Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика штаммов ВТМ (дальневосточные изоляты), идентифицированных на овощных культурах

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика штаммов ВТМ (дальневосточные изоляты), идентифицированных на овощных культурах"

На п^вах|))гкописи

1 3 ДЕК 2003

ГНУТОВА Ирина Валерьевна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВТМ (ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЕ ИЗОЛЯТЫ), ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫХ НА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУРАХ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2000

Работа выполнена в Биолого-почвенном институте Дальневосточного отделения РАН в лаборатории иммунохимии и биологии вирусов растений

Научные руководители:

доктор биологических наук

A.В. Реунов

кандидат биологических наук

B.Ф. Толкач

Официальные ошюнешм:

доктор биологических наук В.И. Малиновский

доктор медицинских наук P.A. Слонова

Ведущее учреждение: Московский государственный университет

Защита диссертации состоится " ПВК&Ср Ч 2000 г. в . _[}(.__ час. на заседании диссертационного совета К 003.97.01. при Биолого'почвскном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр. 100-летия Владивостока, 159.

Факс: (4232)310-193

С диссертацией можно ознакомиться в цешралыюи научной библиотеке ДВО РАН

Автореферат разослан "_М " ноября 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат бнолт ических наук . ' Т.Н. Музарок

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирус табачной мозаики (ВТМ) является одним из самых контагиозных фитопатогенных вирусов, который поражает большое число видов растений из различных семейств и тем самым наносит огромный экономический ущерб растениеводству, главным образом, овощеводству, декоративному цветоводству и садоводству. К настоящему времени идентифицировано более 300 штаммов ВТМ, поражающих самые разнообразные растения дикой и культурной флоры (Nagai et ah, 1987).

Только на юге Дальнего Востока России выявлено уже около 10 штаммов ВТМ, поражающих перец, декоративные культуры, картофель и травянистые растения. Благодаря новым исследованиям число их ежегодно увеличивается. В последние годы штаммы ВТМ стали причиной снижения урожайности овощных культур - томатов, возделываемых как в открытом, так и закрытом грунте (Толкач, Гнутова, 1998), перцев, баклажанов и др. Поэтому актуальность изучения штаммов ВТМ не вызывает сомнений. Представляется необходимым изучать не только свойства этих штаммов, но и определять их групповую принадлежность в рамках одного вида.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в изучении биологических, физико-химических, антигенных и цитопатогенных свойств штаммов ВТМ, идентифицированных на юге Приморья на овощных культурах - перце (ВТМп), томате (ВТМт) и баклажане (ВТМб) и отнесении их к определенной группе штаммов в пределах вида. Кроме того, планировалось провести сравнительный анализ изучаемых штаммов и некротического штамма ВТМ (ВТМпн), описанного ранее на перце (Толкач, 1995), который отличается тем, что не заражает

системно табак настоящий (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun), томат съедобный (Lycopersicon esculentum Mill.) и вызывает на большинстве тест-растений реакцию локально-некротическую.

При этом ставились следующие задачи:

1) выявить экспериментальный круг растений-хозяев и провести сравнительный анализ симптомов, вызываемых исследуемыми штаммами на них;

2) изучить внутриклеточные вирусные включения, индуцируемые каждым штаммом;

3) получить данные о физических и физико-химических свойствах вирусных частиц;

4) исследовать антигенные свойства штаммов и выявить

вирус- и штаммоспецифические эпитопы капсидных белков для определения степени антигенного родства штаммов;

5) изучить ультраструктуру клеток листьев N. tabacum cv. Samsun, инфицированных исследуемыми штаммами;

6) провести классификацию штаммов по группам в пределах одного вида Tobacco mosaic virus рода Tobamovirus.

Научная новизна. Изучены три новых штамма ВТМ, поражающие овощные культуры на юге Дальнего Востока России. Штамм ВТМ из баклажана выделен в России впервые. В результате проведенного комплексного исследования различными методами (биологическими, физико-химическими, иммунохимическимн, цитологическими) дана сравнительная характеристика изучаемым штаммам; выявлен экспериментальный круг растений-хозяев, изучены симптоматология, внутриклеточные включения, ультраструктурные аспекты взаимодействия с клетками, физико-химические свойства и штаммоспецифические эпитопы капсидных белков. Проведенные исследования дали возможность

пополнить новыми представителями штаммов ВТМ две группы - томатную и табачную.

Практическая значимость работы. Получены диагностические антисыворотки к ВТМб и ВТМпн. Показано, что наиболее активным иммуногеном является ВТМб. Рекомендуется использовать этот штамм для получения антисыворотки высокой специфичности и активности с целью разработки иммунодиагностикума, с помощью которого можно будет выявлять штаммы ВТМ на овощных культурах не только в лабораторных, но и в полевых условиях.

Выявленные вирусные включения исследуемых штаммов ВТМ могут использоваться как диагностический тест для идентификации штаммов ВТМ по группам.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной научной конференции "Актуальные проблемы фитовирусологии и защиты растений" (г. Минск, 1997); 9-ой международной конференции "Вирусные болезни овощных культур7' (г. Турин, Италия, 1998); научно-практической конференции "Генофонд растений Дальнего Востока России" (г. Владивосток, 1998); международном симпозиуме по физиологии растений (г. Москва, 1999); XVIII Российской конференции по электронной микроскопии (г. Москва, Черноголовка, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части, состоящей

из 3 глав, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы, состоящего из 175 источников, в том числе - 111 иностранных авторов. Работа изложена на 126 страницах, включает 5 таблиц и 24 рисунка, на 2-х из которых представлена 21 микрофотография.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы дана общая характеристика ВТМ, приведены сведения по распространению вирусов в растениях, симптомам пораженных растений, кругу растений-хозяев, штаммовому разнообразию ВТМ; отдельно рассмотрены штаммы ВТМ, поражающие томаты, перцы и баклажаны и классификация штаммов ВТМ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом исследования служили растения перца, томата и баклажана с вирусоподобными симптомами, отобранные на Приморской овощной опытной станции (с. Суражевка). Для выявления круга растений-хозяев и описания симптомов заболеваний, вызываемых изолятами, инокулировали 45 видов и сортов растений из 9 семейств.

Определение точки термической инактивации (ТТИ), предельного разведения сока (ПРС) и периода сохранения инфекцнонности (ПСИ) вируса в соке проводили по методам, описанным ранее (Гиббс, Харрисон, 1978).

Штаммы вируса размножали и накапливали в растениях N. tabacum cv. Samsun. Некротический штамм ВТМ получали из листьев растений перцев однолетнего (Capsicum annuum L.) и ягодовидного (С. baccatum L.), Очистку штаммов вируса проводили по методике В. Новикова с соавт. (1984) в нашей модификации. Выделение вируса начинали с гомогенизации свежесорванных листьев в 0,05 М фосфатном буфере pH 7,4-7,6 с

добавлением 0,005 М этиленднаминтетраацетата (ЭДТА) и 0,1-0,2% 2-меркаптоэтанола. Вируссодержащую суспензию осветляли смесью хлороформа и бутанола. Осаждение вируса осуществляли полиэтиленгликолем (ПЭГ м.м. 6000). Экстрагирование вируса из осадков проводили 0,05 М боратным буфером, pH 7,6. Окончательным этапом очистки вируса являлось дифференциальное центрифугирование с использованием сахарозной подушки.

Моноштаммовые антисыворотки (As) к ВТМб и ВТМпн получали путем иммунизации кроликов (Гнутова, 1985). Иммуногены вводили подкожно и внутримышечно с полным адъювантом Фрейнда (Дифко, США, v/v 1/2). Титр штаммоспецифических антител (Ат) определяли с помощью реакции двойной иммнодиффузии (РДД) и непрямого варианта иммунофсрментного анализа (ИФА).

Для определения степени антигенного родства штаммов ВТМ и выявления штаммоспецифических эпитопов капсидных белков использовали ИФА (непрямой вариант и "сэндвич" метод), ракетный иммуноэлектрофорез (РИЭФ) и РДД (Гнутова, 1985; Сибирякова, 1987). Для контроля параллельно ставили реакции с гетерологичным и гомологичным антигенами (Аг) - Y-вирусом картофеля (YBK) и контрольным препаратом ВТМ (ВТМк) - вирусами, постоянно поддерживаемыми в коллекции лаборатории.

Внутриклеточные включения штаммов ВТМ исследовали с помощью светового микроскопа (МБР-6) при увеличении х200. Окраску эпидермиса листьев проводили 0,5% трипановым синим по методике М. Гольдина (1963).

Для электрон ном икроскопического изучения вирусных частиц в препаратах применяли метод негативного контрастирования 2%-ной фосфорновольфрамовой кислотой (ФВК) (Развязкина и др., 1968).

Эксперименты по изучению влияния штаммов ВТМ на ультраструктуру клеток листьев растений N. tabacum cv. Samsun проводились по обычным методикам (Уикли, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВТМ Результаты электронномикроскопических исследований показали, что в контрастированных ФВК препаратах, приготовленных из листьев растений, инфицированных изучаемыми изолятами, присутствовали палочковидные частицы длиной 300 нм, соответствующей длине ВТМ.

Изучен экспериментальный круг растений-хозяев для данных изолятов и показаны отличия в симптомах, проявляющихся на испытуемых растениях (табл. 1).

Известно (Гольдин, 1948; Власов и др., 1973; Игнаш, 1978), что томатные штаммы ВТМ вызывают на табаке крылатом (N. alata Linket Otto), махорке (N. rustica L.), табаке лесном (N. sylvestris Speg et Comes), петунии гибридной (Petunia hybrida Vilm.) появление локальных некрозов или латентно заражают эти растения, а табачные штаммы - системное поражение или локальное, переходящее затем в системное. Эти тест-растения при инфицировании изолятами из томата и баклажана отвечали локальной реакцией или поражались латентно, а при заражении изолятом из перца - развивали системную реакцию или локальную, переходящую в системную (табл. 1). Другие виды растений, используемые нами в работе, при заражении исследуемыми изолятами также различались по симптоматологии. Эти результаты дали возможность отнести изучаемые патогены к самостоятельным штаммам ВТМ (ВТМт, ВТМб и ВТМп).

Таблица1

Реакция тест-растений на заражение изучаемыми изолятамн ВТМ

Вид, сорт растений Изоляты из растений

перец томат баклажан

Amaranthaceae Juss.

Amaranthus caudatus L.

Am. hybridus L.

Gomphrena decumbens L.

G. globosa L. L:N

Brassicaceae Burnett.

Alyssum saxatile L.

Iberis amara L.

Matthiola incana Br.

Sinapis aiba L.

Lobeliaceae Juss.

Lobelia inflata L.

Chenopodiaceae Vent.

Chenopodium amaranticolor L.NSp

Coste et Reyn.

Ch. ambrosoides L. L:NR

Ch. bonus henricus L. Ch. capitatum L.

Ch. murale L. L:NSp

Ch. quinoa Willd. L:NSp

Commelinaceae R.Br.

Tinantia fugax Schient.

Cucurbitaceae Juss.

Cucumis sativus L.

copT AB-6

copT Mur

Cucurbita meló L.

Cucurbita pepo L.

Fabaceae Lindl.

Faba bona Medic.

Medicago sativa L.

Phaseolus vulgaris L.

cv. Perlicka

ScrophuJariaceae Juss.

Antirrhinum majus L. S:0

L:N

L:N

L:N L:NR

L:NSp L:N

L:N L:NR

L:NR L:NSp

Таблица 1 (продолжение)

Вид, сорт растений Изоляты из растений

перец томат баклажан

Solanaceae Juss.

Capsicum annuuin L. L:NR,S:C1M L:N,S:ClMot S:ClVe,NVe

С. baccatuin L. S:M,Dis S:M,Dis S:ClM,Dis

Datura ferox L. L:N L:N L:N

D. meteloides Dun. L:N L:N L:N

D. stramonium L. L:NR L:N L:N

Lycopersicon esculentum Mill.

сорт Невский S:M,Dis S:M,Dis S:M,Dis

сорт Новичок S:C1M S:M,Dis S:M,Dis

сорт Хабаровский S:ClM,Dis S:M,Dis S:M,Dis

L. pimpinellifolium Mill. S:0 S:0 S:0

Nicandra physaloides L:NR L:NR L:NR

(L.) Gaerth.

Nicotiana alata Linket Otto S:ClM,Dis L:NR L:NR

N. longiflora - - -

N. rustica L. L:N,S:Dis,Cl L:N L:N;S:0

N. sandera Wats. L:N L:N;S:0 L:N

N. sylvestris Speg et Comes S:ClM,Dis S:0 S:0

N. tabacum L. cv. Samsun S:C1M S:ClSp,M S:C1M

cv. Xanthi-nc L:N L:N L:N

Petunia hybrida Vilm. L:N;S:VC L:N L:N

Solanum dulcamara L. - - -

S. melongena L. L:NSp - L.ClSp

S. nigrum L. S:C1M S:0 S:C1M

Аббревиатура:

Ь - локальное поражение N - некрозы N11 - некротические кольца ^р - некротические пятна М - мозаика

С1Мо1 - хлоротичная крапчатость С1М - хлоротичная мозаика О - бессимптомное поражение

S - системное поражение MSp - мозаичная пятнистость RSp - кольцевая пятнистость Dis -деформация листа C-lVe - хлороз жилок NVe - некроз жилок VC - посветление жилок "-" - не заражается

Штамм ВТМп в большей степени отличался от ВТМт и ВТМб по кругу-растений хозяев. В сравнении с ними этот штамм специфически инфицировал следующие тест-растения: марь амарантоцветную (Chenopodium amaranticolor Coste et Reyn.), львиный зев (Antirrhinum majus L.), C. annuum, дурман вонючий (Datura stramonium L.), L. esculentum сортов Новичок и Хабаровский, N. alata, N. rustica, N. sylvestris, P. hybrida и баклажан (Solanum melongenaL.) (табл. 1).

По реакции тест-растений ВТМт и ВТМб проявили себя более близкими штаммами, чем ВТМп. Однако и у этих штаммов имелись отличия по проявлению локальной и системной реакций на следующих тест-растениях: мари квиноа (Ch. quinoa Willd.) и стенной (Ch. murale L.), С. annuum, С. baccatum , N. rustica, табаке сандера (N. sandera Wats.), P. hybrida, S. melongena и паслене черном (S. nigrum L.).

Анализируя наши и литературные данные по реакции тест-растений на заражение исследуемыми штаммами, мы пришли к заключению, что ВТМт и ВТМб можно отнести к томатной, ВТМп - к табачной группам. Следует отметить, что штамм ВТМ идентифицирован нами на баклажане впервые в России.

Определенные отличия среди штаммов выявлены нами при изучении в световом микроскопе внутриклеточных включений. В клетках эпидермиса листьев N. tabacum cv. Samsun, инокулированного ВТМп, были обнаружены кристаллические включения в виде крупных правильных гексагональных пластинок и околоядерных слоистых Х-тел, по морфологии не отличающихся от включений, образующихся при заражении типичным (табачным) штаммом ВТМ (Власов, 1977; Молдован, 1979). Х-тела ВТМт были найдены в околоядерных зонах и часто имели бобовидную форму, также встречались крупные аморфные включения, в основании первого членика эпидермального волоска. ВТМб образовывал включения игловидной и правильной октаэдрической формы с четко выраженными

гранями, сходящимися в общей вершине, а также рыхлые зернистые Х-тела типичные для ВТМ. Эти данные свидетельствуют о различиях, существующих у исследуемых патогенов, и дают возможность отнести их к трем самостоятельным штаммам ВТМ.

Изучаемые штаммы ВТМ имели различия по физическим свойствам (табл. 2). Точка термической инактивации у ВТМб была довольно низкой по сравнению с другими штаммами и составляла 85°С. Более низкая ТТИ (80°С) отмечена лишь для дальневосточного штамма ВТМ из ириса (Толкач, 1995). У некротического штамма ВТМ, выделенного из перца, ТТИ составляла 95°С. ВТМт и ВТМп имели ТТИ 90°С, то есть такую, как у типичного штамма ВТМ.

Таблица 2

Сравнительная характеристика физических свойств дальневосточных

штаммов ВТМ

Штаммы ВТМ ТТИ ПСИ ПРС

ВТМп 90°С Более 2 мес. 10-12

ВТМт 90°С Более 2 мес. Ю-11

ВТМб 85°С Более 2 мес. ю-12

ВТМпн* 95°С Более 2 мес. •

ВТМоб** 90°С Более 4 мес. Ю"10

""данные В.Ф. Толкач (1995); * »Description 1997 (Brunt et al., 1997)

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И АНТИГЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИЗУЧАЕМЫХ ШТАММОВ ВТМ

Спектрофотометрический анализ очищенных препаратов изучаемых штаммов ВТМ показал наличие нуклеопротеидного спектра с минимумом

поглощения при 245 нм и максимумом при 265 нм. Эти данные соответствуют литературным (Гнутова, 1993) и являются характерными для очищенного препарата ВТМ. Показана относительно высокая концентрация и стабильность штаммов ВТМп, ВТМб и ВТМт в соке листьев N. tabacum cv. Samsun, а также ВТМпн в соке листьев С. annuum и С. baccatum. Выход вируса взависимости от штамма составил 7085 мг на 100 г инфицированных листьев.

Штаммоспецифические антисыворотки получены к штаммам ВТМб и ВТМпн. Количество вводимого вируса соответствовало разовой дозе 1 мг при 4-х кратном введении иммуногена с адъювантом Фрейнда. Штаммы ВТМб и ВТМпн, которые вводили животным по удлиненной схеме иммунизации, оказались разными по иммуногенной активности. По результатам РДД и непрямого варианта ИФА ВТМб вел себя как более активный иммуноген.

Согласно данным РДД специфические антисыворотки к штаммам ВТМб и ВТМпн имели титры - 1:128 и 1:8, соответственно.

При постановке непрямого варианта ИФА для определения оптимального разведения As использовали антигены ВТМб и ВТМпн с концентрацией 10 мкг/мл и антивидовой конъюгат в разведении 1:400. По расположению кривых титрования определяли максимальное разведение антнсывороток, составившее для ВТМб - 1:25600 и ВТМпн - 1:3200. Полученные нами антисыворотки обладали строгой специфичностью.

ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИГЕННОГО РОДСТВА МЕЖДУ ШТАММАМИ ВТМ С ПОМОЩЬЮ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Сравнительный анализ антигенных взаимоотношений штаммов ВТМ, проведенный с помощью РДД показал, что при использовании двух штаммоспецифических антисывороток в перекрестных реакциях

формируются полосы преципитации как с

гомологичными, так и гетеро логичным и штаммами ВТМ. Эти результаты свидетельствуют о наличии общих вирусспецифичных эпитопов у всех изучаемых штаммов ВТМ (ВТМп, ВТМт, ВТМб и ВТМпн) (рис. 1а,б).

,1

6

5 >

1.2

■ 3

6

б

5 _ 3

'"а''

а)

б)

Рис. 1а,б. Определение антигенного родства штаммов ВТМ в РДЦ. В центральных лунках Аб к ВТМб (а) и ВТМпн (б); в периферических - Аг: 1-ВТМк; 2-ВТМб; 3-ВТМт; 4-ВТМпн; 5-ВТМп; 6-УВК. Концентрация антигенов 1 мг/мл.

1

а

4

Кроме того, ВТМб и ВТМт показали реакцию идентичности, образуя схожие полосы преципитации (рис. 1а), что свидетельствует о высокой степени антигенного родства этих штаммов. В то же время ВТМпн давал реакцию частичной идентичности с ВТМт и ВТМп и образовывал четкую полосу преципитации только со своей антисывороткой (рис. 16). ВТМп с антисыворотками к ВТМб и ВТМпн формировал такие же полосы преципитации как и штаммы ВТМб и ВТМт (рис. 1а,б).

Более четкие данные по антигенному родству

исследуемых штаммов ВТМ были получены нами с помощью РИЭФ, который как метод более чувствителен, чем РДД. Разведение антисывороток для ВТМб и ВТМпн подбирали экспериментально - 1:1001:200 и 1:50-1:100, соответственно. Продолжительность постановки РИЭФ составляла 2-2,5 ч при 30 мА и 120 V.

По величине ракет на рис. 2а,б можно судить о степени антигенных взаимоотношений между штаммами ВТМ. Расчетным путем были получены данные о наличии идентичных эпитопов у четырех изучаемых штаммов ВТМ (табл. 3), выраженных в процентном отношении.

$ У ' $

а) 1 2 3 4 5

Рис. 2а,б. Иммуноэлектрофореграммы, полученные РИЭФ при выявлении штаммоспецифических эпитопов ВТМ. а - в геле антисыворотка к ВТМб, в лунках слева направо антигены:

1-ВТМк, 2-ВТМт, 3-ВТМб, 4-ВТхМпн, 5-ВТМп; б - в геле антисыворотка к ВТМпн, в лунках слева направо антигены: 1-ВТМпн, 2- ВТМп, 3-ВТМк, 4-ВТМб, 5-ВТМт. Концентрация антигенов 1 мг/мл.

* А • - ■ -

б) 1 2 3 4 5

Методом РИЭФ мы подтвердили результаты РДД о наличии идентичных эпитопов у ВТМт и ВТМб, так как в системе Аб ВТМб процент родства у ВТМт был наивысший и составил 83,3%, а у ВТМп -58,8% и ВТМпн - 0%. В системе Аб ВТМпн степень антигенного родства у штаммов ВТМб и ВТМт была 50,0% и 45,4%, соответственно, что также указывает на их близкое родство. У штамма ВТМп было отмечено наименьшее родство с ВТМпн - 26,3%.

Таблица 3

Количественное определение антигенного родства (%) между штаммами ВТМ методом РИЭФ

Антисыво- Штаммы

ротки ВТМп ВТМт ВТМб ВТМпн

ВТМб 58,8 83.3 100 0

ВТМпн 26,3 45,4 50 100

Таким образом, по результатам РИЭФ о степени антигенного родства между штаммами мы пришли к заключению, что их можно разделить на три группы - 1- ВТМб и ВТМт, 11- ВТМп и 111- ВТМпн. При этом следует отметить, что наиболее близкородственные антигенные взаимоотношения у ВТМт и ВТМб, штамм ВТМп занимает промежуточное положение и ВТМпн имеет самый низкий процент антигенного родства.

Для определения антигенных взаимоотношений ВТМп, ВТМб, ВТМт и ВТМпн непрямым вариантом ИФА использовали антигены с концентрацией 20 мкг/мл и антивидовой конъюгат в разведении 1:400.

При постановке "сэндвич" метода ИФА были

использованы иммуноглобулины, полученные только к ВТМпн. Рабочее разведение иммунопероксидазного конъюгата составило 1:500 (2-5 мкг/мл).

Кривые титрования, полученные для штаммов ВТМ как в непрямом варианте, так и "сэндвич" методе ИФА в системах ВТМб и ВТМпн, подтвердили результаты РИЭФ.

Таким образом, с помощью методов иммунноанализа нами получены данные о принадлежности изучаемых штаммов к трем группам: I - ВТМт и ВТМб, II - ВТМп и Ш- ВТМпн. По биологическим свойствам, как было показано нами, I группа соответствует томатным, II -табачным и Ш -некротическим штаммам.

УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ШТАММОВ ВТМ С КЛЕТКАМИ ТАБАКА

В клетках, системно инфицированных любым из исследованных штаммов ВТМ, накапливалось значительное количество вирусных частиц, которые выявлялись в виде рассеянных вирионов либо различных скоплений в цитоплазме, а также обнаруживались в центральной вакуоли (ЦВ).

Вирусные частицы в скоплениях часто существенно различались в диаметре. Наряду с вирионами, имеющими диаметр близкий к диаметру ВТМ, обнаруживались более тонкие частицы. Вместе с тем, нередко вирусные частицы приобретали высокую элеюронную плотность. Такие частицы набухали и могли слипаться, образуя сгустки, в которых отдельные вирионы не различались или различались с трудом. В наибольшем количестве аномальные ("тонкие" и набухшие) вирусные частицы наблюдались в клетках, зараженных ВТМп.

В некоторых пораженных клетках (чаще инфицированных ВТМп) содержащие вирус участки цитоплазмы инвагннировали в полость ЦВ. При

этом в подобных участках иногда наблюдались остатки

мембранных структур, вероятно подвергшихся автолизу. В полости ЦВ обнаруживались "порции" цитоплазмы с вирусом, которые, как показал анализ серийных срезов, могли полностью утрачивать связь с основной цитоплазмой.

Ядра инфицированных клеток обычно выглядели так же, как и в здоровом контроле. В противоположность этому существенные аномальные изменения в пораженных клетках претерпевали хлоропласта, в которых наблюдались набухшие либо слипшиеся тилакоиды, увеличилось количество пластоглобул, формировался периферический ретикулум. Особенно часто такие аномальные изменения в хлоропластах обнаруживались в клетках, зараженных ВТМп. Характерным признаком хлоропластов в инфицированных ВТМп клетках является формирование в них больших крахмальных зерен. В хлоропластах клеток, зараженных ВТМб и ВТМт, величина крахмальных зерен была заметно меньше.

Значительно, в сравнении со здоровым контролем, в инфицированных клетках возрастало количество митохондрий. Часть митохондрий содержала достаточное количество несколько расширенных крист, погруженных в умеренно плотный матрикс, что свидетельствует (Машанский и др., 1972) об их высокой функциональной активности. В то же время часто наблюдались аномальные мшчэхондрии, которые теряли кристы и приобретали электроннопрозрачный вид, превращаясь в вакуолеподобные структуры, о происхождении которых свидетельствовали двойная мембрана и единичные кристы. Во многих клетках обнаруживались вакуолеподобные митохондрии с инвагинациями, которые на срезах выглядели как подковообразные структуры. Нередко инвагинации митохондрий были ассоциированы с вирусными частицами. Чаще всего аномальные митохондрии наблюдались в клетках, инфицированных ВТМп.

К характерным вирусиндуцированным изменениям, в наибольшей степени проявляющимся в инфицированных ВТМп клетках, следует отнести новообразование цитоплазматических вакуолей, диктиосом, агранулярных элементов эндоплазматического ретикулума, различных пузырьков, мультивезикулярных тел, цитосом. В соответствии с существующими представлениями (Васильев, 1972; Белицер, 1978; Реунов, 1989), все эти изменения отражают стимуляцию в инфицированных клетках лизосомального компартмента. Развитие литическнх процессов вызывает деструкцию как вирусных частиц, так и клеточных структур.

В целом, по степени индуцирования описанных ультраструктурных изменений после ВТМп следует расположить В'ГМб, затем ВТМт.

ВЫВОДЫ

1. Идентифицированы три новых дальневосточных штамма ВТМ на овощных культурах - перце (ВТМп), томате (ВТМт) и баклажане (ВТМб), Штамм ВТМ на баклажане обнаружен и изучен в России впервые.

2. Показано, что исследуемые штаммы различаются по кристаллическим и аморфным включениям (Х-телам), образуемым в зараженных клетках табака. Выявленные включения могут служить диагностическим признаком этих штаммов.

3. Определен круг растений-хозяев (45 видов и сортов из 9 семейств) и выявлены различия штаммов по симптоматологии.

4. Установлено, что дальневосточный штамм ВТМб имеет наиболее низкую ТТИ (85°С) в сравнении с двумя другими изученными

штаммами ВТМ.

5. Иммунохимическими методами (РДД, РИЭФ, непрямым вариантом и "сэндвич" методом ИФА) показана степень антигенного родства штаммов ВТМп, ВТМт, ВТМб и ВТМпн. Выявлены вирусспецифические и штаммоспецифические эпитопы капсидных белков штаммов.

6. Показано, что штамм ВТМб является активным иммуногеном. К этому штамму получена моноштаммовая антисыворотка, которую можно использовать для детекции других штаммов ВТМ.

7. Электронномикроскопические исследования клеток системно инфицированных листьев N. tabacum cv. Samsun показали, что по степени стимуляции лизосомального компартмента, а также развития внутриклеточных литических процессов исследованные штаммы могут быть расположены в следующем порядке: ВТМп, ВТМб, ВТМт.

8. На основании изучения биологических, физических, физико-химических, антигенных, цитопатогенных свойств штаммы ВТМт и ВТМб отнесены к томатной, а ВТМп - к табачной группам вида Tobacco mosaic virus рода Tobamovirus.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гнутова Р.В., Толкач В.Ф., Гнутова И В. Tobamovirus: новые штаммы ВТМ // Матер. Межд. конф. "Актуальные вопросы фнтовирусологии и защиты растений". Минск. 1997. С. 40-41.

2. Gnutova R.V., Tolkach V.F., Gnutova I.V. Identification of TMV strains from eggplant, tomato and pepper on biological properties // Abstr. 9-th conf. of I.S.H.S. "Vegetable Vims Working group" / Italy. Torino. 1998. P. 6.

3. Толкач В.Ф., Гнутова И.В. Вирусы, поражающие томаты на юге Приморья // Матер, науч.-практ. конф. "Генофонд растений Дальнего Востока России". Владивосток: ДНМЦ РАСХН. 1998. С. 141-143.

4. Какарека Н.Н., Гнутова И.В. Иммунодиагностика штаммов вируса табачной мозаики, идентифицированных на овощных культурах // Тез. Межд. симпозиума по физиологии растений. М: 1999. С. 263-264.

5. Реунов А.В., Гнутова И.В., Лапшина Л.А., Нагорская В.П., Толкач В.Ф. Ультраструктурная характеристика паренхимных клеток листьев табака, инфицированных различными штаммами вируса табачной мозаики // Тез. докл. XVTII Российской конф. по электронной микроскопии. М: 2000. С. 76.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гнутова, Ирина Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ. 4

ГЛАВА I. ВИРУС ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ И ЕГО ШТАММЫ обзор литературы) 1. ' Общая характеристика ВТМ .7

2, Распространение вирусов в растениях , , »

3. Симптомы пораженных растений

4. Круг растений-хозяев.

5. Цитопатология.

6. Штаммовое разнообразие вируса табачной мозаики.

6.1. Штаммы ВТМ, поражающие томаты

6.2. Штаммы ВТМ, поражающие перцы.

6.3. Штаммы ВТМ, поражающие баклажаны.

6.4 Классификация штаммов ВТМ.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Вирусные изоляты, идентифицированные на овощных культурах

2. Биологическое тестирование

2.1. Механическая инокуляция

2.2. Определение физических свойств штаммов ВТМ

3. Получение очищенных вирусных препаратов штаммов ВТМ.

4. Получение штаммоспецифических антисывороток

5. Иммунохимические методы детекции штаммов ВТМ

5.1. Реакция двойной иммунодиффузии,,,,,,,,,

5.2. Ракетный иммуноэлектрофорез.

5.3. Иммуноферментный анализ.

5.3.1. Непрямой вариант

5.3.2. "Сэндвич" метод

6. Изучение вирусных включений методом световой микроскопии.

7, Электронная микроскопия

7.1. Негативное контрастирование .42

7.2. Ультратонкие срезы

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Биологическое тестирование вирусных изолятов ВТМ, выявленных на овощных культурах

1.1. Изолят из перца . 44

1.2. Изолят из томата.53

1.3. Изолят из баклажана.59

2. Физико-химическая и антигенная характеристики изучаемых штаммов ВТМ

2.1. Получение очищенных вирусных препаратов штаммов ВТМ.65

2.2. Получение моноштаммовых антисывороток . 67

2.3. Выявление антигенного родства между штаммами

ВТМ с помощью иммунохимических методов

2.3.1. Реакция двойной иммунодиффузии

2.3.2. Ракетный иммуноэлектрофорез .70

2.3.3. Иммуноферментный анализ .71

3. Ультраструктурная характеристика взаимодействия штаммов ВТМ с клетками листьев табака . 76

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .84

ВЫВОДЫ . 102

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная характеристика штаммов ВТМ (дальневосточные изоляты), идентифицированных на овощных культурах"

Вирус табачной мозаики (ВТМ) является одним из самых контагиозных фитопатогенных вирусов, который поражает большое число видов растений из различных семейств и тем самым наносит огромный экономический ущерб растениеводству, главным образом, овощеводству, декоративному цветоводству и садоводству. Поэтому, изучение этого вируса и его штаммов до еих пор остается актуальной проблемой в прикладной фишовирусологии.

Вирус распространен в природе в виде различных штаммов, которые возникают в результате мутаций в процессе его репродукции. При этом образуемые штаммы значительно различаются по вирулентности (Молдован, 1979; Matthews, 1981; Van Loon, 198?), Наиболее вредоносными и опасными для овощных культур являются многие штаммы фитопатогенных вирусов, в том числе и штаммы ВТМ (Власов и др5, 1978; Толкач, Гнутова, 1996).

Известно, что особенности взаимодействия штаммов с растением-хозяином обусловлены свойствами их структурных белков и РНК (Мэтьюз, 1973). Исследование влияния различных штаммов на состояние растения-хозяина - перспективный путь для изучения механизмов вирусного патогенеза и защитных реакций растений.

Идентификацию вирусов растений обычно начинают с описания биологических свойств изолятов, в результате чего 5 предварительно относят их к определенному виду и роду по принятой Международным комитетом таксономии вирусов (Murphy et al., 1995).

Для характеристики штаммов необходимо всестороннее исследование их с помощью различных методов физиков химических, иммунохимических, цитологических. Физико-химические и электрофоретические исследования позволяют изучать структурные белки. С помощью иммунохимических методов выявляется антигенная специфичность капсидных белков не только вирусов, но и их штаммов. Благодаря специфичности антитела реагируют только с теми эпитопами, в ответ на которые, они образовались, или с вирусами, сходными я© антигенной структуре (Гнутова, 1993а). Цитологические исследования дают представление об особенностях внутриклеточного развития вирусов и их штаммов.

Только на юге Дальнего Востока России выявлено уже около 10 штаммов ВТМ, поражающих перец, декоративные культуры, картофель и травянистые растения. Благодаря новым исследованиям число их ежегодно увеличивается. В последние годы штаммы ВТМ стали причиной снижения урожайности овощных культур - томатов, возделываемых как в открытом, так и закрытом грунте (Толкач, Гнутова, 1998), перцев, баклажанов и др. Поэтому актуальность изучения штаммов ВТМ не вызывает сомнений. Представляется необходимым изучать не только свойства этих штаммов, но и определять их групповую принадлежность в рамках одного вида. б

Цель настоящей работы состояла в изучении биологических, физико-химических, антигенных и цитопатогенных свойств штаммов ВТМ, идентифицированных на юге Приморья на овощных культурах - перце, томате и баклажане и отнесении их к определенной группе штаммов в пределах вида. Кроме того, планировалось провести сравнительный анализ изучаемых штаммов и некротического штамма ВТМ, описанного ранее на перце (Толкач, 1995), который отличается тем, что не заражает системно табак настоящий (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun), томат съедобный (Lycopersicon esculentum Mill.) и вызывает на большинстве тест-растениях реакцию локально-некротическую.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи: 1) выявить экспериментальный круг растений-хозяев и провести сравнительный анализ симптомов, вызываемых исследуемыми штаммами на них; 2) изучить внутриклеточные вирусные включения, индуцируемые каждым штаммом; 3) получить данные о физических и физико-химических свойствах вирусных частиц; 4) исследовать антигенные свойства капсидных белков и выявить вирус- и штаммоспецифические эпитопы для определения степени антигенного родства штаммов; 5) изучить ультраструктуру клеток листьев N. tabacum cv. Samsun, инфицированных исследуемыми штаммами; 6) провести классификацию штаммов по группам в пределах одного вида Tobacco mosaic virus рода Tobamovirus. 7

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Гнутова, Ирина Валерьевна

ВЫВОДЫ

Идентифицированы три новых дальневосточных штамма ВТМ на овощных культурах - перце (ВТМп), томате (ВТМт) и баклажане (ВТМб). Штамм ВТМ на баклажане обнаружен в России впервые.

Показано, что все исследуемые штаммы различаются по кристаллическим и аморфным включениям (Х-телам), образуемым в зараженных клетках табака. Выявленные включения могут служить диагностическим признаком этих штаммов.

Определен круг растений-хозяев (45 видов и сортов из 9 семейств) и выявлены различия штаммов по симптоматологии.

Установлено, что дальневосточный штамм ВТМб имеет наиболее низкую точку термической инактивации (85°С) в сравнении с двумя другими изученными штаммами ВТМ. Иммунохимическими методами (РДД, РИЭФ, непрямым вариантом и "сэндвич" методом ИФА) показана степень антигенного родства штаммов ВТМп, ВТМт, ВТМб и ВТМпн. Выявлены вирусспецифические и штаммоспецифические эпитопы капсидных белков штаммов. Показано, что штамм ВТМб является активным иммуногеном. К этому штамму получена моноштаммовая антисыворотка, которую можно использовать для детекции других штаммов ВТМ.

Электронномикроскопические исследования клеток

103 системно инфицированных листьев N. tabacum cv. Samsun показали, что по степени стимуляции лизосомального компартмента, а также развития внутриклеточных литических процессов исследованные штаммы могут быть расположены в следующем порядке: ВТМп, ВТМб, ВТМт. 8. На основании изучения биологических, физических, физико-химических, антигенных, цитопатогенных свойств штаммы ВТМт и ВТМб отнесены к томатной, а ВТМп - к табачной группам вида Tobacco mosaic virus рода Tobamovirus.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гнутова, Ирина Валерьевна, Владивосток

1. Аксельсен Н., Крелль И., Вееке В. Руководство по количественному иммунозлектрофорезу. М.: Наука, 1977. С. 200-205.

2. Белицер Н.В. Лизосомная система и микротельца в клетках растений и животных: Автореф. дис. .д-ра биол. наук. Л., 1978. 48с.

3. Бойко А.Л. Вирусы и вирусные заболевания хмеля и розыэфиромасленичной. Киев: Наук, думка, 1976. 70с.

4. Васильев А.Е. Функциональная морфология секреторных клеток растений. Л.: Наука, 1977. 208с. Васильева Т. Изучение свойств штамма вируса табачной мозаики, выделенного из растений рода Allium // Биол, науки. 1976. N1. С. 31-34.

5. Гамалей Ю.В. Цитологические основы дифференциации ксилеммы. Л»: Наука, 1972. 144с.

6. Гиббс А., Харрисон Б. Основы вирусологии растений. М.: Мир, 1978. 429с.

7. Гнутова Р.В., Чуян А.Х., Крылова Н.В., Рублева Н.В., Крылов A.B. Характеристика некоторых дальневосточных штаммов вируса табачной мозаики // Биол. науки. 1980. N1. С. 31-37.

8. Гнутова Р.В. Иммунологические исследования в фитовирусологии. М.: Наука, 1985. 183с. Гнутова Р.В. Серология и имунохимия вирусов растений. М.: Наука, 1993а. 301с.

9. Гольдин М. Вирусные включения в растительной клетке и природа вирусов. М.: Изд-во АН СССР, 1963. 204с. Дамрозе И., Копоревич В., Игнаш Я. Вирус табачной мозаики на паприке // Тр. JICXA. Вып. 69. Елгава: ЛСХА, 1972. С. 134-135.

10. Дорохов Ю.Л. Транспорт инфекции в растении: функция, контролируемая геномом вируса и хозяина // Успехи совр. генетики. 1994. N19. С. 3-24.

11. Журавлев Ю.Н. Фитовирусы в целом растении и в модельных системах. М,: Наука, 1979, 247с,

12. Иванова Е.С., Сухов К.С. Штаммы вируса табачной мозаики выделенные из мозаичных растений сладкого перца в теплицах Болгарии // Штаммы вирусов растений и их практическое использование. Елгава. Вып. 191. 1981. С. 53-55.

13. Ивановский Д. О двух болезнях табака // Сел. хоз-во лесоводство. 1892. N2. С. 1-3.

14. Игнаш Я.Р. Сравнительные результаты реакции тест-растений Nicotiana sylvestris Speg et Comes, и Petunia hybrida Vilm, при заражении различными изолятами вируса табачной мозаики // Тр. ЛСХА. Вып. 164. Елгава: ЛСХА, 1978. С. 21-25.

15. Курсанов А.JI. Транспорт ассимилятов в растении. М. : Наука, 1976. 646с.

16. Леднева Р.К. Вирус табачной мазаики, нуклеиново-белковые взаимодействия // Итоги науки и техники. Сер. Молекул, биол. Т.17 М.: ВИНИТИ, 1982. С. 66-138. Лурия С., Дарнелл Дж. Общая вирусология. М: Мир, 1970. 423с.

17. Малиновский В.И. Механизмы устойчивости сверхчувствительных растений табака к вирусу табачной мозаики: Автореф. дис. .д-ра биол. наук. Владивосток, 1998. 45с.

18. Машанский В.Ф., Винниченко Л.Н., Мосевич Т.Н., Дунаев С.Е., Синицкая И.А. Два различных типа изменений ультраструктуры митохондрий в животных и растительных клетках // Ультраструктура растительных клеток. Л.: Наука, 1972. С. 98-102.

19. Мэтьюз Р. Вирусы растений. М.: Мир. 1973. 600с. Молдован М.Я. Вирусные болезни табака и меры борьбы с ними. Кишинев: Штиинца, 1979. 228с. Навалинскене М. Вирусы цветочных культур (идентификация, биология и профилактика заболеваний):

20. Поликсенова В.Д. Повышение устойчивости томатов к вирусным болезням // Матер. Межд. конф. "Актуальные вопросы фитовирусологии и защиты растений". Минск. 1997. С. 38-39.

21. Проценко А.Е. Штаммы или виды вирусов рода Virothrix Ryzk // Штаммы вирусов. Владивосток: ДВНЦ АН СССР. 1977 С. 5-11.

22. Романова С.А,, Леднева В,А. Вирус табачной мозаики на картофеле в Приморском крае // Фитовирусологические исследования на Дальнем Востоке, Владивосток: ДВО РАН. 1989. С. 191-193.

23. Сердеченко В.Д. Штамм вируса табачной мозаики, вызывающий кольцевые пятнистости листьев табака в Молдавии: Автореф. дис. .канд. биол. наук. Киев, 1974. 23с.

24. Силаева A.M. Структура хлоропластов и факторы среды. Киев, 1978. 233с.

25. Сибирякова И.И. Повышение активности антисывороток к вирусам растений, применяемых в иммунохимических реакциях: Дис. .канд. биол. наук. Владивосток. 1987, 141с.

26. Смит К. Некроз табака // Вирусные болезни растений. М. :1. Мир. I960. 72c.

27. Тальянский М.Э. Молекулярно-биологическиеосновы взаимодействия между вирусами растений: Автореф.дис. .д-ра. биол. наук. М., 1984. 35с.

28. Толкач В.Ф., Чуян А.Х., Шафрановская И.В., Крылов A.B. Биологическая характеристика ВТМ, изолированного из ириса в Приморском крае // Бюл. Гл. ботан. сада. 1988. Вып. 157. С. 72-76.

29. Толкач В.Ф., Гнутова Р.В. Вирусы овощных культур // Приморский центр НТИ N 66-96. 1996. 4с.

30. Allam Е.К., Ali M.D.H., Abo Tl-Nasr M.A. Host range as a mean of differentiation between tomato mosaic virus strains // Egypt. J. Phytopathol. 1978(1979), 10. N1. P. 1-7.

31. Amparo V.J. Microbiol. Esp. 1972. 25, N4. P.211-224. Anderer F.A., Uhlig H., Weber E., Schramm G. Primary structure of the protein of tobacco mosaic virus // Nature. 1960. 186. P. 922-925.

32. Atabekov J.G., Morozov S.Y. Translation of plant messenger RNAs // Adv. Virus Res. 1979. V.25. P. 1-91. Atabekov J.G., Dorokhov Y.L. Plant virus-specific transport function and resistance of plant to virus // Ibid. 1984. V. 29. P. 313-364.

33. Blanco S., Herrera C., Abreu S. Comportamien to de doce variedades de pimieto (Capsicum annuum) frente a tres cepas del virus mosaico del tobacco (TMV) // Sienc. agr. 1987. N31. P. 3-7.

34. Cherian S., Joseph J., Muniyappa V., Savithri H.S. Characterization of tobacco mosaic virus isolated from tomato in India // Current Science. 1999. N76(10). P. 1384-1388.

35. Corbett M.K. Some distinguishing characteristics of the orhid strain of tobacco mosaic virus // Phytopathology, 1967. Vol.57. N2. P. 164-171.

36. Строименова E. Нов щам тютюнево мозаичния вирус (ТМВ) по пипера // Градин, и лозар. Наука. 1984. Вып. 21. N 6. С. 72-78.

37. Culver J.N., Dawson W.O. Point mutations in the coat protein gene of tobacco mosaic virus induce hypersensitivity in Nicotiana sylvestris // J. Mol. Biol. 1989. V.2. N4. P. 209-213.

38. Elliot M.S., Zettler F.W., Zimmerman M.T., Barnett O.W., Legrande M.D. Problems with interpretation of serological assays in a virus survey of orchid speciesfrom Puerto-Rico, Ecuador, and Florida // Plant disease. 1996. N80(10). P. 1160-1164.

39. Esau K. Viruses in plant hosts. Form, distribution and pathologic effects. Madison, Milwaukee: and London: Univ. Wisconsin Press, 1968. 225p.

40. Everitt E., Persson M.J., Wohlfart C. PH-dependent exposure of endoproteolytic cleavage sites of the adenovirus 2 hexon protein // FEMS microbiol. Left. 1988. V.49. N2. P. 229-233.

41. Feldman J., Oremianer S. An unusual strain of tobacco mosaic virus from pepper // Phytopathol. Z. 1972. N75. S. 250-267.

42. Feng L., Tian R., Yang C., Yang C.Y. Обследование иидентификация на томатах вирусов и штаммов TMV, CMV в

43. Северном Китае // Zhiwu baohu xuebao = Actaphytophylacica sin. 1996. Vol.23. N1. P. 51-55.

44. Fenner F. Classification and nomenclature of viruses //1.tervirology. 1976. Vol.7. N1/2. P. 65-90.

45. Gebre S., Dumas V., Marchoux G., Pochard E. La virusde la mosaique du tabac chez le piment. 1. Apparation en

46. France du pathotype P 1-2 // Aggronomie. 1981. N10. P.853.858.

47. Gibbs A. Viruses and plasmodesmata // Intercellular communication in plants: studies on plasmodesmata. Berlin; Hiedelberg; New York: Springer, 1976. P. 149164.

48. Gibbs A. Tobamovirus group // С.M.I./A.A.B. Description

49. Plant of Viruses. 1977. N 184. 5p.

50. Giri L., Chessin M. A severe strain of Tobacco mosaic virus from cactus // Phytopathology. 1975. Vol.65. N6. P. 824-825.

51. Gnutova R.V. Comparison of tobacco mosaic virus (TMV) strains by rocket immunoelectrohoresis // Zeszyty problemowe postepow Nauk Roiniczvch, Warszawa. 1983. Z. 291. P. 111-118.

52. Gnutova R.V., Tolkach V.F. Taxonomy of the family Potyviridae // Arch. Phytopath. Pflanz., 1998. Vol.31 P. 543-548.

53. Golinowski W., Kupidlowska E., Skrzeczkowski L. Degradation of potato virus X (PVX) in the intercellular spaces of potato mesophyll // Phytopathol. Z. 1981. Bd.101. H.2. P. 136-142.

54. Greenleaf W.f Cook A., Heyn A. Resistance to tobacco mosaic in Capsicum with reference to the Samsun latent strain // Phytopathology. 1964. Vol.54. N11. P. 1367-1371.

55. Hart R.G. Morphological changes accompanying thermal de naturation of tobacco mosaic virus // Biochim. Biophys. Acta, 20. 1956. P. 388-389.

56. Henry E.W. Tobacco mosaic virus in tissues of Nicotiana tabacum cv. "Little Turkish"// Cytology. 1980. Vol.45. N 3. P.467-476.

57. Kiss E., Lovai Z., Suranyi R., Gombos J. The effect of ecological factors on the virus infection of pepper // Proc. Int. Conf. Integr, Plant Prot. 1983. Vol.3. P. 58-64.

58. Macleill B.H. A specializes tomato from of the tobacco mosaic virus in Canada // Can. J. Bot., 40. 1. 1962. P. 1603-1604.

59. Markham R., Hitchborn J.H., Hills G.J., Frey S. The anatomy of tobacco mosaic virus // Virology, 1964. N22. P. 342-359.

60. Matile P. Plant lysosomes// Lysosomes in biology and pathology. Amsterdam: North-Holland Publ. Co., 1969. P. 406-430.

61. Matthews R.E.F. Classification and nomenclature of viruses Third report of the international committee on taxonomy of viruses // Intervirology, 1979, Vol,12, N3-5. P. 129.

62. Matthews r.e,F, Plant virology. Second edition. New York; London; Toronto; Sydney; San Francisco: Acad. Press, 1981. 897p.

63. Murphy F., Fauquet C., Bishop D. et al. The classiffication and nomenclature of virus // Virus Taxonomy 6-th report of the international Committee on Taxonomy of Virus. 1995. P. 1-586.

64. Nagai J., Takauchi T.f Tochihara H. A new mosaic of sweet pepper caused by pepper strain of tobacco mosaic virus // Ann. Phytopathol. Soc. Jap. 1981. Vol.47. N4. P. 541-546.

65. Pares R.D. A tobamovirus infecting capsicum in Australia // Ann. App. Biol. 1985. 106. N3. P. 469-474. Pop I., Jilaveanu A. O boala necrotica a vinetelor pro dusl de virusul mozaicului tutunului // Stud, si cerc. biol. 1975. Vol.27. N3. P. 239-243.

66. Prochazkova Z. Presumed role of mucilage of plantainseeds in spread of tobacco mosaic virus // Biologia

67. Plantarum. 1977. Vol.19. N4. P. 259-263.

68. Rast A. Maat D. Yellow mosaic strains of Capsicum mosaicvirus // Meded. Fac. Landbouwwetensch Rijksuniv. Gent.1986. Vol.51. N2B. DEEL 2. P. 791-797.

69. Reinero A., Beachy R.N. Association of tobacco mosaicvirus coat protein with chloroplast membranes in virusinfected leaves // Plant Mol. Biol. 1986. V.6. N5. P.291.301.

70. Reinero A., Beachy R.N. Reduced photosystem II activity and accumulation of viral coat protein in chloroplasts of leaves infected with tobacco mosaic virus // Plant Physiol. 1989. V.89, N1. P. 111-116.

71. Rochon D., Siegel A. Chloroplast DNA transcripts are encapsidated by tobacco mosaic virus coat protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V.81, N6. P. 17191723.

72. Russo M., Martelli G.P. Ultrastructure of turnip crinkle- and saguaro cactus virus-infected tissues // Virology. 1982. V.118. N1. P. 109-116.

73. Shaw J.G., Plaskitt K.A., Wilson T.M.A. Evidence that tobacco mosaic virus particles disassemble cotranslationally in vivo // Virology. 1986. V.148, N2. P. 326-336.

74. Sulzinski M.A., Zaitlin M. Tobacco mosaic virus replication in resistant and susceptible plants: in some resistance species virus is confined to a small number of initially infected ceils // Virology. 1982. V.121. N 1. P. 12-19.

75. Tosic M., Videnov E. Prilog proucavanju nekih izolata virus mozaika duvana in paprike // Zast. Bilja. 1981. Vol32. N157. P. 285-292.

76. Wetter C., Dore I., Bernard M. Bell pepper mottle virus, a distinct tobamovirus infecting pepper // Phytopathol. Z. 1987. 119, N4. P. 333-344.126

77. Wilson T.M.A. Cotranslational disassembly of tobacco mosaic virus in vitro 11 Virology. 1984. V.137, N2. P. 255-265.

78. Wittmann H.G., Wittmann-Liebold B. Protein chemical studies of two RNA viruses and their mutants, Cold Spring Hrbor Symp. Quant, Biol., 31. 1966. P. 163-172.

79. Христова Д., Кайтазова П. Вирусни болести по доматите в България през периода 1986-1994 гг. // Растениевьд. Науки. 1996. 33. N3. С. 57-59.

80. Zaitlin М., Israel H.W. Tobacco mosaic virus (type strains) // CMI/AAB. Descriptions of plant viruses. 1975. N 151. 5p.

81. Zaitlin M., Hull R. Plant virus-host interactions // Ann. Rev. Plant Physiol. 1987. V.38. P. 291-315.