Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Изучение физико-химических особенностей потивирусов, поражающих растения семейств Brassicaceae, Commelinaceae и Fabaceae на Дальнем Востоке

ВАК РФ 06.01.01, Общее земледелие

Автореферат диссертации по теме "Изучение физико-химических особенностей потивирусов, поражающих растения семейств Brassicaceae, Commelinaceae и Fabaceae на Дальнем Востоке"

I , О Ой

На правах рукописи

2 СП" 1П--3

МОИСЕЕНКО Лариса Игнатьевна

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ПОТИВИРУСОВ, ПОРАЖАЮЩИХ РАСТЕНИЯ СЕМЕЙСТВ Втжсасеае, СоттеИпасеае и РаЬасеае на ДАЛЬНЕМ ВОСТОКЕ.

06.01.01 - защита растений 03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВЛАДИВОСТОК 1998

Диссертационная работа выполнена на Горнотаежной станции ДВО РАН. Значительная часть экспериментов выполнена в отделе вирусологии Биолого-почвенного института ДВО РАН и на кафедре вирусологии МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители - доктор биологических наук,

A.В.Крылов

кандидат биологических наук, с.н.с. П.С.Зориков

Консультант - кандидат биологических наук, с.н.с,

B.К. Новиков.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор,

Ю.Т. Дьяков

доктор биологических наук, А.В- Реунов.

Ведущая организация - Всероссийский институт защиты растений

Защита диссертации состоится « 25 » сентября 1998 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 003.99.02 при Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022 Российская Федерация, г.Владивосток, Проспект 100-летия Владивостока, 159.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке ДВО РАН.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах с заверенными подписями просим направлять по адресу: 690022, Владивосток, Проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН, ученому секретарю. Факс (4232)314050

Автореферат разослан «2А » августа 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук 4— " / Е.П. Иванова

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В связи с организационными изменениями в сельском хозяйстве России (возникновением арендаторства, фермерства) наблюдается падение объема защитных мероприятий в сельском хозяйстве, что ведет к увеличению поражаемости возделываемых культур вредителями и болезнями. Детальное изучение патогенов является необходимым условием в разработке методов профилактики заболеваний и уменьшения их вредоносности. Потиви-русы наиболее многочисленны среди фитовирусов. Экономический ущерб от этой группы патогенов определяется значительным снижением урожайности сельскохозяйственных (соя, картофель, сахарный тростник) и декоративных культур. Знание свойств вирусов и их структурных компонентов позволяет разрабатывать и применять высокочувствительные методы диагностики. Это необходимо для предупреждения инфекций, защиты сельскохозяйственных растений от вирусных болезней и, в конечном итоге, повышения урожайности.

При изучении проблемы защиты растений от болезней до сих пор уделялось недостаточно внимания физико-химическим характеристикам патогенов. К единичным положительным примерам можно отнести термо- и химиотерапию, причем наиболее эффективной является тепловая обработка (Мэтыоз, 1973; Гиббс, Харрисон, 1978).

Наиболее успешным примером использования знаний о физико-химических свойствах вирусов в целях защиты растений является экспресс-метод определения зараженности сои, базирующийся на возбужденной люминесценции белков при 340-350 нм, на основе которого было разработано первое устройство для отбора безвирусных семян (Трубицин и др., 1974). Созданная в дальнейшем промышленная установка позволяет отбирать 300 кг здоровых семян в час, что увеличивает урожай на 20% (Ермак, 1997).

Современные исследования направлены на изучение структурной организации патогенов. При протеолизе капсидных белков, как при ферментативной обработке, так и в процессе хранения препаратов потивирусов, происходит отщепление N- и С-концевых фрагментов, которые содержат наиболее иммуно-доминантные эпитопы, в основном индивидуальные (Shukla, Ward, 198В). Они располагаются на поверхности глобул и наиболее подвержены деградации. Исследования протеолиза белков оболочки потивирусов являются актуальными, так как углубляют знания о молекулярной организации возбудителей, открывают новые возможности получения надежных диагностикумов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Целью работы явилось изучение физико-химических особенностей трех дальневосточных потивирусов: мозаики турнепса (ВМТ), мозаики клевера горного (ВМКГ) и вируса, идентифицированного на традесканции белоцветковой (ВТБ). Упомянутые возбудители наносят урон сельскохозяйственнным и декоративным растениям семейств Brassicaceae, Fabaccae и C.ommelinaceae в связи с чем проведенные исследования являются актуальными с позиций защиты растений. В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

-подобрать методы выделения для каждого возбудителя; -охарактеризовать препараты вирионов, используя электронномикроскопи-ческую, спектрофотометрическую, электрофоретическую технику исследований;

-изучить свойства структурных компонентов (белок оболочки, РНК); -изучить процесс деградации белков оболочки при хранении препаратов; -разработать иммунодиагностикумы для практического выявления заболеваний, вызываемых ВМТ и ВМКГ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Нами изучены три дальневосточных потивируса: ВМТ, ВТБ и ВМКГ. ВТБ и ВМКГ впервые идентифицированы на территории России. Предполагается, что они являются новыми.представителями группы потивирусов. Изучены их физико-химические свойства, а у ВМКГ также и биологические. ВМТ распространен повсеместно, в природе ( на Дальнем Востоке России и в Японии) чаще всего встречается в смеси с вирусом мозаики редиса (BMP), вызывая заболевание деформирующей мозаики редиса. Нами получены дополнительные данные, подтверждающие факт комплексного характера заболевания при двойном заражении ВМТ и BMP. Эти исследования необходимы для выработки стратегии и тактики защиты растений от вирусных заболеваний.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. ВМТ и ВМКГ поражают многие сельскохозяйственные растения из семейств Brassicaceae и Fabaceae, являющиеся ценными овощными, масличными и кормовыми культурами. Изготовленные к ним диагностикумы рекомендуется использовать для проведения защитных мероприятий. ВТБ наносит урон декоративным культурам га семейства Commelinaceae, в последнее время широко использующимся для озеленения и фитодизайна.

Изученный процесс протеолиза капсидных белков в препаратах потивирусов ведет к отщеплению наиболее иммунодоминантных областей вирионов, так как вирусспецифические эпитопь? локализованы в N- и С-концевых участках бел-■ ковой глобулы (Shukla et al., 1988). Предполагается, что N- и С-концевые фрагменты белков содержат и штаммоспецифичные эпитопы (Sukla, Ward, 1988; Гнутова и др., 1991), поэтому идущий в процессе хранения протеолиз не может не влиять на вирусспецифичность получаемых диагностикумов.

Полученные данные о физико-химических свойствах дальневосточных патогенов вносят вклад в наши знания о свойствах потивирусов, что позволит успешнее разрабатывать и применять комплекс мер по защите растений.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. Результаты были представлены на конференции, посвященной 100-летию со дня открытия вирусов Д.И.Ивановским (Ростов-на-Дону, 1992), Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 1995), заседаниях Ученого совета ГТС ДВО РАН. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 2 тезисов.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена наЮ&траницах, содержит 6 таблиц, иллюстрированаг8 рисунками, состоит из введения, обзора

литературы (глава 1), описания материала и методов (глава 2),, экспериментальной части (глава 3, 4), обсуждения результатов (глава 4), выводов и списка литературы, включающего -/W источников, в том числе 80 иностранных.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили ВМТ, ВТБ и ВМКГ, идентифицированные на Дальнем Востоке. Заражение растений и накопление материала проводили в вегетационном домике и теплице с нерегулируемым режимом Биолого-почвенного института ДВО РАН. .ВМТ накапливали в растениях лобы (Raphanus sativus L. subsp. sinensis (Mill.) Sazón convar loba Sazón) сорта "Октябрьская". На тех же растениях проводили изучение заболевания, местного под названием "деформирующей мозаики редиса", последовательно заражая лобу ВМТ и BMP. ВТБ накапливали в растениях тинантии высокой (Tinantia erecta Schlecht.), а ВМКГ - в бобах (Faha bona Medic.) сорта "Русские черные".

Растения лобы и тинантии инокулировали экстрактом, который получали из инфицированных листьев в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,5 % 2-меркаптоэтанола (pH 7,6). Для инфицирования бобов ВМКГ листья больных растений гомогенизировали в дистиллированной воде. На инокулируемые листья предварительно напыляли карборунд. После заражения растения затеняли. Инфицировали от 10 до 20 растений в стадии семядолей или 4-5 листьев. Листья лобы, зараженные ВМТ, собирали на 12-15 день после инокуляции, а листья тинантии и бобов, зараженные соответственно ВТБ и ВМКГ, - через 15-20 дней. Накопление вирусов в инфицированных растениях контролировали с помощью электронного микроскопа и иммунохимическими методами.

Точку термической инактивации (ТТИ), предельное разведение и период сохранения инфекционности (ПСИ) ВМКГ в соке изучали по стандартным методикам (Шоймоши, 1974;Гиббс, Харрисон 1978).

Для получения препаратов вирусов подбирались условия, замедляющие действие растительных и бактериальных протеаз, препятствующие агрегации и фрагментации частиц, способствующие максимальному выходу вирусов. Все операции во время выделения и очистки вирусов выполняли при 4 °С. Модификации были направлены на сокращение длительности процесса выделения препаратов потивирусов. Степень очистки вирусных препаратов контроли-. ровали методами спектрофотометрии и электронной микроскопии. Кроме того, на разных стадиях очистки проводили электрофоретический анализ.

Препараты потивирусов хранили при температуре 4 °С. Для предотвращения бактериального зарастания в суспензии вирусов после спектрофотометри-рования добавляли азид натрия в концентрации 4x1o"4 М. При изучении процесса деградации капсидного белка ВТБ в буферные растворы вводили фе-

!

нилметилсульфонилфторид (ФМСФ) - ингибитор серинсодержащих протеаз - в концентрации 0,1 мМ (Cecil et al., 1977).

Выделение ВМТ проводили по методу В.К. Новикова с соавторами (Новиков и лр., 1984) с некоторыми модификациями ^которые заключались в выборе буфера для гомогенизации (0;1 М калин-фосфат, содержащий 0,2% 2-меркаптоэтанола, рН 7,6) и осветлении-смесыо хлороформа (1/8 объема) и бу-танола (8%). Выделение ВМТ и BMP, возбудитлей деформирующей мозаики редиса, проводили по этой же схеме.

ВТБ очищали по двум схемам, составленным на основании методик, опубликованных ранее для других потивирусов (Новиков и др., 1984; Dougherty, Hiebert, 1980). Предложенная нами методика включала гомогенизацию в 0,05 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,005 М этилсндиамиитетраацстата натрия и 0,2% 2-меркаптоэтанола, рН 7,8, ступенчатое осветление первоначально смесыо хлороформа (1/8 объема) и бутанола (8%), а затем тритоном Х-100 до 1%. Осаждение частиц вируса также проводили в два приема: 4%-ным поли-этиленгликолем (М.м. 6000) в присутствии 0,1 М NaCl и повторно 8%-ным по-лиэтилепгликолем. •

Для получения препаратов из растений, инфицированных ВМКГ, составляли три схемы очистки. При этом были опробованы и модифицированы методики для выделения потивирусов (Gill, 1971; Новиков и др., 1984; Dougherty, Hiebert, 1980; Hisachi, Wakimoto, 1985). В наиболее удачной методике (III-я схема) использовали глициновые буферы (рН 7,0), осветление проводили смесыо хлороформа и бутанола (8 % каждого), осадки после низкоскоростного центрифугирования подвергали воздействию'ультразвука при частоте 12 Гц в течение 5 сек на ультразвуковом дезинтеграторе (MSE, Великобритания). Ультрацентрифугирование проводили при 30000 g в течение 2,5 час.

Оптические свойства ВМТ, ВТБ и ВМКГ изучали в ультрафиолетовой области спектра. Для расчетов концентрации ВМТ и ВМКГ использовали коэффициент экстинкции Е0,'%/2б6им равный 3,0 о.е. (Bokx, Huttinga, 1981). Для определения концентрации вируса, выделенного га традесканции белоцветковой, использовали коэффициент экстинкции, равный 2,4 о.е. (Purcifull, Hiebert, 1982). Спектры поглощения снимали на спектрофотометрах СФ-26, МОМ-204 и Speeord UV-Vis в диапазоне длин врлн от 220 до,300 им. .

Образцы для электронного микроскопа готовили, используя модифицированный метод разбавленных суспензии (Развязкина, Полякова, Штейн-Марголина, 1968). Для негативного контрастирования использовали растворы солей тяжелых металлов - 2%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК), рН 6,5-7,0 или 2%-пый водный раствор уранилацетата (УА), рН 4,2. Поддерживающей пленкой служили 0,5-2%-ный или 0,1-0,2%-ный раствор коллодия, в амилацетате или формваре (поливииилформальдегиде) соответственно. Препараты исследовали с помощью электронных микроскопов ЭВМ-100 и Hitachi 7В. Электронно-оптическое увеличение' составляло 20000-40000.

Седиментациоиные свойства В'ГБ определяли с помощью ультрацептрнфу-гироиания в градиентах плотности сахарозы.(10-40 %) и хлористого цезия. ПрефЬрмированный градиент плотности CsCl готовили из двух ступеней объемом 16 и 19 мл с плотностью 1,48 г/см3 и 1,24 г/см' соответственно.

Для получения диагностических антисывороток вирусными антигенами иммунизировали кроликов по схеме: 1-й день внутрикожно, '7-й день - подкожно и 14-й день - внутримышечно. Разовая доза иммуногена не превышала 1 мг для вируса мозаики турнепса и 0,3-0,5 mi- для чируса мозаики клевера горио-• го. Через месяц проводили однократную внутривенную инъекцию. Кровь отбирали на пятый день после последней инъекции. В качестве иммуностимулятора использовали адъгавант Фрейнда или его аналоги. Титры полученных антител определяли в реакции двойной иммунодиффузии (РДЦ) в 1 %-ном агаровом геле и в непрямом варианте иммуноферментпого -анализа ГИФА). Антигенное родство ВМТ и ВМКГ с дальневосточными потивирусами определяли непрямым методом ИФА (Сибиряков;! и др., 19S7). Исходная концентрация антигенов для сорбции составляла 10-50 мкг/мл (ВМТ) и 10 мкг/мл (ВМКГ), антивидового конъюгата - 1: 1000 (Моисеенко и др., 1991; Волков и др., 1994)..

С помощью электрофоретического анализа в денатурирующей системе У.К. Лэммли (Laenimli, 1970) определяли чистоту препаратов, молекулярную массу и степень деградации капсидных белков. Для. определения молекулярной массы капсидных белкой и качестве маркере)» пенользоиилн бычий сывороточный альбумин (68000), овальбумин (45000), .химотрипсиноген (25000), лизо-цим (14300) или стандартный набор белков .- маркеров фирмы "Serva" (cat N33856).

Молекулярные массы капсидных белкой ВМТ, ВТБ и ВМКГ определяли по общепринятому методу (Weber, O.sborn. 19691.

Деградацию капсидных белков ВМТ, ВТБ и ВМКГ в процессе хранения изучали также с помощью электрофореза ' в денатурирующей системе (Laemmli, 1970) в полиакриламидном геле (ПААГ). Анализ белков проводили непосредственно после выделения, в дальнейшем образцы отбирали еженедельно в течение 1-1,5 месяцев. В каждую ячейку геля вместе с вирусным белком наносили ^изоцим в качестве внутреннего стандарта.

Ограниченный протеолиз капсидных белков проводили по методу Д.В. Клсисланда о соавторами (Cleveland et ¿il.,1977).

Выделение РНК потнвирусов проводили методом фенольной дспротеиниза-Ции в присутствии додецилсульфата натрия (Мейхи,' .1988). Гомогенность и степень очистки препаратов определяли спектрофотометрически и электрофо-ретичееки. При расчете концентрации использовали коэффициент экстинкции (Е" |%Л„ц, равным 25. Фракционирование проводили в 0,8 % геле агарозы и 3 % ПААГ (Rickwood, Harnes, 1982).

Трансляцию вирионных РНК in vitro проводили « бесклегочных белок-. синтезирующих системах из лизатов ретикулоцитов кролика (Pelham, Jackson, 1976) и проростков пшеницы (Haiiiis, Higgins, 1987)!

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВИРУС МОЗАИКИ ТУРНЕПСА легко передавали механически. Симптомы поражения проявлялись на листьях через 10-14 дней. Препараты ВМТ имели типичный пуклсопротсидиый спектр поглощения п ультрафиолетовой области с максимумом при 265-им и минимумом при 245 нм. Соотношение поглощения Агбо/Агко варьировало в пределах 1,18-1,2. В среднем выход вируса составлял 10-12 мг на 100 г свежих листьев, хотя нами было зарегистрировано и более высокое содержание патогена в инфицированных растениях (18-20 мг/100 г).

При просмотре препарата ВМТ в электронном микроскопе выявлены частицы одного типа с модальными размерами 760-780 х 11-12 нм (рис. I ).

Рис. I. Электронномикроскопическая фотография ВМТ. Контрастирование 2%-ным УА. Увеличение х 40000.

Получены строго специфичные ангисьшоротки к ВМТ с титрами в РДД -1:16 - 1:32, непрямом методе ИФА - 1:3200 - 1:6400. Для непрямого варианта ИФА минимальное выявляемое количество ВМТ в экстрактах зараженных растений составляет 2-5 мкг/мл. По наличию перекрестных реакций и одинаковому характеру кривых выявлено наличие общих эпитопоп ВМТ с дальневосточными потивирусами: Y- и А- вирусами картофеля (YBK, АВК), желтой мозаики фасоли (ВЖМФ), желтой карликовости лука (ВЖКЛ), мозаики сои (ВМС), мозаики гиппеаструма (ВМТ), ВТБ.

ДЕФОРМИРУЮЩАЯ МОЗАИКА РЕДИСА. Заболевание изучали после последовательного заражения растений лобы ВМТ и BMP. Симптомы поражения появлялись на 12-17 день в виде мозаики, посветления жилок. Позднее развивались локальные поражения в виде хлоротичных колец и рисунка с последующей деформацией листовой пластины. На нижней поверхности листовой пластины иногда появлялись пластинчатые энации-выросты. Таким образом, нами наблюдалась картина типичного заболевания. При просмотре препаратов вирионов в электронном микроскопе было выявлено наличие частиц

двух типов - извитых нитевидных, и полиэдрических. Модальные размеры нитевидных частиц составляли 760-780 х 11-12 нм, что соответствует морфологии ПМТ (попшнруг.) Диаметр nnmn./rpimrrimv члстпн pnnnn 28 10 нм. что тгтпнч но для BMP (комовирус). Количество вирионов ВМТ и BMP приблизительно одинаково (рис. 2).'

Из полученного препарата возбудителей болезни была выделена суммарная РНК. Электрофорезом в ПААГ выявлено наличие трех типов молекул. Зона с молекулярной массой 3,5 MD (рис. 3 п) соответствует молекулярной массе РНК потивирусов и идентифицируется нами как РНК ВМТ. Две молекулы с массами 2,1 и 1,3 MD (рис. 3 6, в) - компоненты РНК, BMP.

Рис.2. ЭлектрОнномикроскопическая фотогрлфпп ппрус.ол nmfiv гштслсй деформирующей мозаики редиса: ВМТ и BMP (указаны стрелкой). Увеличение х 40000.

Рис. 3. Электрофореграммы РНК ПМТ (л) и BMP Сб.п/). г-РНК ВТМ.

ВИРУС ИЗ ТРАДЕСКАНЦИИ БЕЛ01ШЕТКОВОЙ. Препараты выделяли из листьев на 21-28 день после заражения. Предложенная нами методика, включающая экстракцию ВТБ из инфицированных тканей буфером с высокой ионной силой, осветление органическими растворителями и обработку тритонам X 100 птппдипл получить более чнетиг прспярятм П результате применения модифицированной нами методики был получен препарат вируса с ти-

пичным для нуклеопротеидов спектром поглощения в ультрафиолетовом свете. Соотношение максимального и минимального поглощения составляло 1,13, а соотношение А 260 /А 280 - 1,35, что свидетельствует о степени чистоты препарата и целостности вирионов. Максимальный выход вируса составил 12-15 мг на 100 г свежих листьев.

Результаты электронной микроскопии показали невысокую степень агрегации и фрагментации частиц ВТБ, модальные размеры которых составляли 750-780 х 12 нм. В некоторых вирионах просматривалась поперечная-исчер-ченность (рис. 4).

Рис.4. Электронномикроскопическая фотография ВТБ. Контрастирование 2% У А. Увеличение х 40000.

В градиенте концентрации сахарозы ВТБ осаждался медленнее, чем вирус табачной мозаики (ВТМ), в виде одной зоны. При аналитическом ультрацентрифугировании в градиенте плотности CsCl он также седиментировал одной зоной. Плавучая плотность колебалась от 1,316 до 1,33 - 1,34 г/см 3 в зависимости от способа получения и времени хранения препарата.

ВИРУС МОЗАИКИ КЛЕВЕРА ГОРНОГО. При изучении круга растений-хо зяев показано, что ВМКГ заражал 17 видов, преимущественно из семейства бобовых (табл 1). Установлено, что вирус передается, как и все потивирусы, механически и тлями неперсистенгно. Нами была осуществлена передача персиковой тлей ßiyzus persicae Sulz.). Через семена пораженных растений гороха, бобов, фасоли, маша и вигны передача инфекции не происходит.

ТТИ ВМКГ расположена в диапазоне 55-60 °С, в соке бобов вирус сохранял инфекционность в течение двух суток, предельное разведение - 1:1001:1000. Препараты, полученные по предложенной нами методике, имели типичный нуклеопротеидный спектр, с соотношением поглощения 260/280 нм равным 1,2. Средний выход вируса при очистке - 3 мг на 100 г свежих листьев. При благоприятных условиях в теплице (умеренная температура, длинный световой день в апреле-мае) выход вируса составлял 10-12 мг на 100 г листового материала.

Таблица

Круг растений-хозяев вируса мозаики клевера горного По Волкову, Толкач, Моисеепко, Какарека, Сибпрякопой, Гнугопон (1994)

Род, вид растения

Симптомы заболевания

Amarant/ms aureus /,.

Chenopodium amaranlicolor C'oste et Reyrtier

('. ficifolium Smith

C. quinoa IVilld

Faha bona Medic

Glycine hispida ßdoench) Maxim

Lahlah purpureus Savi Lens culinaris Medic Medicago luptdina L. Phaseolus aureus Roxb. P. cocäneus L. P. mungo L. P. vulgaris (L). Savi Pisum jamardi Schrenk P. sativum (ICov. Trigonellafoemuv-ymc. /,. T. gladiata Ledeb

Некротические пятна Хлоротичные пятна Некротические пятна Некрозы Мозаика

Мозаика, хлоротическая крап-чатость

Без симптомов . Хлоротическая мозаика Мозаика

Точечные некрозы Мозаика

Некрозы, пожелтение жилок Желтая крапчатость Хлороз

Мозаика, скручивание листьев Мозаика, хлороз жилок Мозаика, хлороз жилок

■Рис.5 . Электронномикроскопическая фотография ВМКГ. Контрастирование 2 % УА. Увеличение х 40000.

Электронномикроскопически в препаратах ВМКГ выявлены извитые нитевидные частицы, характеризующиеся значительной степенью агрегации. Модальные размеры вирионов, контрастированных забуференным раствором ФВК при рН 4,5, составляли 780 х 12 им, а при рН 7,5 - 825 х 13 им.

Титр антисыворотки ВМКГ и РДД составил 1:32, при определении его и непрямом варианте ИФА 1:6400 - 1:12800. С помощью метода ИФА было показано, что ВМКГ в препаратах выявляется при концентрациях 1-3 мкг/мл, а в соке инфицированных бобов - при разведениях 10° - 10"'' . При исследовании сходства ВМКГ с ВМС и ВЖМФ была обнаружена высокая степень антигенного родства ВМКГ со вторым вирусом.

СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ.. Препараты РНК исследуемых нами вирусов в ультрафиолетовом свете имели минимум поглощения при 230 нм и максимум - при 260 нм, что является характерным для РНК фитопатогенных вирусов. Соотношения поглощения в минимуме и максимуме так же, как и поглощения при длине волны 260 и 280 нм, свидетельствуют о достаточно высокой степени чистоты препаратов РНК:

Вирусы ВМТ ВТБ ВМКГ

Агм/цн 2,47 2,36 2,40

А26./2Х1. 1,95 1,87 1,84

РНК ВТБ в 3 % ПААГ мигрирует в виде одной зоны с электрофоретической подвижностью, близкой к подвижности РНК УВК (М.м. 3.2 МО), и меньшей, чем у РНК ВТМ (М.м. 2,0 МП). Молекулярная масса РНК ВТГ> составила 3,2 МО.

В 0,8 % геле агарозы РНК ВМТ, ВТБ и ВМКГ также мигрируют в виде одной зоны. Молекулярные массы РНК ВМТ и ВМКГ составляют 3,5 МО, ВТБ -3,2 МБ.

. При трансляции РНК ВТБ ш \>ит в белоксинтезирующей системе из лиза-тов ретикулоцитов кролика выявлено четыре полипептида с молекулярными

а б в г д ж з

Рис. 6. Электрофореграммы капенд-ных белков: а - ВМТ, б - ВТБ, в - ВМКГ, г-з - белки-маркеры.

массами 70, 45, 14 и 12 кЭ. В бесклеточной системе из зародышей пшеницы РНК ВМТ, ВТК и ВМКГ транслируют гетерогенный набор гюлипептндоп с молекулярными массами 300, 100-120, 70, 50, 40-45, 30-35 и 20 к!>

Непосредственно после выделения электрофорезом в Г1ААГ в составе белковой оболочки вириопов ВМТ выявлено наличие двух типов полипептидои с молекулярными массами 38 и 32 кБ. Молекулярные массы белков оболочки ВТБ и ВМКГ составляют 34 и 36 кЭ соответственно (рис.6).

ПРОТЕОЛЭТИЧЕСКОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ КАПСИДНЫХ БЕЛКОВ ПРИ ХРАНЕНИИ В процессе хранения препаратов вирусов наблюдается появление дискретных форм белка с убывающей молекулярной массой. Через две недели хранения препаратов при 4-°С в присутствии антисептика у изучаемых потиви-русов обнаруживали дополнительные полипептиды:

Вирус Основные . Дискретные

зоны (кЭ) зоны (Ш)

ВМТ 38,0 29,0

32,0 27,0

ВТБ ■ 34,0 31,9

29,4

ВМКГ 36,0 . 34,5

32,0

Через месяц хранения препарата ВМТ наблюдали'6-7 дискретных форм белка, а ВТБ - 5-6. При этом в составе белка оболочки ВТБ обнаружили полипептид с молекулярной массой около 18 кБ. Количество исходных белковых' субъединиц уменьшалось (рис.* 7). Следует отметить, что после переосаждения и ресуспендирования частиц потивирусов в свежеприготовленных буферных растворах протеолиз не прекращался.

' Показано, что добавление ФМСФ в ресуспендирукмций буфер на последней стадии выделения препарата ВТБ и в буфер для хранения в концентрации 0,1 мМ существенно замедляло деградацию капсидного белка. Появление одной дополнительной дискретной зоны с молекулярной массой 31,9 кП отмечено лишь к концу пятой недели хранения. В течение месяца в этом препарате белок оболочки оставался практически шггактным (рис. 8).

Дальнейшее изучение капсидных белков потивирусов и. продуктов их деградации проводили методом пептидного картирования после частичного гидролиза ггапаином в геле. Белки оболочки ВМТ, ВТБ и ВМКГ с соответствующими молекулярными массами 38, 34, и 36 кЭ при этом расщепляются на 10-14 пептидов (рис. 9 а, б, г). Причем по электрофоретической подвижности гидро-лтатои отмечается большее сходство белков ВМТ и ВМКГ.

а б в

а б

Рис. 7. Рис. 8.

Рис. 7. Электрофореграммы капмсных белков ВМТ (а) и ВТБ (б) через месяц хранения; в - бег.ки-маркеры.

Рис. 8. Электрофореграммы калийного белка ВТБ: а - непосредс твенно после выделения: б - через месяц хранения с ФМСФ.

а б в г д

Рис. 9. Электрофореграммы ггодуктов частичного гидролиза капсидных белков трех пот, зирусов: а - ВМКГ (36 кЭ); б - ВТБ (34 Ш); в - (32 кЭ): г - РМТ (38 кО к л - ВМТ (32 кО). В скоб ках указаны молекуляр;- че массы "юлковых компонентов

Продукты деградации капсидных белков, образующиеся при выделении ВМТ (32 kD) и хранении ВТБ (3 1,9 kD) при частичном гидролизе папаином, расщепляются на 10-12 лолипептидов (рис. 9 в, д). Гидролиза ты белков оболочки ВМТ и В'ГБ и продуктов деструкции одноименных вирусов совпадают пи злек-трофоретпческой подвижности. Это свидетельствует об идентичности их аминокислотных последовательностей и подтверждает, что низкомолекулярные пептиды, появляющиеся в препаратах потивирусов в процессе выделения и хранения, являются продуктами деградации исходных капсидных белков.

ОБСУЖДЕНИЕ

ВРЕДОНОСНОСТЬ.. Из трех изученных потивирусов наибольший ущерб наносит ВМТ. Он зарегистрирован в Канаде (Nicolas, Laliberte, 1991), Китае (Kong et al., 1992), Японии (Nakasliima et al., 1993), США и Индии (Had et al., 1994). ВМТ инфицирует большое количество экономически важных культур из семейства Brassicaceae, включая масличные. Поражает декоративные растения (Dekker et al.', 1993). Идентифицированный на Дальнем Востоке изолят ВМТ заражает растения 23-х видов из семейств Brassicaceae, Amaranthaceae, Asleraceae, Chenopodiaceae и Solanaceae (Толкач, 1995). Отличается более высокой точкой температурной инактивации: 65 °С (Крылов, 1992) и 70 °С (Толкач, 1995) и является одним из самых термостабильных штаммов. ТТИ других штаммов ВМТ колебнется в пределах от 30 до 60 °С (Liza, Lovisolo, 1976; Kobyko, May, 1989). Дальневосточный изолят ВМТ меньшее время сохраняет инфекционность при комнатной температуре (2 суток) и имеет более узкий круг растений-хозяев (Крылов, 1992). Сужение круга растений-хозяев отмечается при длительном культивировании на одном растеннии (Hollings, 1955; Станголис и др., 1977), что, по-видимому свидетельствует о длительной циркуляции вируса в условиях юга Дальнего Востока России на крестоцветных (редис). ' *

ВТБ был впервые идентифицирован в России и определен A.B. Крыловым (Крылов, 1987) как вирус мозаики коммелины. Известны три потивируса, которые поражают растения семейств Commelinaceäe: мозаики коммелины, тра-десканции/зебрины и анейлемы (Baker, Zetter, 1988). Вирус анейлемы не заражает растения родов Rhoeo, Tradescanlia и Zehrina, которые поражает вирус, выделенный в Приморье из традесканции белоцветковой. Исследуемый изолят незначительно -отличается по кругу растений-хозяев как от вируса мозаики коммелины (Morales, Zettler, 1977), так и традесканции/зебрины (Lokhart et al., 1981), что дало основание В.Ф. Толкач (Толкач, 1995) рассматривать ВТБ как самостоятельный представитель группы потивирусов. На основании полученных нами данных мы считаем такой вывод несколько преждевременным. A.B. Крылов (Крылов, 1992) также склонен считать, что изучаемый приморский изолят является вирусом мозаики коммелины, хотя и не исключает возможности, что обнаруженный вирус является новым, четвертым потивирусом.

поражающим растения семейства Commdinctceae - вирусом традесканции бело-цветковой. Для окончательного заключения, является ли вирус из традесканции бслоцветковой, обнаруженный в Приморском крае, штаммом одного из описанных ранее потшшрусов; поражающих растения семейства коммелиновых, или это самостоятельный член группы иотивирусов, необходимо дальнейшее изучение антигенных свойств.

ВМКГ - новый для Дальнего Востока и, возможно, для России представитель группы иотивирусов, обнаружен в 1981 г. Ю.Г. Волковым (Волков и др. 1989). Нами был уточнен перечень хозяев (табл. 1), в результате чего определен круг культурных растений, для которых возбудитель представляет угрозу. В основном это кормовые культуры. По морфологии, биологическим и физико-химическим свойствам вирус, несомненно, относится к цотивирусам. Во время исследований патоген был обозначен нами как "вирус мозаики клевера горного". Это не означает, что открыт новый представитель группы. Возможно, изучавшийся патоген является вирусом пожелтения жилок клевера или его штаммом.

ДЕФОРМИРУЮЩАЯ МОЗАИКА РЕДИСА. - болезнь, впервые обнаруженная в Японии. Х.Точихара (Tochihara, [968) предположил, что заболевание является смешанной инфекцией ВМТ и BMP. Заболевание с подобными сим. птомами было обнаружено в Приморском крае при обследовании овощных культур. Электронно-микроскопическим анализом, реакцией кольцепреципи-тации и исследованием круга растений-хозяев A.B. Крыловым с соавторами (Крылов и др., 1981) было показано, что растения заражены BMP и ВМТ. ВМТ из смешанной инфекции был выделен переносом персиковой тлей и в дальнейшем каждый патоген изучался в отдельности. Дальневосточный изолят BMP . был идентифицирован, как типичный японо-американский штамм, относящийся по общепринятой классификации к комовирусам (Крылов и др., 1981). Для BMP характерно наличие двух типов раздельно инкапсулированных молекул РНК с молекулярными массами 2,1 и 1,3 MD (Сапоцкий, 1990).

Мы провели изучение комплексного заболевания, экспериментально заражая растения лобы двумя возбудителями. Симптомы болезни, включая энации-выросты на листовых пластинах, были подобны описанным для деформирующей мозаики редиса. Электронной микроскопией выделенного препарата обнаружено присутствие частиц комовирусов (BMP) и иотивирусов (ВМТ). Анализ РНК, выделенной из полученного препарата, показал наличие трех типов молекул, соответствующих РНК ВМТ и двум зонам РНК BMP.' Таким образом, нами получены дополнительные данные, подтверждающие, что заболевание, известное как деформирующая мозаика редиса, на Дальнем Востоке России вызывается смешанной инфекцией BMP и ВМТ.

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА ВМТ и ВМКГ. Как большинство иотивирусов, ВМТ и ВМКГ являются умеренными иммуногенами', о чем сшщстельст-

вуют титры специфических амтисывороток в РДД и непрямом методе ИФА. Установлено, что наиболее близкородственными ВМТ из дальневосточных потивирусов являются ВМГ, А- и YBK. Для ВМКГ отмечена высокая степень антигенного родства с ВЖМФ. Разработаны иммунодиагностикумы для непрямого варианта ИФА. Минимальное определяемое количество ВМТ в экстрактах зараженных растений составляет 2-5 мкг/мл, а ВМКГ - 1-3 мкг/мл, что свидетельствует о возможности использования антисывороток для практической диагностики.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СТРУКТУРНЫХ КОМПОНЕНТОВ. Молекулярные массы РНК потивирусов составляют.3,0-3,5 -MD (Hollings, Bruni, 1981; Matthews, 1982). РНК трех дальневосточных потивирусов имели типичный спектр поглощения и общепринятые соотношения (А260/А230 и А260/А280). Наличие одной молекулы РНК, с определенными нзми молекулярными массами, характерно для потивирусов. Таким образом, РНК изученных в данной работе потивирусов, подобны РНК других представителей группы.

Из литературных источников известно, что экспрессия генома потивирусов осуществляется через синтез высокомолекулярного полипептида, из которого путем протеолитического расщепления образуются девять вирусспецифиче-ских белков (Verchot et al.,1991; Parles et al., 1995). При трансляции РНК ВМТ, ВТБ и ВМКГ в белоксинтезирующих системах нами обнаружено семь полипептидов. По молекулярной массе мы определили белок-предшественник (300 kD), белок цитоплазматических включений (70 kD), белок ядерных включений (50 kD) и белок оболочки (30-40 kD)..

Молекулярные массы нативных белков^, оболочки имеют типичные для потивирусов значения. В отличие от большинства известных представителей группы белок оболочки ВМТ состоит из двух субъединиц. По литературным данным, молекулярные массы двух белковых зон разных штаммов колеблются в небольших пределах: и 30 kD (Papa, 1975); 36 и 29 kD (Hiebert, McDonald, 1976); 37 и 31 kD (Had et al.,1994). Всеми авторами отмечается гетерогенность капсидного белка. Из литературных источников известно, что геном потивирусов содержит один ген структурного белка (Allison et al., 1985, 1986). Вероятно, полипептид дальневосточного изолята ВМТ с молекулярной массой 32 kD - продукт деградации, происходящей уже в процессе выделения препарата. Полученные нами данные о плавучей плотности ВТБ (1,316 г/ см3) и относительной молекулярной массе структурного белка (34 kD) очень близки к значениям, известным для вируса коммелины (Migliory, Lastra, 1980), что может свидетельствовать о сходстве этих изолятов, поражающих растения семейства CommeHnaceae.

ИЗУЧЕНИЕ ДЕГРАДАЦИИ КАПСИДНЫХ БЕЛКОВ. Для потивирусов характерна деградация капсидного белка в процессе очистки и хранения (Fraifki el al., 1985). В препаратах изученных вирусов нами также отмечено на-

коплснис дискретных форм белка с убывающей молекулярной массой по мере их храпения. Электрофорстичсскпм анализом непосредственно после очистки показано, что капсидпые белки трех потпвирусо» содержат только основные гюлппелтпды, тогда как через неделю хранения в каждом препарате наблюдается появление двух дополнительных ннзкомолскулярпых полипептидов. Салили нестабильный белок-'отмечен у вируса мозаики турнепса - к копну пятой недели хранения и препарате обнаруживалось 6-7 дискретных форм белка. Отмеченное нами уменьшение общего количества белка в геле очевидно связано с тем, что продукты более глубокого расщепления (например, 18 kD у вируса, выделенного га традсскапции'бслоцпстковой) выходят из геля. Методом 'пептидного картирования показано, нто более легкие полипептиды, появляющиеся в препаратах в процессе выделения и хранения, являются продуктами деструкции интактных капсидных белков.

Гетерогенность белков оболочки вследствие протсолнза в процессе очистки и хранения характерна и для других групп фитовирусов: потеке- (Kocnig et al., 1981; Лртюкова, Крылов, 1989; Сапоцкпй, 1980; Гольдштейн и др., 1990); то-бамо- (Bloomer et al., 1976) и тобра- (Mayo et al., 1974). По данным Д.Д. Шукла с соавторами (Shukla et al., 1988, 1989), N- и С-концевые участки капси-ды, в которых локализованы наиболее нммунодоминантные области, располагаются на поверхности белковой глобулы, которые отщепляются в процессе очистки и хранения препаратов вирусов.

У потивирусов, идентифицированных на' Дальнем Востоке, гетерогенность, капсидного белка выявлена у ВМС' (Пииксвич, Крылов,- 1977),' ВЖКЛ (Артюкова и др., 1988), двух штаммов YI3K (Гнутова и др., 1991). Предшествующие сообщения о гетерогенности белков оболочки потивирусов приписывали действию растительных клеточных протеаз, седиментиругощих с вирусными частицами в процессе очистки (Moghal, Francki, 1976; Пинкевич, Крылов 1977), или микробиологическому загрязнению (H/ebert et a!., 19S4). В наших экспериментах появление бактериальных протеаз в препаратах, хранившихся при низких температурах с антисептиком, исключается." Поэтому мы также считаем, что-спонтанный переход белков оболочки изучаемых потивирусов из высокомолекулярных форм в низкомолекулярные является результатом действия примесей растительных протеаз, присутствующих даже в препаратах вирусов, очищенных с помошыо ультрацентрифугирования в градиентах плотности сахарозы или солях хлористого цезия. Тем более, что в ответ па вирусную инфекцию возрастает активность лирического аппарата клеток, одним из показателей чего является деструкция частиц вирусов гидролазами (Реунов, 1989). В пользу того, что протеолиз капсидных белков происходит под действием растительных протеаз, может свидетельствовать и тот факт, что в препарате ВМС, выделенном из каллуса, не наблюдается деградация'белка оболочки (Какарека, 1995).

Нами показано, что процесс деградации замедляется при добавлении в ре-суспедпрующий буфер на последней стадии выделения и при хранении

ФМСФ. В этом злучае п течение 3-4 недель каисидный белок ВТБ оставался интактным.

Таким образом, протеолиз вирусных частиц, с одной стороны, следует рассматривать как защитную реакцию растения па вирусную инфекцию. С точки же зрення разработки методов практической диагностики важное значение имеет тот факт с каким белком имеет дело вирусолог - интактным или деградированным, так как в отщепляющихся при хранении N- и С- участках белковой глобулы сосредоточены штаммоспецифичные эиитопы. Явление протеолиза, изученное нами, приводит к изменению белка, что в свою очередь ведет к изменению специфичности реакций. Поэтому его необходимо учитывать при разработке диагностикумовл их использовании. Это существенно с точки зрения защиты растепнйп от потивирусов и разработке способов борьбы с ними.

ВЫВОДЫ

I .Охарактеризованы три патогена-потивируса, идентифицированные, на Дальнем Востоке: вирус мозаики турнепса, вирус из.традесканции белоцветко-вой и вирус мозаики "клевера горного. Вирус мозаики, клевера горного - новый представитель группы, изучен впервые. Круг растений-хозяев включает 17 видов, преимущественно из семейства бобовых, патоген передается механически и тлями неперсистентно. Точка термической инактивации - 55-60 "С, период сохранения инфекционности в соке бобов - двое суток, предельное разведение 1:100 - 1:1 ООО.

2. Подтверждено по симптомам, в электронном микроскопе и электрофорезом суммарной РНК, что деформирующая мозаика редиса на Дальнем Востоке России - смешанное заболевание, вызываемое вирусами мозаики турнепса и редиса. *

3. Предложены оригинальные методики выделения для каждого вируса, даны спектрофотометрические, электронномикроскопические, а для вируса из традесканции белоцветковой' 'седиментационная, характеристики. Определены модальные размеры частиц возбудителей: 750-7S0 х 11-12 нм для вируса мозаики турнепса и 750-780 х 12 нм для вируса из традесканции белоцветковой. Размеры частиц вируса мозаики клевера горного, контрастированных ФВК, при рН 4,5 составляли'780.x 12 нм, а при рН 7:5 - 825-х 13; нм.

4. Изучены антигенные свойстпа вирусов мозаики турнепса и мозаики клевера- горного. Установлено, что по антигенным взаимоотношениям наиболее близки к вирусу .мозаики турнепса А- и Y-впрусы картофеля и вирус мозаики гиппеаструма. Для вируса мозаики клевера горного отмечена высокая степень антигенного родства с вирусом желтой мозаики фасоли. Разработаны иммуио-диагностикумы для непрямого варианта иммуноферментного анализа, которые позволяют определять в экстрактах зараженных растений уже 2-5 мг/мл вируса мозаики турнепса и 1-3 мкг/мл вируса мозаики клевера горного. Метод позволяет диагностировать заражение этими вирусами на ранних стадиях инфекции.

5. Изучены свойства структурных компонентов вирусов. Молекулярные массы капсидных белков составляют 38 и 32 kD для вируса мозаики турнепса, 34 kD для вируса из традесканции белоцветковой и 36 kD для вируса мозаики клевера горного. Выделены РНК с молекулярными массами 3,0-3,5 MD. При трансляции РНК трех изученных патогенов в бесклеточных системах обнаружен гетерогенный набор полипептидов. По молекулярной массе определен белок-предшественник (300 kD), белок цитоплазматических включений (70 kD), белок ядерных включений ( 50 kD) и белок оболочки (30-40 kD).

6. Изучен процесс деградации капсидных белков вирусов мозаики турнепса, мозаики клевера горного и вируса из традесканции белоцветковой при выделении препаратов и их хранении. Методом сравнительного пептидного картирования показано, что дискретные формы полипептидов с молекулярными массами 32 kD у вируса мозаики турнепса (образуется в процессе выделения) и 32 kD у вируса из традесканции белоцветковой (образуется при хранении) являются продуктами деструкции исходных капсидных белков. Изменение молекулярной массы белка ведет к увеличению плавучей-плотности вируса из традесканции белоцветковой (от 1,316 до 1,340 г/см3). Разрушение капсидного белка замедляется при добавлении ФМСФ в буферные смеси на последних стадиях выделения и при хранении. Процесс протеолиза необходимо учитывать при разработке и использовании диагностикумов.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

Артюкова Е.В., Моисеенко Л.И., Толкач В.Ф., Крылов A.B. Выделение и некоторые свойства потивируса, изолированного из традесканции белоцветковой (7'radescantiaalbifloraKunth). //Биологические науки. 1988. JV° 8. С. 30-34.

Моисеенко Л.И., Какарека H.H., Сибирякоза И.И., Гнутова Р.В. Некоторые физико-химические и антигенные свойства дальневосточного изолята вируса мозаики турнепса. //Доклады ВАСХНИЛ. 1991. № 11. С. 44-48.

Какарека H.H., Моисеенко Л.И., Сибирякова И.И., Гнутова Р.В. Некоторые физико-химические и антигенные свойства вируса мозаики турнепса (дальневосточный изолят). //Матер. Юбилейной конференции. Ростов-на Дону. 1992. С. 94-95. •

Волков Ю.Г., Толкач В.Ф., Моисеенко Л.И., Какарека H.H., Сибирякова И.И., Гнутова Р.В. Вирус мозаики клевера горного - новый патоген из группы Potyvirus. //Микробиологический журнал..1994. Т. 56. № 6. С. 30-34.

Моисеенко Л.И., Крылов A.B. , Бездетко Г. Н. Деформирующая мозаика редиса и ее возбудители. //Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность. Тезисы докладов. Всеросс. Съезда по защите растений. 1995. С. 68-69.

Моисеенко Л И., Крылов A.B. Изучение некоторых аспектов деградации структурных белков трех дальневосточных потивирусов. //В кн.: «Биологические исследования на Горнотаежной станции». Уссурийск. 1996. С. S3-99.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Моисеенко, Лариса Игнатьевна, Владивосток

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ГОРНОТАЕЖНАЯ СТАНЦИЯ

МОИСЕЕНКО Лариса Игнатьевна

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ПОТИВИРУСОВ, ПОРАЖАЮЩИХ РАСТЕНИЯ СЕМЕЙСТВ ВЯА851САСЕЛЕ, СОММЕЬШАСЕАЕ и РАВАСЕАЕ НА ДАЛЬНЕМ ВОСТОКЕ

06.01.11 - защита растений 03.00.06 - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Консультант:

к.б.н., с.н.с. Новиков В.К.

Научные руководители: д.б.н. Крылов А.В. к.б.н., с.н.с. Зориков П.С.

ВЛАДИВОСТОК 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................5

ГЛАВА 1 Краткая характеристика вирусов потигруппы..............................8

1.1. Общие сведения о биологии потивирусов.....................................8

1.2. Физико-химические особенности потивирусов.............................9

Г'

1.2.1. Седиментационные характеристики..............................................9

1.2.2. Оптические свойства.......................................................................9

1.2.3. Свойства белка оболочки................................................................9

1.2.4. Структура.генома............................... .............................................10

1.3. Включения......................................................................................12

1.4. Характеристика антигенных свойств.............................................14

1.5. Таксономия.....................................................................................15

1.6. Дальневосточные потивирус........................................................16

1.6.1. Вирус мозаики турнепса................................................................16

1.6.2. Вирус традесканции белоцветковой.............................................19

1.6.3. Вирус мозаики клевера горного....................................................21

ГЛАВА 2. Материал и методы.......................................................................23

2.1. Материал........................................................................................23

2.2. Получение препаратов вирусов.....................................................25

2.2.1. Выделение вируса мозаики турнепса............................................25

2.2.2. Выделение вируса традесканции белоцветковой.........................26

2.2.3. Выделение вируса мозаики клевера горного................................27

2.2.4. Физические свойства вируса мозаики клевера горного...............29

2.3. Спектрофотометрическая характеристика препаратов................29

2.4. Электронная микроскопия препаратов потивирусов....................30

2.5. Иммунохимические методы..........................................................30

2.6. Исследование седиментационных свойств вируса традесканции белоцветковой.........................................................32

2.7. Электрофорез белков потивирусов.............................................

2.8. Сравнительное пептидное картирование белков.......................

2.9. Выделение РНК потивирусов......................................................

2.9.1. Характеристика РНК потивирусов..............................................

2.9.2. Фракционирование РНК потивирусов методом электрофореза..............................................................................

2.9.3. Трансляция РНК потивирусов.....................................................

ГЛАВА 3. Результаты экспериментальных исследований.........................

3.1. Вирус мозаики турнепса...............................................................

3.1.1. Антигенные свойства...................................................................

3.2. Изучение деформирующей мозаики редиса................................

3.3. Вирус традесканции белоцветковой...........................................

3.4. Вирус мозаики клевера горного..................................................

3.4.1. Биологические и физические свойства.......................................

3.4.2. Получение препарата вируса мозаики клевера горного............

3.4.3. Антигенные свойства вируса мозаики клевера горного............

3.5. Характеристика РНК потивирусов............................................

3.5.1. Трансляция вирусных РНК.........................................................

ГЛАВА 4. Изучение процесса деградации капсидных белков

потивирусов.................................................................................

4.1. Протеолитическое расщепление капсидных белков

в процессе хранения препаратов вирусов.................................

4.2. Сравнительное пептидное картирование белков потивирусов. ГЛАВА 5. Обсуждение.................................................................................

5.1. Выделение потивирусов..............................................................

5.2. Спектрофотометрическая характеристика.................................

5.3. Электронная микроскопия..........................................................

5.4. Седиментационные свойства вируса традесканции

белоцветковой...............................................................................83

5.5. Свойства структурных компонентов................... ..........................83

5.5.1. Белковые компоненты............................ .......................................83

5.5.2. Характеристика РНК потивирусов................................................85

5.6. Антигенные свойства потивирусов.................... ............................86

5.7. Вредоносность изученных вирусов.................... ............................87

5.8. Деформирующая мозаика редиса..................... ..............................89

5.9. Изучение деградации капсидных белков трех дальневосточных потивирусов в процессе очистки и хранения..............90

ВЫВОДЫ........................................................................................................95

ЛИТЕРАТУРА.................................................................................................97

ВВЕДЕНИЕ

В связи с организационными изменениями в сельском хозяйстве России (возникновением арендаторства, фермерства) наблюдается падение объема защитных мероприятий, что ведет к увеличению поражаемости возделываемых культур вредителями и болезнями. Вирусы растений считаются второй по вредоносности группой возбудителей болезней после грибов. Детальное изучение патогенов является необходимым условием в разработке профилактики заболеваний и уменьшения их вредоносности.

Потивирусы, самая многочисленная группа на Дальнем Востоке, представлены вирусами, зачастую вызывающими снижение урожайности сельскохозяйственных культур. В дальневосточном регионе основные посевные площади заняты такими культурами, как соя и картофель. Чаще всего соя поражается вирусом мозаики сои. Потеря урожая зерна при этом составляет от 30 до 78 % (Рейфман, Поливанова, 1969). Ущерб, наносимый вирусными заболеваниями картофеля, в среднем по России определяется в 30 % (Атабеков, 1984, Бобкова и др. 1986). На территории Дальнего Востока распространены два потивируса, поражающие эту наиболее важную экономическую культуру, - Y- и А-вирусы картофеля. Наиболее вредоносным считается Y-вирус картофеля, так как он вызывает снижение урожайности от 30 до 80 % (Рейфман и др., 1971; 1973).

Возрастание роли потивирусов характерно не только для Дальнего Востока и России. В настоящее время во всем мире обнаруживаются новые представители группы потивирусов, увеличивается количество их штаммов, и численность группы составляет 182 постоянных и предполагаемых представителя (Edwardson, Christie, 1996). На Дальнем Востоке России идентифицировано 10 представителей группы потивирусов: Y- и А- вирусы картофеля, обыкновенной мозаики фасоли, желтой мозаики фасоли, мозаики гиппеаструма, желтой карликовости лука, мозаики сои, мозаики турнепса, мозаики коммелины и пест-ролепестности тюльпана (Крылов и др., 1987). Сразу отметим, что в настоящей

работе вирус мозаики коммелины мы называем "вирусом традесканции бело-цветковой", так как в дальневосточном регионе он был идентифицирован на растении Tradescantia albiflora Kunth. В 1987 году появилось сообщение еще об одном патогене, обнаруженном в Приморском крае, предположительно отнесенном к группе Potyvirus - вирусе мозаики клевера горного (Волков и др., 1989). Нами изучались три дальневосточных потивируса: мозаики турнепса, традесканции белоцветковой и мозаики клевера горного. Все три вируса впервые обнаружены в регионе. Вирус мозаики турнепса распространен повсеместно. Два последних возбудителя, возможно, впервые идентифицированы на территории России. Физико-химические свойства их не изучались.

Детальное изучение состава, физико-химических свойств, определение точного таксономического положения вирусов по принятой международной системе классификации, а также распространения и способов циркуляции в природе, механизмов их взаимодействия с растениями являются необходимым условием в разработке методов профилактики вирусных заболеваний и снижения их вредоносности. Знание свойств вирусов и их структурных компонентов позволяет разрабатывать и применять высокочувствительные методы диагностики. Это необходимо для предупреждения заболеваний, защиты сельскохозяйственных растений от вирусных инфекций и, в конечном итоге, повышения урожайности.

Предпринятые усилия в попытках увязать, а тем более использовать физико-химические свойства вирусов в борьбе с болезнями немногочисленны. Тем более, что изучение структурных компонентов потивирусов долгое время было затруднено в связи с их низкой концентрацией в инфицированных растениях (от 3 до 10 мг/100 г свежих листьев) и большими потерями в процессе очистки в результате агрегации и фрагментации частиц. С конца 70-х годов, в связи с развитием методов белковой химии и молекулярной биологии, позволяющих работать с небольшими количествами вещества началось интенсивное изучение потивирусов и разработка методов защиты растений от вызываемых ими инфек-

ций. Такими примерами могут служить термо- и химиотерапия, причем наиболее эффективной является тепловая обработка (Мэтьюз, 1973; Гиббс, Харрисон, 1978). Так, при тепловой обработке черенков сахарного тростника происходит прямая инактивация вируса мозаики сахарного тростника - члена группы поти-вирусов. В последние годы большое внимание уделяется и исследованию действия химических препаратов на вирусы. Известны примеры, когда после обработки антивирусными препаратами (диметилсульфоксидом, 2-тиоурацилом, малахитовой зеленью) снижается репродуктивность вирусов. Однако, следует отметить, что пока еще не найден препарат, приводящий к инактивации вирусов в клетке и оздоровлению пораженных растений.

Наиболее успешным примером использования физико-химических свойств вирусов в целях защиты растений являются разработки А.Г. Трубицина. Это люминесцентный экспресс - метод определения зараженности семян сои (Трубицин, 1974), который базируется на явлении возбужденной люминесценции белков при 340-350 нм и полифенолов при 400 нм. Соотношение спектров при заражении меняется в несколько раз (1,5-3) в сравнении со здоровым зерном. На основе метода были разработаны устройство для отбора безвирусных семян сои (Трубицин и др., 1974) и в дальнейшем промышленная установка (Технико-экономическая справка, Ермак, 1997). Производительность установки - 300 кг здоровых семян в час, при этом планируется увеличение урожая сои до 20 %.

Цель наших исследований - изучение физико-химических особенностей трех дальневосточных потивирусов: мозаики турнепса, мозаики клевера горного и вируса, идентифицированного на традесканции белоцветковой. Упомянутые возбудители наносят урон сельскохозяйственнным и декоративным растениям семейств ВгазБюасеае, 17аЬасеае и СоттеИпасеае в связи с чем проведенные исследования являются актуальными с позиций защиты растений. Эти исследования необходимы для выработки стратегии и тактики защиты растений от вирусных заболеваний.

ГЛАВА 1.

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ ПОТИГРУППЫ.

1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О БИОЛОГИИ ПОТИВИРУСОВ. Фитовирусы -обширная группа патогенов, которые наносят существенный ущерб сельскохозяйственным растениям. Р.Е.Ф. Мэтьюз ( Matthews, 1991) делит все растительные вирусы на три суперсемейства: альфа-, кармо/собемо- и пикорнаподобные вирусы. По ряду свойств (морфология, структура генома) потивирусы относят к супергруппе пикорнаподобных вирусов, включающей многие широко распространенные и изученные вирусы животных и человека. Это самая многочисленная и растущая группа вирусов растений. Она постоянно пополняется новыми членами и по данным Д. Р. Эдвардсона и Р.Д. Кристи (Edwardson, Christie, 1996) насчитывает 182 представителя, которые составляют около одной четверти всех изученных фитовирусов в мире. Название группа получила от типового представителя - Y-вируса картофеля (potyvirus; potato virus Y).

Вирусы этой группы наносят существенный урон сельскохозяйственным растениям. На Дальнем Востоке кроме картофеля потивирусы поражают зернобобовые (соя, фасоль, горох), овощные (лук, капусту, редис, лобу, томаты), кормовые и декоративные культуры.

По своей морфологии вирусы этой группы представляют собой гибкие нитевидные частицы длиной 680-900 нм длиной и диаметром приблизительно 11-15 нм. Они состоят из одноцепочечной кодирующей (плюс-цепь) молекулы РНК, составляющей около 5,3-6,0% от массы частицы, и приблизительно 2000 идентичных белковых субъединиц, образующих спиральную капсиду с шагом спирали 3,4 нм (Hollings, Brant,1981). Потивирусы передаются механически, многими видами тлей неперсистентно, клещами и некоторыми грибами. Также в литературе есть сообщение о передаче потивирусной инфекции белокрылкой (Shukla et al., 1988).

1.2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОТИВИРУСОВ

1.2.1. СЕДИМЕНТАВДОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ. Седиментацион-ные характеристики частиц, содержащихся в препаратах потивирусов, показали, что, в основном, они осаждаются в виде гомогенного пика. Коэффициенты седиментации колеблются от 140 до 160 S. Так, коэффициент седиментации Y-вируса картофеля варьирует от 150 до 160 S, вируса мозаики сои -147 S и вируса желтой мозаики фасоли -143 S. Плавучая плотность вирионов располагается в пределах от 1,31 до 1,33 г/см3. Как показали Е. Хиберт и Дж. Г. МакДональд (Hiebert, McDonald, 1976), довольно большие различия в значениях коэффициентов седиментации и плавучей плотности, полученные для потивирусов, объясняются гетерогенностью белкового компонента (140 S и 1,33 г/ см3 - для частично деградированного вирусного белка, 160 S и 1,31 г/см3 - для вируса с интактным белком).

1.2.2. ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА. Препараты потивирусов обладают специфическим нуклеопротеидным спектром поглощения в ультрафиолетовой области с минимумом при 245 нм и максимумом при 260 нм. Коэффициент экс-тинкции при длине волны 260 нм для вирусов потигруппы колеблется от 2,0 до 3,0 для разных представителей. Сотношение поглощения в максимуме и минимуме, которое является одним из показателей чистоты препарата вируса, составляет 1,1-1,3 (Hollings, Brant, 1981).

1.2.3. СВОЙСТВА БЕЖА ОБОЛОЧКИ. Электрофоретический анализ белкового компонента большинства изучавшихся потивирусов выявил присутствие одного полипептида. Исключение составляет вирус мозаики турнепса, белок оболочки которого содержит 2 белковые субъединицы. Молекулярные массы белков потивирусов колеблются в пределах от 30 до 38 kD. N- и С-концевые части белковой глобулы гидрофильны и располагаются на поверхности вирио-

на, образуя вирусспецифические антигенные детерминанты (Shukla et al, 1988 а). Установлено, что после ферментативной обработки белка потивирусов в составе вириона происходит потеря антигенных детерминант, в основном, индивидуальных. (Allison et al., 1985; Shukla et al; 1988).

Для большинства потивирусов характерна деградация капсидного белка в процессе очистки и хранения препаратов (Francki et al., 1985). Предшествующие сообщения о гетерогенности белков оболочки потивирусов приписывали действию растительных клеточных протеаз (Moghal, Francki, 1976; Пинкевич, Крылов, 1977) или загрязнению микробиологическими протеазами (Hiebert et al., 1984), седиментирующими с вирусными частицами в процессе очистки. Не исключено, что эта деструкция происходит под действием вирусспецифических протеаз (Dougherty, Semler, 1993; Parks et al., 1995).

1.2.4. СТРУКТУРА ГЕНОМА. Геном потивирусов представлен одноце-почечной молекулой (плюс-цепь) РНК с массой 3,0-3,5 MD (Matthews, 1982) длиной 10000 оснований. К 5' -концевому нуклеотиду ковалентно присоединен небольшой белок Vpg, а 3'-концевая часть представлена полиА-последовательностью длиной от 20 до 140 остатков (Dougherty, Carrington,1988). 5'- нетранслируемый участок, богатый аденозином и уридином, располагается между 1 и 144 нуклеотидами. Как было показано Р.Ф. Аллисоном с соавторами (Allison et al., 1986) для вируса гравировки табака этот нетранслируемый участок соседствует с большой открытой рамкой считывания, продуктом которой является гигантский полибелок, состоящий из 3054 аминокислотных остатков с молекулярным весом 346 kD. Такая структура генома характерна для всех изученных потивирусов.

К настоящему времени изучены геномы шести потивирусов: гравировки табака (Allison et al., 1986), крапчатости жилок табака (Domier et al., 1986), шар-ки сливы (Lain et al., 1989; Maiss et al., 1989), Y-вируса картофеля (Robaglia et al., 1989), вируса гороха, передающегося семенами (Johansen et al., 1991) и мо-

заики турнепса (Nicolas, 1992). Установлено, что экспрессия геномов этих вирусов происходит через синтез высокомолекулярных полипротеинов, содержащих от 3005 до 3206 аминокислот. Протеолитически этот полипротеин расщепляется на девять самостоятельных белковых продуктов тремя вирус кодируемыми про-теазами (Dougherty, Carrington, 1988; Reihmann et al.,1992): N-терминальным белком, протеиназой компонента-помощника и белком ядерных включений. Эти три белка обладают ферментативной активностью и вовлекаются в различные протеолитические расщепления вирус-кодируемого полипротеина (Carrington et al.,1989; Verchot et al.,1991). Кроме этих функций, N-терминальный белок, или как его обозначают PI, также является РНК-связанным протеином, участвующим в репликации РНК (Verchot, Carrington, 1995). Белок компонента-помощника (НС-Pro) необходим также для накопления и трансмиссии вирусно�