Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика отдельных представителей потивирусов и методы их индикации

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика отдельных представителей потивирусов и методы их индикации"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УССР

КИЕЕСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ им. Л.В•ГРОМАШЕВСКОГО

На правах рукописи

МОЛЧАНЩ Оксана Витальевна

X АР АКТЕР ИСТЖА ОТДЕЛЫШХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ' ПОТИВИРУСОВ И МЕТОДЦ ИХ ИНДИКАЦИИ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических ¡.лук

Киев -

1991

Работа выполнена на ка4>едре вирусологии Киевского ордена Ленина и ордена Октябрьской Революции государственного университета ям. Т.Г. Шевченко

Научней руководитель: член-корреспондент ijUH, доктор апологических наук, профессор А.Л. Ьойко

0|ицкальние оппоненти: доктор бяологячесгях .наук Н.С. Дячеико кандидат бвологичесгдх наук ЮЛ. Радавокий

Ведущее учреждение - Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР

Закдата диссертации состоится ^дщ г>

в " часов на заседании специализированного совета Д-0830402 при Киеве ком научно-иселсдочательском институте эпидемиологии к инфекцчошгах болезней им. Л.В. Громажевского /252015, г.Киев, ул. Январского восстания, 23/

■ ■ С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Киевского нау чн о-и сс л е доелт ель с ко г о института эпидемиологии в внфекцяонншс болезней ии. Л.В. Громашееского /252038, -г. Киез,'спуск Степана Разина, 4/

Автореферат разослан " " ¿^.-teyu^ 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор ыедагдансивх наук

Л.Д. вовк

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Проблема вирусных поражений растений в последние годи привлекает все большее внимание исследователей в связи с тем огромным уроном, который они наносят сельскому хозяйству. Снижение урожая и ухудшение его качества определяют настоятельную необходимость изучения болезней растений.

Среди фитовирусов, вызывающих большую часть болезней растений, значительное место занимают потивирусы, которые поражают широкий круг растений, в том числе зернобобовые культуры, включая многие сорта кормового люпина. Эта культура выращивается почти на всей территории Украины, отличается высокой урожайностью на обедненных песчаных и супесчаных почвах с повышенной кислотностью. Зеленая масса люпина богата белками, содержит полный набор аминокислот. Кроме того, люпин представляет собой мощный фактор накопления биологического азота в почве, что делает его уникальной агротехнической культурой, повышающей естественным путем плодородие почв / Довбан, 1987 /.

Исследованиями, проведенными в Квропе, Америке, Австралии, установлено, что наиболее распространенной болезнью люпина является узколистность, вызванная одним из представителей потивиру-сов - вирусом желтой мозаики фасоли / ВНМФ /.Известны и другие вирусы, способные поражать люпин, однако их вредоносность несколько ниже / Якушева, Шмидт, 19Ьэ /.

Как показали исследования отечественных ученых / Краев, 1966; Сергеенко, 1982; Ровков,1989 /, пораженкость люпина вирусом желтой мозаики фасоли на территории Украины в отдельные годы составляла 80-100%, при этом потери урожая зерна к зелен й массы достигали 95%.

Несмотря на то, что возбудитель узколистности люпина известен, глубокий всесторонний анализ его популяции до настоящего времени не проводился, не выяснена степень пораженнооти семян, одного из основных источников инфекции на посевах, что затрудняет осуществление контроля за распространением йЖМФ; не разработаны эффективные мет-ды экспресс-диагностики инфекции, которые можно было, бы применить в семеноводческих опытных станциях, а также при .селекции вирусоустойчивых сортов.

Сказанное определяет актуальность глубокого изучения природы возбудителя узколистности люпина, особенностей штаммов, состав-

лякхцих его популяцию, что представляет интерес в общебиологическом плане и имеет прикладное значение для создания современных методов выявления ВШФ. Последнее, по пашем/ мнению, необходимо для разработки системы мероприятий по борьбе с вирусной болезнью люпина и служит существенным этапом в успешном решении важной народнохозяйственной задачи по обеспечению животноводства полноценной кормовой базой.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучить распространенность узколистности люпина на территории Украинского Полесья, природу его возбудителя и разработать методы иммунодиагностики, пригодные для скрининга виру соносительства в семенном материале.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- изучить степень пораженности широко районированных сортов люпина ряда областей республики возбудителем узколистности и идентифицировать его;

- отработать методы выделения, очистки и концентрации вируса;

- изучить биологические и физико-химические свойства иэоля-тов вьщеленного вируса;

- получить высокоспецифичные иммунные препараты для экспресс-диагностики вирусной инфекции люпина;

- разработать методы выявления вирусоносительства в семенном материале люпина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ:

На территории Украины из растений люпина впервые ввделены и изучены два штамма вируса желтой мозаики фасоли. На основании сравнительного анализа биологических и физико-химических свойств установлены различия между исследуемыми штаммами и штаммами ВЖМФ, описанными в литературе. Впервые обнаружено, что вирионы одного из штаммов отличаются по характеру поражений на растениях-индикаторах, содержанию аминокислот, молекулярной массе белка и по некоторым другим физическим параметрам, что позволило отнести его к оригинальному штамму.

Доказано влияние вирусной инфекции на рост и развитие клубеньков ляпина, что может свидетельствовать о снижении способности больных растений связывать азот воздуха.

Впервые для выявления семенной инфекции люпина применен имму-ноферментный анализ, который позволил определить степень вирусоно-

сительства в семенном материале.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ работы определяется тем, что выделенный нами оригинальный штамм ШНМФ может быть использован для диагностики вирусной инфекции зернобобовых культур, поскольку свойственная ему высокая антигенная активность позволяет получать высокоспецифичные иммунные сыворотки.

Разработан оптимально щадящий метод вьщеления и очистки поти-вирусов, применение которого дает возможность сохранить целостную структуру вирионов. Усовершенствован иммуноферментный анализ путем применения нитроцеллюлозных фильтров для скрининговых исследований распространенности инфекции и пораженности семян.

Нами разработана методика получения иммунных поликлональных сывороток к ВЖМФ, которая как и сами сыворотки используются в селекционной и практической работе Украинского института земледелия ' ЮО ВАСХНШ1, а также Института экспериментальной биологии им.Хо Ши Мина /СРВ, акт о.внедрении от 1963г./.

Результаты исследований, составляющих предмет диссертационной -работы, включены в Методические указания к практическим занятиям по вирусологии / Киев, 1988 /, вошли в Методические рекомендации по научным основам борьбы с вирусной инфекцией люпина / Москва, 1990 /.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОБСУВДЕНЦ на конференциях молодых ученых биологического факультета Киевского госуниверситета / 1986, 1987 /', научно-практической конференции "Вирусология -народному хозяйству" / Киев, 1987 /, международной конференции по вопросам возделывания люпина /Познань, 1988 /, конференции по генетическим аспектам проблемы "Человек и Биосфера" / Киев, 1988/ на УП съезде Украинского микробиологического общества / Черновцы, 1989/.

На публичную защиту выносятся следующие ПОЛОЖЕНИЯ:

1. Узколистность люпина на Украине вызвана двумя штаммами вируса желтой мозаики фасоли, относящегося к потивирусам;

2. Один из выделенных изолятов вируса представляет собой оригинальный штамм ЕШФ, отличающийся по характеру поражений на растениях-индикаторах, молекулярной массе белка, содержанию аминокислот, интерферирующей активности; другой изолят - подобен

типичному штамму ВЖМФ.

3. Отработан и модифицирован метод выделения и очистки ШШ, сохраняющий целостность вирионов, что необходимо при изучении некоторых аспектов структуры вирусов.

4. Иммуноферментный анализ на нифроцеллюлозных фильтрах может быть использован для скрининга семян на вирусоносительство с целью создания генофонда, свободного от вирусов растений.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 128 страницах машинописи, иллюстрирована 16 таблицами и 24 рисунками. Состоит из введения, 2 глав обзора литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Указатель литературы содержит 1б2 источников из них74 отечественных и 88 иностранных авторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Материал и методы. В работе использованы растения люпина из селекционных и семеноводческих опытных станций пяти областей Украинского Полесья в период I9B3-I989 гг. Из растений с ярко выраженными симптомами мозаики и деформации листьев выделяли вирус, накопление его проводили в условиях теплиц на культурах гороха ■( Piaum sativum ) и мари гигантской (Chenopodium amaranticolor).

На основании известных способов выделения и очистки некоторых нитевидных вирусов / Новиков, 1982;Huttinga j 1974; Sako,I980/ нами модифицирована методика получения препаратов ВАМ, оптимально щадацая структуру вириона.

Критерием оценки чистоты и целостности вирусных препаратов служили- электронноиикроскопические / JEOL-IOO В / и спектральные . / СФ-26 / характеристики, результаты электрофореза в ПААГ /Ьаеш-mll,I970 / и иммунологических тестов. Расчет размеров вириона вели на анализаторе субмикронных частиц фирмы "Malvern" ./.

Кроличью антисыворотку к штаммам ВЖМФ получали методом чередования внутривенных и внутримышечных инъекций 12-15 мг вирусного антигена, который вводили с полным или неполным адъювантом Фрейнда по разработанной нами схеме. Титры антител определяли с помощью капельной агглютинации на стекле и иммуноферментным анализом /ИФА/ на нитрсцеллюлозных фильтрах / Фролов с соавт.,1985/.

Содержание аминокислот капсидного белка определяли при использовании анализатора. LC-5000, фирмы "Biotronic"/ ФРГ /.

Физические свойства штаммов ВШ£ в соке растений - точку температурной инактивации / 1ТИ /, предельное разведение в соке / I1PC / и выстаивание in vitro - изучали общепринятыми ме-

тодами .

Оедиментационный анализ вирусов проводили в аналитической центрифуге M0M-3I80 / ВНР / с применением адсорбционной ширен-оптики. Значение коэффициента седиментации определяли по Шпиките-ру /1964 /.

Значение показателя плавучей плотности вирусов получали путем центрифугирования очищенных препаратов в линейном градиенте плотности CaCI / Beckman LG-50, ротор sw -40, 100 ООО g - 16 час/.

Для выявления вирусоносительства в семенах люпина были исследованы 6482 образца 16 сортов кормового люпина /любезно предоставлены доктором сельскохозяйственных наук В.Й.Головченко.УНИИ земледелия /. Определение вирусного антигена в семенах проводили методом ИМ на нитроцеллюлозных фильтрах, а также с помощью биологического тестирования, используя иммунную поликлональную сыворотку, полученную по нашей модификации.

Характеристика биологических, антигенных свойств и морфологии возбудителя .узколистности люпина.

При обследовании селекционных и семеноводческих посевов опытных станций Киевской, Житомирской, Львовской, Волынск..й и Черниговской областей установлена высокая степень поражений полей люпина узколистностью, которая в отдельные годы колебалась от 6 до 100%. Снижение урожайности зеленой массы и семян люьина сопровождалось достоверным уменьшением количества азотфиксирующих клубеньков с 32,4*2,40 У здоровых особей до I5,2±I,5I у больных.

Симптомы узколистности кормового люпина выражались мозаикой и деформацией листьев, пустыми цветоносами, чрезмерным развитием боковых побегов, в результате чего растения приобретали вид "метельчатости". Зеленая масса таких больных растений использовалась для выделе: ш возбудителя узколистности и последующей его идентификации.

Первичную дифференциацию выделенных изолятов проводили в опытах на растениях-индикаторах, для чего использовали II видов, относящихся к 4 семействам. Появление специфических поражений на

ceM.beguminaceae при отсутствии п:чэнаков инфекции у растений ceM.Solanaceae и Cucurbitaceae указывало на возможную принадлежность выделенных иэолятов к потивирусам, в частности к вирусу желтой мозаики фасоли. Подтверждением этого бьш характер проявления инфекции на некоторых сортах фасоли ( Bountiful, Saxa, Top-crop ), которые являются индикаторами инфицирования ВЖМФ и исключают присутствие в инокуляте других вирусов, способных поражать люпин /вирус огуречной мозаики, вирус обыкновенной мозаики фасоли, вирус обыкновенной мозаики гороха идр./. Последние не поражают указанные сорта фасоли к имеют сбой круг чувствительных растений-индикаторов.

Доказательством принадлежности вируса, выделенного из растений с симптомами узколистности, к группе потивирусов были результаты электронномикроскопических исследований, согласно которым обнаруженные вирусные частицы имели нитевидную форму и длину 750780 нм, что соответствует параметрам указанной группы вирусов, и в частности-ВЖМФ.

С целью идентификации гьделенных вирусов были проведены серологические исследования с сыворотками к У-вирусу картофеля,типичному представителю потивирусов, вирусу огуречной мозаики, часто поражающему люпин, и ЫКМФ. Положительные результаты получены только с сывороткой к ШМФ в реакции капельной агглютинации /в титре 1:128 / и методом ИФА /1:1<1б0/, что дало основание считать выделенные изоляты вирусом желтой мозаики фасоли.

Сравнительное изучение методов вьщеления и очистки вируса желтой мозаики фасоли.

Изучение структурных и функциональных особенностей возбудителя инфекций требует получения больших количеств достаточно очи -(ценного препарата вируса. В данном случае трудность заключалась в том, что потивирусы отличаются высокой ломкостью частиц и при использовании общепринятых методов выделения и очистки вирусных препаратов получить полноценные вирионы не удается. В связи с этим возникла необходимость отработать щадящий метод выделения и очистки ШМФ, который бы позволил максимально сохранить целостную структуру вирионов.

С этой целью для выделения вируса использовали три различных способа и сравнили их результативность:'

1. Гомогенизация растительного материала в 0,1 М трис-тиогли-колеваом буфере, рН 9,0, осветление смесью хлороформа и четырех-хлористого углерода / 1:1 /, концентрирование 6% ПЭГ и 2% раствором хлорида натрия с последующим циклом дифференциального центрифугирования / 90 ОООй - 90мин, 8 00(^ - 15мин/.

2. Гомогенизация материала проводилась в 0,3 М натрий-фосфатном растворе рН 9,0, содержащем 0,1% тиогликолевой кислоты, 0,1% МЭ, осветление 15% раствором СС14, добавление тритона Х-100 и последующим дифференциальным центрифугированием в режиме, указанном в п.1,

3. Гомогенизация материала в 0,3 М глициновом буфере, рН 8,0, содержащем 0,1% МЭ. Концентрирование проводили осаждением в изо-электричесной точке / рН 7,5 /, а затем 6% ПЭГ с добавлением 0,25 М хлорида натрия и 0,5% тритона Х-100, после чего препарат подвергали ультрацентрифугированию.

Сравнительная характеристика препаратов вирусов, полученных с помощью описанных трех методов, представлена на табл.1.

Таблица I

Эффективность методов выделения и очистки ВМФ

Метод очистки

Титры вируса в Соотноше- Выход вируса, ИФА с гомологич- ние мг/мл

ной антисыв-кой А3(-п/9яп

1260/280

0,1 М трис-тио-гликолевый буфер, 1:160 6% ПЭГ

1,00

4,6

0,3 М Иа-фосфат-ный р-р.15% СС14 1:1280

тритон Х-100

1,21

28,0

0,3 М глициновый буфер,осаждение в 1:320 изээлектр.точке,6%

1,31

4,5

ПЭГ

Электронномикроскопические исследования и данйые анализатора субмикронных частиц "Malvern " позволили расчитать модальную длину вирионов, содержащихся во всех трех препаратах. Как оказалось только в препарате вируса, очищенного вторым способом,присутствуют вирионы соответствующие стандартной длине БШФ /750-780 нм/ (рис.1). В остальных двух препаратах, полученных с применением ПЭГ, отмечалось большое число поломок, что свидетельствовало о деструктивном действии реагента и требовало его исключения из процесса очистки и концентрации вируса.

Эффентивность второго метода вццеления и очистки вируса продемонстрировали также кривые спектра поглощения УФ-лучей, типичные для потивирусов: ¿260/280 ~ 1»2П Amàx - 260 нм, A '246-247нм.

Таким образом, характеристика вируссодержащего материала, выделенного с использованием 0,3 M Иа-фосфатного буфера, 15% CCI^ и тритона Х-100, указала на его чистоту и соответствие стандартным параметрам ВШ6. Очищенный и сконцентрированный таким способом вирусный препарат был пригоден для изучения структуры вириона, а также использования в качестве тест-антигена в иммунохимических исследованиях.

Структурные и функциональные особенности штаммов Ш№, выделенных на Украине

Изучение биологических свойств выделенных изолятов обнаружило различия в проявлении инфекции на растениях-индикаторах, по которым их можно было разделить на две группы: изоляты I группы на растениях фасоли сортов Bountiful , Торсгор, Saxa вызывали четкую системную реакцию с ярко выраженной крапчатостью, II группы - слабую мозаичную реакцию; растения сорта Lunatus на инокуляцию изолятами I группы не реагировали, тогда как введе-дение вирусов II группы вызывало системную крапчатость. Различия в характере поражений наблюдались и на других растениях-индикаторах. Наиболее выражены они были при инокуляции растений Vicia fa-ba.Chenopodium amaranticolor ; в случае заражения последних изолятами I группы симптомы инфекции в виде четкой некротической реакции появлялись на 4-6 день, в то время как изоляты II группы вызывали системную мозаику на 8-12 день после инокуляции.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение биологических, структурных и. функциональных особенностей изолятов,обеих-групп, условно обозначенных как B-I - вызывающий местные пораже-

20

гоо 300 «О 100 4.00 МО Ш Ч«о Рим II

Рис.1. Диаграмма распределения размеров вирионов НШФ: в -выделение вируса с применением ПЭГ о -Еыделение вируса без применения ПЭГ

Рис.2. Плавучая плотность штаммов ВШБ:

По оси абсцисс-иомвра фракций, ординат-левая-олтическая плотность; -правая-ялогяость раствора С5С1

1- кривая оптической плотности В—I;

2- кривая оптической плотности В-2.

ния и В-2 - системную мозаику.

Изоляты В-1 и В-2 характеризовались разными показателями точки температурной инактивации / В-1: 60-65°С; В-2: 55~60°С /, предельного разведения в соке / 1:2000 и 1:800; соответственно /, что указывало на большую термолабильность В-2 и его меньшее' содержание в соке больного растения. В то же время изолят В-2 оказался более устойчивым к хранению при комнатной температуре / В-1 - 48 ч; В-2 - 72 ч, табл.2 /.

Изучение свойств выделенных изолятов было проложено в опытах по исследованию их интерферирующей активности. При заражении растений СЬ.атагап-Ысо1ог последовательно В-1, а затем В-2, первый в 56,7% случаев подавлял развитие симптомов второго, при обратной очередности В-2 в 100% случаев угнетал развитие В-1 инфекции. Обнаруженная способность В-1 и В-2 интерферировать подчеркивает принадлежность обоих изолятов к одной группе вирусов, а разница в степени угнетения друг друга указывает на то, что это близкородственные штаммы одного вируса (Воэ , 1960).

При электронномикроскопическом исследовании препаратов вирусов В-1 и В-2 было установлено,что их' модальные размеры укладывались в пределы, которыми характеризуются различные штаммы ВШФ, при этом вирионы В-1 имели длину 750-770 нм, а В-2 - 760-780 нм, диаметр частиц у обоих вирусов был равен 12-13 нм.

Оба изолята седиментировали в одной зоне, коэффициент седиментации был равен 142 б , плавучая нлотность в растворе хлористого цезия составляла 1,31 г/см3 (рис.2).

Электрофоретическое разделение капсидного белка в ПААГ выявило у обоих- изолятов по два белковых компонента с различной электро-форетической подвижностью. Белки В-1 мигрировали с меньшей скоростью, их молекулярная масса составляла 36,2 ± 0,6 и 30,4 + 0,5 кД. Скорость миграции белковых компонентов В-2 была большей, соответственно их молекулярная масса равнялась 35,4 * 0,8 и 28,5 11 0,1 кД. . (рис.З). Изучение природы минорных компонентов показало зависимость их появления от времени хранения вируссодержащих препаратов. На электрофореграммах белка, полученных непосредственно после выделения и очистки материала; располагалось по одной полосе, соответствующей мажорному белку. По-видимому, появление двух полос явилось результатом протеолитического гидролиза капсидного белка

Таблица 2

Сравнительная характеристика штаммов ВШФ, вьделенчых на Украине

Свойства

B-I

В-2

Симптомы на Ph.vulgaris

Ch.amaranticolor

Интерференция

ТТИ

Предельное разведение в соке

Выстаивание in vitro

Длина частиц

Коэффициент седиментации

Плавучая плотность Молекулярная масса

ярко выраженная слабая моэа-мозаика и крапча- ика тость n местная реакция системная

56,7% 60-65°

1:2000 48 ч

750-770нм

142 S 1,31г/см3

36,2 кД.

100%

55-60°

1:800 72 ч

760-780нм 1423

1,31г/см3 35,4 кД

ВЖМФ-

умеренная мозаика

системная не опред. 55-60?

1:2000 48 ч

750-780нм

143 3 . 1,318г/смэ

34-35 кД

Примечание : ВШФХ/' - совокупность данных по штаммам вируса, представленные АмбросовыМ (1985),Варатовой (1972), Huttihga (1974), Handlea .(1980), Barnett (19£У?).

и свидетельствовало о композиционной нестабильности белка оболочки потивирусов, что подтверждает предположение, высказанное Hie -bert (1984).

Продолжая изучение белка оболочки, мы провели исследование аминокислотного состава, На рис.4 представлено процентное содержание аминокислот изолятов B-I и В-2 в сравнении с данными, приведенными для штаммов ВИМФ, выделенными из различных культур. Результаты анализа показали, что B-I и В-2 по содержанию 6 аминокислот / аланин.валин, изолейцин, лизин,треонин, фенилаланин/ мало отличаются от ВШФ. Различия в процентном содержании 8 других аминокислот более значимы, при этом существенны они у B-I, где количество глицина, глутаыиновой кислоты и серина превышало групповые значения для'ВЖЬ®. Кроме того,в составе капсидного белка Б-1 обнаружен орнитин, которого нет ни у ВШ&, ни у В-2, в то время да;: у B-I нет лейцина, присутствующего в довольно, умеренном количестве у других штаммов.' Вместе с тем, об аминокислотном составе капсидного белка ВШ$, поражающего люпин, в доступной литературе сведений нет, поэтому полученные нами результаты сопоставляли с содержанием аминокислот штаммов, поражающих другие культуры. ^ Мы склонны считать,что отклонения в аминокислотном составе, наблюдаемые, у изолята B-I, в определенной мере объясняют фенотипи-ческие отличия вируса и дают основания рассматривать его как оригинальный штамм / люгшновый /, который как и австралийский А -BYMV ( Barnett , 1987) можно считать "отдаленно-родственны/," в группе ВШБ. •

Исходя из обобщенных данных, полученных при сравнительном изу-~ чении двух изолятов возбудителя узколистности люпина, можно сделать вывод о том, что в популяции содержалось два штамма, один из которых - B-I по совокупности биологичейких свойств и структурных параметров может быть отнесен к оригинальному /люпиновому / штамму ВШФ, тогда как другой - В-2 - представляет собой типичный штамм данного вируса.

Выявление семенной вирусной инфекции

у кормового люпина

Одним из основных источников заражения посевов люпина являются семена, поэтому выявление вирусов в семенном материале

'Рис.3. Схема распределения белков при электрофорезе в ПААГ: 1-БСА,. 2-яичшй альбумин, 3-химотрипсино-ген, 4-цитохром С, 5- В-1,' 6- В-2, 7- смесь белков

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 4 Процентное содержание аминокислот капсидного белка штаммов ВЕМФ

представляется необходимой мерой, борьбы с вирусной инфекцией. До настоящего времени зараженность семян контролировалась проращиванием их и появлением'симптомов болезни у ростков - метода громоздкого и продолжительного по времени.

Впервые нами для определения семенной инфекции люпина применен модифицированный метод иммуноферлентного анализа на нитроце-ллюлоэных фильтрах /synpor , 0,23-0,45 мкм/, которые по данным А.Ф.Фролова с соавт./1989/ могут заменить плашки в твердофазном методе и удобны для ведения скрининга при массовых исследованиях семенного материала.

В качестве антигена в ИМ использованы гоыогенаты набухших семян, свободценных от кожуры, или семидневных проростков; оптимальное разведение антигена 1:100 - 1:500.

Источником антител служила кроличья поликлональная сыворотка полученная нами к оригинальному штамму B-I /разведение 1:400/, обладающему более высокой антигенной активностью по сравнению со штаммом В-2.

Определение вирусоносительства в материале проводили,в двух модификациях: в единичных образцах семян и в партии'из 10 штук, 7та же постановка велась при исследовании проростков.

Исследованы образцы 16 сортов люпина. Антиген ВЖМФ чаще обнаруживался в единичных семенах, процент пораженности в зависимости от сорта колебался от 6 до 80, при этом в семенах 4 сортов /Мотив 369, JI.2.3636, JI.II38, Ранний 87/ он выявлялся в минимальных количествах. При анализе партий из 10 семян отрицательные результаты были получены у 7 сортов, в том числе у 4-х вышеуказанных. Высокая чувствительность ША позволяет выявлять, главным образом, присутствующий в семенах антиген вируса, который свидетельствует о зараженности семенного материала. Учитывая это, целесообразно было определить наличие инфекционного вируса в проростках. Исследование препаратов, приготовленных из отдельных проростков, выявило высокую степень пораженности, которая достигала 50% у отдельных сортов /рис.5/. В то же время, как и в случае исследования партии семян, вирусная инфекция не. обнаружена у 4-х вышеуказанных сортов при анализе препаратов из партии проростков.

Для подтверждения полученных результатов проводили биологическое тестирование, учитывая появление симптомов инфекции на растениях спустя 2-3 недели после высаживания семян в грунт.

4

1+1 л

1

Е * 1 I ? в 5 к :

г ё 8 Г И И

2 ^ 5 I I

3 2а!'

а - , а

Рис.5 Сравнительный анализ результатов И<М при:

а/ тестировании единичных семян /о / и проростков /& б/-тестировании групп из 10 семян ¡с)/ и проростков (ш/.

Во всех случаях, кроме одного /сорт Фотон 1987/ обнаружены симптомы узколистности, что свидетельствовало о высокой чувствительности предлагаемого теста и адекватности его методу биологического тестирования.

На основании проведенных' исследований можно сделать заключение о целесообразности использования ИФА для выявления семенной вирусной инфекции в посевном материале люпина. Как показали наши исследования, оптимальным является .обследование пулов из 10 проростков. Тот факт, что отечественная промышленность выпускает необходимые для реакции стандартизированные антивидовые антитела и и комплекс пероксидаза-антипероксидаза, значительно облегчает вне-

дрение ИМ в практику.

Обобщая приведенные материалы, следует заключить, что высокая степень пораженности кормового люпина узколистносгью является проявлением ВЛШ-инфекции. Популяция вируса представлена типичным штаммом, распространенным в странах Европы, и оригинальным, люпинобым, впервые вццеленным и описанным нами. Последний отличается от общеизвестного вируса желтой мозаики фасоли по ряду биологических и структурных особенностей.

Отработаны методы выделения и очистки вирусного материала, модифицирован иммуноферменгяый анализ и предложена тест-система .для выявления вирусной инфекции у зернобобовых культур, которые могут быть рекомендованы для скрининга вирусоносительства в практических семеноводческих и селекционных, учреждениях.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что узколистность, поражающая посевы люпина на территории Украинского Полесья, вызвана возбудителем, который

'по антигенным свойствам, морфологии и размеру вирионов,коэффициенту седиментации и показатрчю плавучей плотности идентифицирован как вирус желтой мозаики фасоли, относящийся к потивирусам.

2. Вирусная инфекция приводит к уменьшению в 1,6 раза массы и числа азотфиксируащих клубеньков и вызывает поражения у 6 -100$ растений различных сортов люпина.

3. Популяция вируса желтой мозаики фасоли представлена двумя штаммами, отличающимися друг от друга по характеру проявления инфекции на растениях-индикаторах, интерферирующей активности, размеру вирусных частиц, молекулярной массе и аминокислотному составу капсидного белка.

4. На основании изученных структурно-функциональных особенностей один из выделенных штаммов отнесен к оригинальному, люпй-новому, свойственному агроценозам Украины, а другой - к типичному вирусу желтой мозаики фасоли.

5. Впервые для определения вирусной семенной инфекции люпи-

;а предложен иммуноферментный анализ на нитроцеллюлозньк фильт-1ах, использование которого позволило диагностировать вирусоно-!итбльстпо в семенах 16 сортов.

6. На основании выделенного оригинального штамма ВЖМ1 и 1ммунн0й сыворотки к нему разработана тест-система для диагности-;и вирусной инфекции зернобобовых культур.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Диагностика вирусных болезней бобовых-вакная' экологическая проблема//Сб. тр.мездувед.н-тех. совета по компл.пробл. охраны окружающей природной среды, секция "Человек и биосфера',' -Ереван, 1987. С. 66 (в соавторстве с Н.В.Тайоква, А.1 .Бойко, Т.Б.Гращенко).

2. Выявление вирусной инфекции в семенах люпина //Научно-практ.совед. "Вирусология-народному хозяйству". Тез .дом,, -Киев, 198?. С. 18 (в соавторстве с Н.В.Тайкова, ЛЛДмурко,

B.И .Головченко, Т.Б.Гращенко, А Д.Бойко).

3. Использование ИФА на нитроцеллшозных фильтрах дая оценки различных способов очистки ВШФ, выделенного из растений люпина/ДЗикробиология, эпидемиология,иммунология, 1988, № 2. СД07-109(В соавторстве с Н.В.Тайкова, Л.И.Кмурко, Т.Б.Гращенко, АД .Бойко).

4. Использование электронной микроскопии дая диагностики вирусных болезней люпина // У1 Всес.симп. "Ультраструктура растений". Тез.докл. - Чернигов , 1988. С.237 (в соавторстве с Н.В.Тайкова, ЛЛ.Кмурко).

5. Методические указания по применению реакции агглютинации латекса для диагностики фито-вирусных инфекций (дяя студ. биод.ф-та), Киев/ НУ. 1988. С. II (в соавторстве с Н.В.Тайкова, Ж.А.Дупевич, Т.Б.Гращенко).

6. Значение своевременной индикации вирусоноситольства лх>-пина в деле охраны окружающей среды //Сб .трудов секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" - Киев,.1988.

C.82 (в соавторстве с Н.В.Тайкова, Т.Б.Гращенко, АД.Бойко).

7. The laboratory diagnostics at nnrrow-leavea yellow lupin.// 5 th International lupin confers,ce.- loznen, Poland, 1983, A-18 (Boyk® A.L.Qolorchenko V.I.,Zhmurko L.I., Taik>va U.V., Ornschen-ko T.B.)

8. Сравнительная характеристика серологических тестов для диагностики семенной вирусной инфекции лдятна /ДП съезд УМО. Тез.докл. - Черновцы, 1989. С J03 (в соавторстве с Н.В. Тайкова, Т.Б.Гращенко).

9. Индуцируемие вирусами опухоли у растений при различной экологической ситуации //Всес.симп. "Объем и методы генетической оценки и побоч.эффектов биолог.активных в-в"- Ленинград. 1989. С. 19 (в соавторстве с А.Л.Бойко, Н.В.Тайкова, Аль-Кадах, А .0 .Шарова, Г .В Луж).

• 10. Сравнительная характеристика фасоли, поражающего кормовой люпин в условиях У краинн //УН съезд УМО. Тез .докл. -Черновцы, 1989. С.172 (в соавторстве с ЛДДмурво, Н.БЛорембсяой).

11. Анализ повреждающего действия вирусов /Д1етодическне рекомендации "Современные метода определения поврездзющего воздействия факторов окружающей среды /биол„,физ., хим. на живно организмы/" -?;'юсква, 1930 . 40 С. (в соавторстве с А Л.Бойко,-Н.В.Тайкова, ЛЛ.Жмурко).

12. Характеристики 1золят1в Blpycy жовто1 моза!ки квасол1, вид1лених з люпину // Допов1д1 АН УРСР, 1990, № 4. С. 66-69,

(в соавторстве'с Н.В.Тайкова, ЛД.Жмурко, А.Л.Бойко) ■

13. Индикация вирусоносительства в семенах люпина //Всес. конф. "Микробная. и биотехнологические основи интенсификации растениеводства и кормопроизводства". Тез .докл.- Алма-Ата, 1990. С.100(в соавторстве с Н.В.Тайкова, ЛД.Жмурко, Т.Б.Гращенко).