Совершенствование технологии получения гаплоидных и дигаплоидных растений рапса (Brassica napus L.) и белокочанной капусты (Brassica oleracea L.) in vitro

Май Дык Чунг

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование технологии получения гаплоидных и дигаплоидных растений рапса (Brassica napus L.) и белокочанной капусты (Brassica oleracea L.) in vitro
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование технологии получения гаплоидных и дигаплоидных растений рапса (Brassica napus L.) и белокочанной капусты (Brassica oleracea L.) in vitro"

904613804 На правах рукописи

МАЙ ДЫК ЧУНГ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДНЫХ И ДИГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ РАПСА (BRASSICA NAPUS L.) И БЕЛОКОЧАННОЙ КАПУСТЫ (BRASSICA OLERACEA L.)

IN VITRO

Специальность: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 ЛЕН 2010

Москва-2010

004618804

Работа выполнена в Российском государственном аграрном университете-МСХА имени К. А. Тимирязева

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Калашникова Елена Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Поляков Алексей Васильевич

кандидат биологических наук

Ралдугина Галина Николаевна

Ведущая организация: Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН

Защита состоится 23 декабря 2010 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете-МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д.49. Факс (499) 976-24-92.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

Автореферат разослан 22 ноября 2010 г. и размещен на сайте университета www.timacad.ru

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Важным направлением в современной селекции является создание улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйственных растений, обладающих единичной, групповой или комплексной устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессовым факторам среды при сохранении и повышении их продуктивности и качества. Рациональное сочетание методов классической селекции с биотехнологическими методами позволяет решать поставленные задачи в более короткий срок.

Метод культуры изолированных пыльников и микроспор (андрогенез) -один из перспективных способов получения гаплоидных растений. Подбор оптимальных условий культивирования, обеспечивающих дифференцировку эмбриоидов из репродуктивных органов (микроспоры и семяпочки) и сравнение этого процесса с процессом формирования соматических и зиготических зародышей является предметом биохимических и морфологических исследований, и целью опытов по изучению молекулярных механизмов, специфичных для эмбриогенеза. Андрогенез зависит от ряда взаимосвязанных факторов (генетических, физиологических, факторов внешней среды (минеральномого и гормонального состава питательной среды), условий культивирования), каждый из которых оказывает свое влияние на морфогенетические процессы при культивировании изолированных пыльников и микроспор in vitro. Результаты исследований ряда авторов показали, что до сих пор эмбриогенез в культуре пыльников in vitro различных видов Brassica происходит спонтанно и имеет низкую частоту выхода гаплоидных растений (1-4%), более того предлагаемые технологии трудно воспроизводимы и недостаточно изучены на каждом этапе андрогенеза. Помимо этого технология получения растений-регенерантов различных видов Brassica из изолированных семяпочек (процесс гиногенеза) из известной литературы не отработана. Поэтому данное направление исследований является актуальным.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка регламента получения растений-регенерантов рапса (В. napus L.) и белокочанной капусты (В. oleráceo L.) из репродуктивных органов путем прямого эмбриогенеза; совершенствование технологии получения гаплоидных и дигаплоидных растений. Задачи исследований:

• Выявить оптимальность стадии развития микроспор в пыльниках в зависимости от расположения бутонов в соцветии и изучить первые этапы развития микроспор внутри пыльника в условиях in vitro;

• Исследовать влияние предобработки соцветий и установить

оптимальные режимы воздействия на процесс прямого эмбриогенеза;

• Изучить влияние различных питательных сред на морфогенез репродуктивных органов различных видов Brassica',

• Изучить процесс формирования первичных и вторичных эмбриоидов, а также адвентивных почек при размножении в культуре in vitro различных видов Brassica;

• Усовершенствовать методики адаптации растений-регенерантов к почвенным условиям и методики получения дигаплоидных растений;

• Провести цитологические исследования гаплоидных и дигаплоидных растений;

• Усовершенствовать экспресс-метод по идентификации последовательности гомологичных генов, отвечающих за устойчивость растений рапса к вирусу желтухи репы (Turnip yellow virus - TuYV). Научная новизна. Совершенствована технология получения гаплоидных и

дигаплоидных растений рапса и белокочанной капусты путем прямого эмбриогенеза из микроспор изолированных пыльников.

Впервые для белокочанной капусты оптимизирован первый этап получения растений-регенерантов из семяпочек изолированных завязей. Установлена оптимальная стадия развития микроспор в пыльниках в зависимости от расположения бутонов в соцветии и изучены этапы развития микроспор внутри пыльника в условиях in vitro. Предложена схема комплексной предобработки соцветий пониженными (+4-6°С в течение 2-х суток) и повышенными (+32°С в течение 1-х суток) температурами в сочетании с обработкой соцветий нитратом серебра (40 мг/л), обеспечивающая индукцию прямого эмбриогенеза.

Установлены оптимальные составы питательных сред для индукции прямого эмбриогенеза в культуре изолированных пыльников: для рапса -минеральные соли по прописи В5, кинетин 1 мг/л, НУК 0,5 мг/л; для белокочанной капусты - минеральные соли по прописи В5, Дропп 0,2 мг/л, НУК 0,05 мг/л; для изолированных семяпочек белокочанной капусты -минеральные соли по прописи В5, Дропп 1,0 мг/л, ИУК 0,5 мг/л.

Изучен процесс первичного эмбриогенеза из изолированных микроспор и вторичного эмбриогенеза из изолированных сегментов гипокотиля и семядолей гаплоидных растений рапса.

С использованием экспресс-метода (ПЦР-анализ) по идентификации фрагментов генов, отвечающих за устойчивость растений рапса к вирусу желтухи репы (Turnip yellow virus - TuYV), выявлены три линии, которые можно рекомендовать для включения в селекционный процесс при подборе родительских пар с целью создания сортов, устойчивых к данному вирусу.

Практическая значимость работы. Полученные гаплоидные и дигаплоидные растения рапса переданы на Селекционную станцию

им. H.H. Тимофеева РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Разработанная методика создания дигаплоидных растений рапса и гаплоидных растений белокочанной капусты может быть применена и к другим представителям рода Brassica. Полученные результаты используются в учебном процессе при чтении лекций и проведения лабораторно-практических работ по курсу «Сельскохозяйственная биотехнология» и «Основы биотехнологии».

Апробация работы. Результаты работы представлены на: Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтение» (Саратов, 2008), Международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии» (Брянск, 2008), Международной научно-практической конференции РГАУ-МСХА (Москва, 2009), Международном симпозиуме по фенольным соединениям «Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2009), 5-й Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы нанобиотехнологии и инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2009), 2-м Международном конгрессе-партнеринге по биотехнологии и биоэнергетике (Москва, 2010), 10-й молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2010), 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2010), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА (Москва, 2010), 5-ом Всероссийском смотре научных и творческих работ иностранных студентов и аспирантов вузов (Томск, 2010), Международной конференции «Достижения и перспективы земледелия, селекции и биологии сельскохозяйственных культур» (Казахстан, Апмалыбак, 2010).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1) Усовершенствованный метод культуры микроспор из изолированных пыльников рапса (В. napus L.) и белокочанной капусты (В. oleráceo L.), а также семяпочек из изолированных завязей белокочанной капусты, включающий:

• оптимальность стадии развития микроспор в пыльниках от расположения бутонов в соцветии;

• совместное применение обработки соцветий пониженными и повышенными температурными режимами в сочетании с нитратом серебра;

• модифицированную питательную среду для культивирования пыльников и семяпочек в условиях in vitro;

• адаптацию растений-регенерантов к почвенным условиям и получение дигаплоидных растений.

2) Процесс индукции прямого эмбриогенеза из изолированных микроспор и образование вторичных эмбриоидов и адвентивных почек из изолированных

сегментов гипокотиля, семядолей гаплоидных растений.

3) Молекулярно-генетические исследования растений рапса.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из которых 2-статьи в журналах, включенных в перечень журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Струю-ура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы. Объем работы составляет dZO страниц. В диссертации содержится рисунков, %.. таблиц. Список использованной литературы содержит источников, в том числе на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работу проводили на сортах и гибридах Fi представителей рода Brassica: белокочанной капусте (В. oleráceo L.): гибрид F, Юбилей, сорт Клаус, линии ЭТ1 и АМФ 3JI; и рапсе (В. napus L.): гибрид WFx Титан. Растения - доноры выращивали в теплице на Селекционной станции им. H.H. Тимофеева РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева в течение года. Объектом исследования служили изолированные бутоны, микроспоры, завязи и семяпочки.

В работе использовали питательные среды по прописи Мурасиге и Скуга (MC), Гамборга (В5), Нича (N6) с добавлением фитогормонов. В качестве веществ с цитокининовой активностью использовали Дропп, БАЛ, кинетин, 2iP (2-изопентениладенин) в концентрациях 0,2 - 2,0 мг/л, в качестве веществ ауксинового типа - 2,4-Д, НУК, ИУК в концентрациях 0,5 - 1,5 мг/л. pH среды находился в пределах 5,5-5,8.

Исследования проводили на бутонах из соцветий, которые изолировали как с главного, так и боковых побегов. Схема включала 6 вариантов:

1) обработка соцветий низкой положительной температурой (+4-6°С) в течение 2 суток до введения пыльников в культуру in vitro;

2) обработка пыльников высокой температурой (+32°С) в течение 1 суток после введения их в культуру in vitro\

3) сочетание низкой положительной температуры (+4-6°С) в течение 2 суток (до введения в культуру in vitro) с последующей обработкой высокой температурой (+32°С) в течение 1 суток после введения пыльников в культуру in vitro;

4) обработка соцветий раствором нитрата серебра 40 мг/л в течение 2 суток при температуре 25°С;

5) обработка соцветий раствором нитрата серебра 40 мг/л в течение 2 суток при температуре +4-6°С.

6) обработка соцветий раствором нитрата серебра 40 мг/л в течение 2 суток при температуре +4-6°С с последующим культивированием изолированных пыльников in vitro при температуре +32°С в течение 1 суток.

Для получения фертильных соцветий растения-регенеранты рапса были обработаны в течение 7 дней 0,5%-ным колхицином в сочетании с 4%-ным раствором диметилсульфоксида (ДМСО). Обработку проводили путем нанесения раствора на пазушные почки растений, после чего растительный материал переносили в условия холодовой обработки (+4°С) на 30 суток. По истечении срока стратификации растения пересаживали в теплицу.

Цитологический анализ растений-регенерантов проводили путем подсчета хромосом в корневых меристемах, а также количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (Практикум по цитологии и цитогенетике растений, 2007).

Выделение тотальной растительной ДНК проводили с использованием методики, предложенной Edwards et al. (1991). В работе использовали праймеры «344» (forward: 5'-GATCCGTTTGGGTCTTGGTA-3'; reverse: 5'-TTGATGTG АА ACGC AC ATTG-3') и «437» (forward 5'-ATCGGACATTGGTCAGGTTC-3'; reverse 5 '-CATACCCCACTGGTTCTTGG-3'), синтезированные в ЗАО «Синтол» (Москва). Амплификацию проводили на амплификаторах «Терцик» («ДНК-технология», Москва), используя следующий температурный профиль : 94°С - 4 мин; 35 циклов: 94°С - 1 мин, 54°С - 1 мин, 72°С - 1 мин и 20 сек., 72°С - 4 мин. Продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза в 1,5 %-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия в TBE буфере при 120В в течение 40 минут. Электрофореграммы визуализировали с помощью гельдокументирующей видеосистемы. Длину фрагментов определяли с использованием маркера молекулярной массы 100-3000 bp.

Математическая обработка экспериментальных данных выполнена на основе методов математической статистики (Лакин Г.Ф., 1980; Смиряев А.В, Кильчевский A.B., 2007). Дисперсионный анализ проводили на ПЭВМ с использованием пакета программы MS ECXEL.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Совершенствование технологии получения гаплоидных и дигаплоидных растений рапса (Brassica парт L.) in vitro

Исходя из литературных данных, для различных видов растений, и, в частности, для рапса изучена зависимость стадии развития микроспор от размера бутона в момент инокуляции. Однако данный подход имеет место только в том случае, когда изолирование бутонов осуществляется с главного

соцветия, находящегося в определенной фазе цветения (начало бутонизации). Кроме того, зависимость стадии развития микроспор от размера бутона зависит от сортовых особенностей изучаемой культуры, что затрудняет технологический процесс массового получения гаплоидных растений, так как связано с ограничением временного интервала изолирования первичного экспланта. С целью разработки более эффективных приемов андрогенеза целесообразно увеличить сроки введения изолированных эксплантов в культуру in vitro за счет включения в работу соцветий не только главного, но и боковых побегов.

В связи с этим был проведен цитологический анализ по определению процентного содержания одноядерных микроспор в бутонах, расположенных в разных рядах от центра главного и боковых соцветий (Табл. 1).

Таблица 1. Содержание микроспор, находящихся на разных стадиях развития в пыльнике в зависимости от места расположения бутона в главном и боковых _соцветиях рапса (гибрид \VFxTnTan), %_

Место расположения бутона от центра соцветия, ряд Стадии развития микроспор

1-2 3-6 7-9

центр соцветия 82,3 (75,7-88,0) * 3,1 (1,0-6,5) 0

1-2 22,4 (15,7-29,1) 75,1 (68,2-82,0) 0

3-4 10,1 (5,9-15,4) 87,5 (81,7-92,3) 0

5-6 0 10,4 (6,1-15,8) 80,7 (74,0-86,6)

>6 0 0 98,8 (96,4-99,9)

* - здесь и далее 95 %-ный доверительный интервал

Как следует из таблицы 1 микроспоры, находящиеся на одноядерной стадии развития, находятся, как правило, в бутонах, расположенных как на главном, так и на боковых соцветиях в рядах от 1 до 4 от его центра. Содержание микроспор в пыльниках в стадии ранней средней одноядерной (3 стадия) до поздней одноядерной (6 стадия) составляет 75,1 - 87,5%. Кроме того, при изолировании бутонов целесообразно учитывать цвет пыльника, который должен иметь окраску светло-зеленого цвета.

В многочисленных исследованиях выявлен ряд факторов, от которых зависит процесс андрогенеза в культуре in vitro, способствующих увеличению доли морфогенных микроспор (Рахимбаев И.Р. и др., 1992, Тюкавин Г.Б., 2007). К этим факторам относятся: макро- и микроэлементы, витамины, компоненты углеводного и азотного питания, регуляторы роста, агар.

В связи с этим целью наших экспериментов было определение оптимального минерального состава питательной среды, оказывающего индуцирующее влияние на процесс формирования эмбриоидов in vitro из

изолированных пыльников и микроспор растений рапса. В работе изучали влияние минеральных солей по прописи МС, В5 и N6 (Рис. 1). В качестве регуляторов роста в состав питательной среды входили ПУК и кинетин в концентрациях 1мг/л, а также сахароза и агар в концентрации 3% и 0,8%, соответственно.

* 20

Hi 15

1 10

3 5

□ каллусогенеэ ■ эмбриогенез

МС В5 N6

Варианты питательных сред

Рис. 1. Зависимость каллусо- и эмбриогенеза пыльников гибрида УУТхТитан от минерального состава питательных сред

В результате исследований установлено, что оптимальной средой для культивирования пыльников была среда, содержащая минеральные соли по прописи Гамборга. В этих условиях микроспоры внутри пыльника сохраняли свою жизнеспособность на протяжении длительного периода выращивания в условиях in vitro, и нами был отмечен процесс прямого эмбриогенеза.

Для понимания закономерностей андрогенеза in vitro важно изучить пути развития микроспор, формирование морфогенных структур и регенерацию растений. Поэтому при культивировании пыльников необходимо учитывать особенности всех тканей, так как наряду с микроспорами в образовании эмбриоидов могут принимать участие и соматические клетки пыльников.

Цитологические исследования показали, что в процессе культивирования пыльников рапса в течение 25 дней на среде В5, содержащей кинетин 1 мг/л и НУК 1 мг/л, наблюдали процесс образования из микроспор сильно вакуолизированных и активно делящихся клеток. В дальнейшем они подвергались многократным симметричным митотическим делениям, что вело к формированию сначала двухклеточных микроспор, а затем многоклеточных структур (Рис. 2 а). Развитие этих структур происходило двумя путями: 1) формирование эмбриоидов, 2) формирование вытянутых клеток и дальнейшая их гибель. Визуально было отмечено, что формирование эмбриоидов происходило лишь в том случае, когда структуры попадали на питательную среду после разрыва оболочки пыльника (Рис. 2 б). В случае, если структуры оставались внутри пыльника, то наблюдали процесс формирования вытянутых клеток, похожий на процесс прорастания пыльцы in vivo (Рис. 2 в,г). Эта способность была характерна только для клеток, которые находились в

периферийной зоне клеточных структур. Такие структуры в дальнейшем не были способны к эмбриогенезу и погибали в процессе культивирования. Таким образом можно предположить, что низкая частота эмбриогенеза в культуре изолированных пыльников связана с незначительным выходом клеточных структур на питательную среду.

При невысокой частоте эмбриогенеза, равной 1%, общее среднее число индуцированных эмбриоидов на один пыльник составило 16-25 шт., причем данный процесс происходил асинхронно (Рис. 3).

В случае культивирования пыльников на средах МС и N6 деление микроспор не было отмечено, наблюдали лишь формирование каллусной ткани из тычиночной нити пыльника, которая не представляла интерес для дальнейших исследований.

Одним из факторов, индуцирующих процесс андрогенеза, являются различные способы предобработки бутонов или соцветий, которые могут переключать развитие микроспор с гаметофитного на спорофитный .путь.

В наших исследованиях использовали 6 вариантов обработки эксплантов (см. материалы и методы исследований), из которых наиболее оптимальной была следующая схема: обработка соцветий раствором нитрата серебра в концентрации 40 мг/л в течение 2 суток при температуре +4-6°С с последующим культивированием изолированных пыльников in vitro при температуре +32°С в течение 1 суток (Табл. 2).

Таблица 2. Влияние различных способов предобработки эксплантов на процесс __андрогенеза_

Количество пыльников

Вариант обработки культивируемых, шт. образующих каллусную ткань, % образующих эмбриоиды, %

1 365 9,6 (6,8-12,8) 0,82 (0,16+2)

2 326 12,9 (9,5-46,8) 1,5 (0,47+3,1)

3 386 2,59 (1,2-4,4) 1,0 (0,25+2,3)

4 350 13,7 (10,3+17,5) 1,4 (0,43+2,9)

5 345 7,3 (4,8+10,3) 1,5 (0,5+3,1)

6 337 14,0 (10,5+17,9) 2,1 (0,84+3,9)

7 контроль (без предобработки) 380 9,2 (6,5+12,3) 1,1 (0,3+2,4)

Как следует из таблицы 2, в варианте № 6 частота андрогенеза составила 2,1%, что примерно в 2 раза выше по сравнению с контрольным вариантом (без обработки). Повышенная морфогенетическая активность изолированных

пыльников и микроспор связана, вероятно, с применением ступенчатой предобработки эксплантов различными температурами, а также нитратом серебра. Разработанный нами методический подход был применен в дальнейших экспериментах.

При культивировании эксплантов, обладающих низким морфогене-тическим потенциалом, актуальным остается поиск эффективных регуляторов роста, повышающих их морфогенную активность. В работе было изучено 30 вариантов питательных сред, отличающихся разными комбинациями цитокининов (БАП, кинетин, 2\?) и ауксинов (ИУК, 2,4-Д, НУК) (Табл. 3).

Таблица 3. Эффективность каллусо- и морфогенеза рапса на питательной среде _ В5 с различным сочетанием регуляторов роста, %_

Дитокинины, мг/л

БАП Кинетин 2!р

2 1 0,5 2 1 0,5 2 1 0,5

| Ауксины, мг/л НУК 1 К*(70,0) 65,3+74,8 К* (85,7) 81,8+89,1 К"(30,8) 26,0+35,6 Э*(1,1) 0,26+2,5 К*(59,6) 54,2+65,0 К"(35,0) 30,1+39,9 Э*(0,7) 0,11+1,8

0,5 К"(45,4) 40,5+50,3 К*(15,5) 12,0+19,4 Э*(2,4) 1,0+4,3 К'(8,6) 5,8+12,0 Э*(0,6) 0,07+1,6 К'(28,0) 23,5+32,5 Э*(0,6) 0,07+1,6

2,4-Д 1 К'(85,6) 81,8+89 К'(74,2) 69,7+78,7 К*(83,9) 79,7+97,7 К*(71,0) 66,3+75,7 К"(92,2) 89,0+94,9 К* (65,4) 60,5+70,4

0,5 К'(25,4) 20,6+30,2 К* (20,7) 16,2+25,2 К*(42,4) 37,2+47,6 К* (36,7) 31,7+41,7 К*(72,4) 67,4+77,4 К'(64,1) 59,1+69,1

ИУК 1 К"(52,7) 17,7+57,7 К"(47,0) 41,7+52,3 К'(42,3) 37,2+47,4

0,5 К* (24,0) 19,8+28,2 Э*(1,2) 0,31+2,6 К* (12,7) 9,4+16,5 Э*(0,2) 0+0,96 К'(32,2) 27,5+36,9 Э*(0,54) 0,04+1,6 К'(9,8) 7,0+13,0 Э*(0,6) 0,07+1,6 К'(21,4) 17,1+25,7 Э*(0,25) 0+1,0 К* (26,0) 21,3+30,7 Э*(1,4) 0,41+3

К - каллусогенез; Э - эмбриогенез

Исследования показали, что оптимальной средой для индукции прямого эмбриогенеза была среда, содержащая кинетин 1 мг/л в сочетании с НУК 0,5 мг/л. В этом варианте частота андрогенеза составила 2,4% со средним числом 11 шт. эмбриоидов на один пыльник.

В дальнейшем сформированные эмбриоиды отделяли от первичного экспланта и переносили на среды, содержащие минеральные соли по прописи МС, а также разные гормоны и концентрации агара: 1) твердая безгормональная среда МС, сахароза - 2 %, агар - 8 г/л; 2) жидкая безгормональная среда МС (с применением фильтровальной бумаги (на мостиках)), сахароза - 2 %, 3) твердая среда МС, сахароза - 2 %, агар - 8 г/л, ИУК -0,5 мг/л, БАП-0,5 мг/л.

Было установлено, что быстрое развитие эмбриоидов в проростки происходило на агаризованной питательной среде, содержащей гормоны, в то время как в жидких условиях культивирования (на мостиках) сначала развивалась корневая система, а затем гипокотильная часть проростка. При длительном культивировании растений в условиях жидкой среды наблюдали спонтанное образование вторичных эмбриоидов, которые формировались из эпидермальных клеточных слоев гипокотиля и семядолей (Рис. 4).

Сформированные вторичные эмбриоиды переносили на индуцирующую среду МС, содержащую сахарозу - 2%, а также БАП - 0,5 мг/л, ИУК -0,5 мг/л. В этих условиях эмбриоиды формировались в проростки, которые в дальнейшем были перенесены на разные питательные среды для размножения. Для этого применяли два способа: 1 - индукция развития существующих в растении меристем (пазушные и апикальные почки), 2 - индукция образования адвентивных почек или эмбриоидов непосредственно тканями экспланта (сегменты семядольных листьев, гипокотиль). В качестве индукторов морфогенеза в питательную среду добавляли вещества из группы цитокининов Ир и БАП в концентрациях 0,5 - 1,5 мг/л, и из группы ауксинов - ИУК -0,5 мг/л (Табл. 4).

Таблица 4. Частота образования эмбриоидов у изолированных гииокотильных

сегментов и сегментов семядольных листьев, %

Экспланты Среды Изолированные гипокотильные сегменты Изолированные сегменты семядольных листьев

частота образования эмбриоидов, % частота образования эмбриоидов, %

Среда МС(0,5 мг/л кинетин) 16,4 (9,9-23,8) 21,6(14,8- -28,4)

Среда МС (1 мг/л кинетин) 20,0 (13,4-26,5) 17,3 (10,5- -25,1)

Среда МС (0,5 мг/л 2ip ) 71,4 (63,4-79,4) 30,0 (20,9- -39,0)

Среда МС (1 мг/л 2ip) 50,0( 43,4-60,6) 56,1 (48,1- -64,3)

Как следует из таблицы 4, оптимальные условия для индукции вторичных эмбриоидов была среда, содержащая минеральные соли по прописи МС в сочетании с 21р в концентрации 0,5-1,0 мг/л. В этом варианте частота эмбриогенеза для изолированных гипокотильных сегментов составила 71,4%, для сегментов семядольных листьев - 56,1%. Среднее число эмбриоидов на один эксплант составило от 7 до 31 шт. (Рис. 5).

Рис. 2. Развитие микроспор и формирование клеточных структур: а - многоклеточные структуры, б - формирование эмбриоидов, в, г -формирование вытянутых клеток, похожих на прорастающую пыльцу in vivo

Рис. 3. Асинхронное формирование эмбриоидов: 1 - глобулярная стадия, 2 - сердцевидная стадия, 3 - стадия Торпедо, 4 - проросток

Рис. 4. Формирование и развитие вторичных соматических эмбриоидов: а - глобулярная стадия на 4 день наблюдений, б - сердцевидная стадия на 8 день наблюдений, в - торпедовидная стадия на 12 день наблюдений, г - формирование проростка на 19 день наблюдений

Рис. 5. Дифференцировка вторичных соматических эмбриоидов: а, б - на изолированных сегментах гипокотиля, в, г - на изолированных сегментах семядольных листьев

Для доказательства гаплоидной природы полученных растений-регенерантов рапса применен метод подсчета количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и числа хромосом в меристеме корня.. Установлено, что количество хлоропластов у гаплоидного растения составило от 10 до 15 шт., в то время как у исходных донорных растений их было от 35 до 45 шт. (Рис. 6 а, б). Уменьшенное количество хлоропластов было также в растениях, полученных из вторичных эмбриоидов. Нами установлено, что у растений-регенерантов содержится одинарный набор хромосом (Рис. 6 в).

Полученные гаплоидные растения рапса были обработаны раствором колхицина, что привело в 50% случаев к формированию фертильных цветков с последующим созреванием семян, в то время как в варианте без обработки колхицином растения были стерильными, и семена не образовывались. Полученные семена были высеяны в почву, из них формировались дигаплоидные растения.

Данная технология отличается от существующих: 1) регламентом предобработки эксплантов; 2) рекомендациями по изолированию бутонов в соответствии с их месторасположением в соцветии; 3) питательными средами, обеспечивающими индукцию образования первичных и вторичных эмбриоидов; 4) технологией адаптации растений-регенерантов к почвенным условиям; 5) технологией получения дигаплоидных растений.

Предложения для использования в селекционной практике

Для получения гаплоидных и дигаплоидных растений рапса в культуре изолированных пыльников и микроспор необходимо:

- проводить предобработку эксплантов по следующей схеме: обработка соцветий раствором нитрата серебра в концентрации 40 мг/л в течение 2 суток при температуре +4-6°С;

- отобрать бутоны, расположенные в средних рядах соцветия (1-4 ряд), учитывая при этом цвет пыльника, который должен иметь светло-зеленую окраску;

- культивировать изолированные пыльники in vitro на среде, содержащей минеральные соли по прописи B5i содержащей кинетин 1 мг/л в сочетании с НУК 0,5 мг/л при температуре +32°С в течение 1 суток, с последующим переносом эксплантов в стандартные условия культивирования (16-часовой фотопериод, температура 25°С, интенсивность освещения 5 тыс. лк);

- для увеличения коэффициента размножения применять питательную среду, содержащую минеральные соли по прописи МС, в сочетании с 2ip в концентрации 1 мг/л и ИУК 0,5 мг/л, сахароза 2%;

- для доказательства гаплоидности полученных растений провести цитологический анализ количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и числа хромосом в клетках меристемы корня;

- адаптацию растений-регенерантов проводить в субстрате торф: дерновая земля в соотношении 1:1 в течение 14 суток;

- для получения дигаплоидных растений провести обработку растений в течение 7 суток 0,5%-ным колхицином в сочетании с 4%-ным раствором диметилсульфоксида путем нанесения раствора на пазушные и верхушечные почки.

Технология получения гаплоидных растений белокочанной капусты (Brassica oleraceae L.J in vitro

Разработанная нами технология получения гаплоидных растений рапса была апробирована на белокочанной капусте. В результате исследований выявлены некоторые особенности технологического процесса андрогенеза. Экспериментально установлено, что микроспоры, находящиеся на одноядерной стадии развития, находятся, как правило, в бутонах, расположенных как на главном, так и на боковых соцветиях на расстоянии 0,5 - 2 см от его верхушки (Табл. 5).

Таблица 5. Развитие микроспор в зависимости от места расположения бутона в

главном и боковых соцветиях белокочанной капусты, %

Место расположения бутона в соцветии, см Стадии развития микроспор

1-2 3-6 7-9

0-0,2 85,1 (78,0+91,0) 10,5 (5,5+16,6) 0

0,2-0,5 65,8 (56,9+74,6) 31,2 (23,9- -38,5) 0

0,5-1 25,8 (17,7+33,9) 66,5 (58,1- -74,9) 0

1-1,5 10,5 (5,8+16,4) 86,5 (80,6- -91,5) 5,6 (2,4+10,1)

1,5-2 0 60,7 (51,6- -69,8) 30,1 (21,7- -38,5)

2-2,5 0 20,2 (12,6- -27,8) 65,7 (57,0- -74,4)

2,5-3 0 8,7 (4,1+14,8) 85,6 (79,4- -90,8)

>3 0 0 95,6 (91,0- -98,6)

В этом положении содержание микроспор в пыльниках в стадии ранней средней одноядерной (3 стадия) до поздней одноядерной (6 стадия) составляет 60,7 - 86,5 %. В остальных бутонах, расположенных либо выше, либо ниже указанного расстояния, микроспоры в основном находились в стадии тетрад или зрелой пыльцы.

В следующей серии экспериментов была апробирована разработанная нами ранее для рапса методика по предобработке соцветий. Изолированные

пыльники культивировали на среде В5, содержащей кинетин в концентрации 1 мг/л и НУК 0,5 мг/л. В этих условиях наблюдали формирование лишь каллусной ткани (Рис. 7 а,б), из которой на среде, содержащей БАП и ИУК в концентрациях 1 мг/л и 0,5 мг/л, соответственно, формировались адвентивные побеги (Рис. 7 в). Частота морфогенеза составила в среднем 25,7%, а среднее число побегов на один каллус - от 2 до 4 шт.

Исходя из того, что при разработке гаплоидной технологии необходимо добиться прямой регенерации растений из культивируемых пыльников и микроспор были проведены исследования по подбору гормонального состава питательных сред (40 вариантов). Для этого были изучены разные комбинации цитокининов (БАП, кинетин, 2ip) и ауксинов (ИУК, НУК). Кроме того, изучали влияние на процесс андрогенеза мало применяемый для растений рода Brassica препарат Дропп.

Исследования показали, что присутствие в питательной среде Дроппа в различных концентрациях (от 0,2 до 1,0 мг/л) в сочетании с НУК 0,05 мг/л стимулировало процесс прямого эмбриогенеза до 8,2% (Рис. 7 г).

Для разных генотипов белокочанной капусты было изучено влияние Дроппа (0,2 - 2,0 мг/л) на процессы прямого эмбриогенеза (Табл. 6). Установлена зависимость этого процесса от генотипических особенностей культивируемых пыльников. Повышенной морфогенетической активностью отличалась линия АМФ ЗЛ, для которой в вариантах с присутствием Дропп 0,2 мг/л учитываемый показатель составил 8,2%, в варианте с Дроппом 0,5 мг/л и 0,1 мг/л - 2,6% и 1,1%, соответственно. При более высоких концентрациях Дроппа в питательной среде процесс эмбриогенеза не был отмечен ни для одного из изучаемых генотипов. Вероятно, повышенные концентрации гормона в питательной среде приводят к изменению метаболических процессов, что вызывает гибель пыльника и микроспор.

Таблица б. Влияние различных концентраций Дроппа в питательной среде на

индукцию прямого эмбриогенеза изолированных пыльников _(во всех вариантах содержание НУК 0,05 мг/л)_

Генотипы Концентрация Д роппя, мг/л

ОД 0,5 1,0 1,5 2,0

Клаус 2,8 (1,3+4,8) 0,6 (0,05-1,7) 0 0 0

Эт1 2,3 (1,0-4,1) 0,8 (0,12-1,9) 0,5 (0,04-1,5) 0 0

АМФЗЛ 8,2 (5,6-11,3) 2,6 (1,2-4,5) 1,1 (0,29-2,4) 0 0

Fi Юбилей 3,2(1,7-5,3) 1,3 (0,42-2,7) 0 0 0

Эмбриоиды, индуцированные на среде с препаратом Дропп, были перенесены на среды для размножения (минеральные соли по прописи МС, Дропп - 0,5 мг/л, ИУК - 0,5 мг/л, сахароза - 2%).

Рис. 6. Доказательство гаплоидной природы растений-регенерантов рапса: хлоропласты в замыкающих клетках устьиц (а - гаплоидные растения, б - диплоидные растения); в - одинарный набор хромосом в меристеме корня гаплоидных растений

Рис. 7. Формирование каллусной ткани из микроспор, находящихся внутри пыльника белокочанной капусты (а, б), индукция образования адвентивных побегов

Рис. 8. Хлоропласты в замыкающих клетках устьиц: а, б - растения-регенеранты, в- исходные растения белокочанной капусты

Для косвенного доказательства гаплоидной природы полученных растений-регенерантов белокочанной капусты применен метод подсчета количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц. Установлено, что количество хлоропластов в клетках устьиц растений-регенерантов в среднем составило 8 - 12 шт., в то время как у исходных донорных растений 18 - 22 шт. (Рис.8).

Культура изолированных неопыленных завязей и семяпочек

В работе в качестве первичного экспланта использовали изолированные семяпочки неопыленных завязей, которые изолировали из цветочных бутонов и культивировали на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи В5, а также цитокинины (кинетин - 0,5 -

1,5 мг/л; БАЛ - 0,5 - 1,5 мг/л; Дропп - 0,2 - 1,5 мг/л) и ауксины (НУК, 2,4-Д и ИУК в концентрациях 0,5 - 1,0 мг/л в различных сочетаниях.

При культивировании семяпочек на разных вариантах сред отмечалось образование либо каллусной ткани, либо формирование эмбриоидов. Эти процессы зависели от гормонального состава питательной среды. Так, присутствие кинетина в концентрации 1 мг/л в сочетании с 2,4-Д 1 мг/л приводило к формированию каллусной ткани из всех клеток семяпочек, а на среде с Дроппом 1,0 мг/л и ИУК 0,5 мг/л - эмбриоидов. В остальных вариантах отмечалось незначительное увеличение размера семяпочек, клетки которых в дальнейшем некротизировались, что приводило к полной гибели первичного экспланта.

Таким образом, был установлен регламент получения гаплоидных растений белокочанной капусты путем андрогенеза и гиногенеза.

Предложения для использования в селекционной практике

Для получения гаплоидных растений белокочанной капусты в культуре изолированных пыльников, микроспор и семяпочек необходимо:

- провести предобработку эксплантов по следующей схеме: обработка соцветий раствором нитрата серебра в концентрации 40 мг/л в течение 2 суток при температуре +4-6°С;

- отобрать бутоны с главного и боковых соцветий, расположенных на расстоянии от 0,5 до 2 см от верхушки соцветия;

- культивировать изолированные пыльники (светло-зеленого цвета) ш vitro на среде, содержащей минеральные соли по прописи В5, Дропп - 0,2 мг/л, НУК - 0,05 мг/л, а изолированные семяпочки - на среде В5, Дропп - 1,0 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л при температуре +32°С в течение 1 суток с последующим переносом эксплантов в стандартные условия культивирования (16-часовой фотопериод, температура 25°С, интенсивность освещения 5 тыс. лк);

- для увеличения коэффициента размножения применять питательную среду, содержащую минеральные соли по прописи МС в сочетании с препаратом Дропп - 0,5 мг/л, ИУК - 0,5 мг/л, сахароза - 2%;

- для доказательства полученных гаплоидных растений проводить цитологический анализ по количеству хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и числа хромосом в клетках меристемы корня.

Идентификация гена устойчивости растений рапса к вирусу желтухи репы (Turnip yellow virus - TuYV)

Рапс поражается несколькими вирусными заболеваниями, из которых наиболее вредоносным является вирус желтухи репы (Turnip yellow virus • TuYV), который широко распространен во всем мире, и потери урожая от этой

болезни составляют, например, в Германии от 12 до 34%, а в Австралии от 37-до 46% (Monique Juergens, Claudia paetsch et al., 2009).

Исходя из выше изложенного, представляют определенный интерес исследования по выявлению растений, содержащих фрагмент ДНК, отвечающий за устойчивость растений к этому вирусу. Для этого применяют современные методы молекулярного маркирования, например, ПЦР-анализ.

Известно, что важным этапом в этой методике является правильный подбор праймера. Ранее немецкие ученые (Monique Juergens, Claudia Paetsch et al., 2009) на растениях рапса экспериментально подобрали 2 праймера, которые идентифицировали фрагмент ДНК, отвечающий за устойчивость растений к вирусу TuYV. Эти праймеры и были нами взяты для работы и проверены на разных сортах и линиях рапса (Рис. 9). Праймер «344» идентифицирует фрагмент ДНК в областях 344 п.н. (устойчивый генотип) или в области 385 п.н. (восприимчивый генотип), а праймер «437» - в областях 437 п.н. (устойчивый генотип) или в области 376 п.н. (восприимчивый генотип).

Установлено, что в ДНК линий Титан 10, Лимегрин 2, Галиция 1 (Рис. 9), присутствует фрагмент, отвечающий за устойчивость растений к вирусу желтухи. Поэтому данные генотипы можно рекомендовать для включения в селекционный процесс при подборе родительских пар с целью создания сортов, устойчивых к данному вирусу.

4Q0S

зооа

100

2 3 4 5 6 7 8

¿>нс. 1> Эдекчрофорегримлаш продувши ПТ{Р с использованием праймера « 1 I ''>> 1 - сортСсребрянин, 2 - линия Посейдон, Я - питип Титан I О, Л - линия Лимегрин 1, Ч - Маркер I 00-3000 bp, fi - .пинта Галиция 1,7- линия Кобра 2, S - линия Циклон 2,9- сорт Ханна

"ОО 300

200Ц 1001

3 4

Рис. 10 О лектрофореграляиы продуктов TTTtP с использованием праймера «34-1»:

1 - Маркер 100-3000 Ьр, 2 - линия WF, 3 - линия Титан, 4 - гибрид WT хТитан

Рис. 11 Электрофореграммы продуктов ПЦР:

1 - тилонд «WF хТн'ти», ириммер 344,

2 - гаплоид «WF хТитан», праймер 437,

3 - Маркер 100-3000

Ьр, 4 - дигагт.поид tvWF хТитан», прнПмер 437, 5 - дигаплоид «WF хТитан», праймер 344

Исходя из полученных данных, праймер «344» был апробирован на гибриде WFxTmaH, который ранее использовался нами в работе по получению гомозиготных линий и его родительских форм (WF и Титан) (Рис. 10). Как видно из рисунка 10, у гибрида WFxTnTan обнаружены два фрагмента длиной 344 п.н. и 385 п.н., которые наследовались от родительских форм при скрещивании.

При анализе ДНК гаплоидных и дигаплоидных растений рапса, полученных in vitro из этого гибрида, присутствовал только один фрагмент длиной 385 п.н. (Рис. 11), что свидетельствует о восприимчивости этих растений к вирусу желтухи репы.

Выводы

1. Совершенствована технология и получены гаплоидные и дигаплоидные растений рапса (Brassica napus L.) и белокочанной капусты (Brassica oleracea L.) путем прямого эмбриогенеза из микроспор изолированных пыльников. Для белокочанной капусты оптимизирован первый этап получения растений-регенерантов из семяпочек изолированных завязей.

2. Установлена зависимость стадии развития микроспор в пыльниках (одноядерная стадия развития) от расположения бутонов в главном и боковых соцветиях: для рапса целесообразно изолировать бутоны, расположенные в средних рядах соцветия (1-4 ряд), для белокочанной капусты - с главного и боковых соцветий, расположенных на расстоянии от 0,5 до 2 см от его верхушки соцветия.

3. Предложена схема, обеспечивающая индукцию прямого эмбриогенеза из изолированных пыльников и микроспор, сочетающая совместное применение предобработки соцветий пониженными (+4-6°С в течение 2 суток) и повышенными (+32°С в течение 1 суток) температурами и обработку соцветий нитратом серебра в концентрации 40 мг/л.

4. Установлены оптимальные составы питательных сред для индукции прямого эмбриогенеза в культуре изолированных пыльников: для рапса -минеральные соли по прописи В5, кинетин - 1 мг/л, НУК - 0,5 мг/л (частота эмбриогенеза - 2,4%); для белокочанной капусты - минеральные соли по прописи В5, Дропп - 0,2 мг/л, НУК - 0,05 мг/л (частота эмбриогенеза - до 8,2%); для изолированных семяпочек белокочанной капусты - минеральные соли по прописи В5, Дропп -1,0 мг/л, ИУК - 0,5 мг/л (частотаэмбриогенеза-1,1%).

5. Показано, что при культивировании сегментов гипокотиля и семядолей гаплоидных растений рапса на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи MC в сочетании с 2ip - 1 мг/л, ИУК - 0,5 мг/л и сахароза - 2%, процесс дифференциации вторичных эмбриоидов происходит из эпидермальных

клеточных слоев изолированных эксплантов.

6. Установлено положительное влияние торфо-дернового субстрата (в соотношении 1:1) на адаптацию растений-регенерантов рапса к условиям in vivo.

7. Установлено, что обработка гаплоидных растений рапса 0,5%-ным колхицином в сочетании с 4%-ным диметилсульфоксидом в течение 7 суток путем нанесения раствора на пазушные и верхушечные почки приводит к формированию фертильных цветков с последующим созреванием семян.

8. Использование праймеров «344» и «437» при проведении ПЦР-анализа позволило определить участки генов, отвечающих за устойчивость растений рапса к вирусу желтухи репы (Turnip yellow virus - TuYV). Выявлены три линии (Титан 10, Лимегрин 2, Галиция 1), которые можно рекомендовать для включения их в селекционный процесс при подборе родительских пар с целью создания сортов, устойчивых к данному вирусу.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Май Дык Чунг, Калашникова Е.А. Влияние пиридоксина на морфогенез изолированных пыльников растений различных видов Brassica II Материалы Международной научно-практической конференции, 2008 г. Саратов, 2008. -С. 150-151.

2. Май Дык Чунг, Калашникова Е.А. Экспериментальный морфогенез в культуре изолированных пыльников растений различных видов Brassica // Материалы Международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии», 2008. Брянск, 2008. - С. 39 - 42.

3. Май Дык Чунг, Калашникова Е.А. Создание гаплоидных растений рапса (Brassica napus) in vitro II Материалы V Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы нанобиотехнологии и инноваций с нетрадиционными ресурсами и создания функциональных продуктов», 2009. М., 2009. - С. 73-75.

4. Май Дык Чунг, Калашникова Е.А. Содержание фенольных соединений в репродуктивных органах растений различных видов Brassica // Материалы VII Международного симпозиума по фенольным соединениям «Фундаментальные и прикладные аспекты», 2009. М., 2009. - С. 157-258.

5. Май Дык Чунг Оптимизация и совершенствование технологии получения гаплоидных растений различных видов Brassica in vitro // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Научная инициатива иностранных студентов и аспирантов российских вузов», 2010. Томск, 2010. -С. 295-300.

6. Калашникова Е.А., Май Дык Чунг Технология получения гаплоидных растений вида Brassica в условиях in vitro методом андрогенеза // Докл. ТСХА / Рос. гос. аграр. ун-т - МСХА им. К.А. Тимирязева. Москва, 2010; Вып. 282.-С. 272-275.

7. Май Дык Чунг Экспериментальный андрогенез белокочанной капусты (Brassica oleráceo) И Материалы Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию Академии имени К.А. Тимирязева, 2010. М., 2010. - С. 64 - 67.

8. Май Дык Чунг, Калашникова Е.А. Гаплоидные технологии in vitro в селекции растений // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира», 2010. Волгоград, 2010. - С. 85 - 89.

9. Май Дык Чунг, Калашникова Е.А. Разработка и усовершенствование технологии создания гаплоидных форм растений различных видов рода Brassica // Материалы X молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, живодноводстве и ветеринарии», 2010. М., 2010. - С. 31 -32.

Ю.Май Дык Чунг, Калашникова Е.А., Соловьев A.A. Технология получения гаплоидных растений рапса (Brassica napus) in vitro // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2010, № 1. - С. 86-91.

Н.Калашникова Е.А., Май Дык Чунг. Андрогенез и получение in vitro гаплоидных растений Brassica napus // Материалы II Международной конгресс-партнеринг и выставка по биотехнологии и биоэнергетике, 2010. М„ 2010.-С. 86-87.

12.Калашникова Е.А., Май Дык Чунг Получение гаплоидных растений белокочанной капусты // Картофель и овощи, 2010, № 8. - С. 26.

1 З.Калашникова Е.А., Соловьев A.A., Май Дык Чунг, Нгуен Тхань Хай. Применение гаплоидных технологий in vitro в селекции растений вида Brassica И Материалы Международной конференции «Достижения и перспективы земледелия, селекции и биологии сельскохозяйственных культур», Казахстан, Алмалыбак, 2010. - С. 127 -128.

14.Калашникова Е.А., Май Дык Чунг, Соловьев A.A., Шевелуха B.C. Технология получения дигаплоидных растений рода Brassica in vitro // Доклады Россельхозакадемии, 2011, № 1. - С. 15-18. (в печати)

Подписано к печати 18.11.2010 Формат 60x84/16. Печать трафаретная Усл.-печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ №570

Отпечатано в издательском центре

ФГОУ ВПО МГАУ

127550, Москва, Тимирязевская, 58

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Май Дык Чунг

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Значение гаплоидии в селекции растений.

1.2. Методы создания гаплоидных растений.

1.3. Факторы, влияющие на получение гаплоидных растений in vitro.

1.4. Создание гаплоидных растений различных видов Brassica.

ГЛАВА IL ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Условия культивирования изолированных эксгшантов.

2.2.2. Цитологические исследования.

2.2.3. ПЦР - анализ растений рапса.

2.2.4. Статическая обработка результатов исследований.

ГЛАВА III. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДИГАПЛОИДНЫХ

РАСТЕНИЙ РАПСА (BRASSICA NAPUS) IN VITRO.

3.1. Строение пыльника некоторых видов Brassica.

3.2. Пути развития микроспор in vitro.

3.3. Влияние стадии развития микроспора и расположения бутонов в соцветии на процесс морфогенеза растений рапса.

3.4. Зависимость морфогенеза от состава и консистенции питательной среды.

3.5. Влияние различных методов предобработки соцветий и изолированных эксплантов на морфогенез.

3.6. Влияние гормонального состава питательной среды на процесс андрогенеза.

3.7. Формирование из эмбриоидов проростков и их дальнейшее клонирование.

3.8. Доказательство гаплоидной природы растений-регенерантов рапса.

3.9. Адаптация растений-регенерантов in vivo и их колхицинирование.

3.10. Предложения для использования в селекционной практике.

ГЛАВА IV. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ БЕЛОКОЧАННОЙ КАПУСТЫ {BRASSICA OLERACEAE L.) IN VITRO.

4.1. Культура изолированных пыльников и микроспор.

4.2. Культура изолированных неопыленных завязей и семяпочек.

4.3. Предложения для использования в селекционной практике.

ГЛАВА V. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНА УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ РАПСА К ВИРУСУ ЖЕЛТУХИ РЕПЫ (TURNIP

YELLOW VIRUS - TUYV).

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование технологии получения гаплоидных и дигаплоидных растений рапса (Brassica napus L.) и белокочанной капусты (Brassica oleracea L.) in vitro"

Важным направлением в современной селекции является создание улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйственных растений, обладающих единичной, групповой или комплексной устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессовым факторам среды при сохранении и повышении их продуктивности и качества. Рациональное сочетание методов классической селекции с биотехнологическими методами позволяет решать поставленные задачи в более короткий срок.

Использование методов клеточной и тканевой биотехнологии в селекции, облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс создания новых форм и сортов растений. Одним из таких методов является метод, направленный на получение гаплоидных растений in vitro, позволяющий быстро создавать генетически стабильные гомозиготные линии. Обычно для индукции процессов гаплоидии используют традиционные методы - отдаленную гибридизацию, обработку фитогормонами, создание стрессовых условий и др. Однако данные приемы трудоемки, требуют много времени и неэффективны вследствие низкого коэффициента выхода гаплоидных растений (Пыльнев В.В., Коновалов Ю.Б., Хупацария Т.И., 2005).

Метод культуры изолированных пыльников и микроспор - один из перспективных способов получения гаплоидных растений. Культура микроспор и пыльцы является удобным экспериментальным объектом для фундаментальных исследований, касающихся регенерации в одноклеточных системах. Кроме того, правильный подбор условий культивирования, обеспечивающих дифференцировку эмбриоидов из репродуктивных органов (микроспоры и семяпочки) и сравнение этого процесса с процессом формирования соматических и зиготических зародышей является предметом биохимических и морфологических исследований, а также опытов по изучению молекулярных механизмов, специфичных для эмбриогенеза.

Получение растения из микроспор в культуре изолированных пыльников является наиболее распространенным методом создания гомозиготных линий у многих видов Brassica. Однако этот процесс зависит от ряда взаимосвязанных факторов, каждый из которых оказывает свое влияние на морфогенетические процессы при культивировании изолированных пыльников и микроспор in vitro. Для некоторых культур показано, что эмбриогенез зависит от генетических, физиологических причин, стадии развития бутона и микроспор, а также факторов внешней среды, в частности, состава питательной среды (минеральный и гормональный состав) и условий культивирования (жидкие, твердые питательные среды, световой и температурные режимы) (Ball S.T. et al., 1992; Cathrine L., Magnor H., 1988). Кроме того, этот процесс зависит и от процентного содержания микроспор, находящихся на оптимальной стадии развития для индукции пыльцевого эмбриогенеза в момент инокуляции пыльника. Результаты исследований показали, что до сих пор эмбриогенез в культуре пыльников in vitro различных видов Brassica происходит спонтанно и имеет низкую частоту выхода гаплоидных растений (1-4%), а также предлагаемые технологии трудно воспроизводимы и недостаточно изучены на каждом этапе андрогенеза. Кроме того, технология получения растений-регенерантов различных видов Brassica из изолированных семяпочек (процесс гиногенеза) в доступной для нас литературе не изучена. Поэтому данное направление исследований является актуальным.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка регламента получения растений-регенерантов рапса (В. napus L.) и белокочанной капусты (В. oleracea L.) из репродуктивных органов путем прямого эмбриогенеза; совершенствование технологии получения гаплоидных и дигаплоидных растений.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• Исследовать влияние предобработки соцветий и установить оптимальные режимы воздействия на процесс прямого эмбриогенеза;

• Изучить влияние различных питательных сред на морфогенез репродуктивных органов различных видов Brassica',

• Изучить процесс формирования первичных и вторичных эмбриоидов, а также адвентивных почек при размножении в культуре in vitro различных видов Brassica-,

• Провести цитологические исследования гаплоидных и дигаплоидных растений;

• Усовершенствовать экспресс-метод по идентификации последовательности гомологичных генов, отвечающих за устойчивость растений рапса к вирусу желтухи репы {Turnipyellow virus - TuYV). Научная новизна. Совершенствована технология получения гаплоидных и дигаплоидных растений рапса и белокочанной капусты путем прямого эмбриогенеза из микроспор изолированных пыльников.

Впервые для белокочанной капусты оптимизирован первый этап получения растений-регенерантов из семяпочек изолированных завязей. Установлена оптимальная стадия развития микроспор в пыльниках в зависимости от расположения бутонов в соцветии и изучены этапы развития микроспор внутри пыльника в условиях in vitro. Предложена схема комплексной предобработки соцветий пониженными в течение 2-х суток) и повышенными (+32°С в течение 1-х суток) температурами в сочетании с обработкой соцветий нитратом серебра (40 мг/л), обеспечивающая индукцию прямого эмбриогенеза.

Установлены оптимальные составы питательных сред для индукции прямого эмбриогенеза в культуре изолированных пыльников: для рапса

- минеральные соли по прописи В5з кинетин 1 мг/л, НУК 0,5 мг/л; для белокочанной капусты - минеральные соли по прописи В5, Дропп 0,2 мг/л, НУК 0,05 мг/л; для изолированных семяпочек белокочанной капусты

- минеральные соли по прописи В5, Дропп 1,0 мг/л, ИУК 0,5 мг/л.

Практическая значимость работы. Полученные гаплоидные и дигаплоидные растения рапса переданы на Селекционную станцию им. H.H. Тимофеева РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Разработанная методика создания дигаплоидных растений рапса и гаплоидных растений белокочанной капусты может быть применена и к другим представителям рода Brassica. Полученные результаты используются в учебном процессе при чтении лекций и проведения лабораторно-практических работ по курсу «Сельскохозяйственная биотехнология» и «Основы биотехнологии».

2-м Международном конгрессе-партнеринге по биотехнологии и биоэнергетике (Москва, 2010), 10-й молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2010),

3-й Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2010), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА (Москва, 2010), 5-ом Всероссийском смотре научных и творческих работ иностранных студентов и аспирантов вузов (Томск, 2010), Международной конференции «Достижения и перспективы земледелия, селекции и биологии сельскохозяйственных культур» (Казахстан, Алмалыбак, 2010).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Май Дык Чунг

ВЫВОДЫ

1. Совершенствована технология и получены гаплоидные и дигаплоидные растений рапса {Brassica napus L.) и белокочанной капусты {Brassica oleracea L.) путем прямого эмбриогенеза из микроспор изолированных пыльников. Для белокочанной капусты оптимизирован первый этап получения растений-регенерантов из семяпочек изолированных завязей.

4. Установлены оптимальные составы питательных сред для индукции прямого эмбриогенеза в культуре изолированных пыльников: для рапса -минеральные соли по прописи В5, кинетин - 1 мг/л, НУК - 0,5 мг/л (частота эмбриогенеза — 2,4%); для белокочанной капусты - минеральные соли по прописи В5, Дропп - 0,2 мг/л, НУК - 0,05 мг/л (частота эмбриогенеза - до 8,2%); для изолированных семяпочек белокочанной капусты - минеральные соли по прописи В5, Дропп - 1,0 мг/л, ИУК - 0,5 мг/л (частота эмбриогенеза - 1,1%).

5. Показано, что при культивировании сегментов гипокотиля и семядолей гаплоидных растений рапса на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи MC в сочетании с 2ip - 1 мг/л, ИУК - 0,5 мг/л и сахароза -2%, процесс дифференциации вторичных эмбриоидов происходит из эпидермальных клеточных слоев изолированных эксплантов.

8. Использование праймеров «344» и «437» при проведении ПЦР-анализа позволило определить участки генов, отвечающих за устойчивость растений рапса к вирусу желтухи репы {Turnip yellow virus - TuYV). Выявлены три линии (Титан 10, Лимегрин 2, Галиция 1), которые можно рекомендовать для включения их в селекционный процесс при подборе родительских пар с целью создания сортов, устойчивых к данному вирусу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Май Дык Чунг, Москва

1. Анапияев Б.Б. / Культура микроспор и гаплоидная биотехнология пшеницы // Монография (Ред. Рахимбаев И.Р). Алматы, 2001. - 220с.

2. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: Институт цитологии и генетики СО РАН, 1993. - 241с.

3. Ахатов А.К., Джалилов Ф.С., Белошагасина О.О. и др. Защита овощных кулыур и картофеля от болезней. — М., 2006. 352с.

4. Бельская Г.Б., Семашко Т.В. / Получение гаплоидов белокочанной капусты с помощью культуры пыльников для создания гетерозисных гибридов интенсивного типа // Проблемы селекции овощных культур, Минск, 1997.-С. 17-20.

5. Бобков C.B. / Влияние температурного стресса на эффективность каллусогенеза в культуре пыльников проса и гороха // 3-й Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва, 2005. - С. 231.

6. Бунин М.С., Шмыкова H.A. и др. Методы репродуктивной биологии в репродуктивной селекции культур рода Brassica L. МСХРФ. М., 2003.-61с.

7. Бутенко Р.Г. / Создание гаплоидов и гомозиготных дигаплоидных линий методами in vitro // В кн.: Основы сельскохозяйственной биотехнологии, (под ред. Г.С. Муромцева) М.: Агропромиздат, 1990. -С. 179-187.

8. Внучкова В.А., Чеботарева Т.М., Глущенко Г.И. / Получение гаплоидов из пыльников тритикале и фертильного семенного потомства от них // Сельскохозяйственная биотехнология. 1983. №5.-С. 20-24.

9. Гришина Е.В., Зайцева М.И. / Получение гаплоидов у кукурузы при воздействии химическими мутагенами и физиологически активными веществами // Апомиксис и цитоэмбриология растений. Саратов, 1968.-С. 65-68.

10. Гурецка, К. Получение гомозиготных линий капусты белокочанной (Brasica oleracea L, var capitata L.) через культуру пыльников -Скерневицы, 1998. — 71с.

11. Давыдова H.H. Усовершенствование метода культуры пыльников для использования в селекционном процессе капусты (Brassica oleracea L.): Автореф. . канд-т биол. наук. М.: 2008. - 25 с.

12. Домблидес, Е.А., Шмыкова H.A. / Развитие пыльников капусты брокколи in vivo и при культивировании in vitro // Сб. науч. труд. Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур. 2002. - Выпуск 37. -С. 82-92.

13. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статиетическойобработки результатов исследований). 5-е изд., доп. и перераб. М.: Агропромиздат, 1985.- 351 с.

14. Жамбакин, К.Ж. Гаплоидная биотехнология растений. Алматы, 2004.-186с.

15. Ивановская Е.В. Цитоэмбриологическое исследование дифференцировки клеток растений. — М.: Изд-во Моск. гос. ун-та, 1983. — 152 с.

16. П.Калашникова Е.А. Клеточная инженерия растений: Курс лекций. М.: Изд-во РГАУ МСХА имени К.А. Тимирязева, 2009. - 94 с.

17. Калашникова, Е.А., Кочиева Е.З., Миронова О.Ю. Практикум rio сельскохозяйственной биотехнологии. М.: КолосС, 2006. - 144 с.

18. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наук, дума, 1980. 488с.

19. Карпеченко Г.Д. / Экспериментальная полиплоидия и гаплоидия // Теоретические основы селекции растений. Т. 1. Л.: Сельхозгиз, 1935. — С. 397-434.

20. КошКин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур.-М.: 2010.-638 с.

21. Кучко A.A., Маруненко И.М. Методические указания по получению андрогенетических дигаплоидов картофеля. Киев: Институт ботаники АН УССР. - 1987. -27с.

22. Лаврова Н.В. Технологические аспекты создания андрогеппых гаплоидов озимой мягкой пшеницы. М.: РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2006. - 124с.

23. Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. / Методы гаплоидии в селекции зерновых культур // Сельскохозяйственная биология, 1983. № 5. - С. 8-15.

24. Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Получение гаплоидов ячменя с помощью гаплопродгосеров. Методические рекомендации. Одесса, 1988.

25. Малышенко С. И., Тюлькина Л.Г., Зверева С.Д. и Ралдугина Г.Н. / Получение трансгенных растений Brassica campestris, экспрсссирующих ген gfp. II Физиология растений. 2003. Т. 50. № 2. С. 309-315.

26. Маруненко И.М. / Получение дигагшоидов методом андрогенеза // Создание исходного материала в селекции картофеля. Киев. 1992 (1993). - С. 29-38.

27. Модяева Т.В. / Получение регенерантов капусты белокочанной методом андрогенеза // Молодые ученые интенсификации сельского хозяйства: Тез. док. науч.-практ. конф., 1990. С. 90-91.

28. Муравлёв А. А. Культура пыльников в селекции ярового рапса : Автореф. канд-т биол. наук. — Саратов, 2007. 29с.

29. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т. И., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М.: Агропромиздат, 1990.

30. Нам И.Я. / Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнолониях in vitro // Автореф. дис. докт. биол. наук. -М.: 2004. -42с.

31. Неттевич Э.Д., Молчанова JI.M., Пухальский В.А., Смолин В.П., Денисова JI.B., Внучкова В.А. / Гаплоидия как метод создания исходного материала в селекции // Вестник с.-х. науки. 1989 - № 7. - С. 93-99.

32. Ницше В., Венцель Г. Гаплоиды в селекции растений / Пер. с англ. Попова B.B. М.: Колос, 1980. 127 с.

33. Павлова М.К. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек: возможности и перспективы (обзор) // С.-х. биология. 1987. № 1. - С. 27-35.

34. Павловская Н.Е., Голышкин JI.B., Голышкина JI.B. и др. Ввдение в сельскохозяйственную биотехнологию. Орел: изд-во ОГСХА, 1998. -132с.

35. Поляков A.B. Биотехнология в селекции льна: Монография,- Издание второе. -Москва, 2009. -128 с.

36. Пухальский В.А., Соловьев A.A., Юрцев В.Н. Цитология и цитогенетика растений. М.: Издат-во МСХА, 2004. - 118 с.

37. Пыльнев В.В., Коновалов Ю.Б., Хупацария Т.И. Частная селекция полевых культур: Учебник для вузов. — М. : Колосс, 2005. 552 с.

38. Ралдугина Г.Н., Соболкова Г.И. / Факторы, влияющие на органогенез у семядольных эксплантов рапса // Физиология растений. 1995. т. 42. С. 916-922.

39. Ралдугина Г.Н., Соболкова Г.И. Генотипические различия при действии абсцизовой кислоты на каллусные культуры Brassica napus L. // Физиология растений. 1994. Т. 41. № 5. С. 702-706.

40. Рахимбаев И.Р. / Культура репродуктивных клеток и гаплоидная биотехнология генетического улучшения растений // Биотехнология. Теория и практика. 1997. - № 3. - С. 8-10.

41. Рахимбаев И.Р. / Экспериментальная гаплоидия в культуре пыльников и микроспор зерновых злаков // Сельскохозяйственная биология, 1990.-№3. С. 44-45.

42. Рахимбаев И.Р., Мухамбетжанов С.К., Ережепов А.Е. / Проблемы экспериментальной гаплоидии в культуре женского гаметофита // Известия HAH PK. Серия биологическая. 1994. - № 4. - С. 15-22.

43. Резникова С.А. / Закономерности клеточной дифференцировки при микроспоро- и гаметогении // Автореф. . д-ра биол. наук. М.: 1975. -46 с.

44. Резникова С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника. М.: "Наука". 1984. - 272с.

45. Сандухадзе Б. И., Рыбакова М. И., Морозова 3. А. Научные основы селекции озимой пшеницы в Нечерноземной зоне России. М.: МГИУ, 2003. -426с.

46. Сандухадзе Б.И., Кочетыгов Г.В., Рыбакова М.И., Бугрова В.В. / Роль адаптивной интенсификации земледелия в повышении эффективностиаграрного производства // Международная научная конференция. -Жодино, 1998. Т. 2. - С. 164.

47. Семова Н.Ю. / Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений белокочанной капусты с использованием культуры пыльников // Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: 1992. - 17с.

48. Семова Н.Ю., Ушакова JI.A. / Андрогенез in vitro и получение гаплоидных растений белокочанной капусты с помощью культуры пыльников // Докл. ВАСХНИЛ. 1993. - С. 168.

49. Смиряев А.В, Кильчевский A.B. Генетика популяций и количественных признаков. М.: «КолосС», 2007. - 272 с.

50. Суханов В.М. / Андроклиния и ее особенности у пшеницы// Автореф. . канд. биол. наук: М.: ИОГен, 1984. 25с.

51. Суханов В.М., Тырнов B.C. / Получение гаплоидов in vitro из гаметических клеток // Гаплоидия и селекция. -М.: Наука, 1976. - С. 99100.

52. Тарасенко Н.Д., Скворцов Е.П., Лаптев Ю. Я. / Гаплоидия картофеля // Генетика картофеля. -М.: Наука, 1973. С. 140-156.

53. Тивари Ш. Морфогенез в культуре пыльников и изолированных микроспор ячменя. Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: -1989. 24 с.

54. Тиссера Б. Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений. Биотехнология растений: культура клеток: Пер. с англ. М.: Агропромиздат, 1989. - С. 97-127.

55. Тырнов B.C., Алаторцева Т.А. / Культура завязей кукурузы in vitro как модельная система для изучения партеногенеза // Генетика развития: Тез. докл. 2 Всесоюзн. совещ. 29-31 августа 1990. Ташкент.: 1990. Т.14. 2: С. 164-166.

56. Тырнов B.C., Хохлов С.С. / Андрогенез // Гаплоидия и селекция. -М.: Наука, 1976.-С. 87-99.

57. Тюкавин Г.Б. Основы биотехнологии моркови: Монография. ВНИИССОК. -М.: 2007. 480 с.

58. Харченко П.Н., Шкловский В. И. / Использование метода культуры пыльников в ускорении селекционного процесса // Доклады ВАСХНИЛ, 1982.-№9. С. 24-25.

59. Хотылева Л.В., Ермишин А.П., Воронкова Е.В. / Способы повышения частоты каллусообразования в культуре пыльников картофеля // Международная конф. «Биотехнология культивируемых клеток и биотехнология». Тез. Докл. Новосибирск, - 1988. - С. 223.

60. Хохлов С.С., Тырнов B.C. Гаплоидия и селекция. М.: Наука, - 1976. - С. 99- 105.

61. Чистякова В.Н. Гаплоиды неполных пшенично-пырейных амфидиплоидов, мягкой пшеницы и ячменя: получение и использование. М. МАКС Пресс, 2000. 355 с.

62. Шерер Н.В. / Влияние условии выращивания донорных растений пшеницы на эффективность пыльниковой гаплопродукции // Материалы научной конференции, по с-х. биотехнологии.- Целиноград. 1991. - С. 57.

63. Шамина З.Б. / Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. - С. 124136.

64. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Кочиева Е.З. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М.: Высш.шк., 2008. 710с.

65. Шевченко С. В. Спорогенная ткань. В кн.: Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепция под ред. Батыгиной Т.Б. СПБ.: «Мир и семья». 1994. - Т. 1. - 69 с.

66. Шкаликов В.А, Белошапкина О.О. Защита растений от болезней. — М.: КолосС, 2004.-255 с.

67. Шмыкова Н.А. / Разработка системы биотехнологических методов, направленных на укоренение селекционного процесса овощных культур // Автореф. дис. докт. с.-х. наук. /ВНИИССОК М.: 2006. - 20 с.

68. Ао G.M., Zhao S.X., Li G.H. / Induction of haploid plantlets from unpollinated maize ovaries in vitro // Acta Genetica Sinica. 1982. - V. 9. -№ 4. - P. 281-283.

69. Arnison P.F., Donaldson P., Jackson A., Sempel C., Keller W. / Genotypespecific response of cultured broccoli anther to cytokinins // Plant Gell, Tissue and Organ Culture 1990. - № 3. - P. 217-222.

70. Aslatfr-E.N., MacDonald M.V., Ingram D.S. / Rapid-cycling Brassica species:anther culture potential of B. campestris L. and B. napus L. // New Phytol. -1990.-V. 115. № l.-P. 1-9.

71. Bajaj Y.P.S. / In vitro production of haploids // Handbook of plant cell culture: Techniques for propagation and breeding (Eds D.A. Evans) New York, London: Macmillam, 1983. V. 1. - P. 228-287.

72. Bajaj Y.P.S. / The regeneration of plants from frozen pollen embryos and zygotic embryos of wheat and rice // Theor Appl Genet. 1984.- V. 67.-P. 525-528.

73. Bajaj'Y.P.S., Gasol S.S. / Biotechnology of wheat improvement // Crop. L., 1986.-V.2.-P.3-38.

74. Ball S.T., Zhou H., Konzak C.F. / Sucrose concentration and its relationship to anther culture in wheat // Crop Science. 1992.-V. 32. P. 149-154.

75. Batty N., Dunwell J. / Effect of maltose on the response of potato anthers inculture // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1989. - V. 18. - P. 221-226.

76. Bhattacharya N.M., Sen S.K. / Production of plantlets through somaticembryo-genesis in Brassica campestris. // Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie, 1980.-V. 99.-P. 357-361.

77. Biddington N.L., Robinson H.T. / Variation in response to high temperaturetreatmens in anther culture of Brussels sprouts // Plant Cell, Tissue and Organ Culture 22, 1990. P. 48-54.

78. Blaydes D.F. / Interaction of kinetin and various inhibitors in thegrowth ofsoybean // Physiol. Plant. 1966. - V. 19. - № 3. - P. 748-753.

79. Bossoutrot D., Hosemans D. / Gynogenesis in Beta vulgaris L.: From In Vitro

80. Culture of Unpollinated Ovules to the Production of Doubled Haploid Plants in Soil // Plant Cell Rep. 1985. V. 4. - P. 300-303.

81. Breukelen E.W., Gamonna M.S., Hermsen L.G. / The parthenogeneticmonohaploids // Euphytica. 1977. V. 26. - № 2. - P. 263-274.

82. Bullock P., Baenziger P.S. / Anther culture of wheat Triticum aestivum L. F-lsand their reciprocal crosses // Theor.Appl.Genet., 1982. - V. 62. - P. 155159.

83. Campion В., Alloni C. / Induction of Haploid Plants in Onion (Allium сера L.) by In Vitro Culture of Unpollinated Ovules // Plant Cell, Tissue Organ Cult. 1990.-V. 20.-P. 1-6.

84. Campos F.F., Morgan D.T. / Genetic control of haploidy in Capsicum frutescens L. following crosses with untreated and x-rayed pollen // Cytologia. I960.- V. 25. - № 3-4. - P. 362-372.

85. Cao M.Q., Chariot F., Dore C.C. / Embryogenese et regeneration de plantes de choucroute (Brassica oleracea L. ssp. Capitata) par culture in vitro de microspores isolees // R. Acad. Sei. Paris, 1990. T. 310. V 3. - P. 203-209.

86. Cappadocia M., Chretien L., Laublin G. / Production of Haploids in Gerbera jamesonii via Ovule Culture: Influence of Fall versus Spring Sampling on Callus Formation and Shoot Regeneration // Can. J. Bot. 1988. V. 66. - P. 1107-1110.

87. Cathrine L, Magnor H. / Anther culture of cabbage. Influence of growthtemperature of donor plants and media composition on embryo yield and plant regeneration. // Norwegian Journal of Agricultural Sciences., 1988. — № 1. — P. 105-109.

88. Chase S.S. / Monoploid frequencies in a commercial double crass hybrid maize and its components single cross hybrids and inbred lines //Genetics., 1949. -V. 34. P. 328-332.

89. Chase S.S. / Utilization of haploids in plant breeding: Breeding diploidspecies // Haploids in higher plants. K.J. Kasha (ed.). University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada, 1974. - P. 211-230.

90. Chen F.Q., Hayes P. M., Rivin C.J. / Wide hybridization of Hordeum vulgarex Zea mays // Source Journal: Genome 34(4). — 1991. P. 603-605.

91. Chen" F.Q., Hayes P.M. / A comparison of Hordeum bulbosummediated haploid production efficiency in barley using in vitro floret and tiller culture // Theor. Appl. Genet., 1989. - V. 77. - P. 701-704.

92. Chen Y, Li L.T. / Investigation and utilization of pollen-derived haploid plant in rice and wheat // In: Proc Symp Plant tissue culture. 1978. P. 199211.

93. Chen Y. // Anther and pollen culture of rice Haploids in higher plantsin vitro (ed. by Hu Han and Jang Hongyan) / Springer Verlag Publishers: Berlin New York Tokyo., - 1986. - P. 3-25.

94. Cheri'Y.L.C., Xu Y., He P., Zhu L. / Gametoclonal variation of microspore de rived doubled haploids in indica rice: Agronomic performance, isozymes and RFLP analysis // Acta Genetica Sinica. 1996. V. 23. - № 3. - P. 196204.

95. Chi-Chang Chen, Hsin-Sheng Tsay, Chien-Rong Huang / Rice (Orysa saliva)factors affecting androgenesis // In: Biotechnology in agriculture and forestry. Berlin. -1986. V. 2. - P. 123-138.

96. Choo T.M., Reinberg E., Kasha K.J. / Use of haploids in breeding barley // Plant Breeding Rev., -1985. V. 3. - P. 219-252.

97. Choo T.M., Reinbergs E., Park S. / Comparison of frequency distributions of doubled haploid and single seed descent lines in barley // Theor. Appl. Genet., 1982. - V.61. - P. 215-218.

98. Choo U.H., Kasha K.J. / Ethylene production and embryogenesis from anther cultures of barley (Hordeum vulgare) // Plant Cell Reports., 1989. -V. 8.-P. 415-417.

99. Chu C.C. / The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops // Proc. of symp. on plant tissue culture Science Press: Peking, 1978. -P. 43-50.

100. Chuang C.C, Ouyang T.W., Chia H., Chou S.M., Ching C.K. / A set of potato media for wheat anther culture // Proc. Symp. Plant tissue culture -Beijing: Science Press, 1978. P. 51-56.

101. Clapham D. / Haploid Hordeum plants from anthers in vitro Z. // Pflanzenzucht. -1973. V.69. - P 142-155.

102. Clausen R.E., Mann M.C. / Inheritance in Nicotiana tabacum. V. The occurence of haploid plants in interspecific progenies // Proc. Nat. Acad. Sei. 1924. V. 10.-P.121-124.

103. Cooper D.C. / Haploid diploid twin embryos in Lilium and Nicotiana // Am. J. Bot. 1943. - V. 30. - № 6. - P. 408-413.

104. Crespan M., Cipriani G., Vischi M., Olivieri A.M. / Individuzione dela micro e macrosporogenesi in orzo (Hordeum vulgare L.) e primi resultati comparative della colture in vitro di antere e ovari // Riv. Agron. 1988. -V.22, № 2. - P. 89-93.

105. Daniel G. / Vergleichende Untersuchungen zur Erzeugung vor Doppel -haploiden über Antherenkultur und Bulbosum Methode bei Wintergerste (Hör deum vulgare L.) // Bayer, landwirt. Jahrb. 1989. - V.66. - № 6. - P. 757-768.

106. De Klerk G. J. / Rooting of microcuttings: theory and practice // In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, 2002. V. 38. - № 5. - P. 415422.

107. De Klerk G. J., Keppel M., Ter Brugge J., Meekes H. / Timing of the phases in adventitious root formation in apple microcuttings // Journal of Experimental Botany, 1995. V. 46. - P. 965-972.

108. Deanon J.R. / Treatment of sweet corn silks with maleic hydrazyde and colchicine as a means of increasing the frequency of munoploids // Philipp. Agr, 1957. V.41.— P.364-377.

109. Dias J.S., Martins M.G. / Effect of silver nitrate on anther culture embryo production of different Brassica oleracea morphotypes. // Sei Hort. 1999. — V. 82. P. 299-307.

110. DietertM.F., Barron S.A., Yoder O.C. / Effects of genotypes on in vitro culture in the genus Brassica // PI. Sei. Lett., 1982. V. 26. - P. 233-240.

111. Doctrinal M., Sangwan R.S., Sangwan-Noreel B.S. / In Vitro Gynogenesis in Beta vulgaris L.: Effect of Plant Growth Regulators, Temperature, Genotypes and Season //Plant Cell, Tissue Organ Cult. 1989. V. 17. - P. 1-12.

112. Duijs J.G., Voorrips. R.E. / Highly regenerative cultivars in microspore culture in Brassica oleraseae L. var. Capitata. // Euphytica 1992. V. 60. - P. 45-55.

113. Dunwell J.M. / Embryogenesis from pollen in vitro // Biotechnology in plant science. Orlando cts., 1986. P. 49-54

114. Dunwell J.M. Sunderland N. / Anther culture of Solarium tuberosum L. // Euphytica, 1973,-V.22.-P. 317-323.

115. Dunwell J.M. Francis R.J., Powell W. / Anther culture of Hordeum vulgare L.: a genetic study of microspore callus production and differentiation // Theor. Appl. Genet., 1987. -V. 74. P. 60-64.

116. Erickson R.O. / Cytological and growth correlations in the flower bud and anther of Lilium longiflorum // Amer. J. Bot. 1948. V. 35. - P. 729 - 739.

117. Evans D.A., Sharp W.R., Medina-Filho H.P. / Samoclonal and gametoclonal variation // American Journal of Botany, 1984. V. 71. - P. 759-774.

118. Falk D.E., Kasha K.J. / Comparison of crossability of rye (Secale cereale) and Hordeun bulbosum onto wheat (Triticum aestivum) Canad. J. Genet.

119. Cytol, 1981.-V.23.-P 81-88.

120. Finstad, K., Brown, D. C. W., Joy, K. / Characterisation of competence during induction of somatic embryogenesis in aifalfa tissue culture. // Plant cell Tiss. Org. Cult., 1993. -V. 34. P. 125-132.

121. Foroughi-Wehr B., Mix G. / In vitro response of Hordeum vulgare L. Anthers cultured from plants grown under different environments // Environ, and Exp. Bot, 1979. V.19. - № 4.- P.303-309.

122. Furusho M., Suenaga K., Nakajima K. / Production of haploid barley plants from barley x maize and barley x Italian ryegrass crosses // Jap. J. Beed. -1991.-V. 41,-№ l.-P. 175-179.

123. Gamborg, O.L. Miller R.A., Ojima K. / Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells / /Exp. Cell. Res. 1968. V. 21. -P. 359-368.

124. Godercka K.; Krzyzanowska D. / The influence of different factors on the effectiveness of embriogenesis in head cabbage anther culture. Vegetable crops research bull. // Research inst. of vegetable crops. Skierniewice, 2004; -V. 61.-P. 5-13.

125. Gorecka K. / Propagation of cauliflower from flower buds in tissue culture // Bull. Pol. Acad. Sc, 1985. T. 33. № 1-6. - P. 27-30.

126. Green C.E. / Prospects for crop improvement in the field of cell culture // HortSci., 1977. V. 12. - P. 131-134.

127. Guha S., Iyer R.D., Gupta N., Svvaminathan M.S. / Totipotency of gametic cells and the production of haploids in rice // Current Sci. 1970. V. 39. -P. 174-176.

128. Guha S., Maheshwari S.C. / In vitro production of embryos from anthers of Datura // Nature. London. 1964. V. 204. - P. 497.

129. Guo J.D. / Maintenance of male sterile germ-plasm in Brassica rapa by in vitro propagation. /J.D. Guo, T. Niemela, U. Talisalo, S. Pulli. // Agr, And Food Scince in Finland, 2000. V. 9. - P. 231-238.

130. Hanzel L.I., Miller I.P., Brinkman M.A., Fendos E. / Genotype and media effects on callus formation and regeneration in barley // Crop. Sc., 1985. — V.25. № l.-P. 27-31.

131. Harland S.C. / Haploids in polyembryonic seeds of Sea Island cotton // J. Hered. 1936,-V. 27. P. 229-231.

132. Heberle-Bors E. / On the time of embryogenic pollen grain induction during sexual development of Nicotiana tabacum L. plants // Planta., 1982. V. 156. - P. 402-406.

133. Heberle-Bors E. /In vitro haploid formation: a critical review // Theor. Appl. Genet., 1985. V. 71. - P. 361-374.

134. Heberle-Bors E., Odenbach W. / In vitro pollen embryogenesis and cytoplasmic male sterility in Triticum aestivum L. // z. Pflanzenzucht.,1985. -V.95. P.14-22.

135. Heberle-Bors E., Reinert J. / Environmental control and evidence for predetermination of pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum L.'pollen // Protoplasma. 1981. -V. 109.-P. 249-255.

136. Heherle-Bors E., Reinert J. / Isolated pollen cultures and pollen dimiorphism // Naturwissenschaften. 1980. V. 67. - P. 311-316.

137. Hinkovski C., Stojanova I., Atanassov A. / Reorganization of plant breeding on the achievements of genetics and higher plants // Agricultural Science,1986. Y. XXIV. - № 3. - P. 24-29.

138. Homer M, Street H.E. / Pollen dimorphsm origin and significance in pollen plant formation by anther culture // Ann. Bot. 1978. - V. 42. - P. 763771.

139. Hu G., Liang G.H., Wasson C.E. / Chemical induction of apomictic seed formation im maize // Euphytica. 1991. V. 56. - № 2. - P. 97-105.

140. Hu Han / Crop improvement by anther culture //XV Int. Congr. Genet. NewDelhi, 1983.-P. 121-122.

141. Hu Han / Wheat: improvement through anther culture // Biotechnology in agriculture and forestry. (Ed. By Y.P.S. Bajaj) Springer-Velag: Berlin

142. Heidelber., 1986. -V. 2. P.55-71.

143. Hu Han. Genetic stability and variability of pollen derived plants. / Int.Symp. "Plant cell culture in crop improvement" // Calcutta, 1981. P. 145-157.

144. Huang Q.F., Yang H.Y., Zhou C. / Embryological observations on ovary culture of unpollinated young flowers in Hordcum vulgare L. (in Chinese) // Acta Bot. Sinica. 1982. -V. 24, № 4. - P. 295-300.

145. Inagaki M.N. / Comparison of crossabilities of tetraploid wheat with Hordeum bulbosum and maize // Cereal Research Communications, 1995. V. 23. - № 4. - P. 339-343.

146. Ionescu A. / Cercet ri preliminare de haploidie prin culturi de antere la tomate // An. Inst. cerc. legumicult. si flori cult. 1984. - № 7. - P. 79-82.

147. Ivers D.R., Palmer R.G., Fehr W.R. / Anther culture in soybeans // Crop. Sci. 1974. - V. 14, - № 6. - P. 891-893.

148. Jacques J., Lucienne S., Yvette H., Georges P. / Hormonal requirement and tissue competency for shoot organogenesis in two cultivars of Brassica napus //Physiologia Plantarum. 1992. V. 84. № 4. - P. 521-530.

149. Kao K. / Plant formation from barley anther cultures with ficoll media // Z. Pflanztn -Physiel., 1981. -V. 103. № 5. - P. 437-443.

150. Kao K.N. / Induction of pollen plant formation in barley anther culture /K.N Kao, D.C. Horn // Int. Symp. On genetic manipulation in crops. Abstracts. Beijing. China, 1984. P. 64.

151. Kao K.N., Kasha K.J. / Haploidy from interspecific crosses with tetraploid barley // Barley Genetics II. R.A. Nilan (ed.). Wash. State Univ. Press, 1969.-P. 82-88.

152. KarthaK.K., Gamborg O.L., Constabel F. / In vitro plant formation from stem explants of rape (Brassica napus cv. Zephyr) // Physiol. Plant, 1974a. -P. 214-218.

153. Kasha K.J., Reinbergs E. / Recent development in the production and utilization of haploids in barley // Barley Genet .1981. V. 4. - P. 655-665.

154. KasTTa K.S. Kao K.N. / Highly frequency haploid production in barley

155. Hordeum vulgare L.) // Nature., 1970. V. 225. - P. 874-876.

156. Katayama Y. / Haploid formation by X-rays in Triticum monococcum // Cytologia. 1934. -V. 5. № 2. - P. 235-237.

157. Keller E.R., Schmidt J. / Effect of a gametocide on the induction of haploids in Triticum aestivum // Gen. Manipulat. Plant. Breed. Proc. Int. Symp. Berlin (West), 1985. P. 8-13.

158. Keller J. / Culture of unpollinated ovules, ovaries, and flower buds in some species of the genus Allium and haploid induction via gynogenesis in onion // Euphytica. 1990. V. 47. - № 3. - P. 241-248.

159. Keller W. A., Rajhathy R, Lacapra J./ In vitro production of plants from pollen in Brassica camprestris // High frequency plant regeneration from thin cell layer explains of Brassica napus. Plant Cell, Tissue and Organ culture, 1985.-V. 4.-P. 183-197.

160. Klimaszewska K., Keller W.A. / High frequency plant regeneration from thin cell layer explants of Brassica napus // Plant Cell, Tissue and Organ culture, 1985.-V. 4.-P. 183-197.

161. Kott L.S., Polsoni L. / Tological Aspects of isolated microspore culture of Brassica napus //Can.J.Bot. -1988.- V.66,-№ 8.-P. 1658-1664.

162. Kuginuki Y., Nacamura K., Hida K.I., Yosicawa H. / Varietal differences in embryogenic and regenerativ ability in microspore culture of Chinese cabbage (Br. Camperstris spp. pekinesis) // Breeding Scince, 1997. V. 47. - P. 341346.

163. Kuhlmann U., Foroughi-Wehr B. / Production of doubled haploid lines in frequencies sufficient for barley breeding programs // Plant Cell Repts. 1989. V. 8. -№ 2. P. 78-81.

164. Lamm R. / Notes on haploid potato hybrid // Hereditas. 1938. -V. 24.-P.391.

165. Larsen E.T., Tuvesson I.K.D., Andersen S.B. / Nuclear genes affecting percentage of green plants in barley (Hordeum vulgare L.) anther culture // Theor. and Appl. Genet., 1991.-V. 82. № 4. - P. 417-420.

166. Lazzeri PA, Dunwell J.M. / In vivo shoot regeneration from seedling root segments of Brassica oleracea and Brassica napus cultivars // Ann Bot. — 1984: —V. 54.-P. 341-350.

167. Lelu M.A., Bollon H. / Cabbage Brassica oleracea var. capitata and Brussels Spour Brassica oleracea var. gemmifera: in vitro // Production of Haploids. Biotechnology in Agriculture and Forestry. Springer-Verlag Berlin: 1990. -V. 12.-P. 358-373.

168. Lillo C., Hansen M. / Anther culture of cabbage. Influence of growth temperature of donor plants and media composition on embryo yield and plant regeneration //Norw. J. agr. Sc, 1987. T. 1. № 2. - P. 105-109.

169. Linsmaier E.M., Skoog F. / Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures//Physiol. Plant. 1965.-V. 18. -P. 100-127.

170. Luckett D.J., Smithard R.A. / A comparison of several published methods for barley anther culture // Plant Cell Repts. 1995b. V. 14. - № 12.-P. 763-767.

171. Maheshwari S. C , Rashid A. , Jyagi A . K. / Haploids from pollen grains retrospect and prospect. // Amer. J. Bot., 1982. V. 69. - № 5. - P. 865-879.

172. Matzk F., Mahn A. / Improved techniques for haploid production in wheat using chromosome elimination // Plant Breeding 1994. V. 113(2). - P. 125129.

173. Mix G., Wang H.M. / In vitro erzeugung von haploiden Corpea-Pflanzen (Vigna unguiculata L.) // Landbauforsch Volkenrode. 1988. - V.38, - № 4.-P. 305-309.

174. Murashige T. A, Skoog F. / Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. 1962. — V.15. — P.473-497.

175. Nakamura A., Itagaki R. / Anther culture in Nicotiana and the characteristics of the haploid plants // Japan. J. Breed, 1973. V. 23. - P. 71-78.

176. Nitsch P.C., Noreel B. / Effect dun choc termigue sur lepouvoir embryogenis pollen de Duture in noxia culture dans lanthereon isole de lantoure // C.R. Acad. Sei., 1973. V. 27 - P.305-306.

177. Nitsch C. / Pollen culture a new technics for mass production of haploid andhomozygous plant. // Haploids in higher plants - advances and potential. University of Guelph. Guelph, 1974. - P. 123-135.

178. Nitsch J.P. / Experimental androgenesis in Nicotiana // Phytomorphology. 1969. -V. 19. № 4. - P. 389-404.

179. Nitsch J.P., Nitsch C. / Haploid plants from pollen grains // Science. -1969. -V. 163. № 386. - P. 85-87.

180. Ockendon D.J. / Utilization of anther culture in Breeding Brussels sprouts // Genetic Manipulation in plant Plant Breeding. Walter & Gruyter CO. Berlin New-York Printed in Germany: 1986. - P. 256-271.

181. Ockendon D.J., Sutherland R.A. / Genetic and non-genetic factors affecting antherculture of Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera) // Theor Appl. Genet. 1987. V. 74. - P. 566-570.

182. Ouyang S.M., Zhou S.M., Jia S.E. / The response of anther culture to culture temperature in triticum aestivum // Theor and Appl. Genet., 1983. -V. 66. №2.-P. 101-109.

183. Pechan P.M., Keller W.A. / Identification of potentially embryogenic in Brassica napus // Physiologia Plantarum. 1988. V. 74. - P. 377-384.

184. Pechan P.M., Keller W.A. / Identification of potentially embryogenic in Brassica napus // Physiologia Plantamm., 1988. V.74. - P.377-384.

185. Person C. / An analytical study of chromosome behaviors in a wheathaploid // Canad. J. Bot., 1955. V. 33. - № 1. - P. 11-30.

186. Phippen C., Ockendon DJ. / Genotype plant, bud size and media factors affecting anther culture of cauliflowers (B. Oleraceae var. botrytis) // Theor. Appi.'Genet. 1990. -V. 79. № 1. - P. 33-38.

187. Picard E., Buyser J. / Nouveaux résultats concernant la culture d'antheres in vitro de ble tendre (Triticum aestivum L.). Effects d'un choc thermique et la position de I'anthere dans Tep // C.R. Acad. Sei. Paris., 1975.-V. 281D. P. 127-130.

188. Prakash S. / Haploidy in Brassica nigra Koch // Euphytica. 1973. V. 22. -№ 3. -P. 613-614.

189. Qin X., Rotino G.L. / Chloroplast number in Guard cells as ploidy indicator of in vitro grown androgenic peper plantlets // Plant Cell, Tissue Organ Cult, 1995.-V. 41.-P. 153-160.

190. Raghavan V. / Role of the generative cell in androgenesis in Henbane. // Science, 1976.-V. 191. -№ 4225. P. 388-389.

191. Ramiah K., Parthasarihi N., Ramanujam S. / Polyembriony in rice (Oryza sativa) // Indian J. Agric. Sei. 1935. V. 5. - P. 119.

192. Randolph L.F. / Some effects of high temperatures on polyploidy and other variations in maize // Proc. Nat. Acad. Sei. (USA). 1932. V. 18. - P. 222-229.

193. Rashid A., Siddiqui A.W., Reinert J. / Subcellular aspects of origin and structure of pollen embryos of Nicotiana // Ibid. 1982. V.l 13. - P. 202-208.

194. Rines N.W., Dahleen L.S. / Haploid oat plants produced by application of maize pollen to emasculated oat florets // Crop Sei. 1990. V. 30, - № 5. -P. 1073-1078.

195. Roulund N. , Andersen S. B. and Farestveit B. / Optimal concentration of sucrose for head cabbage (Brassica oleracea L. convar. capitata (L.) Alef.) anther culture. // Euphytica. 1991- V. 52. № 2. - P. 125-129.

196. San Noeum. / Haploides d'Hordeum vulgare L. par culture in vitro d'ovaires nonfecondes // Ann. Amelior. Plants. 1976. V. 26. - P. 751 -754.

197. Senaratha T., Kott L., Beversdorf W.D., McKersie B.D. / Desiccation of microspore derived embryos of oilseed rape (Brassica napus L) // Plant Cell Repts. 1991.-V. 10.- №6-7.-P. 342-344.

198. Sethi U., Basu A., Guha-Mukherjee S. / Role of Inhibitors in the Induction of Differentiation in Callus Cultures of Brassica, Datura and Nicotiana.il Plant Cell Rep. 1990. V. 8. - №. 9. - P. 598 - 600.

199. Shu W. / Secondary embryogenesis from thin cell layers of Brassica napus ssp. oleifera / W. Shu, C.S. Loh // New Phytologist. 1991. V. 119. - P. 427432.

200. Sibi M., Dumas de Vaulx R., Shambonnet D. / Obtention de plantes haploids par androgenese in vitro chez le Piment (Capsicum annum L.) // Ann. Amelior Plant. 1979. - V. 29, - № 5. - P. 583-606.

201. Singh P., Gupta V.P. / Variations in fatty acid composition in Brassica during seed development.// Crop Improv. 1994. V. 21. - P. 54-60.

202. Sonnio A., Tanaka S., Jwananga M. / Genetic control of emryo formation in anther culture of diploid potatoes // Plant Cell Reports. 1989.- V.8. -№ 2. P. 105-107.

203. Sopory S.K. / Effect of sucrose, hormones and metabolic inhibitors on the development of pollen embryoids in anther cultures of dihaploid Solarium tuberosum // Can. J. Bot. 1979. V. 57. - P. 2691-2694.

204. Sopory S.K., Jacobsen E., Wenzel G. / Monohaploid embryoids and plantlets in cultured anthers of Solanum tuberosum // Sei. Lett. 1978. - № 12. - P. 4754.

205. Stadler L.J. / The experimental modification of heredity in crop plants. I. Induced chromosomal irregularities // Sei. Agric. 1931. V. 11. - P. 557-572.

206. Suenaga K., Nakajima K. / Efficient production of haploid wheat (Triticum aestivum) through crosses between Japanese wheat and maize (Zea mays) II //'Plant Cell Reports. 1989. V. 8 (5). - P. 263-266.

207. Sun C., Wang C., Chu C. / Cell division and differentiation ofpollen grains Triticale antheres cultured in vitro II // Sci. Sin., 1974. V. 17. -P. 47-54.

208. Sun J.S., Lu T.G, Wang J.L., Sun X.H., Jang C, Wang X.Y. / Гибридизация голозерного овса с кукурузой // Zhiwu xuebao Acta Bot. Sinica. 1995.-V. 37.-№ 4.-P. 255-258.

209. Sun J.S., Lui H., Lu T.G., Wang X.A., Ren Z., Wang J.L., Fang R, Yang C. / The production of haploid wheat plants via wheat x maize hybridization // Acta Botanica Sinica. 1992. № 34(11). - P. 817-821.

210. Sunderland N. / On the use of microspores for genetic modification // Symposium on genetic engineering of plants. 1983. P. 315-332.

211. Sunderland N. / The concept of morphogenic competence with reference to anther and pollen culture // Plant Cell Cult. Crop. Imrovement Proc. Int. Symp. Calcutta, London, 1983. - P. 125-139.

212. Sunderland N., Huang B. / Barley anther culture the switch program and albinism // Hereditas. 1985. № 3. - P. 27-40.

213. Sunderland N., Huang В., Hills B. / Disposition of pollen in situ and its relevance to anther pollen culture // J. Exp. Bot. 1984. V. 35. - P. 521530.

214. Swaminathan M.S., Singh M.P. / X-ray induced somatic haploidy in watermelon // Current. Sci. 1958. V. 27. - № 2. - P. 63-64.

215. Takanori S., Takeshi N., Masashi H. / Plant regeneration from isolated microspore cultures of Chinese cabbage (Brassica campestris spp. pekinensis) // Plant Cell Reports. 1989. V. 8. - № 8. - P. 486-488.

216. Tanksley S.D., Zamir D., Rick C.M. / Evidence for extensive overlap of sporophytic an gametophytic gene expression in Lycopersicon esculentum // Science. 1981. V. 213. - P. 453-464.

217. Telmer T. A. / Cellular changes During heat shock induction and embryo development of cultured microspores of Brassica napus sv. Topas / T. A. Telmer, W. Newcomb, D.H. Simmonds // Protoplasma. 1995. V. 185. - P. 106-112.

218. Thomas E. Embryogenesis from microspores of Brassica napus. / E. Thomas, G. Wenzel. // HZ. Planzenzucht. 1975. V. 74. - P. 77-81.

219. Thurling N. / The influence of donor plant genotype and environment on production of multicellular microspores in cultured anther of Brassica napus ssp oleifera / N. Thurling, P.M. Chay // Ann. Bot. 1984. V. 54. - № 5. - P. 681693.

220. Touraev A., Indrianto A., Wratschko I., Vicente O., Heberle B.E. / Efficient microspore embryogenesis in wheat (Triticum aestivum L.) induced by star vation at high temperature // Sexual Plant Reproduction. 1996. V. 9(4). -P. 209- 215.

221. Truno-Andre J., Demarly Y. / Obtaining plants by in vitro culture of unfertilized maize ovaries (Zea mays L.) and preliminary studies on the progeny of gynogenetic plant // HZ. Planzenzucht. 1984. V. 92. - P. 309320.

222. Ushiyama T., Shimizu T., Kuwabara T. / High frequency of haploid production of wheat through intergeneric cross with teosinte // Jap. J. Breed. 1991.-V. 41.-№ 2. P. 353-357.

223. Van G.J., Halluin K. / Jacobs M. Induction of nuclear and cell divisions in microspores of sugar beet (Beta vulgaris.) // Z. Pflanzenzucht. 1985. - V. 95,-№4.-P. 325-335.

224. Wang C.C., Kuang B.J. / Induction of haploid plants from the female gametophyte of Hordeum vulgare L. (in Chinese) // Acta Bot. Sinica. 1981. -V. 23. P.329-330.

225. Wang Z.N., Guo B.H., Li H.J., Sun J.S., Liu H., Wang J. L. / Haploid wheat induction by crosses between different ploidy wheat and different populations of maize // Acta Botanica Sinica 1996. V. 38(5). - P. 414-416.

226. Wei X.L, Cao H.L., Hu Q.D. / Studies on the process of fertilization and the development of haploid embryos and endosperms of Triticum aestivum after crossing with tetraploid Hordeum bulbosum // Acta Genet. Sinica. 1985.-V. 12.-P. 275-280.

227. Wenzel G., Foroughi-Wehr B. / Anther culture of cereal and grasses // Ed. Vasil I.K. Cell culture and somatic cell genetics of plants. Orlando: Academic Press. 1984. P. 311-327.

228. Wernicke W., Milkovits L. / The regeneration potential of wheat shoot meristems in the presence and absence of 2,4-dichlorphenolacetic acid. // Protoplasma, 1986.-V. 131.-P. 131-141.

229. White Ph. R. / A handbook of the plant tissue culture. Ronald Press, NewJork, 1943.-P. 261.

230. Wu B.J., Chen K.C. / Cytological and embryological on haploid production from cultured unpollinated ovaries of Nicotiana tabacum L. // Acta. Bon. Sin. 1982. V. 24. - № 32. - P.125-129.

231. Yang H.Y., Zhou C. / In vitro induction of haploid plant from unpollinated ovaries and ovules // Theor. and Appl. Genet. 1982. V. 63. - № 2. - P. 97-104.

232. Yang O., Chauvin J.E., Herve Y. / A study of factors affecting anther culture of cauliflower Brassica oleracea var. botrytis // Plant Cell, Tissue and Organ Culture 28, 1992. P. 289-296.

233. Yang Y., Wei W. / Induction of haploid plants Dimocarpus longan from the' anthers cultivated on medium with certain properties // Acta genet. Sinr- 1984.-V.ll,-№4.-P. 288-293.

234. Yin D., WeiQ. Yu Q. Wang L. / Effects of gamma radiation on wheat pollen development inanthcr culture // J. Agric. Sci. 1985. -V. 1. P. 17-24.

235. Zarsky V., Tupy J. / Stamen morphology and induction of pollen embryogenesis in tobacco // Acta Univ. agr. 1985. - V. 33. № 3. - P. 537540.

236. Zhao Z., Gu M. / Получение диплоидных чистых линий кукурузы через партеногенез, индуцированный химическим путем // Acta Genet. Sin. 1984. -V. 2.- № 1. P. 39-46.

237. Zhou С., Yang H.Y. / Induction of haploid rice plantiets by ovary culture // Plant. Sci. Lett. 1981. V. 20. - № 3. - P. 231-237.

238. Zhu Z.C., Wu H.S. / In vitro induction of haploid planticls from the unpollinated ovaries of Triticum aestivum and Nicotiana tabacum // Acta Genetica Sinica. 1979. -V. 6,-P. 181-183.

239. Zhuang J., Lia X., Chen G. / Factors affecting the induction of pollen plants of intergeneric hybrids of Traestivum x Tr. agropyron // Genet, 1985. — V.70. № 3.-P. 294-299.

240. Hu Han and Bin Huang. / Application of pollen derived plants to crop improvement // International Reviev of cytology. 1987. V. 107. - P. 293313.

241. Сое E.H. A line of maize with high haploid frequency // Amer. Natur. 1959. V. 93. - № 873. - P. 381-382.

Информация о работе

Май Дык Чунг
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Совершенствование технологии получения гаплоидных и дигаплоидных растений рапса (Brassica napus L.) и белокочанной капусты (Brassica oleracea L.) in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы