Усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор

Зонтиков, Дмитрий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор"

□03480357

На правах рукописи

ЗиНтИКиВ Дмитрий Николаевич

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР

Специальности: 06.01.05 - селекция и семеноводство 03.00.23 - биотехнология

2 2 ОПТ 2™9

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных на\тс

Мпсктча - 2009

003480357

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россель-хозакадемии в 2006-2009 гг.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Поляков Алексей Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник

Старцев Виктор Иванович

внииссок

доктор биологических наук, профессор

Калашникова Елена Анатольевна

РГАУ-МСХА км. К.А. Тимирязева

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится «5» ноября 2009 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 006.022.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте овощеводства Россельхозакадемии по адресу: 140153 Московская обл., Рамскскии район, д. Верея, строение 500,

вниио.

Факс (49646) 2-43-64

E-mail: vniio@yandcx.ru. www.vniio.com

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института овощеводства.

Автореферат разослан - « 3» октября 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета

JI.H. Прянишникова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Капуста белокочанная является пере-кр'ёстноопыляемым растением, имеющим двухлетний цикл развития. В связи с этим селекционный процесс этой культуры является длительным, трудоемким и преимущественно основан на внутривидовой гибридизации с последующим многократным отбором, использовании инфекционно-провокационных фонов для оценки материала на устойчивость к стрессовым факторам среды (Поляков A.B., 2004).

В настоящее время актуальным стало использование технологий, сортов и гибридов, приводящих к получению высокой выравненное™, товарности, урожайности (Литвинов С.С., 2003).

Известно, что применение гаплоидов позволяет ускорить получение генетически стабильных линий, облегчить поиск редких признаков, контролируемых рецессивными генами, и существенно повысить эффективность селекционного процесса (Поляков A.B., 2000).

В настоящее время гаплоиды можно получать различными способами, однако искусственным путем с использованием методов культуры изолированных тканей удается получать большее их количество. На сегодняшний день разработаны и наиболее часто применяются следующие способы получения гаплоидов с использованием методов in vitro:

- культура изолированных пыльников и микроспор;

- культура семяпочек;

- метод гаплоиндуктора, при котором из-за несовместимости родителей происходит элиминация отцовских хромосом. Однако метод гаплоиндуктора и культура семяпочек трудоёмки, а в культуре пыльников часто происходит развитие диплоидов из соматических тканей. Наиболее эффективным и технологичным является использование метода культуры микроспор, но в данном направлении остаётся ещё много нерешённых технолгических и биологических вопросов. Особенно это актуально для капусты белокочанной.

Целью настоящей работы являлось усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор для использования их в селекционном процессе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• установить эффективность использования наночастиц серебра для снижения бактериальной и грибной инфекции у донорных растений;

• изучить влияние температуры на эмбриоидогенез капусты белокочанной в культуре микроспор;

• установить зависимость стадии развития микроспоры от длины бутона и эмбриоидогенеза от стадии развития микроспоры;

• выявить влияние плотности суспензии микроспор на эмбриоидогенез;

• определить влияние питательных сред и регуляторов роста на эм-бриоидо- и каллусогенез;

• изучить влияние сахарозы и аскорбиновой кислоты в питательной среде на эмбриоидогенез;

• определить влияние кислотности среды на эмбриоидогенез;

• установить влияние сочетаний концентраций регуляторов роста и сахарозы на рост и развитие эмбриоидов капусты белокочанной в культуре микроспор;

• получить растения-регенеранты;

• оценить растения - регенеранты капусты белокочанной, полученные в культуре микроспор, по цитологическим, биохимическим и морфологическим признакам.

Объект исследований — технология получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор.

Предмет исследований — бутоны, пыльники, микроспоры, эмбриоиды, растения - регенеранты капусты белокочанной.

Научная новизна работы. Впервые в России усовершенствованы технологические элементы культуры микроспор капусты белокочанной, позволяющие получать гаплоиды и удвоенные гаплоиды. Выявлены эффективные концентрации 6-бензиламинопуриа (БАП) -4 мг/л, а-нафтилуксусной кислоты (НУК) - 0,3 мг/л для индуцирования эмбриоидогенеза, показана эффективность температурной предобработки бутонов повышенной температурой в течение 1 суток, установлено высокая эффективность использования наноча-стиц серебра в концентрации 0,12 л/М для снижения бактериальной и грибной инфекции у донорных растений.

Практическая ценность. Установлено, что использование питательной среды Мурасиге - Скуга (Миш1^е Т., Skoog Р., 1962) (М8), содержащей БАП в концентрация 4 мг/л, НУК — 0,3 мг/л, аскорбиновую кислоту — 1 мг/л, сахарозу — 120 г/л, и режима температурной предобработки бутонов капусты белокочанной +32°С в течение 1 суток, индуцирует эмбриоидогенез микроспор с частотой 0,164±0,04% и позволяет получить гаплоиды и удвоенные гаплоиды.

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными уч-

реждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены и представлены на IV конференции РАЕН Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты (Москва, 2007); VIII и IX Молодежной научной конференции, посвященной памяти Г.С. Муромцева (Москва, 2008, 2009); на IX Международной научной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на Международной научно-практической конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова (Верея, 2009).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• применение наночастиц серебра в концентрации 0,12 .мМ в качестве стерилизующего агента для предобработки донорных растений капусты белокочанной позволяет снизить инфицлрованность эксплантов бактериальными и грибными инфекциями;

• лучшая стадия для получения гаплоидных растений является ранняя невакуолизированная микроспора; при введении в культуру, плотность суспензии микроспор составляет 50000 шт./мл в жидкой питательной срезе;

• культивирование микроспор на питательной среде MS, содержащей БАП в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, сахарозу-120 г/л, рН-5.6, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л, плант агар-5 г/л, при температуре +25°С и фотопериоде 16/8, позволяет получить эмбриоиды;

• культивирование эмбриоидов на питательной среде MS, содержащей БАП в концентрации 1 мг/л, НУК - 0,1 мг/л, сахарозу 30 - г/л, рН 5,6, плант агар 5 г/л, при температуре +25°С и фотопериоде 16/8 позволяет получить расте-ния-регенеранты;

• лиши, получение на основе удвоенных гаплоидов капусты белокочанной сорта Подарок и линии 33, характеризуются высокой выровненностью, повышенным содержанием витамина С и Сахаров.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы, содержащего 124 наименования, в том числе 67 иностран-

ных авторов. Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 таблицами, 18 рисунками.

2. УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ

ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИО), расположенном в Раменском районе, Московской области в период 2006 - 2009 гг.

В качестве исходного материала использованы сорт Подарок, полученный из ГНУ ВНИИССОК Россельхозакадемии, и линии 33, 34 селекции ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии.

Агротехника на опытном участке применялась согласно методике опытного дела в овощеводстве и бахчеводстве (Велик В.Ф., 1992).

Исследования в условиях in vitro проводили в соответствии с методическими указаниями по культуре ткани и органов в селекции растений (Бутенко Р. Г., Хромова Л. М., Седнина Г.А., 1984; Поляков A.B., 2005).

Изучение содержания сухого вещества, витамина С, Сахаров в растениях-регенерантах проводили по методике Скурихина И.М., Ту-тельянаВ.А., (¡998).

Цитологический анализ растений-регенерантов проводили по методике Пухальского В.А., Соловьёва A.A., Бадаева Е.Д. и др., (2004).

ПЦР-анализ проводили с помощью набора реагентов и протоколов «ООО Компания Биоком» (2004).

Математическую обработку экспериментальных данных проводили на основе методов математической статистики по методикам, опубликованным у Б.А. Доспехова (1979).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Влияние предобработки донорных растений капусты белокочанной наночастицами серебра

Важным этапом при введении в культуру in vitro является уменьшение иифицировапнссти донорных растений (Бунин М.С., 2004; Поляков A.B., 2005). Для ослабления действия бактериальной и грибной инфекции донорньге растения за 7 и 2 суток до изолирования

бутонов были дважды обработаны водным раствором наночастиц серебра, используемым в концентрации: 0,04, 0,08,0,12 и 0,16 .wM.

Установлено, что при обработке соцветий раствором наночастиц серебра в концентрации 0,04 л/М число бутонов, инфицированных бактериальной инфекцией уменьшилось на 12%, а грибной - на 14% у сорта Подарок, а у линии 33 - на 6% и 28% соответственно. В варианте использования наночастиц серебра в концентрации 0,08 .wM инфицированность бутонов снизилась на 21% и 24% соответственно. Лучшим был вариант использования наночастиц серебра в концентрации 0,12 мМ. При данной концентрации наночастиц число жизнеспособных эксплантов было выше, чем в других вариантах (23,2±0,7 у сорта Подарок и 31,7±2,2 у линии 33) (табл. 1).

Таким образом, применение наночастиц серебра в концентрации 0,12 .wM в качестве стерилизующего агента для предобработки донорных растений капусты белокочанной позволяет снизить инфицированность эксплантов в зависимости от сортообразца на 19 -39% бактериальными и на 25 - 31% грибными инфекциями.

3.2. Влияние температуры на эмбрмоидигенез

К числу наиболее важных факторов, способных вызвать индукцию эмбриоидогенеза у представителей рода Brassica, относится температурная обработка. Индуцируя симметричные деления в микроспорах, температурная обработка увеличивает и частоту образования эмбриоидов при их культивировании in vitro, в то время как действие других физических факторов, способных увеличить образование эмбриоидов, было малоэффективным (Ни Z.H., Sunderland N., 1982).

В наших опытах образование эмбриоидов наблюдалось на 20 сутки культивирования. Отмечено, что на 35 сутки культивирования, процесс образования эмбриоидов прекратился. Лучший результат был получен в варианте инкубирования микроспор в течение 1 суток при температуре 32°С. Среднее число эмбриоидов в этом варианте составляло 0,074 ± 0,001% или 32,6 ± 0,7 шт. на чашку Петри, что было достоверно выше, чем в контроле и других вариантах (табл. 2).

Таким образом, температурная предобработка (+32°С) в течение 1 суток, позволяет повысить интенсивность эмбриоидогенеза у сорта Подарок на 34%, линии 33 - 33%, линии 34 - 25%.

Таблица 1 — Влияние обработки донорных растений капусты белокочанной наночастипами серебра на

инфицированность эксплантов бактериалъной и грибной инфекцией

Сорт, линия Концентрация наночастиц серебра, лМ Получено эксплантов

стерильных нежизнеспособ пых стерильных жизнеспособных инфицированных

бактериями грибами

шт. %±8р шт. 9с-±5?р шт. %±Яр шт. %+5р

Подарок Контроль 6 10,3+1,0 9 15,5+1,4 28 48,2±2,7 15 25,8+1,4

0,04 7 12,9+0,7 10 19,2+1,0 23 42,5+1,0 12 22,2±0,9

0,08 12 23,1 ±0,9 11 20,5+0,4 20 38,4±0,9 10 19,2+0,9

0,12 15 29,4±1,3 12 23,2±0,7 15 29,4±1,8 10 19,6+0,7

0,16 23 44,2±3,8 8 15,3±0,7 12 23,0+1,0 9 17,3+1,0

33 Контроль 7 12±1,1 8 ! 3,7±1,3 26 44,8 ±2,5 17 29,3+2,0

0,04 5 10,6+1,0 12 25.5+1.2 20 42,5±3,2 10 21,2+2,0

0,08 7 15,5±1,2 13 23,8+1,6 19 42,2±3,1 6 13,3+0,9

0,12 8 19,5+0,9 13 31,7+2,2 15 36,5+2,5 5 12.1+0,6

0,16 15 40,5±2,3 6 16,2+1.2 11 29,7±2,1 5 13,5+0,8

Таблица 2 -Влияние температуры на эмбриоидогснсз капусты белокочанной в культуре _______микроспор (11=50000)______

Сорт, линия Те м ггератур н ы й. реж и м Обиаружено эмбриоидов

шт. %±вр

Подарок контроль, 25иС 23,1 ±0,5 0,043x0,001

1 сутки. 4°С 10,2+ 0,5 0,043+0,001

2 суток. 4"С 22,3+ 0,6 0,045x0,001

1 сутки, 32°С 31,0+0,7 0,074 ± 0,001

2 суток, 32°С 24,1 ±0.6 0,047±0,001

33 контроль, 25иС 24,0± 0,4 0,040±0,001

1 сутки, 4"С 19,8± 0.6 0,043±0,001

2 суток. 4°С 24,2+ 0,6 0,048+0,001

1 сутки, 32°С 32,6± 0,7 0,075 ± 0,001

2 суток, 32иС 26,2+ 0,6 0,049±0.001

34 контроль, 25°С 24,5+0,4 0,041+0,001

1 сутки, 4°С 20,2± 0,6 0,044±0,001

2 суток, 4°С 26,3+ 0,6 0,050+0,001

1 сутки, 32°С 30,6+ 0,7 0,064 ± 0,001

2 суток, 32°С 25,3+ 0,6 0,048±0,001

3.3. Определение зависимости стадии развития микроспоры от длины бутона

Андрогенез in vitro в значительной степени зависит от стадии развития микроспор в момент их введения в культуру in vitro. Поэтому крайне важно подобрать оптимальную стадию развития микроспоры к моменту изолирования бутона.

На основании анализа литературы (Круглова H.H., 2002) и наших наблюдений у капусты белокочанной было выделено 5 основных стадий развития микроспор: 1) тетрада, 2) невакуолизированная, 3) слабовакуолизированная, 4) сильновакуолизированная микроспора,

5) трехклеточная пыльца.

Развитие микропор внутри бутона было асинхронным. Только в бутонах самого меньшего и самого большего размера микроспоры находились на одной стадии развития. В бутонах длиной 2 мм содержались тетрады, а в бутонах более 8 мм - зрелая пыльца. В бутонах размером 3-8 мм одновременно присутствовали микроспоры, находящиеся на разных стадиях развития. В бутонах размером 3 мм присутствовали микроспоры I и 2 стадий развития, при этом 75% приходилось на 1 стадию. В бутонах размером 4 мм представлены микроспоры от 1 до 3 стадии и 57% m них приходилось на 2 стадию. В бутонах длинной 5 мм микроспоры находились на 2, 3, 4 стадиях, 75% приходилось на 2 стадию. При длине 6 мм, микроспоры находились на 3, 4, 5 стадиях, 45% находилось на 4 стадии. В бутонах длинной 7 мм микроспоры находились на 3, 4, 5 стадиях при этом на 4 стадии находилось уже 70%. В бутонах длиной 8 мм на 5 стадии было 76% микроспор, 34% на 4 стадии. В бутонах длиной 9 мм была зрелая пыльца (табл. 3).

3.4. Зависимость эмбриоидо! снеза от стадии развития микроспоры

Способность к морфогенегепезу напрямую зависит от стадии развития, на которой находится микроспора (Ермаков И.П., J 986). В связи с этим, важно определить на какой стадии развития следует производить их введение в х-ультуру.

Наибольшей способностью к эмбриоидогенезу среди всех изученных образцов характеризовались невакуолизированные микроспоры. Максимальный показатель эмбриоидогенеза при этом наблюдался у линии 33 и составил 0J14±0,007%, а каллусогенеза 0,010+0,002 (табл. 4).

Таблица 3 - Соотношение различных стадий развития микроспор капусты белокочанной сорта Подарок а зависимости от длинны бутона

Стадия развития микроспор Длинна батона, мм

2 3 4 5 6 7 8 о

1. Тетрада 98±0,5 75+0,4 33+0,6 0 0 0 0 0

2.Невакуолизированная микроспора 0 25±0,6 57±0,6 75+0,6 0 0 0 0

3. Слзбо-вакуолизи-рованная микроспора 0 0 10+0,4 20±0,4 35+0.6 3+0,8 0 0

4. Сильно-вакуолизи-ро ванная микроспора 0 0 0 5+0,8 45+0,7 70+0,6 24+0,4 0

5. Пыльца 0 0 0 0 20+0.6 27+0,6 76±0,5 99+1

Таблица 4 - Зависимость эмбриоидо- и каллусогенеза от __стадии развития микроспор _

Сорт, линия Стадия развития микроспор Число эмбриоидов Число каллусов

шт. %±Бр шт. %±8р

Подарок тетрады 19 0,0380+0,004 1 0,002+0,001

невакуолизированная 42 0,084±0,006 5 0,009±0,002

слабовакуолизиро-ванная 28 0,056+0,005 0 0

33 тетрады 17 0,034±0,001 1 0,002+0,001

невакуслизировянная 57 0д14±0,007 5 0,010+0,002

слабо вакуолширо-ванная 13 0,026+0,005 5 0,010+0,002

34 тетрады 45 0,090±0,002 0 0

невакуолизированная 56 0Д12±0,007 3 0,006±0,002

слабовакуопикированная 34 0,068+0,002 0 л с

3.5. Определение зависимости змбриоидогенеза от плотности суспензии микроспор

По литературным данным морфогенных микроспор в пыльниках различных представителей рода Brassica содержится от 0,05% до 0,12% (Pechan, P.M., 1988). Поэтому очень важно определить зависимость между числом закладываемых на питательную среду микроспор и интенсивностью змбриоидогенеза.

При изучении отмечено, что более интенсивный эмбриоидо- и кал-лусогенез наблюдался в варианте с плотностью микроспор 50000 шт./мл питательной среды. При использовании этого варианта, наибольшей способностью к эмбриоидогенезу характеризовалась линия 33 - 0,164+0,04 %, а наименьшей - сорт Подарок - 0.037±0,004% (табл. 5).

Таблица 5 - Влияние плотности суспензии микроспор на эмбриоидо- и каллусогенез в культуре микроспор капусты белокочанной__

Сорт, линия Плотность сусп. микроспор, шт/мл Обнаружено эмбриоидов Обнаружено каллусов

шт. %±Sp шт. %±Sp

Подарок 30000 40 0,133+0,05 з 0,016+0,002

50000 67 0,134 ±0,003 12 0,024±0,003

70000 47 0,067±0,001 - -

90000 34 0,037±0,004 9 0,010+0,003

33 30000 39 0.130±0,04 6 0,020±0,003

50000 82 0,164 ±0,04 14 0,028+0,003

70000 51 0,072+0,002 13 0,014±0,005

90000 54 0,060±0,003 - -

1 А 30000 43 0,136+0,003 6 0,020+0,003

50000 69 0,138±0,04 13 0.026+0,001

70000 50 0,071 ±0,003 - -

90000 56 0,062±0,005 4 0,004±0,0009

3.6. Влияние питательной среды на эмбриоидо- и каллусогенез

На индукцию андрогенного развития большее влияние оказывает используемая питательная среда (Домблидес Е.Л., 2002). В практике биотехнологических исследований применяется достаточно большое количество разнообразных вариантов питательных сред.

Для изучения влияния питательной среды на эмбриоидо- и каллусогенез микроспоры помещали на питательные среды: MS (Murashige Т., Skoog F., 1962), NLN (Nilsch J. Р., 1967). B5 (Gamborg O.L., 1984), наиболее успешно применяемые в культуре пыльников и микроспор у различных видов капусты (Домблидес H.A., 2002; Давыдова H.H., 2005).

При культивировании микроспор на этих средах, лучшие результаты были получены на среде N18. На этой среде в присутствии БАП в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л наблюдали наиболее активное образование эм-бриоидов. В этом варианте доля образовавшихся эмбриоидов составила у сорта Подарок - 0,164%; линии 33 - 0,126%: линии 34 - 0,130% (рис.1). При этом частота каллусогенеза составляла у сорта Подарок - 0,028%; линии 33 -0,024%; линии 34 - 0,026% (рис. 2).

0,2- (Г

Образовалось 0,15- L

эмбриоидов, % от :

общего числа 0,1

культивируем ых j; |

микроспор 0,05- ;

0- ; L i.

а пиния 33 а линия 34

Рисунок 1 - Влияние питательных срсд на эмбриоидогенез микроспор капусты белокочанной (п~ 50000)

Образовалось каллусов, % от общего числа культивируемых микроспор

13 Подарок ■ линия 33 Плиния 34

Рисунок 2 - Влияние питательных сред на каллусогенез микроспор капусты белокочанной(п~50000)

3.7. Влияние регуляторов роста на эмбриоидогенез

Индукция спорофитного пути развития микроспор или клеток пыльцевого зерна, приводящего к развитию эмбриоидов или каллусов, а далее растений-регенерантов, зависит от многих взаимосвязанных факторов, один из важнейших - введение в состав питательной среды регуляторов роста (Круглова H.H.. 2003).

На основании анализа литературных данных (Грибова Т.Н., 2006; Kuginuki Y., 1997) и опыта работы отдела биотехнологии ГНУ ВНИИО (Давыдова Н.Н., 2005) была разработана схема и проведены исследования тринадцати вариантов сочетания регуляторов роста (табл. 6).

Отмечено, что э.мбриоидогенез активно проходил на питательной среде, содержащей БАП в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, доля образовавшихся эмбриоидов составила у сорта Подарок - 0,152%; линии 33 -0,168%; линии 34 - 0,174%. При этом каллусогенез походил активнее на средах, содержащих регуляторы роста - БАП в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л. Доля образовавшихся каллусов составила у сорта Подарок - 0,024%, линии 33 - 0,034%, линии 34 - 0,032%.

3.8. Влияние сахарозы на эмбриоидогенез

Большое влияние на морфогенез оказывают не только регуляторы роста и состав питательной среды, но и концентрация сахарозы, как источника углеводного питания и поддержания осмотического давления (Бутенко Р.Г., 1964).

На питательных средах с содержанием сахарозы 30 г/л доля образовавшихся эмбриоидов, у сорта Подарок составляла 0,033%; линий 33 -0,030%; 34 - 0,036%; доля полученных каллусов, у сорта Подарок - 0,011%; линии 33 - 0,0147^; 34 - 0,014%. Отмечено, что с увеличением концентрации сахарозы, увеличивалось количество получаемых эмбриоидов, положительный эффект наблюдали на питательной среде, содержащей сахарозу в концентрации 120 г/л. В этом варианте доля эмбриогенных микроспор у сорта Подарок составляла 0,134%; линия 33 - 0,164%; линия 34 - 0,138% (табл. 7).

3.9. Влияния кислотности среды на эмбриоидогенез

Одним из важных факторов, влияющих на успех работы с культурой пыльников, является рН питательной среды. Оптимальное значение рН для большинства растительных тканей лежит в пределах от 5,0-5,5 (Бутенко Р.Г., 1964). Часто, ткани и органы растений культивируют на питательных средах с кислотностью 5,6-5,8 (Поляков А.В., 2005).

По результатам опыта установлена чёткая зависимость по количеству получаемых эмбриоидов от кислотности питательной среды. Гак, в лучшем варианте опыта при рН 5,6, количество образовавшихся эмбриоидов у сорта Подарок составило - 83 шт. на чашку Петри, линий 33 и 34 - 64 и 65 шт. соответственно. Эмбриоиды, полученные на питательной среде с кислотностью 5,4 - останавливались в развитии на стадии глобулы, а при рН 5,0; 5,2; 6,0 - не образовывались (табл. 8).

Кшщешрация регул,* оров роста, мг/л Сорт Подарок Линия 33 Линия 34

обнаружено эмбриоидов обнаружено каллусоя обнаружено эмбриоидов обнаружено кгллусов обнаружено эмбрио-идоз обнаружено каллусов

шт. %±Бр цгт. %±5р шт %±5р шт. %±вр шт. <$±5р шт.

БАИ 1 + КИП 1 2 0,004±0,001 1 0.002±0,001 0 0 1 0,002±0,001 3 0,С06±0,001 0 0

БАИ 2 +КИИ 2 0 0 1 0,002+0,001 4 0,008±0,002 1 0,002+0.00] 0 0 0 0

БАП 3 + КИН 2 (контрол >) 4 0,003±0,002 1 0,002±0,001 0 0 0 0 2 0,ТО4±0,001 1 0,02+0,01

БАП 3 + КИН 3 0 0 "> 0,0D4i0.au 1) 0 0 0 0 0 1 0,0210,01

БАП 4 + КИН3 0,00б±0,002 0 0 0 0 0 (1 0 1 0,02±0,01

БАП 4+ КИН 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 I) 0

БАП 5 + КИН 5 0 0 1) 0 0 0 11 0 0 0 о 0

БАП1+НУК 0,1 (контрол,) 3 0.006±0,003 1) 0 0,004+0,001 1 0,002±0,001 1 0,002+0,001 1 0,02±0,01

БАП 1+1-УК 0,2 0,008±0,004 ■1 0.008±0,00:< 2 0,004±0,001 0 0 3 0,Ю6±0,001 5 0,01 ±0,01

БАП 2+КУК0.2 7 0,014±0,005 7 0,014+0,005 1 0,002+0,001 3 0,СЮ6±0,002 0 0 5 0,01±0,01

БАП 3+1- УК0.3 18 0,03б±0,012 11 0,022±0,006 16 0,032+0,006 <) 0,018+0,004 18 0,036±0,09 9 0,018±0,05

БАП4+ПУК03 76 0,152±0,089 12 0,024*0,010 84 0,168±0,012 17 0,034±0,007 87 0,174±0,09 16 0.032±0,01

БАП 4+Ь УК 0,4 3 0,006±0,001 10 0,020±0,006 4 0,008+0,002 13 0,030±0,004 7 0,014±0,03 19 0,038±0,01

Таблица 7 - Морфогенез в культуре микроспор капусты белокочанной в _____зависимости от концентрации сахарозы__

Сорт, линия Концентрация сахарозы, г/л Обнаружено каллусов Обнаружено эмбриоидов

шт. %±sp I1IT. %±Sp

Подарок ЗО(контроль) 40 0,033±(),05 5 0,011 ±0,002

60 34 0,037±0,004 12 0,024+0,003

90 47 0,067+0,001 - -

120(контроль) 67 0,134+0,003 9 0,010+0,003

140(контроль) 35 0,070 2 0,004±0,002

33 ЗО(контроль) 39 0,030±0,04 6 0,014±0,003

60 54 0,060±0,003 14 0.028±0,003

90 51 0,072+0,002 - -

120( контроль) 82 0,1б4±0,040 13 0.014±0,005

МО(контроль) 44 0,067±0,001 4 0,010±0,002

34 ЗО(контроль) 42 0.036+0,003 6 0,014+0,003

60 56 0,062+0,005 - -

90 50 0.071+0,003 4 0,004+0,0009

120(контроль) 69 0,138+0,040 13 0,026+0,001

140( контроль) 31 0,035±0,004 2 0,004±0,002

ЗЛО. Влияние аскорбиновой кислоты на эмбрноидогенез

В процессе культивирования на питательной среде, стадию глобулы проходит большое количество микроспор, однако единицы претерпевают дальнейшее развитие. Из литературных источников и собственных наблюдений, известно негативное влияние фенолов, образующихся при культивировании. Для снижения этого негативного воздействия была использована аскорбиновая кислота, которая обладает антиоксидантным действием (Guo J.D., 2000; Высоцкий В.А., 2004).

Микроспоры культивировали па среде с различным (0,5, 1,0, 1,5. и 2,0 мг/л) содержанием аскорбиновой кислоты. Исследования показали, что лучшие результаты были получены на среде, содержащей 1,0 мг/л аскорбиновой кислоты. Среднее число образовавшихся эмбриоидов в этом варианте составляло 0,07±0,001 или 54,3 + 0,8 шт. на чашку Петри, что в среднем было на 26% больше по сравнению с контролем.

Таблица 8 -Эмбриоидогеиез в культуре микроспор капуста белокочанной в зависимости от кислотности питательной среды (п~50000)_

Сорт, линия РН Обнаружено эмбриоидов Обнаружено каллусов

шт. %±Sp шт. %+Sp

5,0 0 0 0 0

5,2 0 0 0 0

Пг. 5.4 1 0,002±0.002 3 0,006±0,002

5,6 83 0,164±0,<)04 14 0,028±0,003

5,8 (контроль) 11 0,022±0,0003 2 0,004+0,002

6,0 0 0 0 0

5,0 0 0 0 0

5,2 0 0 0 0

33 5,4 9 0,018+0,002 4 0,009±0,0020

5,6 64 0,126±0,003 12 0,024+0,003

5,8 (контроль) 5 0,010+0,0020 0 0

_ 6,0 0 0 0 0

5,0 0 Ü 0 0

5.2 0 0 0 о

34 5.4 7 0,014+0,002 1 0,004 ±0,002

5,6 65 0,130+0,004 13 0.026+0,001

5,8 (контроль) /\ i\r\ г . [\ лт U.uuoxu.uuz 1 0,002=0,002

6,0 0 0 0 0

3.11. Влияния регуляторов роста н сахарозы на рост и развитие эмбриондов

В результате проведённых опытов, нами были получены эмбриои-ды, однако часть пз них погибала на стадии глобулы, а остальные замедлились в росте. Из этого был сделан вывод, что среда оптимальная для индукции эмбриоидов, не удовлетворяет их потребностям для дальнейшего роста и морфогенеза. Следовательно, эмбриоиды, находящиеся на стадии глобулы, необходимо переносить на новую питательную среду для инициации их последующего органогенеза. С этой целью была разработаны схема, включающая следующие варианты:

1) безгормональная питательная среда, сахароза - 30 г/л.

2) БАП - } мг/л, НУК - 0,1 мг/л; сахароза - 30 г/л.

3) БАП - i мг/л, НУК - 0,1 мг/л; сахароза - 60 г/л;

4) БАИ - 1 мг/л, НУК - 0,] мг/л сахароза - 120 г/л;

5) БАП - 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л сахароза - 30 г/л;

6) БАЛ - 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л; сахароза - 60 г/л;

7) БАП - 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л: сахароза - 120 г/л. Исследования показали, что наименее эффективными оказались среды 3, 4, 5, 6, на которых не было обнаружено роста эмбриоидов и образование каллуса. Вариант среды 2, содержащий регуляторы роста БАП в концентрации 1 мг/л, НУК - 0,1 мг/л и сахарозу - 30 г/л, оказался лучшим (рис. 3). Культивировании эмбриоидов на этой среде позволяет получать около 25%

Варианты питательной среды В Подарок В Линия 33 □ Линия 34 [

Рисунок 3 - Морфогенез эмбриоидов капусты белокочанной, полученных в культуре микроспор в зависимости от регуляторов роста и сахарозы

4. АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ

4.1. Оценка растений-регенерантов капусты белокочанной поколения но количеству хромосом

Прямым доказательством гаплоидной природы полученных растс-ний-регенерантов является уменьшенное в два раза количество хромосом в ядрах их клеток. Это можно установить при сравнительном цитологическом анализе растений капусты белокочанной поколения полученных в культуре микроспор, с их исходными диплоидными формами.

Подсчёт хромосом проведён у 2 растений-регенерантов сорта Подарок, 4 растений-регенерантов линии 33 и 3 растений-регенерантов линии 34 (табл.9).

Установлено, что гаплоидами (п=9). являлись четыре растения-регенеранта. В ядрах этих растений идентифицировано редуцированное в два раза число хромосом по сравнению с контрольными (диплоидными) растениями (рис. 4).

Таблица 9 ■ Характеристика растений-регенерантов капусты белокочанной, полученных в культуре микроспор по количеству хромосом

Сорт, пиния ---*-¿-I Вариант ЛЬ растения Число хромосом, шт.

Подарок контроль 1 18

рэсгения-регенеранты Ш1 9

Я13 18

Лилия 33 контроль 1 18

растения регенераты К7 9

К9 9

К12 18

Я18 18

Линия 34 контроль ] 18

растения-регенеранты К22 9

ИЗО 18

КЗЗ 18

Рисунок 4 - Хромосомы капусты белокочанной: А - диплоидный набор хромосом (2п=18), Б - гаплоидный набор хромосом (п=9)

4.2. Оценка растенйй-регенерактов капусты белокочанной поколения по количеству устьиц и числу хлоропластов в них

Известно, что количество устьиц и хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у гаплоидного растения примерно в два раза меньше, чем у диплоидного (<3т X., Рошю С.Ь., 1995).

Анализ показал, что у сорта Подарок из 3 растений-регенерантов два (II 11 и II 13) имели меньшее количество устьиц (8-9) и хлоропластов (5-6) в замыкающих клетках устьиц по сравнению с контролем и один образец (К 31) 16-20 устьиц и 21 - 23 хлоропластов, как и исходный образец. Из четы-

рёх растений-регенерантов, полученных от линии 33. три 7, К 9, К 12) имели 5 - 9 устьиц и 6 -7 хлоропластов. В образцах, полученных от линии 34, из трёх растений одно (Я 22) имело 6 - 10 устьиц и 8 - 12 хлоропластов, у двух других - количество устьиц было от 17 до 23 (табл. 10).

Таблица 10 - Характеристика растений-регенерантов капусты белокочанной полученных в культуре микроспор по количеству устьиц и хлоропластов

Сорт, Вариант № раст. Количество Количество

линия устьиц, шт. хлоропластов, шт.

контроль 1 12±3 18+2

2 14±4 17±2

Пдарок растения-регенераты Р. 11 9+2 6±2

К 13 8±2 6+2

R31 18+4 23+4

контроль 1 11+3 19+5

14±4 18+4

Линия R7 5+2 7+2

33 растения - R9 9+3 6+2

регенераты К 12 6±3 5±3

К 1S 18+2 22+1

контроль ] 13±4 --- 17+2 ^

Линия 2 15±5 18+2

растения-регенеранты R 22 8±2 10+2

R 30 23+2 23+2

R 53 17±3 19+5

Таким образом, анализ растений-регенерантов по числу устьиц и хлоропластов в замыкающих клетках устьиц подтвердил гаплоидную природу растений-регенерантов (сорт Подарок RI 1, R13; линия 33 R7, R9, R12; линия 34 R22), что свидетельствует о возможности проведения косвенной оценки и идентификации гаплоидов. Кроме того, были выявлены — расте-ния-регенеранты сорта Подарок R31, линия 33 R18, линия 34 R30 и R33 с повышенным числом хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (рис,4),

А Б В

Рисунок 4 - Хлоропласта в замыкающих клетках устьиц: А- гаплоидное растение (7 хлоропластов): Б- диплоидное растение (17 хлоропластов - контроль); В-растение с большим числом хлоропластов (22 хлоропласта)

4.3. Оценка раетений-регенерантов методом ПЦР

Проведённый RAPD-анализ раетений-регенерантов капусты белокочанной сорта Подарок, полученных в культуре микроспор показал снижение гетерогенности в спектрах ДНК по сравнению с исходным образцом. Так, ДНК-профиль исходного образца состоял из 9 фрагментов длиной от 180 до 550 пар нуклеотидов (дор. 1; 12). Регенеранты, полученные на основе прямо го эмбриоидогенеза R 1, R 2, R 3 (дор. 2, 3, 4), отличались от исходного образца тем, что в своём составе имели только 3 или 4 фрагмента (длиной 280, 290, 320. 450 пл., дор. 2, 3, 4). Растенш-регенеранты R 4, R 15, R 17, R 20, полученные из морфогенного каллуса в культуре микроспор и размноженные in vitra имели 5-6 фрагментов длиной 180, 280, 290, 320, 450, 550 пл. В спектрах расгений-регенерантов R 11, R 13. R31 (дор. 9, 10) зафиксировано по 5 одинаковых фрагментов (180, 290, 320, 450, 550 п.н.) аналогичных R 4, R 15, R 17, а у регенеранта R31 - семь фрагментов (170, 180, 280. 290, 320, 450. 550). Эти различия между растениями-регенерантами и исходным образцом свидетельствуют о возможности создания форм, различающихся по ряду признаков и отличающихся от исходных образцов (рис. 5).

Рисунок 5 - Электрофореграмма ПЦР-фрагментов, амплифицированных с праймером PawSS на геномной ДНК капусты белокочанной сорта Подарок: М - маркер молекулярной массы Gene Ruler 1 кЬ DNA Ladder (Fermentas, Латвия); 1- исходный образец (контроль); 2-4 - растенш-регенеранты (R 1, R 2, R 3), полученные в культуре микроспор из эмбриоидов; 5-8 - растсния-регенеранты (R 4. R 15, R 17, R 20), полученные в культуре микроспор из морфогенного каллуса и размноженные с помощью клонаяыюлз размножения; 9-31- взрослыс растения (R JI, R i 3, R31) из теплицы, полученные на основе раетений-регенерантов, 12 - исходный образец (контроль); 13 - отрииательный контроль для PawS5

4.5. Биохимический анализ раетений-регенерантов капусты белокочанной, полученных в культуре микроспор

Для проведения биохимических исследований в фазу начала образования кочана были отобраны образцы тканей четырёх удвоенных гаплоидов, полученных при клональном размножении растения-регенеранта R11

сорта Подарок. Химический анализ, их по содержанию сухого вещества, витамина С и Сахаров позволил выделить образец под номером КЛ 1-1, который в течение двух лет превышал контроль (исходный образец) по содержанию сухого вещества, витамина С, глюкозы и дисахаров на 26,9%, 46,7%, 16,5% и 31,7% соответственно (табл. 11).

Таблица 11- Содержание сухого вещества, витамина С и Сахаров в растени-ях-регенерантах сорта Подарок (2008 - 2009 гг.)

Вариант Номер растения Сухое вещество, % от сырой массы Витамин С, мг Сахара, мг

глюкоза дисахара

контроль 1 5,39 24,0 1,64 0,82

семенное поколение R11-1 6,84 35,2 1,91 1,08

R11-2 5,48 32,3 1,77 1,12

R11-3 5,61 36,9 1,78 0.94

4.6 Характеристика удвоенных гаплоидов по морфологическим признакам

В литературных источниках крайне мало данных об изменении морфологических признаков удвоенных гаплоидов по сравнению с исходными образцами. В некоторых исследованиях говорится, что удвоенные гаплоиды не уступают, а иногда и превосходят исходные формы по хозяйственно ценным признакам (Поляков A.B., 2000).

Морфологический анализ растений-регенерантов, полученных из сорта Подарок и линий 33, 34, показал, что по размаху варьирован™ ряда важнейших признаков семенное поколение удвоенных гаплоидов, полученное в результате самоопыления, характеризовалось большей выравненностью по сравнению с исходными образцами (табл. 12).

Таблица 12 - Размах варьирования морфологических признаков у удвоенных _гаплоидов К)_

Сорт, линия Высота растения, см II Диаметр кочана Я Длинна кочерыги, см И Черешок, длинна, см Я

Подарок

контроль Ю1 Я13 45±7 47+4 44+5 14 8 10 32±5 30+4 29+4 10 8 8 13±6 14±4 10±2 11 8 4 8±5 9±2 7±4 10 4 8

Линия 33

контроль Ю Я9 43±5 39+3 40±5 10 6 10 29±4 27±4 25±3 8 8 6 11±6 13±4 12±5 12 я 10 8±4 8+3 6±3 8 6 6

Линия 34

контроль Я22 ЯЗО ЯЗЗ 44+4 46+3 45+2 40+3 8 6 4 6 26±4 27±3 24+4 26±3 8 6 8 6 13±5 12±4 14±4 13±2 10 8 8 4 7±5 9±2 8±3 8+3 10 4 6 6

ВЫВОДЫ

1. Оптимизированы условия, влияющие на снижение инфицированно-сти и морфогенетическую активность микроспор капусты белокочанной. Установлено, что:

• применение наночастиц серебра в качестве стерилизующего агента для предобработки донорных растений капусты белокочанной в концентрации 0,12 л/М позволяет снизить инфицированность эксплантов от бактерий на 19-39% и от грибов на 25-31% соответственно;

• проведение температурной предобработки (+32°С, в течение 1 суток) позволяет повысить интенсивность эм-бриоидогенеза у сорта Подарок на 34%, линии 33 на 33%, линии 34 на 25%.

2. Морфогенетическая активность микроспор капусты белокочанной зависит от стадии развития бутона, плотности суспензии культивируемых микроспор, вида питательной среды, концентрации регуляторов роста и сахарозы, кислотности среды и наличия в питательной среде аскорбиновой кислоты. Установлено, что:

• оптимальная длинна бутона, при которой микроспоры преимущественно находятся на невакуолизированной ста-

дии развития, для сорта Подарок и линий 33, 34 составляет ~ от 3 до 4 мм;

• плотность суспензии микроспор следует доводить до 50000 шт. в 1 мл питательной среды, что позволяет получить частоту эмбриоидогенеза на уровне 0,134-0,164%;

• для повышения эмбриоидогенеза культивирование микроспор капусты белокочанной следует проводить на питательной среде М8, обогащенной БАП в концентрации 4 мг/л и НУК - 0,3 мг/л, позволяющей получить 0,1520,174%' эмбрисидов;

• оптимальная концентрация сахарозы, составляющая 120 г/л, позволяет получить па 37% эмбриоидов больше чем в контрольном варианте с использованием 140 г/л;

• культивирование микроспор капусты белокочанной на питательной среде с кислотностью 5,6 позволяет получать более 80 эмбриоидов на чашку Петри, что соответствует частоте эмбриоидогенеза 0,126-0,164%;

• использование аскорбиновой кислоты в концентрации 1,0 мг/л позволяет повышать интенсивность эмбриоидогенеза на 26%.

3. Культивирование эмбриоидов на питательной среде М5>, содержащей БАП в концентрации 1 мг/л, НУК - 0,1 мг/л и сахарозу - 30 г/л и имеющая рН 5,6, позволяет получать около 25% растений-регенерантов от числа культивируемых эмбриоидов. При использовании этой среды было получено 27 растений-регенерантов, из них -12 растений сорта Подарок, 11 растений линии 33 и 4 растения линии 34.

4. ЯАРО-аналнз растений-регенерантов капусты белокочанной сорта Подарок, полученных в культуре микроспор, показал значительное снижение гетерогенности в спектрах их ДНК в сравнении с исходным образцом. Проведенный цитологический анализ (подсчёт устьиц, числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и хромосом) подтвердил их гаплоидную природу.

5. Среди растений-регенерантов, полученных из микроспор сорта Подарок, был выделен образец, превышающий контроль (исходный сорт) по содержанию сухого вещества, витамина С, глюкозы и диса-харов на 26,9%, 46,7%, 16,5% и 31,7% соответственно.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ

ПРАКТИКЕ

На основании полученных нами данных предложена усовершенствованная схема получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор капусты белокочанной предусматривающая:

- двукратную обработку донорных растений водным раствором наноча-стиц серебра за 7 и 2 суток до изоляции бутонов;

- стерилизацию бутонов капусты белокочанной в течение 1 минуты в 70% растворе этанола, 10 минут в 1% растворе гипохлорита кальция, трёхкратную промывку стерильной водой в течение 5 минут;

- предобработку бутонов температурой +32"С, в течение 1 суток;

- механическое выделение микроспор в жидкой питательной среде MS, содержащей БАП в концентрации 4 мг/л, НУ К - 0,3 мг/л, сахарозу - 120

г/т, «ц «: А.

1 íví, píl

- культивирование микроспор на питательной среде MS содержащей БАП в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, сахарозу - 120 г/л, pH 5,6, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л; плант агар - 5 г/л, при температуре +25°С и фотопериоде 16/8 до образования эмбриоидов;

- пересадку образовавшихся эмбриоидов на среду MS, содержащую БАП в концентрации 1 мг/л, НУК - 0,1 мг/л, сахарозу - 30 г/л, pH 5,6, плант агар - 5 г/л, культивирование при температуре +25°С и фотопериоде 16/8 до получение хорошо развитых рйстенйи-регекер^ктов^

контроль плоидности: подсчёт хромосом, устьиц и хлоропластов в них, ПЦР-анализ;

- пересадку растений-регенерантов в почву в возрасте 60 суток, яровизацию, самоопыление, получение семян.

При использовании этой технологии, выход эмбриоидов составляет

0.164., а выход растений-регенерантов 0,024%).

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Зонтиков Д.Н. Культура микроспор: состояние и перспективы //A.B. Поляков, Д.Н. Зонтиков, Р.В Сергеев //Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. Сб. науч. трудов. Москва: РАЕН, 2007, вып. 16. - С. 172 - 187.

2. Зонтиков, Д.Н. Культура микроспор Brassica oleráceo L. /Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова //Сб. науч. трудов VIII Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2 апреля 2008 г.). — М.: ГНУ ВНИИСБ, 2008. — С. 17-18.

3. Зонтиков, Д.Н. Эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica olerácea L.) в культуре микроспор /А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова //Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 306-307.

4. Зонтиков, Д.Н. Регенерационная способность капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) /С.А. Зонтикова, А.В. Поляков, О.Ф. Чикризо-ва, Д.Н. Зонтиков, Г.Н. Ралдугина //Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 136-137.

5. Зонтиков, Д.Н. Влияние температурного стресса и борной кислоты на эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре микроспор /Д.Н. Зонтиков, А.В. Поляков /'/Сб. науч. трудов по овощеводству и бахчеводству к 110-летшо со дня рождения Б.В. Квасникова. — Верея, 2009. — С. 191 -193.

6. Зонтиков, Д.Н. Генетический и морфофизиологический полиморфизм овощных культур и использование его в селекции на устойчивость к стрессам /Л.В.Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова, Н.Н. Давыдова, К. Рабей //Сб. науч. трудов V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 1 (Москва, 16-20 марта 2009 г.). — М.: ЗАО «Эксио-биохим-техиологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. 2009. — С. 258-259.

7. Зонтиков, Д.Н. Влияние температурного стресса и кислотности среды на эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре микроспор /Д.Н. Зонтиков //Сб. науч. трудов IX Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 8 апреля 2009 г.). — М.: ГНУ ВНИИСБ, 2009, —С. 13-14.

8. Зонтиков, Д.Н. Температурный стресс повышает выход эмбриоидов капусты белокочанной в культуре микроспор /А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков //Картофель и овощи. — 2009. — №7. — С. 25.

Подписано в печать 2.10.2009. Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1. Кол-во знаков 34332 Тираж 100 экз. Заказ № 42

Типография ООО «Полиграф-Бизнес» Московская обл., г. Раменское, ул. Красноармейская, 133/2

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Зонтиков, Дмитрий Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ГАПЛОИДИЯ. СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДНЫХ 13 РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР BRASSICA OLERACEA L.

1.1. Гаплоидия и её значение для селекции растений

1.2. Культура микроспор Brassica olerace L.

1.3. Некоторые ботанические и биологические особенности Bras- 22 sic a oleraceae L.

1.3.1. Развитие пыльника и микроспор

1.4 Изменение программы развития микроспор под действием фак- 28 торов влияющих на андрогенез in vitro

1.4.1. Оптимальная стадия развития пыльцы для введения в 28 культуру

1.4.2. Условия выращивания растений-доноров

1.4.3. Влияние генотипа на андрогенез in vitro

1.4.4. Влияние температурной предобработки на андрогенез in 32 vitro

1.4.5. Влияние регуляторов роста на морфогенез микроспор ка- 37 пусты белокочанной

1.4.6. Другие факторы, влияющие на андрогенез in vitro

1.5. Способы получения удвоенных гаплоидов

ГЛАВА 2. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ, ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ, 48 СХЕМА И МЕТОДИКИ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ

2.1. Цель, задачи и схема исследований

2.1.1. Схема исследований

2.2. Условия проведения исследований

2.2.1. Почвенные и агрохимические условия проведения иссле- 56 дований

2.2.2. Погодные условия вегетационных периодов 2007 — 2009 58 гг.

2.3. Материал и методика проведения исследований

2.3.1. Исходный материал

2.3.2. Методика лабораторных опытов 60 2зз Проведение оценки исходного и полученного в ходе исследо- ^ ваний материала

ГЛАВА 3. Усовершенствование элементов технологии получения уд- 67 военных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор

3.1. Влияние наночастиц серебра на донорные растения капусты 67 белокочанной

3.2. Влияние температуры на эмбриоидогенез капусты белокочан- 69 ной в культуре микроспор

3.3. Определение зависимости стадии развития микроспоры от 71 длинны бутона

3.4. Определение зависимости эмбриоидогенеза от стадии развития 75 микроспор

3.5. Определение зависимости эмбриоидогенеза от плотности сус- 77 пензии микроспор

3.6. Влияние питательной среды на эмбриоидо-и каллусогенез

3.7. Влияние регуляторов роста на эмбриоидогенез

3.8. Влияние сахарозы на эмбриоидогенез

3.9. Влияния кислотности среды на эмбриоидогенез

3.10. Влияние аскорбиновой кислоты на эмбриоидогенез

3.11. Влияния питательных сред, регуляторов роста и сахарозы на 91 рост и развитие эмбриоидов

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА РАСТЕНИЙ-РЕГНЕРАНТОВ КАПУСТЫ 95 БЕЛОКОЧАННОЙ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР

4.1. Цитологический анализ растений-регенерантов капусты бело- 95 кочанной поколения R0 по количеству хромосом

4.2. Оценка растений-регенерантов капусты белокочанной поколе- 97 ния R0 по количеству устьиц и числу хлоропластов в них

4.3. Подтверждение гаплоидной природы растений-регенерантов 100 методом ПЦР

4.4. Характеристика удвоенных гаплоидов капусты белокочанной 103 полученных в культуре микроспор по морфологическим признакам

4.5. Биохимический анализ растений-регенерантов капусты белоко- 104 чанной, полученных в культуре микроспор

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор"

Актуальность темы. Капуста была введена в культуру более 5000 лет назад. Родиной всех возделываемых видов капусты считают Средиземноморье. На протяжении тысячелетий из дикой капусты человеку удалось получить большое разнообразие форм. В результате отбора растений и укорачивания междоузлий были получены кочанные формы. — белокочанная, краснокочанная и савойская'(Пивоваров В.Ф., Старцев В.И., 2006).

В кочанах капусты в обилии содержатся витамины Р, К, Bl} В2, РР, С, инозит, фолиевая кислота, биотин. Все эти вещества и витамины полезны и необходимы для> организма человека. Зеленые листья капусты служат источником каротина, переходящего в организме человека в витамин А. В капусте был также обнаружен витамин U, который употребляют в качестве эффективного быстродействующего средства для лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Капуста богата полезными минеральными солями. Особенно много в ней калия, фосфора, есть кальция железо, марганец. Капуста является так же источником Сахаров и легкоусвояемых белков. По содержанию азотистых веществ она превышает брюкву, репу, морковь, свеклу. Клетчатка капусты способствует выведению из организма жироподобных веществ - холестерина (Петрушко Ю.Н., 2003).

Немаловажное значение капуста имеет в качестве кормового растения для сельскохозяйственных животных и птиц, для чего в свежем или силосованном виде используют отходы от столовых сортов и специально культивируют кормовые сорта, но главным образом листья капусты (Петрушко Ю.Н., 2003).

Капуста белокочанная является перекрёстноопыляемым растением, имеющим двухлетний цикл развития. В связи с этим селекционный процесс этой культуры является длительным и трудоемким и основан преимущественно на внутривидовой гибридизации с последующим многократным отбором, использовании инфекционно-провокационных фонов для оценки материала на устойчивость к стрессовым факторам среды (Поляков А.В., 2000).

Основные направление в селекции капусты белокочанной, это скороI спелость, устойчивость к болезням (кила, сосудистый бактериоз, фузариоз и др.) и вредителям (Пивоваров В.Ф., Старцев В.И., 2006).

Использование удвоенных гаплоидов в овощеводстве особенно актуально в связи с тем, что в последние годы в производстве особое внимание стали уделять технологиям, сортам и гибридам, приводящим к получению высокой выравненное™, и урожайности (Литвинов С.С., 2003). В связи с этим роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет существенно повысить эффективность селекционного процесса, ускорить получение генетически стабильных линий и облегчить поиск редких признаков, контролируемых рецессивными генами (Поляков А.В., 2000).

- культура изолированных пыльников и микроспор;

- культура семяпочек;

- метод гаплоиндуктора, при котором из-за несовместимости родителей происходит элиминация отцовских хромосом. Однако, метод гаплоиндуктора и культура семяпочек очень трудоёмки, а в культуре пыльников происходит развитие диплоидов из соматических тканей. Наиболее эффективным и технологичным является использование метода культуры микроспор. Но в данном направлении остаётся ещё много проблемных вопросов.

Исходя из вышеописанных проблем, целью исследований является усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор для использования их в селекционном процессе.

Объект исследований — технология получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор.

Предмет исследований — бутоны, пыльники, микроспоры, эмбриоиды, растения - регенераты капусты белокочанной.

Научная новизна работы. Впервые в России усовершенствованы компоненты и технологические элементы, позволяющие получать гаплоиды и удвоенные гаплоиды капусты белокочанной в культуре микроспор. В результате проведённых исследований усовершенствованы элементы технологии культуры микроспор: установлена оптимальная длина бутона капусты белокочанной - 3-5 мм, содержащая невакуолизированные микроспоры, обладающие морфогенетической активностью. Выявлены эффективные концентрации 6-бензиламинопуриа (БАП) - 4 мг/л, а-нафтилуксусной кислоты (НУК) - 0,3 мг/л для индуцирования эмбриоидогенеза Показана эффективность температурной предобработки бутонов повышенной (+32°С) температурой в течение 1 суток. В результате оптимизации условий культивирования микроспор (соотношение и концентрация регуляторов роста, состава питательной среды, концентрации сахарозы) повышена эффективность эмбриоидогенеза до 0,164±0,04%. Проведена оценка с помощью RAPD-анализа полученных растений-регенерантов, в результате которой установлена их генетическая гетерогенность в сравнении с исходным материалом. С помощью цитологического анализа доказана гаплоидная природа растений-регенерантов капусты белокочанной, полученных в культуре микроспор.

Впервые в России усовершенствованы технологические элементы культуры микроспор капусты белокочанной, позволяющие получать гаплоиды и удвоенные гаплоиды. Выявлены эффективные концентрации 6-бензиламинопуриа (БАП) - 4 мг/л, а-нафтилуксусной кислоты (НУК) - 0,3 мг/л для индуцирования эмбриоидогенеза, показана эффективность температурной предобработки бутонов повышенной (+32°С) температурой в течение 1 суток, установлено высокая эффективность использования наночастиц серебра в концентрации 0,12 л*М для снижения бактериальной и грибной инфекции у донорных растений.

Практическая ценность. Установлено, что использование питательной среды Мурасиге - Скуга (Murashige Т., Skoog F., 1962) (MS), содержащей БАЛ в концентрации 4 мг/л, НУК — 0,3 мг/л, аскорбиновую кислоту— 1 мг/л, сахарозу — 120 г/л, и режима температурной предобработки бутонов капусты белокочанной +32°0 в течение 1 суток, индуцирует эмбриоидогенез микроспор с частотой 0;164±0,04% и позволяет получить гаплоиды и удвоенные гаплоиды.

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями^ статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы, и предложения были доложены и представлены на IV конференции; РАЕН Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты (Москва, 2007); VIII и IX Молодежной научной конференции, посвященной памяти F.C. Муромцева (Москва, 2008, 2009); на IX Международной научной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на Международной научно-практической конференции, посвящённой памяти Б.В. Квасникова (Верея, 2009):

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• применение наночастиц серебра в концентрации 0,12 жМ в качестве стерилизующего агента для предобработки донорных растений капусты белокочанной позволяет снизить инфицированность эксплан-тов бактериальными и грибными инфекциями;

• культивирование микроспор на питательной среде-MS, содержащей БАЛ в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, сахарозу-120 г/л, рН-5,6, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л, плант агар-5 г/л, при температуре +25°С и фотопериоде 16/8, позволяет получить эмбриоиды;

• культивирование эмбриоидов на питательной среде MS, содержащей БАЛ в концентрации 1 мг/л, НУК - 0,1 мг/л, сахарозу 30 - г/л, рН 5,6, плант агар 5 г/л, при температуре +25°С и фотопериоде 16/8 позволяет получить растения-регенеранты;

• линии, полученные на основе удвоенных гаплоидов капусты белокочанной сорта Подарок и линии 33, характеризуются высокой вы-равненностью, повышенным содержанием витамина С и Сахаров.

Публикации результатов исследований

По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе одна в журнале «Картофель и овощи», рекомендованном ВАК РФ.

1. Зонтиков Д.Н. Культура микроспор: состояние и- перспективы //А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков, Р.В Сергеев //Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. Сб. науч. трудов. Москва: РАЕН, 2007, вып. 16. - С. 172 - 187.

2. Зонтиков, Д.Н. Культура микроспор Brassica oleracea L. /Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова //Сб. науч. трудов VIII- Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2 апреля 2008 г.). — М.: ГНУ ВНИИСБ, 2008. —С. 17-18.

3. Зонтиков, Д.Н. Эмбриоидогенез капусты белокочанной (.Brassica oleracea L.) в культуре микроспор /А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова //Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 812 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 306-307.

4. Зонтиков, Д.Н. Регенерационная способность капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) /С.А. Зонтикова, А.В. Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков, Г.Н. Ралдугина //Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 136-137.

5. Зонтиков, Д.Н. Влияние температурного стресса и борной кислоты на эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре микроспор /Д.Н. Зонтиков, А.В. Поляков //Сб. науч. трудов по овощеводству и бахчеводству к 110-летию со дня рождения Б.В. Квасникова. —Верея, 2009. — С. 191-193.

6. Зонтиков, Д.Н. Генетический и морфофизиологический полиморфизм овощных культур и использование его в селекции на устойчивость к стрессам /А.В.Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова, Н.Н. Давыдова, К. Рабей //Сб. науч. трудов V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 1 (Москва, 16-20 марта 2009 г.). — М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. — С. 258-259.

8. Зонтиков, Д.Н. Температурный стресс повышает выход эмбриои-дов капусты белокочанной в культуре микроспор /А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков //Картофель и овощи. — 2009. — №7. — С. 25.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы, содержащего 124 наименование, в том числе 67 иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Зонтиков, Дмитрий Николаевич

выводы

1. Оптимизированы условия, влияющие на снижение инфицированности и морфогенетическую активность микроспор капусты белокочанной. Установлено, что:

• применение наночастиц серебра в качестве стерилизующего агента для предобработки донорных растений капусты белокочанной в концентрации 0,12 ./иМ позволяет снизить инфици рованность эксплантов от бактерий на 19-39% и от грибов на 25-31% соответственно;

• проведение температурной предобработки (+32°С, в течение 1 суток) позволяет повысить интенсивность эмбриоидогенеза у сорта Подарок на 34%, линии 33 на 33%, линии 34 на 25%.

• оптимальная длинна бутона, при которой микроспоры преимущественно находятся на невакуолизированной стадии развития, для сорта Подарок и линий 33, 34 составляет — от 3 до 4 мм;

• для повышения эмбриоидогенеза культивирование микроспор капусты белокочанной следует проводить на питательной среде MS, обогащенной БАП в концентрации 4 мг/л и НУК - 0,3 мг/л, позволяющей получить 0,152-0,174% эмбриоидов;

• оптимальная концентрация сахарозы, составляющая 120 г/л, позволяет получить на 37% эмбриоидов больше чем в контрольном варианте с использованием 140 г/л;

3. Культивирование эмбриоидов на питательной среде MS, содержащей БАП в концентрации 1 мг/л, НУК - 0,1 мг/л и сахарозу — 30 г/л и имеющая рН 5,6, позволяет получать около 25% растений-регенерантов от числа культивируемых эмбриоидов. При использовании этой среды было получено 27 растений-регенерантов, из них — 12 растений сорта Подарок, 11 растений линии 33 и 4 растения линии 34.

4. RAPD-анализ растений-регенерантов капусты белокочанной сорта Подарок, полученных в культуре микроспор, показал значительное снижение гетерогенности в спектрах их ДНК в сравнении с исходным образцом. Проведенный цитологический анализ (подсчёт устьиц, числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и хромосом) подтвердил их гаплоидную природу.

5. Среди растений-регенерантов, полученных из микроспор сорта Подарок, был выделен образец, превышающий контроль (исходный сорт) по содержанию сухого вещества, витамина С, глюкозы и дисахаров на 26,9%, 46,7%, 16,5% и 31,7% соответственно.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ

ПРАКТИКЕ

- двукратную обработку донорных растений водным раствором наночастиц серебра за 7 и 2 суток до изоляции бутонов;

- стерилизацию бутонов капусты белокочанной в течение 1 минуты в 70% растворе этанола, 10 минут в 1 % растворе гипохлорита кальция, трёхкратную промывку стерильной водой в течение 5 минут;

- предобработку бутонов температурой +32°С, в течение 1 суток;

- механическое выделение микроспор в жидкой питательной среде MS, содержащей БАП в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, сахарозу - 120 г/л, рН 5,6;

- культивирование микроспор на питательной среде MS содержащей БАП в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, сахарозу - 120 г/л, рН 5,6, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л; плант агар - 5 г/л, при температуре +25°С и фотопериоде 16/8 до образования эмбриоидов;

- пересадку образовавшихся эмбриоидов на среду MS, содержащую БАП в концентрации 1 мг/л, НУК - 0,1 мг/л, сахарозу - 30 г/л, рН 5,6, плант агар -5 г/л, культивирование при температуре +25°С и фотопериоде 16/8 до получение хорошо развитых растений-регенерантов;

- контроль плоидности: подсчёт хромосом, устьиц и хлоропластов в них, ПЦР-анализ;

- пересадку растений-регенерантов в почву в возрасте 60 суток, яровизацию, самоопыление, получение семян.

При использовании этой технологии, выход эмбриоидов составляет 0,164%, а выход растений-регенерантов 0,024%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные экспериментальные данные по морфогенезу микроспор капусты белокочанной сорта Подарок и линий 33 и 34 в культуре in vitro, позволили разработать систему получения гаплоидных растений-регенерантов из микроспор путём прямого эмбриоидогенеза и гемморизогенеза на основе каллусов.

Проведённые исследования позволили идентифицировать именно невакуолизированной микроспору как клетку, морфогенетически компетентную к переключению программы развития с гаметофитной на спорофитную. Одним из факторов переключения на спорофитный путь развития, является стрессовое воздействие повышенной температурой. Фактором индуцирующим эмбриоидогенез, приводящим к регенерации растения, является баланс регуляторов роста БАП и НУК в питательной среде. Нормальное развитие растений регенерантов, происходит на питательной среде MS, с содержанием сахарозы на разных этапах органогенеза от 120 г/л, до 30 г/л, а так же аскорбиновой кислоты, снижающей фенольную нагрузку на эмбриоиды.

Таким образом, полученные данные позволяют уже в настоящее время сделать сложный процесс морфогенеза микроспоры капусты белокочанной по спорофитной программе in vitro управляемым и получать полноценные андроклинные гаплоидные растения-регенеранты полученные в культуре микроспор в большом количестве для внедрения их в селекционную практику.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Зонтиков, Дмитрий Николаевич, Москва

1. Анапияев, Б.Б. Гаплоидная биотехнология и перспективы её использования в генетической инженерии растений /Б.Б. Анапияев //Изучение генома и генетической трансформации растений.- Новосибирск, 2001- С. 174184.

2. Атанасов, А. Биотехнология в растениеводстве /А. Атанасов Новосибирск: Институт цитологии и генетики СО РАН, 1993.- 241с.

3. Батыгина, Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro. Эмбриогенез у покрытосеменных растений /Т.Б. Батыгина, В.А. Васильева, Т.Б. Маметь-ева. //Бот. Журн.69, №1, 1978. С.- 32-34.

4. Батыгина, Т.Б. Эмбриоидогенез злаков /Т.Б. Батыгина //Эмбриология цветковых растений: Терминология и концепции. Т.2: Семя /Ред. Т.Б. Батыгина. — СПб.: Мир и семья, 1997. — С. 528-538.

5. Бельская, Г.Б. Получение гаплоидов белокочанной капусты с помощью культуры пыльников для создания гетерозисных гибридов интенсивного типа /Г.Б. Бельская, Т.В. Семашко //Проблемы селекции овощных культур, Минск. 1997. С. 17-20.

6. Бобков, С.В. Влияние температурного стресса на эффективность каллусо-генеза в культуре пыльников проса и гороха /С.В. Бобков //III Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития". М, 2005. - С.231.

7. Бутенко, Р.Г. Перспективы исследований в культуре клеток и тканей растений. /Р.Г. Бутенко. В кн.: Культура клеток растений. Труды II Всесо-юзн. Конф. Киев, Наук. Думка, 1978. - с. 5-11.

8. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных тканей как метод изучения процессов роста и морфогенеза растений. /Р.Г. Бутенко М.: Наука. - 1964. -256 с.

9. Градова, Н.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии. /Н.Б. Градова. М.: ДеЛи принт, 2001. - 131 с.

10. Грибова, Т.Н. Создание трансгенных линий белокочанной капусты с но-вымиагротехническими свойствами: Автореф. дисс. канд. биол. наук / РАН, 2006. 16 с.

11. Дворядкина, А.Г. Гаплоидия у клещевины как метод создания гомозиготных форм в целях селекции: Автореф. дис .канд биол. наук. -/ВНИИМК.- Краснодар, 1972.-25 с.

12. Домблидес, Е.А. Развитие пыльников капусты брокколи in vivo и при культивировании in vitro. /Е.А. Домблидес, Н.А. Шмыкова. //Сб. науч. труд. Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур.-2002 г.- Выпуск 37.- С. 82-92.

13. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / под ред. Б.А. Доспехова -М.: Агропромиздат, 1985.

14. Еленевский, А.Г. Ботаника высших, или наземных растений. /А.Г. Еле-невский — М.: «Академия», 2000. — 432 с.

15. Ермаков, А.И. Биохимия льна. В кн.: Биохимия культурных растений./ А.И. Ермаков. - Сельхозгиз, 1972. - Т. 3. - С. 67-132.

16. Ермаков, И.П. Диморфизм пыльцы и андрогенез в культуре пыльников и микроспор./ И.П. Ермаков //Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16, Биология. — 1986. № 3. - С. 28-40.

17. Жамбакин, К.Ж. Гаплоидная биотехнология растений. /К.Ж Жамбакин -Алматы, 2004.-186с.

18. Зайцев, B.C. Идентификация генотипов растений с помощью ПЦР-анализа рассеянных повторяющихся последовательностей R173. /B.C. Зайцев Э.Е., Хавкин// Докл. РАСХН, 2001, 2: 3-5.

19. Калашникова, Е.А. Практикум по сельскохозяйственной биотехноло-гии./Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева, О.Ю. Миронова. М. - Колосс, 2006. - 144 с.

20. Калинин, Ф.П. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений /Ф.П. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. Киев. - Наук, думка, 1980.-488с.

21. Круглова, Н.Н. Эмбриологические основы метода культуры пыльников пшеницы, как биотехнологического приема. /Н.Н. Круглова //В кн.: II съезд ВОГИС (1-5 февраля 2000 г.). Тез. докл. С.-П., 2000, т.1, с.151

22. Калинин, Ф.П. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений /Ф.П. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. — Киев. — Наук, думка, 1980.-488с.

23. Круглова, Н.Н. Пыльник in vitro как модель для изучения путей морфогенеза растений in vivo /Н.Н Круглова //The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology — Саратов.: Сарат. губерн. торгово-промыш. Палаты, 2003. 160с.

24. Круглова, Н.Н. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы /Н.Н. Круглова, Т.Б. Батыгина, В.Ю. Горбунова, Г.Е. Титова, О.А. Сельдими-рова. М.: Наука, 2005. - 97 с.

25. Лизгунова, Т.В. Культурная флора СССР. /Т.В. Лизгунова. Т.П. Капуста. Л.: Колос. Ленингр. Отд. 1984. - С.5

26. Литвинов, С.С. Научные основы овощеводства /С.С. Литвинов. —М.: Россельхозакадемия, 2008.—776 с.

27. Маруненко, И.М. Каллусогенез и эмбриогенез в культуре пыльников картофеля /И.М. Маруненко, А.А. Кучко //Цитолог, и генет. 1989 — Т.23 №3. С. 48-51.

28. Муромцев, Г.С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. /Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Т.Н. Тихоненко. М.: Наука, 1990.- 176с.

29. Ницше, В. Гаплоиды в селекции растений. /В. Ницше, Г. Венцель М.: Колос, 1980.- 128с.

30. Пацурия Д.В. Биологическое и технологическое обоснование семеноводства F1 гибридов капусты белокочанной: Автореф. дис. докт. с.-х. наук. // М.: МСХА, 2008.-24 с.

31. Поддубная-Арнольди, В.А. Общая эмбриология покрытосеменных растений./В.А. Поддубная-Арнольди -М.: Наука, 1964.-257 с.

32. Поляков, А.В. Усовершенствование селекционного процесса льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) на основе использования биотехнологических методов: Автореф. дисс. д-ра биол. Наук / РАСХН, 1998. 50 с.

33. Поляков, А.В. Биотехнология в селекции льна. /А.В. Поляков — Тверь, 2000 С.78-95.

34. Поляков, А.В. Получение регенерантов овощных культур и их размножение in vitro. Методические рекомендации. /А.В. Поляков — М.: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, 2005. — 36 с.

35. Поляков, А.В. Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увядянию методами in vitro. Методические рекомендации /А.В. Поляков, А.А. Ткачева, И.И. Тарасенков, Н.К. Бирюкова. — М.: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, 2006. — 28 с.

36. Попадьин, П.В. Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням: Автореф. дис. канд. биолог, наук // М.: МСХА, 2002. 24 с.

37. Пухальский, В.А. Цитология и цитогенетика растений /В.А. Пухальский, А.А. Соловьев, В.Н. Юрцев. М.: Издат-во МСХА, 2004. 118с.

38. Рахинбаев, И.Р. Биотехнология зерновых культур. /И.Р. Рахинбаев, Ж. Тивари, Н.К. Бишимбаева, С.В. Кушнаренко, Е.Д. Азимов. Алма-ата: Гылым, -1992. С.- 40.

39. Ревина, А.А. Синтез и свойства стабильных наночастиц металлов /А.А. Ревина //Наночастицы в природе. Нанотехнологии их создание в приложение к биологическим системам: Материалы 1-ого научно-методологического семинара. -М.: РАЕН-МААНОИ, 2003. С.61-68.

40. Резникова, С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника. /С.А. Резникова. М.: Наука, 1984.- 272с.

41. Резникова, С.А. Мейоз в культуре изолированных пыльников /С. А. Резникова, Ю.Ф.Богданов//Генетика. 1972.- 8 №9. С.30-41.

42. Романов, И.Д. Особенности развития пыльцы злаков и значение их для некоторых генетических исследований /И.Д. Романов //Генетика. — 1970. Т.6.- №10.- С.11-25.

43. Справочник по климату СССР. — 1964. — Вып.8. — 4.2.

44. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. /B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, С.В. Дягтерев и др.: под ред. B.C. Шевелухи //М.: Высшая Школа, 1998. С.69-70.

45. Тюкавин, Г.Б. Биотехнологические основы селекционной технологии моркови (Daucus carota L.): Автореф. дис. докт. биолог, наук. / М., 2007. - 27с.1

46. Шамина, З.Б. //В кн.: Культура клеток растений. /З.Б. Шамина. М.: Наука. 1981.- С.124-136.

47. Шеррер, Н.В. Влияние условий выращивания донорных растений пшеницы на эффективность пыльниковой гаплопродукции /Н.В. Шеррер //Материалы научной конференции. По с.-х. биотехнологии. Целиноград. 1991. С.57.

48. Шмыкова, Н.А. Диморфизм пыльцы и оценка эмбриогенной способности микроспор различных генотипов моркови /Н.А. Шмыкова, Г.Б. Тюкавин //Сельскохозяйственная биотехнология. №5. 2001. С.53-60.

49. Шмыкова, Н.А. Разработка системы биотехнологических методов, направленных на укоренение селекционного процесса овощных культур: Автореф. дис. докт. с.-х. наук. /ВНИИССОК М., 2006. - 20 с.

50. Хохлов, С.С. Гаплоидия и селекция. /С.С. Хохлов, B.C. Тырнов. М.: Наука. 1976.-С. 99- 105.

51. Хржановский В.Г. Практикум по курсу общей ботаники /В.Г. Хржанов-ский, С.Ф. Пономаренко. М.: Агропромиздат, 1989. — 416 с.

52. Цыренов, В.Ж. Основы биотехнологии: Культивирование изолированных клеток и тканей растений /В.Ж Цыренов //Учебно-методическое пособие. Улан-Удэ: ВСГТУ, 2003 С. 21-24.

53. Arnison, P.F. Genotype specific response of cultured broccoli anther to cyto-kinins /P.F.Arnison, P. Donaldson, A. Jackson, C. Sempel, W. Keller // Plant Gell, Tissue and Organ Culture 1990. №3 P. 217-222.

54. Bajaj, Y.P.S. In vitro production of haploids /Y.P.S. Bajaj //Handbook of plant cell culture: Techniques for propagation and breeding (Eds D.A. Evans) New York, London: Macmillam. -1983. -V. 1, P.228-287.

55. Batygina, T.B. Morhogenesis of somatic embryos developing in natural conditions // Biologija.-1998, N 3.-P. 61-64.

56. Bedinger, P.A. The remarkable biology of pollen. /Р.А. Bedinger //Plant Cell. 1992. - V.4. P.879-887.

57. Biddington, N.L. Variation in response to high temperature treatmens in anther culture of Brussels sprouts. /N.L. Biddington, H.T. Robinson. //Plant Cell, Tissue and Organ Culture 22.- 1990. P.48-54.

58. Brooks, J. Chemical structure of the exine of pollen walls and a new function for carotenoids in nature /J. Brooks, G. Shaw //Nature. — 1978. V. 219. -P.532-533.

59. Bhattacharya, N.M. Production of plantlets through somatic embryo-genesis in Brassica campestris. //N.M. Bhattacharya, S.K. Sen //Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie. 1980. - V. 99.-P. 357-361.

60. Bullock, P. Anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) F-ls and their reciprocal crosses /Р. Bullock// Theor. Appl. Genet. -1982.- V. 62.-P. 155-159

61. Cao, M.Q. Embryogenese et regenerationdeplantesde choucroute /Brassica oleracea L. ssp. Capitata) par culture in vitro de microspores .isolees. / M. Q. Cao, F. Chariot, C.C. Dore. Ж Acad. Sci. Paris t. 310; serie 3.-1990. P. 203f 209.

62. Chase, S.S. Monoploid frequencies in a commercial double crass hybrid maize and its components single cross hybrids and: inbred lines. /S.S; Chase //Genetics. 1949- Vol.34 P.328-332.

63. Chu, C.C. The N6 Medium and its Applications for Anther Culture of Cereal Crops /С.С. Chu//Proc. Plant. Tissue culture bening Geience Press. 1978. -P. 43-50.

64. Chuang, C.C. A set of Potato medium for wheat anther culture /С.С. Chuang, J.W. Ouyang //Proc. Symp. Plant Tissue Culture. Science Press: Peking. -1978.- P.51-56.

65. Constantin, M.J. Propagation of Higher Plants; througt Tissue Culture: Emerging Technique and Strategies/M.J: Constantin, R:R^ Henke,K.W.

66. Hughes, B.V. Conger Envir. and Exper Botany. Special issue., 1981. - P. 452.

67. Dunwell, J.M. Anther culture of Solatium tuberosum L / J.M Dunwell, N. Sunderland //Euphytica- 1973 V.22 P. 317-323.

68. Dunwell, J.M. Embriogenesis from pollen in vitro. Biotechnology in plant science. Relevance to agriculture in the eighties. /J.M. Dunwell. //Acad. Press. — 1985. P.44-49.

69. Dunwell, J.M. Pollen, ovule and embryo culture as a tool in plant breeding /J.M. Dunwell //Whither L.A. Anderson P.G. (eds) Plant. Tissue culture and its Agricultural Applications Butterworths. London. - 1986. P.375-404.

70. Duijs, J.G. Highly regenerative cultivars in microspore culture in Brassica oleraseae L. var. Capitata. / J.G. Duijs, R.E. Voorrips. // Euphytica 60. 1992.- P. 45-55.

71. Finnie, S.J. The effect of carbohydrate composition and concentration on anther culture response in barley (.Hordeum vulgare L.) /S.J. Finnie, W. Powell, A.F. Dyer //Plant Breed., 1989.-V.10.- P. 110-118.

72. Gamborg, O.L. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells /O.L. Gamborg, R.A. Miller, K. Ojima //Exp. Cell. Res. 21. 1968. P. 359-368.

73. Green, C.E. Prospects for crop improvement in the field of cell culture. /С.Е. Green.//Hort. Sci. 1977.-V. 12.-P. 131-134.

74. Guha, S. In vitro production of embryos from anthers of Datura. /S. Guha, S.C Maheshwari. //Nature, 204, 1964. P. 497.

75. Guo, J.D. Maintenance of male sterile germ-plasm in Brassica rapa by in vitro propagation. /J.D. Guo, T. Niemela, U. Talisalo, S. Pulli. //Agr, And Food Scince in Finland. 2000. - V. 9. -P. 231-238.

76. Engvild, K.C. Plantlet ploidy and flower bud size in tobacco anther cultures /К.С. Engvild //Hereditas. - 1974. - V.76. - P. 320 - 322.

77. Engvild, K.C. Anther cultures of Datura innoxia: Flower bud stage and em-bryoid level of ploidy. /К.С. Engvild, I. Linde -Laursen, A. Lundquist. //Hereditas. 1972. - V.72. - P. 331 - 332.

78. Evans D.A. Somaclonal and gametoclonal variation / D.A. Evans, W.R. Sharp, M.P. Medina-Filho American Journal of Botany, 1984, V.71, N 6, P.759-774.

79. Hu, Han. Wheat: improvement through anther culture /Ни Han //Biotechnology in agriculture and forestry. (Ed. By Y.P.S. Bajaj) Springer-Velag: Berlin Heidelber. - 1986. - V. 2. - P.55-71.

80. Hunter, C.R. The effect of anther orientation on the production of microspore — derived embryoids and plants of Hordeus Vulgarie Salarlis. /C.R. Hunter. //Plant CelL-1985, 4. P.267-268.

81. Qin, X. Chloroplast namber in Guard cells as ploidy indicator of in vitro grown androgenic peper plantlets /X. Qin, G.L. Rotino //Plant Cell, Tissue Organ Cult. 1995.-V. 41. P. 153-160.

82. Kao K.N. Induction of pollen plant formation in barley anther culture /K.N Kao, D.C. Horn //Int. Symp. On genetic manipulation in crops. Abstracts. Beijing. China. 1984. P.64.

83. Keller, W. A. In vitro production of plants from pollen in Brassica campre-stris. /W.A. Keller, R. Rajhathy, J. Lacapra. //Can. Genet Cytol 17, 1975: P. 655- 666.

84. Kozai, T. Photoautotrophic micropropagation in vitro. /Т Kozai. //Cellular and Developmental Biology Plant. 1991. - V. 27. -P. 47-51.

85. Kuginuki, Y. Varietal differences in embryogenic and regenerativ ability in microspore culture of Chinese cabbage {Br. Camperstris spp. Rekinesis). /Y. Kuginuki, K. Nacamura, K-I. Hida, H. Yosicawa. //Breeding Scince -1997- 47 -P.341-346.

86. Lazar, M.D. Combining abilities and heritability of callus formation and plantley regeneration in wheat (Triticum aestivum) anther culture /M.D. Lazar //Theor. Appl. Genet., 1984a.- V.68. - P. 131-134.

87. Mercy, S.T. Chromosomal behavior of anther culture derived plants of rice / S.T. Mercy, F.J. Zapata //Plant Cell Repts 1986. V. 5 №3 P.215-218.

88. Mukherjee, S.K. Low sugar and osmotic requirements for shoot regeneration from leaf pieces of Solanum melongena L. /S.K. Mukherjee, B. RathinasaEAIIathi, N, Gupta. //Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1991. - V. 25.-P. 13-16.

89. Murashige T. A. Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures /Т. Murashige, F. Skoog //Physiologia Plantarum. -1962. V. 15. -P.473-497.

90. Nichterlein, K. Genotypic and exogenous factors affecting shoot regeneration from anther callus of linseed (Linnum usitatissimum L.). /К. Nichterlein, H. Umbach, W. Friedt //Institute of Agronomy and Plant Breeding, Giessen, 1991,,-P. 125-128.

91. Nitsch, J.P. Experemental Androgenesis in Nicotiana /J.P. Nitsch //Phytomorphology. 1969. - Vol. 19. P. 389-404.

92. Nitsch, P.C. Effect dun choc termigue sur lepouvoir embryogenis pollen de Duture in noxia culture dans lanthereon isole de lantoure /Р.С. Nitsch, B. Noreel //C.R. Acad. Sci. 1973, 276D,3 -P.305-306.

93. Nitsch, P.C. Proceedings of the 18th International Horticulture Congress /Р.С. Nitsch //Tel Ariv. 1972. V.2 - P. 19-58.

94. Ockendon, D.J. Utilization of anther culture in Breeding Brussels sprouts. /D.J. Ockendon. //Genetic Manipulation in plant Plant Breeding. Walter & Gruyter CO. Berlin New York Printed in Germany: 1986. P. 256-271.

95. Oono, К. Production of haploid plantlets of rice (Oryza sativa) by anther culture and their use for breeding. /К. Oono. //Bull. Nat. Inst. Agric. Sci.- 1975 -Series D.-26-P. 139-222.

96. Ouyang, J.W. The response of anther culture to culture temperature in Triti-cum aestivum /J.W. Ouyang, S.M. Zhou, S.E. Jia //Theor. and App. Genet. — 1983., V66, №2, P.101-109.

97. Pechan, P.M. W. A. Identification of potentially embryogenic in Brassica napus /Р.М Pechan, W.A. Keller //Physiologia Plantarum. 1988. - V.74. P.377-384.

98. Phippen, C. Genotype plant, bud size and media factors affecting anther culture of califlowers (В. Oleraceae var. botrytis). /С. Phippen, D.J. Ockendon // Theor. Appi. Genet.-1990.-79.-№l.-P.33-38.

99. Purahauser L. Stimulation of shoot regeneration in Triticum aestivum and Nicotiana plumbaginifo-lia in tissue culture using the ethylene inhibitor AgNOs PL. Purahauser, M. Medgyesy, P.J. Czenko, L. Marton //Plant Cell Reports, 1987. Vol. 6.-P. 1 -4.

100. Shu, W. Secondary embryogenesis from thin cell layers of Brassica napus ssp. oleifera /W. Shu, C.S. Loh //New Phytologist. 1991. - V. 119. -P. 427-432.

101. Singh, B. Heterosis in radish {Raphanus sativus L.). / B. Singh, V.P. Gupta, P.K. Gupta. //Indian J. Hort. 1986. - V. 43. 3-4. -P. 242-247.

102. Sorvari, S. Influence of sucrose and milibiose on barley anther culture in starch media. // S. Sorvari, O. Schieder // Plant Breeding. -1982, 99.- P. 1-24.

103. Sunderland, N. The consept of morfogenic competence with reference to anther and pollen culture. / N. Sunderland. // Plant Cell Culture Crop. Proc. Int. Symp., Calcutta., 6-10 Dec.,1981. N.Y.; L.P.- 1983.-P. 125-139.

104. Telmer, T. A. Cellular changes During heat shock induction and embryo development of cultured microspores of Brassica napus sv. Topas / T. A. Telmer,

105. W. Newcomb, D.H. Simmonds //Protoplasma. 1995. V.l85. - P. 106 - 112

106. Thomas, E. Embryogenesis from microspores of Brassica napus. / E. Thomas, G. Wenzel. //Z. Planzenzucht 74, 1975: p77-81.

107. Thurling, N. The influence of donor plant genotype and environment on production of multicellular microspores in cultured anther of Brassica napus ssp oleifera /N. Thurling, P.M. Chay //Ann. Bot. 1984. V/54 №5. P.681-693

108. Vagera, T. Regulation of in vitro androgenesis of tobacco: relationship between concertration of iron ions and kinetin. // T. Vagera, T. Havranek, Z. Opatrny. //Biohem U. Physiol. Pflanzen.- 1979 -P.759-760.

109. Yang, O. A study of factors affecting anther culture of cauliflower Brassica oleracea var. botrytis. // O. Yang, J. E. Chauvin, Y. Herve. //Plant Cell, Tissue and Organ Culture 28, 1992.: 289-296

110. Zagorsca, N. A. Morfogenesis and plant differentiation in anther cultures of the genus Lucopersicon Mill. / N. A. Zagorsca, M. Abadjieva, C.Georgiev, R. Georgieva. //Plant Tissue Cult., Tokio and lake Yamanaka, July 11-16, Tokyo-1982-P. 539-540.

111. Zaki M.A.M. Microspore derived embryos in Brassica: the signiflcanceof division symmetry in pollen mitosis I to embryogenic development / M.A.M. Zaki, H.G. Dickenson //Sexual Plant Reproduction. -1991. V.4. — P.48-55

Информация о работе

Зонтиков, Дмитрий Николаевич
кандидата сельскохозяйственных наук
Москва, 2009
ВАК 06.01.05

Диссертация

Усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы