 (дор. 6). На дорожку 1 нанесены мапкетаые белки, на дорожку 14 -, препарат, рэкомбияантного ВО ХВШ, на. дорожку 15 - рекомбинантный 42К белок ХВШ.

Нлот А обработан Б0 ХВЕЬАс, блот Б - 42К-АС.

Растения, экстракта листьев которых содержат белок оболочки ХВШ встречаются среди обоих сортов. При этом в сорте Спасский число ХВШ-положительных растений оказалось больше. Из результатов, приведенных па рис.5,А, видно, что белок оболочки ХВШ отсутствует вовсе или присутствует в малых количествах в растеилх, экстракты которых нанесены на дорожи 4,5,9,10,11,12. В то зе время, белок с мол. массой около 42К выявляется яитлснвороткой против 42К белка ХВШ только в тех растениях, в которых белок оболочки ХВШ выявляется достаточно интенсивно (дорожки 2,3,6,7,8,13). Таким образом, совокупность представленных данных позволяет заключить, что в детектируемых количествах 42К белок ХВШ обнаруживается только в тех растениях, в которых уровень зкспресии белка оболочки и, соответственно, концентрация вирионов ХВШ высоки.

То что 42К белок обнаруживается в растительных экстрактах в существенно меныпих по сравнению с белком оболочки количествах, вполне естественно, поскольку в зараженной клетке уровень экспрессии неструктурных белков по сравнению со структурными, кок правило, певысок. Видимо поэтому, в случаях, когда белок оболочки в образцах выявляется в малых количествах (Рис.7, дорожка -4),-'42К белок не обнаруживается (Аршава я др., 35).

Предварительные эксперименты по выявлению предпочтительной локализации 42К белка в клетке, основанные на его детекции в осаждаемой (мембранной) и растворимой фракциях экстрактов не дали однозначного результата (данные не приводятся).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время в фитовирусологии при проведении массовых серологических анализов используются в основном Ас, полученные к вирусным частицам, выделенным из инфицированных растений. Такой подход имеет, как правило, ряд существенных недостатков, связанных с выделением чистых вирусных препаратов, , не загрязненных Аг растительного происхождения, а также морфологически близкородственными вирусами и (или) их

изолятами. Негативной стороной такого подхода для ряда вирусов является и дороговизна выделения очищенных вирусных препаратов в количествах, "достаточных для получения Ас. Для устранения этих недостатков становится преимущественным применение рекомбинантных структурных вирусспецифических Аг.

В диагностике некоторых вирусных заболеваний животных уже апробированно использование рекомбинантных Аг, возможность их применения в фатовирусологш исследуется в нашей лаборатории. Нами были получены не только описанные вше Ас к рекоыбинантным БО ХВШ и неструктурному белку 42К, но и к рекомбинантшш БО ряда карлаЕирусов (БО БВК-Ас, БО ЫВК-Ас, БО БВХ-Ас), одного потивируса (БО ХВК-Ас), томбусвируса морщинистости турнепса (БО В?.!Т-Ас) и кукумовирус.а аспермш томатов (БО ВА1-Ас).

Англизируя результаты иммуноблотингов, проведенных с использованием Ас к рекомбинантному БО ХВШ (БО ХВЯЗ-Ас) и Ас к выделенным из инфицированных растений вирусным частицам (ХВШ-Ас, ВЕПК-Ас), вазщо подчеркнуть, что наряду с практически полной идентичностью в выявлении специфического антигена, отмечаются разительные отличия в выявлении неспецифичеческого: ВНПК-Ас и ХВШ-Ас реагируют с большей или меньшей интенсивностью по крайней мере с несколькими белкаг,ш хозяйского происхоздэная (Рис.2;- -4, А), Все.- это наглядно демонстрируют преимущество использования Ас против рекомбинантных структурных белков вирусов, по сравнен™ с таковыми к Еирусным препаратам.

Кроме того, использование Ас к рекомбинантному 42К белку позволило методом кшуноблотинга обнаружить этот неструктурный Бирусспецифический белок в инфицированных ХВШ растениях (рис.Б).

В. то 5ка время, полученные с помощью рекомбинантных БО вирусспецифнческие Ас, не всегда оказываются предпочтительнее традиционных. Например, антисыворотки, БО УВК-Ас и БО ХВК-Ас, оказались значительно менее чувствительными, чем Ас, полученные к кнтактным виршнам, а при использовании БО ХВШ-Ас нэ всегда получается однозначно интерпретируемая картина в ныы-тестах. Однако, положительные результаты работы по вкспрессил генов рекомбинантных вирусных БО и их использованию в ИФА дают все основания дая развития этого направления биотехнологии.

выводы

1 .Идентифицирован вирус, поражающий растения рода Allium - X вирус шалота (ХВШ). Результата морфологического, биологического и серологического исследований; позволили выделить его в новую группу ХВШ-подобных вирусов с гибкими нитевидными вирионами, переносимыми клещами, что подтверждается сравнительным анализом структура генома ХВШ и других вирусов этой группы, описанными позднее.

2.Получен рекомОинаптный белок оболочки ХВШ и соответствующая антисыворотка. Сравнительный анализ антасывороток к шрионам ХВШ и рекомбинантному структурному ВО ХВШ методом иммуноблотинга показал преимущество использования Ас к рекомбинантному БО ХВШ.

3.Получен рэкомбинентный неструктурный 42К белок ХВШ и соответствующая антисыворотка. Использование антисыворотки к 42К ' белку' ХВШ позволил обнаружить его экспрессию 'в инфицированных ХВШ растениях.

4.Проведен широкомасштабный скрининг большого количества растений рода Allium (репчатый лук, лук-шалот, порей, чеснок), а так£е некоторых декоративных культур сем.ПИасеае, в результате которого выявлена картина распространения вирусов в Западной части России. Полученные данные позволяют заклшчить, что большинство растений рода Allium поражены одновременно несколькими вирусами, обладающими узким, перекрывавдимся спектром хозяев в пределах рода.

Основное содержание диссертации отражено в следующих работах:

1. Аршава Н.Б., Конарева Т.Н., Рябов Е.В., Завриев O.K. 42К белок X вируса шалота акспрессируется в инфицированных растениях рода Allium. - Молекулярная биология, 1995, тон 29, с. 192-198.

2. Вишдаченко В.К., Конарэва Т.Н., Аршава Н.В., Завриев С.К. Морфологическая гетерогенность частиц Х-вируса иалота, поражающего культурные растения рода ЛШш. - И., Сельскохозяйственная биология, 19SS, т.1, с.120-123.

3. Zavriev 5.К.., Ryabov Е., Vishnicheiiko Т.К., Arshava It.Т. and Konareva Т.К. Structural and immunoohemioal analysis of the 3'-proximal gene products of shallot virus X. Abstracts oT the РЖ55 Advanced Course: "FimdaiBental and Applied Problems in Phytopathology". - Ukraine, Criema, 1'alta, 1994, p.16.

m