Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная антигенная характеристика капсидных белков потивирусов (Дальневосточные изоляты) и их иммунодиагностика

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная антигенная характеристика капсидных белков потивирусов (Дальневосточные изоляты) и их иммунодиагностика"

Г ' од

2 5 СЕН Ш5

На правах рукописи

КАКАРЕКА Надежда Николаевна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ АНТИГЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАПСИДНЫХ БЕЛКОВ ПОТИВИРУСОВ (ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЕ ИЗОЛЯТЫ) И ИХ ИММУНОДИАГНОСТИКА

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 1995

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии и биологии вирусов растений Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научный руководитель - доктор биологических наук

Р.В. Гнутова

Официальные оппоненты - доктор иедицинских наук

Р.А. Слонова

кандидат биологических наук К.П. Дьяконов

Ведущая организация - кафедра вирусологии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

К 003.97.01 по вирусологии в Биолого-почвенном институте ДВО РАН (690022, Владивосток-22, Биолого-почвенный институт, проспект 100 лет Владивостоку, 159)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ДВО РАН

Защита диссертации состоится

в /О часов на заседании диссертационного совета

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Сибирякова

Актуальность проблемы. Известно, что специфические антитела "узнают" не всю молекулу капсидного белка, а лишь определенный участок - эпитоп (антигенную детерминанту). Изучение строения и локализации эпитопов играет одну из главных ролей при идентификации и классификации фитовирусов. Исследование топографии эпитопов в капсиде важно для познания молекулярной организации вириона и достоверной точной диагностики вирусов, а также создания синтетических антигенов и генно-инженерных сывороток. Поэтому иммунохими-ческие исследования капсидных белков фитовирусов актуальны. Классические иммунохимические методы детекции вирусных заболеваний (капельная агглютинация, преципитация, иммунодиффузионные тесты) из-за низкой чувствительности в настоящее время уступили место современным, высокочувствительным и специфичным - радиоиммунологическому, иммуноферментному, иммунолюминесцентному анализам и иммунной электронной микроскопии, позволяющим за короткое время с высокой точностью определять антигены и антитела в минимальных количествах .

Общеизвестен большой экономический ущерб, наносимый фитопато-генными вирусами сельскому хозяйству. В частности, ежегодные потери картофеля от вирусных заболеваний в нашей стране составляют от 25 до 30% (Атабеков, 1984; Атабеков, Тальянский, 1987), сои - 1570% (Рейфман и др., 1971), лука - 30-50% (Косова, Хайсин, 1970). Поэтому, наряду с селекцией вирусоустойчивых сортов, различными агротехническими мероприятиями и другими методами защиты сельскохозяйственных растений от вирозов, большое значение имеет семеноводство на оздоровленной от вирусов основе, которое невозможно без широкого применения иммунодиагностики. В связи с этим актуальной задачей является усовершенствование иммунохимических методов, позволяющих проводить массовую экспресс-диагностику фитовирусов.

Среди таксономических групп фитовирусов самая многочисленная группа потивирусов. Она включает около 180 вирусов, или 3 6% всех известных (Ward, Shukla, 1991). Вирусы этой группы поражают 1112 видов растений 369 родов 53 семейств. На Дальнем Востоке в настоящее время идентифицировано 10 потивирусов: У- и А-картофеля (УВК, АВК) , желтой мозаики фасоли (ВЖМФ), обыкновенной мозаики фасоли (ВОМФ), мозаики сои (ВМС), мозаики турнепса (ВМТ), желтой карликовости лука (ВЖКЛ), мозаики гиппеаструма (ВМГ), мозаики клевера горного (ВМКГ) и вирус традесканции белоцветковой (ВТБ). Они снижают урожайность и качество важнейших сельскохозяйственных куль-

тур (картофель, соя, овощные, зерновые и декоративные).

Антигенные свойства дальневосточных изолятов потивирусов ранее были изучены слабо, а недавно идентифицированные новые патогены ВЖКЛ, ВМГ, ВМТ (изолят из лобы), ВТБ, ВЖИФ (иэолят из гладиолуса) не исследовались совсем. Поэтому, вопрос изучения антигенных и им-муногенных свойств капсидных белков дальневосточных изолятов потивирусов, а также выявление груплоспецифичных эпитопов современными методами иммуноанализа и повышение специфичности и чувствительности диагностических систем актуален и является составной частью фундаментальных исследований фитовирусологии.

Цель и основные задачи исследований. Целью настоящей работы является сравнительное изучение антигенных свойств капсидных белков дальневосточных изолятов потивирусов, ранее не изученных: ВТБ, ВМГ, ВМТ (изолят из лобы), ВЖКЛ, ВЖМФ (изолят из гладиолуса) и известных, но недостаточно исследованных (УВК, АВК и ВМС) для подтверждения принадлежности новых дальневосточных изолятов к группе потивирусов, а также для разработки современных высокочувствительных иммунохимических методов детекции этих вирусов.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Усовершенствовать известные и подобрать оптимальные методики получения очищенных вирусных препаратов исследуемых потивирусов.

2. Получить кроличьи, мышиные поликлональные антитела и куриные иммуноглобулины на основе разработанных для потивирусов схем иммунизации .

3. Провести сравнительную характеристику антигенного родства изучаемых вирусов с помощью иммунохимических методов с целью выявления вирус- и груплоспецифичных эпитопов капсидных белков для подтверждения принадлежности новых патогенов к группе потивирусов.

4. Разработать иммунодиагностикумы для детекции исследуемых вирусов различными вариантами иммуноферментного анализа (непрямой, "сэндвич"-метод, конкурентный вариант, двойной антительный "сэнд-вич"-метод) и усовершенствовать методы экспресс-имкунодиагкостики для использования их в практической работе.

Научная новизна работы. Впервые получены специфические кроличьи и мышиные поликлональные антисыворотки к новым, ранее не изученным потивирусам желтой мозаики фасоли (изолят из гладиолуса), желтой карликовости лука, вирусу традесканции белоцветковой и мозаики турнепса (изолят из лобы), на основе которых были разработаны иммунодиагностикумы для непрямого, "сэндвич" и двойного анти-

тельного "сэндвич"-методов иммуноферменгного анализа (ИФА), позволившие выявлять до 1-3 нг /мл вируса в вирусном препарате и в соке зараженных растений в разведениях 10~"3-10~5.

Впервые выделены мышиные, куриные иммуноглобулины и Г(аЬ')2-фрагменгы кроличьих иммуноглобулинов в качестве первичных антител для двойного антительного "сэндвич"-метода ИФА.

Впервые применен двойной антительный "сэндвич"-метод ИФА (ДАСМ) для изучаемых потивирусов, позволивший повысить чувствительность и специфичность ИФА.

Разработан вариант конкурентного ИФА для выявления группоспеци-фичных эпитопов с целью определения антигенного родства потивирусов .

Практическая значимость работы. Показана высокая надежность им-мунодиагностикумов, разработанных на основе ИФА к вирусу мозаики сои для выбраковки зараженных растений сои (апробированы на сортах Венера и Приморская 494 на опытных полях Приморского НИИСХ).

Рекомендованы иммунодиагностикумы к вирусу желтой карликовости лука для отбора безвирусного посадочного материала (апробированы на опытных полях Института растениеводства и селекции СО РАСХН).

Материалы исследований включены в методические рекомендации "Иммунодиагностика вируса мозаики сои в растениях и семенах сои" (1990) в помощь селекционерам и семеноводам.

Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на 9-ом совещании чехословацких фитовирусологов (Прага, 1989), конференции немецких фитовирусологов (Эберсвальд, 1989), Всесоюзном координационном совещании по генетике, семеноводству и технологии возделывания сои (Благовещенск, 1989), Всесоюзной конференции "Микробиологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства" (Алма-Ата, 1990), Всесоюзном совещании "Иммунитет сельскохозяйственных культур к болезням и вредителям" (Минск, 1991), Всесоюзном совещании "Биология клеток в культуре" (С.-Петербург, 1992), а также на рабочих совещаниях по проекту ГНТП "Безвирусное растениеводство" (Москва, МГУ, 1987-1994).

Публикации■ По материалам диссертации опубликовано 24 печатных работы.

Объем и структура диссертации■ Работа изложена на стра-

ницах, содержит 5 таблиц, иллюстрирована 29 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), экспериментальной части (глава 3), обсуждения ре-

зультатов (глава 4), выводов и списка литературы, включающих наименований, в том числе работ иностранных авторов.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Исследования проводились с дальневосточными изолятами потивирусов: УВК (обычный штамм), АВК, ВЖМФ (изолят из гладиолуса), ВМС, ВМТ (изолят из лобы), ВЖКЛ, ВМГ и ВТБ.

Вирусы размножали и накапливали: АВК и УВК - в растениях табака (Nicotiana tabacum L. cvs Samsun, Xanthi) ; ВЖМФ - в бобах (Faba bona Medic.); BMC - в сое сорта Приморская 494 (Glycine hispida L.), а также в каллусе сои с гликоэидными добавками (томатозид, ланогитозид). Питательная среда готовилась по методике (Murashige, Scoog, 1962) в модификации (Юдакова, Танашкина, 1993); ВМТ - в ло-бе сорта Октябрьская (Raphanus L. subsp. sinensis (Mill) Sazón convar loba Sazón); ВТБ - в растениях тинантии высокой (Tinantia fugax L.) или традесканции белоцветковой (Tradescantia albiflora Kunth.); ВЖКЛ - в проростках лука шаллота Кустовка 513 (Allium as-calonicum L.); ВМГ - в растениях гиппеаструма садового (Hippeastrum hortorum Maatsch. ) .

Выделение вирусов проводили по разработанным нами методикам, а также по модифицированным : Пинькевич и Крылов (1977), Gugerli (1979), Mohamed, Young (1981), Новиков с соавт. (1982), Makkouk et al. (1982), Hisachi, Wakimoto (1985).

Чистоту полученных препаратов определяли спектрофотометрически и электронной микроскопией. Электрофоретический анализ капсидных белков проводили по методике Laemmli (1970).

Кроличьи антисыворотки получали, используя 2 схемы иммунизации:

а) краткая:

1-й день - внутрикожное и подкожное введение 0,3-0,5 мг антигена (Аг) с адъювантом в 5-7 точек по боковым линиям тела животного и вдоль позвоночника в области расположения лимфоузлов;

8-й день - внутримышечное - 0,5 мг Аг с адъювантом;

15-й день - внутримышечное - 0,5 мг Аг с адъювантом;

б) удлиненная:

1-й день - внутрикожное введение 0,3-0,5 мг Аг с адъювантом в 5-7 точек вдоль позвоночника и по боковым линиям тела животного;

7-й день - внутримышечное - 0,4 мг Аг с адъювантом;

14-й день - внутрикожное - 0,4-0,5 мг Аг с адъювантом;

Через 1,5 месяца проводили реиммунизацию. Внутривенно вводили

0,3-0,5 мг антигена. Взятие крови независимо от схемы иммунизации осуществляли на 5, 7, 9, 11, 18-й дни после последней инъекции.

Количество вводимого антигена за весь цикл иммунизации не превышала 1,5-2 мг.

В качестве адъюванта использовали полный адъювант Фрейнда (Диф-ко, США: v/v = 1/2) или его аналог, приготовленный в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН, в котором микробный компонент был заменен на клетки или липополисахариды синезеленых водорослей. Кроме того, как иммуностимулятор применяли коклюшно-диф-терийно-столбнячную вакцину (АКДС).

Мышиные ангисыворотки получали путем трехкратной внутрибрюшин-ной иммунизации с недельным интервалом. Дозы иммуногена - 10, 20, 40 мкг .

Для получения куриных иммуноглобулинов использовали метод Hu et al.(1985 ).

Иммуноглобулины (IqG) выделяли из антисывороток, взяв за основу методики Аксельсена с соавт. (1977) и Леонова с соавт. (1987).

F(ab ' )-> -фрагменты получали по методике Adams, Barbara (1982). Конъюгирование молекул IgG и белка А с пероксидазой из хрена проводили с помощью периодатного метода по методике Nakane, Kowaoi (1974) .

В работе использовали наши модификации следующих иммунохимичес-ких методов: реакция иммунодиффузии (РДД) (Сибирякова и др., 1987); ракетный иммуноэлектрофорез (РИЭФ) (Gnutova, 1980); иммуно-ферментный анализ (ИФА): непрямой метод (Koenig, 1981), "сэнд-вич"-метод (Clark, Adams, 1977), конкурентный вариант (Сибирякова и др., 1987), двойной антительный "сэндвич"- метод (Barbara, Clark, 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СРАВНИТЕЛЬНОЙ АНТИГЕННОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАПСИДНЫХ БЕЛКОВ ПОТИВИРУСОВ И ИХ ИММУНОДИАГНОСТИКИ

Исследование физико-химических свойств капсидных белков изучаемых вирусных антигенов. Максимальное накопление вирусов в растениях отмечено для УВК - на 20-25, АВК - 25-30, ВЖМФ - 12-14, ВМС -40-45, ВМТ - 12-15, ВЖКЛ - 30-35 и ВТБ - 12-15 дни.

Полученные нами вирусные препараты имели характерный нуклеопро-теидный спектр с локальным максимумом при 260-265 нм и минимумом при 240-245 нм (рис. 1), что типично для потивирусов (Hollings, Brunt, 1981). Выход вируса на кг зеленой массы составил: УВК -

70-120, АВК - 20-40, ВЖМФ - 35-40, ВМС - 4-16, ВМТ - 70-100, ВЖКЛ - 80-100, ВТБ - 90-100 мг. Наши результаты согласуются с литературными данными (Bos, 1970; Huttinga, 1973; Пинькевич, Крылов, 1977; Новиков и др., 1982; Одинец и др., 1985; Hisachi, Wakimoto, 1985).

Е

о,г 0,2

0,<

240 260 280

X

Рис. 1. щения

Спектр погло-ультрафиолета

препаратом АВК

По нашим и литературным данным известно, что ВМС накапливается и выделяется из растений сои в небольших количествах. Для того, чтобы повысить количество вируса в исходном материале, мы накапливали вирус в каллусе сои. В процессе выращивания каллуса применяли различные гликозидные добавки. При выделении ВМС из каллуса сокращается процесс очистки вируса за счет исключения этапа осветления сока. Стероидные гликозиды (ланогитозид, томатозид) увеличивали массу каллуса сои и повышали концентрацию вируса в каллусной культуре клеток в 1,5-3 раза по сравнению с контрольной партией, которая содержала 0,9 мг ВМС на 100 г каллуса. С томатозидом (концентрация 4 мг/л) максимальный выход составлял 2,8 мг вируса из 100 г каллусной массы и с ланогитозидом (в той же концентрации) - 3,5 мг из 100 г (табл.1). В то время, как выход вируса из сока больных растений сои составлял 1,4 мг из 100 г листьев.

Электронномикроскопические исследования показали, что все изучаемые вирусы представляют собой нитевидные частицы, длина которых составляет от 700 до 790 нм (рис. 2) .

Табл. 1

Влияние гликозидов на рост каллусной ткани сои и концентрацию ВМС в ней

Концентрация Масса каллуса,г Выход вируса,

Гликозиды гликозида, мг/л мг/100 г каллуса

1 85 1,35

2,5 73 1,2

4 51 3,5

Ланогитозид 5 95 3,2

3 93 3,0

25 67 1,1

40 57 0,98

1 90 1,1

2,5 69 2,2

4 58 2,8

Томатозид 5 95 2,4

8 87 2,4

25 63 1,3

40 53 0,87

_ 47 0,9

- 58 0,75

- 42 1,2

Контроль* - 60 0,93

- 61 0 ,83

- 61 0,96

- 47 0,73

« опыт без гликозидов Среднее квадратичное отклонение для всех опытов составляло 5-10%

Результаты электрофоретических исследований капсидных белков потивирусов различных исследователей (Huttinga, Mosch, 1974; Hiebert, McDonald, 1976; Пинькевич, Крылов, 1977; Matthews, 1982; Hiebert et al. , 1984; Артюкова и др., 1988; Гнутова, 1993), показали, что для большинства изучавшихся ими потивирусов молекулярная масса (м.м.) капсидного белка колеблется в пределах 32,0-38,0 кД. Электрофоретический анализ капсидных белков, проведенный нами, позволил определить в препаратах УВК присутствие основной белковой полосы с м.м. 32,0 кДи продуктов протеолиза с более низкими значениями м.м.; у АВК - белка с м.м. 32,0 кД; у ВЖМФ - двух полипептидов с м.м. 32,0 кД для основного компонента и 28,0 кД - для минорного; у ВМС - двух белковых компонентов с м.м. 32,0 и 28,0 кД; для препарата ВМТ характерно наличие двух полипептидов с м.м. 38,0 и 32,0 кД; для ВЖКЛ - капсидного белка с м.м. 35,0 кД и нескольких продуктов его расщепления; для ВТБ - присутствие в свежеочищенных препаратах одного полипептида с м.м. 34,0 кД.

Нами отмечено, что капсидные белки дальневосточных изолятов потивирусов при хранении подвергаются протеолизу. Как отмечают некоторые исследователи, это связано с действием растительных и бактериальных протеаз (Francki et al., 1985; Shukla et al. , 1988; 1989) .

При выделении ВМС из каллуса протеолиза капсидного белка не наблюдали. Был получен препарат, белковый компонент которого имел м.м. 32,0 кД (рис. 3) .

Рис. 3. Электрофоре-грамма капсидного белка ВМС. 1-2 - капсидный белок ВМС, з - химо-трипсиноген (25,7 кД), 4 - бычий сывороточный альбумин (68 кД), 5 -лизоцим (14,3 КД).

Таким образом, анализ полученных результатов исследования физико-химических свойств изучаемых дальневосточных иэолятов вирусов (морфология частиц, параметры нуклеопротеидных спектров, м.м. кап-сидных белков) и литературных данных, а также результатов исследований биологических свойств, полученных в нашей лаборатории (Толкач, 1995), позволяет нам подтвердить принадлежность ранее неизученных патогенов: ВТБ, ВМТ (изолят из лобы), ВЖКЛ, ВЖМФ (изолят из гладиолуса) к группе Ро1уУ1гиБ.

Получение кроличьих. куриных и мышиных поликлональных антител. У-вирус картофеля является умеренным иммуногеном и как антиген достаточно четко определяется в реакции капельной агглютинации (КА). Сравнительная оценка двух схем иммунизации животных УВК показала явное преимущество удлиненной схемы. По результатам РДД антисыворотка к УВК, полученная по этой схеме имела титр - 1:128, в непрямом методе ИФА - 1:6400, (рис.4а).

16-

1б< (Ч-121.0

06' 06 О*

100 200 ЧОО 800 1600 3200 6400 I2600

раьбеЗсние ангписмбороток

Рис. 4. Растит-ровка кроличьих антисывороток в непрямом варианте ИФА. а-е - кривые титрования антисывороток: УВК, ВЖМФ, ВЖКЛ, ВТБ, ВМС, ВМТ; ж нормальная кроличья антисыворотка. Концентрация антигенов - 5 мкг/мл; разведение антивидового конъюгата - 1:800.

Разработанный нами для УВК "сэндвич"-метод ИФА, дает возможность проводить количественную оценку содержания вируса в очищенном препарате и в соке зараженных растений. Высокая чувствительность этой системы позволила выявлять в препарате до 3-7 нг/мл вируса, а в соке зараженных растений - до разведения 10"3-10"4.

А-вирус картофеля - слабый иммуноген. Титр антител, по краткой

схеме иммунизации составил в РДД - 1:8, по удлиненной - 1:16. В непрямом методе ИФА - 1:1600.

Вирус желтой мозаики фасоли оказался хорошим иммуногеном. Наиболее оптимальной схемой иммунизации ВЖМФ, по которой получен высокий титр антител к вирусу, оказалась удлиненная схема. Полученные титры специфичных антител при использовании краткой схемы иммунизации были в РДД - 1:32, при удлиненной - 1:128.

По результатам непрямого варианта ИФА титр полученной сыворотки составил - 1:6400 (рис. 46).

Применение АКДС, как дополнительного иммуностимулятора, и увеличение разовой дозы вводимого иммуногена до 1 мг существенно не влияло на антителообразование.

При постановке РДД предварительная обработка антигена ультразвуком или 0,1-0,01% додецилсульфата натрия или Твин-80, а также внесение в гель 1,5% полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) способствовали проявлению более четких полос преципитации. Добавление к соку бобов 0,01% 2-меркаптоэтанола препятствовало окислению таннинов и образованию вокруг лунок с соком темных ореолов. Наиболее четкие линии преципитации наблюдали в РДД, если сок бобов предварительно осветляли смесью хлороформа и четыреххлористого углерода (1:1).

Вирус мозаики сои - средний иммуноген. При использовании удлиненной схемы иммунизации тигр полученных антител составлял в РДД -1:32, а при краткой схеме - 1:16. Титр специфических антител в непрямом методе ИФА был - 1:1600 (рис. 4д) . На основе полученных антисывороток был приготовлен иммунодиагностикум для "сэндвич"-ме-тода ИФА. Высокая чувствительность метода позволила выявлять до 1-3 нг/мл ВМС в препаратах и в соке зараженных растений при разведении - 10~3 .

Вирус мозаики турнепса является умеренным иммуногеном. Антисыворотки, полученные по двум схемам иммунизации, были активны и специфичны. В РДД их титр составил - 1:16-1:32, в непрямом варианте ИФА - 1:3200-1:6400 (рис.4е).

Разработан иммунодиагностикум ИФА для непрямого варианта с целью выявления ВМТ в соке зараженных растений. Минимальное количество выявляемого вируса в препаратах - 2-5 мкг/мл, в соке зараженных растений при разведениях порядка - 10~3-10~4.

Вирус желтой карликовости лука - хороший иммуноген. При получении антисыворотки наиболее оптимальной оказалась удлиненная схема иммунизации. Антисыворотки имели титр на 2 порядка выше, чем

при использовании краткой схемы. Он составил в РДД - 1:256 и в непрямом методе ИФА - 1:6400 (рис. 4в).

Для диагностики ВЖКЛ были разработаны непрямой и "сэндвич"-методы ИФА. Высокая чувствительность непрямого метода позволила выявлять до 2-5 мкг/мл вируса в препаратах и в соке зараженных растений при разведениях порядка 10"3-10"4 . Определена концентрация ВЖКЛ в соке пера лука - 1,4-1,5 мг/мл и в луковицах - 0,87-0,92 мг/мл. На рис. 5 представлены калибровочные кривые, полученные при титровании инфекционного сока и очищенного препарата ВЖКЛ в "сэндвич"- методе ИФА. Используемый метод позволил выявить исследуемый

Ед92

(.41.2 ю оа

ов од 02

100 200 400 800 (600 3200 6400

рщЬеОение сока юч ю1 ю* ю' ю° ю'1 С Аг (нг/мд)

Рис. 5. Определение минимальной концентрации ВЖКЛ "сэндвич"-ме-тодом ИФА. 1 - препарат вируса, 2 - сок зараженных растений, 3 - сок здоровых растений, 4 - препарат ге-терологичного антигена ВТМ.

вирус в концентрации 1-3 нг/мл в препаратах и в соке зараженных

- 4 - Я

растений при разведениях - 10 -10 .

Вирус традесканции белоцветковой - умеренный иммуноген. Титр специфических антител, полученных по удлиненной схеме иммунизации был выше, чем при использовании краткой, и составил в РДД - 1:64 (рис. 6) и непрямом методе ИФА - 1:6400 (рис. 4г).

Используемый нами полный адъювант Фрейнда и его аналог, приготовленный в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН одинаково стимулировали антителообразование.

На основе полученных антител к ВТБ был разработан "сэндвич"-ме-

то;; ИФА. При подборе оптимальных условий реакций было установлено, что концентрация IgG составляет 10-15 мкг/мл для сорбирования планшета на 1-ом этапе, оптимальное разведение конъюгата 1:500. Высокая чувствительность метода позволила выявлять до 3-5 нг/мл ВТБ в препарате и в соке зараженных растений при разведении 10" 3.

Рис. 6. Определение титра антисыворотки ВТБ в РДД. В периферических лунках - разведение антисыворотки: цельная, 1:2,1:4,1:8 и т.д., в центральных: А - очищенный препарат ВТБ, Б - сок здоровых растений тинантии.

Антисыворотка к вирусу мозаики гиппеаструма. любезно предоставленная Н.В.Рублевой, была использована при изучении антигенных взаимоотношений дальневосточных изолятов с помощью РДД и ИФА.

Из кроличьих IgG были выделены F(ab' )2 -фрагменты к ВЖКЛ и ВМС. Их использовали в качестве первичных антител в ДАСМ ИФА.

Таким образом, изучаемые потивирусы оказались неплохими иммуно-генами за исключением ABK. Подобранные и используемые нами две схемы иммунизации (краткая и удлиненная) позволили получить специфичные активные кроличьи антисыворотки. Однако, необходимо отметить, что удлиненная схема иммунизации оказалась наиболее эффективной, так как титры специфических антител по этой схеме, были выше, чем по краткой. Краткую схему иммунизации целесообразно использовать при быстром получении антител.

Итак, получены кроличьи поликлональные антисыворотки к ранее не изученным дальневосточным изолятам потивирусов: ВЖМФ (изолят из гладиолуса), ВЖКЛ, ВМТ (изолят из лобы), ВТБ, а также выделены F(ab')2-фрагменты из кроличьих IgG к ВЖКЛ и ВМС и разработаны им-мунодиагностикумы к этим патогенам для непрямого и "сэндвич"-методов ИФА.

Мышиные антисыворотки. Получены специфические мышиные антитела, титр которых (для всех исследуемых вирусов) составил в РДД -1:4-1:8, а в непрямом методе ИФА для УВК - 1:6400; ВЖМФ, ВМТ, АВК, ВЖКЛ - 1:3200; ВТБ и ВМС - 1:400. В литературе имеются сведения о получении мышиных антител к фитовирусам других таксономических групп с более высоким титром в РДД, хотя вводимая доза иммуногена

(Лб. I Г 8 ' "

И

32 2 Б

г 4

была аналогична нашей (Moghal, Francki., 1976; Rihter et al., 1979).

Куриные иммуноглобулины. Титр куриных IgG в РДД не превышал 1:2-1:4. Концентрация IgG, полученных из 5 мл куриного желтка, составила для УВК - 0,79; ВМТ - 0,28; ВЖМФ - 0,55; ВЖКЛ - 10,3; ВМС - 5,1; ВТБ - 21,4; АВК - 0,43 мг/мл. Низкая концентрация IgG, выделенных из желтков куриных яиц, считается обычным явлением и показана другими исследователями (Poison et al.,1980; Ни et al.,1985) .

Титры полученных кроличьих, мышиных антител и куриных иммуноглобулинов к исследуемым вирусам представлены в табл. 2.

Табл. 2

Титры кроличьих, мышиных антител и куриных иммуноглобулинов

Вирусы Кроличьи As Мышиные As Куриные IgG

РДД ИФА РДД ИФА РДД Конц.мг/мл

УВК 1 : 128 1: 6400 1 : 8 1 : 6400 1 4 0,79

АВК 1 : 16 1: 1600 1 :4 1 : 3200 1 2 0,43

ВЖМФ 1 : 128 1 : 6400 1 : 4 1 : 3200 1 4 0,55

ВМС 1 : 32 1 : 1600 1 : 2 1 : 400 1 4 5,1

ВМТ 1 : 32 1 6400 1 : 4 1 :3200 1 4 0,28

ВЖКЛ 1 : 256 1: 6400 1 : 4 1 : 3200 1 2 10,3

ВТБ 1 : 64 1: 6400 1 : 2 1 : 400 1 4 21,4

ВМГ 1 : 128 1: 32000 - - -

As - антисыворотки

Куриные и мышиные антитела были использованы для разработки им-мунодиагностикумов к исследуемым вирусам на основе ДАСМ ИФА.

При подборе условий постановки ДАСМ для всех исследуемых вирусов установлено, что оптимальная концентрация 1дС для сорбирования на первом этапе составляет: для мышиных - 2-5 мкг/мл, куриных -30-50 мкг/мл, кроличьих К(аЬ')2-фрагментов - 2-5 мкг/мл. Разведение кроличьих антисывороток к УВК, ВМТ, ВЖМФ, ВЖКЛ - 1:3000, ВТБ -1:1500, ВМС - 1:500. Результаты титрования антигенов в системе ДАСМ представлены на рис. 7.

1,6

0,8

0,4

1,2

CA г(нг/мл)

Рис. 7. Определение ВЖКЛ ДАСМ 1 - Г(аЬ')2 -фрагменты, 2 - мышиные 1дС, 3 куриные 1дС, 4 - гетероло-гичный антиген (ВТМ). Разведение конъюгата А-бе-лок-пероксидаза - 1:800.

103 10' 10''

В разработанных системах были выявлены исследуемые вирусы в концентрации 30 нг/мл с использованием в качестве первичных антител IgG мыши, до 60 нг/мл - IgG кур, и до 5-10 нг/мл - кроличьи F(ab')2-фрагменты.

Необходимо отметить, что ДАСМ с применением F(ab')2-фрагментов имеет определенные преимущества перед другими методами ИФА: минимальный уровень фоновых реакций за счет устранения неспецифической сорбции конъюгата, высокая чувствительность, возможность использования универсального конъюгата и одного типа антител для диагностики всех вирусов.

Достоинства ДАСМ с использованием F(ab')г-фрагментов, как одного из вариантов ИФА, отмечены и другими исследователями (Maeda, Inouye, 1987; Нацвлишвили и др., 1987; Weiss, Regenmortel, 1989; Chen, Adams, 1991).

Исследование антигенных взаимоотношений изучаемых потивирусов иммунохимическими методами.

Хотя чувствительность РДД невелика - 0,1 мг/мл, главное ее достоинство - специфичность, что позволяет применять эту реакцию при определении антигенного родства фитовирусов.

Полученные нами данные в РДД свидетельствуют о том, что АВК, ВЖМФ и УВК имеют идентичные группоспецифичные эпитопы (рис. 8).

Рис. 8. Определение антигенного родства потивирусов в РДД. В центральной лунке - препарат УВК (1 мг/мл), в периферических -антисыворотки: 1 - АВК, 2 ВЖМФ, 3 - УВК, 4 - ВЖКЛ, 5 -ВМТ, б - ВТБ.

При определении антигенного родства ВМГ с исследуемыми потиви-русами было показано, что вирус реагирует с антителами к УВК, ВЖМФ, ВЖКЛ и ВМТ. ВЖМФ взаимодействовал с антисыворотками к УВК и ВМС.

В литературе приводятся немногочисленные данные о попытках показать антигенное родство потивирусов с помощью РДД (Bartels, 1964; Fribourg, Loeten, 1970; Delgado-Sanchez, Grogan,1970; Maat, Mierzwa, 1974).

Более веские доказательства антигенного родства исследуемых вирусов нам удалось получить с помощью РИЭФ. Соотношение величин ракет позволило оценить степень антигенных взаимоотношений. Разведение сывороток для каждого вируса, подобранное экспериментально, составило для УВК, АВК, ВТБ - 1:30, ВЖМФ - 1:40, ВЖКЛ - 1:25-1:30, ВМТ - 1:25, ВМС - 1:20. Данные по антигенному родству потивирусов в РИЭФ представлены в табл. 3 и на рис. 9.

Табл. 3

Степень антигенного родства потивирусов, выявленная ракетным иммуноэлектрофорезом (%%)

Система Антигены

УВК АВК ВЖМФ ВЖКЛ ВМС ВМТ ВТБ

УВК 100 17 40, 5 50 11 11 10

АВК 44 100 57 80 13 50 11

ВЖМФ 45 62 ,5 100 49 39 45 45

ВЖКЛ 22 25 50 100 17 22,5 23

ВМС 50 11 50 25 100 33 , 3 33 , 3

ВМТ 45 62 55 83 37 100 60

ВТБ 16,6 14,2 33, 3 30 14 , 2 13 100

Рис. 9. Выявление антигенных взаимоотношений потиви-русов РИЭФ. В геле антисыворотка к АВК, в лунках -препараты : 1 - ВМС, 2 ВЖМФ, 3 - ВЖКЛ, 4 - УВК, 5 - ВМТ, 6 - ВТБ, 7 -АВК, к -сок здорового растения.

Нами показано, что ВЖМФ и ВЖКЛ наиболее близки по антигенным свойствам. Типовой представитель потивирусов УВК, а также АВК занимают промежуточное положение. Для ВТБ, ВМТ и ВМС характерно еще более отдаленное антигенное родство с исследуемыми вирусами. Как показали наши расчеты, наибольший процент идентичных эпитопов со всеми исследуемыми вирусами отмечен у ВЖКЛ (от 83% с ВМТ до 25% с ВМС); наименьший для ВМС (от 39% с ВЖМФ до 11% с УВК), для остальных вирусов от 10 до 60% (например, для ВЖКЛ от 57% с АВК до 3 3,3% с ВТБ). Подобных данных по выявлению идентичных эпитопов у потивирусов с помощью РИЭФ в литературе нет, хотя имеются сообщения об установлении антигенного родства этим методом между фитовирусами других таксономических групп (Ке1сЬепЬасЬег et а1., 1979; Гнутова и др., 1980; Гнутова и,др., 1985; Сибирякова и др., 1987).

При подборе условий для определения антигенного родства потивирусов непрямым методом ИФА установлено, что оптимальная концентрация сорбции антигенов на первом этапе составляет 2-5 мкг/мл, начальная концентрация - 50 мкг/мл. Перекрестные реакции свидетельствовали о наличии общих эпитопов. По расположению кривых титрования в гомологичных и гетерологичных системах определено антигенное родство исследуемых вирусов в системах УВК и ВМТ (рис. 10).

Анализируя порядок расположения кривых, можно констатировать, что в системе ВМТ наиболее близкородственными этому вирусу являются ВМГ, АВК и УВК. Промежуточное положение занимает ВЖКЛ, а отдаленное родство показано для ВМС и ВЖМФ. В системе УВК наиболее близкородственны - ВМТ, АВК, ВЖКЛ. Небольшой процент идентичных эпитопов обнаружен для ВТБ, ВЖМФ и ВМС. Для ВМГ в этой системе идентичных эпитопов не отмечено.

f«»1

С tkjGn^fc.

Рис. 10. Определение антигенных взаимоотношений потивирусов непрямым вариантом ИФА. Система ВМТ: 1-ВМТ, 2-ВЖКЛ, 3-ВМГ, 4-АВК, 5-ВМС, 6-УВК, 7-ВЖМФ, 8-ВТМ.

Аналогичные исследования для потивирусов отечественными фитови-русологами не проводились. Имеются немногочисленные данные зарубежных исследователей по изучению родственных взаимоотношений австралийских и северно-американских изолятов желтой мозаики фасоли и четырех штаммов вируса желтой мозаики цуккини непрямым методом ИФА (Barnett et al., 1987; Wang et al., 1992).

Непрямой метод ИФА дает только информацию, а не количественную оценку антигенных взаимоотношений фитовирусов. Поэтому мы и применили модификацию конкурентного варианта ИФА для исследования антигенных взаимоотношений и определения степени родства исследуемых вирусов.

При подборе условий для проведения конкурентного варианта ИФА установлено, что минимальная концентрация антигенов, используемая для сорбции - 1 нг/мл, рабочее разведение антисыворотки - 1:500, концентрация IgG - 10 мкг/мл.

Для этапа конкуренции и установления в системе равновесия достаточно 3,5-4 ч инкубации ингредиентов при 37°С. Экспериментально было показано, что оптимальными условиями для этапа конкуренции является использование 50 мкл конкурентного антигена и 150 мкл сыворотки, гомологичной сорбированному антигену, а также проведение реакции при постоянном встряхивании. Предварительно подобранные условия проведения реакции конкурентного варианта ИФА позволили

провести сравнительное исследование потивирусов в гомологичных и гетерологичных системах. Антигены для конкуренции использовали в диапазоне концентраций 1-10 нг/мл.

В результате были получены кривые ингибирования или конкуренции (рис. 11), построенные в координатах У = В/В0х100, х=ЬдС, где В - экстинкции, полученные в лунках, где присутствует конкурентный антиген, В0- экстинкции, полученные в лунках, где отсутствует конкурент (вместо раствора конкурентного антигена вносили 50 мкл буфера) , ЬдС - Ьд концентрации конкурентного антигена.

ыак

ВЖМФ

ишимо)м0йшш111и и и Ц0ММ1Г«|Ови}111311

юоя <»САг «5.ав* ЧСАг

«•о*

а» оз алм аэ в*ат ов в® 1л»на I >

»01» ¿«САГ

Рис. 11. Кривые конкуренции (система УВК). а - УВК, б - ВЖМФ, в -ВЖКЛ, г - ВМС.

Степень родства между антигенами оценивали по концентрациям при 50%-ном ингибировании реакции сорбированного антигена с гомологичной антисывороткой и рассчитывали по формуле: % родства = ЬдС, /ЬдСг х 100, где

ЬдС] - Ьд концентрации гомологичного конкурентного антигена при

50%-ном ингибировании; ЬдС2 - Ьд концентрации гетерологичного конкурентного антигена

при 50%-ном ингибировании; Итак, степень родства потивирусов, определенная конкурентным вариантом ИФА в системе УВК показала, что наиболее близкородственными УВК являются ВЖМФ и ВЖКЛ (50-70% родства). Для АВК, ВМТ, ВТБ, ВМГ характерна слабая степень родства (10-15%). ВМС занимает промежуточное положение - до 35% родства.

Таким образом, РДД, РИЭФ, непрямым и конкурентным методами ИФА

показано, что УВК, АВК, ВЖМФ, ВМС, ВМТ, ВЖКЛ, ВТБ и ВМГ имеют идентичные группоспецифичные эпитопы. Конкурентным вариантом ИФА и РИЭФ определена степень этого родства.

Анализ полученных результатов исследования физико-химических свойств изучаемых дальневосточных изолятов вирусов и их сравнительной антигенной характеристики, а также литературных данных, подтверждает принадлежность ранее неизученных патогенов: ВТБ, ВМТ (изолят из лобы), ВЖКЛ, ВЖМФ (изолят из гладиолуса) к группе Ро1у-

ВЫВОДЫ

1. Разработаны оптимальные методики выделения очищенных препаратов потивирусов, идентифицированных на Дальнем Востоке: У- и А-вирусов картофеля, желтой мозаики фасоли, мозаики сои, желтой карликовости лука, мозаики турнепса и вируса традесканции белоцвет-ковой. Для вируса мозаики сои, который выделяется в минимальных количествах, удалось повысить выход при очистке, применяя каллус сои с добавками стероидных гликозидов (томатозид, ланогитозид).

2. Получены кроличьи, мышиные поликлональные антитела и куриные иммуноглобулины к исследуемым вирусам на основе разработанных нами схем иммунизации для потивирусов. Специфические антитела к вирусу традесканции белоцветковой, желтой карликовости лука, мозаики турнепса (изолят из лобы), желтой мозаики фасоли (изолят из гладиолуса) получены впервые.

3. Определено наличие идентичных группоспецифичных эпитопов у изучаемых потивирусов иммунохимическиии методами (РИЭФ, варианты ИФА). Наиболее близкородственными типовому представителю УВК являются ВЖМФ и ВЖКЛ (50-70% родства). Для АВК, ВМТ, ВТБ, ВМГ характерна слабая степень родства (10-15%). ВМС занимает промежуточное положение - до 3 5% родства.

4. Для усовершенствования детекции потивирусов разработан ДАСМ ИФА с использованием первичных антител - мышиных и куриных иммуноглобулинов. Для ВМС и ВЖКЛ использовали также и Г(аЬ')2"фрагменты кроличьих 1дС.

5. Разработаны иммунодиагностикумы на основе - непрямого, "сэндвич" и ДАСМ методов ИФА для массовой экспресс-иммунодиагностики потивирусов с целью отбора свободного от вирусов селекционного и семенного материала.

Основное содержание диссертации отражено в следующих работах:

1. Gnutova R.V., Sibiryakova I.I., Kakareka N.N., Rybleva N.V., Korzh V.G., Kozlovskaya Z.N., Tolkach V.F. Immunological characteristics of potex-, poty- and carlaviruses//Abst. VII-th International Congress of Virology. Edmonton Alberta Canada. 1987. P. 1134.

2. Гнутова P.В., Какарека H.H., Толкач В.Ф., Чуян А.Х., Сибиря-кова И.И., Рублева Н.В., Крылов А.В. Биологическая и серологическая характеристика вируса желтой карликовости лука //Докл. ВАСХ-НИЛ. 1988. N 11. С. 20-23.

3. Гнутова Р.В., Какарека Н.Н., Толкач В.Ф., Чуян А.Х., Сибиря-кова И.И., Рублева Н.В., Крылов А.В. Некоторые свойства вируса желтой иозаики фасоли, идентифицированного на юге Дальнего Восто-ка//Вестник АН СССР, серия биол. 1989. N 3. С. 442-449.

4. Rubleva N.V., Gnutova R.V., Kakareka N.N. The ummunoelectron microscopy for identification of serological relationships of four potyviruses//Abst. X-th Conference of Czechoslovak plant virologists. 1989. Prague-Suchdol. P.168.

5. Gnutova R.V., Sibiryakova 1.1., Kakareka N.N., Rubleva N.V., Korzh V.G., Kozlovskaya Z.N. Approaches to elucidation of common and individual antigenic determinants in viruses of the potygro-up//Ibid. P. 84.

6. Kakareka N.N., Gnutova R.V.., Sibiryakova I.I., Busse T.I. Use of modification of double antibody "sandwich" method of ELISA for diagnostics of onion yellow dwarf virus and soybean mosaic vi-rus//Ibid. P. 104

7. Gnutova R.V., Sibiryakova I.I., Korzh V.G., Kakareka N.N., Rubleva N.V., Kozlovskaya Z.N. Antigenic characteristics of potato A and Y//Ibid. P. 86.

8. Gnutova R.V.., Sibiryakova I.I., Kakareka N.N., Tolkach V.F., Rubleva N.V., Korzh V.G., Kozlovskaya Z.N. Elucidation of common and individual antigenic determinants of potyviruses of various immunochemical methods//Abst. Symposium "Recent Results in Plant Virology", 1989. Eberswalde. DDR. P. 24-25.

9. Гнутова P.В., Какарека H.H., Сибирякова И.И., Толкач В.Ф., Рублева Н.В., Козловская З.Н., Корж В.Г. Подходы к выявлению общих и индивидуальных антигенных детерминант потивирусов, идентифицированных на Дальнем Востоке//Биол. науки. 1989. N 10. С. 20-26.

10. Гнутова Р.В.., Какарека Н.Н., Сибирякова И.И., Рублева Н.В.

« •

Иммунохимические свойства капсидных белков потивирусов//Тезисы Всесоюз. конф. "Микробиол. и биотехнол. основы интенсификации рас-тениев. и кормопроизв.". Алма-Ата. 1990. С.16.

11. Какарека H.H., Сибирякова И.П., Гнутова Р.В. Диагностика вирусов мозаики сои и желтой карликовости лука иммуноферментным методом с использованием F(ab')2-фрагментов.//Там же С. 36.

12. Какарека H.H., Гнутова Р.В., Сибирякова И.И. Разработка им-мунодиагностикумов против вирусных болезней сои//Научно-техн. бол. СО ВАСХНИЛ. Новосибирск. 1990. Вып. 4. С. 20-26.

13. Какарека H.H., Гнутова Р.В., Сибирякова И.И., Буссе Т.И. Диагностика вирусов мозаики сои и желтой карликовости лука иммуноферментным анализом с использованием F( ab ' )2-фрагментов//Докл. ВАСХНИЛ. 1991. N 5. С. 26-29.

14. Горбунова Н.И., Лялько Р.В., Гнутова Р.В., Какарека H.H. Иммунодиагностика вируса мозаики сои в растениях и семенах сои (методические рекомендации)//Владивосток: ДВО АН СССР. 1991. 15 с.

15. Какарека H.H., Курика A.B. Сравнительное иммунохимическое изучение потивирусов различными вариантами иммуноферментного ана-лиэа//Тезисы 9-го Всесоюз. совещ. по иммунитету с/х культур к болезням и вредителям. Минск. 1991. С.185-186.

16. Моисеенко Л.И., Какарека H.H., Сибирякова И.И., Гнутова Р.В. Некоторые физико-химические и антигенные свойства вируса мозаики турнепса (дальневосточный изолят)//Докл. ВАСХНИЛ. 1991. N 11. С. 44-43.

17. Гнутова Р.В., Какарека H.H., Сибирякова И.И., Харитоненков И.Г. Антигенные свойства потивирусов, идентифицированных на Дальнем Востоке//Докл. ВАСХНИЛ. 1992. N 7. С. 16-20.

18. Гнутова Р.В., Какарека H.H., Самсонова С.И. Влияние глико-эидов на размножение вируса мозаики сои в каллусе//Тезисы Всесоюз. совещ. "Биология клеток в культуре". С.-Петербург. 1992. С 35.

19. Самсонова С.И., Какарека H.H., Сибирякова И.И., Гнутова Р.В. Антигенная характеристика капсидных белков вирусов мозаики сои и желтой мозаики фасоли//Матер. юбилейной научн. конфер. Рос-тов-на Дону. 1992. С. 90-91.

20. Волков Ю.Г., Сибирякова И.И., Какарека H.H., Гнутова Р.В. Иммунодиагностика вирусов, поражающих бобовые культуры на Дальнем Востоке//Там же, С.62-63

21. Моисеенко Л.И., Какарека H.H., Сибирякова И.И., Гнутова Р.В. Некоторые физико-химические и антигенные свойства вируса мозаики

*

»

турнепса (дальневосточный изолят)//Там же, С.94-95.

22. Какарека H.H., Самсонова С.И., Гнутова Р.В. Стимулирующее действие гликозидов на концентрацию вируса мозаики сои в каллусе// В кн: "Фитовирусы Дальнего Востока". Владивосток. Дальнаука: 1993. С. 104- 113.

23. Рублева Н.В., Какарека H.H., Гнутова Р.В. Иммунная электронная микроскопия группы potyvirus//TaM же, С. 150-156.

24. Волков Ю.Г., Толкач В.Ф., Моисеенко Л.И., Какарека H.H., Сибирякова И.И., Гнутова Р.В. Вирус мозаики клевера горного - новый патоген из группы P0tyvirus//MHKp06H0fl0r. журнал. Киев, 1994, 56. N 6. С.30-35.