Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Усовершенствование метода культуры пыльников для использования в селекционном процессе капусты (Brassica oleracea L.)
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство
Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование метода культуры пыльников для использования в селекционном процессе капусты (Brassica oleracea L.)"
На правах рукописи
УДК 635.34/36:631.147
4
ДАВЫДОВА Наталья Николаевна
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ПЫЛЬНИКОВ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОМ ПРОЦЕССЕ КАПУСТЫ (Brassica oleracea L.)
Специальности: 06.01.05 - селекция и семеноводство 03.00.23 - биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук
Москва-2008
003457152
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии в 2003-2007 гг.
Научные руководители:
доктор биологических наук, старший научный сотрудник
кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ
доктор биологических наук, профессор
Поляков Алексей Васильевич
Гарасенкоп Иван Илларионович
Примак Алексей Павлович
ВНИИССОК
Калашникова Елена Анатольевна
РГАУ-МСХА им. Тимирязева
Ведущая организации: ГНЦ ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова
Защита диссертации состоится «24» декабря 2008 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.022.01 во Всероссийском иаучио-исследовагсльском институте овощеводства по адресу: 140153 Московская обл., Раменский район, д. Верея, строение 500, ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии.
Факс (49646) 2-43-64
Е-та^: vniioh@yandex.ru. Интернет сайт:\у\уш.vniio.com
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института овощеводства.
Автореферат разослан - «24» ноября 2008 год
Ученый секретарь диссертационного совета
Л.Н. ПряадрйшДэва
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время при выращивании капусты наиболее актуальным стало использование гетерозисных гибридов, применение которых увеличивает урожайность, обеспсчизает выравнснность кочанов, устойчивость к стрессовым условиям среды. Вследствие этого, одной из важнейших задач селекционной работы является получение генетически однородных линий для последующего использования в качестве исходного материала н получения ютерозисных гибридов.
Селекционный процесс при выведении гетсрозисных гибридов отличается большой сложностью, обусловленной преимущественно получением исходных самонесовместимых линий, включающим выделение самонесовместимых растений. их самоопыление, оценку уровня самонесовмеетимости, идентификацию аллелей и выделение гомозиготных растений,
В связи с тем, что процесс создания константных линий основан на гибридизации с последующим многократным отбором, использованием инфекциопно-провокационных фонов, для оценки материала на устойчивость к стрессовым факторам среды, он достаточно трудоемок и занимает длительное время.
Для сокращения периода создания генетически константного селекционного материала (линий) используют гаплоиды. IIa основе гаплоидов путем удвоения числа хромосом можно за 1-2 поколения создать гомозиготные линии, в то время как при традиционных способах селекции у капусты па это затрачивается до 10 и более лет.
Одним из перспективных методов получения гаплоидов является культура пыльников (Хотылсва Л.В., Ермишин А.П., 1988). В настоящее время разработаны способы получения гаплоидных растений моркови (Тюкавин Г.Б., 2007), томата (Кучковская Е.В, 2003), лука (Шмыкова H.H.," 2006), льна (Поляков A.B., 2000) и других культур.
Исследования по получению гаплоидных растений у представителей рода Brassica веду тся в Японии (Kuginyki Y.. 1997), Польше (Гурсцка К., 1998), России (Семова ШО., 1992; Домблидес Е.А., 2001, Шмыкова Н.А, 2006). Однако факторы, от которых зависит эффективность пыльцевого эмбриогенеза, еще недостаточно изучены. В связи с этим актуальными проблемами повышения эффективности метода культуры пыльников являются выявление сортов, гибридов, линий, характеризующихся повышенной андроклишюй способностью, определение длины бутона на момент изоляции пыльников, при которой микроспоры являются морфогашыми, режим их стерилизации и состав питательной среды для их культивирования.
Цель н задачи исследований.
Целью исследований являлось усовершенствование метода культуры пыльников и выявление эффективных приемов получения растений - регенерантов для использования их в селекционном процессе капусты белокочанной, цветной и брокколи
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Выявить линии и сорта капусты белокочанной, цветной и брокколи, с повышенной андроклинной способностью для эффективного использования в культуре пыльников;
2. Определить оптимальную длину бутонов капусты белокочанной, цветной и брокколи, содержащих микроспоры на поздней одноядерной стадии развития для введения в условия in vitro;
3. Изучить режимы стерилизации бутонов для введения in vitro;
4. Исследовать влияние обработки бутонов наночастицами серебра и аскорбиновой кислотой на морфогенез капусты белокочанной и цветном в культуре пыльников;
5. Изучить влияние питательных сред на морфогенез капусты белокочанной, цветной и брокколи в культуре иылыгаков;
6. Оценить полученные растения-регенеранты с помощью RAPD-анализа и по количеству хлороппастов н замыкающих клетках устьиц.
Объект исследований - метод культуры пыльников капусты белокочанной, цветной и брокколи.
Предмет исследований - бутоны и пыльники, капуста белокочанная, цветная и брокколи.
Научная новизна. В результате проведенных исследований усовершенствован метод культуры пыльников, заключающийся в установлении оптимальной длины бутона капусты белокочанной - 5-6 мм, капусты цветной и брокколи - 4-5 мм, при которой микроспоры обладают морфогенетической активностью, выявлена оптимальная питательная среда MS, содержащая 6-БАП в концентрации 1 мг/л, а- НУК - 1 мг/л, сахарозу - 140 г/л для эффективного культивирования пыльников капусты белокочанной, цветной в условиях in vitro. Впервые показана высокая эффективность использования предобработки бутонов капусты белокочанной и цветной 1%-ным раствором аскорбиновой кислоты, уточнен режим стерилизации бутонов капусты белокочанной с использованием гипохлорита натрия в концентрации 1,0% и экспозиции 10 минут. Проведена
оценка с помощью RAPD-анализа растений - регенератов, при которой установлена их гепегическая неоднородность.
Практическая ценность работы состоит в том, что выделены линии капусты белокочанной - 222, 201, цветной - сорт Дачница, брокколи - сорта Амбро 12, Амбро 34, характеризующиеся повышенной способностью к андроклинии. Установлена питательная среда MS, содержащая 6-БАГ1 в концентрации 1 мг/л, а - НУК - 1 мг/д, сахарозу - 140 г/л для культивирования пыльников капусты белокочанной, цветной в условиях in vitro, уточнен режим С7ерилизацин бутонов, разработан способ предобработки бутонов капусты белокочанной и urctiioh. позволяющие получить в зависимости от вида капусты от 13,3% до 23.3% теммогенных эксплаптов. получены растения-регенераты в культуре пыльников капусты.
Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.
Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены или представлены на Международной научно - практической конференции "'Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур" (Москва, 2004), 111 Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), III Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва, 2005). Научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов РГАУ им. П.А. • Костычева (Рязань, 2007).
Основные положении диссертации, выносимые на защиту:
- усовершенствованный метод культуры пыльников капусты Brassica oleracea L. включающий:
• режим стерилизации бутонов;
• оптимальную длину бутонов для введения пыльников in vitro;
• линии, сорта капуста, характеризующиеся повышенной андроклшшой способностью;
• предобработку бутонов аскорбиновой кислотой и наночастицами серебра;
• модифицированную питательную среду MS для культивирования пыльников в условиях in vilro;
- растения-рег-енеранты, полученные я культуре пыльников.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит ш введения, 3 глав, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка иснольчованвой литературы, содержащего 169 наименований, в том числе 88 иностранных автороз и приложений.
Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами, 22 рисунками.
2. УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проведены в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИО), расположенном в Раменском районе Московской области в период 2003 - 2007 гг.
Ö качестве исходного материала использовали: 5 образцов капусты белокочанной селекции ГНУ ВНИИО, полученные от заведующего лабораторией капустных культур д.с.-х.н. А. Ф. Бухарова - (222, 201, 204, 205, 850) и 3 линии (С-221, К-132, Ф-31) - от к.б.н. И. О. Стожаровой, к.с.-х.н. Г. А. Костенко, а также 2 гибрида и 1 сорт капусты цветной: Дачница, TSX-C22 F^ Авизо Fi , и 3 сорта брокколи: Амбро 12, Амбро 34, Коломбреза.
Полевые опыты проводили в соответствии Методики опытного дела в овощеводстве и бахчеводстве (под ред. Велика. В.Ф., 1992). Лабораторные исследования проводили в соответствии с «Методическими указаниями по культуре ткани и органов в селекции растений» (Бугснко Р. Г., 1964; Бутенко Р. Г., Хромова J1. М., Седнина Г.А., 1984) и Методическим указаниям по размножению кочанной капусты в культуре ткани для использования в селекции (Марьяхина И.Я., 1981). Цитологические анализы проводили согласно методическим указаниям «Цитология и цитогенетика растений» (Пухальский В.А.,. Соловьев А.А, Юрцев В.Н. 2004).
Растительную ДНК выделяли с помощью набора для выделения ДНК Diatora DNA Prep 200 (ООО «Компания Биоком», Москва 2007). RAPD- анализ осуществляли в пробирках с сухой универсальной смесью «1ТЦР ядро» (ООО «Компания Биоком». Москва) в термоциклере «AMPLY 4» (ООО «Компания Биоком», Москва) с номошыо праймера Paw S5 (AACGAGGGGTTCGAGGCC), фланкирующего концевые повторы ретротранспозоиов семейства R173 (Rogowsky Р. М., Shepherd К. W., Langridge Р., 1992), используя следующий температурный профиль : 94"С - 4 мин; 40 циклов: 94°С - 1 мкн, 54°С - 1 мин, 72°С - 1 мин и 20 сек., 72°С - 4 мин. Продукты амплификации разделяли в 1,5%-ном агарозной геле в TBE - буфере при 120 В течение 40 мип.
Математическую обработку экспериментальных данных проводили на основе методов математической статистики но Доспехову Б.А. (1985).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ
3.1. Оптимизация режимов стерилизации исходного материала капусты
Известно, что главным и необходимым условием для введения любых растительных экспланто» в культуру иг vitro яагаегся их стерелизация. В последние года в биогехнологаческой практике широкое распространение получило использовшше в качестве стерилизующею вацесша растворов коммерческого препарата «Белизна», действующим началом которого является гипохлорит нафия, 3%-ньш раствор перекиси водорода 0.1%-ный раствор сулемы (Шмыкова НА., Бунда М.С., 200J), 70%-ный этиловый спирт (Гуренка К., 1998).
В наших иследованиях для стерилизации бугонов капуста белокочанной, цветной и брокколи использовали 0,5%-ный и 1%-ный растворы гштохлорита натрия в экспозиции 5, 10, 15,20 мшгут и 70%-ный раствор этилового спирта в экспозиции 1 минута. Исследования показали, что лучшим режимом стерилизации является использование раствора гипохлорнта натрия в концентрации 1,0% в течение 10 минут. Данный вариант опыта позволяет получать до 62,8% стерильных жизнеспособных эксплантов капусты белокочанной, 64,4% капусты цветной и 66,6% брокколи (табл. 1, 2).
Таблица 1 - Эффективность стерилизации бутонов капуста белокочанной (линия 222) гипохлорито.м натрия и этиловым спиртом, п = 180 (2003 - 2006 гг.)
s I 11 S. я Й о 6 | = Ё. g я £ 3 m в ьг X § а Ъ£ « 3 к а г" S п _ д ^ О it СП Получено эксплантов
стерильных жизнеспособных стерильных нежизнеспособ- инфицированных
шт. feSp шт. %±Sp шт. %± Sp
70 1 64 35,6+3,6 114 63,3±3,6 2 1,1+0,8
Гипохлорит натрия 0,5 5 76 42,2+3,7 34 18,9+2,9 70 38,9±3,6
10 65 36,1+3,6 54 30,0+3,4 61 33,9+3,5
15 81 45.0±3,7 42 23,3+3,2 57 31,7+3,5
20 86 47,8+3,7 40 22,2±3,1 54 30,0+3,4
1,0 5 121 67.2+3,5 И 6.1±1,8 48 26,7±3,3
10 113 62,8+3,6 59 32,8+3,5 ^ 8 4,4+1,5
15 78 43,3±3,7 96 53,3+3,7 6 3,3±1,3
20 64 35,6±3,6 110 61,1 ±3,6 6 3,3+1,3
Таблица 2 - Эффективность стерилизации бутонов капусты 1%-ным раствором гипохлорита натрия в экспозиции 10 минут, n = 180 (2003 - 2006 гг.)
Виды капусты Получено эксплан гов
стерильных жизнеспособных стерильных нежизнеспособных инфицированных
шт. %±Sp шт. %±Sp шт. %±Sp
Капуста белокочанная (линия 222) 113 62,8+3,6 59 32,8±3,5 8 4,4±1,5
Капуста цветная (сорт Дачница) 116 64,4+3,6 53 29,4±3,4 12 6,6+1,8
Брокколи (Амбро 12) 120 66,6+3,5 51 28,3±3,3 9 5,0+1,6
3.2. Изучение влияния стадии развития микроспор капусты на индукцию каллусо- и эмбриогенез в культуре in vitro
3.2.1. Определение зависимости стадии развития микроспор от длины бутона
Из литературных источников известно, что эффективность андроклинии в культуре пыльников в значительной степени зависит от стадии развития микроспор в момент введения пыльников в культуру in vitro (Аганасов A.A., 1993). Поэтому крайне важно подобрать оптимальную стадию развития микроспор к моменту изолирования пыльника из бутона. Для различных видов рода Brassica поздняя одноядерная стадия развития микроспор является оптимальной (Данвелл Д.М., 1989). В связи с этим нами проведен анализ развития микроспор капусты белокочанной, цветной и брокколи при длине бутона от 2 мм до 8 мм.
Исследования, проведенные на линия 222 капусты белокочанной показали, что в бутонах длиной 2 мм содержится 97,0% микроспор, находящихся в стадии тетрады, при длине бутона 3 мм - 60,3% микроспор относятся к стадии тетрада и 34.3% - к ранней одноядерной стадии. Бутоны длиной 4 мм содержат микроспоры преимущественно на ранней средней одноядерной (21,7%) и средней одноядерной (35,4%) стадии. Поздняя одноядерная вакуолизированная стадия микроспоры (39,5%) находится в основном в бутонах длиной 5 мм. При длине бутона 6 мм микроспора находится преимущественно на поздней одноядерной вакуолизировапной (31,5%) и поздней одноядерной стадии (48,1%), но так же обнаружены микроспоры на митотической стадии (10,1%). В бутонах длиной 7 мм наблюдаются микроспоры, находящиеся на различных стадиях, но преимущественно имеются пыльцевые зерна, относящиеся к стадии двуядерной
пыльцы (36,2%). В бутонах длиной 8 мм содержится зрелая трехклеточпая пыльца (76,2%) (табл. 4).
При этом в бутонах разной длины наблюдались различные стадия микроспор, по при увеличении дшшы бутона, увеличиваюсь доля микроспор, находящихся на более поздних стадиях развития, что согласуется с данными Домблидесс К.Л. (2001) и Шмыкооои H.A. (2006). Цитологический анализ также был проведен и на других линиях капусты белокочанной (201, С-222), при этом колебания в распределении микроспор по стадиям в бутонах разной длины по отношению к линии 222 были несущественными.
Аналогичный анализ был проведен па капусте цветной и брокколи. Отмечено, что в бутонах брокколи и капусты цветной длиной от 4 до 5 мм, микроспоры находятся преимущественно па поздней одноядерной микроспоры.
3.2.2. Влияннс стадии развития микроспор на индукцию каллусо- и
эмбриогенеза в культуре пыльников капусты белокочанной
На сегодняшний день остается актуарной проблема точной идентификации бутонов, которые содержат потенциально эмбриогенные микроспоры.
В исследованиях Е.В. Домблидес (2001) и H.A. Шмыковой (2006) установлено, что у капусты белокочанной морфогешше микроспоры содержат бутоны длиной 5-6 мм, у капусты китайской - 2,5 - 2,8 мм, у капусты цветной - 4
- 4,5 мм, и брокколи - 4,4 - 4,8 мм.
В нашем исследовании использованы бутоны капусты белокочанной линии 201 и 222 с длиной бутонов от 3 мм до 7 мм.
Сравнительный анализ результатов исследований показал, что каллусогенез у линии 222 активно протекал при длине бутона 7 мм, а у линии 201
- 6 мм. Наиболее активно образование эмбриоидов у линии 222 и 201 отмечено при длине бутона равной 5 мм (3,6 - 6,1%) (табл. 3).
3.3. Особенности культуры пыльников капусты в зависимости от состава питательной среды
Как известно, процесс андроклинии является очень сложным и выявление природы генетического контроля необходимо для отбора генотипов, позволяющих получаи. высокий процент андроклинпых растений в культуре пылышков in vitro (Пролетова, Н.В., 2003; Тюкании Г.Б., 2007; Шмыкова H.A., 2006 н др.).
Таблица 3 - Зависимость эмбрио- и каллусогенеза капусты белокочанной от стадии развития микроспор в культуре пыльников (2004 - 2006 гг.)
Линия Длина бутона, мм Стадия развития микроспоры Изучено пыльников, шт. Получено пыльников
каллусогенных эмбриогенных
шт. %+Sp. шт. % +Sp
201 3 тетрада, 50 35 70,0+6,5 0 0
4 ранняя 50 43 86,0+4,9 1 2,0+2,0
5 поздняя 56 45 80,4+5,3 2 3,6+2,5
6 поздняя 42 38 90,5+4,5 1 2,4±2,4
7 двуядерная 60 30 50,0+6,5 1 ],7±1,7
222 3 тетрада, 47 43 91,5+4,1 0 0
4 ранняя 55 31 56,4+6,7 2 3,6+2,5
5 поздняя 49 36 73,5+6,3 3 6,1+3,4
6 поздняя 57 37 64,9+6,3 0 0
7 двуедерная 47 44 93,6+3,6 0 0
В наших исследованиях в качестве исходного материма использовали линии капусты белокочанной - 222, 201, К 132, Ф 311. С 221, 205, 204, В50; сорт капусты цветной - Дачница, и гибриды - TSX-C22 F,, Авизо F, и сорта брокколи -Амбро 12, Амбро 34, Каломбреза. В качестве объекта использовали пыльники, которые помешали на модифицированные среды Гамборга В5 (Gamborg, O.L., 1968) и MS (Murashige Т., Skoog F., 1962).
Проведенные исследования показали влияние генетического фактора в зависимости от состава питательной среды на морфогенез в культуре пыльников у представленных видов капусты Наибольшим андроклинным потенциалом у капусты белокочанной характеризовалась линия 222 (2,3-5,2%), капусты цветной - сорт Дачница (5,1 - 13,3%), у брокколи - сорт Амбро 34 (2,2 - 8,9%) и Амбро 12 -(7,1-5,1%) (табл. 4).
Также в ходе опыта было выявлено различие морфогснстического потенциала между отдельными растениями линий капусты белокочанной, что совпадает с литературными данными (Roulund N., 1991). В нашем случае это отмечено на линии К 132, где у первого растения на питательной среде MS проходил процесс теммогеиеза (4,3%), а у второго растения это не было отмечено. Сравнивая морфогенетическую активность растений различных линий капусты белокочанной можно отметить, что инициация морфогенеза у обоих растений линии С221 была только на питательной среде Гамборга В5, а у растений линии 201 только на питательной среде MS. У остальных линий морфогенезическая активность варьировала между отдельными растениями на разных питательных средах. Например, морфогенетическая активность растения № 1 линии Ф311 была отмечена только на среде MS, а у растения К»2 линии 205
только на среде Гамборга В5 или, например, не отмечен морфогенез на растениях линии 850 на представленных средах (табл. 5).
3.4. Выявление эффективной питательной среды для культивировании капусты в культуре нылышков
Многими исследователями подтверждено, что состав питательной среды является одним из важных факторов, позволяющих успешно культивировать пыльники in vitro и получать развитие андроклинных структур (Bajaj Y.P.S, 1983; Поляков A.B., 1998; Шмыкова H.A., 2006; Ткжавин Г.Б.. 2007).
Проведенные исследования показали, что питательная среда MS является наилучшей для культивирования пыльников капуста и позволяет получать у капусты белокочанной до 5,2';«, капусты цветной до 13,3% и брокколи до 9,5% геммогеиных пыльников (табл. 6).
3.5. Зависимость каллусо- и геммогенеза капусты в культуре пыльников от содержания репляторов роста в питательной среде
Из литературных данных известно, что культуры клеток различных видов растений сильно различаются по способности реагировать на различные ауксины и цитокипипы, содержащиеся в питательной среде (1 амбург i\.J., 1990). Варианты сочетаний и концентраций регуляторов роста для индукции морфогенеза у разных видов мо1ут быть очень разнообразны. Выбор необходимых регуляторов роста во многом предопределяет результаты исследований в этом направлении.
На основе анализа литературных данных по работе с культурой растительных тканей различных видов рода Brassica нами изучено 55 вариантов питательной среды, содержащей различные комбинации цитокшшнов и ауксинов.
В исследованиях в качестве растительного материала использовали линию 222 капусты белокочанной и сорт Дачница капусты цветной.
Полученные данные свидетельствуют о том, что лучшим вариантом сочетания и концентрации регуляторов роста в питательной среде для индукции морфогенеза в культуре пыльников является использование б-БАП в концентрации 1 мг/л и о-НУК - 1 мг/л, позволяющего получать до 6.0% геммогеиных пыльников капусты белокочанной (габл.7). Подобные результаты получены и на капусте цветной, где доля геммогеиных пылышков составила до 10,0%
Таблица 4 - Эффективность геммо- и каллусогенеза капусты в культуре пыльников в зависимости от состава питательной среды (2003 - 2006 гг.) (42 суг.)
Сорт, линия Гамборга В5
Проанализирован!«) пыльников, шт Получено пыльников Проаналкзиро- ванно пыльников, шт. Получено пыльников
каллусогелых геммогенных каллусогенных геммогенных
шт. %±8р 1 шт. шт. %±8р шт. %±8р
Капуста белокочанная
К132 83 69 83,1 ±4,1 2 2,4+1,7 104 83 79,8+3.9 0 0
Ф311- 101 87 86,1+3,4 3 3,0 ±1,7 87 69 79,3+4,3 2 2,3+1,6
С221 86 58 67,4±5,1 0 0 111 82 73,9+4.2 3 2,7 ±1,5
201 96 65 67,7+4,8 3 3,1±1,8 90 56 62,2±5,1 0 0
222 96 86 89,6±3,1 5 5.2±2,3 88 57 64,8±5,1 <-> 2,3±1,£
204 101 57 56,4+4,9 0 0 122 69 56,6±4,5 2 1,б±1,|
205 110 72 65,5+4,5 1 0,9±0,9 404 205 50,7±2,5 17 4,2±1,С
850 97 65 67,0±4.8 0 0 89 44 49,4+5,3, 0 0
Брокколи
Амбро-34 45 41 91,1+4,2 4 8,9±4,2 45 35 77,8+6,2 1 2,2+2, л
Амбро-12 42 39 92,9±4,0 3 7,1+4,0 39 28 71,8±7,2 2 5,1 ±3,5"
Коломбре 60 53 88,3+4,1 0 0 42 31 73,8+6,8 3 7,1+4,6
Капуста цветная
Дачница 45 36 80,0+6,0 6 13,3+5,1 39 15 38,5+7,8 2 5Д±3,5
Р)Т8Х- 45 28 62,2±7,2 1 2,2+2,2 45 18 40,0+7,3 1 2,2±2 Л
Р)Авезю 54 35 64,8+6,5 0 0 60 48 80,0±5,2 4 , 6,7±ЗЯ
Таблица 5 - Эффективность геммо- и каллусогенеза отдельных растений капусты белокочанной на питательной среде разного минерального состава в культуре пыльников (2003 - 2006 гг.) (42 сут.)
Линия, номер растения MS Гамборга В^.
Проаиализиро- ванно пыльников, шт. Получено пыльников Проанализировало пыльником, шт. Количество пыльников
каллусогениых геммогенных каллусогснных геммогенных
шг %±Sp шт. % шт. %±Sp шт. j %±Sp i
К132-раст. №1 46 36 78,3±6,1 2 4,3±3,£ 48 33 68,3+7.0 0 0
КШ-раст. №2 37 33 89,2+5,1 0 0 56 43 76,8+5,6 0 0
ФЗИ-раст. №1 40 29 72,5+7.1 1 2,5+2 Л 41 30 73.2+6,9 0 0
Ф311-раст.№2 47 36 76,6±6,2 2 4,3±3.¡J 46 42 91,3+4,2 2 4,3+3,0
С221-раст. №1 48 37 77,1±6Д 0 0 57 52 91,2±3,8 1 1,8+1,8
С'221-раст.№4 38 30 78,9+6,6 0 0 54 44 81,5±5,3 2 3.7+2,6
201-раст.№1 54 40 74,1 ±6.0 2 3.7+2.Í 43 31 72,1 ±6,8 0 0
201-раст.№2 42 29 69,0±7,1 1 2,4±2,Ч 47 29 61,7+7,1 0 0
222-раст.№1 48 46 93,8±2,9 3 6,3±3¿ 44 28 63,6±7,3 1 , 2,3+2.3
222-раст.№2 48 40 83,3±5,4 2 4,2+2.9 44 32 72,7±6,7 1 ; 2.3+2,3
204 -раст.№>1 50 28 56,0+7,0 0 0 64 36 56,3+6,2 1 I 1.6+1.6
204 -раст.№2 51 2.6 50,9+7,0 0 0 64 41 64,0±6,4 1 1,6±1.6
205 -раст.№1 53 34 64,2±6,6 1 1,9±1,9 200 146 73,0±3,1 9 4,5±1,5
205 -раст.№2 57 36 63,2+6,4 0 0 202 131 64±3,6 8 4.0+1,4
850 -pacT.jVal 40 23 57,5+7.8 0 0 41 24 58,5±7,7 0 0
850 -раст.№2 37 34 59,6+6,5. 0 0 48 31 64,6+6,9 0 0
Таблица 6 - Эффективность гсммо- и каллусогенеза в культуре пыльников капусты в зависимости от состава питательной среды на 42 еут. (2004 - 2006 гг.)
Среда Сорт, ЛИНИЯ Проанализировано пыльников, шт. Получено пыльников
каллусогеиных геммогенных
тт. 1 <&+Яп тт 1 %+Яп
Капуста белокочанная
МБ 222 96 82 85,4±3,6 4 14,1+2,0
201 95 65 68,4±4,8 2 2,1+1,5
Гамборга в, 222 88 55 62,5±5,2 3 3,4+1,9
201 90 54 60,0±5,2 0 0
М1ЛЧ 222 103 71 68,9±4,6 2 1,9+1,3
201 102 65 63,7±4,8 0 0
СЬи 222 90 55 61,1±5,1 1 1,1±1,1
201 86 60 69,8±5,0 0 0
Брокколи
М8 Амбро 12 45 41 91,1+4,3 3 6,7±3,7
Амбро 34 42 39 92,8±4,0 4 9,5+4,5
Гамборга в, Амбро 12 39 27 69,2±7,4 1 5,1+3,5
Амбро 34 45 34 75,5±6,4 2 4,4+1,5
ШМ Амбро 12 48 37 77,1 ±6,1 2 4,2+2,9
Амбро 34 44 36 81,8±5,8 1 2,3±2,3
СЬи Амбро 12 40 27 67,5+7,4 0 0
Амбро 34 40 30 75,0+6,8 0 0
Капуста цветная
М8 Дачница 45 36 90+4,5 5 11,1+4,6
тъх-сгг 45 29 64,4±7,1 2 4,4±3,1
Гамборга В, Дачница 39 16 41+8,1 2 5,1 ±3,5
ТЯХ-С22 45 17 37,8±7,2 1 2,2±2.2
ыьк Дачница 45 23 51,1±7,5 1 2,2±2,2
ТБХ-С22 45 18 40+7,3 0 0
СЬи Дачница 40 13 32,5+7,4 0 0
Т8Х-С22 40 10 25,0±6,8 0 0
3.6. Особенности каллусо- и геммо- и ризогенсза в культуре пыльников капусты в зависимости от концентрации сахарозы в питательной среде
Некоторыми авторами на различных видах культурных растений отмечена зависимость процесса индуцирования морфогенеза не только от содержания регуля горов роста в питательной среде, но и от источника углеводного питания и концентрации сахара в тканях (Бутснко Р.Г., 1975; МсМегЬт К., 1991). В качестве источника углеводов в питательной среде, как правило, для большинства
культивируемых видов растений используют сахарозу, а также мальтозу и глюкозу (Пролетова Н.В., 2003).
Таблица 7 - Эффективность органогенеза капусты белокочанной (линия 222) на питательной среде MS с различным сочетанием регуляторов роста (2005 - 2006 гг.)
Цитокиншш, мг/л Ауксины, мг/л
НУК 2,4-Д
КАП 0.1 0.5 1 0.1 0.5 1
0,1 80,6% к 3,0% г 60,3% к 64,5% к 86,8% к 86,0% к 5,3 % г 87,8% к 3,0% г
0,5 77,0% к 86,2% к 5,2% г 79.0% к 83,3%к 3,3% г 72,1% к 4,9% г 74,3% к
1 80,6% к 80,0% к 94,0% к 6,0% г 75,0% к 80,0% к 2,9% г 92,1% к 3,9% г 1.3% v
2 ip
0,1 50.0% к 2.8% г 62,5% к 61,5% к 39,7% к 1,7% г 51,7% к 66,7% к
0,5 76,9% к 62,3% к 2,3% г 72,0% к 1,7% р 70,4% к 1,7% р 88,9% к 3,7% г 75,0% к
1 78,2% к 83,3% к 66,7% к 4,2% г 66,7% к 77,2% к 68,3% к
тдз
0,1 71,9% к 1,6% г 70,9% к 69,4% к 1,4% р 82,4% к 76,0% к 60,0% к
0,5 74,1% к 79,6% к 3,7% г 68,9% к 50,0% к 40,0% к 33,3% к
1 58,3% к 1 Г. „ Ои, 1 /V IV 65,2% к 3,0% г Л \ Л О! .. Ч-t,**'/и к 36,0% к 30,0% к
НУК
1 73,3% к 3,3% г (контроль)
-к - каллусогенез; г - геммогенез; р - ризогенез.
В наших исследованиях изучено влияние различных концентраций сахарозы в питательной среде на индукцию морфогенеза в культуре пыльников капусты. Опыт проводили на линии 222 капусты белокочанной и сорте Дачница капусты цветной. В ходе опыта исследовали различные концентрации сахарозы: 90 г/л, 100 г/л, ПО г/л, 120 г/л, 130 г/л, 140 г/л, 150 г/л.
Исследования показали, что использование в питательной среде сахарозы в концентрации 140 г/л положительно влияет на процесс морфогенеза в культуре пыльников и позволяет получить от 5,0% и до 11,7%, геммогенных пыльников капусты белокочанной и цветной, что согласуется с данными К. Турецкой (1998) (рис. 1, 2).
90 8« 70
бон
; 50 40 30 20 10 У
70
42,7 44,8
53,6
56,8
7&4
0 0
0 Г>
2,7
3,3
60
1,7
о
□ 5
а г
ЙЗ
90 100 110 520 130 140 150
Концентрация сахарозы в питательной среде, г/л
1,- каллусогенные пыльники; 2 - геммогениые пыльники; 3 -ризогенные пыльники.
Рисунок 1 - Зависимость геммо-, каллусо-. ризогенеза капусты белокочанной от содержания сахарозы в питательной среде (2005 - 2006 гг.)
100 110 120 130 140
Концентрация сахарозы в питательной среде, г/л
1 -каллусогенные пыльники; 2 - геммогенные пыльники; 3 - ризогенные пыльники.
Рисунок 2 - Зависимость геммо, калдусо-, и ризогенеза капусты цветной от содержания сахарозы в питательной среде (2005 — 2006 гг.)
3.7. Влияние обработки бутонов капусты на каллусо - н геммогенсз в культуре пыльников
В качестве стимулирующего фактора для повышения эффективности процессов каллусо- и эмбриогенеза при использовании методов андроклинии in vitro используют различные виды предобработки пыльников или бутонов (Тюкакин Г.Б., 2007). Одним из важных факторов, способных вызвать индукцию эмбриогенеза у представителей рода Brassica, является температурный стресс. Так, в исследованиях H.A. Шмыковой (2006) установлено, что тепловая обработка бутонов при температуре 35°С в течение 1 суток способствует наиболее эффективному образованию морфогенной пыльцы.
Известно, что при введении растительных объектов в культуру in vitro в результат« перенесенного стресса и повреждении тканей может накапливаться этилен, который влияет- на состояние цитоекклета, взаимосвязь мембран, микротрубочек и снижает регенерационную способность эксплантов (Полевой В.В., 1989). Одним из ингибиторов синтеза этилена является нитрат серебра, применение которого стимулирует perei¡еп.чцш>иную активность (Заячковская Т.В., 2005)
Кроме того, в культуре in vitro положительный эффект установлен от использования ряда веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, одним из таких веществ является аскорбиновая кислота (Попов 10.1',, Трушечкин В.Г., Высоцкий В.А., 1978).
В наших опытах проведенных на капусте белокочанной (линия 222) и цветной (сорт Дачница) изучалось влияние предварительной обработки бутонов аскорбиновой кислотой и наночастицами серебра на процесс каллусо - и геммогенеза в культуре пыльников Для этого бутоны замачивали в растворах аскорбиновой кислоты, используемой в концентрациях - 0,5%, 1% и 0,25 %, а также растворах наночастиц серебра - 0,4 мМ, 0,8 мМ, 2.0 мМ. Кроме это го использовали температурную обработку бутонов при 35°С в течение 1 суток.
В ходе исследований отмечено, что предобработка бутонов капусты белокочанной раствором аскорбиновой кислоты в 1,0%-ной концентрации и позволяет получать 13,3% геммогеиных ночек. В культуре пыльников капусты цветной при обработке бутонов 1%-ным раствором аскорбиновой кислоты и 0,4 мМ раствором наночастиц серебра доля почек составляет 23,3% (табл.8).
Таблица 8 - Эффективность геммо- каллусогенеза и нылышков каиусты после обработки бутонов аскорбиновой кислотой п наночастицами серебра (2005 - 2006 гг.)
Вариант обработки Проанализировано пыльников, HIT. Получено пыльников
каллусогенных геммогенных
шт %±Sp шт %±Sp
Капуста белокочанная(линия 222)
Контроль 1 (без обработки) 30 5 16,7±6,8 0 0
Контроль 2 (35°С - 1сут.*) 30 6 20,0±7,3 1 3,3*2,3
Л.К. 1,0% 30 9 30,0±8,4 4 13,3±6,1
Л.К. 0,5% 30 7 23,3±7,7 1 3.3±2,3
А.К. 0,25% 30 3 10,0+5,5 0 0
Н.Ч.С. 2,0 мМ 30 б 20,0±7,3 0 0
Н.Ч.С. 0,8 мМ 30 8 26,7+8,1 0 0
Н.Ч.С. 0,4 мМ 30 10 33,3+8,6 1 3,3±2,3
Капуста цветная(сорт Дачница)
Контроль 1 (без обработки) 32 24 75.0+7,7 3 9,3+5,1
Контроль 2 (35°С - 1сут.*) 35 28 80,0+6.8 5 11,4+5,4
А.К. 1,0% 30 25 83,3+6,8 7 23,3+7,7
А. К. 0,5% 40 28 70,0+7,2 3 7,5+4,2
А. К. 0,25% 33 18 54,5+8,7 1 3,0±3,0
Н.Ч.С. 2,0 мМ 30 24 80,0+7,3 1 3,0±3,0
Н.Ч.С. 0,8 .«Л/ 35 20 57,1+8,4 3 7,5+4,2
Н.Ч.С. 0,4 мМ 30 22 73,3+8,1 7 23,3+7,7
* - температурная обработка бутонов (Шмыкова Н.А., 2006)
3.8. Влияние наночастни серебра в питательной среде на кадлусо- и геммогепез капусты в условиях in vitro
В следующей серии опытов для индукции каллусо- и геммогснеза использовали среду MS, содержащую наночастицы серебра в концентрациях - 0,4 мМ, 0,8 мМ, 2,0 мМ. Эксперименты проводили на линии 222 капусты белокочанной и сорте Дачница капусты цветной.
Результаты исследований показали, что использование наночастиц серебра в питательной среде в концентрации 0,4 мМ положительно влияет на каллусогенез и геммогенез в культуре пыльников капусты цветной и позволяет получить до 20,0% геммогенных и до 83,3% каллусогенных эксплаптов (рис.3).
90-ГГ
О% 0,4 мМ П,8мМ 2,0 мМ
питательная среда МБ с различным содержанием наночастиц серебра
капуста белокочанная: 1 — л од л каллусогснныл пыльников; 2 — доля геммогехшых пыльников.
капуста цветная: 3 - доля каллусо: ешшх пыльников; 4 - доля геммогснных пыльников.
Рисунок 3 - Зависимость геммо- и каллусогснеза капусты от концентрации наночастиц серсбра в питательной среде М8 (2005-2006 и-.)
3.9. Совместное влияние наиочастип серебра и аскорбиновой кислоты на каллусо- и геммогенсз з капусты в культуре пыльников
В нашем эксперименте, проведенном на капусте белокочанной (линия 222) и цветной (сорт Дачница), бутоны предварительно замачивали в растворах аскорбиновой кислоты (0,25%; 0,5%; 1%) и наночастиц серебра (0,4 мМ, 0,8 мМ, 2,0 мЩ. Затем, ассснтичсски изолированные пыльники помешали па питательную среду М8 с различными концентрациями наночастиц серебра (0,4 мМ, 0,8 мМ. 2,0.«А/).
Установлено, что предобработка бутонов капусты белокочанной и цветной аскорбиновой кислотой в 1,0%-ной концентрации и последующее культивирование пыльников на среде, содержащей наночастицы серсбра в концентрации 0,4 л/Л/ является эффективным приемом, положительно влияющим на процесс геммогенеза и позволяющим получить от 10,0% пыльников с почками у капусты белокочанной и до 20,0% у капусты цветной (табл. 9,10).
Таблица 9 - Эффективность гсммо- и кадлусогенеза капусты белокочанной (линия 222) на среде MS с наночастицами серебра в зависимости от предобработки бутонов аскорбиновой кислотой и наночастицами серебра (2005 - 2006 гг.), п = 30
Концентрация наночастиц серебра в среде, мМ ГТо1\ченп пыпт,никпя
КЯПГ™Р.ПГР!ШМУ ГРММОГГННЫУ
шт. %±Sp ШТ. %+Sp
Без обработки
0 5 1б,7±6.8 0 0
0,4 15 50,0+9,1 0 а V
0.8 10 33,3+8,6 0 0
2,0 , 7 23,3±7,7 0 0
Аскорбиновая кислота -1,0 %
и 25 83,3+6,8 2 6,7+4.6
0,4 24 80,0+7,3 3 10,0+5,5
0.8 24 80,0+7,3 I 3,3±3,3
2,0 22 73,3+8,1 0 0
Аскорбиновая кислота - 0,5 %
0 22 73,3+8,1 1 3,3±3,3
0,4 22 73,3+8,1 2 6,7+4,6
0.8 21 70,0±8,4 1 3,3±3.3
2,0 21 70,0+8,4 0 0
Аскорбиновая кислота - 0,25 %
0 18 60,0±8,9 0 0
0,4 23 16.1 ±1,1 0 0
0.8 16 53,3+9,1 0 0
2,0 20 66,7±8,6 0 0
Наночаетицы 2,0 мМ
0 6 20,0±7,3 0 0
0,4 21 70,0±8,4 0 0
0.8 11 36,7+8,8 0 0
2,0 5 16,7+6,8 0 0
Наночаетицы 0,8 мМ
0 8 26,7±8,1 0 0
0,4 22 73,3+8,1 0 0
0.8 !4 46,7+9,1 0 0
2,0 10 33.3+8,6 0 0
Наночаетицы 0,4 мМ
0 10 33,3+8,6 1 3,3+3,3
0,4 26 86,7+6,2 0 0
0.8 20 66,7+8,6 0 0
2,0 15 50,0+9,1 0 0
Таблица 10 - Эффективное!!, геммо- ц каллусогсцсза капусты цветной (сорт Дачница) на среде N48 с наночастицами серебра в зависимости от предобработки бутонов аскорбиновой кислотой п паночастицами серебра (2005 - 2006 гг.)
Концентрация наночастиц серебра, мМ и питательной среде Проанализировано пыльников, шт. Получено пыльников
каллусогенных геммогенных
шт. %±.8р шт. %±8р
Кез обпяботки
0 32 24 75,0+7,7 5 15,6+6,4
0,4 30 25 83,3+6.8 4 13,3+6,2
0.8 35 29 82,9+6,4 3 8,6+4,7
2,0 30 15 50,0+9,1 1 3,3+3,3
Аскорбиновая кислота - 1,0%
0 35 30 85,7+5,9 6 17,1+6,4
«,4 30 25 83,3+6,8 6 20,0+73
0.8 35 23 65,7+8,0 2 5,7+3,9
2,0 38 21 55,3+8,1 I 2,6+2,6
Аскорбиновая кислота - 0.5%
0 32 26 81,3+6,9 2 6,3+4,3
0,4 30 21 70,0+8,4 3 10,0+5,5
0.8 30 15 50,0+9,1 1 3,3+3.3
2,0 30 12 40,0+8,9 0 0
Аскорбиновая кислота - 0.25%
0 31 18 58,1+8,9 1 3,2+3.2
0,4 33 18 54,5+8,7 2 6.1+4,2
0.8 36 18 50,0+8,3 0 0
2.0 34 14 41,2+8,4 0 0
Наночастицы - 2,0 мМ
0 зи 24 80,0+7,3 1 3,3+3,3
0,4 30 15 50,0+9,1 0 0
0.8 39 18 46,2+8.0 0 о
2,0 30 10 33,3+8,6 0 0
Наночастицы - 0,8 мМ
0 35 I 20 57,1+8,4 о 5,7+3.9
0,4 34 14 41,2+8,4 1 2,9+2,9
0.8 36 15 41,7+8,2 1 2,8+2,7
2,0 36 | 14 38,9+8.1 0 0
Наночастицы - 0,4 мМ
0 30 22 73,3+8,1 2 6,7+4,
0,4 27 24 88,9+6.0 \ 3,7+3,6
0.8 32 22 68,8+8,2 1 3,1+3,1
_ ..... 2,0 - - ..30 ...... . 15 40,0+8,9- ~л 0
3.10. Получение растеннй-рсгенерантов капусты в кулыурс пылышков
На эффективность клокального микроразмнсжеиия кроме генетических и физиологических факторов, большое влияние оказывает химический состав среды. Для кпоналыюго микроразмножения капусты белокочанной использовали следующие питательные среды: MS. содержащую 20 г/л сахарозы, 0,05 мг/л 6-БАП, 0,001 мг/л а-ИУК; MS - 30 г/л сахарозы, 3 мг/л 6-БАП, 1 мг/л а-НУК; MS -60 г/л сахарозы, 3 мг/л 6-БАП, 2 мг/л а-ИУК. Отмечено, что процесс регенерации побегов наблюдался только на среде, содержащей 60 г/л сахарозы, 3 мг/л БАП и 2
МГ/Л £7-1 ¡УК.
Окоренение полученных побегов достигалось на безгормоналыюй среде MS, содержащей 20 г/л сахарозы и 7 г/л агара. Для адаптации растений -регенерантов к обычным условиям среды - в крышке культивиционных сосудов делали отверстие, которое расширяли но мере адаптации растений. После этого растения - регенеранты извлекали из культивационных сосудов и помещали под проточную воду для отмывки среды с корней. В дальнейшем растения -регенеранты переносили в торфоперегнойные горшки, с почвенной смесью, состоящей из торфа, перегноя, песка в соотношении 2:1:1 и накрывали стаканчиками, у которых в верхней части имелись отверстия. Процесс адаптации к условиям in vivo протекал в течении 2-3 недель, по мерс развития новых листочков стаканчики убирали.
3.11. Оценка растений - регенерантов H« капусты белокочанной, полученных в культуре пылышков
3.11.1, Изучение растсиий-регеперантов R0, полученных в культуре пылышков с помощью RAPD -анализа
RAPD анализ линии 222 капусты белокочанной и растений-регснерантов. полученных на ее основе в культуре пыльников показал значительное снижение гетерогенности в спектрах ДНК по сравнению с исходным образном. Так, ДНК-профиль исходного образца (дорожка 1) содержат девять полос (180, 220, 280, 290, 320, 370, 420. 450, 550 п.к.), а в спектрах некоторых изучаемых регенерантов (дорожки 2-7) наблюдали отсутствие 4-6 зон амплификации, соотвествующих исходной линии (рис. 4).
Таким образом, молекулярно-генетический анализ выявил различную степень гетерогенности у андроклинных растений. Такие изменения в их геноме, связанные с уменьшением зон амплификации и уровня полиморфизма могут свидетельствовать о большей генетической однородности полученных растений -регенерантов по сравнению с исходным образном.
MI 2 3 4 5 6 7
Рисунок 4 - Электрофореграмма I ЩР-фрагментов, амялифицированных с праймсром PawS5 на геномной ДНК капусты белокочанной .пинии 222: 1— исходный образец (контроль); 2-4 — регенераты полученные н культуре пыльников путем прямого эмбриогенеза; 5-7 - регенеранты. полученные в культуре пыльников путем вторичного эмбриогенеза (из каллуса); М - маркер молекулярной массы Gene Ruler 1 кЬ DNA Ladder (Fermentas. Латвия).
11.2. Оценка растений - регенерантов Ra капусты белокочанной но количеству хлоропластов в замыкающих клетках устьиц
Для оненки андроклинных растений, полученных в культуре пыльниов, использовали метод подсчет количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц. Из литературных источников известно, что количество хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у гаплоидного растения в два раза меньше, чем у диплоидного (Qin X., Rotino G.L., 1995).
В ходе цитологического анализа было выявлено, что количество хлоропластов в клетках устьиц у исходного донорного растения капусты состовляет 15-16. При подсчете хлоропластов у растений - регенерантов был выявлен полиморфизм. Количество хлоропластов в замыкающих клетках у различных растений - регенерантов колебалось от 8-9 до 17-18 шт.
ВЫВОДЫ
!. Выявлены линии и сорта капусты, характеризующиеся наибольшим андроклинньш потенциалом: у капусты белокочанной -линия 222, у цветной -сорт Дачница, у брокколи - Амбро12, Амбро 34, у которых доля геммогенных пыльников соответственно составляет: 5,2 %, 13,3%. 8,9 %.
2. Длина бутона, при которой микроспоры преимущественно находятся на поздней одноядерной стадии развития у капусты белокочанной составляет от 5 до б мм, цветной и брокколи - от 4 до 5 мм.
3. Стерилизация бутонов капусты белокочанной, цветной и брокколи гипохлоритом натрия в концентрации 1,0 % и экспозиции 10 мин. позволяет получить 62,8% стерильных морфогенных экснлантов капусты белокочанной, 64,4% капусты цветной и 66,6 % брокколи.
4. Культивирование пыльников на среде MS, содержащей 6-БА11 в концентрации 1 мг/л, а-НУК - 1 мг/л и 140 г/л сахарозы сопровождается индуцированием геммогенеза у 5,0 - 6,0 % эксплантов капусты белокочанной и 10,0 % -11,7 % капусты цветной.
5. Предобработка бутонов аскорбиновой кислотой в концентрации 1 % и последующее культивирование пылышков на среде MS, содержащей ианочастицы серебра в концентрации 0,4 мМ сопровождается индуцированием геммогенеза у капусты белокочанной (до 10,0 %) и тщетной (до 20,0 %).
6. Предобработка бутонов аскорбиновой кислотой в концентрации 1 % позволяет получать до 13,3 % геммогениых пыльников капусты белокочанной. Обработка бутонов аскорбиновой кислотой в концентрации 1% и наночастицами серебра в концентрации 0,4 мМ позволяет получать до 23,3 % геммогенных пыльников капусты цветной.
7. Культивирование почек и побегов капусты белокочанной на среде MS, содержащей 60 г/л сахарозы, 3 мг/л 6-БАП 2 мг/л 0-1ГУК сопровождается дальнейшим их ростом и образованием полноценных растений-рсгенерантов.
8. Использование праймера Paw S5 при проведении RAPD-акализа позволяет выявить гетерогенность в спектрах ДНК андроклинных растений. Обнаруженное снижение полиморфизма в ДНК-профилях у некоторых растений-рсгенерантов свидетельствует о их большей генетической однородности по сравнению с исходным образцом.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ
С целью получения андроклинных растений капусты рекомендуется:
1. Использовать линию 222 капусты белокочанной, сорт Дачница капусты цветной и Амбро 34, Амбро 12 брокколи, характеризующихся в культуре пыльников повышенной морфогенстической активностью;
2. Для введения пыльников в культуру in vitro:
• стерилизацию необходимо осуществлять гипохлоритом натрия в
концентрации 1,0% и экспозиции 10 минут;
• использовать бутоны длиной 5-6 мм у капусты белокочанной и 4-5 мм у цветной и брокколи;
• проводить предобработку пыльников аскорбиновой кислотой в концентрации 1%;
3. Для культивирования пыльников капусты белокочанной и цветной использовать питательную среду MS. содержащую 6-БАП в концентрации 1 мг/л и а-НУК - 1 мг/л, сахарозу - 140 г/л и агар - 7 г/л, с добавлением 0,4 мМ-мого раствора наиочастиц серебра;
4. Дтя клоналыюго микроразмножения полученных почек в культуре пыльников использовать питательную среду MS, содержащую 6-БЛ11 в концентрации 3 мг/л и а-НУК - 2 мг/л, сахарозу 100 г/я и агар - 7 г/я.
5. Для оценки полученных растений - регенерантов в культуре пыльников использовать 11ЦР - анализ (праймер Paw S5) и подсчет числа хлоропдастов в замыкающих клетках устьиц.
Список опубликованных работ по теме диссертации
1. Ананьина, H.H. Культура пыльников капусты белокочанной (Brassica oleraceae L.): обзор. /H.H. Ананьина, A.B. Поляков //Сб. науч. трудов международной научно-практической конференции "Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур" (22-25 марта 2004 г.). - М.: ГНУ ВНИИО, 2004,- С. 122-127.
2. Ананьина, H.H. Получение регенерантов сельдерейных (Apiac.eae), тыквенных (Cucurbitaceae), капустных (Brassicaceae) и ряда цветочных культур in vitro /A.B. Поляков, И.И. Тарасенков, О.И. Федоришина, A.A. Ткачева, О.И. Ильченко, H.H. Ананьина, H.H. Лебедева, М.И. Иванова, Т.В. Ларионова, H.H. Нарочикова //Ш Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - Москва (14-18 марта 2005 г.), 2005. - С. 286-287.
3. Ананьина, H.H. Влияние размера бутонов и ниппельных сред ia морфогенез капусты белокочанной в культуре пыльников. /ПН. Аванышз, A.B. Поляков, И.И. Тарасенков, И.Н. Боровикова //Ш Российская научно-пракшческая конференция «Амуатьные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов». - Москва; РАЕН, (6-7 июня 2005 г.), 2005. - С. 5£-59.
4. Давыдова, H.H. (Ананьина, H.H.) Аскорбиновая кислота повышает регенерационную ахгивность пыльцы. /H.H. Давыдова // Картофель и овощи. - 2007. -№ 6. - С. 31.
5. Ананьина, H.H. Изучение влияния сочетаний регуляторов роста на каллуеогенез и регенераииоиную способность капусты белокочанной (Brassica oleraceae L) в культуре пыльников. /H.H. Ананьина, A.B. Поляков, Г.А. Костенко, И.А. Сгажарова //Сб. науч. трудов професеорско-преподовательского состава и аспирантов РГАУ им. ÍI.A. Косгычева. (2007) - Рязань, 2008 - С. 25-30
Подписано в печать 18.11.2008 г.
Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Кол-во знаков 37473 Заказ № 19
Тираж 100 экз.
Отпечатано в ООО "Полиграф-Бизнес" г. Раменсиое, ул. Красноармейская, 133/2.
Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Давыдова, Наталья Николаевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.:.
1. ГАПЛОИДИЯ. КУЛЬТУРА ПЫЛЬНИКОВ КАК ОДИН ИЗ СПОСОБОВ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ.
1.1. Гаплоидия, ее значение для селекции. Получение гаплоидных растении in vitro.
1.2. Культура пыльников капусты Brassica oleraceae
1.3. Строение пыльника in vivo у капусты. Стадия развития мужского гаметофита. ^
1.4. Влияние различных факторов на морфогенез капусты {Brassica oleraceae L) в культуре пыльников. ^
1.4.1. Влияние вида, разновидности, сорта донорного растения на выход андроклинных структур в культуре пыльников.
1.4.2. Условия выращивания донорных растений капусты.
1.4.3. Влияние стадии развития микроспоры капусты на андроклинную активность в культуре пыльников.
1.4.4. Влияние различных условий предобработки эксплантов на морфогенез в культуре in vitro.
1.4.5. Влияние минерального состава питательной среды на морфогенез капусты в культуре пыльников.
1.4.6. Роль регуляторов роста в индукции морфогенеза в культуре пыльников капусты.
1.4.7. Культивирование пыльников в культуре in vitro.
2 УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ, ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ, СХЕМЫ И
МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ.
2.1. Цель, задачи и схема исследований.
2.2. Условия проведения исследований.
2.3. Материал и методика проведения исследований.
2.3.1. Исходный материал.
2.3.2. Методика лабораторных опытов.
2.3.3. Проведение оценки исходного и полученного в ходе исследова- 50 ний материала.
2.3.4. Методы выращивания донорных растений.
3.УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ПЫЛЬНИКОВ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОМ ПРОЦЕССЕ КАПУСТЫ (Brassica oleracea L).
3.1. Оптимизация режимов стерелизации исходного материала капусты.
3.2. Изучение влияния стадии развития микроспор капусты на индукцию каллу со- и эмбриогенеза в культуре in ^ vitro.
3.2.1. Определение зависимости стадии развития микроспор от длины бутона.
3.2.2. Влияние стадии развития микроспор на индукцию каллу со- и эмбриогенеза в культуре пыльников капусты белокочанной. ^
3.3. Особенности культуры пыльников капусты в зависимости от состава питательной среды.
3.4. Выявление эффективной питательной среды для культивирования капусты в культуре пыльников. ^g
3.5. Зависимость каллусо- и геммогенеза капусты в культуре пыльников от содержания регуляторов роста в питательной среде.
3.6. Особенности каллусо- и геммо-, ризогенеза в культуре пыльников капусты в зависимости от концентрации сахарозы в питательной среде.
3.7. Влияние обработки бутонов капусты на каллусо- и геммогенез в культуре пыльникрв.
3.8. Влияние наночастиц серебра в питательной среде на каллусо- и геммогенез капусты в условиях in vitro.
3.9. Совместное влияние наночастиц серебра и аскорбиновой кислоты на каллусо- и геммогенез капусты в культуре пыльников.
3.10. Получение растений-регенерантов капусты в культуре пыльни
3.11. Оценка растений-регенерантов Ro капусты белокочанной, полученных в культуре пыльников.
3.11.1. Изучение растений-регенерантов Ro, полученных в культуре пыльников с помощью RAPD -анализа.
3.11.2. Оценка растений - регенерантов Ro капусты белокочанной по количеству хлоропластов в замыкающих клетках устьиц.
Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Усовершенствование метода культуры пыльников для использования в селекционном процессе капусты (Brassica oleracea L.)"
Одна из основных задач сельскохозяйственного производства — обеспечение населения свежей овощной продукцией в течение года. Важная роль в выполнении этой задачи отводится одной из главных возделываемых в Р.Ф. овощной культуре - капусте. Капуста — универсальная культура, широкому распространению которой способствовали ее ценные хозяйственные свойства: высокая урожайность, наличие большого сортового разнообразия различной скороспелости, а также лежкоспособность используемых органов, что позволяет иметь свежую продукцию в течение почти круглого года. Биологические особенности капусты обуславливают возделывание ее на всей территории страны. Капуста имеет ценный химический состав, является источником минеральных элементов, аскорбиновой кислоты и ряда других витаминов, а также значительного количества азотистых и биологически активных веществ (Лизгунова Т.В., 1984).
В настоящее время актуальным стало использование технологий, сортов и гибридов, приводящих к получению высокой выровненности, товарности, урожайности. В этом отношении гетерозисные гибриды выгодно отличаются по сравнению с сортами, поэтому создание гетерозисных гибридов является приоритетным направлением (Литвинов С.С., 2003). Селекционный процесс при выведении гетерозисных гибридов отличается большой сложностью получения исходных самонесовместимых линий и включает 2 этапа:
1 - выделение самонесовместимых растений, их самоопыление и оценку уровня самонесовместимости, идентификация аллелей с выделением гомозиготных растений;
2 - определение комбинационной способности путем скрещиваний линий между собой.
В связи с тем, что процесс производства константных линий основан на гибридизации с последующим многократным отбором, использование ин-фекционно-провокационных фонов, для оценки материала на устойчивость к стрессовым факторам среды, вследствии этого он достаточно трудоемок и занимает длительное время.
Для сокращения периода создания генетически константного селекционного материала (линий) используют гаплоиды. На основе гаплоидов путем удвоения числа хромосом можно за 1-2 поколения создать гомозиготные линии, в то время как при традиционных способах селекции у капусты на это затрачивается до 10 и более лет.
Одним из перспективных методов получения гаплоидов является культура пыльников (Хотылева JT.B., Ермишин А.П., 1988). В настоящее время разработаны способы получения гаплоидных растений моркови (Тюкавин Г.Б., 2007), томата (Кучковская Е.В, 2003), лука (Шмыкова Н.Н., 2006), льна (Поляков А.В., 2000) и других культур.
Исследования по получению гаплоидных растений у представителей рода Brassica ведутся в Японии (Kuginyki Y.,1997), Польше (Гурецка К., 1998), России (Семова Н.Ю., 1992; Домблидес Е.А., 2001; Шмыкова Н.А., 2006). Однако факторы, от которых зависит эффективность пыльцевого эмбриогенеза, еще недостаточно изучены. В связи с этим актуальными проблемами повышения эффективности метода культуры пыльников являются выявление сортов, гибридов, линий, обладающих повышенной андроклинной способностью, определение длины бутона на момент изоляции пыльников при которой микроспоры являются морфогенными, режим их стерилизации и состав питательной среды для их культивирования.
Объект исследований - метод культуры пыльников капусты белокочанной, цветной и брокколи.
Предмет исследований — бутоны и пыльники, капуста белокочанная, цветная и брокколи.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований усовершенствован метод культуры пыльников, заключающийся в установлении оптимальной длины бутона капусты белокочанной — 5-6 мм, капусты цветной и брокколи - 4-5 мм, при которой микроспоры обладают морфогенетической активностью, выявлена оптимальная питательная среда MS, содержащая 6-БАП в концентрации 1 мг/л, а- НУК 1 мг/л, сахарозу 140 г/л для эффективного культивирования пыльников капусты белокочанной, цветной в условиях in vitro. Впервые показана высокая эффективность использования предобработки бутонов капусты белокочанной и цветной 1%-ным раствором аскорбиновой кислоты, уточнен режим стерилизации бутонов капусты белокочанной с использованием гипохлорита Na в концентрации 1,0% и экспозиции 10 минут. Проведена оценка с помощью RAPD-анализа растений - регенерантов, при которой установлена их генетическая неоднородность. Практическая ценность работы состоит в том, что выделены линии капусты белокочанной - 222, цветной - сорт Дачница, брокколи - сорта Амбро 12, Амбро 34, характеризующиеся повышенной способностью к андроклинии. Установлена питательная среда MS, содержащая 6-БАП в концентрации 1 мг/л, а - НУК 1 мг/л, сахарозу 140 г/л для культивирования пыльников капусты белокочанной, цветной в условиях in vitro, уточнен режим стерилизации бутонов, разработан способ предобработки бутонов капусты белокочанной и цветной, позволяющий получить в зависимости от вида капусты от 13,3% до 23,3% геммогенных эксплантов, получены растения-регенеранты в культуре пыльников капусты.
Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями нашей страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Международной научно - практической конференции "Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур" (Москва, 2004), III Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2005), III Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва, 2005). Научнопрактической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов РГАУ им. П.А. Костычева (Рязань, 2007).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-усовершенствованный метод культуры пыльников капусты {Brassica olerasea L.), включающий:
• режим стерилизации бутонов;
• оптимальную длину бутона для введения пыльников in vitro',
• линии, сорта капусты, характеризующиеся высокой андроклинной способностью;
• предобработку бутонов аскорбиновой кислотой и наночастицами;
• модифицированную питательную среду для культивирования пыльников в условиях in vitro',
- растения-регенеранты, полученные в культуре пыльников.
Публикации результатов исследований
По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 5 работы, в т.ч. одна в журнале «Картофель и овощи», рекомендованном ВАК РФ.
1. Ананьина, Н.Н. Культура пыльников капусты белокочанной {Brassica oleraceae L.): обзор. /Н.Н. Ананьина, А.В. Поляков //Сб. науч. трудов международной научно-практической конференции "Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур" (22-25 марта 2004 г.). - М.: ГНУ ВНИИО, 2004.- С. 122-127.
2. Ананьина, Н.Н. Получение регенерантов сельдерейных (Apiaceae), тыквенных {Cucurbitaceae), капустных (Brassicaceae) и ряда цветочных культур in vitro /А.В. Поляков, И.И. Тарасенков, О.И. Федоришина, А.А. Ткачева, О.В. Ильченко, Н.Н. Ананьина, Н.Н. Лебедева, М.И. Иванова, Т.В. Ларионова, И.Н. Боровикова /ЯП Московский международный конгресс
Биотехнология: состояние и перспективы развития". - Москва (14 - 18 марта 2005 г.), 2005. - С. 286-287.
Ananina, N.N. Obtaining regenerants of Apiaceae, Cucurbitaceae, Brassicaceae and some flower crops in vitro /A.V. Poliakov, I.I. Tarasenkov, O.I. Fedorishyna, A.A. Tkacheva, O.V. Ilchenko, N.N. Ananina, N.N. Lebedeva, M.I. Ivanova, T.V. Larionova, I.N. Borovikova /ЯП Moscow International Congress "Biotechnology: state of the art and'prospects of development".- Moscow (March, 14-18, 2005), 2005. - P. 286-287.
3. Ананьина, H.H. Влияние размера бутонов и питательных сред на морфогенез капусты белокочанной в культуре пыльников. /Н!Н. Ананьина,
А.В. Поляков, И.И. Тарасенков, И.Н. Боровикова /ЯП Российская научно
1 / практическая конференция «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания, функциональных продуктов». -Москва: РАЕН, (6-7 июня 2005 г.), 2005. - С. 58-59.
4. Давыдова, Н.Н. Аскорбиновая кислота повышает регенерацион-ную активность пыльцы. /Н.Н. Давыдова // Картофель и овощи. - 2007. - № 6.-С.31.
5. Ананьина, Н.Н. Изучение влияния сочетаний регуляторовфоста на каллусогенез и регенерационную способность капусты белокочанной (Brassica oleraceae L) в культуре пыльников. /Н.Н. Ананьина, А.В. Поляков, Г.А. Костенко, И:А. Стажарова //Сб. науч. трудов профессорско-преподовательского состава и аспирантов РГАУ им. П.А. Костычева. - Рязань, 2008 - С. 25-30
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованой литературы, содержащего 169 наименований, в том числе 88 иностранных авторов, и 81 отечественных авторов. Диссертационная'работа изложена на 124 страницах, иллюстрирована 15 таблицами, 22 рисунками и 7 приложениями.
Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Давыдова, Наталья Николаевна
выводы
1. Выявлены линии и сорта капусты, характеризующиеся наибольшим андроклинным потенциалом: у капусты белокочанной - линия 222, у цветной - сорт Дачница, у брокколи - Амбро 12, Амбро 34, у которых доля геммогенных пыльников соответственно составляет: 5,2 %, 13,3%, 8,9 %.
2. Длина бутона, при которой микроспоры преимущественно находятся на поздней одноядерной стадии развития у капусты белокочанной составляет от 5 до 6 мм, цветной и брокколи - от 4 до 5 мм.
3. Стерилизация бутонов капусты белокочанной, цветной и брокколи гипохлоритом натрия в концентрации 1,0 % и экспозиции 10 мин. позволяет получить 62,8% стерильных морфогенных эксплантов капусты белокочанной, 64,4% капусты цветной и 66,6 % брокколи.
4. Культивирование пыльников на среде MS, содержащей 6-БАП в концентрации 1 мг/л, а-НУК - 1 мг/л и 140 г/л сахарозы сопровождается индуцированием геммогенеза у 5,0 - 6,0 % эксплантов капусты белокочанной и 10,0 % - 11,7 % капусты цветной.
5. Предобработка бутонов аскорбиновой кислотой в концентрации 1 % и последующее культивирование пыльников на среде MS, содержащей наночастицы серебра в концентрации 0,4 мМ сопровождается индуцированием геммогенеза у капусты белокочанной (до 10,0 %) и цветной (до 20,0 %).
6. Предобработка бутонов аскорбиновой кислотой в концентрации 1 % позволяет получать до 13,3 % геммогенных пыльников капусты белокочанной. Обработка бутонов аскорбиновой кислотой в концентрации 1% и наночастицами серебра в концентрации 0,4 мМ позволяет получать до 23,3 % геммогенных пыльников капусты цветной.
7. Культивирование почек и побегов капусты белокочанной на среде MS, содержащей 60 г/л сахарозы, 3 мг/л 6-БАП 2 мг/л а-НУК сопровождается дальнейшим их ростом и образованием полноценных растений-регенерантов.
8. Использование праймера Paw S5 при проведении RAPD-анализа позволяет выявить гетерогенность в спектрах ДНК андроклинных растений. Обнаруженное снижение полиморфизма в ДНК-профилях у некоторых растений-регенерантов свидетельствует о их большей генетической однородности по сравнению с исходным образцом.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ
ПРАКТИКЕ
С целью получения андроклинных растений капусты рекомендуется:
1. Использовать линию 222 капусты белокочанной, сорт Дачница капусты цветной и Амбро 34, Амбро 12 брокколи, характеризующихся в культуре пыльников повышенной морфогенетической активностью;
2. Для введения пыльников в культуру in vitro:
• стерилизацию необходимо осуществлять гипохлоритом натрия в концентрации 1,0% и экспозиции 10 минут;
• использовать бутоны длиной 5-6 мм у капусты белокочанной и 4-5 мм у цветной и брокколи;
• проводить предобработку пыльников аскорбиновой кислотой в концентрации 1%;
3. Для культивирования пыльников капусты белокочанной и цветной использовать питательную среду MS, содержащую 6-БАП в концентрации 1 мг/л и а-НУК - 1 мг/л, сахарозу - 140 г/л и агар - 7 г/л, с добавлением 0,4 .i/Af-ного раствора наночастиц серебра;
4. Для клонального микроразмножения полученных почек в культуре пыльников использовать питательную среду MS, содержащую 6-БАП в концентрации 3 мг/л и а-НУК - 2 мг/л, сахарозу 60 г/л и агар - 7 г/л.
5. Для оценки полученных растений — регенерантов в культуре пыльников использовать ПНР - анализ (праймер Paw S5) и подсчет числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящее время при выращивании капусты наиболее актуальным стало использование гетерозисных гибридов, в сравнении с сортами применение которых увеличивает урожайность, обеспечивает выравненность кочанов, устойчивость к стрессовым условиям среды и т.д. Вследствие этого, одной из важнейших задач селекционной работы является получение генетически стабильных линий в качестве исходного материала для получения гетерозисных гибридов. Вовлечение в селекционную работу биотехнологических приемов, в частности метода культуры пыльников, позволяет сокращать сроки получения константных гомозиготных линий и, тем самым, облегчает и ускоряет селекционный процесс.
В результате проведенных исследований по изучению различных факторов, влияющих на выход андроклинных растений в культуре пыльников: капусты белокочанной, цветной и брокколи:
• выявлены линии, и сорта обладающие наибольшей способностью к андроклинии в культуре пыльников у капусты белокочанной - линия 222, у капусты цветной - сорт Дачница, у брокколи сорт - Амбро 34, Амбро 12;
• определен оптимальный режим стерилизации растительного материала гипохлоритом натрия (концентрация 1,0% и экспозиция 10 минут);
• определена оптимальная длина (4-5 мм) бутона для введения пыльников капусты цветной, брокколи и капусты белокочанной 5-6 мм в культуру in vitro;
• предложена предобработка бутонов 1%-ным раствором аскорбиновой кислоты для введения эксплантов в культуру пыльников;
• оптимизирована питательная среда для культивирования эксплантов (MS, содержащей 140 г/л сахарозы, 1 мг/л 6-БАП 1 мг/л а-НУК) и трансплантов капусты - (MS, содержащей 60 г/л сахарозы, 3 мг/л 6-БАП, 2 мг/л а-НУК).
Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Давыдова, Наталья Николаевна, Москва
1. Анапияев, Б. Б. Гаплоидная биотехнология и перспективы её использования в генетической инженерии растений /Б.Б. Анапияев //Изучение генома и генетической трансформации растений.- Новосибирск, 2001-С. 174-184.
2. Атанасов, А. Биотехнология в растениеводстве /А. Атанасов Новосибирск: Институт цитологии и генетики СО РАН, 1993.- 241с.
3. Батыгина, Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro. Эмбриогенез у покрытосеменных растений. /Т.Б. Батыгина, В.А. Васильева, Т.Б. Маметьева. //Бот. Журн.69, №1, 1978. С.- 32-34.
4. Бельская, Г.Б. Получение гаплоидов белокочанной капусты с помощью культуры пыльников для создания гетерозисных гибридов интенсивного типа /Г.Б. Бельская, Т.В. Семашко //Проблемы селекции овощных культур, Минск. 1997. С. 17-20.
5. Бобков, С.В. Влияние температурного стресса на эффективность кал-лусогенеза в культуре пыльников проса и гороха /С.В. Бобков //III Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва, 2005. - С.231.
6. Бунин, М.С. Методы репродуктивной биологии в селекции овощных культур рода Brassica L /М.С. Бунин. М.- 2003. 28с.
7. Бунин, М.С. Использование биотехнологических методов для получения исходного селекционного материала капусты. /М.С. Бунин, Н.А. Шмыкова. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2004. - 44с.
8. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных тканей как метод изучения процессов роста и морфогенеза растений. М.: Наука. - 1964. - С.256
9. Внучкова, В.А. Оптимизация условий получения гаплоидов пшеницы при посадке пыльников /В.А. Внучкова, Т.М. Чеботарева // Докл. ВАСХНИЛ. 1990. - №5.-С.6-9
10. Высоцкий, В.А. Клональное микроразмножение растений / В.А. Вы-соцский // Культура клеток растений и биотехнология. — М.: Наука, 1986.- С. 91-102.
11. Гамбург, К.З. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. /К.З. Гамборг, Н.И. Рекославская, С.Г. Швецов Новосибирск, 1990.- 243с.
12. Гуляев, Г.В. Словарь терминов по генетике, цитологии, селекции, семеноводству и семеноведению. /Г.В. Гуляев, В.В. Мальченко. — М.: Россельхозиздат, 1975.-С. 184.
13. Гурецка, К. Получение гомозиготных линий капусты белокочанной (Brasica oleracea L, var capitata L.) через культуру пыльников /К. Гурецка, Скерневицы, 1998. - 71с.
14. Данвелл, Д.М. Культура гаплоидных клеток /Пер. с анг. под ред. Р.Г. Бутенко //Биотехнология растений: культура клеток.- М.: Агропром-издат, 1989. С.33-51.
15. Дворядкина, А.Г. Гаплоидия у клещевины как метод создания гомозиготных форм в целях селекции: Автореф. дис .канд биол. наук. -/ВНИИМК.-Краснодар, 1972.-25 с.
16. Домблидес, Е. А. Разработка методов индукции андрогенеза у различных видов капуст: Автореф. дис. канд. с.-х. н. /ВНИИССОК1. М., 2001.-18с.
17. Домблидес, Е.А. Развитие пыльников капусты брокколи in vivo и при культивировании in vitro. /Е.А. Домблидес, Н.А. Шмыкова. //Сб. науч. труд. Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур.- 2002 г.- Выпуск 37.- С. 82-92.
18. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / под ред. Б.А. Доспехова -М.: Агропромиздат, 1985.
19. Ермаков, А.И. Биохимия льна. В кн.: Биохимия культурных растений./А.И Ермаков. - Сельхозгиз, 1972. - Т. 3. - С. 67-132.
20. Жамбакин, К.Ж. Гаплоидная биотехнология растений. /К.Ж Жамба-кин -Алматы, 2004.-186с.
21. Жуковский, П.М. Ботаника / П.М.Жуковский. Москва. - «Советская наука», 1949. - 552с.
22. Заячковская, Т.В. Оценка исходного материала вида Raphanus sativus L. с использованием методов репродуктивной биологии для селекции на гетерозис: автореферат на соискание к.с.-х.н. М. 2005. 26с.
23. Калинин, Ф.П. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений /Ф.П. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. Киев. -Наук, думка, 1980. - 488с.
24. Киселев, Н.С., Шелухин, Н.В. Атлас по анатомии растений, /под ред. С.В. Калишевича.- Минск: Вышэйшая школа, 1969.- 288с.
25. Круглова, Н.Н. Эмбриологические основы метода культуры пыльников пшеницы, как биотехнологического приема. /Н.Н. Круглова //В кн.: II съезд ВОГИС (1-5 февраля 2000 г.). Тез. докл. С.-П., 2000,т.1, c.151
26. Круглова, Н.Н. Пыльник in vitro как модель для изучения путей морфогенеза растений in vivo /Н.Н Круглова //The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology- Саратов.: Сарат. губерн. торгово-промыш. Палаты, 2003. 160с.
27. Кучковская, Е.В. Влияние уровня плоидности на морфометрические показатели вегетативной и генеративной сфер томата. — Автореф. дисс.канд. биолог, наук, 2003. 20с.
28. Лаврова, Н.В. Технологические аспекты создания андрогенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы /Н.В.Лаврова: М., ФГОУ ВПО РГАУ -МСХА им. К.А. Тимирязева, 2006. 124с.
29. Лизгунова, Т.В. Культурная флора СССР. /Т.В. Лизгунова. Т.П. Капуста. — Л.: Колос. Ленингр. Отд. 1984. С.5
30. Литвинов, С.С. Овощеводство России и его научное обеспечение (состояние, приоритеты, перспективы). М.: ВНИИО, 2003. - 35с.
31. Лутова, Л.А. Биотехнология высших растений: Учебник /Л.А. Лутова. Из-во: С-Петербург, 2003. 228с.
32. Маруненко, И.М. Каллусогенез и эмбриогенез в культуре пыльников картофеля /И.М. Маруненко, А.А. Кучко //Цитолог, и генет. 1989 -Т.23 №3. С. 48-51.
33. Методы культуры тканей и органов в селекции растений (Методические рекомендации). Одесса: ВСГИ, 1980. -21с.
34. Методические указания по цитологической и цитоэмбриологической технике (для исследования культурных растений). JL: ВИР, 1981. -28 с.
35. Методика опытного дела в овощеводстве и бахчеводстве /под ред. В.Ф. Велика. М.: Агропромиздат, 1992. - 319с.
36. Методика полевых и вегетационных опытов с гербицидами и удобрениями. М.: Наука, 1967. - С. 125-139.
37. Методические рекомендации: Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию методами in vitro /А.В. Поляков, А.А. Ткачева, И.И. Тарасенков, Н.К. Бирюкова. ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, М. 2006. 28с.
38. Муромцев, Г.С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. /Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Т.И. Тихоненко. М.: Наука, 1990.- 176с.
39. Ницше, В. Гаплоиды в селекции растений. /В. Ницше, Г. Венцель -М.: Колос, 1980.- 128с.
40. Павлов, А.В. Влияние различных концентраций серебра на микроразмножение земляники in vitro /А.В. Павлов, В.М. Плащев //The Biology of Plant Cells in vitro and Biotechnology Саратов.: Сарат. гу-берн. торгово-промыш. Палаты, 2003. С.243.
41. Подвигина, О.А. Теоретическое обоснование и приемы использования методов биотехнологии в селекции сахарной свеклы: Автореф. дис. доктр. с.-х. н. /Воронеж. 2003. 44с.
42. Полевой, В.В. Физиология растений: Учебник для биологических специальностей вузов./В.В. Полевой М.: Высш. шк., 1989. - С. 244379.
43. Половые клетки и оплодотворение у покрытосеменных и водорослей. /В.П. Банникова, О.А. Хведынич, С.П. Шпилевская и др. Киев: Наук. Думка, 1985. - С.6 - 54.
44. Попов, Ю.Г. Способ размножения древесных растений / Ю.Г. Попов, В.Г. Трушечкин, В.А. Высоцкий //Автор, свид-во №626728 БИ -1978.
45. Поляков, А.В. Усовершенствование селекционного процесса льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) на основе использования биотехнологических методов: Автореф. дисс. д-ра биол. Наук / РАСХН, 1998. 50 с.
46. Поляков, А.В. Биотехнология в селекции льна. /А.В. Поляков Тверь, 2000 - С.78-95.
47. Поляков, А.В. Получение регенерантов овощных культур и их размножение in vitro /А.В. Поляков //Методические рекомендации: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемия, 2005. 35с.
48. Попадьин, П.В. Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням: Автореф. дис. канд. биолог. Наук //М.: МСХА, 2002. 24с.
49. Приходько, Н.И. Влияние условий выращивания донорных растений на андрогенез в культуре пыльников пшеницы {Triticum acstivum L.) /Н.И. Приходько //Сб. Науч. по прикл. бот., генет. и селекции (ВНИИ растениеводства). 1989. -Вып 128. - С. 86-89.
50. Пухальский, В.А. Цитология и цитогенетика растений /В.А. Пухаль-ский, А.А. Соловьев, В.Н. Юрцев. М.: Издат-во МСХА, 2004. 118с.
51. Рахинбаев, И.Р. Биотехнология зерновых культур. /И.Р. Рахинбаев, Ж. Тивари, Н.К. Бишимбаева, С.В. Кушнаренко, Е.Д. Азимов. Алма-ата: Гылым, -1992. С.- 40.
52. Ревина, А.А. Синтез и свойства стабильных наночастиц металлов /А.А. Ревина //Наночастицы в природе. Нанотехнологии их создание в приложение к биологическим системам: Материалы 1-ого научно-методологического семинара. -М.: РАЕН-МААНОИ, 2003. С.61-68.
53. Резникова, С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника. /С.А. Резникова. М.: Наука, 1984.- 272с.
54. Резникова, С.А. Мейоз в культуре изолированных пыльников /С. А. Резникова, Ю.Ф.Богданов//Генетика. 1972.- 8 №9. С.30-41.
55. Ригер, Р. Генетический и цитогенетический словарь. /Р. Ригер, А. Михаэлис. Москва, 1967. - С. 219.
56. Романов, И.Д. Особенности развития пыльцы злаков и значение их для некоторых генетических исследований /И.Д. Романов //Генетика. 1970. Т.6.- №10.- С.11-25.
57. Селиванов, А.С. Гаплоидия и селекция. /А.С. Селиванов, B.C. Тыр-нов. М.: Наука, 1976. С.77-87.
58. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. /B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, С.В. Дягтерев и др.: под ред. B.C. Шевелухи //М.: Высшая Школа, 1998. С.69-70.
59. Семова, Н.Ю. Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений белокочанной капусты с использованием культуры пыльников: Автореф. дис. канд. с.-х. н. /ВНИИССОК.1. М.: 1992 -20с.
60. Семова, Н.Ю. Андрогенез in vitro и получение гаплоидных растений белокочанной капусты с помощью культуры пыльников /Н.Ю. Семова, Л.А. Ушакова //Докл. ВАСХНИЛ. -1993 С. 168.
61. Справочник по климату СССР. 1964. - Вып.8. - 4.2.
62. Таганов, Б.О. Разработка лабораторной технологии получения андро-генных растений моркови in vitro.: Автореф. дис. к. с.-х. н. /ВНИИС-СОК.- М.:1991. 10с.
63. Тюкавин, Г.Б. Биотехнологические основы селекционной технологии моркови (Daucus carota L.)\ Автореф. дис. докт. биолог, наук. / М., 2007.-27с.
64. Шамина, З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор. //В кн.: Культура клеток растений. /З.Б. Шамина. -М.: Наука. 1981.- С. 124-136.
65. Шевченко, С.В. Спорогенная ткань. В кн.: Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепция под ред. Батыгиной Т.Б. /С.В. Шевченко //СПБ.: «Мир и семья». 1994. T.l. С.69.
66. Шеррер, Н.В. Влияние условий выращивания донорных растений пшеницы на эффективность пыльниковой гаплопродукции /Н.В. Шеррер //Материалы научной конференции. По с.-х. биотехнологии. Целиноград. 1991. С.57.
67. Шмыкова, Н.А. Диморфизм пыльцы и оценка эмбриогенной способности микроспор различных генотипов моркови /Н.А. Шмыкова, Г.Б. Тюкавин //Сельскохозяйственная биотехнология. №5. 2001. — С.53-60.
68. Шмыкова, Н.А. Разработка системы биотехнологических методов, направленных на укоренение селекционного процесса овощных культур: Автореф. дис. докт. с.-х. наук. /ВНИИССОК М., 2006. - 20 с.
69. Хохлов, С.С. Гаплоидия и селекция. /С.С. Хохлов, B.C. Тырнов. М.: Наука, 1976.- С. 99- 105.
70. Цыренов, В.Ж. Основы биотехнологии: Культивирование изолированных клеток и тканей растений /В.Ж Цыренов //Учебно-методическое пособие. Улан-Удэ: ВСГТУ, 2003 С. 21-24.
71. Arnison, P.F. Genotype specific response of cultured broccoli anther to cytokinins /P.F.Arnison, P. Donaldson, A. Jackson, C. Sempel, W. Keller // Plant Gell, Tissue and Organ Culture, 1990. №3 P. 217-222.
72. Bajaj, Y.P.S. In vitro production of haploids /Y.P.S. Bajaj //Handbook of plant cell culture: Techniques for propagation and breeding (Eds D.A. Evans) New York, London: Macmillam,1983. V. 1. - P.228-287.
73. Bedinger, P.A. The remarkable biology of pollen. /Р.А. Bedinger //Plant Cell, 1992. V.4. - P.879-887.
74. Berhards, S. Improvement of haploids production through in vitro anther curture in hexaploid triticale /S. Berhards, G. Charmet //Genet and breed. Triticale. Proc. 3rd EUCARPIA Meet Gereal See. Triticale, Clermont
75. Ferrand 2-5 Juill 1984-Paris, 1985. P.305-316.
76. Biddington, N.L. Variation in response to high temperature treatmens in anther culture of Brussels sprouts. /N.L. Biddington, H.T. Robinson. //Plant Cell, Tissue and Organ Culture 22, 1990. P.48-54.
77. Brooks, J. Chemical structure of the exine of pollen walls and a new function for carotenoids in nature /J. Brooks, G. Shaw //Nature, 1978. V. 219. -P.532-533.
78. Bhattacharya, N.M. Production of plantlets through somatic embryo-genesis in Brassica campestris. //N.M. Bhattacharya, S.K. Sen //Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie, 1980. -V. 99.-P. 357-361.
79. Buiatti, M. Genetics of growth and differentiation in vitro of Brassica oleracea var. botrytis. /М. Buiatti, S. Baroncelli, A. Bennici. //IV. Genotype-hormone interactions. Z. Pflanzenzuchtg, 1974. V. 73. -P.298-302.
80. Bullock, P. Anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) F-ls and their reciprocal crosses /Р. Bullock// Theor. Appl. Genet, 1982. V. 62.-P. 155159
81. Cao, M.Q. Embryogenese et regeneration de plantes de choucroute /Brassica oleracea L. ssp. Capitata) par culture in vitro de microspores isolees. /М. Q. Cao, F. Chariot, C.C. Dore. //R. Acad. Sci. Paris t. 310. serie З.Д990. P. 203-209.
82. Chase, S.S. Monoploid frequencies in a commercial double crass hybrid maize and its components single cross hybrids and inbred lines /S.S. Chase //Genetics., 1949. Vol.34 P.328-332.
83. Chu, C.C. The N6 Medium and its Applications for Anther Culture of Cereal Crops /С.С. Chu //Proc. Plant. Tissue culture bening Geience Press., 1978. P. 43-50.
84. Chuang, C.C. A set of Potato medium for wheat anther culture /С.С. Chuang, J.W. Ouyang //Proc. Symp. Plant Tissue Culture. Science Press: Peking., 1978.-P.51-56.
85. Constantin, M.J. Propagation of Higher Plants througt Tissue Culture: Emerging Technique and Strategies /M.J. Constantin, R.R. Henke, K.W. Hughes, B.V. Conger Envir. and Exper Botany. Special issue., 1981. - P. 452.
86. Devreux, M Reflexions sur nos cultures d anthers de plantes cultivees / M Devreux, U. Laneri, P. Martinis //G. bot. ital., 1975. V. 109. №6 P. 335349.
87. Dunwell, J.M. Anther culture of Solarium tuberosum L / J.M Dunwell, N. Sunderland//Euphytica, 1973 V.22 P. 317-323.
88. Dunwell, J.M. Embriogenesis from pollen in vitro. Biotechnology in plant science. Relevance to agriculture in the eighties. /J.M. Dunwell. //Acad. Press., 1985.-P.44-49.
89. Dunwell, J.M. Pollen, ovule and embryo culture as a tool in plant breeding /J.M. Dunwell //Whither L.A. Anderson P.G. (eds) Plant. Tissue culture and its Agricultural Applications Buttervvorths. London. - 1986. - P.375-404.
90. Duijs, J.G. Highly regenerative cultivars in microspore culture in Brassica oleraseae L. var. Capitata. / J.G. Duijs, R.E. Voorrips. // Euphytica 60., 1992.- P. 45-55.
91. Durr, A. Production of haploid plants of Nicotiana langsdorfill /А. Durr, J. Fleek //Plant Sci Lett. ,1980. V. 18. №1. P. 75-79.
92. Dieu, P. Further studies of androgenic embryo production and plant regeneration from in vitro cultured anthers in maize (Zea mays L.) /Р. Dieu, M. Beckert //Macdica,1986. V.31 №3. P. 245-259.
93. Dietert, M.F. Effects of genotypes on in vitro culture in the genus Brassica / M.F4 Dietert, S.A. Barron, O.C. Yoder. //Plant. Sci. Lett., 1982. V. 26.-P. 233-240.
94. Finnie, S.J. The effect of carbohydrate composition and concentration on anther culture response in barley (Hordeum vulgare L.) /S .J. Finnie, W. Powell, A.F. Dyer//Plant Breed., 1989.V. 10.-P. 110-118.
95. Foroughi-Wehr, B. In vitro responce of Hordeum vulgare L. Anthers culturd from plants grown under different environments. /В. Foroughi-Wehr, G. Mix //Environ. And Exp. Bot., 1979. V. 19. №4 p.303-309.
96. Gamborg, O.L. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells /O.L. Gamborg, R.A. Miller, K. Ojima //Exp. Cell. Res. 21. 1968.-P. 359-368.
97. Green, C.E. Prospects for crop improvement in the field of cell culture. /С.Е. Green.//Hort. Sci., 1977.V. 12.-P. 131-134.
98. Gunter, W. Ein neues Verfahren fur die pflanzliche in vitro kultur /W.
99. Gunter, F. Gunter. //Biochem und Physiol. Pflandz., 1985, 1.- P. 79-83.
100. Guha, S. In vitro production of embryos from anthers of Datura. /S. Guha, S.C Maheshwari. //Nature, 204, 1964. P. 497.
101. Guo, J.D. Maintenance of male sterile germ-plasm in Brassica rapa by in vitro propagation. /J.D. Guo, T. Niemela, U. Talisalo, S. Pulli. //Agr, And Food Scince in Finland, 2000. V. 9. -P. 231-238.
102. Engvild, K.C. Plantlet ploidy and flower bud size in tobacco anther cultures /К.С. Engvild //Hereditas,1974. V.76. - P. 320 - 322.
103. Engvild, K.C. Anther cultures of Datura innoxia: Flower bud stage and embryoid level of ploidy. /К.С. Engvild, I. Linde -Laursen, A. Lundquist. //Hereditas, 1972. V.72. P. 331 - 332.
104. Evans D.A. Somaclonal and gametoclonal variation / D.A. Evans, W.R. Sharp, M.P. Medina-Filho American Journal of Botany, 1984, V.71, N 6, - P.759-774.
105. He, D.G. Somatic embryogenesis and morphogenesis in callus derived from the epiblast of immature embryos of wheat (Triticum aestivum L.) /D.G. He, G. Tanner, K.J. Scott //Plant Sci., 1986. V.45. P. 119-124.
106. Hu, Han. Wheat: improvement through anther culture /Ни Han //Biotechnology in agriculture and forestry. (Ed. By Y.P.S. Bajaj) Springer-Velag: Berlin Heidelber., 1986. V. 2.-P.55-71.
107. Hunter, C.R. The effect of anther orientation on the production of microspore derived embryoids and plants of Hordeus Vulgarie Salarlis. /C.R. Hunter. //Plant Cell, 1985, 4. - P.267-268.
108. Qin, X. Chloroplast namber in Guard cells as ploidy indicator of in vitro grown androgenic peper plantlets /X. Qin, G.L. Rotino //Plant Cell, Tissue Organ Cult., 1995. V. 41. P. 153-160.
109. Kameya, T. Induction of haploid from plants Grains of Brassica. /Т. Kameya, K. Hinata. //Jpn Breed 20, 1970. P.82- 87.
110. Kao K.N. Induction of pollen plant formation in barley anther culture /K.N Kao, D.C. Horn //Int. Symp. On genetic manipulation in crops. Abstracts. Beijing. China, 1984. -P.64.
111. Keller, W. A. In vitro production of plants from pollen in Brassica camprestris. /W.A. Keller, R. Rajhathy, J. Lacapra. //Can. Genet Cytol 17, 1975-P. 655- 666.
112. Klimaszewska, K. High frequency plant regeneration from thin cell layer explants of Brassica napus. /К. Klimaszewska, W.A. Keller. //Plant Cell, Tissue and Organ culture, 1985. V. 4. P. 183-197.
113. Kozai, T. Photoautotrophic micropropagation in vitro. /Т Kozai. //Cellular and Developmental Biology Plant, 1991. V. 27. -P. 47-51.
114. Kuginuki, Y. Varietal differences in embryogenic and regenerativ ability' in microspore culture of Chinese cabbage (Br. Camperstris spp. Rekinesis). /Y. Kuginuki, K. Nacamura, K-I. Hida, H. Yosicawa. //Breeding Scince, 1997- 47 P.341-346.
115. Lazar, M.D. Combining abilities and heritability of callus formation and plantley regeneration in wheat (Triticum aestivum) anther culture /M.D. Lazar //Theor. Appl. Genet., 1984a. V.68. P.131-134.
116. Lazzeri, P.A. In vitro shoot regeneration from seedling root segments of Brassica napus cultivars. /Р.А. Lazzeri, J.M. Dunwell. //Ann. Bot., 1984. V. 54. №3.-P. 341 -350.
117. Mercy, S.T. Chromosomal behavior of anther culture derived plants of rice / S.T. Mercy, F J. Zapata //Plant Cell Repts 1986. V. 5 №3 P.215-218.
118. Mii, M. Effects of pollen degeneration on the pollen embryogenesis inanther culture of Nicotiana Tabacum L. /М. Mii. //Z. Pflanzenphusiol, 1980-99. -P.349-355.
119. Mukherjee, S.K. Low sugar and osmotic requirements for shoot regeneration from leaf pieces of Solarium melongena L. /S.K. Mukherjee, B. Rathinasabapathi, N, Gupta. //Plant Cell, Tissue and Organ Culture,1991. V. 25. P. 13-16.
120. Murakami, T. Effect of genotype on shoot regeneration from cotyledonary explants of rapeseed {Brassica napus L.). /Т. Murakami, Y. Ono, Y. Takahata, N. Kaizuma. //Plant Cell Rep., 1994.V. 14.-P. 1317.
121. Murashige T. A. Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures /Т. Murashige, F. Skoog //Physiologia Plantarum, 1962. V. 15.-P.473-497.
122. Narasimhulu S.B. Somatic embryogenesis in Brassica nigra (Koch) /S.B. Narasimhulu, P.B. Kirti, V.L. Chopra //Journal of Experimental Botany,1992. V. 43.-P. 1203-1207.
123. Nichterlein, K. Genotypic and exogenous factors affecting shoot regeneration from anther callus of linseed {Linnum usitatissimum L.). /К. Nichterlein, H. Umbach, W. Friedt //Institute of Agronomy and Plant Breeding, Giessen, 1991 P. 125-128.
124. Nitsch, J.P. Experemental Androgenesis in Nicotiana /J.P. Nitsch //Phytomorphology, 1969. Vol. 19. P. 389-404.
125. Nitsch, P.C. Effect dun choc termigue sur lepouvoir embryogenis pollen de Duture in noxia culture dans lanthereon isole de lantoure /Р.С. Nitsch, B. Noreel //C.R. Acad. Sci., 1973, 276ДЗ -P.305-306.
126. Nitsch, P.C. Proceedings of the 18th International Horticulture Congress /Р.С. Nitsch//Tel Ariv., 1972. V.2-P. 19-58.
127. Ockendon, D.J. Utilization of anther culture in Breeding Brussels sprouts.
128. D J. Ockendon. //Genetic Manipulation in plant Plant Breeding. Walter & Gruyter CO. Berlin New York Printed in Germany, 1986. - P. 256-271.
129. Oono, K. Production of haploid plantlets of rice (Oryza sativa) by anther culture and their use for breeding. /К. Oono. //Bull. Nat. Inst. Agric. Sci., 1975 Series D.- 26- P. 139-222.
130. Ouyang, J.W. The response of anther culture to culture temperature in Triticum aestivum /J.W. Ouyang, S.M. Zhou, S.E. Jia //Theor. and App. Genet., 1983., V66, №2. -P.101-109.
131. Peeters, A.J.M. In vitro flower bud formation in tobacco: interaction of hormones /A.J.M. Peeters, W. Gerads, G.W.M. Barendse, G.J. Wullems //Plant Physiol., 1991. V.97. -P.402-408.
132. Pechan, P.M. Identification of potentially embrvogenic in Brassica napus /Р.М Pechan, W.A. Keller //Physiologia Plantamm., 1988. V.74. -P.377-384.
133. Phippen, C. Genotype plant, bud size and media factors affecting anther culture of califlowers (В. Oleraceae var. botrytis). /С. Phippen, D.J. Ockendon//Theor. Appi. Genet., 1990.-79.№l.-P.33-38.
134. Purahauser L. Stimulation of shoot regeneration in Triticum aestivum and Nicotiana plumbaginifo-lia in tissue culture using the ethylene inhibitor AgN03 /L. Purahauser, M. Medgyesy, P.J. Czenko, L. Marton //Plant Cell Reports, 1987. Vol. 6. P. 1 - 4.
135. Reinert, J. Anther culture: haploid production and its significance (Applied and Fundamental Aspects of plant cell, tissue and organ cultyre /J. Reinert //Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1977. P.251-267/
136. Rogowsky, P.M. Polymerase chain reaction based mapping of rye involving repeated DNA sequences /P.M. Rogowsky, K.W. Shepherd, P. Langridge//Genome. 1992. V.35 (4). P.621-626.
137. Roulund, N. Optimal consentration of sucrose for head cabbage (Brassicaoleracea L. covarr capitata L) anther culture. /N. Roulund, S.B. Andersen, B. Ferestveit. //Alef Euphytica 52, 1991- P.125 129.
138. Sangwan-Norreei, S. Androgenic stimulating factors in the anther and isolated pollen grain culture of Datura innoxia Mill /S. Sangwan-Norreei. //J. Exp. Bot., 1987, 28.- P. 843-852.
139. Shu, W. Secondary embryogenesis from thin cell layers of Brassica napus ssp. oleifera /W. Shu, C.S. Loh //New Phytologist., 1991. V. 119. P. 427-432.
140. Singh, B. Heterosis in radish {Raphanus sativus L.). / B. Singh, V.P. Gupta, P.K. Gupta. //Indian J. Hort., 1986. V. 43. -№ 3-4. -P. 242-247.
141. Somgstad D.D. Effect of 1 aminocy-clopropane, carboxylic acid, silver nitrate and norboriodiene on plant regeneration from maiz callus cultures / D.D. Somgstad, D.R. Duncan, J.M. Whdholm // Plant Cell Reports, 1988. vol. 7.-P. 262-265.
142. Sopory, S.K. Induction of haploids: achievements problems and possibilities / S.K. Sopoiy //Сип Sci (India), 1983. V.52 №23 -P. 1112 -1113
143. Sopory, S.K. Development of pollen embryoids in anther cultures of Datura innoxia. General observations and effects of physical factors / S.K. Sopory, S. C. Maheshwari. //Exp. Bot. 27, 1987 P.49-57.
144. Sorvari, S. Influence of sucrose and milibiose on barley anther culture in starch media. // S. Sorvari, O. Schieder // Plant Breeding., 1982, 99.- P.l-24.
145. Sunderland, N. The consept of morfogenic competence with reference toanther and pollen culture. / N. Sunderland. // Plant Cell Culture Crop. Proc. Int. Symp., Calcutta., 6-10 Dec.,1981. N.Y.; L.P., 1983.-P. 125-139.
146. Telmer, T. A. Cellular changes During heat shock induction and embiyo development of cultured microspores of Brassica napus sv. Topas / T. A. Telmer, W. Newcomb, D.H. Simmonds //Protoplasma, 1995. V.185. -P.106- 112
147. Thomas, E. Embryogenesis from microspores of Brassica napus. / E. Thomas, G. Wenzel. //Z. Planzenzucht 74, 1975 p77 -81.
148. Thurling, N. The influence of donor plant genotype and environment on production of multicellular microspores in cultured anther of Brassica napus ssp oleifera / N. Thurling, P.M. Chay //Ann. Bot., 1984. V/54 №5. -P.681-693
149. Vagera, T. Regulation of in vitro androgenesis of tobacco: relationship between concertration of iron ions and kinetin. // T. Vagera, T. Havranek, Z. Opatrny. //Biohem U. Physiol. Pflanzen, 1979 -P.759-760.
150. Yang, O. A study of factors affecting anther culture of cauliflower Brassica oleracea var. botrytis. II O. Yang, J. E. Chauvin, Y. Herve.
151. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 28, 1992. 289-296
152. Zaki M.A.M. Microspore derived embryos in Brassica: the significanceof division symmetry in pollen mitosis I to embryogenic development / M.A.M. Zaki, H.G. Dickenson //Sexual Plant Reproduction., 1991. V.4. -P.48-55
153. Месяц Декада Осадки, мм. Среднесуточная температура воздуха, °С Среднесуточная относительная влажность воздуха, %среднемногол етние метеоплощадка ВНИИО, 2004 г. среднемно-голетняя 2004 г. среднемно-голетняя 2004 г.
154. Май 1 14,0 0,2 9,6 15,4 63,5 54,011 17,0 18,5 11,5 9,5 62,0 65,0111 19,0 28,5 14,1 12,8 62,5 68,0за месяц 50,0 47,2 11,8 9,5 62,0 65,0
155. Июнь 1 20,0 14,5 14,4 14,8 59,5 62,0
156. И 21,0 38,5 15,4 14,6 60,0 69,0111 24,0 9,5 16,4 20,1 61,5 70,0за месяц 65,0 62,5 15,4 16,5 60,3 67,0
157. Июль 1 26,0 21,0 17,4 18,8 64,0 71,011 27,0 33,5 17,8 19,7 65,5 71,0111 27,0 30,5 17,7 21,8 67,0 75,0за месяц 80,0 85,0 17,6 20,1 65.5 72,0
158. Август 1 25,0 3,0 17,1 21,5 69,0 67,0
159. И 23,0 22,0 15,9 17,3 70,5 73,0111 22,0 4,0 14.4 20,0 72,5 69,0за месяц 70,0 29,0 15,8 19,7 70,0 70,0
160. Сентябрь 1 20,0 9,0 12,5 14,0 74,0 73,0
161. И 18,0 0,0 10,8 14,0 78,0 71,0111 17,0 10,0 8,1 11,1 78,0 79,0за месяц 55,0 19,0 10,5 13,0 76,5 74,0
162. Октябрь 1 15,0 11,5 6,0 9,0 79,0 • 74,0и 15,0 13,4 4,0 4,8 80,0 75,1111 16,0 40,4 3,5 4,5 80,0 80,2за месяц 46,0 65,3 4,5 6,6 79,7 76.6за вегетацию 366,0 308,0 12,6 14,7 69,2 70,3
163. Месяц Декада Осадки, мм. Среднесуточная температура воздуха, °С Среднесуточная относительная влажность воздуха, %среднемногол етние метеоплощадка ВНИИО, 2005 г. среднемноголетняя 2005 г. среднемноголетняя 2005 г.
164. Май 1 14,0 13,3 9,6 11,9 63,5 54,0
165. И 17,0 38 11,5 13,5 62,0 65,0111 19,0 13 14,1 19,3 62,5 68,0за месяц 50,0 64,3 11,8 14.9 62,0 65,0
166. Июнь 1 20,0 15 14,4 15,7 59,5 62,011 21,0 21,2 15,4 17,7 60,0 69,0111 24,0 77,7 16,4 17,4 • 61,5 70,0за месяц 65,0 113,9 15,4 16.9 60,3 67,0
167. Июль 1 26,0 12,5 17,4 16,6 64,0 71,0
168. И 27,0 17,6 17,8 20,8 65,5 71,0111 27,0 23 17,7 22,0 67,0 75,0за месяц 80,0 53,1 17,6 19.8 65.5 72,0
169. Август 1 25,0 2 17,1 19,8 69,0 67,011 23,0 6,9 15,9 16,7 70,5 73,0111 22,0 4,7 14.4 11,9 72,5 69,0за месяц 70,0 13,6 15,8 16.1 70,0 70,0
170. Сентябрь 1 20,0 8 12,5 15,1 74,0 73,011 18,0 11 10,8 11,7 78,0 71,0111 17,0 0,4 8,1 12,1 78,0 79,0за месяц 55,0 19,4 10,5 13.0 76,5 74,0
171. Октябрь 1 15,0 11,5 6,0 9,0 79,0 74,011 15,0 13,4 4,0 4,8 80,0 75,1111 16,0 40,4 3,5 4,5 80,0 80,2за месяц 46,0 65,3 4,5 6,1 79,7 76.6за вегетацию 366,0 310,2 12,6 40,2 69,2 70,3
172. Месяц Декада Осадки, мм. Среднесуточная температура воздуха, °С Среднесуточная относительная влажность воздуха, %среднемногол етние метеоплощадка ВНИИО, 2006 г. среднемногол етняя 2006 г. средне-многолетняя 2006
173. Май 1 14,0 1,9 9,6 13,8 63,5 52,411 17,0 7,3 11,5 12,7 62,0 64,0111 19,0 19,3 14,1 14,3 62,5 66,9за месяц 50,0 28,5 11,8 13,6 62,0 61,3
174. Июнь 1 20,0 10,8 14,4 15,7 59,5 67,311 21,0 12,6 15,4 18,7 60,0 68,0111 24,0 14,6 16,4 23,8 61,5 67,8за месяц 65,0 38,0 15,4 19,4 60,3 • 67,7
175. Июль 1 * 26,0 12,6 17,4 19,2 64,0 67,311 27,0 50,1 17,8 21.2 65,5 70,6111 27,0 7,4 17,7 16,9 67,0 68,5за месяц 80,0 70,1 17,6 19,0 65.5 68,8
176. Август 1 25,0 24,7 17,1 17,0 69,0 77,2
177. И 23,0 15,0 15,9 19,8 70,5 77,0111 22,0 19,1 14.4 18,2 72,5 78,2за месяц 70,0 58,8 15,8 18,3 70,0 77,5
178. Сентябрь 1 20,0 56,6, 12,5 15,6 74,0 84,411 18,0 0,0 10,8 13,2 78,0 70,6111 17,0 0,0 8,1 13,9 78,0 77,1за месяц 55,0 5 6,6 10,5 14,2 76,5 77,4
179. Октябрь 1 15,0 34,6 6,0 11.7 79,0 85,811 15,0 6,0 4,0 3,9 80,0 75,7111 16,0 14,7 3,5 6,3 80,0 77,2за месяц 46,0 55,3 4,5 7,3 79,7 79,5за вегетацию 366,0 307,3 12,6 15,3 69,2 72,0
-
Давыдова, Наталья Николаевна
-
кандидата сельскохозяйственных наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 06.01.05
- Усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор
- Разработка методов индукции андрогенеза у различных видов капусты
- Усовершенствование способов размножения самонесовместимых линий белокочанной капусты и элементы технологии семеноводства F1 гибридов в условиях Пакистана (Кашмир)
- Совершенствование технологии получения гаплоидных и дигаплоидных растений рапса (Brassica napus L.) и белокочанной капусты (Brassica oleracea L.) in vitro
- Культура пыльников в селекции ярового рапса
