Генетическая трансформация капусты белокачанной (Brassica oleracea var. capitata L.) в селекции на устойчивость к фитопатогенам (Plasmodiophora brassicae Wor., Fusarium ssp.)

Зонтикова, Светлана Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Генетическая трансформация капусты белокачанной (Brassica oleracea var. capitata L.) в селекции на устойчивость к фитопатогенам (Plasmodiophora brassicae Wor., Fusarium ssp.)
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Генетическая трансформация капусты белокачанной (Brassica oleracea var. capitata L.) в селекции на устойчивость к фитопатогенам (Plasmodiophora brassicae Wor., Fusarium ssp.)"

На правах рукописи

ЗОНТИКОВА Светлана Анатольевна

003480344

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ (Brassica oleracsa var. capitata L.) В СЕЛЕКЦИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ (Plasmodiophora brassicae War., Fusarium ssp.)

Специальности: 06.01.05 - селекция и семеноводство 03.00.23 - биотехнология

2 2 0К7

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 2009

003480344

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии в 20ОТ-2009 гг.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

кандидат сельскохозяйственных наук

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Поляков Алексей Васильевич Шарафова Ольга Федоровна

Бухаров Александр Федорович

вниио

Россельхозакадемии

кандидат биологических наук

Овчинникова Вера Николаевна ВНИИСБ

Россельхозакадемии

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт селекции к семеноводства овощных культур Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится « 5 » ноября 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.022.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте овощеводства Россельхозакадемии по адресу: 140153 Московская обл., Раменский район, д. Верея, строение 500, ВНИИО.

Факс (49646) 2-43-64

E-mail: vniio@vandex.ru, www.vmio.com

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института овощеводства.

Автореферат разослан - » октября 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди продовольственных культур капуста занимает 25-е место в мире, объем мировых посевных площадей составляет более 3 млн. га. Особенно широко возделывают её в странах с умеренным климатом. В России капусту выращивают повсеместно (Пивоваров В.Ф., Старцев В.И., 2006). Капуста белокочанная является ценным пищевым и диетическим продуктом питания. Она обладает богатым химическим составом. Клетчатка капусты способствует выведению из организма жироподобных веществ, и, в частности, холестерина (Петрушко Ю.Н., 2003). Получение стабильного урожая капусты белокочанной является одной из важнейших задач отечественного овощеводства. Однако многочисленные заболевания, которым подвержена капуста, приводят к потерям значительной части урожая и сильно снижают качество продукции.

Гриб Plasmodiophora brassicae Wor. (возбудитель килы крестоцветных) — один из самых распространенных патогенов капусты. В России встречается в большинстве областей страны. Болезнь приводит к снижению урожая на 10-60% и более. В годы сильного проявления болезни недобор урожая капусты на зараженных килой участках составляет 400-500 центнеров с гектара (Мазин В.В., Проценко Е.П., 1976; Ахатов А.К. и др., 2006).

Фузариоз (или фузарпозное увядание./, вызываемое грнбаШ! рода Fusarium — заболевание капусты, поражающее корневую и сосудистую систему растений. Гибель растений от фузариоза в некоторые годы может достигать 20-25% (Ахатов А.К. и др., 2006). Болезнь наиболее вредоносна в районах с высокой температурой почвы.

Получение устойчивых к киле и фузариозу сортов и гибридов капусты белокочанной является приоритетной задачей отечественной селекции. Генетическая инженерия обладает широкими возможностями в защите растений, поскольку её методы позволяют включать чужеродные гены в геном растений. Этот процесс называют «генетической трансформацией». Трансформацию растений осуществляют различными способами, однако наиболее распространенным, эффективным и апробированным на разнообразных видах растений является метод агробактериальной трансформации с помощью модифицированных штаммов Agrobacterium timefaciens и A. rhizogenes.

Методом генетической трансформации уже получены растения, устойчивые к вирусным, бактериальным и грибным патогенам, насекомым-вредителям; абиотическим факторам, имеющие измененное время созревания плодов; пищевую ценность, улучшенный внешний вид плодов и вкус и т.д. (Глик Б., Пастернак Дж.,2002). В связи с этим, получение трансгенных форм капусты белокочанной, устойчивых к фитопатогенам (PL brassicae Wor., Fusarium ssp. и др.), является актуальной и своевременной задачей селекции.

Цель и задачи исследований.

Целью исследований являлось получение трансгенных растений капусты белокочанной, устойчивых к фитопатогенам (Plasmodiophora brassicae Wo г., Fusarium ssp.).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить морфогенетический потенциал различных линий и сортов капусты белокочанной;

2. Подобрать оптимальное сочетание регуляторов роста в питательной среде для повышения регенерационной активности капусты белокочанной;

3. Подобрать оптимальные условия для трансформации капусты белокочанной с помощью Agrobacterium tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN 19+13К, несущим целевой ген mß (кодирует МИЗ-белок, гомологичный пептидил-пролил-г^сУот/рда/с-изомеразам FKBP-типа) и маркерный геи npt //(кодирует неомицинфосфотрансферазу II);

4. Провести агробактериальную трансформацию капусты белокочанной и получить растения-регенеранты;

5. Оценить полученные трансгенные растения поколения Т0 с помощью молекулярно-биологического анализа (ПЦР);

6. Провести реципрокнык скрещивания трансгенных растений поколения Т0 и установить характер наследования трансгена в семенном потомстве (поколение ТО;

7. Оценить устойчивость полученных трансгенных растений поколения Т| к киле и фузариозу на селективных фонах.

Объект исследований - технология получения трансгенных растений капусты белокочанной со встроенным геном mß, придающим устойчивость к фитопатогенам (PI. brassicae Wo г., Fusarium ssp.).

Предмет исследований - семядоли и гипокотильные сегменты проростков 2 линии (33, 34) и 4 сортов (Подарок, Касатка, Малайка, Горлица), растения-регенеранты и трансформанты капусты белокочанной.

Научная новизна.

Дана характеристика морфогенетического потенциала 6 селекционных образцов среднепоздней капусты белокочанной и подобрано оптимальное сочетание и концентрация регуляторов роста для их регенерации в культуре in vitro. Впервые с помощью векторной конструкции с геном mß проведена агробактериальная трансформация капусты белокочанной и получены трансгенные формы, которые характеризуются повышенной устойчивостью к киле {PI. brassicae Wor.) и фузариозу (Fusarium ssp.) и могут быть использованы как исходный материал в дальнейшей селекционной работе. Определен характер наследования трансгена в поколении Ть а также устойчивость транс-

генных растений капусты белокочанной к киле (PI. brassicae Wo г.) и фуза-риозу (Fusarium ssp.).

Практическая ценность.

Оптимизированы условия регенерации и агробактериальной трансформации капусты белокочанной (сочетание и концентрация регуляторов роста, плотность суспензии агробактерий, способ поранения эксплантов, длительность инокулирования и сокультивирования эксплантов с агробакте-рией, оптимальный возраст экспланта и длительность его прекультивирова-ния). которые могут быть использованы при размножении этой культуры в условиях in vitro и для создания генетически модифицированных растений капусты белокочанной с определенными хозяйственно-ценными признаками. Получено 12 трансгенных форм сорта Малайка со встроенным геном т/3, которые характеризуются повышенной на 23-44% устойчивостью к киле (PI. brassicae Wo г.) и на 9-23% — к фузариозу (Fusarium ssp.) по сравнению с исходным (нетрансгенным) образцом, которые могут быть использованы в селекции капусты белокочанной.

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы н предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены и представлены на II Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2007), IX Международной научной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологи» (Москва, 2008), IX Молодежной научной конференции, посвященной памяти Г.С. Муромцева (Москва, 2009); на Международной научно-практической конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова (Верея, 2009), V Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы нанобиотехнологии л инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2009)

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• оптимизированные условия регенерации капусты белокочанной в условиях in vitro на основе гипокотильных сегментов и семядолей;

• оптимизированные условия генетической трансформации капусты белокочанной с использованием Agrobacterium tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN 19+1ЗК, несущим маркерный (npt 1Г) и целевой (mß) ген, кодирующий МРЗ-белок;

• трансгенные растения капусты белокочанной поколений Т0 и Ть несущие целевой ген mß и маркерный ген npt II и отличающиеся повышенной устойчивостью к киле (Pl. brassicae IVor.) и фузариозу (Fusarium asp.).

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы, содержащего 135 наименований, в том числе 55 иностранных авторов, приложений.

Диссертационная работа изложена на 148 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 таблицами, 14 рисунками и 4 приложениями.

2. УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии (ГНУ ВНИ-ИО), расположенном в Раменском районе, Московской области в период 2007 - 2009 гг.

В качестве исходного материала в работе использованы 4 сорта капусты белокочанной, внесенные в Госреестр (Подарок, Касатка, Малайка, Горлица), и линии 33 и 34.

Бактериальный штамм и тазмида. Для генетической трансформации использовали Agrobacterium tumefaciens штамм AGLO с бинарным вектором pBiN 19+13К, несущим целевой ген mß (выделенный из Pseudomonas fluores-cens), который кодирует МРЗ-белок (гомологичный пептидил-пролил-цис/транс-изомеразам FKBP-типа), придающий растениям неспецифическуто устойчивость к грибной и вирусной инфекции (Патент D?,havakhia V. et al. "Proteins inducing multiple resistance of plants to phytopathogens and pests" W02005061533 publication date 2005-07-07 to PCT International system to Finnish patent office). Ген mß находился под контролем 35S промотора CaMV и NOS-терминатора. Плазмида также содержит маркерный ген npt II, придающий растениям устойчивость к канамицину. Штамм любезно предоставлен зав. отделом молекулярной биологии ГНУ ВНИИ фитопатологии Россельхо-закадемии к.б.н. Джавахия В.Г.

Селективные факторы. Для селекции трансгенных растений поколений To-Tj использовали водный раствор канамицина. Для создания селективного фона при оценке на устойчивость к фузариозу применяли фузариевую кислоту. Для создания искусственного инфекционного фона использовали полевой изолят Pl. brassicae Wor. (возбудитель килы крестоцветных), индекс рассового состава 16/11/31 по ЕСД-коду, полученный с инфекционного участка селекционной станции им. Н.Н.Тимофеева.

Питательные среды. Для культивирования in vitro применяли агаризо-ванные питательные среды, содержащие минеральную основу по Мурасиге и Скугу (MS) (Murashigc Т., Scoog F„ 1962), дополненные сахарозой (30 г/л), агаром (5 г/л) и различными концентрациями регуляторов роста (перед авто-клавированием pH 5,6).

Исследования в условиях in vitro проводили в соответствии с «Методическими указаниями по культуре ткани и органов в селекции растений» (Бутенко Р. Г., Хромова Л. М., Седнина Г.А., 1984) и «Получение регенеран-тов овощных культур и их размножение in vitro» (Поляков A.B., 2005).

Агробактериальную трансформацию проводили по методикам Полякова A.B. и Чикризовой О.Ф. (2001), Ралдугиной Г.Н. (1996; 2007), Попадьи-на П.В. (2002). Молгкулярио-бгюлогический анализ проводили при помощи ПЦР со специфичными праймерами для генов npt ¡1 (5'-GTGGAGAAGGCTATTCGG СТА-3'; 5'-CCACCATGATATTCGGCAAAG-3') и mß (Pm-1: 5'-GGTTTACCTGCAAGGTGCAGG-3' и Pm-2: 5'-ATGA-GCGATTTCTTCCTGG CT-3').

Уход за растениями капусты белокочанной проводили в соответствии с методическими указаниями Бопларенко Л.Д., Болахонепко В.Е., Карецкая H.A. и др., (1984). Скрещивания капусты белокочанной проводили согласно Методическими рекомендациями Крючкова A.B., Монахосз Г.Ф., Пацурия Д.В.и др., (2002). Описание морфолопгческих признаков полученных семян и растений проводили по общепринятым методикам (Лудилов В.А., 2005; Пивоваров В.Ф., Старцев В.И., 2006).

Экспресс-оценку устойчивости трансгенных и исходных форм капусты белокочанной к киле крестоцветных проводили по методике Voorrips R.E. (1992) с использованием шкалы Buckzacki et al. (1975).

Статистическая обработка данных проведена согласно общепринятым методикам (Доспехов Б.А., 1979)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ (В. oleracea var. capitata L.) В СЕЛЕКЦИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ (PL brassicae War., Fusarium ssp.)

3.1. Сравнение регенерацнонной активности семядольных и гнпоко-тнльных сегментов капусты белокочанной на питательной среде MS с

различным сочетанием л концентрацией регуляторов роста

Из литературных источников известно, что генотип растения и тип экспланта являются главными факторами, определяющими способность к органогенезу. Поэтому в первую очередь проводили оценку морфогенетической

активности гипокотильных сегментов и семядолей различных селекционных образцов капусты белокочанной. Для этого пшокотильные сегменты и семядоли 7-суточных стерильных проростков культивировали на питательной среде МБ (Мигаз^е Т., Scoog Р., 1962), дополненной 30 г/л сахарозы, 5 г/л агара и регуляторами роста в различной концентрации: среда 1 - 2,0 мг/л 6-бензиламинопурин (БАП) и 0,1 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК) (Марьяхина И .Я., 1981); среда 2 — 3,0 мг/л БАП (Попадьин П.В. и др., 1999); среда 3 — 2,0 мг/л БАП и 1,0 мг/л кинетина (Грибова Т.Н., 2003); среда 4 -1,0 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК (Поляков А.В., 2005); среда 5 - 1,0 мг/л БАП и 1,0 мг/л НУК; среда 6 - 3,0 мг/л БАП и 4,0 мг/л НУК.

Было установлено, что гипокотильные сегменты капусты белокочанной обладали большей регенерационной активностью и их морфогенный потенциал (в зависимости от генотипа) был в 3-4 раза выше, чем у семядолей (табл.1). Для сортов Подарок, Касатка, Малайка и линии 34 оптимальной являлась питательная среда М8, содержащая БАП в концентрации 2,0 мг/л и НУК в концентрации 0,1 мг/л, что позволило получить в течение 7-9 недель в среднем по 19, 15. 17 и 10 почек на один гипокотильный сегмент соответственно.

Таблица 1 - Влияние различных концентраций и сочетаний регуляторов роста на адвентивный геммогенез капусты белокочанной (длительность __ культивирования 9 недель)_

Среда Эксп- Получено адвентивных почек, шт./экешгант

лаит Подарок Касатка Малайка линия 34

1 сем. * 6 1 6 0

г.с. ** 19 15 17 10

2 сем. 2 4 4 0

г.с. 5 12 9 1

3 сем. 2 12 4 0

г.с. 17 15 15 8

4 сем. 2 7 5 0

г.с. 3 9 7 1

5 сем. 2 0 1 -

г.с. 5 0 4 -

6 сем. 0 2 2 -

г.с. 0 4 4 -

* - семядоли; ** - гипокотильные сегменты.

Для индукции каллусогенеза капусты белокочанной наиболее эффективными были среды, содержащие 3,0 мг/л БАП и 4,0 мг/л НУК (среда 6)

или 1,0 мг/л БАП и ],0 мг/л НУК (среда 5). Окоренение и адаптацию к почвенным условиям лучше всего прошли регенеранты, полученные на средах 1 и 4.

3.2. Агробактериальная трансформация капусты белокочанной

3.2.1. Определение оптимальной плотности суспензии агробактерий для эффективной трансформации капусты белокочанной

На эффективность генетической трансформации большое влияние оказывает плотность суспензии агробактерий, т.к. при высокой концентрации суспензионной культуры происходит некроз тканей экспланта, а при низкой — процесс ¡«-¡окулирования мало эффективен. Были исследованных 4 варианта концентрации суспензией агробактерии: Ш8, I О7, 106 и 10' клеток/мл. При использовании суспензии агробактерий с концентрацией 108 и 107 клеток/мл, на месте срезов и в других частях эксплантов наблюдались обширные некрозы, регенерация отсутствовала. При применении концентрации 10б клеток/мл, также образовывались некрозы, однако у некоторых эксплантов наблюдали образование плотного каллуса и незначительную регенерацию побегов.

62а

жЩ

j gg

10(5! 10(6) Ш> НИВ) Плотносгъ суспензии. КДЕЛОК/МЛ

В i ипокотили S семядоли

!«5) mm Ш 7) 10(8) Пистшосгь суспетин. клеток/ш

Ш гипокотили В семядоли

А Б

Рис. 1. - Эффективность инокулирования эксплантов капусты белокочанной суспензией А. iiim.efacie.ns разной плотности; А - сорт Касатка; Б - сорт Горлица

Было показано, что наиболее эффективно проводить трансформацию капусты белокочанной при плотности суспензии агробактерий 105 клеток/мл. В данном случае некрозы на эксплантах отсутствовали, а частота морфогенеза составляла 38,7 - 66,3% в зависимости от генотипа и типа экс плата.

3.2.2. Определение наиболее эффективного способа поранения экс-ллантов при агробактериальной трансформации капусты белокочанной

Контакт агробактерий с соединениями, выделяющимися из поврежденной ткани растения, инициирует транскрипцию у;У-области Тьплазмиды, что приводит к активации генов вирулентности и повышает уровень их экспрессии.

Для определения наиболее эффективного способа поранения эксплаи-тов капусты белокочанной изучали: свежий срез, удаление всего эпидермиса, удаление 50% эпидермиса и проколы иглой шприца.

Установлено что, при удалении всего эпидермиса с гипокотилькых сегментов (табл.2) наблюдали гибель эксплантов вследствие развития обширных некрозов, вызванных механическим разрушением глубоких слоев растительных тканей. В случае прокалывания эксплантов иглой инсулиново-го шприца частота регенерации была низкой (28-35%).

Таблица 2 - Влияние способа поранения экспланта на частоту регене-

рации капусты белокочанной ( на примере сорта Подарок)

Способ поранения эксплантов Тип экспл анта Проана-лизирова но эксплан- Получено морфогенных эксплантов Полу-ченно побегов, шт.

шт. %±5р

Свежий срез сем. тоа^ит. 38 66,0+6,3 9

г.с. 60 33 55,0±6,4 17

Удаление всего эпидермиса г.с. 61 0 0 0

Удаление 50% эпидермиса сем. 52 8 15,4+5,0 0

г.с. 60 37 61,7±6,3 29

Проколы иглой шприца сем. 60 17 28,3±5,8 3

г.с. 60 21 35,0*6,2 6

При удалении около 50% верхних слоев эпидермиса с гипокотильных сегментов в виде тонких полос у 62% эксплантов наблюдали формирование адвентивных почек по всей раневой поверхности. На семядолях по линии среза на черешке в 66% случаев формировался плотный морфогенный каллус светло-зеленого цвета.

Таким образом, наиболее эффективным способом поранения эксплан-тов при генетической трансформации капусты белокочанной для гипоко-тильных сегментов является удаление (в виде тонких полос) около 50% эпидермиса, а для семядолей — свежий срез на черешке.

3.2.3. Определение оптимальной длительности инокулирования и сокультивирования эксплантов с агробактерисй

Имеющиеся в литературе данные относительно оптимальной длительности инокулирования и сокультивирования растительных эксплантов с культурой агробактерий при генетической трансформации сильно варьируют и требуют уточнений.

В наших опытах проведено инокулирование в течение 5, 30 и 60 мин, с последующим сокультивированием в течение 1, 3 и 5 суток.

Установлено, что при нахождении эксплантов в суспензии агробактерий в течение 60 мин. с последующим сокультивированием в течение 3 и 5 суток наблюдалось полное подавление их морфогенетической активности и гибель вследствие обширных некрозов (рис. 2).

кулнровЕШгя. .пин.

Длительность инокулирования. мин.

£3 i сут. 8 3 сут. О 5 сут.

Рисунок 2 - Влияние длительности инокулирования и сокультивирования эксплантов на эффективность трансформации капусты белокочанной (на примере сорта Горлица); А - семядоли; Б - гипокотильные сегменты

При инокуляровании в течение 5 минут и последующем сокультивиро-вании в течении 1, 3 и 5 суток, не смотря на хорошую регенерационную активность эксплантов, эффективность трансформации оставалась низкой, поскольку большинство полученных регенератов не выдерживало дальнейшей селективной нагрузки на фоне канамицина. Инокулирование эксплантов в течение 30 минут и последующее сокультивирование их с агробактерией на

твердой среде было наиболее эффективным и сопровождалось частотой трансформации 4,3-4,5%.

3.2.4. Изучение влияния возраста экспланта и длительности прекультивирования на эффективность генетической трансформации

Растительные клетки, как полагают P. Meyer с соавторами (1985), компетентны для трансформации только в течение короткого промежутка времени, вероятно, соответствующего S-фазе клеточного цикла, когда происходит репликация генома, поэтому для успешной трансформации необходимо чтобы большинство клеток экспланта начало подготовку к делению. Для инициации этого процесса применяют метод прекультивирования экспланта на регенерационной среде в течение определенного времени.

В наших опытах исследования проведены на семядолях и гипокотиль-ных сегментах 5-, 7- и 9-ти суточных проростков с прскультивированием в течение 2, 7, 14 и 21 сугок. Установлено, что для обоих сортов и типов экс-плантов наименее эффективным оказалось прекультивирование в течение 1421 суток вне зависимости от возраста проростка. Дчя исследованных селекционных образцов капусты белокочанной наибольшая эффективность трансформации получека в варианте с 7-суточными проростками при прекульти-вировании в течение 7 суток. Компетентность к трансформации у 9-суточиых эксплантов при прекультивировании в течение 7 суток выше, чем у 5-суточных. При этом эффективность трансформации сорта Малайка (2,3%) была выше, чем у сорта Подарок (1,6%).

Таким образом, оптимальный возраст эксплантов капусты белокочанной для трансформации с помощью векторной конструкции с геном tnf3, составляет 7-9 суток, а время прекультивирования на регенерационной питательной среде MS — 7 суток.

3.2.5* Изучение эффективности агробяктерналькой трансформации капусты белокочанной в зависимости от сорта и типа экспланта

Все оптимизированные в предшествующих опытах режимы агробакте-риальной трансформации были учтены при изучении влияния генотипа и типа экспланта на эффективность получения трансгенных растений капусты белокочанной.

Наиболее эффективно трансформация капусты белокочанной проходила на семядолях сорта Малайка (5,6%) (табл. 3). Для гипокотильных сегментов сортов Касатка, Малайка и Горлица достоверных различий по эффективности трансформации не получено (4,0,4,1 и 4,4 % соответственно).

При проведении агробактериальной трансформации капусты белокочанной изучаемых селекционных форм с использованием оптимизированных условий не удалось выявить достоверных различий по эффективности транс-

формации семядольных и гилокотильных эксшзантов. Следовательно, оба эти типа эксплантов можно рекомендовать для получения трансгенных растений капусты белокочанной.

Таблица 3 - Эффективность агробактериальной трансформации капус-

ты белокочанной в зависимости от генотипа и типа экспланта с использованием А. Гшпе/аает штамма АСЬО с бинарным вектором рБНИ 19+1ЗК, не_ сущим целевой (т/З) и маркерный (прг II) гены_

Сорт, ЛИНИЯ Тип эксп- Л£ЦлТЕ» Исследовано эксплантов, шт. Получено регенерантов, шт. Эффективность

всего трансгенных регенерации*, %±5р трансфор ма щш*, %±Б\>

Подарок сем. 316 89 6 28,2±2,5 1,9±0,8

г.с. 353 134 6 38,0+2,6 1,7+0,7

касатка сем. 333 211 15 63,4 ±2,6 4,5±1,1

г.с. 350 174 14 49,7+2,7 4,0+1,0

Малайка сем. 321 165 18 51.4+2,8 5,6+1,3

г.с. 414 170 17 41,6+2,4 4,1+1,0

Горлица сем. 340 98 16 28,8±2,5 4,7±1,1

г.с. 409 114 38 27,9±2,2 4,4+1,0

Линия 33 сем. 46 6 0 - -

г.с. 77 14 0 - -

Линия 34 сем. 91 29 0 - -

г.с. 139 17 0 - -

* - процент к исследованному числу эксплантов.

В результате проведенной трансформации были получены канамици-ноустойчивые регенеранты сортов Подарок (12 шт.), Касатка (19 шт.), Малайка (35 шт.) и Горлица (34 шт.). При помощи ПЦР-анализа подтверждено наличие в них генов пр1 Н и тр.

3.2.6. Изучение действия канамицина на регенерацию растений капусты белокочанной при подборе селективных сред

Наши исследования показали, что достаточно жестким фоном для вы браковки нетрансформированных тканей капусты белокочанной являла с концентрация канамицина 50 мг/л. Морфогенная активность эксплантов ис ходных (нетрансгенных) селекционнь!х образцов на этом фоне была невоз можна (гибель составляла 100 %). При наличии в среде 10, 25 и 50 мг/л кана мицина через две недели культивирования наблюдали незначительную реге нерационную активность, а уже после 4 недель культивирования даже самьк выносливые экспланты белели и погибали.

Поэтому для селекции трансгенных регенерантов следует использовать питательную среду М5, содержащую 50 мг/л канамицина.

3.3. Молекулярно-биоло! ический анализ растений-регенерантов капусты белокочанной, полученных в результате агробактериальной

трансформации

При длительном культивировании на селективной среде, содержащей 50 мг/л канамицина, из 180 независимых регенерантов с предположительно встроенными генами npt 11 и т/3, для молекулярно-биологического анализа было отобрано 35, характеризующихся ярко-зеленым цветом.

С помощью 1 !ЦР было доказано, что маркерный (npt 11) и целевой (т/3) гены содержат все отобранные трансформанты, из них 9 грансгенных растений капусты белокочанной, созданных на основе сорта Горлица, 13 — сорта Малайка, (5 — сорта Касатка и 7 — сорта Подарок (рис. 3).

¡V1123456789 10 Ml 23456789 10

А Б

Рисунок 3. - Электрофореграмма продуктов ГП IP капусты белокочанной: А) М - маркер молекулярной массы Gene Ruler 100 bn DNA Ladder (Fermentas, Латвия); 1 - контроль: растение copra Малайка (исходный генотип); 2, 3. 4, 5, 6. 7, 8 - растения, -несущие ген npl //; 9 - контроль, продукт ПЦР па ллачмидной ДНК; 10 - Н20.

Б) М - маркер молекулярной массы Gene Ruler 100 bp DNA Ladder (Fermentas. Латвия); 1 - контрольное растение сорта Малайка (исходный генотип); 2, 3, 4, 5 - растения-регенеранты сорта Малайка, трансформированные геном tnß; 6 ■ контрольное растение copra Горлица (исходный генотип), 7.8 растения-регенеранты copra Горлица, трансформированные геном mß: 9 - контроль, продукт ПЦР на плазмидной ДНК. 10 H¡0.

4. СКРИНИНГ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ ПОКОЛЕНИЯ Т,

4Л. Экспресс-оценка при проращивании семян капусты белокочанной на селективных фонах

4ЛЛ. Экспресс-оценка при проращивании семян Т) на фоне канамицина

Рекомбинантные ллазмиды, используемые при агробактериальной трансформации растений, содержат химерный маркерный ген устойчивости к антибиотикам, который эффективно эксперссируется в растительных клетках как доминантный менделевский признак в любом генетическом окружении (Дрейпер Дж. и др., 1991). В зависимости от места локализации Т-ДНК, её копийности и уровня экспрессии трансгена наблюдается расщепление семенного поколения трансгенных растений по маркерному и целевому генам, с сегрегацией, типичной для того или иного типа наследования.

При проращивании семян капусты белокочанной (сорт Малайка) на растворе канамицина с концентрацией 25, 50, 75 и 100 мг/л было установлено. что на фоне 100 мг/л семена не прорастали, а при 75, 50 и 25 мг/л всхожесть семян была 2,0% 16,0% и 62% соответственно (всхожесть семян на дистиллированной воде была на уровне 98,0%). Подавляющее большинство проростков при концентрации канамицина 75 мг/л погибает в течение 7 суток, а при 50 мг/л в течение 10-14 суток.

При проращивании семян, полученных при реципрокных скрещива-нииях трансгенных растений-регенерантов Мал К12, Мал К13 и Мал II14 и растений исходного селекционного образца (сорт Малайка), отмечено, что на 4-5 сутки нетрансгенные проростки начинали терять пигментацию (обесцвечивались), а на 10-14 сутки разница между трансгенными (устойчивыми к канамицину) и нетрансгенньши растениями была очевидна.

Для всех комбинаций реципрокных скрещиваний трансгснных и исходных (нетрансгенных) растений сорта Малайка с целью выявления соответствие между наблюдаемыми и ожидаемыми (теоретическими) расщеплениями признака (устойчивость к канамицину) провели вычисления по методу %2. На основании полученных данных мы сделали вывод о наличии трансгена (прг II) и характере его передачи в семенном потомстве трансгенных растени-яй поколения Т0 (табл. 4).

Трансгенные растения Мал И12 и Мал ЮЗ, в семенном потомстве которых при самоопылении и при реципрокных скрещиваниях получено расщепление по фенотипу 3:1 (устойчивые : неустойчивые), вероятно, имеют только одну вставку Т-ДНК, которая нормально транскрибируется и

Таблица 4 - Устойчивость семенного потомства трансгенных растений капусты белокочанной сорта Ма-_____лайка к канамицину

Комбинация скрещивания трансгенных растении-регенерашов Контроль (дистиллиропанная вода) Канамицин (50 мг/л) Расщепление (трансгенные : нетранс-генные) -А * А факт.

проанализировано семян. шт. энергия прорасти ния, % всхожесть. % проа-налит-ровано семян, шт. энергия прорас тания, % пехо- жесть, % проанализировано проростков, выявлено проростков, шт.

зеленых белых

Мал 0 х Мат 0 (контроль) 100 29 98 160 8,8 68,1 шт. 109 0 109 0 0

Мат 1?12 х Мал И12 100 11 97 127 7,7 87,9 112 90 22 3 : 1 1,72

Мат Я12 х Мал К. 13 100 14 92 130 11,6 89,4 116 83 33 3 : 1 0,73

Мат И12 х Мат Ш4 100 14 95 134 12,7 88.1 118 49 69 1 : 1 3,38

Мал 1*12 х Мал 0 100 13 91 125 9,1 83,2 104 45 49 1 : 1 1,88

Мат ШЗ х Мал 1*12 100 21 97 118 15,6 93,1 110 74 36 3 : 1 3,50

МатШЗхМатШЗ 100 24 99 126 17,9 94.5 119 84 35 3 : 1 1,24

Мат 1*13 х Мал К14 100 30 97 147 28,3 95.7 141 66 75 1 : 1 0.58

Мал ШЗ х Мал 0 100 27 95 130 21.5 90,5 118 61 57 1 : 1 0,14

М&1 Ш4 х Мат Я12 100 35 87 123 28,3 83,1 102 42 60 1 : 1 1,42

Мат Ш4 х Мат 1*13 100 24 97 111 16,9 92,4 103 60 43 1 •. 1 2,80

Маг 1*14 х Мат И14 100 27 93 138 10,7 81,4 123 2 121 1 : 60 0

Мат 1*14 х Мал 0 100 27 96 120 9,4 79.2 112 0 112 0 0

Мал Ох Мал 1*12 100 24 93 87 18.7 88,1 77 41 36 1 : 1 0,32

Мат Ох Мал К13 100 20 95 93 ! 15,9 91.2 85 39 46 1 : 1 0,58

Мал 0 х Мал 1*14 100 25 92 90 i 9,3 89.9 81 0 81 0 0

* -Х205 Гтео0.) = 3.84.

не влияет на жизнеспособность гамет. В этих комбинациях скрещиваний (Мал R12 х Мал R12; Мал R12 х Мал R13; Мал R13 х Мал R13 и Мал R13 х Мал R12), согласно менделеевским закономерностям наследования, по генотипу потомство должно было расщепиться на гетерозиготу (nptll+mj3/-), доминантную (nptll+mft/ npt¡I+mf3) и рецессивную (-/-) гомозиготы. При этом гетерозиготы и доминантные гомозиготы были устойчивы к канамицину, а рецессивные гомозиготы элиминировались под действием селективного фактора. При скрещивании Мал R12 и Мал R13 с контрольными (нетрансгенны-ми) растениями наблюдали ожидаемое расщепление по фенотипу (и генотипу) 1:1, при этом устойчивыми к действию антибиотика были также гетерозиготы, а рецессивные гомозиготы погибали.

Семенное поколение трансгенного растения поколения Т0 Мал RÍ4, полученное от самоопыления, расщепилось по схеме, не типичной для мен-делевского типа наследования признака. Вероятно, нормальная экспрессия трансгена в данном случае отсутствовала или была крайне снижена.

4.1.2, Экспресс-оценка при проращивании семян Т5 капусты белокочанной сорта Малайка на фоне фузариевой кислоты

Проведенная генетическая трансформация растений рапса, цветной капусты и моркови столовой с использованием A. tumefacieiis штамма AGLO с бинарным вектором pBiN19+13K, несущим маркерный ген npt II и целевой ген т/3, позволила повысить устойчивость этих культур к грибным фитопатогенам (Шумилина Д.В. и др., 2006; Baranski R., Klocke Е„ Nothnage! Т., 2007).

В связи с этим проводили экспресс-оценку устойчивости семенного поколения Ti к фузариозу проводили при проращивании семян в присутствии фузариевой кислоты в концентрации 50 мг/л. Под действием селективного агента у неустойчивых проростков наблюдали отмирание зародышевого корешка и гибель всего проростка.

Было показано, что энергия прорастания и всхожесть семян как исходного (нетрансгенного) образца, так и семян, полученных при реципрокных скрещиваниях трансгенных растений поколения Т0 на фоне фузариевой кислоты резко снижалась. Растения, полученные при самоопылении Мал R14 и при скрещивании с исходным (нетрансгенным) образцом по степени устойчивости к фузариевой кислоте не отличались от контрольных (исходных не-трансгенных) (табл. 5).

Таблица 5 - Устойчивость семенного поколения Tj капусты белоко-

чанной сорта Малайка к фузариевой кислоте (п = 100)

Селекционный образец Контроль (дистиллированная вода) Фузариевая кислота (50 м/л) Превосходство по устойчивости над исходной формой, %

энергия прораст ания, 11: всхож сеть, % энергия прораста ния, % всхожесть, % число жизнеспособных проростков, шт.

Малайка (контроль) 28 97 10 39 21 -

Ma.;iR12xMa.TR]2 10 96 12 48 35 14

Ma.nR12xMaTR13 14 92 12 50 37 16

Ma.TR12xMa.iR14 14 95 Л 46 31 10

МшЖ12хМалО 13 92 10 54 31 10

Ma.iR13xMaaR12 22 96 14 59 41 20

MajiR13xMaJiRl3 23 98 18 62 43 23

Ma .tR 13 хМалК ] 4 31 98 16 57 35 14

MariR 1 ЗхМалО 27 94 15 49 32 11

MxiR14xMa,iR12 36 85 14 43 31 10

Ma.iR14xMa.TR13 24 97 13 43 30 9

M a.aR 14xMa¡iR 14 26 93 И 41 21 -

МшШ4хМалО 28 95 10 39 21 -

Мал0хМшШ2 25 93 13 42 30 9

Ma-nOxMariRl 3 22 96 14 45 31 10

Mar0xM;uiR14 27 91 и 38 20 -

Таким образом, растения всех комбинаций скрещивания с участием трансгенных растений-регенераитои сорта Малайка Мал R12 и Мал RÎ3, показали повышенный на 9-23%уровень устойчивости на фоне фузариевой кислоты.

4.1.3. Экспресс-оценка капусты белокочанной сорта Малайка поколения Tj на устойчивость к киле (/'/, brassicae Wor.)

Устойчивость семенного поколения трансгенных растенив-регенерантов к киле (PL brassicae Wor.) проводили с использованием пипе-точного метода, предполагающего 100% заражение растений. Результаты, полученные с помощью этого метода, продемонстрировали высокую корел-ляцито с развитием симптомов, проявившихся в нормальных полевых условиях (Voorrips R., Visser D„ 1993).

Растения, полученные при самоопылении трансгенных регенерантов То сорта Малайка (Мал R12 и Мал R13), показали повышенный уровень устойчивости к PL brassicae Wor. по сравнению с контрольным негрансгенным образцом того же сорта. Однако устойчивость проростков, полученных от трансгенного растения Мал R14, осталась на уровне исходного нетрансгенно-го образца (контроль***) (табл.6).

Таблица 6 - Устойчивость растений капусты белокочанной к Р1. Ьгаз.ч-_сае У/ог. на искусственном инфекционном фоне _

ЦюПОТПДЙ O^n'lWI л iiWLkUiltiv Число растений, соответствующих баллам поражения, ¡нт. Средний балл поражения Степень развития болезни Превосходство по устойчивости ¡¡ад исходным образцом, %

0 1 2 з

Килагон Fi * 14 з - - 0,18 0.06 -

Текила F) * 16 4 - - 0,20 0,07 -

Слава 1305 ** - - 9 10 2,53 0,84 -

Грибовский 147** - - 2 19 2,90 0,97 -

Мал ОхМал 0 *** - - 4 17 2,81 0.94 -

ManR12xManR12 - 9 11 о 1,68 0,56 40,2

Мал Я12хМал R13 - 6 12 2 1,80 0,60 35,9

Мал Я12хМал R14 - - 19 1 2,05 0,68 27,0

Мал Я12хМал0 - 2 16 2 2,00 0,67 28,8

Мал R13xMan R12 - 10 9 2 1,62 0,54 42,3

Мал R13xMaл R13 1 10 10 2 1,57 0,52 44,1

Мал Я13хМал R14 - 4 19 3 1,96 0,65 30,2

Мал R13xMan 0 - 1 19 1 2,00 0,67 28,8

Мал R14xMan R12 - 1 18 3 2,09 0,70 25,6

Мал R14xMaл R13 - - 19 2 2.10 0.70 25,3

MaflR14xManR14 - - 4 15 2,79 0,93 0,7

Мал И14хМал 0 - - 4 16 2,80 0,93 0,4

Мал ОхМал R12 - - 16 3 2,16 0,72 23,1

Мал ОхМал R13 - - 24 1 2.04 0,68 27,4

Мал ОхМал R14 - - 3 14 2,82 0,94 -0,1

* - контроль устойчивости; * - контроль восприимчивое чти ; *** - исходный (негрансгенный) селекционный образец.

В результате проведенной оценки все изучаемые образцы капусты белокочанной были условно распределены по степени поражения килой. В группу со средним баллом поражения (1-1,9) вошли 5 образцов: Мал ШЗхМал R13, Мал R13xMaii R12, Мал R12xMaii R12, МалИ]2хМал R13 и ManR13xMan R14. На боковых корнях этих растений наблюдались мелкие опухоли. В группу со средним баллом поражения (2-3) были объединены 11 образцов: Мал RI3 х Мал 0, Мал R12 х Мал 0, Мал 0 х Мал R13, Мал RÎ2 х Мал R14 и другие. На главном и боковых корнях этих растений были отмечены средние и крупные опухоли. Исходная (нетрансгенная) форма Мал 0 х Мал 0 имела балл поражения 2,81.

При изучении устойчивости к киле семенного поколения трансгенного растения капусты белокочанной сорта Малайка Мал R14 не удалось установить достоверных различий с контрольными иетрансгенными растениями этого сорта. Это соответствует данным, полученным ранее при экспресс-оценке семенного поколения Tj на селективных фонах с канамишиюм и фу-зариевой кислотой и, вероятно, обусловлено теми же причинами.

Таким образом, установлено, что семенное потомство, полученное во всех проведенных комбинация скрещиваний с участием трансгенных растс-шш-регенерантов сорта Малайка Мал R12 и Мал R13, превосходило нетранс -генные раст ения этого сорта по устойчивости к патогену Pl. brassicae Wor. на 23-44%.'

4.1.4. Молскулярно-Ппологичсский анализ трансгенных растений капусты белокочанной поколения Ть выделившихся при экспресс-оценке на селективных фонах (фузарисвая кислота, Pl. brassicae Wor.)

Для подтверждения соответствия между устойчивостью трансгенных растений сорта Малайка к фитопатогенам и экспрессией целевого гена mß, был проведен ПЦР-анализ растений, у которых проявилась устойчивость на селективном фоне с фузариевой кислотой и Fl. brassicae Wor.

Дпя этого было отобрано 44 образца с баллом поражения килой 0-1: Мал R13xMan R13 (î 1 растений), Мал Н13хМал Ri2 (10), Мал Я12хМал R12 (9), Мал R12xMa;ï R13 (6), Мал R13xMan R14 (4), Мал К13хМал 0 (1), Мал R ! 2хМал 0 (2) и Мал R14xMan R12 (1), а также проростки, оказавшиеся наиболее устойчивыми на фоне фузариевой кислоты (всего 35 шт.)

У всех тестируемых образцов (79 шт.) была показана положительная ГЩР-реакция на наличие mß-гена. Следовательно, повышенная устойчивость трансгенных растений к фитопатогенам (Fusarium ssp. и Pl. brassicae Wor.) обеспечивается экспрессией этого гена.

4.2. Характеристика трансгенных растеннй капусты белокочанной по морфологическим признакам

Трансгенные растения капусты белокочанной со встроенным геном т/3 и контрольные (нетрансгенные) растения исходных селекционных образцов по мере их получения и адаптации к условиям окружающей среды (ноябрь 2008 г.- февраль 2009 г.) были высажены в вегетационные сосуды и перенесены в условия защищенного фунта для прохождения дальнейших этапов онтогенеза. Наблюдения показали, что у трансгенных растений поколения То, несущих гены т/З и пр{ ¡1, фенотип не был изменен, они были фер-тильны и на них образовались семена. С целью установления характера наследования трансгена в семенном потомстве Т, были проведены самоопыление и реципрокные скрещивания на трансгенных растениях-регенерантах сорта Малайка (Мал Ю2, Мал ШЗ и Мал Ш4) и растениях исходного (не-трансгенного) образца (всего 16 комбинаций).

Было установлено, что семена, полученные от трансгенного растения Мал Я12, имели неправильную, слегка угловатую форму, малую массу и отличались от контрольных малыми линейными размерами (масса 1000 семян растения Мал Я12 была в 2 раза ниже, длина и ширина семени соответственно — в 1,8 и 1,7 раза меньше, чем в контроле), однако это не оказало влияния на их всхожесть и жизнеспособность. Семена, полученные во всех комбинациях от трансгенных растений Мал Г? 13 и Мал К14, по своим морфологическим признакам не отличались от семян исходной нетрансгенной формы (сорт Малайка).

Также была проведена оценка соответствия морфологических признаков нетрансгенных исходных селекционных образцов капусты белокочанной и трансгенных растений поколения Т0, не прошедших яровизацию и образовавших кочаны. Среди этих растений также не наблюдали каких-либо изменений фенотипа, достоверно отличающихся от исходных (нетрансгенных) сортообразцов.

БЫВ ОДЫ

1.Оптимизированы условия регенерации капусты белокочанной при использовании семядолей и гипокотильных сегментов. Установлено, что:

• для повышения регенерационной активности капусты белокочанной (сорт Подарок, Касатка, Малайка и линия 34) лучшей является питательная среда МБ, содержащая БАП в концентрации 2,0 мг/л и НУК в концентрации 0,1 мг/л, которая позволяет получить в течение 7-9 недель в среднем по 10-19 адвентивных почек на один гипокотильный сегмент и по 1-6 почек из каллуса, образовавшегося на срезе черешка семядоли;

• для индукции каллусогенеза капусты белокочанной наиболее эффективно использование среды MS, содержащей 3,0 мг/л БАП и 4,0 мг/л НУ К или 1,0 мг/л БАП и 1,0 мг/л НУК;

• поддержание в культуре in vitro и клоналъное размножение микропобегов капусты белокочанной необходимо осуществлять на среде MS, содержащей БАП в концентрации 1,0 мг/л и НУК в концентрации 0,1 мг/л.

2. Оптимизированы условия получения трансгенных растений с помощью A. tumefaciens, применительно к сортам капусты белокочанной Подарок, Малайка, Касатка и Горлица и штамму AGLO с бинарным вектором pBiN19+13K, несущим маркерный (npt II) и целевой (tnß) гены: определены оптимальная плотность суспензии агробактерий, эффективный способ поранения эксплантов, длительность инокулирования и сокультивирования экс-шгантов с агробактерией, оптимальный возраст экспланта и длительность его прекультивирования. Установлено, что:

« эффективным способом поранения эксплантов является удаление около 50% эпидермиса (в виде тонких полос) с гипокотильных сегментов и свежий срез черешка семядоли, что обеспечивает частоту морфогенеза на уровне 66,0-61,7%;

» шюкулнрование эксплантов капусты белокочанной в течение 30 минут в суспензии агробактерий с плотностью И)5 клеток/мл с последующим сокультивированием на агаризованной среде в течение 2-3 суток является оптимальным. при этом выход канамициноустойчивых трансготантов составляет 4,3-4,5%;

• оптимальный возраст эксплантов капусты белокочанной для трансформации А. tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN 19+13К, несущим целевой (т/3) и маркерный (npt II) гены, составляет 7-9 суток; оптимальное время прекультивирования на регеиерационной питательной среде MS — 7 суток.

3. Получены трансгенные растения капусты белокочанной, отличающиеся повышенной устойчивостью к PI. brassicae War. и Fusarium ssp. , на основе генетической трансформации капусты белокочанной с помощью А. tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN19+13K, несущим целевой ген tnß, кодирующий синтез МРЗ-белка, гомологичного пептидил-пролшы/кс/транс-изомеразам FKBP-типа, и маркерный ген npt //, придающий устойчивость к канамицину. Наличие введенных генов доказано с помощью ПЦР-анализа. Установлено, что:

• в семенном поколении Т, капусты белокочанной сорта Малайка при проращивании семян на фоне канамицина, устойчивость к этому антибиотику, обеспеченная наличием маркерного гена npt II, наследуется как доминантный менделевский признак;

• устойчивость семенного поколения к фузариозу (Fusarium ssp.) на 9-23%, а к киле крестоцветных (PI. brassicae Wo г.) на 21-44% выше по сравнению с исходным (нетрансгенным) образцом при экспресс-оценке на селективном фоне;

• имеется высокая степень соответствия между устойчивостью растений Ti капусты белокочанной к фитопатогенам и наличием в их геноме гена mß, доказанная с помощью ПЦР-анализа;

• трансгенные растения капусты белокочанной поколений 1 n~ 11 по м о р ф о л о г и чсс к им признакам не отличались от растений исходного (нетранс-генного) селекционного образца.

Предложения для нспвльзсизния в сслскциинион практике

С целью получения трансгенных растений капусты белокочанной устойчивых к PI. brassicae Wor. и Fusarium ssp. с помощью A. tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN19+13K, несущим целевой ген mß, кодирующий синтез MF3-белка (гомолог пептидил-пролил-цис/транс-изомераз FKBP-типа) и маркерный ген npt И, придающий устойчивость к ка-намицину, рекомендуется:

1) для повышения регенерационной активности семядолей и гипоко-тильных сегментов капусты белокочанной использовать питательную среду MS, дополненную 6-бензиламинопурином в концентрации 2,0 мг/л и а-нафтилуксусной кислотой в концентрации 0,1 мг/л;

2) поддержание в культуре in vitro и клоналыюе размножение микропобегов капусты белокочанной необходимо осуществлять на среде MS, содержащей БАП в концентрации 1,0 мг/л и НУК в концентрации 0,1 мг/л;

3) для агробактериальной трансформации капусты белокочанной рекомендуется:

• D УОп^лти^ штппштлт) iiprtnni.onnaTL лймаплтги т» riinnvATiini in то лог .

- D ни 1VV1 UV ч/UV«!. JU1 л I UU I1W1IUJIU^UUU 111 VViU/^V/Jltl 11 J hlt^lw J IIVIUXIUIV VV1

менты 7-9-суточных асептических проростков;

s прекульт1ВироБать экспланты на питательной среде MS, содержащей 2,0 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК, в течение 7 суток;

• перед инкулированием эксплантов проводить удаление около 50% эпидермиса (в виде тонких полос) с гипокотильных сегментов и делать свежий срез черешка семядоли;

• использовать суспензию агробактерий с концентрацией Ю5 клеток/мл;

• инокулировать экспланты в суспензии агробактерий в течение 30 минут; последующее сокультивирование проводить на агаризованной среде в течение 2-3 суток;

• селекцию трансформантов проводить на среде MS, содержащей 2,0 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК и 50 мг/л канамицина;

• подтверждение трансгенной природы проводить с помощью ПЦР-реакции на наличие т/3 и npt II генов;

• оценку на устойчивость к фузариозу и киле проводить с использованием методов экспресс-оценки на селективных фонах (фузариевая кислота, PL brassicae War.)-,

4) полученные трансгенные формы капусты белокочанной с геном mß могут быть использованы для селекции на устойчивость к киле и фузариозу.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Зонтикова, С.А. Трансгенные растения овощных культур: способы получения и перспективы использования /A.B. Поляков, О.Ф. Чикризова, С.А. Зонтикова /72-й Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» Москва, 22 - 23 октября 2007 г.- М.: Отделение биологических наук РАН, 2007.- С. 73

2. Зонтикова, С.А. Эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleráceo L.) в культуре микроспор /A.B. Поляков, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова ЛТезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-Г1РЕСС, 2008. — С. 306-307.

3. Зонтикова, С.А. Регенерационная способность капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) /С.А. Зонтикова, A.B. Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков, Г.Н. Ралдугина //Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 136-137.

4. Зонтикова, С.А. Наночастицы серебра in vivo и in vitro технологиях /A.B. Поляков, О.Ф. Чикризова, О.И. Ситникова, A.A. Егорова, H.H. Лебедева, С.А. Зонтикова, М.И. Иванова, Ж.В. Куршева, О.В. Бакланова, К.Л. Алексеева, М.А. Демидкина, A.A. Ревина // Актуальные проблемы биоэкологи. Сб. материалов Международной научно-практической конференции, 21-24 октября 2008 г. — М.: Диоиа, 2008. — с. 180-181.

5. Зонтикова, С.А. Влияние регуляторов роста на морфо- и каллусоген-ную активность капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) /С.А. Зонтикова, A.B. Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков //Сб. науч. трудов по овощеводству и бахчеводству к 110-летию со дня рождения Б.В. Квасникова. — Верея, 2009, —С. 194-197.

Н.Н.Давыдова, К. Рабей //Сб. науч. трудов V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние н перспективы развития», часть 1 (Москва, 16-20 марта 2009 г.). — М.: ЗАО «Экспо-бисхим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. — С. 258-259.

7. Зонтикова, С.А. Генетическая трансформация капусты для повышения устойчивости к фитопатогенам /С.А. Зонтикова, О.Ф. Шарафова, A.B. Поляков //Картофель и овощи — 2009. — №7. — С.24-25.

8. Зонтикова, С.А. Получение трансгенных растений капусты белокочанной /С.А. Зонтикова, О.Ф. Шарафова, A.B. Поляков // Актуальные проблемы нанобиотехнологии и инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов: Материалы V Российской научно-практической конференции. — М.: РАЕН, 2009. — 250 с. — С. 50-57.

Подписано в печать 2.10.2009. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Кол-во знаков 39835 Тираж 100 экз. Заказ № 41

Отпечатано в ООО «Полиграф-Бизнес» Московская обл., г. Раменское, ул. Красноармейская, 133

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Зонтикова, Светлана Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Генетическая трансформация растений

1.1.1. Успехи в генетической трансформации сельскохозяйственных растении

1.1.2. Теоретические основы генетической трансформации расте

1.1.3. Методы генетической трансформации растений

1.1.4. Экспрессия трансгена в растительном организме

1.2. Изучение регенерационной активности растений в культуре in vitro

1.2.1. Морфогенетический ответ растений при регенерации в культуре in vitro

1.2.2. Зависимость морфогенеза от генотипа

1.2.3. Зависимость морфогенеза от типа экспланта

1.2.4. Зависимость морфогенеза от питательной среды

1.3. Систематическое положение и особенности биологии капусты белокочанной {Brassica oleracea var. capitata L.)

1.4. Болезни капусты белокочанной, вызываемые Plasmodiophora brassicae Wor. и фитопатогенными грибами рода Fusarium

2. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ, ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ, СХЕМЫ И МЕТОДИКИ ОПЫТОВ

2.1. Цель, задачи и схема исследований

2.2. Условия проведения исследований

2.3. Материал и методы проведения исследований

2.3.1. Исходный материал

2.3.2. Методика опытов

2.3.3. Математическая обработка экспериментальных данных

3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ (Brassica oleracea var. capitata L.) НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ {Plasmodiophora brassicae ^ Wor., Fusarium ssp.)

3.1. Сравнение регенерационной активности семядольных и гипо-котильных сегментов капусты белокочанной на питательных средах с различных сочетанием и концентрацией регуляторов роста

3.2. Агробактериальная трансформация капусты белокочанной

3.2.1. Определение оптимальной плотности суспензии агробакте-рий для эффективной трансформации капусты белокочанной

3.2.2. Определение наиболее эффективного способа поранения экс-плантов при агробактериальной трансформации капусты белокочанной

3.2.3. Определение оптимальной длительности инокулирования и сокультивирования эксплантов с агробактерией

3.2.4. Изучение влияния возраста экспланта и длительности пре-культивирования на эффективность генетической трансформации

3.2.5. Изучение эффективности агробактериальной трансформации капусты белокочанной в зависимости от генотипа и типа экспланта

3.2.6. Изучение действия кананмицина на регенерацию растений капусты белокочанной при подборе селективных сред

3.3. Молекулярно-биологический анализ растений-регенерантов капусты белокочанной, полученных в результате агробакте-риальной трансформации

4. СКРИНИНГ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ ПОКОЛЕНИЯ Т,

4.1. Экспресс-оценка при проращивании семян капусты белокочанной на селективных фонах

4.1.1. Экспресс-оценка при проращивании семян Ti на фоне кана-мицина

4.1.2. Экспресс-оценка при проращивании семян Т] капусты белокочанной сорта Малайка на фоне фузариевой кислоты

4.1.3. Экспресс-оценка капусты белокочанной сорта Малайка поколения Ti на устойчивость к киле {Plasmodiophora brassicae Wor.)

4.1.4. Молекулярно-биологический анализ трансгенных растений капусты белокочанной поколения Ть выделившихся при экспресс-оценке на селективных фонах (фузариевая кислота, Plasmodiophora brassicae Wor.)

4.2. Характеристика трансгенных растений капусты белокочанной по морфологическим признакам ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Генетическая трансформация капусты белокачанной (Brassica oleracea var. capitata L.) в селекции на устойчивость к фитопатогенам (Plasmodiophora brassicae Wor., Fusarium ssp.)"

•Актуальность темы. Капуста белокочанная (Brassica oleracea var. capi-tata L.) — одна из самых распространенных овощных культур во всем мире. В настоящее время в нашей стране капусту белокочанную выращивают на площади 161,7 тыс. га, что составляет 21,6% от всех площадей, занятых под овощами. Не менее востребована эта овощная культура и в других странах мира. Так, в США, по официальным данным (http://www.usda.gov/nass/pubs/ vegetablecruci-ferstatusup-date2004.pdf), за период 1996-1999 гг. суммарный доходы от продажи капусты белокочанной на мировом и внутреннем рынке страны вырос с 228 млн. до 312 млн. долларов и продолжает оставаться на этом уровне.

Капуста является ценным пищевым и диетическим продуктом питания. Она обладает богатым химическим составом. В кочанах содержится в среднем 8,5% сухого вещества, в состав которого входят: углеводы (сахара) — в среднем 4,2%; азотистые вещества (в т.ч. аминокислоты}; минеральные вещества, такие как соли кальция, магния, железа и др.; витамины группы В, РР, К, U, много витамина С и провитамина А (каратиноидов). Не менее ценны и имеющиеся в капусте горчичные масла, нормализующие работу кишечника. Кроме того, белокочанная капуста широко признанна как ценный источник пищевых волокон. Клетчатка капусты способствует выведению из организма жироподобных веществ, и, в частности, холестерина (Петруш-ко Ю.Н., 2003). Немаловажное значение капуста имеет и в качестве кормового растения.

В связи с этим, получение стабильного урожая капусты белокочанной является одной из важнейших задач отечественного растениеводства. Однако многочисленные заболевания, которым подвержена капуста, приводят к потерям значительной части урожая и сильно снижают качество продукции.

Гриб Plasmodiophora brassicae Wor. — один из самых распространенных патогенов капусты. Вызываемое им заболевание, получившее название «кила», является одним из наиболее вредоносных для представителей семейства крестоцветных. В России это заболевание встречается в большинстве областей страны. Болезнь приводит к снижению урожая на 10-60% и более. В годы сильного проявления болезни недобор урожая капусты на зараженных килой участках составляет 400-500 центнеров с гектара (Мазин В.В., Проценко Е.П., 1976).

Фузариоз (или фузариозное увядание), вызываемое грибами рода Fusarium — еще одно не менее серьезное заболевание капусты, поражающее корневую и сосудистую систему растений. После проникновения патогена в ткани молодые растения быстро отмирают, взрослые вначале желтеют, сбрасывают листья и в последствии также отмирают. Гибель растений от фуза-риоза в некоторые годы может достигать 20-25% (Ахатов А.К. и др., 2006). Болезнь наиболее вредоносна в районах с высокой температурой почвы.

Высокая подверженность капусты белокочанной болезням вызывает необходимость получения устойчивых форм, тем более что в последние годы в производстве особое внимание стали уделять технологиям, сортам и гибридам, приводящим к получению высокой выровненности, товарности и урожайности (Литвинов С.С., 2008). При использовании традиционных методов селекции создание устойчивых форм является длительным и трудоёмким процессом. Однако решение этой задачи может быть ускорено благодаря новым прогрессивным методам биотехнологии, и в частности, генной инженерии растений (Шевелуха B.C., 2005). Генетическая инженерия обладает широкими возможностями в защите растений, поскольку её методы позволяют включать чужеродные гены в геном растений. Введение чужеродных генов в растительные клетки называют «генетической трансформацией».

Методом генетической трансформации уже получены растения, устойчивые к вирусным заболеваниям (одними из первых были трансформированы табак, папайя, картофель, рис, томат, огурец, люцерна); бактериальным (картофель); грибам (рис, табак, рапс); насекомым-вредителям (хлебные злаки, табак, хлопок, томат, картофель); окислительному стрессу (табак) и др. Ведутся работы по агробактериальной трансформации растений с целью регуляции времени созревания плодов; улучшения внешнего вида плодов; изменения пищевой ценности (белкового и липидного состава); улучшения вкуса; получения новых окрасок цветков декоративных культур и т.д. (Глик Б., Пастернак Дж., 2002).

Трансформацию растений осуществляют различными способами, однако наиболее распространенным, эффективным и апробированным на разнообразных видах растений является метод агробактериальной трансформации с помощью модифицированных штаммов Agrobacterium tumefaciens и А. rhizogenes.

Целью наших исследований являлось получение трансгенных растений капусты белокочанной, устойчивых к фитопатогенам {Plasmodiophora brassicae Wor., Fusarium ssp.).

Объект исследований — технология получения трансгенных растений капусты белокочанной со встроенным геном т/3, придающим устойчивость к фитопатогенам {Plasmodiophora brassicae Wor.,Fusarium ssp.).

Предмет исследований — семядоли и гипокотильные сегменты проростков 2 линии (33, 34) и 4 сортов (Подарок, Касатка, Малайка, Горлица), растения-регенеранты и трансформанты капусты белокочанной.

Научная новизна работы. Дана характеристика морфогенетического потенциала 6 селекционных образцов среднепоздней капусты белокочанной и подобрано оптимальное сочетание и концентрация регуляторов роста для их регенерации в культуре in vitro. Впервые с помощью векторной конструкции с геном mf3 проведена агробактериальная трансформация капусты белокочанной и получены трансгенные формы, которые характеризуются повышенной устойчивостью к киле {PL brassicae Wor.) и фузариозу {Fusarium ssp.) и могут быть использованы как исходный материал в дальнейшей селекционной работе. Определен характер наследования трансгена в поколении Ть а также устойчивость трансгенных растений капусты белокочанной к киле {PL brassicae Wor.) и фузариозу {Fusarium ssp.).

Практическая ценность. Оптимизированы условия регенерации и агробактериальной трансформации капусты белокочанной (сочетание и концентрация регуляторов роста, плотность суспензии агробактерий, способ поранения эксплантов, длительность инокулирования и сокультивирования эксплантов с агробактерией, оптимальный возраст экспланта и длительность его прекультивирования), которые могут быть использованы при размножении этой культуры в условиях in vitro и для создания генетически модифицированных растений капусты белокочанной с определенными хозяйственно-ценными признаками. Получено 12. трансгенных форм сорта Малайка со встроенным геном т/3, которые характеризуются повышенной на 23-44% устойчивостью к киле (PL brassicae JVor.) и на 9-23% — к фузариозу (Fusarium ssp.) по сравнению с исходным (нетрансгенным) образцом, которые могут быть использованы в селекции капусты белокочанной.

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены и представлены на II Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2007), IX Международной научной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологи» (Москва, 2008), IX Молодежной научной конференции, посвященной памяти Г.С. Муромцева (Москва, 2009); на Международной научно-практической конференции, посвящённой памяти Б.В. Кваснико-ва (Верея, 2009), V Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы нанобиотехнологии и инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2009).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• оптимизированные условия генетической трансформации капусты белокочанной с использованием Agrobacterium tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN 19+13К, несущим маркерный, (npt II) и целевой (т/3) ген, кодирующий MF3-белок;

• трансгенные растения капусты белокочанной поколений Т0 и Ть несущие целевой ген т/3 и маркерный ген npt II и отличающиеся повышенной устойчивостью к киле (PL brassicae Wor.) и фузариозу (Fusarium ssp.).

Публикации результатов исследований

По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе одна в журнале «Картофель и овощи», рекомендованном ВАК РФ.

1. Зонтикова, С.А. Трансгенные растения овощных культур: способы получения и перспективы использования /А.В. Поляков, О.Ф. Чикризова, С.А. Зонтикова //2-й Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» Москва, 22 — 23 октября 2007 г.- М.: Отделение биологических наук РАН, 2007.- С. 73

2. Зонтикова, С.А. Эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica ol-eracea L.) в культуре микроспор /А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова //Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 306-307.

3. Зонтикова, С.А. Регенерационная способность капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) /С.А. Зонтикова, А.В. Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков, Т.Н. Ралдугина //Тезисы IX Международной конференции

Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 136-137.

4. Зонтикова, С.А. Наночастицы серебра in vivo и in vitro технологиях /А.В. Поляков, О.Ф. Чикризова, О.И. Ситникова, А.А. Егорова, Н.Н. Лебедева, С.А. Зонтикова, М.И. Иванова, Ж.В. Куршева, О.В. Бакланова, К.Л. Алексеева, М.А. Демидкина, А.А. Ревина // Актуальные проблемы биоэкологи. Сб. материалов Международной научно-практической конференции, 21-24 октября 2008 г. — М.: Диона, 2008. — с.180-181.

5. Зонтикова, С.А. Влияние регуляторов роста на морфо- и каллусоген-ную активность капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) /С.А. Зонтикова, А.В. Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков //Сб. науч. трудов по овощеводству и бахчеводству к 110-летию со дня рождения Б.В. Квасникова. — Верея, 2009. — С. 194-197.

6. Зонтикова, С.А. Генетический и морфофизиологический полиморфизм овощных культур и использование его в селекции на устойчивость к стрессам /А.В.Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова, Н.Н. Давыдова, К. Рабей //Сб. науч. трудов V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 1 (Москва, 16-20 марта 2009 г.). — М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. — С. 258-259.

7. Зонтикова, С.А. Генетическая трансформация капусты для повышения устойчивости к фитопатогенам /С.А. Зонтикова, О.Ф. Шарафова, А.В. Поляков //Картофель и овощи — 2009. — №7. — С.24-25.

8. Зонтикова, С.А. Получение трансгенных растений капусты белокочанной /С.А. Зонтикова, О.Ф. Шарафова, А.В. Поляков // Актуальные проблемы нанобиотехнологии и инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов: Материалы V Российской научно-практической конференции. — М.: РАЕН, 2009. — 250 с. — С. 50-57.

Объем и структура диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Зонтикова, Светлана Анатольевна

выводы

1. Оптимизированы условия регенерации капусты белокочанной при использовании семядолей и гипокотильных сегментов. Установлено, что:

• для повышения регенерационной активности капусты белокочанной (сорт Подарок, Касатка, Малайка и линия 34) лучшей является питательная среда MS, содержащая БАП в концентрации 2,0 мг/л и НУК в концентрации 0,1 мг/л, которая позволяет получить в течение 7-9 недель в среднем по

10-19 адвентивных почек на один гипокотильный сегмент и по 1-6 почек из каллуса, образовавшегося на срезе черешка семядоли;

• для индукции каллусогенеза капусты-белокочанной наиболее эффективно использование среды MS, содержащей 3,0 мг/л БАП и 4,0 мг/л> НУК или 1,0 мг/л БАП и 1,0 мг/л НУК;

• поддержание в культуре in vitro и клональное размножение микропобегов капусты белокочанной необходимо осуществлять на среде MS, содержащей БАП в концентрации 1,0 мг/л и НУК в концентрации 0,1 мг/л.

2. Оптимизированы условия получения, трансгенных растений с помощью A. tumefaciens, применительно к сортам капусты белокочанной Подарок, Малайка, Касатка и Горлица и штамму AGLO с бинарным вектором pBiN19+13K, несущим маркерный (npt II) и целевой (т/3) гены: определены оптимальная плотность суспензии агробактерий, эффективный способ поранения, эксплантов, длительность инокулирования и сокультивирования эксплантов с агробактерией, оптимальный возраст экспланта и длительность его прекультивирования. Установлено, что:

• эффективным способом поранения эксплантов является удаление около 50% эпидермиса (в виде тонких полос) с гипокотильных сегментов и свежий срез черешка семядоли, что обеспечивает частоту морфогенеза на уровне 66,0-61,7%;

• инокулирование эксплантов капусты белокочанной в течение 30 минут в суспензии агробактерий с плотностью 105 клеток/мл с последующим сокультивированием на агаризованной среде в течение 2-3 суток является оптимальным, при этом выход канамициноустойчивых трансплантов составляет 4,3-4,5%;

• оптимальный возраст эксплантов капусты белокочанной для трансформации A. tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN 19+13К, несущим целевой (т/3) и маркерный (npt II) гены, составляет 7-9 суток; оптимальное время прекультивирования на регенерационной питательной среде MS — 7 суток.

3. Получены трансгенные растения капусты белокочанной, отличающиеся повышенной устойчивостью к PL brassicae Wor. и Fusarium ssp. , на основе генетической трансформации капусты белокочанной с помощью A. tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN19+13K, несущим целевой ген т/3, кодирующий синтез MF3-белка, гомологичного пептидил-пролил-г/мс/транс-изомеразам FKBP-типа, и маркерный ген npt II, придающий устойчивость к канамицину. Наличие введенных генов доказано с помощью ПЦР-анализа. Установлено, что:

• в семенном поколении Ti капусты белокочанной сорта Малайка при проращивании семян на фоне канамицина, устойчивость к этому антибиотику, обеспеченная наличием маркерного гена npt II, наследуется как доминантный менделевский признак;

• устойчивость семенного поколения Ti к фузариозу (Fusarium ssp.) на 9-23%, а к киле крестоцветных (PL brassicae Wor.) на 21-44% выше по сравнению с исходным (нетрансгенным) образцом при экспресс-оценке на селективном фоне;

• имеется высокая степень соответствия между устойчивостью растений Ti капусты белокочанной к фитопатогенам и наличием в их геноме гена mf3, доказанная с помощью ПЦР-анализа;

• трансгенные растения капусты белокочанной поколений Т0-Т] по морфологическим признакам не отличались от растений исходного (нетранс-генного) селекционного образца.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ

ПРАКТИКЕ

С целью получения трансгенных растений капусты белокочанной устойчивых к PL brassicae Wor. и Fusarium ssp. с помощью A. tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN19+13K, несущим целевой ген mf3, кодирующий синтез MF3-белка (гомолог пептидил-пролил-цис/транс-изомераз FKBP-типа) и маркерный ген npt II, придающий устойчивость1 к канамицину, рекомендуется:

1) для повышения регенерационной активности семядолей и гипоко-тильных сегментов капусты белокочанной использовать питательную среду MS, дополненную 6-бензиламинопурином в концентрации 2,0 мг/л и а— нафтилуксусной кислотой в концентрации 0,1 мг/л;

2) поддержание в культуре in vitro и клональное размножение микропобегов капусты белокочанной необходимо осуществлять на среде MS, содержащей БАП в концентрации 1,0 мг/л и НУК в концентрации 0,1 мг/л;

3) для агробактериальной трансформации капусты белокочанной рекомендуется:

• в качестве эксплантов использовать семядоли и гипокотильные сегменты 7-9-суточных асептических проростков;

• прекультивировать экспланты на питательной среде MS, содержащей 2,0 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК, в течение 7 суток;

• использовать суспензию агробактерий с концентрацией 105 клеток/мл;

• селекцию трансформантов проводить на среде MS, содержащей 2,0 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК и 50 мг/л канамицина;

• подтверждение трансгенной природы проводить с помощью ПЦР-реакции на наличие mf3 и npt II генов;

• оценку на устойчивость к фузариозу и киле проводить с использованием методов экспресс-оценки на селективных фонах (фузариевая кислота, PL brassicae Wor.);

4) полученные трансгенные формы капусты белокочанной с геном mf3 могут быть использованы для селекции на устойчивость к киле и фузариозу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Генетически модифицированные растения в промышленных масштабах выращиваются уже более 15 лет. За это время методами генной инженерии и биотехнологии созданы сорта, устойчивые к вирусам, грибным и бактериальным фитопатогенам, насекомым-вредителям, гербицидам, засухе, засолению, характеризущиеся измененными сроками созревания и хранения, вкусовыми качествами и др. Создание отечественных сортов трансгенных растений с новыми хозяйственно-ценными свойствами является приоритетной задачей.

Методом агробактериальной трансформации с использованием A. tumefaciens штамма AGLO с бинарным вектором pBiN19+13K, несущим целевой ген mf3, кодирующий синтез MF3-белка (гомолог пептидил-пролил-цис/транс-изомераз FKBP-типа) нами были получены трансгенные растения капусты белокочанной, отличающиеся' повышенной? устойчивостью к PL brassicae Wor. и Fusarium 'ssp.

В результате проведенных исследований подобрано- оптимальное сочетание и концентрация регуляторов роста для повышения регенерационной активности семядолей и гипокотильных сегментов проростков; оптимизированы условия' агробактериальной. трансформации применительно к используемому штамму агробактерий и исходным селекционным образцам, что позволило получать трансгенные растения капусты белокочанной с эффективность трансформации 4,0-5,6%. Трансгенная природа растений-регенерантов поколений То и Ti была подтверждена методом ПЦР-анализа.

Анализ семенного поколения Т\ показал, что гены npt II и mf3 наследуются! как доминантный менделевский признак. Экспресс-оценка растений поколения Ti выявила повышение их устойчивости к фитопатогенам (PL brassicae Wor. и Fusarium ssp.) по сравнению с исходными (нетрансгенными) образцами. Проведенный ПЦР-анализ показал высокую-степень соответствия между устойчивостью растений Tj капусты белокочанной к фитопатогенам и наличием в их геноме гена т/3. При этом между трансгенными и исходными нетрансгенными) растениями капусты белокочанной не было обнаружено достоверных различий по морфологическим признакам.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Зонтикова, Светлана Анатольевна, Москва

1. Агротехника выращивания белокочанной капусты. Рекомендации. /Л. Д. Бондаренко, В.Е. Болахоненко, Н.А. Карецкая, В.К. Чирков. — Краснодар, 1984. —55 с.

2. Артамонов, В.И. Растения и чистота природной среды / В.И.Артамонов. — М.: Наука, 1986. — 113 с.

3. Атанасов, А. Биотехнология в растениеводстве /А. Атанасов Новосибирск: Институт цитологии и генетики СО РАН, 1993.- 241с.

4. Ахатов, А.К. Защита овощных культур и картофеля от болезней

5. А.К.Ахатов, Ф.С.Джалилов, О.О.Белошапкина и др.; /под ред. А.К.Ахатова и Ф.С.Джалилова. Москва, 2006. 352.с.

6. Белоногова, М.А. Генетическая трансформация льна-долгунца с использованием семядольных эксплантов: Автореферат дис.к.б.н. /ИФР РАН — М., 2006. —24 с.

7. Биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ. /Под ред. И.Хиггинса, Д.Беста, Дж. Джонса. М.:Мир, 1988. - 480 с.

8. Егоров, Н.С. Биотехнология: Проблемы и перспективы /Н.С.Егоров, А.В.Олескин, В.Д.Самуилов Учеб.пособие для вузов. В 8 кн. /под ред Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. М.: Высшая школа, 1987- 142 с.

9. Бутенко, Р.Г. Биотехнология: Клеточная инженерия Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. /под ред Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. /Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф. Киркин, Т.Г. Корженевская, Е.Н.Маркарова М.: Высшая школа, 1987- 128 с.

10. Быков, В.А. Биотехнология: Производство белковых веществ. Учеб.пособие для вузов. В 8 кн. /под ред Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. /В.А.Быков, М.Н.Манаков, В.И.Панфилов и др. М.: Высшая школа, 1987142 с.

11. Бунин, М.С. Методы репродуктивной биологии в селекции овощных культур рода Brassica L. /М.С. Бунин, Н.А. Шмыкова, В.А. Степанов, В.И.

12. Старцев, JI.JI. Бондарева //Методические указания и рекомендации по селекции и семеноводству капустных культур. — М.: ВНИИССОК, 2007. — 280 С. —с. 199-237.

13. Богомолов, М.А. Пыльцевые трубки — биологический вектор в генной инженерии сахарной свеклы / М.А. Богомолов //IV Московский Международный Конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития. 4.1. — М.,2007. —с.258.

14. Будынков, Н.И. Фузариозное увядание огурца в защищенном грунте / Н.И. Будынков, Е.Ф. Никифорова, В.Н. Юваров // М.: Гавриш, 1999. N 6.-С.16.

15. Булычева, Н.В. Изучение влияния различных типов со-культивации на эффективность трансформации тополя / Н.В. Булычева, М.С. Иноземцева,

16. A.M. Камионская //Материалы I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге. — СПб., 2006. — с.136-137.

17. Бунин, М.С. Использование биотехнологических методов для получения исходного селекционного материала капусты / М.С. Бунин, Н.А. Шмыко-ва. — М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2004. — 44 с.

18. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных растительных тканей и физиология морфогенеза растений / Р.Г. Бутенко. — М.: Наука, 1964.

19. Вехов, В.Н. Практикум по анатомии и морфологии высших растений /

20. B.Н. Вехов, Л.И. Лотова, В.Р. Филин. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1980. — 196 с.

21. Вдовитченко, М.Ю. Культивируемые in vitro корни копеечника чайного и образование в них фенольных соединений / М.Ю. Вдовитченко, И.Н. Ку-зовкина, X. Пэтц, Б. Шнайдер //Физиология растений, 2007, Т.54, №4. — с.604-613.

22. Гапоненко, А.К. Эффективность трансформации незрелых зародышей подсолнечника / А.К. Гапоненко, И.П. Воронина, Ю.Д. Белецкий //Новые методы биотехнологии растений. Материалы симпозиума. — Пущино, 1991. —223 е. —с.13-14.

23. Глазко, В.И. ДНК-технологии в генетике и селекции / В.И. Глазко, Т.Т. Глазко— Краснодар: ВНИИ риса, 2006. — 399 с.

24. Глазко В.И. Кризис аграрной цивилизации и генетически модифицированные организмы (ГМО) //Интернет-журнал "Коммерческая биотехнология", 2007. — http://www.cbio.ru/

25. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. / Б. Глик, Дж. Пастернак. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с.

26. Головешкина, Е.Н. Получение трансгенных линий овощных культур с измененными сроками цветения / Е.Н. Головешкина, A.M. Камионская /ЯV Московский Международный Конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития. 4.1. — М., 2007. — с.270.

27. Грибова, Т.Н. Создание трансгенных линий белокочанной капусты с новыми агротехническими свойствами: Автореферат дис.к.б.н. /РГАУ-МГСХАим. К.А. Тимирязева — М., 2006—17 с.

28. Даскалов, X. Гетерозис и его'использование в-овощеводстве /X. Даскалов. -М.: Колос, 1978.-310 с.

29. Дрейпер, Дж. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство:

30. Пер с англ. / Дж. Дрейпер, Р. Скотт, Ф.Армитидж, Г.Дьюри, Л. Джекоб, Р. Уолден, А. Кумар, Р. Джефферсон, Дж. Хэмил— М.: Мир, 1991. — 408 с.

31. Заяц, Л.И. Создание экспрессирующихся конструкций с геном bar длятрансформации растений / Л.И. Заяц, И.Н.Стехин, Н.В.Путилина, Б.Л.Левенко //Биополимеры и клетка. Т. 10. №3-4. — 1994. — с.89-92.

32. Еленевский, А.Г. Ботаника высших, или наземных растений. /А.Г. Еленевский — М.: «Академия», 2000. — 432 с.

33. Закревский, В.В. Генетически модифицированные источники пищи растительного происхождения. Руководство по санитарно-эпидемиологическому надзору. /В.В. Закревский — СПб.: «Издательство «Диалект», 2006. — 152 с.

34. Ивашута, С.И. Генетическая трансформация культуры клевера лугового / С.И. Ивашута, В.В.Мазин, Л.А.Солодкая //Новые методы биотехнологии растений. Материалы симпозиума. — Пущино, 1991. — 223 с. — с. 18-19.

35. Использование биотехнологических методов для получения исходного селекционного материала капусты. — М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2004. — 44 с.

36. Калашникава, Е.А. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии. / Е.А.Калашникава, Е.З.Кочиева, О.Ю.Миронова — М.: КолосС, 2006. — 143 с.36. " Калашникова, Е.А. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии.

37. Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева— М.: КолосС, 2000. — 149 с.

38. Картель, Н.А. Трансгенные растения картофеля, полученные кокульти-вацией листовых дисков с агробактериями. / Н.А.Картель, С.Д.Курочкина, К.И. Забенькова //Новые методы биотехнологии расте ний. Материалы симпозиума. — Пущино, 1991. — 223 с. — с.20.

39. Кочетов, А.В. Проблемы трансгенеза. Феномен "замолкания" трансгенов и устойчивость растений к вирусным инфекциям /А.В. Кочетов // Вестник ЦС ВОГиС, — №5 — 1998; электронное издание (www.bionet.nsc.ru/vogis/vestnik.php?f=19988p=52).

40. Крючков, А.В. Методические рекомендации по размножению самонесовместимых инбредных линий поздней кочанной капусты. / А.В.Крючков, Г.Ф. Монахос, Д.В.Пацурия, Н.Н. Воробьева, А.А Лежнина, Д.М. Харламов, В.Г. Судденко — М., 2002. — 22 с.

41. Литвинов, С.С. Научные основы овощеводства /С.С. Литвинов — М.: Россельхозакадемия, ВНИИО, 2008. — 776 с.

42. Лудилов, В.А. Семеноведение овощных и бахчевых культур. /В.А. Луди-лов — М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2005. — 392 с.

43. Лукин, А.Л. Трансформация семян арабидопсиса с целью получения коллекции инсертантов / А.Л.Лукин, М.М.Сартбаев, Ю.В. Денисенко //Новые методы биотехнологии растений. Материалы симпозиума. — Пущино, 1991. — 223 с. — с.26-27.

44. Мазин, В.В. Возбудитель килы крестоцветных. / В.В.Мазин, Е.П.Проценко — М.: Наука, 1976. — 192 с.

45. Марьяхина, И.Я. Характер морфогенеза и размножения кочанной капустыв культуре ткани при использовании различных стимуляторов роста /И.Я. Марьяхина //С.-Х. биология. — 1981. — №2. — с.246-252.

46. Методика обнаружения генетически модифицированной ДНК в пищевыхпродуктах и полуфабрикатах. Часть 1. Пробоподготовка (Инструкция по применению наборов реагентов Silica М). — М.: ООО «Компания Био-ком», 2004.

47. Методика обнаружения генетически модифицированной ДНК в пищевыхпродуктах и полуфабрикатах. Часть 2. Проведение полимеразной цепной реакции (Инструкция по применению наборов серии «ПЦР-ядро»). — М.: ООО «Компания Биоком», 2004.

48. Мишуткина, Я.В. Создание трансгенных растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам на основе фосфинотрицина /Я.В. Мишуткина // Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Звенигород, 2008. - с. 262-263

49. Мухамедшин, Э.К. Агробактериальная трансформация незрелых эмбрионов арабидопсиса. / Э.К. Мухамедшин, Т.З. Дидишвили //Новые методыбиотехнологии растений. Материалы симпозиума. — Пущино, 1991. — 223 с. — с.31.

50. Нетрусов, А.И. Микробиология: учебник для высш. учеб.заведений

51. А.И. Нетрусов, И.Б. Котова. М.:Издательский центр "Академия", 2006. -352 с.

52. Новое в клонировании ДНК. Методы: Пер. с англ. /Под ред Д.Гловера.1. М.:Мир, 1989. -368 с.

53. Омельянчук, Н.А. Трансформация пшеницы методом пыльцевых трубок /

54. Н.А.Омельянчук, Г.И.Филиппова, М.И.Ривкин, В.В.Гулевич //Новые методы биотехнологии растений. Материалы симпозиума. — Пущино, 1991. —223 е. —с.33-34.

55. Пастернак, Е.Ю. Введение гена устойчивости к глифосату в пшеницу /

56. Е.Ю. Пастернак, Б.А. Левенко, И.Н. Стехин //Новые методы биотехнологии растений. Материалы симпозиума. — Пущино, 1991. — 223 с. — с.34-35.

57. Петрушко, Ю.Н. Белокочанная капуста. Современная ресурсосберегающая технология выращивания в условиях Приморского края. / Ю.Н. Петрушко, В.И.Потемкина, В.П.Федяй — Уссурийск, 2003. — 76 с.

58. Пивоваров, В.Ф. Капуста, её виды и разновидности. / В.Ф.Пивоваров, В.И.

59. Старцев— М., 2006. — 192 с.

60. Пирузян, Э.С. Основы генетической инженерии растений. / Э.С. Пирузян1. М.: Наука, 1999. — 303 с.

61. Поляков, А.В. Биотехнология в селекции льна. / А.В. Поляков — Тверь,2000. — 179 с.

62. Поляков, А.В. Получение регенерантов овощных культур и их размножение in vitro. Методические рекомендации. / А.В. Поляков — М.: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, 2005. — 36 с.

63. Поляков, А.В. Температурный стресс повышает выход эмбриоидов капусты в культуре микроспор / А.В.Поляков, Д.Н.Зонтиков //Картофель и овощи. — №7 — 2009. — С. 25.

64. Поляков, А.В. Получение растений огурца с повышенной устойчивостьюк фузариозному увяданию методами in vitro. Методические рекомендации. / А.В.Поляков, А.А.Ткачева, И.И.Тарасенков, Н.К.Бирюкова — М.: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, 2006. — 28 с.

65. Поляков, А.В. Методические рекомендации по получению трансгенныхрастений льна-долгунца (на примере введения генов NPTII и ALS). / А.В.Поляков, О.Ф.Чикризова — М.; 2001. — 40 с.

66. Поляков, А.В. Трангенные растения овощных культур: способы получения и перспективы использования. / А.В.Поляков, О.Ф.Чикризова, С.А.Зонтикова //Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности. — М., 2007. — 92 с. — с.73

67. Попадьин, П.В. Применение агробактериальной трансформции в селекциибелокочанной капусты на устойчивость к • болезням: Автореферат дис.к.б.н. / РГАУ-МГСХА — М., 2002. — 20 с.

68. Ралдугина, Г.Н. Факторы, влияющие на органогенез у семядольных эксплантов рапса / Г.Н.Ралдугина, Г.И.Соболькова // Физиология растений. 1995. — Т.42. — С.916-922.

69. Ралдугина, Г.Н. Получение и' исследование трансгенных растений рапса (Brassica napus L.): Дисс. на соиск. ученой степени канд. биолог. Наук. / ИФР РФН — М:ИФР, 1997. — 155с.

70. Рис, Э. Введение в молекулярную биологию: От клеток к атомам: Пер. с англ. / Э.Рис, М.Стернберг — М.: Мир, 2002. — 142 с.

71. Рубин,'Б.А. Биохимия и физиология иммунитета растений / Б.А. Рубин, Е.В. Арциховская, В.А. Аксенова// М.: Высшая школа, 1975.

72. Рыбчин, В.Н. Основы генетической инженерии. / В.Н. Рыбчин— СПб.: из-во СПбГТУ, 1999: — 522 с.

73. Рымарь, G.E. Трансформация незрелых зародышей; пшеницы / С.Е.Рымарь, Г.Н-Юркова, Г.М:Билека //Новые методы биотехнологии растений. Материалы симпозиума: — Пущино, 1991. — 223 с. — с.З9.

74. Шевелуха, B.C.; Проблемы трансгенных технологий в XXI веке. / B.C. Шевелуха //III Московский Международный Конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития. 4:1. — М;, 2005. — с.206-207.

75. Шевелуха, B.C. Сельскохозяйственная биотехнология. / В.С.Шевелуха, Е.А.Калашникова.—М.: Высшая школа,' 2003. — 469 с.

76. Шумилина, Д.В. Изучение структуры и свойств пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы MF3, индуцирующей устойчивость. растений к болезням: Автореферат дис. .к.б.н. / ВНИИФ — М;, 2007. —126 с.

77. Шумилина, Д.В. Микробный факторЗ-база для создания новых биопестицидов. / Д.В. Шумилина, Т.М.Воинова, В.Г.Джавахия //Защита и карантин растений- №10.- 2006 С. 20-21

78. Юрина, О.В. Селекция огурца на устойчивость к болезням / О.В. Юрина //Плодоовощное хозяйство, 1986. Т - 3. - С. 36 - 37.

79. Юркова, Г.Н. Трансформация сахарной свёклы. / Г.Н. Юркова, С.Е. Ры-марь, Г.Р. Галецкая, Т.В. Чугункова //Новые методы биотехнологии растений. Материалы симпозиума. — Пущино, 1991. — 223 с. — с.47.

80. Bajaj, Y.P.S. In vitro propogation of red cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata). / Y.P.S.Bajaj, P. Nietsh // J.Exp.Bot., 1975, v.26, p.883-890.

81. Baroncelli, S.M. Genetics of growth and differentiation in vitro of Brassica oleracea var. botrytis. I. Differences between 6 inbred Lines. / S.M. Baroncelli, M. Buiatti, A.Bennici // Z. Pflanzenzucht. 1973, v.70, p.99-107.

82. Beaty, J.S. Tzs, a nopaline Ti plasmid gene from Agrobacterium tumefaciens associated with trans-zeatin biosynthesis. / J.S. Beaty, G.K.Powell, L.Lica, D.A. Regier, E.M.S. MacDonald, N.G. Hommes, R.O. Morris //Mol. Gen. Genet., 1986, V.203,274p. pp.80.

83. Bieber, N.E. Influence of media, genotype, explant source, and serial subculture on shoot regeneration of in vitro broccoli, Brassica oleracea. / N.E. Bieber, J.F.Reynolds // In Vitro, 1983, v. 19, p.248.

84. Chi, G.-L. Effect of AgNC>3 and aminoethoxyvinylglycine on in vitro or-ganegenesis from seedling explants of recalcitrant Brassica genotypes. / G.L.Chi, D.C.Barfield, G.E.Sim, E.C. Pua // Plant Cell Rep, 1990, v.9, p. 195198.

85. Chi, G.-L. Ethylene inhibitors en hanced de novo shoot regeneration from cotyledons of Brassica campestris ssp. chinensis (chines cabbage) in vitro. / G.-L. Chi, E.C. Pua // Plant Sci., 1989, v.64, p.243-250

86. Christey, M.C. Regeneration on Brassica oleracea from peduncle explants. / M.C. Christey, E.D. Earle // Hortscience, 1991, v.26, p.1069-1072.

87. Damiano, C. In vitro fruit trees rooting by Agrobacterium rhizogenes wild type infection. / C. Damiano, S. Monticelli //EJE Electronic Journal of Biotechnology, Vol.1 #2, 1998.

88. Douglas, C.J. Identification and genetic analysis of an Agrobacterium tumefa-ciens chromosomal virulence region. / C.J. Douglas, R.J. Staneloni, R.A. Rubin, E.W. Nester //J. Bact., 1985, 161, 850 60.

89. Deng, S.Y. In vitro vegetative propogation of Chierse cabbage. / S.Y. Deng, J.M. Heap, T.A. Klein // Plant Cell Org.Cult., 1991, v.26, p.135-139.

90. Dunemann, F. In vitro Massenvemehrung von B.oleracea — Verietaten. / F. Dunemann, J. Grunewaldt//Gartenbauwissenschaf, 1987, V.52, S.249-254.

91. Dunwell, J.M. In vitro regeneration from excised leaf discs of three Brassica species. / J.M. Dunwell // J.Exp.Bot., 1981, v.32, p.789-799.

92. Fazekas, G.A. Genetic and environmental effects of in vitro shoot regeneration from cotyledon explants of Brassica juncea L. / G.A. Fazekas, P.A. Sed-mach // Plant Cell, Tissue and Organ Cult., 1986, v.6, p.177-180.

93. Flavell, R.B. Cell-Autonomous Behavior of the rolC Gene of A. rhizogenes. / R.B. Flavell //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 3490-3496

94. George, L. In vitro regeneration of mustard plants (Brassica juncea var.Rai-S) on cotyledon explants from non-irradiated, irradiated and mutagen-treated seeds. / L.George, P.S. Rao // Ann.Bot., 1980. v.46. p.107-112.

95. Gurlitz, R.H.Z. Involvement of carrot cell surface proteins in attachment of Agrobacterium tumefaciens. / R.H.Z. Gurlitz, P.W. Lamb, A.G. Matthysse //Plant Physiol., 1987, 83, 546 68.

96. Hachey, J.E. Efficient shoot regeneration of Brassica campestris using cotyledon explants cultured in vitro. / J.E. Hachey, K.K. Sharma, M.M. Moloney //Plant Cell Rep., 1991, v.9, p.549-554.

97. Halperin, W. Attainment and Retention of Morphogenetic Capacity in vitro. / W. Halperin // Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, v.3. Plant Regeneration and Genetic Variability.(Ed. Vasil I.) 1986, Academic Press, N.Y. p.3-47.

98. Horak, J. Regeneration of diploid and polyploid plants from the stem pith explants of diploid marrow stem kale / J. Horak, J. Lustinec, J. Mesicek, M. Kamenek, D. Polackova // Ann.Bot., 1985, v.39, p.571-577

99. Horeau, N. A comparative study of in vitro shoot regeneration from'cotyledon and root explants of four varieties of B.oleracea L. / N.Horeau, R.Arora, S.S.

100. Bhojwani //Curr.Sci. — 1988. — V.58. —N.24. — P. 1349-1351.

101. Jain, R.R. Genotypic and media effects on plant regeneration from cotyledon explant cultures of some Brassica species. / R.R. Jain, J.B. Chowudhury, D.R. Sharma, W. Friedt//Plant Cell, Tiss. Organ Cult., 1988, v.14, p.197-206.

102. Klein, H. Agrobacterium-media.iOd plant transformation and its further application to plant biology. /Н. Klein, R. Horsch, S. Rogers //Ann.Rev.Plant Physiol. 1987. V.38. P.467-486.

103. Klimaszewska, K. High frequency plant regeneration from thin cell layer ex-plants of Brassica napus. / K.Klimaszewska, W.A.Keller //Plant Cell Tis. Organ Cult, 1985, v.4, p. 183-197.

104. Lazzeri, P. A. In vitro shoot regeneration from seedling root segmrnts of Brassica oleracea and B. napus cultivars. / P.A. Lazzeri, J.M. Dunwell //Ann.Bot.,1984, v.54, p.341-350.

105. Leike, H. In vitro Vermehrung bei Kopfkohl (B.oleracea L.). / H. Leike, G. Wieczorek //Arch. Zuchtungsforsch., 1982, V.12, N.6, pp.375-383.

106. Matzke, М.А. Transformation of Brassica napus L. using A. tumefaciens I M.A. Matzke, A.J. Matzke //Cell Mol. Life Sci. 1998. V. 54. P. 94-103

107. Meyer, P. Synchronized tobacco protoplasts are efficiently transformed by DNA. / P.Meyer, E.Walgenbach, K.Bussmann, G.Hombrecher, H.Saedler //Mol. Gen. Genet., 1985, Y.199, 269 76.

108. Moloney, M.M. High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors. / M.M. Moloney, J. Walker, K.K. Sharma //Plant Cell Rep., 1989, v.8,p.23 8-242.

109. Murashige, T. Clonal propogation through tissue cultures. / T. Murashige //Annu. Rev. Plant Physiol., 1974, v.25, p.133-160.

110. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassys with tobacco tissue cultures. /T.Murashige, F.Skoog //Physiol. Plant., 1962. v.15. N.13. P. 473-497.

111. Narasimhulu, S.B. Species specific shoot regeneration response of cotyledon-are explants of Brassicas. / S.B. Narasimhulu, V.L. Chopra //Plant Cell Rep., 1988, v.7, p.104-106.

112. Nemeth, G. Lippai Janos emlekules es tud ulesszak eljadas. / G. Nemeth //Kot.I/Budapest. — 1982. — P.147-150.

113. Nielsen J. Metabolic engineering: techniques for analysis of targetic manipulations. / J. Nielsen // Biotechnol. Bioeng. 58: 125-132.

114. Pareek, L.K. Morphogenesis in organ, tissue and cell cultures of some species of Brassica. / L.K.Pareek, S.Singh, N.Chandra //Abstracts of V Intern. Congr. of Plant Tissue and Cell Culture. Tokyo, 1982, p.145

115. Pua, E.-C. Transgenic plants of Brassica napus L. / E.-C. Pua, A.Mehra-Palta, F.Nagy, N.-H.Chua //Bio/Technology, 1987, v.5, p.815-817.

116. Pua, E.-C. High frequency plant regeneration from stem explants of Brassica alboglabra Bailey in vitro. / E.-C.Pua, T.H.Trinh, N.-H.Chua //Plant Cell Tis. Organ Cult. 1989, v. 17, p. 143-152.

117. Radke, S.E. Transformation of Brassica napus L. using Agrobacterium tumefaciens: developmentally regulated expression of a reintroduced napin gene. /

118. S.E. Radke, B.M. Andrews, M.M. Moloney, M.L.Crouch, J.C.Kride, V.C. Knauf //Theor.Appl.Genet. 1988, v.75, p.685-694.

119. Sanford, J.C. Biolistic plant transformation. / J.C. Sanford //Physiol. Plant., 1990, v.79, p.206-209.

120. Schmulling, Th. Promoters of the rolA, B, and С Genes of Agrobacterium rhizogenes Are Differentially Regulated in Transgenic Plants. / Th. Schmulling, J. Schell, A. Spena //The Plant Cell, Vol.1, July 1989. — pp.665-670.

121. Shukla, S. In vitro multiple plantlet regeneration in knol khol (Brassica ol-eracea L.). / S.Shukla, S.K. Mishra // Curr.Sci, 1989, v.58, p.205-207.

122. Singh, S. Direct differentiation of shoot buds from internode explants of Brassica campestris cv. yellow sarson. / S.Singh, N.Chandra //Curr.Sci. (India), 1984, v.53, p.379-380.

123. Singh, S. Morphogenesis and plantlet formation in callus and suspension cultures of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). / S.Singh, N.Chandra // Beitr.Biol.Pflanz, 1985, v.60, p.191-198.

124. Singh, S. Plant regeneration in callus and suspension cultures of B.campestris / S. Singh, N. Chandra // Plant Cell Rep., 1990, v.8, p.598-600.

125. Turgut, R. Agrobacterium mediated transformation of Brassica napus. / R.Turgut, M.Bargchi, J. Draper // In Vitro, 1991, v.21, р.150А.

126. Valpuesta V. Fruit and Vegetable Biotechnology. / V. Valpuesta— CRC Press; 2002; pp338

Информация о работе

Зонтикова, Светлана Анатольевна
кандидата сельскохозяйственных наук
Москва, 2009
ВАК 06.01.05

Диссертация

Генетическая трансформация капусты белокачанной (Brassica oleracea var. capitata L.) в селекции на устойчивость к фитопатогенам (Plasmodiophora brassicae Wor., Fusarium ssp.) - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы