Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Иммунохимические исследования капоидных белков вирусов растений

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимические исследования капоидных белков вирусов растений"

«6 ûR . 7 '.'ДОЛ

¡1ТУТ ЕИОЛОГИЧЕСЯСЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ШДЦОВЫ

На правах рукописи

ПЭТСПЛ Раиса Васильевна

1ШМУГОХИШЧБСКИЕ ЯССЛ2Д ЗВАНИЯ ШЮ1ЩШ БЬДКОВ В4РУООЗ РАЗТЕНИЧ

06.01.11. - ггэдгга рсстений от Fpyui-reJart и болериеП

А в i с р е } е D a i диссертации ни соиск&иие ученой огезеич доктора биолог ически к на?<к

fin;wie в - 1993

Работа выполнена в лэйогхаторли иммунохимии и биологии Бирусов растений Блолого-почвенного института Дальневосточного отдохенвд Российской Академии каук

Научный консультант

академик Российски Акадеши наук и Российской академии сельскохозяйственных наук, профессор И. Г, Атабеков Официальные оглоиенты

доктор биологических каук, профессор Т. Д. Еердеревская доктор биологических наук, профессор а К Кинтя доктор биологических наук, профессор Б. К. Ыилкус

Защита состоится " ШСН^ "1903 г. в__час на

заседании Специализированного совета Дп0 защите диссертации на соискание ученой степени д-ктора биологических иа-5к при Институте биологической звщпи растений по адресу: 277060, Кишинев-60, ул. Дачия, Е8. Институт биологической ващиты рас-тений «н республики молдоез с

С диссертацией иояно ознакомиться в библиотеке Института биологической защити растений

Автореферат разослан , ¿Р /} Л- "1С93 г.

Учений секретарь Специализированного еоэета кандидат сельскохозяйственных наук

Тодпраш Е А.

П

- 3 -

1. ОБШДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Интерес к изучению антиге ■ m (капсид-ные белки) и специфических антител (иммуноглобулины) обусловлен их вадшейиеЛ ролью при выделении индивидуальных белков и поли-пеич'идов из сложных смесей, а также практическим значением ишу-нодиагностикумов при f зработке основ защиты растений от вирусов [Атабеков, 1984; Вердеревскзя, Марннеску, 1985, Трофимец, 1990]. Современный уровень изучения вирусных болезней растений требует внедрения в практику фундаментальных разработок, связанных с защитой растений от болезней. Так как система безвирусного растениеводства высокорентабельна, то реализация в полном объеме достижения в области иммунохгамческих исследований фигошфуооло-гии с целью завдты сельскохозяйственных растений, можт дать серьезные положительные сдвиги б растениеводстве. ичмыглч, 197/; Милкус, 1982; Вердеревская, 1983; Рыбалко, 1986; Атабеков, Таль-янский, 1987].

3 отечественной фитовирусологки сведения ко имкуногонн^стм, антигенности, стр5"тгурным особенностям антигенных детерминант к?лсидных белков носят отрывочный характер и несмотря на актуальность проблемы мало изучены. Нет единых веглядов кл рель кы-муногенности к. юидшх белков в процессе получите тецифических антител, в исследовании связей и взаимоотношений вирусов л их ¡¡ггаммов по антигенной специфичности Почт,! отсутствуют данные го структуре и локализации зпитспов, слабо оюажени кличевке. ¡«шиты идентификации и классификации вирусов по антигенному признаку. Такое положение сохранялось до недавнего соемепи го трем причинам: во-перзиу. не öwj-.л ралрчйотгциг •-ехуологки пе^улнм высокоочищенных препаратов ( антигенов ) , производства диагностических сывороток ( иммуноглобулинов ), слабо изучена оо.-ь адък.Еаитов при иммунизации «итлт.ых. что позволяло бь: решать многие задачи, стояигип ¡черед теоретической и иршладнпс ¿ито.чи-русологией. Во-вторых, на бклк широко впе.чренк рыеок«чувгт8и: тельные иммунохимические методы, сао?обиые обнаруживать наног-ракмовые количества вирусного Ct.vui. че толм'о длч исоледоча-"епьских целей, ко я для серийной иммулодиагкпетики. И, в-третьих, не была решена задача сгандартигации икмунохимических »то ЛОВ.

Актуальность иммунохимических исследований и ранее диктова-■ лась экономическими соображениями, но только в последние 10-15 лет была создана необходимая база для исследований. Это преаде всего относится к современным физико-химическим методам исследования капсидных белков, позволяющим изучать вирупспецифическне Селки, нуклеиновые кислоты, определять функциональное яначение структурных компонентов в инфекционном, иммунологическом и ишу-нохимическом процессах, определять мол. массу капсидных бел сое, прс.одить сравнительное пептидное -'артирование, -трансляцию вирусной РНК, секвенирсвание. Техника моноклональных антител позволяет, например, успешно применять их в аналитических целях для * изучения структур» и локализации груипо-, вирус- и штаммоспеци-фичных эпитопов капсидных белков вирусов' растений.

Изучение проблемы, свя~ энной с исследованием иммуиогеиных и антигенных съойс,< капсидных белков, как одного из подходов изучения вирусов растений, выдвигается на повестку дня.

Цель и основные задачи работы. Главная цель исследований -антигенный анализ капсидных белков вирусов и их штаммов, принадлежащих к различим таксономическим группам, с помощью современных кшунохимических подходов. Параллельно решзлея вопрос о повышении шмуногенной активности капсидных белков и их антигенной специфичности в гомологических и гетерологических системах. В ходе работ решались следуйте задачи:

(1) Комплексное изучение биологических, фигических, физико-хши-ческих, иммунсгенных и антигенных свойств капсидных белков раб-до-, бромо-, ко ью-, кукуш-, иепо-, некро-, карлз-, потеке-, поти- и табачозирусов.

(2) Разработка и усовершенствование технологий получения высэко-очигинных препаратов и их структурных компонентов.

(3; Лучение антигенной структуры капсидных белков на примере грзх иггамдав У-вируса картофеля.

(4) Отработка технологии получения специфических поликлональиых антатед от разных ¿идов животных (куры, мыши, кролики) к поверхностным а потопам капевдт..; белков различной иммуногзгадасти.

(5) Научение приемов, повышающих иммуногенную активность капсидных белков.

(6) Подбор оптимальных условий и усовершенстЕОванче методик сов-реыенных иммунохимических методов применительно к изучаемым вирусам при анализе антигенных взаимоотношений для оп; деления тшсссшмичеспюго положения новых, ранее не описанных вирусов и их шташов.

(7) Получение иммукодиагностикушв и отработка методов их применения в практике безсирусного растениеводства Дальнего Востока ц Сибири.

Научная новизна Работа является первой попытгай связать современное учение иммунохимии об антигенах, антителах и разнообоази-ем проявления их взаимодействия с задачами фчтовирусологии, о целью изучения капе идти белков вирусов растений.

Вгьрвые дан антигенный анализ капсидных белков вирусов и шташов 10 тшхоношчьских групп. Экспериментально получены до-ка&агельства определяющей роли иммулохимических исследований при идентификации и классификации вирусов и их шташов, при изучении функциональных свойств структурным компонентов белков, а также комплексной характеристики фитовирусов.

Впервые дана оценка роли неспецифичьоких факторов иммуногенеза в процессе получения специфических антител и определена сте-г-'ЧЬ их влияния на иммуногеннось капсидных белков (дозы В способы введения иммуногена, схемы иммунизации животных, реимму-г низания).

Шервые исследован ах"ювантньй эффект простых (сапонин, бентонит, полиэтилен; иксль, глицерин) и сложных (масляные адъюван-ты) веществ. Разработанные нами совмес но с коллегами из ТИБОХ ДЮ РАИ новые водно-масляные эмульсии с клетками сине-ае.иеных ьодорсслей и липспол'лсахаридом, выделенным из водорослей, были разгацйнныш заменителями адъюпанта АрэЬида.

Впервые изолировал группоспецифячный эпитоп некротического штамма '.'-вируса картофеля, соответствующий позиции 198-208 полипептидной цепи. Эт. дает возможность идентифициоовать г~тивирусц и их штаммы, тшгеономичеекое положение которых не определено, главным образом, из-за отсутствия данных о капсидных белках.

Вгервые пептидным картированием установлено наличие одич&'-со-вых аш;нокислстных последовательностей в капсидных бедках ранее'

не оп«санных вирусов традесканции белсцьеткоьой и ыоааики клевера горного с типовым представителем потивирусов мозаикой турнепса.

Впервые усовершенствованы и отработаны оптимальные условия детекцли вирусов ракетным ишоноэлэктрофо^езом, конкусентиым вариантом и двойным аитителоным сэндвич-методом ИФА для количественной оценки эпитопоз капсидных белков исследуемых фитоьирусов. Конкурентным вариантом Ш>А вперено для фитовирусов рассчитаны юзнстанты ассоциации гамплекса антиген-антитело и определен процент идентичных эпитопов у исследуемых поти- и потексвируеоа. Практическая значимость. Полученные результаты углубили нааы знания, по фундаментальным основам классической фитовирусологии, пополнивши'.з иовыш данными по характеристик1 и свойствам ранее не описанных я уте известных вирусов к их штаммов.

Разрабомишые в процессе исследования методические подходы послужили основой для ьолучгшш антисывороток к наиболее вредо-носгпым и распространенным в регионе Дгнькего Востока п Сибири вирусам с целью отбора исходного безвирусного материала в селекции и семеноводстве. На базе совхоза "Урожайный" в Чугуевском районе Приморского края была создана зона безвизового картофелеводства Приморского края. Реализация в полном объеме мероприятий, основанных на оздоровлении от вирусов посадочного материала, в том числе и применение антивирусных сывороток против X, У,

У, Б, ВАУК, позволила повысить уро.тай картофеля в 2 раэа [Рейфлан, 1581].

В гюмокь селекционерам и сзмоноЕодам подготовлены и изданы методические указания "Иммунодиагностика вируса мозаики сои в растениях и семенах сои" (1990). Наши данные вошли в "Типовую технологии массового прои: юдетва диагностических сыворо/ок к X, г, VI. У, Я-вирусам картофеля" (М. 1977).

Апробация работы. Материалы работы д^лохеаы и обсуждены на 1,1. ом Всесоюзных совещаниях "111 шмы вирусов растений" (Владивосток, 1977; Пятака, 1981), 7-ом Всесоюзном совещании "Вирусные болезни сзльскохозяйг ^вен"их растений и меры борьиы с ними" (Ленинград. 1078), 9,10-ой конференции чр^осдовацки- фитовирусоло-гов (Бкго, 19Й1; Нрагь, 1989), Конференции немецких фитовирусо-

аогоз (Галле, 1982; Эберсвалъд, 1989), Всесоюзном совещании "Вирусные Солезни растений и меры борьбы с ними (Вильнюс, 1984), 7-ом съезде ВЮ (Алма-Ата, 198Е), Всессотной конферо ;ция "Вирусы микроорганизмов и растений" (Ташгагг, 1986), Б-ой конферегцш "Вирусные болезни злаков в Европе" (Будапешт, 1986), Всесоиэно> конференции "Микробиология и биотехнология - основы интенсифика Ц1И1 растениеЕОдстьа и чормоппоизводетва" (Алма-Ата, 1990), Региональном совещании "Промышленное производство семенного картофеля на безвирусной основе в Дальневосточной гоне" (Хабаровск, 1990), Всесоюзном совещании "Иммунитет сельс.чюхозяйстЕенных культур к болезням и вредителям" (Шнек, 1991), Конференции, посвящзнной 100-летию ей. дня открытия вирусов Д. И. Ивановским (Ростов-на-Дону, 1992), а та!о*е на рабочих совещаниях по проекту "ВезЕИрусное растениеводство" (Шсглз, НГУ, 1987-1992), нг заседаниях отдела физиологии и вирусологии растений и Уча нон совете Бшлого-почвенного института ДВО РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 104 работы в отечественных и зарубежных изданиях, одна монография. Оформлено одно авторское сридетельство "Адъюзант™ N 12972&. от 1986 г; Структура и объем работы. Диссертация изложена на 428 страницах и состоит из введения, семи глав, заключения и вчводов. Обзор литературы по оме представляет первая глава, вюрая - осисаяиэ методов и материалов. В третьей главе изложены новые данш/ пс биологическим, физико-химическим и- аяткгрнгаы свсгстьаы исследуемых фитовирусов. В четвертой покжьш основные пути получения поликлоналъных антител. В пятой анализируются антигенные взаюо-отнооения мезэду вирусами и штаммам-! внутри одной таксономической группы, в тестой дяется сравнительная о'^ш'л совьемзиныч тлзти-химических методов по чувствительности и сгоци4ичностн ври обнаружении вирусного белка. В седьмой главе приводятся данные газ использования антител, иммуноглобулинов, кпнъвгатов в фундаментальных и прикладных исследованиях фитовнр/солэгки. стя.ок литературы включает 478 источника, из которых 346 на шюстрашшк язьках. Эжпериментальные дан»*» предстаиэнц на 28 таблицах {. 73 рисунках и графиках.

11. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исходным матер чалом были потексвируськ Х-вирус картофеля (ХЕК) и его штаммы сильной, слг'ой и средней патогенности; ауку-ба мозаики картофеля (ВАМК); кольцевой пятнистости гортензии (ЕШТГ); мозаики белого клевера (ВМБК) и ыозаики подорожника азиатского (ВША) и его штаммы: приморский, сахалинский Д. и саха-лин^чий Н.- А. Карлавирусы: M и S-вирусы шртофеля (MER, SBK). йекровирусы: вирус некроза таба)Ш (ВНГ). Штивирусы: У-вирус картофеля (УВК) и его штаммы: обычный (УВКя), некротический ( ¿ВКп), штриховатой полосчатости Ci'EKc> ; А-вирус картофеля (ABKj; мозаики сои (ВЬЮ); желтой ыозаики фасоли (ВЯШ); желтой карликовости лука (ВШ1); традесканции белоцветковой (ВТБ) ; мозаики турнепса (^VT); мозаики клевера горного (ВМКГ), мозаики гиппеаструма (ЕМГ). Тобаювирусы: вирус табачной мозаики (ВГМ) и его иггамш: ■ обьчкый, цифомандровый, подорожниковый, петункевый, петлевидный, казанский, ядерный "Т" и "О", душистого табака, зорьки, фибриллярный, ириса, японский ^тамм "ОМ", нарииспа, картофельный. Комовирусы; мозаики редиса (BMP). Бромовируси: мозаики костра (ВМК), мозаики вики однопарной (BUBO) и его штаммы: некротический (ВМВОн), мозаичный (PAffiOi,:) и пятнистый ( ВМЕОп). Неклассифицированный Lnpyc на рисе: штриховатой мсзаики. Кукую-вируск: огуречной мозаики (ЮМ) и его штаммы: кавказский и приморский, вирус аспермии томатов. Рабдовирусьа мозаики н вакукли-ванил влаков (ВМЗ, ВЗЗ). Кеиовирусы: вирусы ксроткоузяия и инфекционного хлороза винограда и их изолята, идентифицированные на Украине: Алиготе, Сильванер, Шасла белая, Шшо серый и Рипариа х Рупестрис ЗЗС&.

Бирж. ические свойства вирусов определяли известными в литература методами СКирай и др., 1974; Власов,;991]. Выделение РНК фенольной депротеинизацией проводили по «ото,. • Е. Добрэьа f 1981], вцделение белков - ацетатным САтабеков, 1981) и солевым, как описано в работе 1Q Радар-чсогс с соавт. [1988]. üjpai-здискировщше белков и нуклеинов« кислот осуществляли дискэлукгрофорс-зом в модификации У. .feMuna CLaetranli, 19'/C1. Ограниченный прогеслиз

капсидкых белков проводила палаином по методу Д. Кливленда с соавт. [Cleveland ot al. , 1977]. Шлучение поликлональтк антител. Кроличьи получали по принятой нами схеме fГнутова. 1985]. Мышиные - путем трехкратной знутрибрюшинной ишунизации с не-деш-ным интервалом. Дезы мммуногека -10,20,40 мкг. Обгем вводимой жидкоехи не превышал 200 мкл. Куриные иммуноглобулины - по мэтеду Ю. Ху [Ни et al. , 1985]. фракцию иммуноглобулинов (IgG) выделяли несколькими способами в зависимости от цели иеследов нчй. Оеалдали из антисывороток сернокислым аммонием, полиэти-леягликолем и с помощью колоночной хроматографии. Выделение F( аЬ)^-фрагмектов из IgG кроличьей антиенгоротки проводили по методу Е Barbara, Ciark, 19822. Ыаркирование IgG пероксидазои из хрена доводили по методу CNakane, Kawaio, 1974].

Е основу всех имм>нохимических методов бнли положены разработки акто])ов, впервые их использовавшие при изучении свойств •белков и модифицированные нами в результате подбора оптимальных •условий постановки метода при исследовании антигенных функций капондных белкоэ Лиговирусоо и их штаммов, изучаемых нами. Реакция иммунодиффузик (РДД) COuchLerlony, 1953]. Радиальная имму-нодиЗДуоия С РИД,- [Mancini et al., 1964]. Виробактериалькая аг-г■здинацил (ДБВ-тесу^ [Чирков и др. 1931]. Ракетный иммуноздек-трофореь (РИЭФ) С Laurell, 1S66; Gnutova, 1980]. Иммунофермзнт-ный анализ (.УМ): сэндвич-метод [Clark, Adams, 1977], непрямой вариант ИФА iKoemg, 197"4] , конкурентный метод [Hermann, 1981; Сибирякова и др., ' 3871, двойной антительный сэндвич-метод (ДАСШ С Barbara, Clark, 1982; Какарека и др., 1С 0;Гнутова и др., 1992]. Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ) [Milne, Luisoni, 1975; Рублева, Гнутова, 198Ь]. Иммупоблоттинг [Towbin et al. . 1979; Гнутоза и др. 19Э1].

III. 'ЛССЛЕЛОВАНЯВ ИМШЮГЕННИХ, АНТИГЕННЫХ. ЮШЮ-ХИМИЧЕСКИХ ?i БИОЛОГИ iCKHX СВОЙСТВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ

Шбор тес,--растения для накопления вирусов. В настоящее ъ/>емя из 1700 описанных вирусных заболеваний идентифицировано около б SO вирусов Г Hamilton et al., 19853. Антивирусные сыворотки при-г.;.тов."ны к более 300 фито. ..русам С Гнутова, 1935]. Качество ва-

русного препарата, - получаемого в результате отделения вируониХ частиц от компонентов клетки растения-хозяина зо многом определяется правильным выбором растения, из которого должен бить выделен вирус. Ка'с правило, одни растения подходят для размно«эщ& вируса лучше, чей другие. Растения, которые варазшг™оя вируеоУ системно, более подходят для накопления вируса.' Очистка многи-вирусов затруднена из-аа отсутствия сведений о процессе раамке жэния вирусов б растениях после инокуляции и. сроках 1а ыакон ыального накопления. В таСл. 1 мы приводим результаты ншш! исследований по выбору тост-растения для некоторых вирусов.

Таблица

Выбор тест-растения для р&зшюжения и накопления вируса

Вирус

Тест-растение

Дни снятия листьев Кон-ция в препарате в ыг/кг

26-30 70-120

25-30 20- ЙО

36-45 4- 16

12-15 12-15 16-24 30- 40 70-100 70- 90

30-35 80-100

14-20 7-10 18-20 £0-30 12-15 30 0С6ШШ-8И.ЛИЙ период 10-12 1С-12 4- 6 ' 30- 35 250-300 180 110-13С 60- 70 40- 70 60- 80 170-250 00-180 40- GO

10-12 100-220

YBK

ahr

im;

вшг виг

кгб вжл

BiC

ХЕК

МШ

SBK

bauk

БИБК

ВКПГ

ВШ ЮМ внг

PAT

Nicotiana tabacurr. L. ov. Saroun Xanthi

N. t abac um cv. Samsun, Xanthi, N. Cleveland ii Ersy. Glycine hispida L. cv.

npHMOpcKaH-494 Faha bona Medik. Rhapl mius sativus L. Tinantla fugrax L. Tradescantta albtflora L. Allium ascalonicum L.ov.

KycroBKa-513 Kippeastnim hybridum Dat .ura stran^ntum L, Lycopersicon esculentun Mill.

esculentum Mill. cv. HptCKMi D. stramonium L. Phaseolus vulgaris L. Hydrangea macrcphy' la L

N. tabacum L. cv. Samsun N. tabacum L. cv. Samsun, Xanthi Chenopodium quinoa Vilid., . Cucumis sativus L.cv.

üaii>HeBocToijHuft-6 N. tabaoum L.cv. Samsun, Xanthi

Штивирусы. При исследовании типовое представителя группы УВН прежде всего учитывали, что вирус широко распространен и вредоносен, имеет большое рь аообразие штаммов и является одним из трудно диагностируемых вирусов на картофеле.

Антигенная характеристика з-:с групп штаммов вируса (УВЧс, УВКп, УРКе). УВК в полель* условиях часто не удается идентифицировать даме высокочувствительным ИФА. Причиной может быть низкая концентрация вируса в растениях картофеля. Другая причина - различная определявмосгь иммунохимическими методами серотипоз вируса, так как антитела взаимодействуют избирательно. В идеальном варианте достаточно •-дентифицировать антигенноактивный штамм с эпитопами разных серотипов или получить такой пггамм или антигенную детерминанту химичесгам синтезам, которая была бы общей для всех серотипов. С этой целью изучали антигенную специфичность штаммов и выявляли тгам«г- к вирусспецифичныа эпитипы капсидных белков.

Исходным материалом, исследованным на шгашсшую принадлежность УВК, служили различные сорта ¡аргофеля, возделываемые в Беларуси, Украине, Эстонии, Республике Саха и различных областях России (Московской, Самарской, Омской, Нэвосибирской, Ленинградской областях и 16)ИШ1Ском крае): Омега, Я-35 (ЕИ?), Гекети-ка, 1«наль, Ревену, Еиоля, Волжанин, Л>рх, Кинельская роза, Ча-рывниця. Сорокаднеэяьэй, Пала Еараяне, Невская горка Лыегавский желтый, Андо-8, Яакко, вилатовский, Приекульский ранний, Тулунс-кий ранний, Неда, Белорусский гибрид и Белорусский ранний, Мурманский, Самогодок, Пауль Вагнер. В качзстве контроля использовали штаммы вируса, полученные Ж.Блоцксй от Л. Лч Вокз и люг^аво переданные нам, а тага® иеоляты УЕКо и УВКп, идентифицированные в Ленинградской области Л. Козловым и Е Обручкоыш на сортах Невский и Лриекульекий ранний, ¡.'псковские изолягь» и игаымы вируса, идентифицированные на сортах ¡¡артофедя о^чественной и еару-Оежной селекции, переданы были Л Трофимцэи и й Варишвым.

Для характеристики антигенной специфичности исследуемых ата*-мов идентичные вирус- и игаммоспецифичные эпитопы выявляли я , гомо- и гетерссистеках непрямым вариантом и сявдвич методе и В перекрестных реакциях иепоггс-эоЬали коммерческие диагь.ктиадс-гае наборы поликлоняльныу. антител, выпускаемые в НйИ ;:артофел£'-лого хозяйства, шноклоиальные антитела, приготовленные з- Н®* химической и биологической Физики аН Эстсчли, а таклк »ев и диагностические комплекты, получерные нами. Характер крив «л. титрования и наличие перекрестных реакций свидетельствовали об ант е-

генном родстве между исстрдуемыми штаммами (рис. 1), благодаря присутствию штамчо- и вирусспецифичных эпитопов в капсидлзк белках игаммов.

Рис. 1. Антигенные взаимоотношеЕйя дальневосточных штаммов YbK в сэндвич-методе ИФА.

A. Препараты вирусов: 1 - YBKo, II - YBKn, III - YBfti, IV -сек здорового табака в разведении 1:20 (контроль)

B. I - YBKn, II - YBl'o, III - YUKc, IV - контроль.

Результаты сэндвич-метода ИФА показали более широкий спектр спецк.{ческих антител, полученных против некротического итамма вирусе По актигодаой активности выдедялягч» УВКп (московские, дальневосточные и санкт-петербургские наал. ч), а ив группы ойычных штаммов - дальневосточные и московские. УВКп проявлял Hjwiiyi) антигенную активность. Иммуногенность УГЖ определялась шгаммовой принадлежностью. Некротический и обычные штаммы оказались умеренными, а У£Кс слабым нммуногенами. Нь оонс^е .юноаггам-довых сывороток были разработаны иммуноферментнне тест-системы пригодна:' для иммунодиагностики убк независимо от ктаммовой принадлежности и от oOH'j 1ырэ;вд£ан!"я различных сортов картофеля. На

территории бывшего СССР среди цггашов УВД наиболее распространен УВКо.

Антигенная структура капсилных Седков некротического штаима УШг Известно, что именно в N-концавой части полипепти^.ой цепи локализованы зирусспецифичные эштаопы, тогда как группоспеци-фические сосредоточены в области трипсинустойчивого бежа, свободного от N- и С-концов [Dougherty et al., 1985; Shukla et al., 19881. Локализация сггаммсспецифичного эпитопа наряду с вирус- и груипоспецифичнши, способными взаимодействовать с дано- и по-ликлональными антителами, важна при исследовании топографии белка в капеиде, а выявление иммунодоминантной области в исследуемых капсидных белках потивирусов и определение её структуры дает гарантию получения надежного иммушдиагностикуна и открывает путь для создания синтетических пептидных антигенов в фитовиру-сологии.

Сравнение mojl масс структурных белков УВКо, УВКп, УВКс с помощью электрофореза о ПААГ показало, что в процессе выделения они подвергаются частичному протеолизу. Помимо основной мажорной полосы с мол. массой 32,0 кД, соответствующей мол. массе днтакт-ного капсидного белка, присутствуе" несколько полос с более низ-киш значениями (рис. 2).

i W ^РГ'ГП

I '. ■ Л^- i Рио- 2- Электрофореграмма капсидных

r'-j * 'У белков штаммов УБК. 1-УВКо, 2-УВКп, 3-

' '"¿г* ' **f УВКс, 4-белки - маркеры : фосфор-'чаза (94 к®, ВСЛ (67 кД), овальбумин (43 кД), карбоншеангкдраза (30 кД) и трипсин-ингибитор (20 кД).

"• гоя.

& Д 3 :( г 3

Для галоидных белков УБКо и УВКп при этом наблюдала сходство в расположении' и количестве структурных белковых компонентов, в то время как белок УВКо, полученный солевым методом, л ввергался сильному расщеплению на двя полипэптида Эти данные указывали на

- 1.4 -

гетерогенность структурных белковых компонентов вташюв вируса,

" У~ч * ч t е ■■ ТТ7

Рис. а Иымунобдотинг покой растений, содеряащн поти-вирусы, с моноклоном Y3C6 (разведение 1:10). 1 - белки-маркеры, 2 - Е8Ш, 3 -ВЖКЛ, 4 - BUT. 6 ВМС. б -Ш, 7 - ВТБ. 8 - АВК, 9 -УВИо, 10 - УВКО (1:£0), 11 - сок вдорового растения

, Основные структурные белкь шгамшв имели согласно данным им-муноблотинга высокую степень антигенного родства о поликлональ-ньши моноиташюаьш сыворотками. Все белковые полосы УВКо и УЕКс реагировали о антителами. Что касается второй белковой поносы УВКп, то реакции не наблюдали, что, очевидно, указывало на отсутствие в данном белковом компоненте ишунодошшантных областей, которые во всех белках исследуемых штамшв выявлялись только в реакциях иммуноблотинга («ох масса 12-14 кД) и имели высокую степень антигенного родствг со штамшепецифичньши антителами. Ш полагаем, что это пептиды, содержащие И- и С-концевые фрагменты капсидных белков со шташоспецифичншр! апитопами. Наши данные согласуются с рееультаташ, полученными дли других потивирусов [Shiikla. Varrl, 1938]. Эти авторы отмечают высокую степень гомологии (до 301) и большое сходство N-концевой области для штаммов одного потивируса Подтверждение своим предпололияк-ям мы получите с помощью : имуноблотинга, используя мож. лональ-ные антитела УЗСб и У4В1, но в этом эксперименте не отмечено реакций с легкими пептидами. Это укаг^вает о направленности ис1«^льэуешк шкоклонаяьных ант тел на общие эпитопы короьСЛ части, более устойчивой части капсидньк белков штаммов jßK. йаш . выводы наши подтсер le ни 4 в следующем эксперименте: УШ, аВК, ШС, ШТ. ИВ, ВХКЛ, Büß и ШГ, присутствующие в соке тест-рас тений, реаги|>овали в иммуноблотинге с моноклонами УЗС6 и У20.. Мон&клсн V2C реагировал топко с белгх1« оболочки УВКп, тс.да как УЗСб реагировал с капсидными белками всех потивирусов.

- -

Этот результат мы получили и при постановке ДАСМ и непрямого варианта ИФА. Эти данные свидетельствовали в пользу того, что на поверхности капсидного белка УБКп локалигован, по крайней мере, один эпитоп, общий для всей группы потивирусов. Ранее были получены моноклональные ачтитела к общим зпитопам УВК tGugerl;, fries, 19751. Е работе tShukla et al., 1988] показано, что слабый трипскнолиз частиц потиг,ирусов отщепляет N- и С-концевые области и оставляет трипсикустойчивую часть белка оболочки е груп-поспецкфичными эпитопами. С целью локализации поверхностных эпи-топов УВКп препарат подвергали ограниченному протеолизу трипсином. Супернатант лиофилизовали и разделяли HPLC. Полученные фракции были лиофилизоя&чы и детектировали флуоресцентным анализом временного разрешения, применяя моноклоны У20 и УЗСб. Из 18 триптических пептидов только один "17" давал сильную реакцию с моноклоном УЗС6. Быв определен иглшокислотный состав этой фракции и проведен сиквенс: Тир-Ала-Фек-Асп-Фен-Тир-Глу-Взл-Тре-Сер-Арг. Данная последовательность соответствовала позиции 198-208 полипептидной цепи исследуемого капсидного белка УЕйп. Причем, была выявлена обща? область, характерная для эпитопо! белка оболочки УВКп, УВКо, вирусов кранчачости пе^ца (РКП), пршз'хкочой крапчатости табака (ВПКТ), гравировки табака (ВГТ). тарст сливи (НЮ) и мозаига сахарного тростника (ВЯСТ) (рис. 4).

YBKn УВКо ВКП

впкт

ВГТ . ВИС

вист

Q

НУ*

R Y A F D F Y К

.,—

V GIL ARYAFDFYE

aF laryafdfye

т s т s

t

ft T R 1

TSR I

R N|L AIPTJA FDFFE

S LjSjR Y A F D F Y E SLARYAFDFYE SLARYAFDFYE

V N G A 1

T S

IS %

к T

T T R 7

209 209 209 20? 206 £72 24«

Рис. 4. Гомологии аминокислотных последовательностей в учзст-•те общэй области зпитопа оелюв оболочки потивирусов (обве дены идентичные аминокислоты, по крайней мэре, 5 посче^оаатвл-остей).

Вследствие того, что полной аминокислотной последовательное-

J

ти капсидных белков дальневосточных изолятов потивирусов не получено, вероятнее всего, ' подобная область также существует в их капсидных белках, а последовательность полипептидной цепи 108-208 является грутптоспецифичным эпитопом, экспонированным на поверхности вириоьа. Шноклон УгО узнавал только штаммоснецифич-ные эпитопы, локализованные в N-концевой области полипепгидной цепи. Эти результаты нашли подтверждение при постановке иммуноб-лотинга препаратов исследуемых потивирусов с иоликлональной моноид аммовой сывороткой к УВКп ( дал: невосточный штамм). Отмечена реакция всех капсидных белков, хотя к в разной степени интенсив-н-сти.

Итак, выявлена обшя иммунодоминантная область ; в капсидных белках потивирусов, соответствующая позиции полипептидной цепи 198-208 (Тир-Ала-Фен-Асп-С^н-Тир-Глу-Вал-Тре-Сер-Арг), которая является группоспсцифичным эпигепом потивирусов.

Вирус мозаики турнепса (Turnip mosaic virus) идентифицирован на производственных посевах лобы в Приморском крае. Дальневосточный изолят отличался от типичного тем, что точка термической инактивации была выше, а инфекционкость при выстаивании сока инфицированного растения при комнатной температуре вирус терял раньше. Кроме того, вирус не вызывал системного поражения у мари квиноа. а у цветной и краснокочанной капусты заболевание протекало латентно. Для очистки вируса использовали стандартную методику, применяемую для потивирусов СГнутова и др., 1992]. Электрофоретическкй анализ капсидных белков вируса показал, что свежевыделенный препарат имеет два полипептида с мол. массой 32,0 кД и 28,0 кД. В процессе хранения в препарате'появлялись пептиды с большей электрофоретической подвижностью. С помощью ограниченного протеолиза получено, что полипептид с мол «ассой 32,0 кД является продуктом деградации капсидного белка с мол. массой 38,0 кД Электрофорезом в 0,8Z агарос.'Ч геле выявлен один

компонент РНК с мох массой 3,5 х 106 Д. Вирус проявлял свойства умеренного иммуногела и антигена Максимальный титр специфических антител (ТСА) в РДД был 1:16-1:32, в непрямом варианте ИФА - 1:3200-1:6400. Полученная антисыворо^ка послужила Основой для приготовления юмуиодиагноотикума для ИФА. Вирус име^ антигенное родство со всеми изучаемыми потивирусаыи.

Вирус мозаики клевера горного (Trifolium montanum mosaic vinjs) выявлен в Приморском крае [Волков, Костин, 19893. Виру-" сильно агрегировал при очистке и концентрация в очишэннс : препарате зависела от времени года. Весной она была 100-1 20 иг/кг. Злектрофоретический анализ белков показал, что вирус содержит пептид с но*. массой 35,1 кД. С помощью ограниченного протеолиза получены пептиды идент-пше ВМТ, что свидетельствовало о сходстве аминокислотных последовательностей этих двух вирусол.

Мол. масса РНК была 3,3 х 10° Д. Вирус оказался хорошим иммуно-' геном, ТСа в РДД Сыли 1:32, в непрямом варианте ИФА -. 1:6400 -1:12800.

Вирус шзаики гиппеаструма (Hippeastrum mosaic virus) обнару-иэн п Приморской крае при обследовании дедаративнъпс растений [Толкач, 19891. Новый для бывшего СССР виру Надежный накопитель вируса кроме растении-хозяина не найден. В электронном микроскопе наблюдали нитевидные частицы длиной 740 нм. Вирус хороший иммуноген. Шксималышй ТСА в РДД - 1:128, в непрямим варианте ИФА - 1:1600-1:32000. Мол. масса основного капсидного белка - 30,0 кД. Поведенное комплексное изучение биологических, физико-химических и антигенных свойств вируса позволило получить А^пше, которые подтвердили его принадлежность к группе потивирусов.

Вирус традесканции белоцветковой (Tradescantia albiflora virus). Новый для бывшь.о СССР вирус £ Толкач и др, 198Э). )»чеет частицы нитевидноь формы 750 - 780 нм. Электрофоретический анализ белковых компонентов показал, что ^вежавцделенный препарат имел один полипепгид с мол. массой 34,0. кД. При хранении вирусного препарата происходило его расщепление на 4-Б легких пептида. Плавучая плотность 1,32 г /ом3. Максимальный ТСА г- РДД -1- 16-1:32, в непрямом варианте ИФА - 1:6400. Изученные нами биологические, физико-химические и вклеенные свойства позволили включить его в группу потивирусов.

' А-вирус картофеля (Potato virus А) изучается нами более 20 лет. В бывшем СССР нами впервые была приготовлена антивирусная сыворотка [Гнутова, 1973]. Процент поражения вирусом по/евого материала не прививал 1-PZ Вирус проявлял слабые ишуногенныв Свойства, но как антиген вел себя дов/угьно активно . в реакциях

пассивной гемагглюткнации, бентошп-аои флокуляции, латекс-тесте и связывания комплемента Концентрация вируса в растениях была низкой. В последние года при использовании для накоплекия табака (тебх 1) удалось добиться более высокой концентрации вируса в препарате после очистки. TOA в РДД - 1:16, ИФА ~ 1:10240. Антигенное родство, вируса отмечено со всеми изучаемыми наш по-тивирусамп.

Вирус ¡вэлтой мозаики фасоли (Bear, yellow mosaic virus) щ Дальнем Востоке сначала обнаружен на сое и клеверах [Шливанова, 1968;• 19783. Ш работали с изолятом, выделенным из гладиолуса. Сеыенксй передачи не наблюдали. По физическим свойствам этот нзсяят. незначительно отличатся от типичного, но если сравнивав с иээлятоы'нз сои, то первый более устойчив, так как температура

инактивации 65-70° С, а га сои - ?6-60°С и в соке гладиолусовый изолят при комнатной температуре сохранялся 15 сут, а соевый лишк трое сут. Различия Сьш! и при сравнении круга растений-хо-вяев. . I/ри получении очищенного препарате. мы отказались от иа-польгования буфера при гомогбкиЕации листьев и для стабилизации вируса в сок добавляли диэтиддитиокарбамат натрия, для поедотв-рапрния агрегации вируса при выделении. Электрофоетический анализ позволил выделить два полипе пт и да: основной с мол. кассой .52,1 кД и минорный - 28,2 кД. Вирус проявлял достаточно высокую иымуногеннул активность. ТСА в РДЦ был 1:54- 3:128. Влрионы вируса легко сбнаруишалисв ИЭЫ в виде специфических скоплений.

Вирус моаакки_¡у-ч (Soybean ¡rosai с virus) один «а Наиэолое

вредоносных и распространенных вирусов на посевах сон. Чайр see-го встречается слабо- и среднелатогеннне штаммы. Дальневосточный среднёпатогенный штаим йо своим свсйочзам совп дае¥ G чибйским атаммом С, к-тории при... то считать типичным СHunsht, Tolin, 1982Í. Дэ сих пир не найден индикатор, в ¡сотяром вирус раз у но-яа-^я и накапливался лучше, чем в сое. мы раоотали с coeil сор-ч "Приморская-494". Ецде^яли вигу- по методике [Hisachi, ''ikimct.o, 19651 и [Lfi-scoahri er al. , 1978) <У>; методики разноцснЫ. ЭЛек-?!»-форезом в ПААГ WJiiapj.¿епь две белковые зоны с vku. массой K;j,а и 32,С :<Д. Вирус бал средним иммунсгено! TOA b РДА 1:32. в ИЛА -1: '.JCV.Yi.

Потексвирусы (Potexvirus). Х-вирус картофеля (Potato virus X) представлен на Дальнем Востоке штвммгнм. Наиболее распространен полевой штамм о признаками средней и слабой патогепнгети. Антигенная специфичность вируса определялась штаммовой принадлежностью t Романова, Гнутова, 1976]. Были приготовлены шнопггаммо-вые антисыворотки к штаммам вируса Слабопатогенный штамм отличался более вырагаанно., антигенной и яммуногеиной активностью по сравнению с другими изучаемыми штаммами.

Вирус мозаики белого клевера (White clover mosaic virus) идентифицирован при обследовании посевов клеверов в Приморском крае и на Сахалина [Поливанова и др., 1977]. Вирус проявил хорошие нммуногенные и антигенные свойства . ТСА в РОТ -1:128-1:256, в MA - 1: 25600. Шел антигенное родство со вйеми изучаемыми по-тексвирусами.

Вирус кольцевой пятнистости .'ортензии (Hydrangea ringspet virus) обнаружен в Ботаническом саду на гортензии С Чуян и др., 1975]. Максимальное накопление вируса для выделения наблюдали только в растениях гсргенаии круглолистной в весенне-осеннии период. Методика очиг гки вируса описана [Рублева и др., 1989]. Хороший иммуноген. ТСА В РДД - 1: 32 - 1:^28. ЙФА - 1:12800.

Вирус аукуба мозаики картофеля (Potato aucuba -юггтЛо virus). Нами первыми в бывшем СССР была приготовлена антивирусная сыворотка к этому вирусу [Гнутова, 1071]. Вирус легко определялся серологически, был неплохой иммучогеь, ТСА в РДД - 1:3-1:32, в ИФА -1:3200.

Вирус мозакки подорожника азиатского .(Plartago asiatica mosaic virus) обнаружен на :оге Далышго Востогл и на Сахалина [Костин, Волков, 1г""6]. Силъний HMVyHOr^H. Рыли прчготоьл<*Нс'. мс-ноштаммовые сыворотки. ТСА в капельной агглютинации - 1:20401:8192, в РДД - 1:128-1:1024. Приморский и сахалинские ийоля-ы отличались по набору эпитопов. Оахаличсгаи рггамч нарягу с обеими имел эпитопы, которых не было у приморского псамма. Отмечс-но антигенное родство в иммунохимически* реакциях вируса с ХВК и BMEÍL

iïyj су мо в и рус ы (Cucuirovr-us). Г.-.¿у a р w'и_ _19 ^15 Г; ' Tomato spormy virus) обмару.чин на юге Придарского края [Чуян, Крыле к, 10791. Вирус выделяли по методике íГнутова и др., 1976). ТСА а

РДЦ - 1:128, в ИФА - 1: "000-1:6400. Неплохой иммуноген и активный антиген.

Вирус огуречной мозаики (Cucumber mosaic virus). Сравнительная антигенная характеристика 1~'-ти дальневосточных изолнтов вируса огуречной мозаики. Вирус обнаружен на лилии тигровой (Lilium tigrinum Her Gawl. ), эхинапии пурпурной (Echinacea purpurea L. МэесК ), томатах (Lycopersicon escuentum Mill., сорт Рев^рмун), бальзамине (Impatiens balsamina L. ), канне индийской (Canna índica L), тюльпанах 1 и 2 tTulipa hybrida hört.), нарциссе (Narcissus hybrydus hort. ), примуле обратноконической (Primula obconica Hance), гладиолусе гибридном (Gladiolo hybridus hort.), смородине черной (Ribes nigrum L.", сорт Приморский чемпион) и бобах (Faba bona L. ). Антивирусные сыворотки получали к четыре-* изолятам: примулы, гладиолуса, смородины и конских бобов. Для сравнительной характеристики дальневосточных изолятов использовали антисыворотки к ЮМ, полученные от доктора Г.Каневского (Польша), от д-ра ¡0.Рихтера (Германии) и от д-ра М. Ыусила (Чехословакия), который также аередал изолят ЮМ (clover blotch virus - CBV). Дальневосточные изоляты BOM проявляли слабые иммуногенные свойства Кммуногенность вируса повышали стабилизируя капсидные белки путем обработки формалином. Увеличение дозы иммуногена при иммунизации не стимулировало антителообразо-вакие.' Иммунный ответ усиливали с помощь» адъюванта Зреинда, а также реиммукизацией. Нам не удалось получить аотивные сьшоротки к изоля1ам из смородины и конских бобов, в то Еремя как к изолятам из примулы к гладио.иуса гибридного ТСА в сыворотках был довольно высок - в РД5 - 1:32-1:64. Все дальневосточные изоляты были объединены в одну серологическую группу, так как ь перекрест, Je реакциях показали наличие идентичных вирусспецифичных эпитоюв. Шгаммоспецифичные зпитопы были в^твлены только в реакции с антисывороткой к CBV (рис. 5).

Применение сенсибилизированных сыворороток к ВОМ белком А стафилококка повышало чувствительность реакции антиген-антитело в 100 раз.

Тобамовирусы (Tcbamovirus). Иммуногенные__и антигенные

свойства 16-ти изолятов вируса табачной мозаики. Ни один иэ ядентиф'щирсванных нами вирусов не имел такого разнообразия штаммов

- Й1 -

Рис. 5. Определение антигенного родства между дальневосточными и чешским изолятаыи.

В центральных лунках антисыворотка, в периферических - мзоляты ВОМ: 1,14 - из лилии; 2 - зхинации; 3 - томатов; 4,16 - бальзамина; 5 - гладиолуса; 6 - каины; 7 - хризантемы; 8,9 - тюльпанов 1,2; 10 - нарцисса; 11 - смородины; 12,18 - банана; 13,15,17 - антиген СВУ.

как ВТМ. Десять дальнеьосточных штаммов сравнивались по биологическим, физическим и антигенным свойствам со штаммами, идентифицированными в Европейской части, Казахстане и Японии. Ко всем штаммам были приготовлены монощташовые сыворотки (табл. 2).

Таблица 2.

Количество вирусного препарата (; ?/кг) и ТСА в РДД.

N Штамм Конц. вируса ТСА

1 Петуниевый 461 1 32

2 Кааахысий* 406 1 128

3 Ядерный "Т"* 92 1 32

4 Картофельный 186 1 2048

5 Нарцисса-216 170 1 32

6 Обычный* 144 1 64

7 Ириса 128 1 2048

8 Душистого табака 170 1 64

9 Подорожниковый* 64 1 64

10 11ифомандровый* 55 1 128

11 Ядерный "0"* 43 1 32

12 Белены 38 1 32

13 Фибриллярный* 25 1 32

14 Петлевидный* 16 1 32

15 :?арьки халкедснской 154 1 32

16 ¡1арцисса-412 80 1 128

17 Ятанский "ОМ 17 1 4

18 Пс-рцевый 42

*-штаммк, .предоставлеьныо Т. Подъяпольской (Ин-т общей генетики, Москва), японский отамм "ОМ" - Ю. ¡Куравлевым.

Индивидуальные и общие зпитопы для каждого штамма выявили в РДД и РИЭФ. Иэ данным РИЭФ был рассчитан процент родства между штаммами и штаммы по степени антигенной специфичности были разделены на три серогруппы.

1-ая: штаммы фибриллярный, цифомандровый, петуниевый, петле-ридный, нарциссовые, картофельный и душистого табака Капсидные белки этих штаммов имели весь набор штаммоспецифичных эпитопов и полученные к ним моноштаммовые сыворотки реагировали в перекрестных реакциях со всеми изучаемыми штаммами.

2-ая: штаммы подорожниковый, белены, зорьки халкедонской, ириса показали наиболее близкое антигенное родство между собой.

3-ья: штаммы казахский, обычный, ядерный '"Г" и ядерный "С", японский отличались слабой иммуногениой и антигенной активностью. В перекрестных реакциях отмечена невысокая активность в формировании иммунного комплекса антиген-антитело.

НепоЕируеы (Nepovirus). Антигенная характеристика 5-ти изола-тов вирусов короткоузлия и инфекционного, хлороза винограда (Grapevine fanleaf, Infection chlorosis viruses). Изоляты были' выявлены на виноградниках Украины С Милкус, 1982] на сортах,Шасла белая, Пино серый , Рипариа х Рупеотрис 3309, С-шьванер и Алиготе. Вирусы накапливали на Chenopodium amaranti-iíolor Coste et Reyn или на Gh. albura L. Симптомы, которые появлялись на этих .■астениях после еа\ ххеппя их кнокулшом из молодых листьев инфекционного винограда были идентична Очистку проводили по методу [Taylor, Hewitt, 19641 в нашей модификации. Самая активная антисыворотка была :.риготоо пена к ияоляту из Шаслы белой, ТСА -1:128, к изолятам Пино серый, '"Алиготе и Сильванер титр был ::32, а к изоляту из сорта Рипариа х Рупестрис 3309 самый низкий - 1: в по результатам РДД. Перекует ныл реакции в имк/нодиффузь- • выяви ли картину антигенного родства между изучаемыми пятью изолятами.

Вромовируса (Broirovmis). Вирус моаапии к :тра (Brome mosaic vil -з) обнаружен в Приморском ,_т>ае и Амурской области [Соколе i и др., 1077). Вирус идентифицированный на серобородникс размножал,! на ячмене еортог Винер и Примарский-99. Вьцц. л ли по методика [Hull, 19723 в нашей модификации. Выход вируса 15С-300 мг /кг. Хороший иммуноген. ТСА в РДД -1:2048.

Вирус мозаики вики однопзрной (Vicia unijuga mosaio virus) -истый для бывшего СССР вирус, идентифицирован на растениях вики однопарной в Приморском крае [Волков, Костин, 1989!. Этими же авторами идентифицировано три штамма вируса: некротический, пятнистый и мозаичный. По совокупности биологических и физико-химических свойств [Волков, 19891, а тают; по антигенной характеристике трех штаммов е'руса он был отнесен к бромовирусам. Вирус реагировал с антисыворотгай к ВМК.

Рабдовирус« (Plant rhabdovirus group). Вирус, вызывающий забо- ' лование злаков и кукурузы в Западней Сибири, был идентифицирован, как вирус вакукливания злаков, а подобное заиолеваниэ на Дальнем Востоке, itaii 'вирус мозаики злаков. (Штейн-Марголина и др., 19903.

Вирус вакукливания злаков (Oat Pseudorosette virus) отличатся слабовыражэнкой ишуногенностью ::апсидных белков, а чрезвычайная их лабильность при выделении, осложняло задачу получения специфических антител. Кроме того, вирус присутствовал в соке больного растения в низкой концентрации ССапоцкий и др., 19913.

Вирус мозаики з.^чков (Cereal mosatc virus). Забол'. аание обнаружено в Читинской области Восточной Сибири, Амурской области, Хабаровском и Приморском краях Дальнего Востока [Мамаев, 1992).

Физико-хими' гская и антигенная характеристика структурных бел-коп вирусов вакукливания и мозаики злаков. Диагностика ятю, дву* вирусов была затруднена из-за сходств симптомов. В сйяуи с гтим возрастала роль иммунодиагностики при идентификации этих вирусов и изучение капсидных белков для характеристики их свойств. Ранее антисыворотки нами были получечы к- препаратам, приготогленным из полевого материала [Минскзя и др., ЮЗ'/3.1 Эевусловно это стлалось на достоверности получаемых результатов.

Инмуногены, которые вводили xtooyhum, отличались низким содержанием белка Поэтому титры специфических актитеч быи 1:4-1:16; В последние годы, е раиоте о sthim вирусами испольао-вался лабораторный материал, что позволяло иметэ гарантированный контроли. Наилучшим тест-растением для накопления и газмнож;нин вирусов был овес. Растения опгз взращивали ь теплице и инфицировали с помощью вирофорных цикадок (Lao-Jelphax ütriat^llus Fall,). Для выделения растворимого антигена (РА) ¿изкомолекулярного вн-

русспецифичного бежа использовали метод изоэлектрической преципитации С Атабеков и др., 1965] в нашей модификации. Элеютсфэро-зом в ПААГ в препаратах РА ЬЮ был обнаружен белок с мол. массой 15-16 кД. отсутствующий в препаратах ¡233 и соке вдорозых растений. Ото быто для нас несколько неожиданным, так как в литературе были данные о присутствии такого белка в ВЗЗ í Минская и др., 1987]. Кроме того, мол. масса обнаруженного нами РА ВМЗ была примерно в два раза меньше, чем было описано этими авторами для ра ; в и взз.

При выделении очищенного препарата РА ВШ мы обратили внимание на то, что при рН 4,8 - 5,0 в основном осаждается белок с мол,, массой 15 - 16 кД. На последних стадиях очистки при достижении атого рН в растворе помимо номутнения возникало двойное лучепреломление в потоке, и при анг^изе тагаго препарата в оптическом микроскопе тбждали игловидные кристаллы. Подобной конфигурации кристаллы описаны в литературе (Шпова, Атабеков, 1665) для ЕЗЗ. Выход РА ВМЗ - 1мг/кг. Этим препаратом иммунизировали кроликов, и сожалению, этим методом нам не удалось выделить РА ВЗЗ. Мы склонны предположить, что концентрация его з исходном материале настолько низка, что метод не осаждает вирусный белок. ТСА в РДД против РА ВМЗ был 1:32, в ИФА - 1:3200- 1:6400. С помощью 1Ш ь;ам удалось выявить 0,01 кг РА ВИЗ в очищенном препарате, а в соке инфицнроваьного овса - ЬД х 10^. Этот результат явился веским доказательством того, что приготовленная антисыворотка, позволяла четко идентифицировать ВМЗ, что очень ьа/.ио при контроле инфекции на раннга стадиях и при подготовке материала к ьыделению структурных компонентов вируса.

При исследовании структурных компонентов бежа ВМЗ был обнаружен белок с мол. массой 29,8 кД, юторый осаящался высокоскоростной центрифугированием и который отсутствовал в здоровых растеьлях. Этот белок был условно обозначе; нами как "нерастзо-римый антиген" (НА). Спектр поглосения препаратор НА ВМЗ в УФ области был типичен для нуклеопротеидов и имел максимум при 260 а«, а минимум при 240 нм. Соотношение А 260'280 было 1,4. НА ВШ г непрям ч варианте ИФА реагировал с антисызороткой приготовленной к РА ВШ, что указывало на родство' структурных белков, а ■гак*е -подтверадио способность антисывороткл выявлять ЫЗ

По своей мол. mccft ГА FAß наиболее близок М-бе.яку ряда Фито-рабдовирусов, относимых к подгруппе везикуловирусов - вируса северной мозаики з/аков CToi iyana, 1986], вируса декрет..ческого пожелтения салата латука и вируса осота С Mead, 19623. Мэтодом РИЗ®, в которое использовалась алтиеыворотка к вирусу северной мозаики злаков, полученная от д-ра КХШироко (Япония), било выявлено антигенное родство между вирусами мозаики и северной мозаики маков (ВСЮ). Сходство ВМЗ h¿BCM3 по морфологии и круг; растений -хозяев, их взаимоотношении с переносчиком [Мамаев, 1992], наличие общкх белков и идентичных эпитопов капеидных бол-ков указывало на то. что эти два вируса очень близки и вероятнее всего рабдовкрус, идентифицированный на Дальнем Востоке, является ье самостоятельным вирусом, а иэолятом вируса северной мозаики н лаков.

Некрсвирусы (Mecrovirus). При обследовании декоративных растений в цветоводческих хозяйствах Приморского края на нарциссах с симптомами хлоротичной игериховатостя впервые на Дальнем Востоке был выделеи вирус некроза табака (Tobacco necrosis viras). Дальневосточный молят по физическим свойствам был стабильнее изолятор, выделенных из тюльпана в Латвии [Цутнаэргле, 1 ' ''6] и примулы в ЧСФР СМосга, 1960]. Вирус достаточно хорош накапливался в Ch. quinoa. Cucumis sativus L., сорт Дальневосточный, Phaseolus vulgaris U, и табаке сортов Самсун и Ксанти. Вирус выделяли по методике [СибирякоЕа и др., 1987]. Вирус хороший иммуноген. Йзедек. ; микродоз (200-500 ыкг) при подкояиых и внут-риколиых способах введения позволяло олучить антисыворотки с титром 1:1024 в РДД.

Ксмзвирусы (Comovirus). Большинство вирусов этой группы объединено по общим антигенным свойствам. Вирус мозаики редиса (Radish mosaic virus) идентифицирован ни юге Приморского края ( Крыло' и др., 1975]. Известны два граммам вируса - америка. но-японский или тииЛчный и европейский. Выход вируса г висел от растения, которое испольаовали для его накопления. Из редьки и лобы получали 50-100 мг/кг, а из хибинской и китайской капусты -3-5 мг/кг. Tànoe же небольшое количество вируса выдели гч из лобы и редьки в летние месяцы. Вирус - неплохой иммуноген. ТСА в РДД . .1:ЗГ 1:64.

Кеюассифицированный вирус, знгывавдий симптомы штриховатой иозаики ка рисе. На посевах риса в Приморском и Краснодарском краях было зарегистрировано заболевание с симптомами игрихсва-7 ост и [Немилостива, 1978]. Шмуногеном для получения антисыво-роткк служил препарат вируса, который выд"тали из полевого материала В основу -методики очистки был взят метод [Sydzuki. Kímyra, 1S6QJ. ТСА в капельной агглютинации был 1:2048, что сви-детельствоваяо о высокой иммуногенной активности капсидного вирусного белка Антисыворотка 'к японскому изоляту вируса шгрихова-тости риса, полученная от д-ра Р.Нисимото, четко реагировача в перекрестной реакции с дальневосточным изолятоы. Это свидетельствовало в пользу того, что приморский изолят по антигенньш свойствам u-teeт родство с японским.

Карлавирусы (Carlavirus). Оценка антигенной специфичности Ми s-вирусов картофеля. При идентификации этих двух вирусов и их даашюв нередко возникают сложности в иммунодиагностике из-за перекрестных реакций между ьирусами и антисыворотками, приготовленными к ним. Для изучения антигенного родства ЫВК и SBK использовали РДД, РИЭФ И ИЭЫ Иммунодиффузионные тесты показали Слизкое серологическое родство меаду ними. PH3v установлено количество гомологичных эпитопов, что составляло bóZ. Ш при ИЭМ наблюдали сорбцию на поверхности внрионов только специфических антител, то есть никаких перекрестных реакций между ЫВК и антисывороткой к SEK и наоборот обнарулэно не было. Применение этого строго специфичного метода весьма полезно при точной диагностике этих двух карлавируьив.

IV. ОСНОВНЫЕ ЗАШШЕРЮСТИ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛШШНАЛЬНЬ£Х АНТИТЕЛ К ПОВЕРХНОСТНЫ".' ЭПИГОНАМ КАШИДНЫХ БЕЛКОВ.

Научали зависимость иммуногенности каисвдви.. белков от неспе-цш^иеских факторов иммуногенез (дозы иммупог'ена, способа bbl дения, схемы иммунизации, применения адъювантсв, реиммуниэацил). Большой фактический i. ;тергал, накопленный нами, сыидетельствовал а пользу того, ' что введение больших г^з не обязг :ельно ведет к получению антисывороток с высокой концентрацией специфических антител (табл. 3). Наиболее зфг|ективн" вводить живошым кммуио-

Таблица 3

Влияние иммунизирующих доз на титр антисывороток

ВИРУС Способ ьзедения йммуногена* Лоза иммуноге-на в мг** Количество инъекций !!а>ссккаям!и<? тип' антисывороток (обратные величины)

РДД к t J

Ь/К0Н,В/К,Я/К 0,72(0,04x3;

0,03x3; 0,012x3) 9 2043

ХЕК В/К, П/К 0,3(0,2x4) 4 2048

В/К, Я/К 0,4(0,1X4) 4 2048

ВГЫ Э/'К, И/К 0,8(0,2x4) Г',/кон, в/к,п/к О,О,?.-/1)

512 51?

1:1194,7+451,5 1:1706,7+341,3 1:15,36+512

1:426+ 85,.3 1:34173+85,3

ВНТ

и/К, П/К В/К, П/К

L'/K, П/К в/к,П/К в/м в/м

В/3

в/в в/с

В/к, п/к

О, В5(0.15; 0,7) 4,65v0,15;0,3

8; 2.4) 0,6(0,2x3) 3(1x3) 0,6(0,2x3) 3(1x9) 0,6(0,2x3) 3(1x3)

15(0,1; 0,2; 0,3;

0,4; 0,5;) 1(0,5x2)

2 32

4 128

•л 2048 1:1194,7+451,6

3 256 1: 213,3+42,7

3 256 1:170,7+42,7

3 20489 1: 74,7+38,2

3 128 1:1706Г?" "451,3

3 2048 1:13,-3+2,7

5 16 1:1706,7+341,3

Z 2048 1:1194,7+451,6

• В/В 3(1x3) 3 16 1:13,3+2,7

ВАЫК в/К, П/к 3(1x3) 3 8 1:18,7+5,7

в/и 3(1x3) 3 32 1: 6,б+Г,4

ВМН в/п, п/к, в/в 2.5(0,^;1;1) 3 2048 1:1706,7+341,3

в/в .5(0,89; 09; 1,8) 3 256 1:213,3+42,7

ВМЬ'К в/м 3,5(0,3;0,9;1,8) 3 253 ' 1:149,3+56,4

в/м 3,5(0,8; 0,0; 1,8) 3 12В 1:106,7+21,3

0/К,П/К,В/Б

ВКПГ

В/В

в/к

В/",

в/м

2,5(0,5; 1;1)

2,5(0,5;1;1)

2,5(0,5; 1;1)

3(1x3)

6(2x3)

9(3x3)

.1x3)

3 3 3 3 3 3

з-

512 128 32 32 64 32 128

1:426+85,3

1:85,3+21,3

1:18,7+5.7

1:26,7+5,3

1:83,3"

1:21,3+5,3

1:190677+21,3

ШВОи в/к,п/к,в/й 2. 5(0. 5,1,1) - 1:512 1:426,7+.95.3 ВМВОм -М- 2.5 1:128 1:85,3+21.3

ВМВОП -"- 2.5 1:32 1:18,7*5,$

* - в/в-внутривенно, в/м-внутримышечно, в/кок-внутрша...ъюкгизно, п/к-подкожно,з/к -внутрикожно.

•» - Зе. скобкой - доза вируса за весь цикл иммунизации; в скобках - количество чируса за ому иньекцию.

ген дозаш от 100 - 500 м.<г до 1 чг. Это упрощало схему иммунизации, сичлало возможность продукции побочных антител, вело к сокращению расхода иммуногена.

Не вь-зызает сомнения и тот факт, что иммуногенность вируса повышается при введении его в смеок с адъ"!вантом. В связи о этим нами были изучены- адыованткые свойства желатины,' альгината натрия, сапонина, бентонита, полиэтиленгликоля, глицерина, и водно-масляных эмульсий, полученных в ТИБОХ ДВО PAIL В качестве микробного компонента использовали клетки сине-зеленой водоросли Mycrocystis aeruginosa L. и липополисахариды (ЛПС) из водоросли Masticocladus laminosus L., а также аналог адъюванта Фреинца, приготовленный самостоятельно (табл. 4 ).

Таблица 4

Влияние адъювантов на антителообразование при иммунизагда животных Х-вирус ом картофеля.

Адъюаанты Доза иммуногена, в мг Титры антисывороток ( обратные титры )

Ш* КА**

- 22 64 512

Сапонин 22 2048 8192

Альгинс.. натрия+желатин 22 128 2048

Адъювант Фрейнда 1024 2048

Бентонит гг 512 8192

Шлиэтиденгликодь 22 128 2048

Аналог адъюванта Фрейнда 22 2048 2048

- 0.4 32 256

Водно- мае лянна- эмульсия

с клетками синезеленой 0,4 128 1024

водоросли Mycrocystis

aeruginosa L.

Водно-масляная эмульсия

г ЛПС водоросли Masti'o- 0,4 512 1024

oladus la Mnosus L. .

* - реакция двойней ишуноЩхрулин i лгар

** - капельная агглютинация на предметных стеклах

Во всех окспйриментах отмечен более высокий иммунный игьет те-астных на ьведеиие с» ■■си иммукоген-адъшант по сравнению о контрольной груыюй,- которой ькрус вводили без адъювй»""а. ТСА в кроем иммунизироьанных хиготных У, Ы и Б-вирусами картофеля увг-яи-

- ЕЭ -

чивался, если в качестве адъюванта к иммуногену добавляли 50% глицерина Но кролики плохо переносили введение згой смеси. Отмечено, что адъювантннй эффект испытанных веществ не. галео полно реализовался при подкожном и внутрикожном введении. Внутримышечные инъекции были менее эффективны. Применение адгювантов стимулировало процесс антителообразования на г.сех стадиях иммуногенеза; высокая концентрация антител в кров/ экспериментальных животных отмечалась уже на ранних стадиях после введения иммуноге-на. нзблюдался продолжительный период нарастания антител и медленное их снижение.

Для фитовирусов вопрос о влшнии способа введения иммучогена на иммунный ответ животного изучен очень слабо. Наши результаты, основанные на получении антивирусных сыворбток к более 60- ти вирусам и их штаммам позволяют отдать предпочтение внугричояею-му. подкожному м влутримъдачнок/ введению вируса. Внутривенный способ, которым раньше пользовались довольно часто, имеет существенные недостатки: иуыулоге.ч вводигся без адтюванта, а глазное, происходит большая потеря вируса прежде, чем он достлгнет селезенки животного От внутрибрюшкнннх инъекций сли /^гет вообще отказаться, так как перестали вводить животным частично очищенные препараты вируса. ВнутриконьюктиБный способ не оправдал надежды при полу мши антисывороток к ХВК и ВТМ. Бн>трчкожиый способ позволял вводить микродозы иммуногена непосредствен•> в мгета расположения пимфоувлов (подколенную ямки, паховые области, вдоль позвоночника, боковые цоьерхности тела животного), что почти не приводило с потере вируса. Этот , способ эффективнее внутримышечного, так как в первом случае происходит высвобождение небольших количеств иммуногена 'лъ м-.ог'/х участков значит-зль-1ю быстрее, чем освобождение большого объ?ма и:; одного места (табл. 3). Практически можно исполььовать любой способ введения вируса, если он сильный имыуноген.

При получении поликлокальных антител следует учитыв.^гь еще один важный Фактор как последовательность югьекциЯ л их коли' чеетзо. В литературе много сообщений о той или иной исключительно эффективной схеме иммунизации. На в большинстве случзйв другие исследователи эти данные- не воспроизводит. Ш предлагаем схемы иммунизации, используя собственный опыт. Разработано пять

схем иммунизация для вирусов различной иммуногенной активности СГнутова, 19853. Приведи наиболее универсальную, пригодную для большинства фитовирусов.

1-ый день -1Со-1000 мкг вирус+адъювант вкутригамга 8-ой день -£00-1000 mît - - подкожно

15-ый день -200-1000 мкг внутримышечно Через 45-60 дней реиммунизация дозой до 1000 мгк внутримышечно или внутривенно. Доза вводимого иммуиогена может быть изменена с учетом индивид, альных особенное"ей вируса

Довольно слабо освещен вопрос в литературе о роли реиммуниза-ыии. Проведенные нами эксперименты с ХВК и ВТК, а затем и другими вирусами показали, что реиммунизация - обязательный прием, способный после ¿[азы относительного угнетения, быстро спровоцировать нарастание антите." в крову иммунизированных животных . Было установлено, что интервалы между иммунизацией и реиммуниза-цией могут быть самые разнообразные, в зависимости от поставленной задачи,' от 30-60 до 150-540 дней. Вирус вводить лучше всего в количестве не меаее 1 мг, если перр/чный титр антител упал до 1:2-1:4. В случае исходного титра 1:64-1:123 достаточно единичной дозы 100-200 мкг.

Итак, исследована роль пяти приемов способных влиять на имму-ногенность капсидных белков и изучены механизмы их взаимодействия.

V. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛШ ИМЕННЫХ ЮАИ1ШГН0ШЕНИЙ ВИРУСОВ И ИХ ШТАММОВ -ОДИН ИЗ ГЛАВНЫХ КРИТЕРИЕВ КЛАССИФИКАЦИИ:

По современной классификации одним из критериев, объединяющих вирусы растений в определенную таксономическую группу является наличие идентичных эпитопов у отдельных членов этой группы СМетыиз, 1973; йданов и др., 1981, Крылов и .л>., 1987]. Ф. Боуден £1952] впервые предложил использовать анти. енные свойства вирусов для объединения их в группы. Ito его с хек,о было выделено 17 антигенных типов. В нас оящее время антигенные взаимоотношения определяется с помощью иммунохимических реакций. Результаты, полученные в перекрестных реакциях, благодаря развитию в последние годы методов молекулярной биологии, стало возможные дополнить и подтвердить методами пептидного картирования, трансляцией ей-

рус к их РНК in vitro, секвенированием. Последние били нами привлечены • при характеристике группы потивирусов для более точной классификации новых, ранее не описанных вирусов.

Вирусы традесканции бедоцветковой и мозаики клевера горного - новые представители группы потивирусов; Для доказательства принадлежности к группе потивирусов не описанных ранее ВМКГ и ВГБ провели сравнительное изучении физико-химических и антигенных свойств депяти потивирусов. Структурные белки ВМКГ и В^" сравнивали с белками ВОТ - типичного представителя потивирусов. Ограниченным протеолизом в геле папаином были выявлены тяжелые полипелтиды с мол. массой 38, 34 и 36 кД ( соответственно для БИТ, ВГБ и ВМКГ).. Отмечено, что основной белок у этих вирусов расщеплялся евдэ на 9-12 полипептидов. При этом, 6-7 иь них по подвижности совпадали ^ всех трех вирусов, что указывало на гомологию структурных компонентов и свидетельствовало о родстве между вирусами. Вероятнее всего, пептиды имеющие аналоги, является промежуточными продуктами гидролиза

При сравнении РНК пяти потивирусов: ВГБ, ВМКГ, БШ1, ВЖКЛ и ВЖЫФ, электрофоретический анализ показ -.л наличие одной воны с мол. массой 3,г. 3,6 х 10^ Д, что находится в пределах мол. масс Р«К потивирусов. 3 системе лизатов ретикулоцитов кролика транслировали РНК ВШ1>, ВТВ и ВМГ. РНК ВМ5 и ВТВ in vitro синтезировали гетерогенный набор пептидов с мол. массой oi 200 до 14 кД. Тяжелые полипелтиды вероятнее всего являлись белка-ми-предшественникгчи, из которых синтезировались вирусспецпфи-ческие белки [Dougherty et al., 1985; У ong et al., 19883. Пептид с мол. массой 75 кД соответствовал белку цитоплазматических включений, что довольно характерно для потивирусов. Среди про- • дуктов трансляции РНК ВШХ> был обнаружен пептид с мол. массой 30 кД, что соответствовало оелку оболочки. В отличие от ЛИ ВЖЬЙ> РНК ВГГ при трансляции in vitro не кодировала белок сходный с мол. массой бедкг оболочки. РНК ВГБ Кодировала два низкомолекулярных пептида с мол. массами 15 и 14 кД, которые отсутствовали среди продучтов трансляции РКК ВШ&. Не исключено, что эти два пептида являйтся продуктами деградации белка ВТБ.

Полученные нами данные о капсидных белках и РНК вир^соз ВШ$, ПМТ, ВМКГ и ВТБ послужили ¡аденным гарантом свидетельствутдаи- о

принадлежности ВМКГ и НТВ к одной таксономической группе. Сравнение первичной структуры родственных белков исследуемых потиви-русов было продолжено при выявлении идентичных эпитопов капеид-иых белдав иммунохимическиии методами, которые показали наличие у всех вирусов группоспецифичных эпитопов (рис. ?).

Гис. 6. Еыявление группоспецифичнчх эпитопов у потивирусов РИЭФ. В геле антисыворотка к АВК в разведении 1:30, в лунках вирусные препараты с кон-цетрацией 1 мг/мл: 1-ВМС, 2-ВЖМФ, 3-ЕШ, 4-УВК, б-АВК, 6- Ш, 7-ВТВ и к-кокт-• роль.

Е 432 2Л

ал

ЗА

га ао te 1.6 м , ta to.

.im

a-A

Рис. 7. Определение антигенных взаимоотношений потивирусов непрямым - чриантои ИФА.

Система УВК; вир/с I - УВК, i. - ваш,

III - BT'JI, IV - BW,

V - АВК, VI - ET Б,

VII - В№. VIII - БМГ и IX - ВШ

SO 33 6 S О?! ОА2

С Аг^пкг/мл)

Для повышения специфичности иммунохиыического анализа использовали при выявлении эпигонов ДАСМ, п,. ¡-.меняя в качестве первичных антител F(ab)2 -фрагменты кроличьих антмел, мышиные и куриные IgG. В случае использования F(ab)2 -фрагментов неспецифических реакций избегали, сенсибилизируя платы протеином А, который специфически связывался с Fc-фрагментом IgG. Высокая чувствительность и строгая специфичность ДАСМ (рис. 8) позволили выявить вирусспецифические эпитопы с высотой точностью. Однако, следует заметить, что использование F(ab)2 -фрагментов кроличьих антител целесообразнее при репояин задачи по повышению чувствительности и специфичности по сравнению с мышиными и куриными иммуноглобулинами, приготовление ¿сотормх требует определенных усилий, затрат и навыга, в то время как чувствительность метода не повышается.

Рис. 8. . Определение чувствительности ДАСМ ЙФА при ,использовании первичных антител от р.¡¿личных кивотных. 1) F(ab)2~ Фрагменты кроличьих антител (5-Ю нг/мл), 2) ыыаиные' I -¿s (20-30 нг/мл), 3) куриные I&G (5С- 60 нг/ мл), 4) сок ' здоровых растений сои.

Конкурентным вариантом ИФА было определено антигенное родство потивирусов в процентах (рис. 9). УВК и АВК имели от £0 до 60% идентичных вирусспецифичных эпитопов, ВМС, ШГ, ШГ, ВТВ от 10 до 40% и самый высокий процент отмечен для БЖКЛ и ЕШ> - от 70 до 902.

Рис. 9. Кривые конкуренции. Система УВК: а) YBK, б) М, в) ВШ, г) ВИС.

Р'чусы аукуба мозаики картофеля и мозаики подорожника азиатского - типичные представители группы потексвирусов. При характеристики трех штаммов ВША нами был, отмечено антигенное родство в FM не только меаду- атяммами, но и с другими представителями потексвирусов - ХБК ч ШБК, которые имели наибольшее в процентном отношении чис.л идентичных группоспецифичных эпитопов. Eho давал- основание сделать вывод о принадлежности ВША к потекевируеам. О карла-, поти-, тобамо-, бромо- и комодирусами специфические слтитела к БМПА ь перекрестных реакциях имуунохими-

ческого анализа не реагировали. Кроме того, сравнительно недавно А. Соловьев с сзавг. £1890] провели исследования по изучению перьичной структуры генома этого вируса и сравнили ее с известными первичными структурами других потексвирусов. В результате сравнения аминокислотной последовательности участка предполагаемой РНК-по^;мера?н ВШ1А с аналогичными белками потеке в ярусов была выявлена степень гомологии между ВША и вирусом мозаики папайи. Итак, антигенные и физико-химические характеристики капеид-янх белков дальневосточного нзеляга ВША позволяют считать вирус НстИн:1ыМ ЧЛеНом потексвирусов.

11а>д не известны работы по классификации ВАШ как действительном »¡лона группы нотежвирусов. Кммунохимический анализ капсид-них бг-штав Четырех потеговирусоз - ХВК, ВМБК, В1ШГ и ВАМИ, проведенный с помоцью РДЦ, Р'ЛЭФ, АВВ-теста, ИФА и ИЭМ, позволил по лучить даг!кые об ентигенном родстве этих вирусов (рис, 10).

Этими методами выявлены вирус- и группоспецифичные эпитопы. Дге количественной оценкч группоспецифичных эпитоиое* Скл йсио.тьздван конкурентный вариант ИФА. Степень родства между по-тексвирусачи оценивали по конкуренции при 501 ингибировании 1>е-акцик сорбированного антигена с гомологичной сывороткой и рас-' с':чтывали по формуле; % родства -1е(5-1/1д(3-2 х 100, где I {*&-!: концентрация гомологичного конкурентного антигена при 50 »-оы ййгибировании, концентрация гетерологичного конкурентного

антигена при 5Сг,-ом ингибировании. Лунные представлены в табл.-б. ¿1.О

Таблица 5.

Степень антигенного родства по результатам конкурентного варианта ИФА (в процентах)

Снста ,:а

Вирусы

ХВК

ЕМБК

ЕАЙЧ

ВКПГ

хьк

&и£К вщ

ВКПГ

С 3,(1/ 20,0

100

95,5 1и0

100 £4,0

66.1

39,5

?«.3 41.7 24, Ь 100

Рис. Ю. Декорирование шрионов антителами в гомо- и гетеросистемах методом ИЭЫ.

д) система ХВК,

е) вирионы ВАХЖ,

ж) система ВАМК,

в) смесь препаратов

ВАШ и ХВК с антисывороткой к ХВй

Процент идентичных группсепецифичных лиге -»а для исследуемах по.,ксвирусов составил - 00% для ХВК и ВМБК, наименьший для ВКГТ - 402 и промежуточное положению занимал ВАМК. имеюс.й до 602 родственных зпитопое о долгими потексвирусьми. Учш данные . ласуюгся с и*эуаьтатами, полученными физико-химическими методами при выявлении гомологичных структурных комлоненто« белков зти.ч ЧМЫреХ вирусов г 1386].

- -

Дальневосточный и европейский изоляты вируса огуречной мозаики - два серотипа родственных вирусу аспярмии томатов. При изучении антигенных свойств 13-ти дальневосточных изол :ов ЮМ и ВАТ, -выделенного из хризантемы, мы показали наличие у яих вирус-и группоспецифичных эпитопов. Сравнительная характеристика дальневосточного штамма ВОМ и европейского, любезно предоставленного Э. Андреевой (Ин-т обще генетики, г. bfccima) и ВАТ, латвийский изоляг, полученный от Л Дзиркале, была проведена методами РДД и РИЭФ. В РДД было показало частичное антигенное родство штаммов ВОМ. РИЭФ группоспецифичные эпитопы, характерные для кукумови-русов были выявлены у двух штаммов ВОМ и латвийского изолята ВАТ. Причем, ВАТ по антигенным свойствам был ближе дальневосточному, а не европейскому штамму ВОН Нэпрямыл вариантом JMA в каждой системе исследуемых вирусов получены кривые титрования гомологичных и гетерологкчных вывороток. Одинаковый характер кривых титрования указывал на антигенное родство среди исследуемых кукумовирусов. Шрядок расположения кривых подтверждав результаты РИЭФ о более <5диз!сом антигенном родстве ВАТ с дальневосточным, а не европейским серотином ВОМ.

Вирус мозаики вики однопаряой - нозый бромовирус. В перекрестных реакциях между исследуемыми штаммами и моногатаммовыми сыворотками в ^ДД выявлены вируеепецифячнш элитоьи Штаммы не отличались по алтигенной специфичности, по имели различную [„чму-ногенную активность. Для изучения антигенного родства с вирусами других таксономических групп были использованы ВМК, BOU, ВНТ, вирус крапчатости клевера красного и BMP. Не отмечено перекрестных реакций в имьунодиффузионных тестах, что свидетельствовало об отсутствии родст-а между ВМВО й некро-, ■ комо-, кукумоьирузь-ми. В то время как штаммы ВМВО рекротический л мооаичьый • четко реагировали в перекрестной реакции с антисывороткой к ВМК. Этот факт указывал на присутствие идентичных группоспецифичных эчи.то-пов у обоих вирусов. Дзнькй результат явился подтверждением исследований С Волков, 1S89J по включении ВМВО в ГРУППУ бромови-русов. •

Дальневосточный и амерккапо-японский - идентичны* касляты типичного штамма вируса мозаики редиса. . Изолят, рыдел^няый в Приморье, в РДД показал реакцию идентичности с аятисмворотхой'про

тиб американо-японского изолята, полученной от д-ра Ф. КямпСелла По данным зтого исследователя ССатрЬе11, 1973] вирус в естественных условиях трудно отличить от вирусов морщинистой и ¡кслтой; мозаики, а такзкс- розеточности турнепса Поэтому диагностика этих вирусов без применения глтисывороток затруднительна В ситуации определения таксономической принадлежности дальневосточного изолята к комовирусаы, вирусы желтой мозаики и розеточности исключались, так как они заражают растения только сем. Капустных, а над йзолят кроме растений этого сем заражал также растения сем. Бобовых. Тыквенных, Пасленовых и Амарантовых. Разница была отмечена и при определении точки термической инак.ивации и предельного разведения инфекционного сока Кроме того, Дг.р И. Хэллингс сообщил, что наша алтисызоротка не реапфовала с вирусом морщинистой мозаики турнепса

Наличие з капс.дных белках идентичных вирусспецифичньк эпигонов у дальневосточного и американо-японского изолятов наряду с данными, полученными по физико-химической и биологической характеристике [Крылов и др., 1030; Сапоцкий, 19913 позволяют отнести дальневосточный изолят ВНР к типичному, а нз европейскому штамму.

Латрийские и дальневосточные аооляты вируса некроза табака -родственные, но не идентичные штаммы. Сравнительное исследование антигенного родства в тест-системах пгггшов ВНТ выявило в капсидных белках вирус- и шташоспецифичные эпитопы. Данные, полученные с поиошяп РлЕ свидетельствовали о частичном антигенном родстве дальневосточного и латвийских, изолятов вируса Наиболее близок по антигенпш свойствам к назему изоляту был латвийский взолят, выделенный иэ растений огурцов, а не почвенные изоляты.

VI. РЕЗУЛЬТАТЫ СРАВНИТЕЛЬНОЙ УАРАКГЕРЙСТК.М КШУШХМЛГЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ КА1ЮЩЩХ БЕЛКОВ Ш ИЗУЧЕНИИ БИРУСОВ РАСТЕНИЙ

Клагсгческис методы иммунохимического анализа (реакция агглютинации, прэцщмгации) нз ранних этапах изучения р.иоусшлс бож-з-

ней растений благодаря своей специфичности способствовали выявлению вирусов, накапливающихся в растениях в высокой концентрации и стличзщихоя стабильностью. Однако чувствительно 'ь этих методов невысока и поэтому в настоящее время их. применение ограничивается лишь предварительной оценкой присутствия вируса в соке. Правда, до сих пор благодаря специфичности и наглядности применяется ышсромодификация РЯД, которая является неплохим предварительным диагностическим тестом при определении титра специфических антител в сыворотках и при определении в перекрестных реакциях идентичных эпитопов «галоидных белков.

К сожаления, в практике отечественных фитовирусологов другой простои 11ммунохимический [.йтод для количественной оценки белков, котормм является РИД, почти не применяется. В то время как за ру5е«ж эта реакция ллроко используется благодаря коммерческому подходу к производству мираловых пленок, покрытых тонким слоем агарозы (Фирма Мы no Colloids, Rocklanxl, США). Чувствительность метода йьшю РДД и составляет 0,1-0,05 мг/мл. Иэтод позволяет определять концедтрации вирусного белка в соке больных растений. Так, по нашим данным ВЖ присутствует J соке из листьев ячменя в концентрации иг/мл, ВОТ в семядольных листьях огурцов - 0,63 ('"/мл, в соке из листьев фасоли -0,634 мг/ш. ВЫЮ в союз листьев бобоз - 1,2-2,1 мг/мл ( в зазисидости от штамма).

Для выявления эпитолоз калсидных белков был разработан для работы с исследуемыми фитовирусгли довольно точный и чувствительный метод РИ?Г. Строгая специфичность, чувствительность (до 100 яг/мл), наглядность и.относительных дешевизна необходимого для постановки оборудования привлекли наш внимание.

й&М - высокочувствительный, экономичный тест, обеспечивающий уверенную диагностику лабильных вирусов, а также вирусов, присутствующих в соке инфицированных растений, в семенах, корейках, ! остках растений и у насекомых-переносчиков в низкой концентрации. ~ ■ ■

Наиболее значительные современные достижения связаны с выявлением вирусных антигенсв с помощью методов, обнаруживающих не вторичный преципитат, а комплекс антиген-антитело, сформировавшийся в результате первичной иммунохимической реакции, !согда ддц г-рвышс$ия чувствительности зализа в состав одного из кемпонен-

тсв вводят специфическую метку (молекулу флуоресцирующего красителя, радиоа-сгиьнуь, либо ферментную метку). &ги высокочувствительные узтоды отвечает требованиям четкой специфичности, точности, окспрессности и автоматизации. В настоящее время в фито-вируеологии прочное положение занял ИФА. Появилась возможность ранней диагностики, вирусной инфекции в юлевых условиях, что имеет важное экономическое значение. Влижайшие годы будуг, несомненно, ознаменованы поисками новых фермент-субстратных систем, позволяющих максимально реализовать чувствительность ИФА.. несмотря на то, что методом можно выявить нанограммовые количества вирусного белка. Различные модификации ИФА позволяют применять метод для титрования вирусов и антител, выявлять проценты идентичных эпитопов, проводить обнаружении структурных вирусных белков.

vii. коммерческий шшюдал?н(х!тикуш л их роль при создании БАЗЫ БЕЗШРУСКОГО РаСТЕНКЗВОДСЦВА

Изучение различных теоретических и экспериментальных подходов к конструированию похиклональных сывороток, получение которых осноьано на применении природных антигенов, тр есть каиоидных белков с гл ними эпиюпами, способствовало широкому внедрению иммунохиыических методов исследования в фитовирусологию, молекулярную биологию, клеточную и генную инженерию. Успехи биотехнологии дали возможность интенсивному развитию И<ьА, РИА и др. методам "второго" поколения, гюоколису с помодаю современных физико-химических методов бигаполучет,.1 высокоочищенные антигены, ранее малодоступные исследователю, а такжэ ферменты-маркеры и гх конъюгаты с антителами. С помощь» :<леточноГ инженеры: открыты мэноклональш ■ антитела с ладанной специфичностью и аффинностью. Проьтста исполнения, доступность, стабильность реагентов, вов-мочость автоматизации обеспечили. прочное положении соьрем<=(шой количественной иммунохимии в фундаментальных и прикладгмх «ee.it'-;:о: ниях.

Организация промы-Лен ^го Производства ангнтел, меченныу личшми маркерами и иммобилиаировадньс на самш раднооора^яьх нои'г.*дтх. .обеспечили базу для развит/я современной ^о.пии^от^н-

кой иммунохимии. Стабильность ингредиентов для иммунохимических методов "второго" поколения позво тот перевести их на промышленную основу. В результате возникла по:; мощность коммерческого 'Обеспечения реагентами: иммуноглобулинами, моноклональными антителами, конъюгатами. В фитовирусологии открылись новые возможности для изучении тонкой структуры эпитопов, ечтигенннх свойств структурных белков, исследования их антигенных взаимоотношений с целью идентификации и классификации.

Более 40 лет для отбора бззвирусного материала з селешдаи и семеноводстве сельскохозяйственных растений применяются антивирусные сыворотки, полученные против различных заболеваний картофеля, сои, бобовых, оврщных, декоративных, ягодных и др. культур. На Дальнем Востоке в Биолого-почвенном институте ДВО РАН создана база для приготовления кошерческих партий диагностических сывороток более 20 лет назад. Шллионы анализов были проделаны с их помощью, в основном, для отбора безвирусного матери-ада картофеля.

Внедрены технологии, позволяющие получать коммерческие препараты полигональных антител для диагностики вирусов, поражающих картофель, сою, злаки, овощные, деютрэтив1.,.е культуры.

Рассматривая проблемы прикладной фпгонирусолзгии чу^ю злклп-чг.ть, что проблема оздоровления от вирусов в растениеводстве в какой-то степени близка к разрешению. Однако успешная ее реализация возможна лишь при условаи внедрен:« результатов, получен-нчх б области фундаментальной фитсвируйоло^ик, мси.окуля?иоЯ •Экологии, иммунохимии и др.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Прогресс современной фитовирусологии, гораздо сильнее, чем другие биологические науки сгяэаг с ра£вчт;:ем метэдег »; работе использовались новь-е подходы по отработке фигикт-х/лич^-оои мг<-, •тодоб по выделению вирусспециф;л»скиу белков, схем иммуки.^чпий, испытанию адъкщгштного эффекта рагличних ■ хиии^сг'л.ч ъешоав, 1Ю"В0ЛИБИ!ИХ решить задачу, овяэанн^то с получение* пазиклеис^ьных иятител строгой специфичности Выяснения механизма продукции по-

ликлональных ант отел под влиянием ^специфических факторов иммуногенеза решили проблем получения специфических антител к калсидным белкам различной иымуногеипой активности.

Разработанные л модифицированные методики постановки РИЗФ, ДАСМ, конкурентного варианта ИфА, РИД, ИЭН позволили выявить штаммо-, вирус- и группоспецифичные элитопы и изучить антигенную специфичность капсидных белков. Эти результаты гарантировали надежность идентификации и классификации вирусов и их штаммов о помадь» количественной иммунохимии.

В сфере этих проблем изучение антигенных свойств капсидных белков вирусов и их штаммов, идентифицирована л, главным образом, в регионе Дальнего Востока и Сибири, способствовало получению новых данных по трем- основным направлениям фитовирусологии -фундаментальным основам классической фитовирусологии, молекулярной биологии и 5иитехнологии.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и усовершенствованы технологии выделения ви-русспецифичных белков рабдо-, бромо-, ко ¡.ю-, кукумо-, непо-, некро-, карла-, потеке-, поти- и тсбамовирусов.

2. Изучена молекулярная природа и антигенная структура эпигонов капсидных белков:

-локализован группоспецифичный эпитол капсидного белка некротического штамма У -вируса картофеля, соответствующий позиции 190-206 полшептидной цепи, что дар г основание идентифицировать потивирусы и их штаммы, когда таксономическое полояение их неоп-ределено.

-пептидным картированием установлено наличие одинаковы« аминокислотных последовательностей в капсидных белках трех потиви-русов: мозаики турнепса, мозаики клевера :- юного и вируса традесканции белоцветковой,

-изучены структурные белки двух фиторабдовирусов. У ' вируса мозаики злакоз зыявлен .¿творимый" антиген с мол. массой 1В кД и "нерас-воришЯ" антиген с мол. массой 30 КД, Яиг иго-химича с кие, антигенные ь биологически« свойства капсидных белков

свидетельствуют в пользу того, что эгот вирус язляется дальневосточным изолятом вируса северной мозаики злаков, имеющим широкое распространение е Азиатско-Тихоокеанском регионе.

3. Выяснен механизм продукции полигональных антител у разданных видов животных (кролики, »мни, куры) к поверхностным эпи-топам капсидных белков под влиянием неоиецчфических факторов иммуногенеза:

- показана целесообразность введения животным микродоз иммук ноге на (220-500 мкг), а для слабых я средних не более 1 мг,

- показано преимущество внутрикожного и подкожного способов введения' иммуногена в места расположения лчмфоузлов по сравнение о внутривенным и внутримышечным, .

- реиммунизация поеволила получать политональные антитела длительное зрсмя,

-ьвучен адъювантный эффект веществ простой и сложной химической природы ( сапонин, альгинат натрия, желатина, подиэти-леигшюль, бентотгг, глицерин, водно-масляные эмульсии, клетками еикезелэных водорослей и липополисахаридами). Два последних явились хоротами заменителями едгювант^ Ореинда.

4. Усовершенствованы и отработаны оптимальные условия технологий иммунохимических методов детеюгш вирусов: иммунодиффузионные тесты, ракетный имчуиозлектрофорез, иммуноблотинг, иммунная электронная микроскопия, а также конкурентный, непрямой, прямой, сэндвич-метод, дчойной г чительный сэндвич-метод - варианты иы-муноферментного ■ ализа для количественной оценки зпитопсв капеидпых белков Фитовидосоч.

5. Проведен анализ взаимосвязей среди вирусов и их штаммов десяти таксономических групп с целью классификации новых ранее не списанных:

-доказано шташовое различие не только по патогенности, но и по ант' ,-енной специфичности при изучении групп штаммоь У-вирус?. ..картофеля: обычной, некротической и шт'риховатой полосчг-ости,

-определено таксономическое положение среди потивирусов новых ранее не известных вирусов мозаики клевера горного и традес.сан-ции селоцветкоьой, а такж сибирского иаолята вируса «гптий карликовости лу:<а. Конкурентным вариантом иммуноферментного анализа <"-;;реде 1ен процент гомологи, апитопов у исследуемых потивирусов,

У и а-вирусы картофеля имели от ЙО до 502 идентичных группоспе-цифичных эпигонов; вируса мозаига: сои, мозаики т/рнепса, мозанки гигшеэструма, вируса традесканции белоцветковой

-от in до 40/. и самый высокий процент гомологии от 70 до OOS отмечен для вирусов желтой карликопост". лука и зкелтой мозаики фасоли,

• .-получены доказательства для включения вируса аукуба мозаики картофеля и вируса мозаики подсродшика азиатского из возможных в типовые члены пстексвьрусов,'

-выявлены группоспецифлчные эпитопы дальневосточного и европейского серо типов вируса огуречной мозаики и вируса аспермии томатов,

- дальневосточный изолят вируса мозаики редиса идентифицирован как типичный штамм идентичный не европейскому, а американо-японскому,

-дана оцеика антигенной специфичности двум карлавирусам Ни S вирусам картофеля, имеющим 50Х идентичны группоспецифичных эпи-топов. Антигенная специфичность у этих вирусов четко прослеживалась только методом иммунной электронной микроскопии, который не показал перекрестна реакций в системах каждого вируса. Все другие иммунохичические методы фиксировали перекрестную реакцию.

-показана идентичность по антиг .-нным свойствам пяти изолятов \Сильванер, Алиготе, Лино серый, Шасла белая, Рипариа х Рупост-рис 3309) вирусов короткоузлия и инфекционного хлороза винограда, идентифицированных в Одесской области.

-доказано, что Вирус нозажи вики однопарной (штаммы пятнистый, мозаичный и некротический) является новым членом группы Оромовкруссв,

-выявлено частичное ант; 'энное родство дальневосточного к латвийских изолятов вируса некроза ч'а&ака,

-18 штаммов вируса табачной иозашш по ан'.лгенной специфичное.и- разделены на три еерогру in; 1-ая - фибриллярный, цифу-мацг'чойий, пстуниевьй, петле видны;!, два нарциссовых, картофе ь ный И душистого Т! 'ака капсидные белки которых имели весь спектр опитопов, а полученные саецифи,"'ые л нш : тятела роаги-

рсвали со эпитопами капсидных белков всех изучаемых штаммов. ° 2-ая - подорожниковый, белены, зорьки и ириса показали Слизкое антигенное родство между собой. 3-я - клзахский, обыч чй> ядерный "Т", ядерный "О", японский "ОМ" отличались слабой иммукогенной активностью и такязэ проявляли низкую антигенную активность в перекрестных реакциях как между собой, так и с другими изучаемыми штаммами ВТМ.

По материалам диссертации опубликованы следующие роботы:

1. Гнутова P. R Сравнительная характеристика эффективности различных способов получения антисыворотки к возбудителю аукуба мозаики картофеля //В кн.: Вирусные болезни растений ДВ. Владивосток: Изд. ДВНЦ. IS74. С. 84-87.

к. Gnutova R. V. , KrylovA. V. Potato A-virus ¡Jiagnosm by Serological Methods //Phytopathol. 1. 1975. vol.83. N 3-1. P. 311-319.

3. Gnutova R V., Krylcv A. V. Serological StJdios of Potato Viruses X, Y, A and Aucuba Ktosaic. I. Methods ror t' -s Isolation of Antigens //Acta Ptytopathol. Acad. sci. hung. 1875. vol.10. N.3-4. P. 185-193.

4. Gnutova R V., Krylov A. V. St rological Studies or Potato Viruses X, Y, A and Aucuba Mosaic. ¡¡.Preparation of Di3gnr-;tic Antisera. Ibid. P. 195-201.

5. Gnutova R. V., Krylov A.V. Serological Studies of Potato Viruses X, Y, A and Aucuba Mosaic. III. Expansion of S^i&k i</ile Limits of Serological Virus Dettidrmlnatlori by tl.e Latox t^st. Bentonite Plocculation, Рас,с i ve ¡!a*-ri3ggh!tiivuticr. -and Conplement-Fixation. Ibid. P. '¿03-203.

6. Гнутова P. H , Крылов A. E Использование адтивирусньк cjt.o-роток для диагностики впруссз con //В кч.: Соя в Приморье. Владивосток.- Иэд. ДВНЦ. 1975. С. 59 -1)!.

7. Костин В. Д., Мин'.'кг'Я Л. А., Гнутова f. а , Оолюи П. Г. Лнт;'.' генные свойства вируса, поразвшпйги »юдорожнж азидгский // Г' кн.: Метаболизм «Зольного растении. Ъяамиьпятох. Изд. ДЫЩ. IV/G. <\ 110-115.

8. Гнутова Р. в., Линскер IL И. Антиснворотка к вирусу штрихова-тости риса //В кн.: Вир;, <лше боле г ни растений ДЕ Владивосток. 1|&д. ДВКЦ. 1976. С. 219-222.

б. Гнутова Р. Ъ., Самонива IL Н. , Микус Б. К Серодиагностика штамма вируса короткоуалия вш:..;Града - инфекционного хлороза /У В Kii.: Штаммы вирусов растений. Владивосток Ивд. ДВКЦ. 1077. С. 250-252.

10. Гнутова Р. Е ГЬ лучение и использование антисывороток в се-рол ."-ических реакциям повышенной чувствительности для диагностики вирусных болезней растений //В кн.: Вирусные болезни растений. Владивосток Изд. ДВНЦ. 1980. С. 100-104.

11. Гнутова P. R , Чуян А. X., Крылова Н. Е , Рублева Н. Е , Крылов л. Е' Характеристика некоторых дальневосточных штаммов вируса табачной мозаики // Биол. "зуки. 1980 . N. 1." С. 31-37. .

12. Гнутова Р. Г Иммунологические особенности некоторых фито-латотшых вирусов и их штаммов //В кн.: Plant Virol. Brno. i981. P. 53-5G.

13. Гнутова Р. В., Артхкова Е. В , Уорж Е Г. Серологические свойства казахского штампа ЕТМ к полиморфна форм его белка // В кн.: Влияние вирусов на обмен растений. Еладивосто.ч. Изд. ДВНЦ. 1.933. С. 77-82.

14. Snutova Г'. V. Comparison of Tobacco Mosaic Virus (TMV) Strains by Rocket Immunoelectrohoi-esis // Zeszyty problemowa postepew Nauk Roiniczvch, Warszawa. 1Ö83. z. 291. P. 111-118.

15. Гнутова P. В., Оибирякова Я И. Возможности повышения чувствительности аьтисивороток при изучении ьнругоустойчивости Гастений //Tag. Вел Acad. Landwirtshu -wiss. DDR. Berlin. 1903. H. 216. S. 217-227.

16. Гнутова P. E , Оибирягава И. Л Усовершенствование методов иммунизации животных фитоьирусами // Теекои докл. 8-ого Всесокэ. совет, Вильнюс. 1684. С. 209-210.

17. Гнутоьа Р. Е , Козловская 3. Н , Чуян А., Сибирякоеа И. К. Иммунологическая характеристика дальневосточных изолятов вируса огуречной мозаикл //В кн. Взаимоотношение вирусов с клетками растения-хозяина. Владивосток. Изд. ДБВД. 1985. С. 64-71.

18. Гнутова P. R Иммунологические ^следования в ^итовирусоло-Гик. //К.: Hayita. 1985. 183 с.

19. Рублева Е В., Г.чутова ?. В. Иммунная электронная микроскопия вирусов группы potexvirus //В кн.: Взаимоотношения вирусов с клетками растения-хозяина. Владивосток. Изд. ДВНЦ 19S5. С. 110-112.

20. Griutova R. У. , Slbiryakova I. I. , Kakareka М. N. , Rybleva N. V, • Korzn v. Q., Kczlovskaya Z. N., Tolkach V. F. Immunological character!sties cf potex-, poty- and carlaviruses // Abst.r. VII -th Internation. Congress of Virology. Edmonton. Alberts Canada. 1987. P. 1133.

21. Гнутова P. В. Роль нммуногенности при получении иммунодиаг-костикумив // Биотехнология и биотехника. Болгария. 1SS7. N. 1. С.

22. Сибирякова И. It, Гнутова Р. В., Толкач В. Ф., Рублева It В., Чули А. X.Крылов А. Д Биологические свойства местного изолята вируса некроза табака и получение специфических антисывороток// С. -X. биология. 1987. N 5. С.55-60.

23. Гнутова р. а , Какарука Е Н., Толкач В. Ф., Чуян А. 3.., Сиби-рякоья И. It, Рублева Е В., Крылов А. К Биологическая и серологическая характеристика вируса яьлтой карликовости лука //Докл. BACXEffl.fi 1983. 11.' С. 20-23.

• Г'А. Гнутова Р. Е , Корж а Г., Сибирякова И. И., Какарека К Е, Рублеса Ч. ЕКозловская 3. Н. Оценка антигенной специфичности и особенности иммуиодиагностики М и S-вирусов картофеля //В кн.: Фитовпрусологические иг. ния на ДЕ Ечадивосток. ДЮ АН СССР. 1989. С. 178-183.

25. Гнутова Р. В., Какарека Е Е , Tojikl , Е Ф., Чуян А. X., Сибирякова И. И., Рублева R R , Крылов А. В. Некоторые свойства вируса желтой мозаики фасоли, идентифицированной на юге Дальнего Востока //Вестник АН ССОР, серия биологическая, 1989. N 1& С. 442-449.

- 26. 1о8Лоэская 3. Е , Гнутова Р. Е ,, Иммунологическая характеристика дальневосточного и европейского серотипов кук; ювирусов //Докл. ВАСХНИЛ. 1989. N. 8. 0.14-13.

27. OnutcmR. V., Slbiryakova 1.1., Rubleva N. V., Krylov A.V. A Comparative linuinodienucal sturly of potato virus " potato aacuba mosaic Virus, hydrangea ring-spot and white clove mosaic

Virus by the sandwich blocking r-fetbods ELISA, double diffusion test, virobacterial agsluti T&Uon, rocket Immunoelectrophoresis and iirmune electron microscopy//Acta Phytopathol. and Cnthom hung. 1PQ9. Vol. 2-4. P. 403-414.

2a. Gnutova R. V., Sibiryakova I. I., ' Kakareka N. N., Volkov Уи. о. , Krylov A. V.. Immunological Characteristics' of Brome tosaio Virus and two RaMo viruses of Cereals//1 bid. P. 416-421. . 29. Гнутова P. a , Какарека E И. , Сибирякова И. Я , Толкач В. Ф., Рублева Н. В., Козловскал 3. ft, Корж В. Г. Подходы к выявлению общих и индивидуальных антигенных детерминант потивирусов, идентифицированных на Дальнем Востоке// Биол. науки. 1089. К 10. С. 2Q-2J6.

30. Савиьа И. а , Гнутова Р. В. Сравнительная характеристика антигенного родства дальневосточных штаммов ВТМ // В кн.: Фитоаи-русологичеокие ис-чпя на ДВ. Владивосток. ДВО АН СССР. 1989. С. 172-177.

31. Gnutova R.V. , Sibiryakova I. I., j^rvekulg L. Insnunoche^i-cal properties of capsid proteins of potyvtrus //1UMS Congress Bacteriology and Mycology. Osaka Japan. 1990. P. 1235.

32. Гнутова P. E , Какарега H. R , Сибирякова И. И., Рублева Ы. а Г4ммунохимические' свойства капсидных белков потнвирусов//Ть8Исы Всесоюз. конф. "М/кробиол. и Сиоте/.кол. основы интенсификации", Аяма-Ата. 1990. С. £0-26.

■ 33. Какарека Е Н., Гнутова Р. а , Сибирякова . и. й. Разработка иммунодиагностикуков против вирусных болезней сои// Изд. СО ВАСХКИЛ Новосибирск 1990. 0.20-26.

34. Рублева Н. К , Гнутова Р. а , Сибирякова И. И. Вирус мозаики гиппэаструма: очистка, свойства и иммунодиагностика // Известия АН СССР, сери? биологичес чя. 1990. N6. С. 845-И53

ЗЪ. Какарека Н. а, Гнутова Р. В., Сибирякова И. И., Еуссе Т. И. Диагностика вирусов мозаики сои и желтой карл...{оиости лука имму-ка*«рме1киьл( анализом с исполье занием F( ab) -фрагментов // Док.» ВАСХНЛЛ. 1991. N5. С. 26-29.

Зь. Моисеекко JL И. как-рела R а , Сибирякова ь. м., Гнутова Р. Е Некоторые физико-химические и анти^ннке свой тва вируса ме-ваик» турнепса (дальневосточный изолят) // Докл. ВАСХНИА 1691. N. И.О. 44-48.

37. Gnutova R. V. , Sibiryakova I. I. . Sepotsky M V. , Kakareka M. W. , Moiseenko L.I. lmmunodiagnostlcs of cereal virus fn t,h« Far East // Abstr. of Vl-th Conf. on virus diseases, Г Gran.insaa in Europe. Torino. Italy. 1931. P. 5.

33. Гнутова P. В., Сибирякоаа И, ,11., Радавский Ю. Л ; Ярвекшьг Л.. Зайцева JL С. Антигенная характеристика канспдных Оелков илдкмов У-вируса карте ч^ля //Виол, пауки. 1991. N 11. С. 35-46.

39. Сапоцкий М. В., Моиссенко Л It, Какарека Е Н., Ыаиаэв П. Я , Гнутова Р. Е Особенности выделения и антигенные, свойства белка "растворимого" антигена вируса шзамки злаков // Докл. ВАСЛШЛ. 1092. N. 2. С.б-11. ■

40. Гнутова Р. В., Какарека а Н.. Сисмрякова.И-И. , Улритэренков И. Г. Изучение антигенных свойств потивирусов,'идентифицированных на Дальнем Востоке //Докл. ВАСХИИЛ. 1692. N 7. С. 1Р-20,

41. Гнутова Р. Б., Сибиряков» ;:. It, Взрицев Ю. А., Kopr. Е Г. Антигенная характеристика У-вируса [сартофеля (штамиовн*» со(.гаа) // Биол. науки. 1992. N Е. С. 42-49.