Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетического разнообразия вируса мозаики турнепса и создание удвоенных гаплоидных линий Brassica - источников устойчивости к нему

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетического разнообразия вируса мозаики турнепса и создание удвоенных гаплоидных линий Brassica - источников устойчивости к нему"

На правах рукописи

У

Зубарева Ирина Александровна

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ВИРУСА МОЗАИКИ ТУРНЕПСА И СОЗДАНИЕ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ВМББЮА - ИСТОЧНИКОВ УСТОЙЧИВОСТИ К НЕМУ

Специальности: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии), 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

З 0КТ 2013

Москва-2013

005533913

005533913

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центре «Биоинженерия» Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Игнатов Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

Карлов Геннадий Ильич, доктор биологических наук, профессор, Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева, руководитель научно-образовательного Центра молекулярной биотехнологии

Супрунова Татьяна Павловна, кандидат сельскохозяйственных наук, Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур, лаборатория биотехнологии, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится 23 октября 2013 г, в 16-00 часов на заседании диссертационного совета Д220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А.Тимирязева по адресу 127550, г.Москва, ул.Прянишникова, д. 15, тел/факс (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева.

Автореферат разослан 23 сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Вирус мозаики турнепса (Turnip mosaic virus - TuMV) относится к крупнейшей группе фитопатогенных вирусов семейства Potyviridae (Shukla et ai., 1994). Это наиболее известный представитель рода Potyvirus, поражающий растения семейства Brassicaceae. При поражении растений происходит задержка в росте, ранняя дефолиация, снижение товарного вида кочанных и салатных форм, что приводит к заметному снижению урожайности (до 100 % в зависимости от культуры) и экономическим потерям. Во многих странах TuMV по экономической вредоносности стоит на втором месте, уступая лишь вирусу мозаики огурца (Cucumber Mosaic Virus - CMV) (Walsh et al., 2002). Вредоносность TuMV резко усиливается при совместном поражении растений с другими вирусами (Camele et al., 1991).

Один из наиболее опасных способов распространения и сохранения вирусной инфекции - передача вируса с семенами, что имеет серьезные последствия и создает очаги первичной инфекции при посеве/посадке растений в поле. Вирусы могут сохраняться в семени в течение длительного времени и распространяться на большие расстояния (Matthews, 2009). Естественная устойчивость растений является единственно возможным, эффективным и экологически безопасным способом борьбы с TuMV.

В настоящее время в России лишь отдельные исследования связаны с TuMV (Микрюков, 2010) и нет данных о его патотипическом составе, притом что опасность распространения инфекции нарастает, а количество сортов Brassica, устойчивых к патогену, невелико. Известные сорта эффективны только против какого-либо одного патотипа TuMV, а гены устойчивости малоизученны. В качестве объекта исследований при изучении генов устойчивости наиболее часто используют удвоенные гаплоидные линии (Rusholme et al., 2007; Jenner et al., 2010; Qian et al., 2013). Поэтому для изучения генов устойчивости создание дигаплоидных линий (DH-линий), одновременно являющихся источниками генов устойчивости к TuMV, представляет собой важную научную и практическую задачу.

Цель и задачи работы

Целью настоящих исследований было изучение генетического разнообразия TuMV и создание удвоенных гаплоидных линий рода Brassica -источников устойчивости к патогену.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Провести молекулярно-генетический и филогенетический анализ изучаемых изолягов TuMV.

2. Оценить коллекции Brassica на устойчивость к TuMV и получить удвоенные гаплоидные линии - источники устойчивости к нему.

3. Оценить полиморфизм локусов eIF4E и eIF(iso)4E, связанных с устойчивостью к TuMV, у представителей Brassica.

4. Изучить возможность передачи изолята TuMV 12 через семена Brassica, получить и проанализировать полную нуклеотидную последовательность кодирующей части его генома.

Научная новизна работы

Идентифицированы 6 новых изолятов TuMV, принадлежащих к двум различным патотипам, один из которых впервые обнаружен в России.

Впервые проведен анализ наличия локусов эукариотических фактров инициации трансляции у различных видов Brassica: В. napus, В. juncea, В. nigra, В. oleráceo и В. carinata. В результате сравнения аминокислотных последовательностей локусов BraA.eIF(iso)4E.a и BraA.eIF4E.a выявлены характерные для всех устойчивых образцов замены, вероятно, ведущие к неспецифической устойчивости образцов к TuMV. Кроме того, показано наличие трех аллельных вариантов BraA.eIF4E.a у некоторых устойчивых к TuMV образцов В. rapa var. oleífera, один из которых оказался псевдогеном.

Впервые доказана возможность передачи TuMV (изолят 12) семенами растений рода Brassica через заражение зародыша семени.

Получена полная последовательность кодирующей части генома изолята TuMV 12, проведен ее биоинформатический анализ, выявлены уникальные аминокислотные замены, вероятно, позволяющие изоляту передаваться семенами растений рода Brassica.

Практическая значимость

Получены удвоенные гаплоидные линии 13 генотипов видов В. napus и В. oleracea, обладающих устойчивостью к 6 изолятам TuMV 1 и 5 патотипов.

Описаны локусы генов eIF(iso)4E и eIF4E, представляющие собой новый и потенциально прочный источник устойчивости к TuMV, который может быть передан восприимчивым сортам и культурам рода Brassica.

Подобраны праймеры и проба для разработки набора диагностики TuMV в семенах и инфицированных растениях методом ПЦР в реальном времени.

Все нуклеотидные последовательности были опубликованы в международной базе данных GenBank и находятся в свободном доступе.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на 2-ой Международной школе-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2012); XXIV и

XXV зимних молодежных научных школах «Перспективы направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2012 и 2013); П(Х) Международной Ботанической Конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012); Осеннем финале «У.М.Н.И.К.» РАН (Москва, 2012); Всероссийской Научной Конференции «Научное Наследие Н.И. Вавилова и Современность»; I Международной Интернет-конференции «Современные тенденции в сельском хозяйстве» (Казань, 2012); Международной научно-практической конференции «Фармацевтические биотехнологии» (Москва, 2013); XII Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2013); 17-ой Международной Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2013).

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 6 статей в журналах, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 144 страницах машинописного текста и включают 34 рисунка и 24 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы из 230 источников и 1 приложения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение TuMV с использованием растений-индикаторов и ИФА

Растительный материал с симптомами вирусной мозаики собирали в четырех районах Москвы и Московской области (Москва, Одинцовский р-н, Подольский р-н, Наро-Фоминский р-н) в ходе обследований посевов и посадок овощных и масличных капустных культур в открытом и закрытом грунте. Всего было собрано 87 образцов, которые классифицировали по признакам поражения и растениям-хозяевам на 11 групп (И, 12,13a, 13Ь, 14,15,16,17,18,19 и 110).

Результаты заражения растений-индикаторов (Nicotiana tabacum L., Chenopodium amaranticolor Coste, Lactuca sativa L., Brassica rapa subsp rapa) и ИФА (DAS-ELISA) с использованием поликлональных антител к TuMV в составе тест-системы NEOGEN показали, что не более 15 % из 87 образцов были инфицированы возбудителем мозаики турнепса. Отобранные изоляты были получены из пораженных растений В. oleráceo (12), В. rapa subsp rapa

(ІЗа), В. napus (I3b) из закрытого грунта и из посадок В. rapa subsp chinensis в поле (17,18,110).

Для выделения и очистки изолятов TuMV проводили серию пассажей, используя С. amaranticolor или С. quinoa, а затем через N. tabacum изоляты переносили и поддерживали на В. rapa или В. napus.

Для молекулярно-генетического анализа из изолятов и контрольного образца (растение В. napus, проверенное ИФА на отсутствие TuMV) выделили тотальную РНК и с помощью ОТ-ПЦР с использованием специфических пар праймеров, амшшфицировали и секвенировали фрагменты кДНК генов PI, Nib и СР. Области секвенирования охватывали три «горячие точки» рекомбинации в геноме вируса. Нуклеотидные последовательности участков трех генов сравнили с последовательностями базы данных GenBank при помощи программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), в результате чего выделили последовательности четырех наиболее близких изолятов TuMV (UK1, KEN1, RUS1 и CAR51) со сходством 97-99% к отдельным изучаемым изолятам и построили филогенетические деревья как для отдельных генов, так и для суммарной последовательности кДНК (рисунок 1). Секвенирование участков трех генов показало, что изучаемые изолят отличались не только от всех известных мировых штаммов TuMV, но и между собой.

Рисунок 1 - Филогенетическое дерево, построенное с использованием алгоритма минимальной эволюции на основе, сравнения нуклеотидных последовательностей объединенных фрагментов генов Р1, ШЪ и СР изучаемых изолятов ТиМУ общей длинной 1650 п.н. На шкале представлено генетическое расстояние между последовательностями кДНК, определенное методом наибольшего правдоподобия

Анализ деревьев, полученных методами минимальной эволюции, ближайших соседей и максимального правдоподобия, показал высокое

Молекулярно-генетический и филогенетический анализ изолятов TuMV

ken1

сходство их топологии и продемонстрировал для последовательностей генов Nib, CP и PI наибольшую близость группы изолятов 12,13а и 13Ь к изолятам, выделенным из растений В. napus и В. oleráceo в Великобритании и относящимся к 1 патотипу (UK1, KEN1). В то же время группа изолятов 17,18 и 110 была близка к последовательностям изолятов, выделенных из Armoracia rusticana и Cochlearia armoracia в России и Польше и принадлежащих к 5 патотипу TuMV (RUS1, CAR51). Генетическое сходство между двумя группами изолятов было менее 95 %, что сопоставимо с ранее описанным сходством групп изолятов вируса внутри вида в пределах 85-95 % (Rzhetsky et al., 1992).

Сравнение нуклеогадных и аминокислотных последовательностей участков трех генов изучаемых изолятов с наиболее близкими к ним изолятами TuMV UK1 и RUS1 показало, что наиболее полиморфным является фрагмент гена PI, содержащий от 1,6 до 3,0 % замен пар нуклеотидов, из которых почти половина ведет к заменам аминокислот. Наиболее консервативным оказался участок гена CP, имеющий всего 0,9-1,3 % нуклеотидных замен, практически не ведущих к заменам аминокислот в сравнении с UK1 и RUS1.

Рассмотрение последовательностей с помощью методов, реализованных в программе RDP, не выявило фактов рекомбинации в изучаемых изолятах по последовательности трех анализируемых генов (Nib, CP, PI). Таким образом, популяции вируса, поражающие растения капусты, рапса и турнепса в защищенном грунте и растения пекинской капусты в полевых условиях, принадлежат к разным патотипам и имеют независимое происхождение.

Анализ вирулентности изолятов TuMV

Для анализа вирулентности и агрессивности изолятов TuMV, а также с целью отбора образцов для создания линий - источников устойчивости к вирусу, проводили механическую инокуляцию 136 образцов растений семейства Brassicaceae из двух коллекций. Коллекция № 1 состояла из 64 образцов и включала в себя представителей В. napus, В. oleráceo, В. carinata, В. juncea и В. nigra. Коллекция № 2 включала 72 образца, представляющих стержневую коллекцию Brassica rapa ВЙРа.

Симптомы заболевания, такие как хлоротичная пятнистость и деформация листовой пластинки, оценивали визуально по 10-бальным шкалам с семи дневным интервалом в течение четырех недель после инокуляции, после чего со всех образцов собирали материал для проведения ИФА. Результаты, полученные ИФА, подтвердили результаты визуальной оценки и выявили дополнительно три толерантных (бессимптомных) к TuMV образца растений.

По результатам оценки устойчивости коллекций растений рода Brassica было выявлено, что изоляты TuMV отличаются между собой по вирулентности (таблица 1). Наиболее вирулентными оказались изоляты 13Ь и 12, поражающие

63 и 51 образец га 136 соответственно. Однако изолят 12 был умеренно агрессивным и поражал растения на уровне 0-5 баллов. Наименее вирулентный изолят 110 поражал всего 13 образцов.

Кроме того, характер проявления симптомов мозаики листьев при инфицировании растений изолятами 17, 18 и 110 отличался от симптомов, наблюдаемых при поражении изолятами 12,13а и 13Ь.

Таблица 1 - Оценка вирулентности изолятов ТиМУ на коллекции из 136

образцов рода Brassica

Изолят TuMV Количество восприимчивых образцов, шт. Количество устойчивых образцов (коллекция № 1 и № 2)

коллекция № 1 коллекция № 2 шт. %

12 31 20 85 62

13а 23 5 108 79

13Ь 49 14 73 54

17 1 28 107 79

18 0 31 104 76

110 1 12 123 90

В результате анализа вирулентности изолятов было отобрано 13 образцов (№ 444, Center-1, № 1, № 417, Jp-8, Ханна, Jp-4, Griffin, Center-2.1, Талант, Луговской, Cobra SR В. napus и ISA454 В. oleráceo) с устойчивостью ко всем шести изолятам TuMV и еще 12 с устойчивостью к пяти из шести изолятов (Oro, Jp-2, Cobra Winter, Center -2.2, №417.1.1, Jp-1, Griffin DR, Griffin CR, Cobra line 1.8, STS Ко В. napus, FH1 и ISA454.1.36 В. oleráceo). Данные образцы являются наиболее перспективными в селекции на устойчивость к TuMV. Устойчивые ко всем шести изучаемым изолятам TuMV образцы Brassica в дальнейшем использовали для получения удвоенных гаплоидных линий -источников устойчивости к TuMV и изучения генов устойчивости к данному вирусу.

Получение удвоенных гаплоидных линий Brassica - источников устойчивости к TuMV

Гаплоидные растения получали с применением изолированной культуры микроспор. Для выделения микроспор у В. napus использовали бутоны размером от 2,0 до 3,5 мм в зависимости от сорта, а у В. oleráceo образец ISA -5,0-6,0 мм. Температурный диапазон теплового шока, при котором были получены эмбриоиды, лежал в пределах от +32 до +35 °С, а продолжительность воздействия варьировала от 24 до 72 часов. Оптимальное для эмбриогенеза каждого образца сочетание температуры и продолжительности теплового шока приведено в таблице 2.

Таблица 2 - Оптимальное сочетание температуры и продолжительности

Параметры теплового шока Образец (количество эмбриоидов, шт.) Параметры теплового шока Образец (количество эмбриоидов, шт.)

+ 32 °С, 48 ч ISA454 (60 шт.) + 33 °С, 72 ч № 1 (20 шт.) № 417 (74 шт.) Луговской (9 шт.) Талант (12 шт.) Griffin (38 шт.)

+ 32 °С, 72 ч № 444 (32 шт.) Jp-8 (24 шт.) Хана (5 шт.) Jp-4 (25 шт.) + 35 °С, 24 ч Cobra SR (4 шт.) Center-1 (53 шт.) Center-2.1 (б шт.)

После тепловой обработки культуру микроспор переносили на +25 °С, и из отдельных микроспор формировались проэмбриональные структуры, которые развивались в эмбриоиды, дающие начало гаплоидным растениям.

Через 21 день образовавшиеся эмбриоиды переносили на твердую питательную среду MS (Murashige and Skoog, 1962) или B5 (Gamborg, 1968), приготовленную с уменьшением концентрации компонентов в 2 раза, где проходило формирование семядольных листьев и корневой системы.

Полученные растения-регенеранты адаптировали к почвенным условиям на стадии формирования 3-4 пары листьев. При оценке плоидности полученных из микроспор растений использовали прямой (подсчет количества хромосом в меристеме корня) и косвенный (подсчет числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц) методы. Гаплоидные растения отбирали и удваивали количество их хромосом впрыскиванием раствора колхицина в верхушечную и пазушные почки с целью получения дигаплоидных линий (таблица 3).

Таблица 3 - Количество полученных удвоенных гаплоидных линий

Количество Количество

Образец Brassica дигаплоидных Образец Brassica дигаплоидных

линий, шт. линий, шт.

ISA454 50 Луговской 5

№444 22 Талант 9

Jp-8 20 Griffin 38

Ханна 3 Cobra SR 3

Jp-4 18 Center-1 37

№1 15 Center-2.1 4

№417 29

Семена удвоенных гаплоидов вновь высевали для подтверждения устойчивости к ТиМУ. При достижении фазы 3-4 настоящих листьев

проводили механическую инокуляцию шестью изолятами TuMV, по 5-10 растений потомства каждой дигаплоидной линии каждого образца. Симптомы заболевания оценивали визуально, а затем в растениях определяли содержание TuMV с помощью ИФА.

По результатам опыта отбирали по одной наилучшей устойчивой ко всем шести изолятам TuMV линии от каждого образца. Таким образом, было получено 13 удвоенных гаплоидных линий: DH № 444, DH Center-1, DH № 1, DH № 417, DH Jp-8, DH Ханна, DH Jp-4, DH Griffin, DH Center-2.1, DH Талант, DH Луговской, DH Cobra SR и DH ISA454.

Анализ полиморфизма локусов eIF(iso)4E и eIF4E у представителей Brassica

При анализе вирулентности и агрессивности изолятов TuMV были отобраны устойчивые ко всем шести изолятам образцы Brassica: 12 представителей В. napus, 1 В. oleracea и 22 В. rapa. Поскольку изучаемые изоляты относятся к двум различным патотипам (1 и 5 патотип) и в то же время не известно ни одного гена устойчивости к 5 патотипу, то было сделано предположение, что устойчивость образцов является неспецифической. Неспецифическую устойчивость растений к TuMV связывают с факторами итттпгатпти трансляции eIF(iso)4E и eIF4E (Rusholme et al., 2007; Jenner et al., 2010; Qian et al., 2013). По литературным данным, в геноме В. rapa ssp. trilocularis было обнаружено 6 таких локусов (BraA.eIF(iso)4E.a, BraA.eIF(iso)4E.b, BraA.eIF(iso)4E.c, BraA.eIF4E.a, BraA.eIF4E.b и BraA.eIF4E.c.), один из которых (BraA.eIF4E.b) был псевдогеном (Jenner et al., 2010). Наличие или отсутствие данных локусов в геномах остальных представителей Brassica до сих пор не было показано.

Для обнаружения и оценки полиморфизма данных локусов, а также установления их отличий по нуклеотидным последовательностям между устойчивыми и восприимчивыми к TuMV образцами использовали различных представителей Brassica: устойчивые к TuMV 12 DH-линии В. napus, 1 DH линия В. oleracea, 22 образца В. rapa; по 1 образцу восприимчивых к TuMV В. juncea, В. nigra и В. carinata, В. napus (Галакси) и В. rapa (Kousaitai).

В результате проведенных исследований наличие локусов BraA.eIF(iso)4E.a и BraA.eIF(iso)4E.c с помощью ПЦР показано во всех образцах В. napus, В. oleracea (рисунок 2), В. nigra, В. carinata и в 11 из 23 образцах (в т.ч. восприимчивый образец) В. rapa.

Локус BraA.eIF4E.a был обнаружен у всех представителей Brassica (в т.ч. В. juncea) и исследуемых устойчивых к TuMV образцов. Кроме того, у образцов В. rapa наблюдалась его вариация по длине и наличие у некоторых образцов до

2-3 аллельных вариантов. Локусы BraA.eIF(iso)4E.b, BraA.eIF4E.b и BraA.eIF4E.c не были обнаружены ни у одного образца.

б

Рисунок 2 - Электрофореграмма продуктов ПЦР; а - BraA.eIF(iso)4E.a и BraA.eIF(iso)4E.c\ б - BraA.eIF4E.a. 1 - маркер молекулярной массы (Fermentas, Gene Ruler Dna Laders); 2 - ПЦР без ДНК-матрицы; 3 - ПЦР на препарате ДНК восприимчивого к TuMV образца В. napus Галакси; 4-16 - ПЦР на препаратах ДНК устойчивых к TuMV DH-линий: № 444, Center-1, № 1, № 417, Jp-8, Ханна, Jp-4, Center-2.1, Талант, Луговской, Griffin, Cobra SR и ISA 454 соответственно

Для установления факта наличия или отсутствия локусов BraA.eIF(iso)4E.a и BraA.eIF(iso)4E.c в геноме 12 из 23 образцов В. rapa, не дающих продукт амплификации, проводили дот-блот анализ препаратов геномной ДНК. Продукты ПЦР локусов BraA.eIF(iso)4E.a и BraA.eIF(iso)4E.c метили с использованием дигоксигенин-11-дУТФ. Дот-блот гибридизация показала наличие искомых локусов в образцах В. rapa (рисунок 3). Вероятно, нуклеотидные последовательности локусов сильно изменены в местах посадки праймеров, что и приводит к отсутствию продукта амплификации.

■Н # * #

■ R2 R3 IM HS

So Л % So 'tü

w Віщі

«Я- Ї$ЄЗ R57 т »

а б

Рисунок 3 - Дот-блот гибридизация ДНК образцов В. rapa с зондами на локусы: а -BraA.eIF(iso)4E.a; б - BraA.eIF(iso)4E.c. +К - ДНК восприимчивого к TuMV образца Kousaitai (В. rapa); R2-R67 - ДНК образцов В. rapa, не дающих продукты амплификации; -К - ДНК плазмиды pBR328; 0 - ТЕ-буфер без ДНК-матрицы

Продукты ПЦР локусов BraA.eIF4E.a, BraA.eIF(iso)4E.a и BraA.eIF(iso)4E.c пяти восприимчивых к TuMV: Галакси (В. napus), Kousaitai (В. rapa), горчица сарептская краснолистная {В. juncea), № 12 (В. nigra) и № 78 (В. carinatá)-, и восьми устойчивых образцов: DH № 417 (В. napus), DH Jp-8 (В. napus), DH ISA454 (В. oleracea), IT 103369 (В. rapa), сурепица Palton sarson

и К-374 88/47 (В. rapa), капуста китайская Dark green leaf и Местный К-316 (В. гара)\ секвенировали. Каждый ген состоит из пяти экзонов и четырех интронов (Jenner et al., 2010). После выравнивания нуклеотидные последовательности сравнивали между собой и с последовательностями, взятыми из GeriBank, на наличие полиморфизма и отличий в нуклеотидных последовательностях между устойчивыми и восприимчивыми к TuMV образцами.

Полиморфизм белков оценивали по показателям энтропии (Нх). Наиболее полиморфным оказался локус BraA.eIF4E.a, в котором замены аминокислот присутствуют во всех пяти экзонах. Аллельные варианты данного локуса 1 и 2 различались между собой длиной 1 интрона, а 3 аллельный вариант (образцы В. rapa var.oleifera R2, R4, R19, R40, R41 и R61) оказался псевдогеном, т.к. в нем отсутствовала часть 3 экзона, полностью 3 интрон и 4 экзон. Меньше полиморфизма наблюдалось в BraA.eIF(iso)4E.c и BraA.eIF(iso)4E.a, где аминокислотные замены встречались в 1, 2 и 3 экзонах и ни одной замены в четвертом и пятом.

В результате выравнивания аминокислотных последовательностей локуса BraA.eIF(iso)4E.a была выявлена замена аминокислоты i52Gly —> Asp (глицин на аспарагиновую кислоту), характерная для всех устойчивых образцов (рисунок 4). Данная аминокислотная замена также была обнаружена в В. rapa ssp. chinensis и отмечалась, как мутация, ведущая к устойчивости к 4 патотипу TuMV (Qian et al., 2013).

1 110 ' 120 130 140 150

-8&42S - :'•'"•" «ей***-:/-' í^ineipus:':.'' - • • TCöüeaitiai' ¿apart•/" В. rape 8. nigtt Me ,12

DH ISA / В. oleracea DH Jp-8 / В. пари* DH No 417 / В. napua ZT 103369 Köre» / В. rapa Palton sarion Kor*«/ B. rapa var. oleífera K-374 88/47 Bhutan / B. capa ver. oleífera Dark gxeen leaf China / В. rap* subsp. chinensis loeal K-316 Vietnam / B. rapa subep. chinensi*

Рисунок 4 - Выравнивание последовательностей аминокислот в коротком сегменте экзона 3 BraA.elF(iso)4Ea среди пяти восприимчивых и восьми устойчивых к TuMV образцов Brassica. 80425 - аминокислотная последовательность локуса BraA.eIF(iso)4E.a восприимчивой к TuMV линии В. тара ssp. chinensis

Замены в локусе BraA.eIF(iso)4E.c преимущественно были локализованы в третьем экзоне, который, возможно, принимает участие в связывании с VPg-белком TuMV, но не у всех устойчивых образцов.

В связи с тем, что локус BraA.eIF4E.a оказался наиболее полиморфным и присутствовал у всех представителей Brassica, секвенировали дополнительные

образцы. В результате выравнивания аминокислотных последовательностей выявлена замена 4оТЪг —► Не (треонин на изолейцин) у всех устойчивых к ТиМУ образцов (рисунок 5). У образца К-131 Туге Индия данная замена наблюдалась в обоих аллельных вариантах локуса, а у К-13 Аргентина - в одном. Однако нефункциональная для репликации ТиМУ аллель данного локуса имеет доминантный характер, что и позволяет образцам проявлять устойчивую фенотипическую реакцию к ТиМУ.

OIP4E.i

Qn!оху / В. п«ри»

КЬаМЬкС-аёмя / «.

»»

DH ISA / 6. oleracea ОН Jp-8 / В. пари« DM N9 417 / В. три«

fíab© silvestre Peru / 9. rapa var. oleífera R-219 Bp4in / В. rapt vir. oleífero K-231 Vat-Cawte Tanzania / В. rapa var. oleífera R-131 Tyre 1 India / B. rapa var. oleífera K-131 Tyre 2 India / B. rapa ver. oleífera K-299 Bengala India / B. capa var. oleífera Palton sareon Korea / в. rapa var. oleífera K-374 88/47 Bhutan / В. rapa var. oleífera K-13 1 Argentina / B. rapa var. oleífera K-13 2 Argentina / B. rapa var. oleífera К-1Э Э Argentina / B. rapa var. oleífera K-83 8v Duro Sweden t B. rapa var. oleífera K-1050 Wolinsky Russia / В. rape rapifera K-1039 White ball Russia / В. rapa rapifera К-1199 bocal Xcaa / B. rapa rapifera IT 103369 Korea / В. rape

local K-316 Vietnam / В. rapa subap. ehinensie Dark, green leaf China / B. rapa subsp. chinensie K-244 21nt ehanting Pakistan i B. raoa eubsp. pek

В.: .¡juncea. . By nígr*-3ío::-.i2A-: В. carínate No 78

20 30 40 SO 60 70

EE3NPb¿lAD)fPIDRVKE£3DDAEB(3ÁTVDEiiSK£AVPBSHÍliSíiS^TLHfDNÍSVK3KQ

Рисунок 5 - Выравнивание последовательностей аминокислот в коротком сегменте экзона 1 BraA.eIF4E.a среди шести восприимчивых и девятнадцати устойчивых к TuMV образцов Brassica. eIF4E.a - аминокислотная последовательность локуса BraA.eIF4E.a восприимчивой к TuMV линии В. rapa ssp. trilocularis R-o-18

Неспецифическая устойчивость у Brassica обеспечивается двумя взаимодействующими генами retrOl и ConTROl (Rusholme et al., 2007). Рецессивная аллель гена retrO 1, совпадающая с локусом фактора инициации трансляции BraA.eIF(iso)4E.a не обеспечивает репликацию TuMV и усиливает проявление устойчивости, контролируемой вторым геном — ConTROly который наоборот имеет доминантную аллель, совпадающую с BraA.eIF4E.a и не функциональную для TuMV. Оба данных локуса (В ra А. eIF(iso)4E. а и BraA.eIF4E.á) имеют мутации, характерные для устойчивых образцов и, вероятно, являются нефункциональными для присоединения VPg-белка TuMV, тем самым, обеспечивая растению устойчивость к вирусу.

Локусы elF(iso)4E и eIF4E представляет собой новый и потенциально прочный источник неспецифической устойчивости к TuMV, который может быть передан восприимчивым сортам и культурам рода Brassica.

Анализ возможности передачи TuMV семенами растений рода Brassica

Подбор растения-индикатора для диагностики TuMV по методике Холмса

Методика Холмса была предложена для диагностики ВТМ на семядолях огурца (Holmes, 1929). По литературным данным Cucumis saíivus не инфицируется TuMV. Поэтому индикаторное растение подбирали экспериментально из представителей семейства Cucurbitaceae (Тыквенные); Cucurbita maxima L. (тыква гигантская), Cucurbita pepo L. (кабачок) Ecballium elaterium L. (бешеный огурец обыкновенный), Cucurbita meló L. (дыня). Механическую инокуляцию семядольных листьев проводили соком неинфицированного растения В. napus и двумя изолятами, относящимися к разным патотипам TuMV (12 и 17).

Через 5-7 дней после заражения инокулированные семядольные листья срезали, часть смотрели на наличие крахмальных паранекрозов при помощи йодного окрашивания, а часть проверяли на наличие TuMV ИФА. Результаты ИФА подтвердили результаты визуальной оценки.

Крахмальные паранекрозы на семядольных листьях, как результат механической инокуляции соком растения Brassica с вирусной инфекцией, были отмечены на С. pepo, Е. elaterium и С. meló. Семядольные листья Е. elaterium и С. meló очень нежные и небольших размеров, что делает работу более трудоемкой. Поэтому в качестве растения-индикатора TuMV по методике Холмса был выбран С. pepo, имеющий оптимальный размер и толщину семядольных листьев.

Диагностика TuMV в семенах, зародышах и взрослых растениях

Растения, инфицированные исследуемыми штаммами TuMV, как правило, не достигали фазы цветения или не завязывали семена. Лишь при поражении TuMV 12 с толерантных и слабовосприимчивых образцов удалось собрать семена. Слабовосприимчивые образцы: яровой рапс {В. napus) Cobra Spring (1), Галакси (5), СЮС5.1 (10), № 423 (24), Aomory-3 (30), Aomory-1 (39), Ратник (45); горчица индийская {В. juncea) Лада (За), FBLM (8а); и толерантный к вирусу образец В. napus STS К0 (47) после механической инокуляции штаммом TuMV 12 довели до цветения, самоопылили и собрали семена.

Перед тестированием семян на наличие в них вирусной инфекции проводили поверхностное обеззараживание тремя способами: 70 % этанолом + NaOCl (pH 12,6) - спирт и щелочная среда инактивирует поверхностную вирусную инфекцию; мирамистином - противовирусный коммерческий препарат; прогревом семян в стерильной дистиллированной воде при 50 °С в течение 20 мин, а затем перемещение на 5 мин в холодную стерильную

дистиллированную воду - термическая обработка семян с целью инактивации вирусных частиц. После предварительного обеззараживания семена были рендомизированно высажены в изолированном боксе теплицы при соблюдении мер предосторожности против случайной контаминации вирусом.

При благоприятных для накопления вирусной инфекции в растениях условиях (+ 24 °С) через 20-25 дней растения шести образцов (1, 10, 24, 39, 45 и За) из девяти показали симптомы. При последующем снижении температуры до +18 °С симптомы исчезали в течение двух недель, что подтверждало толерантную и слабовосприимчивую реакцию отобранных растений. Со всех образцов был собран материал для проверки наличия вируса методами ИФА, ОТ-ПЦР, методом Холмса с модификациями.

ИФА и метод инокуляции семядольных листьев С. pepo по Холмсу (рисунок 6) и ОТ-ПЦР на участок гена Р1 (рисунок 7) показали наличие TuMV в восьми образцах (1, 5, 10, 24, 39,45,47Т и За) из девяти.

Рисунок 6 - Пример крахмальных паранекрозов на семядольных листьях С. pepo, инокулированных: 1 - образцом, не содержащим по результатам оценки TuMV; 2 - соком здорового растения В. napus\ 3 -инокулюмом TuMV 12; 4 - образцом, содержащим TuMV, переданный семенами

Рисунок 7 - Элекгрофореграмма продуктов ПЦР с праймерами на ген Р1Л- маркер молекулярной массы (lOObp Fermentas); 2 -ПЦР без кДНК-матрицы; 3 - ПЦР на препарате кДНК здорового растения; 4 - ПЦР на препарате кДНК TuMV 12; 5-13 - ПЦР на препаратах кДНК исследуемых образцов (Í, 5, 10, 24, 39, 45, 47Т, За, 8а соответственно)

Для обнаружения TuMV в семенах изучаемых образцов пробы по 20 шт. каждого образца (1, 5, 10, 24, 30, 39, 45, За и 8а) были взяты для ИФА и ОТ-ПЦР. ОТ-ПЦР показал наличие TuMV в пробах семян для семи из девяти изучаемых образцов. ИФА выявил TuMV только в двух пробах № 423 (24) и

Ратник (45), что говорит о большой концентрации вируса в них. Причем, вероятно, накопление вирусной инфекции в семенах находится в обратной корреляции с восприимчивостью к вирусу образцов, так как № 423 и Ратник поражались ТиМУ 12 на уровне 2-3 баллов.

Для изучения механизма передачи ТиМУ семенами отбирали пробы по 30 семян каждого из четырех образцов (Аошогу-3, Ратник, Лада и РВЬМ) для индивидуального анализа зародышей семян на присутствие в них ТиМУ методом ОТ-ПЦР, методикой Холмса с модификациями и ИФА. ОТ-ПЦР диагностировал ТиМУ только в четырех и трех из десяти зародышей образцов Ратник и Лада соответственно. Методика Холмса с модификациями показала наличие ТиМУ в трех зародышах из десяти в образце Ратник и в четырех из десяти зародышей образца Лада, а в зародышах образцов Аотогу-3 и РВЬМ вирус не был обнаружен. Таким образом, ТиМУ в зародышах семян образцов Аотогу-3 и БВЬМ не был обнаружен ни одним из методов. Однако в зародышах семян образцов Ратник и Лада реакция на вирус была положительной для всех используемых методов.

Для идентификации передаваемого семенами вируса из зараженных растений выделили тотальную РНК и с помощью ОТ-ПЦР с использованием специфических пар праймеров амплифицировали и секвенировали фрагмент кДНК гена Р1. Нуклеотидные последовательности были идентичны исходному изоляту ТиМУ 12, а сравнение их с последовательностями базы данных, выявило наиболее близкий изолят ТиМУ ЫК1 (Великобритания), с идентичностью 99 %.

Детекция ТиМУ методом ПЦР в реальном времени

Передача вируса с семенами имеет важное экономическое значение, так как обеспечивает наиболее опасный способ распространения и сохранения вирусной инфекции в течение длительного времени. Для ограничения распространения ТиМУ на территории РФ необходимо проводить проверку зараженности этим вирусом семян овощных и масличных крестоцветных культур. Поэтому с целью своевременной детекции вируса при малых его концентрациях необходимо применение более чувствительных методов, например, метода ПЦР в реальном времени.

Для проведения ПЦР в реальном времени последовательности праймеров и зонда подбирали на наиболее консервативный и специфичный для ТиМУ участок гена Р1. Для регистрации накопления продуктов ПЦР использовали линейные разрушаемые пробы (ТадМап), позволяющие детектировать накопление фрагмента ДНК строго определенной последовательности.

В результате анализа данных ПЦР в реальном времени была показана эффективность реакции на уровне 1,7-1,8. Пороговое значение флуоресценции

1б

для определения величины порогового цикла (С^ было установлено на уровне 30 во время экспоненциального возрастания кривой амплификации. Реакции со значениями О менее 45 и экспоненциальными амплификационными участками считали положительными. Если значения О не были получены из-за отсутствия точки пересечения кривой амплификации с пороговым значением, реакции оценивали как отрицательные (таблица 4).

Таблица 4 - Значения порогового цикла (СО ПЦР в реальном времени для изолятов ТиМУ, проб семян и растений, выросших из них __

Образец FAM Ct Наличие TuMV Образец FAM Ct Наличие TuMV

Изоляты TuMV

-К (ПЦР без кДНК-матрицы) 0,00 - 13b 18,97 +

-К (кДНК здорового растения) 0,00 - 17 18,36 +

12 17,93 + 18 19,42 +

Ca 17,96 + 110 16,99 +

Пробы семян

-К (ПЦР без кДНК-матрицы) 0,00 - 24 29,92 +

-К (кДНК здорового растения) 0,00 - 30 30,39 +

+К (кДНК изолята 12 TuMV) 15,23 + 39 23,11 +

1 29,88 + 45 29,29 +

5 29,87 + За 21,33 +

10 17,31 + 8а 30,90 +

Растения, выросшие из инфицированных семян

-К (ПЦР без кДНК-матрицы) 0,00 - 24 23,53 +

-К (кДНК здорового растения) 0,00 - 30 26,17 +

+К (кДНК изолята 12 TuMV) 20,73 + 39 24,81 +

1 22,93 + 45 23,26 +

5 24,91 + За 21,94 +

10 21,68 + 8а 27,11 +

Примечание: FAM Ct - величины порогового цикла по флуоресцентному красителю FAM

По результатам ПЦР в реальном времени было подгверяедено аличие TuMV в образцах. Достижение пороговой величины наблюдали на препаратах кДНК изолятов TuMV на 17-19 циклах, на препаратах кДНК проб семян исследуемых образцов - 22-31 циклах и на препаратах кДНК растений, выросших из инфицированных семян, на 20-27 циюіах. В отрицательных контролях (без кДНК матрицы и к ДІЖ неинфицированного растения) экспоненциального возрастания кривой амплификации не наблюдали на протяжении всех 45 циклов. В пробах, приготовленных из семян и выросших из них растений, образцов Aomoiy-З (30) и FBLM (8а) по данным ПЦР в реальном времени было показано наличие TuMV с величиной порогового около 30 и 27 соответственно, что несколько меньше, чем в других образцах.

Полученные данные позволяют рекомендовать подобранные праймеры и пробу для разработки набора для диагностики TuMV методом ПЦР в реальном времени в семенах и инфицированных растениях.

Генетический и филогенетический анализ изолята 12 TuMV

По литературным данным TuMV не передается семенами, однако в данной работе показана передача TuMV 12 с семенами растений рода Brassica. С целью выявления мутаций, которые позволили изоляту TuMV 12 передаваться через семена, была определена полная кодирующая последовательность его генома (GenBank № КС297103).

Возможные генетические связи и филогенетическая группировка полных последовательностей геномов всех известных изолятов TuMV при исследовании изучали тремя методами: максимального правдоподобия, минимальной эволюции и ближайших соседей. Филогенетические деревья рассчитывали для геномных последовательностей 112 изолятов TuMV, включая все рекомбинантные штаммы. По патогенности и происхождению все изоляты TuMV делят на четыре группы: базальная-В, базальная-BR, азиатская-BR и мировая-В. Изолят 12 принадлежит к мировой-В группе, и наиболее близкими к нему изолятами являются UK1 (AF169561.2), GBR50 (АВ252114.1), GBR98 (EU861593.1) и GBR36 (АВ252113.1).

Таблица 5 - Показатели изменчивости генов для мировой-В группы TuMV_

Показатель Гены TuMV

PI HC-Pro РЗ 6К1 С/ 6К2 VPf> Pro NIb СР

GC состав, % 48,56 45,56 44,69 45,63 45,01 46,79 47,15 44,59 45,38 47,93

Ts/Tv 8,99 11,29 6,55 5,95 9,73 12,23 9,86 12,13 15,99 5,83

N/S 0,254 0,036 0,229 0,016 0,039 0,057 0,024 0,025 0,048 0,095

Число полиморфных сайтов 495 451 398 42 550 49 201 207 425 162

Нуклеотидное разнообразие 0,079 0,058 0,069 0,049 0,041 0,040 0,056 0,047 0,034 0,026

Tajima's D -1,37 Р>0,1 -1,34 Р>0,1 -1,22 Р>0,1 -1,24 Р>0,1 -1,76 Р>0,1 -1,82 Р<0,05 -1,48 Р>0,1 -1,35 Р>0,1 -1,92 Р<0,05 -1,82 Р<0,05

Примечание: Те - транзиция; Ту - трансверсия; Б - синонимичная замена аминокислоты; N - несинонимичная замена аминокислоты

По показателям изменчивости генов для мировой-В группы видно, что СС состав всех 10 генов ТиМУ в среднем находится на одном уровне (таблица 5). Отношение Тз/Ту далеко от единицы, что говорит об отсутствии повторных замен нуклеотидов (реверсий) в генах ТиМУ. Число несинонимичных замен меньше числа синонимичных, а их отношение отлично от 1, следовательно, в мировой-В группе ТиМУ имеет место стабилизирующий отбор. Нуклеотидное разнообразие генов показывает, что наиболее полиморфными генами ТиМУ

являются PI и РЗ, а самыми стабильными - CP и Nib. Тест Tajima's D говорит об отборе, т.к. его значения находятся в пределах -2...О, то отбора нет и существенной адаптации генов не выявлено.

Для детекции возможных рекомбинационных событий в изоляте TuMV 12 использовали методы, реализованные в программе RDP. Результаты показали, что изолят TuMV 12 имеет два рекомбинационных события, которые были идентичны с изолятом UK1. TuMV 12 и UK 1 являются рекомбинантами между FKD001 (95,7 %) и Ти-3 (96,3 %), принадлежащими к мировой-В группе. Нуклеотиды 1-328 генома 12 были из изолята FKD001J (Я sativus, Япония), а 465-9367 - Ти-3 (В. oleráceo, Япония). Сайты рекомбинации были расположены в районе середины гена Р1 и З'-участка гена СР. Рекомбинационные события были обнаружены по меньшей мере шестью методами (RDP, GENECONV, MaxChi, Chimaera, SiScan и 3Seq) и имели Р-значения от 6,204 * Ю'05 до 2,516 х 10"85.

Поскольку изоляты TuMV 12 и UK1 имеют общие рекомбинационные события, то, вероятно, изолят 12 произошел от UK1 в результате мутаций. Результаты оценки времени наиболее вероятного расхождения генотипов 12 и UK1, полученные с помощью эволюционного анализа с использованием модели р-рассгояния (Nei and Kumar, 2000), согласуется с информацией об эпифитотии заболевания в конце 1990-х годов после испытания коллекции сортов пекинской капусты, завезенной в Россию из Великобритании, на Селекционной станции РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Г.Ф. Монахос, личное сообщение).

При сравнении нуклеотидной последовательности кодирующей части генома TuMV 12 с наиболее близкими изолятами (UK1, GBR50, GBR98, GBR36) было обнаружено 99 нуклеотидных замен (92 транзиции (40 C/U и 52 G/A) и 7 трансверсий), распределенных по всем 10 генам вируса (таблица 7).

Таблица 7 - Количество и частота нуклеотидных замен в геноме TuMV 12

Ген Количество замен Частота нуклеотидных замен, %

название п.н. нуклеотидов аминокислот

Р1 1086 12 4 1,10

НС-Рго 1374 6 - 0.44

РЗ 1065 8 - 0.75

6К1 156 1 - 0,64

CI 1932 33 - 1.71

6К2 159 3 - 1.89

VPg 576 2 - 0,35

Pro 729 4 - 0.55

Nib 1551 21 - 1.35

CP 862 9 1 1,04

Пять замен были несинонимичными и уникальными в сравнении со всеми известными штаммами ТиМУ и привели к изменениям в двух из десяти закодированных вирусных белков. Четыре из них были в Р1 и одна - в СР (рисунок 8). Несмотря на большое количество нуклеотидных замен в геноме ТиМУ 12 в сравнении с наиболее близкими к нему изолятами, в среднем <ЗС состав остался на уровне изолята ЦК1 и составил 46,38 %.

гЩ ?

т I } т *

1»й I

5 яя й

I

Сайты замен

Гены

Р1

НС-Рго

РЗ

CI

УРЭ

3»2

ezo

6К1

II

Ц-f 122-

6К2 II

1S"1 1924

Pro Nlb

CP

2116 23M

2STÍ

3164

Рисунок 8 - Схематическое изображение структуры генома TuMV 12 с расположением уникальных аминокислотных замен

Белок PI относится к числу наиболее полиморфных потивирусных белков, участвует в репликации вируса и вместе с НС-Pro действует как усилитель патогенности, подавляя сайленсинг генов. Функции CP заключаются в раздевании и амплификации вируса, его транспорте от клетки к клетке, по всему растению и в передаче тлями (Urcuqui-Inchima et al., 2001). Вероятно, обнаруженные мутации усиливают амплификацию генома и транспорт вируса по растению, одновременно ослабляя его агрессивность, что позволяет растению достигать фазы цветения и завязывать семена, в которых накапливается вирусная инфекция.

ВЫВОДЫ

1. В результате молекулярно-генетического анализа были определены 6 новых изолятов TuMV, принадлежащих к 1 и 5 патотипам вируса, имеющих различное происхождение, вирулентность и характер заражения растений.

2. Получены удвоенные гаплоидные линии 13 генотипов видов В. napus и В. oleráceo, обладающих устойчивостью к 6 изолятам TuMV, относящихся к 1 и 5 патотипам.

3. Впервые показано наличие локуса эукариотического фактора инициации трансляции BraA.eIF4E.a у изученных представителей всех видов рода Brassica и отсутствие его изоформ BraA.eIF(iso)4E.a и BraA.eIF(iso)4E.c в геноме В. juncea.

4. В результате сравнения аминокислотных последовательностей локусов BraA.eIF(iso)4E.a и BraA.eIF4E.a у устойчивых к TuMV образцов Brassica выявлены аминокислотные замены ^Gly —> Asp и 4oThr —<■ Ile, соответственно.

5. Впервые показана возможность передачи TuMV (изолят 12) семенами растений рода Brassica через зародыш семени.

6. В результате анализа полной последовательности кодирующей части генома изолята TuMV 12 показано, что способность передаваться семенами может быть связана с уникальными аминокислотными заменами в последовательностях генов PI (122, 134,261,301) и CP (2896).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Зубарева, И.А. Вирус мозаики турнепса передается семенами / И.А. Зубарева, А.Н. Игнатов, Т.Н. Грибова, С.Г. Монахос // Защита и карантин растений. Москва. - 2013. - № 1. - С. 37-40.

2. Зубарева, И.А. Молекулярная характеристика изолятов Turnip mosaic virus из растений рода Brassica / И.А. Зубарева, Т.Н. Грибова, С.Г. Монахос, А.Н. Игнатов // Известия ТСХА. Москва. - 2013. - № 1. - С. 29-35.

3. Зубарева, И.А. Передача штамма 12 Turnip mosaic virus с семенами растений рода Brassica /И.А. Зубарева, А.Н. Игнатов, Т.Н. Грибова, С.Г. Монахос//Известия ТСХА. Москва. -2013. -№ 2. -С. 34-41.

4. Зубарева, И.А. Генетическое разнообразие вируса мозаики турнепса и механизм его передачи семенами растений рода Brassica / И.А. Зубарева, C.B. Виноградова, Т.Н. Грибова, С.Г. Монахос, академик К.Г. Скрябин, А.Н. Игнатов // Доклады академии наук. Москва. - 2013. - Том 450, № 1. - С. 105108.

5. Зубарева, И.А. Создание дигаплоидных линий Brassica napus -доноров устойчивости к вирусу мозаики турнепса / И.А. Зубарева, E.H. Головешкина, C.B. Виноградова, Т.Н. Грибова, С.Г. Монахос, А.Н. Игнатов // Сельскохозяйственная биология. Москва. - 2013. - № 5. - С. 122-125.

6. Зубарева, И.А. Бактериальные и вирусные болезни сельскохозяйственных культур: распространение и диагностика / А.Н. Игнатов, C.B. Виноградова, E.H. Головешкина, И.А. Зубарева // Овощи России. - 2013. -№2.-С. 67-68.

7. Зубарева, И.А. Изучение коллекции исходного материала растений рода Brassica как источника генов устойчивости к вирусу мозаики турнепса (TuMV) / И.А. Зубарева, Т.Н. Грибова, А.Н. Игнатов // Тезисы докладов II международной школы-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях". Москва: Звенигород. - 2011. - С. 41.

8. Зубарева, И.А. Физиологическая и молекулярная характеристика изолятов вируса мозаики турнепса (TuMV) из растений рода Brassica / И.А. Зубарева, Т.Н. Грибова, А.Н. Игнатов // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIV зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва. - 2012. -С. 90.

9. Зубарева, И.А. Передача изолята 12 Turnip mosaic virus с семенами растений рода Brassica / И.А. Зубарева, Т.Н. Грибова, А.Н. Игнатов // Тезисы докладов II (X) Международной ботанической конференции молодцх ученых в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург. - 2012. - С. 62.

10. Зубарева, И.А. Создание дигаплоидных линий масличного рапса -доноров устойчивости к вирусу мозаики турнепса / И.А. Зубарева, Т.Н. Грибова, А.Н. Игнатов // Сборник тезисов докладов Осеннего финала по программе «У.М.Н.И.К.» РАН. Москва, Президиум РАН. - 2012. - С. 16.

11. Зубарева, И.А. Механизм передачи изолята 12 Turnip mosaic virus с семенами растений рода Brassica / И.А. Зубарева, C.B. Виноградова, Т.Н. Грибова, А.Н. Игнатов // сборник трудов I международной интернет-конференции «Современные тенденции в сельском хозяйстве». Казань. - 2012. -С. 96-97.

12. Зубарева, И.А. Создание устойчивых к TuMV удвоенных гаплоидных линий Brassica / И,А. Зубарева, E.H. Головешкина, Т.Н. Грибова, А.Н. Игнатов // сборник трудов I международной интернет-конференции «Современные тенденции в сельском хозяйстве». Казань. - 2012. - С. 98-99.

13. Зубарева, И.А. Генетическое разнообразие TuMV и создание удвоенных гаплоидных линий - доноров устойчивости к нему / И. А. Зубарева, Т.Н. Грибова, А.Н. Игнатов // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXV международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Том 2. Конкурс молодых ученых. Москва. - 2013. - С. 49.

14. Зубарева, И.А. Молекулярная характеристика изолятов TuMV и создание дигаплоидных линий Brassica - доноров устойчивости к нему / И.А. Зубарева, А.Н. Игнатов // XII Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - 2013. -С. 24-25.

15. Зубарева, И.А. Молекулярная характеристика изолятов TuMV и создание дигаплоидных линий Brassica napus - доноров устойчивости к нему / И.А. Зубарева, Т.Н. Грибова, А.Н. Игнатов // 17 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. - 2013. - С. 335-336.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60х84'/|б. Усл. печ. л. 1,16. Тираж 100 экз. Заказ 437.

Издательство РГАУ - МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: (499) 977-00-12, 977-26-90,977-40-64

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зубарева, Ирина Александровна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» Российской академии наук

На правах рукописи Экз

04201361533 '

Зубарева Ирина Александровна

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ВИРУСА МОЗАИКИ ТУРНЕПСА И СОЗДАНИЕ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ BRASSICA - ИСТОЧНИКОВ УСТОЙЧИВОСТИ К НЕМУ

Специальность: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии),

03.02.07 - генетика

Научный руководитель: доктор биологических наук

А.Н. Игнатов

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

i

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................................................4

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................7

1.1 Вирус мозаики турнепса (TuMV).....................................................................................7

1.1.1 Систематика, происхождение и эволюция............................................................7

1.1.2 Морфология частиц и организация генома...........................................................9

1.1.3 Генетическое разнообразие TuMV.......................................................................14

1.1.4 Симптомы, пути распространения и вредоносность..........................................17

1.2 Растения-хозяева (семейство Brassicaceae)...................................................................22

1.2.1 Систематика, морфобиологические, генетические и физиологические особенности.......................................................................................................................22

1.2.2 Устойчивость к TuMV...........................................................................................29

1.2.3 Устойчивость растений к TuMV, определяемая локусами eIF(iso)4E и eIF4E 35

1.2.4 Получение гаплоидных растений рода Brassica с использованием культуры микроспор..........................................................................................................................38

1.2.5 Заключение.............................................................................................................43

II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................................45

2.1 Растения и изоляты вируса..............................................................................................45

2.2 Молекулярно-генетический анализ изолятов................................................................49

2.2.1 Выделение суммарной РНК из растительного материала.................................49

2.2.2 Проведение реакции обратной транскрипции.....................................................50

2.2.3 Проведение полимеразной цепной реакции........................................................50

2.2.4 Электрофоретический анализ продуктов ПЦР....................................................51

2.2.5 Выделение ДНК из агарозного геля.....................................................................51

2.2.6 Секвенирование ПЦР-фрагментов и биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей...............................................................................52

2.3 Определение вирулентности выделенных изолятов TuMV и поиск растений-источников устойчивости......................................................................................................53

2.3.1 Проведение механической инокуляции растений..............................................53

2.3.2 Оценка устойчивости образцов Brassica к TuMV...............................................54

2.3.3 Обнаружение TuMV методом ИФА.....................................................................54

2.4 Получение удвоенных гаплоидных растений Brassica.................................................56

2.4.1 Выращивание донорных растений и сбор бутонов.............................................56

2.4.2 Изоляция, культивирование и индукция перехода микроспор к эмбриогенезу56

2.4.3 Регенерация эмбриоидов.......................................................................................57

2.4.4 Определение уровня плоидности растений.........................................................57

2.4.5 Удвоение числа хромосом.....................................................................................58

2.5 Анализ полиморфизма локусов eIF(iso)4E и eIF4E......................................................59

2.5.1 Выделение суммарной ДНК из растительного материала.................................59

2.5.2 Проведение дот-блот гибридизации.....................................................................59

2.5.3 Анализ полиморфизма локусов............................................................................61

2.6 Изучение передачи TuMV с семенами растений Brassica...........................................61

2.6.1 Изучение механизма передачи TuMV.................................................................61

2.6.2 Диагностика TuMV методом Холмса...................................................................63

2.6.3 Детекция TuMV методом ПЦР в реальном времени..........................................64

2.7 Генетический анализ изолята 12 TuMV..........................................................................65

2.7.1 Определение и анализ нуклеотидной последовательности генома 12 TuMV.. 65

III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...........................................................................................66

3.1 Определение TuMV с использованием растений-индикаторов и ИФА......................66

3.2 Молекулярно-генетический и филогенетический анализ изолятов TuMV................68

3.3 Анализ вирулентности изолятов TuMV.........................................................................72

3.4 Получение удвоенных гаплоидных линий Brassica — источников устойчивости к TuMV ......................................................................................................................................76

3.5 Анализ полиморфизма локусов eIF(iso)4E и eIF4E у представителей Brassica........87

3.6 Анализ возможности передачи TuMV с семенами растений рода Brassica...............97

3.6.1 Подбор растения-индикатора для диагностики TuMV по методике Холмса.. 97

3.6.2 Диагностика TuMV в семенах, зародышах и взрослых растениях...................98

3.6.3 Детекция TuMV методом ПЦР в реальном времени........................................102

3.7 Генетический и филогенетический анализ изолята 12 TuMV....................................106

ВЫВОДЫ......................................................................................................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................115

Приложение А..............................................................................................................................141

ВВЕДЕНИЕ

Вирус мозаики турнепса (Turnip mosaic virus - TuMV) относится к крупнейшей группе фитопатогенных вирусов семейства потивирусы (Potyviridae) (Shukla, V.l., 1994). Это один из наиболее интересных представителей семейства, так как он инфицирует широкий спектр культурных видов растений, включая все возделываемые виды капустных, а также декоративные, дикорастущие и сорные виды из 156 родов 43 семейств растений (Edwardson, J.R., Christie R.G., 1991). Это наиболее известный представитель рода Potyvirus, поражающий растения семейства Капустные.

При поражении растений происходит задержка в росте, ранняя дефолиация, снижение товарного вида кочанных и салатных форм, что приводит к снижению урожайности и значительным экономическим потерям при выращивании сельскохозяйственных культур видов рода Brassica (Shattuck, V.l., 1992). Во многих странах по экономической вредоносности TuMV стоит на втором месте, уступая лишь вирусу мозаики огурца (Cucumber Mosaic Virus - CMV) (Tomlison, J.A., Carter, A.L., Dale, W.T., et al., 1970). Его вредоносность резко усиливается при перекрестном заражении с другими вирусами (Camele, I., Nuzzaci, М., Rana, G.L., et al., 1991).

Один из наиболее опасных способов распространения и сохранения вирусной инфекции - передача вируса с семенами, что имеет серьезные последствия, и создает очаги первичной инфекции при посеве/посадке растений в поле. Вирусы могут сохраняться в семени в течение длительного времени и распространяться на большие расстояния (Matthews, 2009). Эффективных химических методов борьбы с вирусными заболеваниями в настоящее время не существует. Больные растения рекомендуется удалять из посадок, своевременно проводить опрыскивание от насекомых-переносчиков (тли), подавлять сорняки и улучшать общие фитосанитарные условия. Естественная устойчивость растений является единственно возможным,

эффективным и экологически безопасным способом борьбы с TuMV (Suh, S.K. et al, 1995; Walsh, J.A. et al., 2002).

В настоящее время в России проводится небольшое количество работ, связанных с TuMV и посвященных исследованию устойчивости к этому вирусу у капусты пекинской (Микрюков, А.С., 2010). Генетическое разнообразие российской популяции TuMV не изучено вовсе: только два изолята были включены в исследования английских и японских ученых, посвященных генетическому полиморфизму вируса (Jenner, С.Е., Walsh, J.A., 1996; Tomimura, К., Gibbs, A.J., et al., 2003). На сегодняшний момент изучение TuMV особенно важно, поскольку опасность распространения TuMV нарастает, а количество сортов капустных, устойчивых к нему, невелико. Известные сорта эффективны только против какого-либо одного патотипа TuMV, а гены устойчивости малоизученны.

Анализ аллельного состояния генов устойчивости и их вариативности по нуклеотидной последовательности, приводящей к устойчивости к разным штаммам, возможны только при анализе чистых линий. В свою очередь для создания генетически выровненных чистых линий перекрестных культур требуется не менее 8-10 лет, причем метод самоопыления часто приводит к инбредной депрессии, а иногда и просто невозможен из-за явления самонесовместимости. Поэтому в качестве объекта исследований при изучении генов устойчивости наиболее часто используются удвоенные гаплоидные растения (Rusholme, R.L., 2007; Jenner, С.Е., 2010; Qian, W., 2013), на создание которых требуется от 1 до 2 лет.

Удвоенные гаплоидные растения являются полностью гомозиготными по всем генам и при скрещивании дают морфологически, физиологически и генетически однородное потомство. Кроме того, удвоенные гаплоиды лишены летальных и сублетальных мутаций, ведущих к ослаблению потомства растений при инбредном размножении, и могут использоваться в качестве линий - источников генов устойчивости к TuMV при создании коммерческих

\

сортов и гибридов. Поэтому для изучения генов устойчивости получение удвоенных гаплоидных линий, одновременно являющихся источниками генов устойчивости к TuMV, представляет собой важную научную и практическую задачу.

Цель исследования - изучить генетическое разнообразие вируса мозаики турнепса и создать удвоенные гаплоидные линии рода Brassica -источники устойчивости к патогену.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Провести молекулярно-генетический и филогенетический анализ изучаемых изолятов TuMV.

2. Оценить коллекции Brassica на устойчивость к TuMV и получить удвоенные гаплоидные линии - источники устойчивости к нему.

3. Оценить полиморфизм локусов eIF4E и eIF(iso)4E, связанных с устойчивостью к TuMV, у представителей Brassica.

4. Изучить возможность передачи изолята TuMV 12 через семена Brassica, получить и проанализировать полную нуклеотидную последовательность кодирующей части его генома.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вирус мозаики турнепса (TuMV)

1.1.1 Систематика, происхождение и эволюция

Вирус мозаики турнепса (Turnip mosaic virus - TuMV) относится к роду Potyvirus семейства Potyviridae, которое входит в состав IV класса: вирусы, содержащие одноцепочечную (+)РНК (рибонуклеиновую кислоту). Potyvirus включает в себя 179 видов, поражающих широкий круг растений-хозяев. Среди них такие экономически вредоносные патогены растений как вирус мозаики свеклы {Beet mosaic virus - BMV), вирус шарки сливы {Plum pox virus - PPV), картофельные вирусы A, V, Y {Potato virus A, V, Y- PVA, PVV, PYV) и вирус гравировки табака {Tobacco etch virus — TEV). Вирус мозаики турнепса (ICTV decimal code 57.0.1.0.072) поражает 318 видов, включая все возделываемые виды капустных, декоративные, дикорастущие и сорные виды из 156 родов 43 семейств растений (Crop Protection Compendium, Edition, (с) CAB International, Wallingford, UK, 2005).

Впервые TuMV был описан в США в 1921 году на Brassica rapa (Garden, M.W., Kendrick, J.B., 1921; Schultz, E.S., 1921), а в 1935 - в Великобритании на Brassica oleracea (Smith, K.M., 1935). Симптомы, вызываемые вирусом, были описаны во Франции в 1862 году на Matthiola incana (Tompkins, С.М., 1939).

В настоящий момент это единственный представитель рода Potyvirus, поражающий растения семейства Brassicaceae (Lesmann, D., Vetten, H.J., 1985; Walsh, J.A., Jenner, C.E., 2002; Qian, W. et al., 2013). Синонимами являются следующие названия: вирус мозаики анемона - Anemone mosaic virus, вирус А капусты - Cabbage virus A (Walker, J.C. et al., 1926; Yoshii, H., 1963), черный кольцевой вирус - Cabbage black ring virus (Tompkins, В. et al., 1939), вирус черной кольцевой пятнистости - Cabbage black ringspot virus (Smith, K.M.,

1935), вирус черного кольцевого некроза - Lettuce ring necrosis virus (Larson, R.H., Walker, J.C., 1938; 1941), вирус мозаики дайкона - Daikon mosaic virus (Yoshii, H., 1963), вирус мозаики хрена - Horseradish mosaic virus (Pound, G.S., 1948; Yoshii, H., 1963), вирус П редиса - Radish P virus (Tochihara, H., 1959; Yoshii, H., 1963).

Род Potyvirus возник от вируса однодольных растений примерно 7250 лет назад в Юго-Западной Евразии и Северной Африке (Gibbs, A.J., Ohshima, К., 2010; Gibbs, A.J. et al., 2008). Первого представителя потивирусов связывают с BCMV {Bean common mosaic virus) и PVY. Эти две группы наглядно иллюстрируют родовые фенотипические отличия, которые могли появиться у родственных вирусов в результате различных эволюционных путей после происхождения от общего предка. Самый последний общий предок BCMV и PVY существовал примерно 6770 лет назад, вероятно, в том же сельскохозяйственном регионе, что и прародитель Potyvirus. Примерно 2900 лет назад два потомка TuMV, один в настоящее время в Юго-Восточной Азии и другой в Северной Америке, разошлись, чтобы дать начало вирусным популяциям, которые адаптировались самостоятельно к отдельным комплексам растений, доступных для них в этих двух регионах (Gibbs, A.J., Ohshima, К., 2010).

Совсем недавно была обнаружена TuMV-подобная сестринская линия (TuMV-OM), выделенная из европейских орхидей (Gibbs, A.J. et al., 2000). TuMV и TuMV-OM разошлись около 1000 лет назад. Лишь 150 лет спустя четыре основные группы мировой популяции TuMV (базальная-В, базальная-BR, азиатская-BR и мировая-В) разошлись между собой. Эти данные совпадают с историческими записями распространения сельского хозяйства в Западной Европе. Примерно 1200 лет назад после потепления климата области заселения людьми и сельского хозяйства значительно расширились. Сельское хозяйство заменяло леса, что способствовало распространению вирусов с помощью тлей, которые могли поражать культурные и сорные виды

растений Brassicaceae. Позже межконтинентальная морская торговля, вероятно, позволила TuMV распространиться на остальные части мира (Nguyen, H.D., Tomitaka, Y., 2013).

Адаптация вируса к новым хозяевам - это пример общего эволюционного явления вторжения и адаптации к новой нише. Предполагаемая частота мутаций Potyvirus составляет около 1,15x10"4 нуклеотидных замен / сайт / год. РНК-вирусы имеют самые высокие показатели мутаций в связи с отсутствием корректирующей функции, связанной с РНК-зависимой РНК-полимеразой, и чрезвычайно высокой генетической изменчивостью поколений в популяциях вируса. РНК популяции вируса, как правило, состоит из набора последовательностей (Ohshima, К., Akaishi, S., et al., 2010). Генетические данные, имеющиеся в настоящее время по TuMV, убедительно показывают происхождение вируса в районе возникновения крестоцветных видов (Центральная и Южная Европа) и недавнее появление более агрессивных биотипов в Восточной Азии (Nguyen, H.D., Tomitaka, Y., 2013).

1.1.2 Морфология частиц и организация генома

Вирион вируса мозаики турнепса представляет собой капсулу вируса и одноцепочечную плюс-цепь РНК. Капсула вируса волокнистая, извилистая, длиной 700-750 нм и шириной 15-20 нм. Вирусная частица состоит из белка оболочки (95 %) и РЖ (Walsh, J.A., Jenner, С.Е., 2002). В геноме TuMV содержится около 9800 п.н. (Nicolas, О., Laliberte, J.-F., 1992;. Ohshima, К. et al., 1996). Из-за принадлежности к такой важной группе вирусов, как Potyvirus, и способности поражать ряд модельных растений TuMV стал объектом интенсивного молекулярно-биологического изучения (Revers, F. et al., 1999; Jenner, C.E. et al., 2000; Walsh J.A., Jenner, C.E., 2002).

TuMV погибает при температуре 62 °С, а его продолжительность жизни in vitro составляет 3-4 дня в зависимости от вида растения-хозяина. В зимний период TuMV сохраняется в растительных остатках, корневищах многолетних растений (хрен) и в озимых культурах (рапс, сурепица).

Геном TuMV имеет одну открытую рамку считывания, фланкированную 5' и 3' терминальными нетранслируемыми районами длиной 130 и 210 п.н. соответственно. Открытая рамка считывания транслируется в один большой полипротеин (рисунок 1), который гидролизуется тремя вирусными протеазами на десять белков: Р1, НС-Pro (helper component protease), РЗ, 6К1, CI (cytoplasmic/cylindrical inclusion protein), 6K2, двудоменный белок NIa (nuclear inclusion а), состоящий из терминального белка VPg (viral protein genome linked) и протеазы NIa-Pro, белок Nib (nuclear inclusion protein b) и CP (coat protein) (Urcuqui-Inchima, S. et al., 2001; Lu, Y.W., et al., 2008).

Рисунок 1 - Схематическое изображение структуры генома TuMV (Jenner, С.Е., Walsh, J.A. et al., 2000). Обозначения: UTR - 5' и 3' нетранслируемые районы; PI, НС-Pro, РЗ, 6K1, CI, 6K2, VPg, NIa-Pro, Nib и CP - гены, кодирующие одноименные белки.

PI является аминотерминальным геном, кодирующим трипсин (сериновую протеазу). Белок Р1 не участвует в процессе вирусного заражения, но стимулирует амплификацию генома и вместе с НС-Pro действует как усилитель патогенности, подавляя сайленсинг генов (Urcuqui-Inchima, S. et al., 2001).

НС-Pro участвует во многих процессах инфекционного цикла вируса (Maia, I.G. et al., 1996). С-конец - это папаин-подобная протеаза, которая катализирует автопротеолитическое расщепление полипротеина и играет важную роль в транспорте вируса от клетки к клетке (Urcuqui-Inchima, S. et

al., 1999, 2000; Carrington, J.C. et al., 1989;. Vargason, J., 2003). Центральный район белка отвечает за транспорт вируса по растению и за его репликацию (Cronin, S. et al., 1995). N-конец, содержащий цистеин-богатый район и связанный металлической связью с цинком, участвует в передаче вируса тлями, тяжести симптомов, амплификации генома, системной инфекции и аккумуляции вируса (Atreya, C.D., Atreya, P.L. et al., 1992; Atreya, C.D. et al., 1993; Canto, T. et al., 1995; Yap, Y.K. et al., 2009). НС-Pro является супрессором в пост-транскрипционном сайленсинге генов и препятствует функционированию микроРНК (Kasschau, K.D. et al., 1997; Shiboleth, Y.M. et al., 2007). Штаммы с мутацией гена НС-Pro способны заражать