Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням"



На правах рукописи

ПОПЛДЬИН Павел Владимирович

ПРИМЕНЕНИЕ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ В СЕЛЕКЦИИ БЕЛОКОЧАННОЙ КАПУСТЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К БОЛЕЗНЯМ

(03.00.23 - биотехнология) (06.01.05 - селекция и семеноводство)

!

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2002

Работа выполнена на кафедре селекции и семеноводства овощных, плодовых н декоративных культур Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева и в лаборатории генной инженерии растений ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научные руководители: кандидат сельскохозяйственных наук МОНАХОС Г. Ф.

кандидат биологических наук ЛУНИН В. Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук ПОЛЯКОВ А. В.

кандидат сельскохозяйственных наук ИГНАТОВ А. Н.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт

селекции и семеноводства овощных культур.

Защита диссертации состоится в июня в часов на заседании Диссертаци-

онного совета Д 220.043.10 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 39.

С диссертацией можно ознакомится в Центральной научной библиотеке МСХА им. К. А. Тимирязева.

Автореферат разослан " Ж мая 2002 г

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук : ' ~7 - КАРЛОВ Г. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время белокочанная капуста {Brassica oleráceo convar. (L.) Alef. var. capitata L. / alba De.) является наиболее распространенной овошной культурой в Российской Федерации. Её выращивают на площади 161,7 тыс. га, что составляет 21,6% от всех площадей, занятых под овощами. Многочисленные заболевания, которым подвержена белокочанная капуста, приводят к потерям значительной части урожая и сильно снижают качество продукции. Ситуация осложняется отсутствием разрешенных для применения на продовольственной капусте химических средств защиты. Это вызывает необходимость выведения устойчивых сортов. Однако редкая встречаемость доноров устойчивости среди видов, скрещивающихся с белокочанной капустой, делает эту задачу трудновыполнимой методами традиционной селекции.

ЛЧкоритъ решение данной проблемы можно при помощи генной инженерии.Тем не менее, известна лишь одна работа по генетической трансформации белокочанной капусты с целью повышения устойчивости к болезням, причём она ограничивалась приданием устойчивости к вирусу мозаики турнепса, проведена на сортах и гибридах зарубежной селекции и осуществлена в Германии (Радчук и др., 2000).

Среди генов иммунного ответа растений особое внимание привлекли к себе гены де-фензинов, кодирующие короткие цистеинсодержащие пептиды широкого фунгицидного и бактерицидного действия. Трансгенные растения, экспрессируюшие гены растительных де-фензиноа, в настоящее время успешно проходят полевые испытания, где проявляют устойчивость к грибковым болезням на уровне и даже выше, чем контрольные нетрансгенные, обрабатываемые фунгицидами (Gao et al., 2000). Из обнаруженных к настоящему времени де-фензинов, одними из наиболее активных и широкоспецифичных в отношении фитопатогенов являются дефензины редьки (Raphanus sativus) (Broecaert et al., 1995).

В связи с этим, разработка методик регенерации и агробактериальной трансформации инбредных самонесовместимых родительских линий F| гибридов, а так же изучение наследования и экспрессии гена дефензина редьки rs-ap и оценка устойчивости к грибковым заболеваниям трансгенных растений, в том числе к киле, являются весьма актуальными.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы являлось получение растений белокочанной капусты, экспрессирующнх редечный дефензин RS-AP, и оценка их устойчивости к заболеваниям. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1) Разработать методику регенерации из соматических тканей растений депрессирован-ных инбредных самонесовместимых родительских линий Fi гибридов белокочанной капусты, в том числе:

- оценить морфогенетический потенциал линий различных сроков созревания;

планта и

планта и гипотеда^уцр^^^д.^^

Моск. сальзкокоз академии

2) Разработать методику агробактериальной трансформации растений инбредных линий, а том числе:

- подобрать оптимальные концентрации селективного агента и агробактериальной суспензии;

- оценить влияние типа экспланта и агробактериапьных штаммов на эффективность генетической трансформации.

3) Охарактеризовать полученные трансгенные растения, в том числе:

- проанализировать характер наследования и экспрессии трансгена;

- оценить устойчивость трансгенных растений к киле крестоцветных.

Научная новизна работы. Впервые изучен морфогекетический потенциал шести инбредных линий белокочанной капусты. Установлено положительное влияние гипотермиче-ского стресса на регенерационную способность капусты в условиях in vitro. Выявлен штамм Agrobacterium rhizogenes A4, отличающийся высокой вирулентностью для данной культуры. Получены трансгенные растения белокочанной капусты, несущие ген дефензина редьки га-ар. Охарактеризованы наследование и экспрессия трансгена, а так же устойчивость трансгенных растений к киле.

Практическая значимость Разработанные эффективные методики регенерации и генетической трансформации инбредных линий белокочанной капусты могут быть использованы при размножении их в культуре in vitro, для переноса в их геном чужеродных генов, определяющих хозяйственно-ценные признаки и для проведения фундаментальных исследований. Созданные трансгенные линии, отличающиеся устойчивостью к киле, могут быть использованы в качестве модельных объектов для изучения фунгицидной активности дефензи-нов в отношении облигатных паразитов и для изучения феномена «замолкания» трансгена.

Апробация результатов работы. Результаты работы апробированы на ежегодных научных конференциях Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева (Москва. 8-10 декабря 1998 г., 9-11 декабря 1999 г. и 10-12 декабря 2000 г.), на Международной научной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 4-9 октября 1999 г.). Международной научной конференции молодых учёных - овощеводов (Москва, 28-29 марта 2000 г.) и II Международной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 18-19 октября 2000 г.).

Структура н обьём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, выводов, заключения, библиографического списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 34 рисунка. Библиография включает 248 источников, из них 202 на иностранных языках.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования. В экспериментах использовались инбредные родительские линии Р| гиоридов белокочанной капусгы, выведенные на Селекционной станции им. Н. Н. Тимофеева. Линии Ди1 и И34 раннего срока созревания, Б25 - среднего, ВиЗ и Пд4 - среднепозднего.

Бактериальные штаммы и плазмнды. В работе использовали "обезоруженные" нопа-линовые штаммы AgroЬaclerшm Ште/аЫепя 1.ВА4404 / рАЬ4404 и С58С1 / рСУ3850 (1.0У3850), а так же штамм А. гЫхо£епе$ М / рША4. Все использованные штаммы несли конструкцию рК22ге (Народицкий и др, 2001) на основе бинарного вектора рН22Кпео. Огли-чительной особенностью данного вектора является система переноса опТ-МоЬА.' Конструкция несла целевой ген дефензина редьки г$-ар и маркерный ген прШ (рис. 1). Все штаммы агробактерий выращивали на среде УЕВ по стандартной методике (Шаденков и др., 1996).

1 mob

Рис. 1. Схема вектора pK22rs.

Штаммы фитопатогенов. Возбудитель килы крестоцветных (Plasmodiophora brassicae Wor.) расы 16/11/31 по ЕСД-коду (Ушанов, 2001) получен с инфекционного участка селекционной станции им. Н. Н. Тимофеева. Для получения суспензии зооспор патогена собирали опухоли с пораженных растений капусты, измельчали их на тёрке, помещали в стерильную дисткллированую воду и интенсивно встряхивали. Концентрацию суспензии определяли подсчётом в камере Горяева.

Регенерация растений в культуре in vitro. Семядоли и 5-10 мм фрагменты гипокоти-лей семи-девяги суточных проростков помещали по десять штук в 90 мм чашки Петри, содержащие 25-35 мл питательной среды. В экспериментах использовали варианты питательной среды, содержащие минеральную основу по Мурасиге и Скугу (Murashige and

5

Skoog, 1962) (MS), витамины B5 и различные концентрации сахарозы, БАП и НУК. Регенерацию вели при температуре +20-23 °С, шестнадцатичасовом световом дне и освещённости 2,5 клк. Эксперименты продолжались в течение двух пассажей продолжительностью по две недели. Каждый вариант включал три повторения, в среднем, по тридцать эксплантов.

Стрессовая обработка эксплантов. После вычленения, экспланты помещали на питательную среду и выдерживали в холодильнике при +1 -3 °С в течение шести-восьми суток.

Трансформация и селекция трансформантов. После выделения экспланты предкуль-тивировали в течение двух суток на среде MS, содержащей 3 мг/л БАП, 45 г/л сахарозы и 8 г/л агара. Затем производили инокуляцию в течение 15-20 мин агробактериями, ресуспен-дированными в эксудате листьев табака, приготовленного по Норовой и Калиеву (1998). Затем их обсушивали на стерильной фильтровальной бумаге и помещали на питательную среду того же состава (рН перед автоклавированием 5,1-5,2). Кокультивацию проводили в течение одних-двух суток в темноте при + 24-26 °С. Далее экспланты переносили на среду того же состава, за исключением эксудата листьев табака, но с добавлением 500 мг/мл цефотак-сима (рН перед автоклавированием 5,6-5,8) и проводили стрессовую обработку. Каждые две-надцать-четырнадцать суток экспланты переносили на свежую среду. При появлении зачатков побегов на месте среза у эксплантов, их помещали на ту же среду, содержащую 25 мг/л канамицина-сульфата. Побеги, сохраняющие зелёную окраску, вырезали, размножали черенкованием in vitro и укореняли на среде MS, содержащей 1 мг/л ИМК, 30 г/л сахарозы, 8 г/л агара и те же концентрации антибиотиков. Каждый вариант состоял из трёх повторений, в среднем, по тридцать эксплантоа. Укоренённые растения высотой 8-10 см в стерильных условиях высаживали в горшки диаметром 8 см и укрывали полиэтиленовыми пакетами. Через неделю пакеты перфорировали, а спустя ещё неделю - удаляли.

Молекулярно-бнологические анализы. Выделение растительной ДНК для ПЦР-анализа осуществляли по Дорохову и Клоке (1997). Амплификацию проводили в реакционной смеси, содержащей буфер (трис-HCl рН 8,8, 67 мМ; (NH^iSOj, 166 мМ; MgCh» 2,5 мМ; Твин-20, 0,01%); по 100 мкМ - каждого дАТФ, дГТФ, дТТФ и дЦТФ; по 0,3 мкМ соответствующих праймеров; 0,25 ед. Taq-полимеразы и 20 нг ДНК. Об отсутствии ингибиторов Taq-полимерэзы в препаратах ДНК судили по наличию ампликона длиной около 465 п. о., соответствующего консервативному участку гена 18S рибосомальной РНК, при проведении реакции с использованием праймеров 18S(f) (5'-AGCCATGCATGTGTAAGT ATGAACG-31) и 18S(r) (S'-GCCCGGTATTGTTATTTATTGTCACTO1). Смесь была прогрета 3 мин при +95 °С, далее проводили 25 циклов амплификации: 15 с, +94 °С; 30 с, +54 °С; 1 мин, +72 °С. После определения отсутствия ингибиторов, проводили амплификацию целевого гена с использованием праймеров Dolg 3 (5'-CTGCCGACAGTGGTCCCAAACATGGACCC-3) и Celo 6 (5'-CAAGTGTATCTGTTATTTCCCTTGTTAACTCTAGAGCA-3'), комплементарных 35S-npoMOTOpy и гену rs-ap. Смесь прогревали 3 мин при +95 °С, затем проводили 30 циклов реакции: 15 с, +94 "С; I мин, +52 °С; 1мин, +72 °С. О присутствии трансгена в геноме растений судили по наличию продукта реакции длиной около 610 п. о.

Гибридизацию растительной ДНК по Саузерну осуществляли по стандартной методике

(Дрейпер и др., 1991). В качестве зонда был использован фрагмент, содержащий участок промотора 35Sh ген rs-ap, который был радиактивно помечен a-PJ2 при помощи описанной выше ПЦР. Вывод о трансгенной природе растений делали при наличии сигнала от фрагмента длиной около 1000 п. о.

Транскрипцию трансгена определяли методом реверсной ПЦР. Выделение РНК производили с использованием набора реактивов «РИБО-золь-микро» (АмплиСенс, Центральный НИИ Эпидимиологии МЗ РФ) по прилагаемой к нему методике. Синтез кДНК осуществляли по модифицированной стандартной методике (Маниатис и др., 1984). Для определения наличия транскрипции, производили амплификацию кДНК с использованием праймеров pKrs(f) (S'-CAGCTCGGTACCCCCGAATT-З') и Celo 6 к гену rs-ap. Реакционную смесь прогревали 3 мии'при +94 °С и проводили 30 циклов реакции: 15 с, +94 °С; 1 мин, +66 °С; 1 мин, +72 °С> Вывод о транскрипции трансгена делали но наличию ампликона длиной около 270 п.У.

Ьелковые экстракты из растений получали экстрагированием в TUS-T буфере в течение одного часа при комнатной температуре. Фракционирование белков осуществляли электрофорезом в ПЛАГ в трис-трициновой системе с присутствием ДСП (Shagger and von Jagow, ' 1987). Иммуноферментный анализ (Вестерн-блоттинг) трансформантов проводили по мето-J дике Тоубина и др. (Towbin al., 1979).

Оценка устойчивости растений к киле крестоцветных. Для оценки устойчивости семенного потомства трансгенных растений поколения То к киле, семена, полученные путём принудительного гейтеногамного самоопыления, заражали при посеве по методике Вурепса и Виссера (Voorips, Visser, 1993). В фазе одного-двух настоящих листьев производили повторное заражение рассады по Мэттушу (Matlush et al., 1994), после чего высаживали растения на инфекционный фон в теплице Селекционной станции им. H. II. Тимофеева. Поражае-мость учитывали через шесть недель после высадки рассады на инфекционный фон визуальной оценкой корневой системы по шкале, предложенной Букзаки (Buckzacki et al., 1975).

Статистическая обработка данных. Данные, полученные в экспериментах, обрабатывали методом дисперсионного анализа многофакторного вегетационного опыта с использованием компьютерной программы STRAZ а так же оценивали по критерию соответствия х* (Доспехов, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка методики регенерации белокочанной капусты.

1.1. Оценка растительного материала на интенсивность адвентивного морфогенеза

в культуре in vitro.

Так как в литературе описано влияние генотипа растения и типа экспланта как главных факторов, определяющих способность к органогенезу, то именно поэтому в первую очередь была проведена оценка морфогенетического потенциала семядольных и гипокотильных экс-плантов инбредных линий капусты различных сроков созревания.

Регенерация осуществлялась на среде, содержащей минеральную основу по Мурасиге и Скугу, витамины В5, 3 мг/л БАП, 45 г/л сахарозы и S г/л агара. Из таблицы 1 видно, что средняя частота морфогенеза колебалась, в зависимости от генотипа, от 43,2 % у инбредной линии Пд4, до 71,9 % у линии И34. Следует отметить, что инбредные линии ранней капусты И34 и Ди 1 проявили более высокую регенерационную способность, чем позднеспелые ВиЗ и Пд4. Семядоли, в целом, регенерировали чаще, чем гипокотили, однако важное влияние на это оказывал генотип растения. Так. у линий Ди1, И34, Б25 и Пд4 чаще регенерировали се- ^ мядоли, в то время как у ВиЗ - гипокотили. Тем не менее, у всех генотипов оба типа экспланта давали существенные уровни адвентивного морфогенеза. Так как линии И34 и Б25 отличились наиболее высокими уровнями регенерации, они были отобраны для дальнейших опытов.

Таблица. I.

Частота адвентивного морфогенеза инбредных линий белокочанной капусты _в зависимости от генотипа и типа экпланта. _

Генотип Тип экспланта В среднем,по генотипу (НСРо, = 3,2 %)

семядоли гипокотили

И34 75,6 % 68,2 % 71.9%

Ди1 77,1 % 46,4 % 61,8%

Б25 86,6 % 45,4 % 66.0 %

Пд4 57,4 % 28,9 % 43,2 %

ВиЗ 33,7 % 68,0 % 50,4 %

В среднем, по типу экспланта (НСРо; - 6,5 %) 66,1 % 51,4% -

HCPos Д-чя частных различий == 4,6 %

1.2. Влняние состава питательной среды на адвентивный морфогенез белокочанной

капусты в условиях in vitro.

На следующем этапе проводилась оценка влияния различных вариантов состава питательной среды, использованных для регенерации белокочанной капусты в работах предыдущих исследователей, на адвентивный органогенез линий И34 и Б25 с целью увеличения его эффективности. Оценка общего морфогенетического потенциала производилась подсчётом эксплантов, у которых наблюдалась регенерация побегов, корней или обоих типов органов

8

одновременно.

Таблица 2

Частота адвентивного морфогенеза инбредных линий белокочанной капусты в зависимости от

Вар. состава пит. среды Компоненты питательной среды Линия Эксплант В среднем, по составу среды (НСРм-2,3 %) В среднем, по генотипу

сахароза, г/л БАП, мг/л НУК. мг/л ГК, мг/л семядоли гипо-котили

1 45 3' •... И34 81,0% 81,6% 80,1 % И34 83,3 %

1 Б25 88,9 % 68.9 %

2 30, - И34 73,4 % 69,4 % 78,1 %

Б25 95,8 % 73,6 %

3 30* 2 | 0,2 0,5 ИЗ 4 97,8 % 60.9 % 69,8 %

Б25 100,0% 20.5 %

4 30 3 1 - ИЗ 4 100,0% 100,0% 97,9 % К25 78,8%

Б25 100.0% 91.7%

5 30 1 0,1 - И34 100,0 % 64.3 % 79,4%

Б25 100,0% 48,1 %

В среднем, по типу экспланта (НСР05=1,0%) 93,7 % 68,4% ! -

I Из таблицы 2 можно видеть, что наибольшая частота адвентивного морфогенеза наблюдалась на варианте питательной среды №4, где она составила, в среднем, 97,9 %, в то время как наименьшая зафиксирована на варианте №3, где ей значение равно, в среднем 69,8 %. Варианты №№ 1, 2 и 5 по этому показателю не имели существенных различий на 5 % уровне значимости и занимали промежуточное положение (78,1-80,1 %). Семядоли регенерировали существенно чаще гипокотилей. Эффективность регенерации семядолей составила, в среднем, 93,7 %, тогда как гипокотилей - 68,4 %.

Анализ состава питательных сред показывает, что изменение концентрации БАП от 2 до 3 мг/л, так же как и изменение концентрации сахарозы от 30 до 45 г/л в вариантах №№ 1 и 2 не оказывало эффекта, значимого на 5 % уровне, на частоту регенерации. Внесение НУК в концентрации 1 мг/л в вариант №4 существенно увеличивало эффективность органогенеза по сравнению с наблюдаемой на варианте №1. Кроме того, увеличение концентрации одновременно и БАМ, и НУК в варианте №4 относительно их концентраций в варианте №5 привело к существенному увеличению количества регенерирующих эксплантов. На варианте №3, таким образом, следовало бы ожидать равной или более высокой эффективности регенерации, чем на №5, однако полученные данные свидетельствуют об обратном. Следовательно, внесение ГК в концентрации 0,5 мг/л имело статистически достоверный отрицательный эффект на изучаемый показатель.

Так как траксгенные растения предполагалось получать путём регенерации адвентивных побегов, производили учвт эксплантов, регенерирующих побеги либо и побеги, и корни одновременно. Экспланты же, регенерирующие только корни, не учитывали.

Таблица 3

Частота регенерации побегов инбредных линий белокочанной капусты в зависимости от соста-__!____________ва питательной среды, генотипа и типа экспланта _ ________

Вар. ' состава пит. среды Компоненты питательной среды Линия Эксплант В среднем, по составу среды (HCP0S= 1,9%) В среднем, по генотипу (НСРо5= 0,7 %)

сахароза, г/л БАП, мг/л НУК, мг/л ГК, мг/л семядоли гипо-когали

1 45 3 - • г И34 69,1 % 80,1 % 76,2 % И34 47,7 %

625 1 88,9 % 66,7 %

2 30 2 _ ■ И34 j 42,8 % 59,5 % 43,2 %

Б25 12,8% 43,2%

3 30 2 0,2 0,5 И34 ! 46,8 % 40,9 % 25,5 %

G25 ! 4,2 % 10,0%

4 30 3 1 - И34 23.4 % 33,4 % 19,7 % Б25 28,9 %

Б25 4,2 % 18,1 %

S 30 1 0,1 - И34 30.8 % 50.2%

Б25 11,3 % 28,2 %

В среднем, по тину экснланта (HCPOS=0,7 %) 33,4 % 43,0% - •

MCP для частных различий = 6,9%.

V

Как следует из таблицы 3, наибольшая частота регенерации побегов наблюдалась на > варианте питательной среды №1, где она составила, в среднем, 76,2 %, а наименьшая - на варианте №4, где её среднее значение было равно 19,7 %. На вариантах среды №№2, 3 и 5 этот показатель имел промежугочные значения (25,5 %-39,6 %), существенно различаясь на 5 % ' уровне значимости. Линия И34, в среднем, регенерировала побеги существенно чаще, чем Б25 (47,7 % против 28,9 %), а гипокотилк - существенно чаще семядолей (43,0 % и 33,4 % соответственно).

Кроме того, был проведён учет отношения частоты регенерации побегов по отношению к частоте адвентивного морфогенеза в целом, результаты которого приведены в таблице 4. Из анализа состава питательной среды следует, что ход органогенеза зависел от соотношения концентраций цитокининов и ауксинов, что согласуется с литературными данными (Skoog and Miller, 1957). Так, на варианте состава питательной среды №1, который отличался наибольшей концентрацией БАП (3 мг/л) при отсутствии ауксинов, наблюдалась наибольшая частота регенерации побегов относительно морфогенеза в целом (95,7 %). На варианте №2, содержащем меньшую концентрацию БАП (2 мг/л) и также не содержащем ауксинов, изучаемый показатель характеризовался вторым по величине значением (53,5 %). На вариантах К»3 и №5, имеющих одинаковое отношение концентрации БАП к НУК, значения относительной частоты регенерации побегов существенно не различались на 5 % уровне значимости (42,3 % и 44,5 %), причем ГК, входящая в вариант состава №3, не оказывала существенного эффекта на данный показатель. На варианте состава №4, обладающем наименьшим значением отношения концентрации цитокининов к ауксинам, наблюдалась наименьшая относительная частота регенерации побегов.

Из той же таблицы видно, что линия И34 имела существенно большее значение изу-

чаемого показателя по сравнению с Б25 (60,2 % против 42,0 %). Это, вероятно, объясняется большим содержанием эндогенных, либо большей чувствительностью к экзогенным цито-кининам у данного генотипа.

Из приведённых данных также следует, что при культивировании гилокотилей наблюдалась более высокая относительная частота регенерации побегов, чем при культивировании семядолей (64,0 % и 38,3 % соответственно). Из литературы известно, что семядоли способны к автономному синтезу ауксинов, кроме того, содержанке этого фитогормона в растениях уменьшается от верхушки к основанию стебля (Дёрфлинг, 1985). Этим, вероятно, и объясняется наблюдаемый эффект.

Таблица 4

Частота регенерации побегов по отношению к адвентивному морфогенезу в целом инбредными линиями белокочанной капусты в зависимости от состава питательной среды, генотипа и типа

экспланта (в %)

Вар. Компоненты питательной среды Эксплант В среднем, по В среднем, по

состава Линия составу гено-

пит. среды сахароза, г/л БАП, мг/л НУК, мг/л гк, мг/л семядоли гипо-котили среды (НСРМ= 2,4 %) типу (НСРи= 1,0%)

1 45 3 И34 87,7 % 98,1% 95.7 %

Б25 100,0% 97,0%

2 30 2 И34 59,2 % 81,0% 53,5 % И34

Б25 13,4% 60,3% 60,2 %

3 30 2 0,2 0,5 И34 47,9 % 67,2% 42,3 %

Б25 4,1 % 50,0%

4 30 3 1 И34 23.4 % 33,5% 19,8%

Б25 4,2 % 18,1%

5 30 0,1 ИЗ 4 30,9 % 73,2% 44,2 % Б25 42,0 %

Б25 11,1 % 61,6%

В среднем, по типу экспланта (HCPos=l,0 %) 38.2 % 64,0% -

НСР для частных различий = 9,3 %.

Таким образом частота регенерации побегов на варианте состава питательной среды №1 незначительно отличалась от частоты адвентивного морфогенеза в целом, следовательно концентрация и состав фитогормонов в данном варианте имеют близкие к оптимальным значения для максимального выхода побегов у линий И34 и Б25,

1.3. Влияние гипотермического стресса на адвентивный морфогенез белокочанной капусты в условиях in vitro.

Известно, что стрессовые воздействия могут вызывать «замолкание» трансгенов путём метилирования их промоторных областей (Meyer et а!., 1992; Schmit et al., 1997). Мы предположили, что применение стрессовой обработки при проведении работ по генетической трансформации позволит отбирать трансгенные растения, у которых не происходит такого инактивирования селективных генов, и выявлять «замолкание» целевых генов на самых

11

ранних этапах изучения трансформантов. Кроме того, в литературе описано стимулирующее влияние обработки эксллантов низкими положительными температурами на адвентивный морфогенез (Кучеренко, 1991). Поэтому было решено изучить влияние гвпотермиче-ского стресса на регенерацию линий белокочанной капусты Б25 и И34.

В результате эксперимента было установлено, что гипотермическая обработка существенно увеличивала как частоту адвентивного органогенеза в целом (в среднем, на 10-26 %), так и регенерации побегов в частности (на 6-9 %) у обоих генотипов (таб. 5 и 6), что согласуется с данными литературы.

Исходя из литературных данных, можно предположить, что наблюдаемый положительный эффект обусловлен торможением клеточного цикла под действием стресса посредством митоген-активируемых киназ и запуском комплекса генов, детерминирующих клеточную дифференциацию.

Таблица 5.

Частота адвентивного морфогенеза инбредных линий белокочанной капусты в зависимости ог

воздействия гипотсрмического стресса, генотипа и тина экспланта

Наличие воздействия гило- Тип экспланта В среднем,генотипу (НСРИ=1,4 %)

Генотип термического стресса (+1-3 °С, 6-8 сут.) семядоли гипокотили

ИЗ 4 + 72,2 % 93,2 »/„ 82,7 %

- 65,6 % 79,9% 72,8 %

Б25 + 97,9 % 97,9 % 97,9 %

- 78,5 % 65.6 % 72,1 %

Таблица 6.

Частота регенерации побегов эксплантами инбредных линий белокочанной капусты в Чавиои _ мпс ¡и от во щейс"!вия | ииотсрмическото стресса, генотипа и типа экспланта_

Наличие воздействия гипо- Тип экспланта В среднем, по генотипу (НС¡'05=0,9 %)

Генотип термического стресса (+1-3 °С, 6-8 сут.) семядоли гипокотили

И34 + 68,3 % 82,2 % 72,3 %

- 51.0% 75,7 % 63,4 %

Б25 + 93,6 % 58,3 % 76,0 %

- 74,2 % 65,6 % 69,9 %

Таким образом, в результате проведбнных исследований была разработана эффективная методика регенерации растений депрессированных инбредных линий белокочанной капусты нз соматических тканей, основывающаяся на использовании в качестве эксплантов семядолей и гипокотилей; питательной среды, в состав которой входит минеральная основа по Мурасиге и Скугу, витамины В5, 3 мг/л БАМ, 45 г/л сахарозы и 8 г/л агара; а так же гипо-термической обработки эксплантов. Достигнутая частота регенерации адвентивных побегов у линий И34 и Б25 (в среднем, 76 %), позволила нам перейти к этапу генетической трансформации.

2. Разработка методики агробактериальной трансформации белокочанной капусты.

2.1. Анализ устойчивости растений к канамицину.

В векторе pK22rs (рис. 1), используемом для трансформации белокочанной капусты в данной работе, в качестве селективного содержится ген, кодирующий фермент неомицин-фосфотрансферазуН, инактивирующую антибиотик канамицин, который разрушает хлоро-пласты высших растений. Трансгенные растения, экслрессирующие данный ген, приобретают устойчивость к канамицину, которая выражается в сохранении зелёной окраски и их нормальном росте на питательной среде, содержащей антибиотик. Известно, что чувствительность растений к канамицину зависит от их генотипа и возраста. Это определяет необходимость в каждом отдельном случае подбирать специфическую концентрацию антибиотика. Чаще всего она представляет собой минимальную концентрацию, способную полностью ингибировать рост и развитие растений.

Исходя из анализа литературы, было изучено влияние концентраций 5, 10, 15, 25 и 35 мг/л канамицина-сульфата на регенерацию растений линий Б25 и И34.Экспланты, на срезах которых приблизительно через две недели после стрессовой обработки начинали появляться зачатки побегов, переносили на среду с антибиотиком. Через два пассажа по четырнадцать суток производился учет всех растений, изменивших окраску верхушечной почки. Полученные данные позволили установить оптимальную для селекции и размножения трансформантов концентрацию канамицина-сульфата - 25 мг/л.

2.2. Влияние генотипа растения, типа экспланта, и штамма агробактерий на эффективность генетической трансформации белокочанной капусты.

При проведении генетической трансформации с использованием концентрации агробактерпальной суспензии 109, согласно протоколу Метца (Metz et al., 1995), в котором сообщалось о наибольшей из известных для белокочанной капусты эффективности трансформации (10 %), наблюдались некрозы эксплантов и их гибель при последующем культивировании. В связи с этим было исследовано влияние концентрации суспензии агробактерий на частоту регенерации побегов эксплантами белокочанной капусты. Изучались четыре концентрации суспензии агробактерий: 108, 107, 106 и 105 клеток/мл. Учёт регенерации производился на 28-е сутки после стрессовой обработки. Длительность одного пассажа - четырнадцать суток. При использовании концентраций 108 и Ш7 клеток/мл, на месте срезов и в других частях экспланта наблюдались некрозы, регенерация не отмечалась. При применении концентрации суспензии так же образовывались некрозы, однако у небольшого количества эксплантов имело место образование плотного узловатого каллуса и незначительная регенерация побегов. Когда же инокуляция проводилась суспензией с концентрацией 105 клеток/мл, некрозы отсутствовали, а частота регенерации побегов составила, в среднем, 82%.

После установления оптимальной концентрации агробактериальной суспензии ( 10S клеток/мл), следующим шагом являлось определение влияния на частоту генетической

трансформации генотипа растения, типа экспланта и штамма агробактерий. Его результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7

Частота генетической трансформации белокочанной капусты в зависимости от генотипа расте-____ния. типа экспланта и штамма агробактерий _

Генотип Штамм агробактерий Тип экспланта Кол-во эксплантов, всего, шт. (%) Кол-во регенерировавших эксплантов, шт. Кол-во р-ний, сохр. норм, окраску, шт. Кол-во трансформантов (ПЦР+), UIT. Эффективность трансформации (HCPoj—0,9 %)

И34 LBA 4404 семядоли 107(100,0»/.) 91 (85,0%) 0 (0.0 %) 0 (0,0 %) 0,0 %

гипокотили 115(100,0%) 73 (64,5 %) 0 (0,0 %) 0 (0,0 %)

LGV 3850 семядоли 91 (100,0%) 89 (97,8 %) 1 (1,1 %) 0 (0,0 %)1 _ , 0,0 %

гипокотили 90 (100,0 %) 79 (87,8 %) 0 (0,0 %) 0 (0,0 %)

A4 семядоли 89(100,0%) 84 (94,4%) 0(0,0%) 0 (0,0 %) 0,0%

гипокотили 94(100,0%) 74 (78,7 %) 2(2,1 %) 0 (0,0 %)

Б25 LBA 4404 семядоли 96(100,0%) 82 (85.4 %) 0 (0.0 %) 0 (0.0 %) 0,0%

гксюкотили 103 <100,0%) 77 (74,8 %) Q (.0,0 %) 0 (0,0 %)

LGV 3850 семядоли 74(100,0%) 79 (80,6 %) 2 (2,5 %) 0(0,0%) 0,75% '

гипокотили 66(100.0%) 48 (72,7%) 3 (4,5 %) I (1,5%)

A4 семядоли 78(100,0%) 59 (75,6%) 8(10,3%) 5 (6,4 %) 7,7 %

гипокотили 79(100,0%) 54 (68,4 %) 11(13,9%) 7 (8,9 %)

Наличие гена rs-ap в отобранных регенерантах было подтверждено ПЦР-анализом (рис. 2)

В 25

1 2 3 4 5 Ь 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 К П М

м-943 п о.

«мм м«м т штяя» — »--s«™.

_-341 п.о.

Рис. 2. ПЦР-анализ на содержание гена rs-ap ДНК отобранных на селективной среде регене-рантов. 1-27 - независимые регенеранты, К - контрольное «¡трансформированное растение, П -плазмида pK22rs, М - молекулярный маркер (pUC!8/MboI).

Как следует из таблицы 7, у линии И34 не удалось получить ни одного трансформанта ни в одном из вариантов. Это, вероятно, объясняется устойчивостью данного генотипа к использованным в эксперименте агробактериальным штаммам. Наибольшая частота трансформации наблюдалась при инокуляции линии Б25 штаммом A4 - почти 8 %, тогда как при использовании LGV3850 - всего около 0,8 %, а LBA4404 - 0 %. Полученный результат может быть обусловлен различной вирулентностью агробактериальных штаммов, различной активностью vir - локуса соответствующих Ti и Ri плазмид, а так же тем, что сама методика трансформации может быть в различной степени благоприятной для разных штаммов.

С целью подтверждения трансгенной природы, с нескольких растений, у которых трансген детектировался ПЦР-амплификацей, были взяты пробы ткани для проведения анализа ДНК гибридизацией по Саузерну. У всех проверенных растений был получен положительный сигнал (рис. 3)- Кроме того, было установлено, что у независимых регенерантов №№5 и 9 трансген присутствовал в виде одной копии, а у №№15 и 18 - нескольких.

5 9 15 18 К П М 5 9 15 18 К П М

Рис. 3. Результат анализа ДНК растений гибридизацией по Саузерну: а - элеюрофореограмма рестрицированной HindiII ДНК, б - радиоавтограф блота. 5-18 - независимые регенеранты, К — контрольное нетрансформированное растение, П - плазмида pK22rs, М - молекулярный маркер (pUC18/Mbol).

' Таким образом, была разработана эффективная методика агробактериальной трансформации инбредных линий белокочанной капусты, основывающаяся на использовании семядольных и гипокотильных эксплантов, агробактериальной суспензии в концентрации 105 клеток/мл и штамма Agrobaclerium rhizogenes А4, позволившая достигнуть эффективности трансформации почти 8 % и получить тринадцать независимых трансгенных растений ин-бредной линии Б25. Для удобства работы, линиям, полученным путём клонирования in vitro независимых трансформантов, были присвоены следующие обозначения: №4 - БТ1, №5 -КТ2, №6 - БТЗ, №8 - БТ4, №9 - БТ5, №10 - БТ6, №12 - БТ7, №14 - БТ8, №15 - БТ9, №16-БТ10, №17-БТ11, №18 - БТ12, №19-БТ13.

3. Изучение трансгенных растений белокочанной капусты.

3.1. Анализ растений поколении То на наличие транскрипции трансгена.

Для того, чтобы установить наличие и характер экспрессии гена rs-ap, был проведён анализ трансгенных растений на присутствие его транскриптов методом реверсной ПЦР. Транскрипция трансгена rs-ap детектировалась у растений девяти независимых трансгенных линий(БТ1-7,9и 12). (рис. 4). Нужно отметить, что наличие нескольких копий трансгена, установленное Саузерн-блоттингом в линиях БТ9 (регенерант №15) и БТ12 (регенерант №18) (рис. 3) не препятствовало его транскрипции.

Отсутствие транскрипции трансгена rs-ap в растениях независимых трансгенных линий БТ8, 10, И и 13, вероятно, связано с его инсерцией в область гетерохроматина, так как известно, что такой тип инсерции часто ответственней за «замолкание» на уровне транскрипции (Prols and Meyer, 1992).

10 11 12 13 К П

м

- 943 л.о.

- 585 п о.

>-341 п.о.

275 п.о.

Рис. 4. Результат анализа растений поколения Т0 на наличие транскриптов трансгена п-ар методом рееерсной ПЦР. 1-13 - независимые трансгенные линии БТ1-13, К - контрольное ^трансформированное растение, П - плазмида рК22г5, М - молекулярный маркер (р1)С18/МЬо1).

3.2. Первичная оценка устойчивости семенного потомства растений поколения То

к киле.

Каких либо морфологических отклонений растений Т| от контрольных отмечено не было. В семенном потомстве всех без исключения исследованных независимых трансгец-ных линий выщеплялись растения как с полным отсутствием симптомов поражения (0 баллов), так и со слабым поражением боковых корней (1 балл поражения) (таб. 8). Причем у^ тойчивые экземпляры выщеплялись как в потомстве трансгенных линий, у которых было ^ установлено наличие транскрипции трансгена (БТ1, 3, 4, 7 и 9), так и в потомстве линий, у которых она не детектировалась (КТ8 и 10). В то же время все контрольные нетрансформи-рованные растения имели сильное поражение главного корня (3 балла).

Таблица 8

Потомство незавимой трансгенной линии Количество высаженых на инфекционный фон растений Балл поражения

0 / 2 3

БТ1 27 5 1 21

БТЗ 22 1 1 20

БТ4 8 - 1 7

БТ5 2 1 - 1

БТ7 22 1 21

БТ8 3 2 - 1

БТ9 17 2 - 16

БТ10 13 1 - 12

Б25 (контроль) 15 - • - 15

3.3. Изучение наследования трансгена rs-ap в семенном потомстве растений поколения T«.

С целью изучения наследования интродуцированного трансгена и установления связи его присутствия в геноме капусты с наблюдаемой устойчивостью к киле, был проведбн анализ семенного потомства трансгенной линии БТ1 методом ПЦР-амплификации. У 25 из 27 растений был получен положительный сигнал (рис. 5).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2) 22 23 24 25 26 27 К П М

- 943 по.

„-341П.О.

-153 п о.

Рис. Т.' Результаты анализа на наличие трансгена rs-ap растений семенного потомства независимой трансгенной линии БТ1 методом ПЦР-амплификации. 1-27 — растения семенного потомства линии БТ1, К - контрольное нетрансформироваиное растение инбредной линии Б25, П — плачмила ptC22rs, М — молекулярный маркер (pUC!8/Mbol).

I

I Таким образом, по наличию трансгена потомство линии БТ1 расщепилось в отношении 25 трансгенных растений к 2 нетрансгенным. Для интерпретации полученного результата ¡эыла использована двухлокусная элементарная генетическая модель, предусматривающая нахождение локусов на разных хромосомах и расщепление 15:1 (содержащие трансген : не содержащие). Оценка соответствия между наблюдаемыми и ожидаемыми распределения-I ми по критерию х2 указывает на её справедливость (таб. 9).

Таблица 9.

Вычисление теоретических частот и критерия соответствия (х3) для расщепления семенного по-

томства независимой трансгенной линии БТ1 по наличию трансгена rs-ap

Показатель Растения Сумма

Г1ЦР+ 1 ПЦР-

Ожидаемое расщепление (Н0) 15 ! 1 16

Наблюдаемые частоты (f) 25 2 27

Ожидаемые частоты (F) 25,313 1,688 27

Разность (f-F) -0,312 0,312 -

Квадрат разности (f-F)1 0,097 0,097 -

Отношение (f-F'jVF 0,004 0,057 0,061 (Д)

Вывод xV0.0<> < x!os=3,84; Ы0 не отвергается

3.4. Анализ на наличие транскрипции трансгена га-ар в семенном потомстве растений поколения То.

Для установления наличия и характера экспрессии трансгена в семенном потомстве

трансформантов, было проведено исследование потомства независимой трансгенной линии БТ1 методом реверсной ПЦР-амплификации. У тех же 25 из 27 растений, в ДНК которых предыдущим анализом было установлено наличие трансгена, были получены фрагменты, соответствующие его транскрипту (рис. 6).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 JO II 12 13 14 15 16 17 18 )» 20 21 2223 24 25 26 27 К П M

(V-943 n.o. h»-5S5 n.o.

ww wwww WWVWWWW «--275 n.o.

«..- 153 n.o.

Рис. 6. Результаты анализа растений семенного потомства независимой трансгенной линии ETI на наличие транскрипции трансгена rs-ap методом реверсной ПЦР-амплификации. 1-27 - растения семенного потомства линии БТ1, К - контрольное нетрансформированное растение инбредной линии Ц- пяазмнда pK22rs, М - молекулярный маркер (р1)СШМЬо1).

Принимая во внимание справедливость двухлокусной элементарной генетической модели, использованной для интерпретации результатов расщепления растений по наличию трансгена (таб. 9.), можно прийти к выводу, что наличие его нескольких копий "не вызывало транскрипционного «замолкания».

Учитывая данные, полученные из анализа расщепления семенного поколения независимой трансгенной линии БТ1 по наличию трансгена, его транскрипции, а так же устойчивости к киле, можно предположить, что дефензии Rs-AP в наибольшей концентрации накапливается при содержании в геноме растения одного локуса встраивания, в котором трансген присутствует в гемизиготном состоянии. Таким образом, при условии расположения на разных хромосомах, наличие одного локуса встраивания трансгена должно приводить к расщеплению поколения Ti по устойчивости в соотношении 1:1 (устойчивые : восприимчивые), при я»ух покусах - трёх - 3.29. Анализ этой гипотезы по критерию соответствия х2. проведённый в отношении независимых трансгенных линий БТ1,3 и 7, указывает на её справедливость (таб. 10).

Таблица 10.

Вычисление теоретических частот и критерия соответствия (хг) Для расщепления семенного по-

томства независимых трансгенных линий БТ1,3 и 7 по устойчивости к киле

Показатель Семенное потомство независимой трансгенной линии

БТ1 БТЗ БТ7

Растения Сумма Растения Сумма Растения Сумма

уст. неуст. уст. неуст. уст. неуст.

Ожид, расщеплен. (Н0) I 3 4 3 29 32 3 29 1 32 1

Кабпуод. частоты (0 6 21 27 2 20 22 1 21 22

Ожид.частоты^) 6,7500 20,2500 27 2,0625 19,9375 22 2,0625 19,9375 22

Разность (т -0,7500 0,7500, - -0,0625 0,0625 -1,0625 1,0625 -

Квадрат разности (Г-рУ 0,5625 0,5625 - 0,0039 0,0039 1 1,1289 1,1289 -

Отношение (("-ГГ/Т 0,0833 0,0288 0,1121 0,0019 0,0002 j 0,0021 0,5473 0,0566 0,6039

Вывод ХЧ=0,И2<Х«=3,840 Не не отвергается Хг*=0-002 <Х^З,840 Но не отвергается Х->0,604<х«=3,840 H« не отвергается

Подобное проявление аффекта «дозы» трансгена согласуется с литературными данными (De Wilde et al., 2001). Вероятно, в данном случае мы сталкиваемся с защитной реакцией растения в ответ на внедрение чужеродной генетической информации, которая, возможно, связана с использованным в конструкции вирусным промотором, так как предполагается, что данный защитный механизм направлен именно против вирусов и транспозонов (Waterhouse et al., 2001).

Итак, из тринадцати независимых трансгенных линий блокочанной капусты наличие транскрипции интродуцированного трансгена детектировалось только у девяти. Отсутствие транскриптов в тканях растений независимых трансгенных линий БТ8, 10, 11 и 13 связано, вероятно, с его инсерцией в область гетерохроматина. Расщепление семенного потомства независимой трансгенной линии БТ1 по наличию трансгена указывает на его встраивание в два локуса разных хромосом. Причём, как следует из анализа на содержание мРНК, это не препятствует его транскрипции. Расщепление семенного потомства трансгенных растений поколения То по устойчивости к киле свидетельствует, возможно, о наибольшем уровне накопления дсфензина Rs-AP при наличии одного локуса встраивания кодирующего его трансгена в гемизиготном состоянии. Если же последний присутствует в нескольких локусах либо в го-мнзиготном состоянии, то, вероятно, происходит посттранскрипционная деградация его мРНК. Отбор на инфекционном фоне килы позволил выделить из 129 растений поколения Ti тринадцать образцов с отсутствием симптомов поражения (0 баллов) и три образца со слабым поражением боковых корней ( 1 балл).

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика эффективной регенерации адвентивных побегов инбредными линиями белокочанной капусты. Морфогенетический потенциал белокочанной капусты существенно зависит от генотипа растения, типа экспланта, состава питательной среды, а так же от воздействия гипотермического стресса.

2. Разработан протокол агробактериальной трансформации инбредных линий белокочанной капусты. Эффективность трансформации определяется генотипом растения, концентрацией суспензии и штаммом агробактерий.

3. Получено тринадцать независимых трансгенных линий белокочанной капусты генотипа Б25 и их семенное потомство.

4. Изучены наследование и экспрессия трансгена rs-ap. Транскрипция трансгена rs-ap происходит не во всех растениях поколения То; наличие нескольких локусов встраивания трансгена не препятствует его транскрипции.

5. Отобраны трансгенные растения, отличающиеся устойчивостью к киле крестоцветных. Устойчивость к данной болезни проявляется при гемизиготном состоянии трансгена rs-ap и при наличии его в единичном локусе встраивания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Попадьин П. В., Монахос Г. Ф., Лунин В. Г., Аветисов В. А., Грибова Т. Н. Разработка методов регенерации и генетической трансформации коммерческих гомозиготных линий белокочанной капусты (Brassica oleracea var. capitata). II Тез. докл. Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия", Москва, 1999, с. 666.

2. Грибова Т. Н., Попадьин П. В., Аветисов В. А. Изучение регенерационной способности различных линий ранней капусты. // Тез. докл. Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые - возрождению сельского хозяйства в России в XXI веке", Брянск, 1999.

3. Попадьин П. В., Монахос В. А., Лунин В. Г., Аветисов В. А. Разработка методов регенера-

ции и генетической трансформации инбредных линий белокочанной капусты. // Тез. докл. Международной научно-практической конференции " Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке", Москва, 2000, с. 141-143.

4. Попадьин П. В.. Монахос Г. Ф., Лунин В. Г., Аветисов В. А., Народицкий Б. С. Перенос гена антимикробного пептида редьки (Raphanus sativus) в инбредные линии белокочанной капусты {Brassica oleracea var. capitata). // Тез. докл. II Международной научной конференции "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", Москва, 2000, с. 145-146.

5. Попадьин П. В., Лаврова Н. В., Аветисов В. А., Лунин В. Г., Монахос Г. Ф. Зависимость эффективности генетической трансформации белокочанной капусты {Brassica oleracea var. capitata) от используемого штамма Agrobacterium ssp. II Тез. докл. Международного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология", Москва, 2001, с. 270-271.

Отпечатано с готового оригинал-макета Объем 1,25 п. Зак. ЪОЦ Тираж (00

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Попадьин, Павел Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.6.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.10.

1.1 Болезни и генетика устойчивости белокочанной капусты. .10.

1.1.1 Настоящая мучнистая роса.10.

1.1.2 Альтернариоз или чёрная пятнистость. .11.

1.1.3 Кила.12.

1.2 Дефензины как представители антимикробных пептидов растений.16.

1.2.1 Антимикробная активность. .16.

1.2.2 Механизм антимикробного действия.18.

1.2.3 Роль в защите растения.19.

1.3 Генная инженерия в селекции растений. .24.

1.3.1 Селекция растений в III тысячелетии.24.

1.3.2 Проблемы применения генно-инженерных подходов в селекции растений.28.

1.4 Регенерация из соматических клеток растений рода Brassica.35.

1.5 Факторы, влияющие на агробактериальную трансформацию представителей рода Brassica.39.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.46.

2.1 Растительный материал.46.

2.2 Бактериальные штаммы и плазмиды.46.

2.3 Штаммы фитопатогенов.48.

2.4 Культивирование in vitro и генетическая трансформация белокочанной капусты.48.

2.4.1 Введение в культуру in vitro. .48.

2.4.2 Получение регенерантов методом прямого органогенеза.49.

2.4.3 Стрессовая обработка эксплантов. .50.

2.4.4 Агробактериальная трансформация.50.

2.4.5 Размножение растений клонированием in vitro.51.

2.4.6 Адаптация регенерантов к условиям in vivo.51.

2.5 ПЦР-анализ наличия трансгена в геноме растений.52.

2.6 Гибридизация ДНК растений-регенерантов по Саузерну.54.

2.7 Анализ транскрипции трансгена методом реверсной ПЦР.55.

2.8 Иммуноферментный анализ (Вестерн-блоттинг) трансформантов.56.

2.9 Оценка устойчивости трансгенных растений к заболеваниям.57.

2.9.1 Оценка устойчивости растений поколения То к настоящей мучнистой росе.57.

2.9.2 Оценка устойчивости растений поколения То к альтернариозу.58.

2.9.3 Оценка устойчивости семенного потомства растений поколения То к киле.58.

2.10 Статистическая обработка данных.59.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.60.

3.1 Разработка методики регенерации белокочанной капусты.60.

3.1.1 Оценка растительного материала на интенсивность адвентивного морфогенеза in vitro.60.

3.1.2 Влияние состава питательных сред на адвентивный морфогенез в условиях in vitro.64.

3.1.3 Влияние гипотермического стресса на адвентивный морфогенезе условиях in vitro.78.

3.2 Разработка методики агробактериальной трансформации белокочанной капусты.84.

3.2.1 Анализ устойчивости растений белокочанной капусты к канамицину.85.

3.2.2 Влияние генотипа растения, типа экспланта и штамма агробактерий на эффективность генетической трансформации.87.

3.3 Изучение трансгенных растений белокочанной капусты.96.

3.3.1 Анализ растений поколения То на наличие транскриптов трансгена.96.

3.3.2 Анализ растений поколения То на содержаниепептида RS-AP.98.

3.3.3 Первичная оценка устойчивости трансгенных растений поколения То к настоящей мучнистой росе.99.

3.3.4 Первичная оценка устойчивости трансгенных растений поколения То к альтернариозу.101.

3.3.5 Первичная оценка устойчивости семенного потомства трансгенных растений поколения То к киле.102.

3.3.6 Изучение наследования трансгена в семенном потомстве растений поколения То.104.

3.3.7 Анализ на наличие транскрипции трансгена в семенном потомстве растений поколения То.106.

ВЫВОДЫ.111.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням"

Белокочанная капуста (Brassica oleracea convar. (L.) Alef. var.capitata L. f. alba DC) относится к роду Brassica, семейству Brassicaceae (Barnett), трибе Brassiceae (Hayek) субтрибе Brassicinae (Hayek). Это наиболее распространённая овощная культура в Росии. В настоящее время в Российской Федерации белокочанную капусту выращивают на площади 161,7 тыс. га, или 21,6% всех площадей, занятых овощами (Абрамов,1999). Она даёт дешёвую продукцию в открытом грунте, а наличие сортов разных сроков созревания и хозяйственного назначения позволяет использовать её в свежем виде на протяжении всего года. Благодаря универсальному использованию, высокой урожайности (до 100 т/га) и широкой экологической пластичности, белокочанная капуста выращивается повсеместно (Пантиелев,1981).

Этот овощ обладает благоприятным для пищеварения биохимическим составом. В среднем, капуста содержит 8% сухого вещества, в который входят сахара, лимонная и яблочная кислоты, около 2,1% сырого белка, 0,9% клетчатки, 0,7% минеральных веществ, включающих в себя значительное количество серы. Белокочанная капуста богата витаминами, которые представлены аскорбиновой кислотой (витамин С), тиамином (Bi), рибофлавином (В2), пантотеновой кислотой (Вз), пиридоксином (Вб), фолиевой кислотой (В9), никотинамидом (РР), биотаном (Н), фарнохиноном (К) и метилметионином (U) (СоколД978; Гусев, 1991).

Помимо высоких вкусовых достоинств, белокочанная капуста обладает целебными и диетическими свойствами. Блюда из свежей или квашеной капусты обязательно включают в состав лечебного питания людей, страдающих сердечно-сосудистыми и желудочно-кишечными заболеваниями. Благодаря высокому содержанию солей калия, капуста способствует выведению из человеческого организма излишков жидкости, улучшая работу сердца и почек. Высокое содержание клетчатки в капусте позволяет использовать её для стимуляции моторной функции кишечника и удаления из организма холестерина. Витамин U, содержащийся в соке, способствует быстрому зарубцовыванию язв желудка и двенадцатиперстной кишки, являясь хорошим средством для профилактики этих болезней. Из-за высокого содержания витамина С белокочанная капуста является одним из важнейших источников его поступления в рацион питания зимой (Гусев, 1991).

Многочисленные заболевания, которым подвержена белокочанная капуста, приводят к потерям значительной части урожая и сильно снижают качество продукции. В годы эпифитотий некоторых болезней потери урожая кочанов могут достигать 100% (Дорожкин, Куневич,1980; Шувалова, 1980), а семян - 60% (Тивари,1989). Ситуация осложняется отсутствием разрешённых для применения на продовольственной капусте химических средств защиты. Всё это вызывает необходимость выведения устойчивых сортов. Однако редкая встречаемость доноров устойчивости среди видов, скрещивающихся с белокочанной капустой, делает эту задачу трудновыполнимой при помощи методов традиционной селекции - гибридизации, бекроссов и отбора.

Ускорить решение данной проблемы можно при помощи методов генной инженерии - нового, в значительной мере технологического направления биологии, возникшего в 70-х годах двадцатого века. На данном этапе развития методы генной инженерии позволяют манипулировать с нуклеиновыми кислотами, искусственно создавать рекомбинантные молекулы ДНК с любыми заданными нуклеотидными последовательностями - генами и необходимыми для их функционирования элементами, и вводить их в геном любого организма.

Среди генов иммунного ответа растений особое внимание привлекли к себе гены дефензинов, кодирующие короткие цистеинсодержащие пептиды широкого фунгицидного и бактерицидного действия (Broekaert et al., 1995). Из обнаруженных к настоящему времени растительных дефензинов, одними из наиболее активных и широкоспецифичных, являются дефензины редьки

Raphanus sativus). При трансформации табака геном одного из них, rs-afp2, были получены растения, проявляющие устойчивость к грибному патогену Alternaria longipes, вызывающему альтернариоз (Terras et al.,1995). Впечатляющим оказался и успех фирмы "Monsanto Co.", учёные которой создали картофель, экспрессирующий ген дефензина alfAFP, выделенного из семян люцерны (Medicago sativa). Полученный трансгенный картофель существенно меньше поражался вертициллёзом, вызываемым грибным патогеном Verticillium dahliae, по сравнению с растениями исходного сорта, обработанными фунгицидами (Gao et al.,2000).

Важнейшим этапом в создании трансгенных растений является наличие эффективной методики генетической трансформации. Однако, несмотря на то, что представители рода Brassica являются удобными объектами для манипуляций в культуре in vitro (Sjodin ,1992.), работ по генетической трансформации белокочанной капусты опубликовано немного (Радчук и др.,2000). Ранее были получены трансгенные растения только у небольшого количества сортов, а именно: у сортов King Cole (Metz et. al.,1995), Gourmet, Gourmet Sweet, Sommer Globe (Christey et. al.,1997) и гибридов Fi Kalorama, Erdeno и Krautman (Радчук и др., 2000). Известно, что успешная регенерация -необходимая предпосылка возможности генетической трансформации растений. Однако требования к факторам, влияющим на морфогенез растений в культуре in vitro, в значительной мере определяются их генотипом (Narasimhulu and Chopra, 1988). В связи с этим, практически все опубликованные протоколы регенерации белокочанной капусты малопригодны для применения на конкретных инбредных самонесовместимых родительских линиях Fi гибридов. Большинство опубликованных протоколов трансформации также имеют значительные ограничения. Например, использование необезоруженных штаммов Agrobacterium rhizogenes (Berthomieu, Jouanin, 1992; Christey et. al., 1997) приводит к регенерации растений с изменённым фенотипом из-за встраивания в растительный геном генного локуса rol (Tepfer, 1989). 9

Применение в качестве эксплантов черешков листьев (Berthomieu, Jouanin, 1992) или цветоносов (Metz et. al., 1995) требует заблаговременного, тщательного планирования работ, что особенно усложняется двухлетним циклом развития белокочанной капусты. Кроме того, возникают большие проблемы при стерилизации этих эксплантов для введения в культуру in vitro. Использование же только гипокотилей и не использование семядолей (Радчук и др., 2000) снижает производительность труда и увеличивает расход семян подвергаемого трансформации генотипа.

В связи с вышеизложенным, данная работа посвящена разработке эффективной методики регенерации и генетической трансформации депрессированных инбредных родительских линий Fi гибридов белокочанной капусты, а также изучению устойчивости трансгенных растений к заболеваниям.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Попадьин, Павел Владимирович

выводы

1) Разработана методика регенерации адвентивных побегов из семядольных и гипокотильных эксплантов инбредных родительских линий Fi гибридов белокочанной капусты, позволяющая получить у линий И 34 и Б 25 частоту события, в среднем, 76%. Установлено, что:

- семядольные экспланты обладают большим морфогенетическим потенциалом, чем гипокотильные;

- наибольшим морфогенетическим потенциалом из изученных обладают линии И 34 и Б 25;

- оптимальным для регенерации адвентивных побегов является состав питательной среды: минеральная основа по Мурасиге -и Скугу, витамины В5, 30 г/ л сахарозы и 3 мг/ л БАП;

- воздействие на экспланты низкой положительной температуры существенно увеличивает частоту как адвентивного морфогенеза в целом (на 10-26%), так и регенерации побегов в частности (на 6-9%).

2) Разработан протокол агробактериальной трансформации, позволяющий получать до 8% трансформантов инбредной линии Б 25. Установлено, что:

- концентрация канамицина-сульфата 25 мг/л эффективна для выделения экспрессируюгцих неомицинфосфотрансферазу трансформантов;

- оптимальной является концентрация агробактерий 105 клеток/мл;

- частота генетической трансформации зависит от агробактериального штамма: при использовании LBA 4404 не получен ни один трансформант, при применении LGV 3850 частота трансформации составила около 0,8%, тогда как при инокуляции штаммом А4 - 8%;

- достоверных различий в частоте трансформации между семядольными и гипокотильными эксплантами у исследованных генотипов

112 белокочанной капусты нет. 3) Получено тринадцать независимых трансгенных линий белокочанной капусты генотипа Б 25 и их семенное потомство. Установлено, что:

- по морфологическим признакам трансформанты не имеют отличий от контрольных нетрансформированных растений;

- транскрипция трансгена rs-ap происходит не во всех растениях поколения То;

- присутствие трансгена в нескольких локусах встраивания может не препятствует его транскрипции;

- наибольший уровень экспрессии трансгена rs-ap проявляется при наличии его в гемизиготном состоянии в единичном локусе встраивания; трансформация белокочанной капусты конструкцией pK22rs неэффективна для получения генотипов, устойчивых к заболеваниям;

- использование гена дефензина RS-AP перспективно для создания исходного селекционного материала белокочанной капусты, обладающего устойчивостью к киле. из

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в результате проведённых экспериментов разработаны эффективные методики регенерации и агробактериальной трансформации депрессированных инбредных линий белокочанной капусты. Получены и изучены трансгенные растения, содержащие ген дефензина Rs-AP.

Изучение морфогенетического потенциала пяти инбредных самонесовместимых родительских линий Fi гибридов белокочанной капусты, выведенных на селекционной станции им. Н. Н. Тимофеева, показали, что семядольные экспланты подавляющего большинства исследованных генотипов обладают большим морфогенетическим потенциалом, чем гипокотильные, и регенерируют, в среднем, на 15% чаще. Тем не менее, данный показатель имеет существенные значения у обоих типов эксплантов, что позволяет использовать для получения растений - регенерантов и те, и другие, экономя трудовые затраты, а так же семена. Было выделено две линии - И 34 и Б 25 - отличающиеся высокой способностью к регенерации адвентивных побегов. Частота адвентивного морфогенеза у эксплантов линии Б 25 достигала, в среднем, 94%, а И 34 - 82%.

Из пяти изученных, определён оптимальный состав питательной среды, включающий: минеральную основу по Мурасиге и Скугу, витамины В 5, 45 г/л сахарозы и 3 мг/л БАП.

В ходе работы установлено, что воздействие на экспланты гипотермического стресса существенно увеличивает как частоту адвентивного морфогенеза в целом (на 10-26%), так и регенерации побегов в частности (на 6-9%), что, вероятно, связано со стимуляцией экспрессии генов, отвечающих за клеточную дифференциацию.

Выявлена селективная концентрация канамицина-сульфата, 25 мг/л, позволяющая с успехом отбирать трансформанты, экспрессирующие неомицинфосфотрансферазу.

Показано, что большое значение на успех генетической трансформации белокочанной капусты оказывает концентрация агробактерий. Существенного уровня регенерации инокулированных эксплантов (в среднем 82%) удалось достичь лишь при испорльзовании суспензии с концентрацией 103 клеток/ мл. При больших концентрациях регенерации не наблюдалось, а экспланты погибали, что, вероятно, связано с их реакцией сверхчувствительности в ответ на инфекцию.

Частота агробактериальной трансформации белокочанной капусты в существенной мере зависела и от генотипа растения. Несмотря на высокую частоту регенерации, не удалось получить ни одного трансформанта инбредной линии И 34, по-видимому, из-за её устойчивости к использованным в работе агробактериальным штаммам.

Существенное влияние на частоту генетической трансформации оказывал также штамм агробактерий. Инокуляция эксплантов штаммом LBA 4404 не позволила получить ни одного трансгенного растения, при использовании LGV 3850 частота трансформации составила, в среднем, около 1%, тогда как при применении А4 - 7%.

Тип экспланта не оказывал существенного влияния на эффективность трансформации.

Трансгенные растения, адаптированные к условиям in vivo, не проявляли отличий по морфологическим признакам от нетрансформированных, что свидетельствует о стабильности генома белокочанной капусты при регенерации по разработанной методике.

Наличия дефензина Rs-AP в трансгенных растениях поколения То детектировать не удалось. Так же не удалось выявить отличий трансгенных растений поколения То от нетрансформированных по устойчивости к настоящей мучнистой росе и альтернариозу. Полученные результаты, возможно, объясняются отсутствием или недостаточным уровнем накопления пептида.

Изучение наследования трансгена rs-ap на примере расщепления семенного потомства независимой трансгенной линии БТ1 по его наличию, а так же анализ растений поколения То методом гибридизации ДНК по Саузерну показало, что в геноме трансформантов он может быть представлен несколькими копиями и находится в локусах разных хромосом.

Наличие нескольких копий трансгена не препятствовало его транскрипции. В то же время транскрипция трансгена происходила не во всех растениях поколения То что, вероятно, объясняется его инсерцией в область гетерохроматина.

При анализе устойчивости к киле семенного потомства трансгенных растений поколения То наблюдалось расщепление по этому признаку, что, возможно, свидетельствует об активности дефензина Rs-AP против возбудителя данной болезни. Кроме того, анализ наблюдаемой картины расщепления позволил установить, что, по-видимому, наибольшее накопление пептида RS-AP происходит при наличии кодирующего его трансгена в гемизиготном состоянии в единичном локусе встраивания и, вероятнее всего, в виде одной копии.

Полученные в ходе исследований трансгенные растения белокочанной капусты могут быть использованы для дальнейшего изучения наследования и экспрессии трансгена rs-ap. Использование же их в качестве исходного материала для создания килоустойчивых Fi гибридов затруднительно из-за наблюдаемого эффекта «дозы» трансгена. Однако обнаруженная активность дефензина Rs-AP в отношении возбудителя килы свидетельствует о перспективности применения его для этой цели, однако, вероятно, он должен находится под контролем других регуляторных элементов.

Разработанные эффективные методики регенерации и генетической трансформации депрессированных инбредных линий белокочанной капусты могут быть использованы при размножении их в культуре in vitro, для

116 переноса в их геном чужеродных генов, определяющих хозяйственно-ценные признаки и для проведения фундаментальных исследований по биологии этой культуры. Созданные трансгенные линии, отличающиеся повышенной устойчивостью к киле, могут быть использованы в качестве модельных объектов для изучения фунгицидной активности дефензинов в отношении облигатных паразитов и для изученияфеномена «замолкания» трансгена.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попадьин, Павел Владимирович, Москва

1. Абрамов В. К овощному сезону 1999 года. // Семена. 1999. - №1. - С. 26.

2. Алпиева М., Димитров С. Изследвания върху устойчивостта към брашнеста мана (Erysiphe cruciferarum Opis ex L. Junell) на хибриди в Fi от главесто зеле. // Генетика и селекция. 1989. - Т22. - №5. с. 420-423.

3. Биотехнология растений: культура клеток./ Под редакцией Бутенко Р. Г.- М.: Агропромиздат, 1989. С. 13.

4. Геринг X. Преодоление витрификации и улучшение акклиматизации растений при клональном микроразмножении. В кн.: Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М.: Наука, 1991. С. 197-200.

5. Глазков М. В. Границы структурно функциональных единиц (доменов) эукариотических хромосом. / / Генетика. - Т. 34. - С. 593 - 604.

6. Гусев А. М. Целебные овощные растения. М.: МСХА, 1991. С. 90-101.

7. Дёрфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир, 1985. С. 42-46.

8. Джалилов Ф. С., Монахос Г. Ф., Семёнов П. А. Оценка устойчивости гибридов капусты к болезням при хранении. / / Известия ТСХА. 1999. -Вып. 2. - С. 107-113.

9. Дорожкин Н. А., Куневич Л. Р. Слизистый бактериоз капусты в БССР: Тез. докл. на IV Всес. совещании. Ереван, 1980. С. 75-76.

10. Дорохов Д. Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов. // Молекулярная генетика. 1997. - Т. 33.- №4. С. 443-450.

11. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта. М.: Колос, 1979. С. 242-271.

12. Дрейпер Дж., Скотт Р., Кумар А. и др. Генная инженерия растений. / Пер. под ред. А. М. Колчинского. М.: Мир, 1991. С. 262, 277-303.

13. Катаева H. В., Александрова И. Г., Драгавцева Е. В. Значение гормонов в формировании витрифицированных побегов яблони при микроразмножении. В кн.: Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М.: Наука, 1991.С. 189-192.

14. Квасников Б. В. Методика оценки сортов капусты на устойчивость к киле. М.: Типография ВАСХНИЛ, 1970. С.21.

15. Кирай 3., Клемент 3. Методы фитопатологии. // М.: Колос, 1974. С. 189190.

16. Комалетдинова Ф. М. Методы получения трансгеиных растений картофеля с использованием штаммов Agrobacterium, несущих гены устойчивости к болезням и вредителям: дис. канд. биол. наук. Санкт-Петербург: ВНИИ Защиты растений, 1997.132 с.

17. Кучеренко JI. А. Подходы к разработке технологии массовой регенерации растений in vitro. В кн.: Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. С. 232-242.

18. Ли А., Тинланд Б. Интеграция Т-ДНК в геном растений: прототип и реальность (Т-ДНК агробактерий). / / Физиология растений. 2000. - Т. 47. - №3. - С. 354-359.

19. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.// Под ред. Баева А. А. и Скрябина К. Г. М.: Мир, 1984. С. 225-229.

20. Марьяхина И. А. Методические указания по размножению кочанной капусты в культуре. М.: ВАСХНИИЛ, 1985. 22 с.

21. Методические указания по селекции капусты./ Под редакцией Бобровой Ю. М.: Типография ВАСХНИЛ, 1989. С. 35

22. Методы экспериментальной микологии. / Под ред. Билай В. И. Киев. Наукова думка, 1982. С. 486-487.

23. Мобильность генома растений./ Под редакцией Винецкого Ю. П. М.: Агропромиздат, 1990. С. 228-260.

24. Молекулярная клиническая диагностика.Методы. / Под редакцией С. Херрингтона и Дж. Макли. М.: Мир, 1999. С. 354-357.

25. Монахос Г. Ф. Расовый состав возбудителя килы и результаты селекции капусты на устойчивость к патогену.// Защита овоще-бахчевых культур и картофеля от вредителей и болезней: Тез. докл. науч.-практ. конф. -Тирасполь, 1986. С. 64-66.

26. Монахос Г. Ф. Состояние и перспективы селекции капусты белокочанной на устойчивость к киле (Plasmodiophora brassicae Woron.). В кн.: Акту ал. пробл. науки в с.-х. пр-ве. - М.: РУДН, 1997. С. 24-26.

27. Монахос Г. Ф., Джалилов Ф. С., Артемьева Е. А. Устойчивость пекинской капусты к киле и рассовый состав патогена. // Селекция и семеноводство в XXI веке.: Тез. докл. международной науч.-практич. конф. . М.: ВЫПИСОК, 2000. Т. 2. С. 84-85.

28. Монахос Г. Ф., Зубик И. Н. Наследование устойчивости к киле у линий дайкона. // Доклады ТСХА. 2000. - Вып. 272. - С. 227-233.

29. Монахос Г. Ф., Ушанов А. А. Наследование устойчивости к киле (.Plasmodiophora brassicae Woron.) у линий листовой капусты (Brassica oleracea ssp. acepliala). / / Известия ТСХА. 1998. - Вып. 2. - С. 106-114.

30. Народицкий B.C., Лунин В. Г., Анисимова С. С. и др. Ген rs-ap из Raphanus sativus, вектор для трансформации растений и способ получения трансгенного растения. / / RU 2176669 С1, 2000.

31. Норова Г. Е., Калиев А. Б. Трансформация растений томата (Lycopersicon esculentum L.) сорта Бахтемир. // Биотехнология. 1991. - №2. - С. 16-18.

32. Пантиелев Я. X. Пригородное овощеводство. М.: Колос, 1981. С. 195-201.

33. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. М.: Агропромиздат, 1989. С. 318-330.

34. Петрова С., Родева В., Антонова Т. Регенерация ин витро при експланти от облъчени с гамма-лъчи семена на главесто зеле. // Сборник на докладите и резюментата от Юбилейната научна сессия на тема:

35. Устойчивото земледелие в условиях на перехода въм пазарна икономика. Пловдив, 1995. T.IV. кн. 2. С.83-86.

36. Попов Ф. А. Вредоносность альтернариоза семенников капусты. / / Защита растений. 1993. - №10. - С. 30.

37. Радчук В. В., Блюм Я. Б., Рышка у. И. др. Изучение регенерации и получение трансгенных растений у различных сортов белокочанной капусты. / / Физиология растений. 2000. - Т. 47. - №3. - С. 453-460.

38. Ралдугина Г. Н., Горелова С. В., Кожемякин А. В. Стабильность и наследование трансгенов в растениях рапса. // Физиология растений. -2000. Т. 47. - №3. - С. 437-445.

39. Романов Г. А. Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности // Физиология растений. 2000. - Т. 47. - №3. - С. 343-353.

40. Сафразбекян С. А., Катаева Н. В., Миляева Э. JI. Морфогенетические особенности побегов каперса в системе клонального микроразмножения. / / Физиология растений. 1990. - Т. 37. - N 1. - С. 169-176.

41. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести. -М.: Издательство стандартов, 1985. 57 с.

42. Сокол П. Ф. Улучшение качества продукции овощных и бахчевых культур. М.: Колос, 1978. С. 66-97.

43. Тивари Р. Д. Биологическое обоснование приёмов защиты капусты от сосудистого бактериоза: автореф. дис. канд. с.-х. наук. М., 1989. - 21 с.

44. Тутельян В. А., Кравченко JI. В., Лашнева Н. В. и др. Медико-биологическая оценка безопасности белкового концентрата, полученного из генетически модифицированной сои. Биохимические исследования. / / Вопросы питания. 1999. -Т. 68. - № 5/6. - С. 9-12.

45. Ушанов А. А. Наследование основных хозяйственных признаков и комбинационная способность самонесовместимых линий кормовой капусты: дис. канд. с.-х. наук. М.: МСХА, 2001.190 с.

46. Шаденков А. А., Ковалёва М. В., Кузьмин Е. В. и др. Vir D2 независимый, но Mob-A зависимый перенос ДНК плазмиды широкого круга хозяев RSF 1010 из агробактерии в ядро растительной клетки. / / Молекулярная биология. 1996. - Т. 30. - Вып. 2. - С. 458-464.

47. Шувалова Г. В. Распространение слизистого бактериоза корнеплодов крестоцветных культур в Ленинградской обл./ Тез. докл. на IV Всес. совещании. Ереван, 1980. С.34-35.

48. Almedia М. S., Cabral К. М., Lindali R. В. , Kurtenbach Е. Characterisation of two novel defense peptides from pea (Pisum sativum) seeds. / / Arch. Biochem. Biophys. 2000. - V. 378 - № 2. - P. 278-286.

49. Bailey J. E. Metabolic Engineering. / / Adv. Mol. Cell. Biol. 1996. -V 15. - P 289-296.

50. Basu A., Sethi U. and Gua-Mukherjee S. Regulation of cell proliferation and morphogenesis by amino acids in Brassica tissue cultures and its correlation with threonine deaminase. // Plant Cell Rep. 1989. - V. 8. - P. 333-335.

51. Beclin C., Chalot F., Botton E. et al. Potential use of the aux2 Gene from Agrobacterium rhizogenes as a Conditional Negative Marker in Transgenic Cabbage. // Transgen Res. 1993. - V 2. - P. 48-55.

52. Berthomieu P., Jouanin L. Transformation of Rapid Cycling Cabbage ( Brassica oleracea var. capitata) with Agrobacterium rhizogenes. / / Plant Cell Rep. -1992. V. 11.-P. 334-338.

53. Bevins C. L. and Zasloff M. Peptides from frog skin. // Annu. Rev. Biochem. -1990. V. 59. - P. 103-106.

54. Bhatia C. R., Mitra R. Biosafety of Transgenic Crops Plants. // Proc. Indian Natl. Sci. Acad. Pt. В (Biol. Sci.). 1998. - V. 64 - №5-6. - P. 293-318.

55. Bhattacharya N. M., Sen S. K. Production of plantles through somatic embriogenesis. // Z. Pflanzenphysiol. 1980. - V. 99. -P. 357-365.

56. Bogre L., Meskiene J., Heberle-Bors E. and Hirt H. Stressing the role of MAP kinases in mitogenic stimulation. // Plant Molecular Biology. 2000. - V. 43. -P. 705-718.

57. Bloh C. and Richardson M. A new family small (5 kDa) proteins inhibitors of insect a-amilases from seeds of sorgum (Sorgum bicolor (L) Moench) have sequence homologies with wheat y-purothionins. / / FEBS Lett. 1991. - V. 279. - P. 101-104.

58. Boman H. and Hultmark. G. Cell-free immunity in insects. // Annu. Rev. Microbiol. 1987. - V. 41. - P. 103-106.

59. Borlaug N. E. A Green Revolution yelds a golden harvest. // Columbia J. World Bus. -1969. P. 9-19.

60. Boulter M. E., Croy E., Simpson P. et al. Transformation of Brassica napus L. (oilseed rape) using Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhisogenes a comparison. / / Plant Science. -1990. - V. 70 - P. 91-99.

61. Broecaert W. F., Cammue B. Ph., Osborn R. W. et al. Biocidal Proteins.//WO 93/05153 -1993.

62. Broecaert W. F., Terras F. R. G., Cammue B. P. A., Osborn R. W. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system. // Plant Physiol. 1995. - V. 108. - P. 1354-1358.

63. Brown D. C. W., Leug D. W. N. and Thorpe T. A. Osmotic requirement for shoot formation in tobacco callus. // Physiol. Plant. 1979. - V. 46. - P. 36 -41.

64. Brown D. С. W. and Thorpe T. A. Changes in water potential and its components during shoot formation in tobacco callus. / / Physiol. Plant. -1980. V. 49. - P. 83 -87.

65. Buczacki S. Т., Toxopeus Hv Mattusch P. et al. Study of physiologie specialization in Plasmodiophora brassicae: proposols for attempted rationalization trough an international approach. / / Trans. Br. mycol. Soc. -1975. V. 65 -P. 295-303.

66. Buiatti M., Baroncelli S., Bennici A. et al. Genetic of growth and differantion in vitro of Brassica oleracea var. botrytis. II. An in vitro and in vivo analysis of a diallel cross. // Z. Pflazenzucht. 1974. - V. 72. - P. 269-274.

67. Casse F. Le mais et la resistance aux antibiotique. //La Recherche. 2000. - V. 327. - P. 35-39.

68. Charest P. }., Holbrook L. A., Gabard J. et al. Agrobacterium-mediated transformation of thin cell layer explants from Brassica napus L. // Theor Appl Genet 1988. - V. 75. - P. 438 - 445.

69. Chevassus-au-Luis N. La batalle non termine de terminator. //La recherche. -2000. V. 327. - P. 80-82.

70. Chen L., Marmey P., Taylor N. J. et al. Expression and inheritance of multiple transgenes in risce plants. / / Nature Biotechnology. 1998. - V. 16. - P. 10601064.

71. Chi G.-K. and Pua E.-C. Ethylene inhibitors enhanced de novo shoot regeneration from cotyledons of Brassica campestris ssp. chinensis (Chinese cabbage) in vitro. // Plant Science. 1989. - V. 64. - 243-250.

72. Chiang С. C. and Hadwiger L. A. The Fusarium solani-inducted expression of a pea gene family encoding high cysteine content proteins. / / Mol. Plant-Microbe interact. 1991. - V. 4. - P. 324-331.

73. Chiang M. S. and Crete R. Interitance of clubroot resistance in cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata L.). // Can. J. Genet. Cytol. 1970. - V. 12. - P. 253-256.

74. Chiang M. S. and Crete R. Diallel analis of the inheritance of resistsnce to race 6 of Plasmodiophora brassicae in cabbage. / / Can. J. Plant Sci. 1976. - V. 56. - P. 865-868.

75. Chiang M. S. and Crete R. Transfer of resistance to rase 2 of Plasmodiophora brassicae from Brassica napus to cabbage (B. oleracea var. capitata). The inheritance of resistance. // Euphytica. 1983. - V. 32. - P. 479-483.

76. Comczynskiy P. A reagent for the single-step simultaneosus isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. // Biotechniques. 1993. - V. 15 - №3. - P. 532-534,536-537.

77. Chriqui D. Strategies et Enjeux de Transgenese chez les Plantes. // Comptes Rendus Societe de Biologie. 1997. - V. 191. - P. 143-153.

78. Christey M. C., Sinclair В. K., Braun R. H., Wyke L. Regeneration of transgenic vegetable brassicas ( Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation. // Plant Cell Reports. -1997. V. 16 - P. 587-593.

79. Chua N.-H. and Sundaresan V. Plant Biotechnology. The ins and auts of a new green revolution. / / Current Opinition in Biotechnology. 2000. - V. 11. - P. 117-119.

80. Conner A. J., Jacobs J. M. Genetic engineering of crops as potential source of genetic hazard in the human diet. // Mutat Res. 1999. - V. 443. - V. 1-2. - P. 223-234.

81. Cramer C. L., Boothe J. G., Oishi К. K. Transgenic Plants for Therapeutic Proteins: Linking Upstream and Downstream Strategies. / / Plant Biotechnology ./ Eds. Hammond J. et al. Berlin : Springer, 1999. P. 95-118.

82. Crete R. Word wide importance of clubroot. // Clubroot Newsletters. 1981. -V. 11.-P. 6-7.

83. Crisp P., Crute R. A., Sutherland S. M. et al. The exploitation of genetic resources of Brassica oleracea in breeding for resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae). // Euphytica. 1989. - V. 42. - P. 215-226.

84. Crute J. R. and Pink D. A. C. The characteristics and inheritance of resistance to clubroot in Brassica oleracea. / / Asp. Applied Biol. 1989. - V. 23. - P. 57-60.

85. Daniell H. GM Crops: Public Perception and Scientific Solution. / / Trends Plant Sci. 1999. - V. 4 - P. 467-469.

86. Daniell H., Muthukumar В., Lee S. B. Marker free transgenic plants: engineering the chloroplast genome without the use of antibiotic selection. / / Curr. Genet. 2001. - V. 39. - № 2. - P. 109-116.

87. Daniell H., Streatfield S. ., Wycoff K. Medical molecular farming: production of antibodes, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. / / Trends Plant Sci. 2001. - V. 6. - № 5. - P. 219-226.

88. Davies G., SheikhM., Ratcliffe O. et al. Genetics of homology-dependent gene silencing in Arabidopsis: a role for methylation. / / Plant J. 1997. - V. 12. -P. 791-804.

89. Debergh P.CV Harbcoui J., Lemeur R. Mass propogation of globe artichoke (Cynare scolymus) evolution of different hypotheses to overcome vitrification with spesial reference to water potential. // Physiol, plant. 1981. - V. 53. - P. 181-187.

90. De Block M., De Brouwer D. and Terming P. Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea Using Agrobacterium tumefaciens and the Expression of the bar and neo Genes in the Transgenic Plants. / / Plant Physiol. 1989. - V. 91. -P. 694-701.

91. De Carvalho F., Gheyesen G., Kushnir S. et al. Supression of b-l,3-glucanase transgene expression in homozygous plants. / / EMBO J. 1992. - V. 11. -P. 2595-2602.

92. De Samblanx G. Wv Goderis I. J., Thevissen K. et al. Mutational analysis of a plant defensin from radish (Raphanus sativus L.) revereals two adjacent sitesimportant for antifungal activity. //J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 11711179.

93. De Wilde C., Podevin N., Windels P., Depicker A. Silencing of antibody genes in plants with single-copy transgene inserts as a result of gene dosage effects. / / Mol. Genet. Genomics. 2001. - V. 265. - № 4. - P. 647-653.

94. Ding L.-C., Hu C.-Y., Yeh K.-W., Wang P.-J. Development of insect-resistant transgenic cauliflower plants expressing the trypsin inhibitor gene isolated from local sweet potato. // Plant Cell Reports. -1998. V. 17. - P. 854-860.

95. Dingermann Т., Zundorf J. Gentechnik, Biotechnik. Stutgart: Wiss. Verl.-Ges., 1999. P. 213-232.

96. Dixon G. R. Review of resistance to fungal pathogens in the Brassica Eucarpia./ "Cruciferae 1979". Wageningen, 1979. P. 122-129.

97. Dunwell J. M. In vitro regeneration from excised leaf discs of three Brassica species. //J. Exp. Bot. 1981. - V. 32. -№ 129. - P. 789 - 799.

98. Dunwell J. M. Novel Food Product from Genetically Modified Crop Plant: Method and Future Prospects.// Int. J. Foods Sci. Techn. 1998. - V. 33. - P. 205-213.

99. Eimert K., Siegemund F. Transformation of cauliflover (Brassica oleracea L. var. botnjtis) an experimental survey. / / Plant Mol. Biol. - 1992. - V. 19. - P. 485490.

100. Elmayan Т., Balzergue S., Beon F., Bourdon V. Arabidopsis mutants impaired in cosuppression. / / Plant cell. -1998. V. 10. - P. 1447-1457.

101. Elomaa P., Helariutta Y., Griesbach R. et al. Transgene inactivation in Petunia hybrida is influenced by the properties of the foreing gene. / / Mol. Gen. Genet. -1995 V. 248 - P.649-656.

102. Epple P., Apel K., Bohmann H. ESTs reveal a multigene famyly for plant defensins in Arabidopsis thaliana. / / FEBS Lett. 1997. - V. 400. - P. 168-172.

103. Fagard M. and Vaucheret H. (Trans)gene silencing in plants: how many mechanisms? // Annu.Rev. Plant Physiol.Plant Mol. Biol. 2000. - V.51. - P. 179-188.

104. Filatti J. J., Kiser J. et al. Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector. / / Biotechnology. -1987. V. 5. - №7. - P. 726-730.

105. Fisher R., Emans N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. // Transgenic Res. 2000. - V. 9. - № 4 - P. 279-299.

106. Flannery К. V. The origins of agriculture. // Ann. Rev. Of Anthropic. 1973. -V. 2. - P. 271-310.

107. Fraley R. Т., Rogers S. G., Horsh R. B. et al. Expression of bacterial genes in plant cell. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - V. 80. - P. 4803-4807.

108. Fry J., Barnason A., Horsh R. B. Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens Based Vectors. / / Plant Cell Rep. 1987. - V. 6. - P. 321-325.

109. Gandhi R. and Khurana P. Stress-mediated regeneration from mature embryo-derived calli and gene transfer trough Agrobacterium in rice (Oryza sativa). // Indian J.of Exp. Biol. 1999. - V. 37. - P. 332-339.

110. Ganz T. and Lehrer R. J. Defensins. // Immunology. 1995. - V. 6. - P. 584589.

111. Gao A.-G., Hakimi S. M., Mittanck C. A. et al. Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide. / / Nature biotechnology. -2000. V. 18. - P. 1307-1310.

112. George L., Rao P. S. In vitro regeneration of mustard plants (Brassica juncea cv. Rai-5) on cotyledon explants from non-irradiated, irradiated and mutagen-treated seed. / / Ann. Bot. 1980. - V. 46. - P. 107-112.

113. Giddings G., Allison G., Brooks D., Carter A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. // Nat. Biotechnol. 2000. - V. 18. - No 11. - P. 1151-1155.

114. Goodwin J., Gordon Т., Ford-Lloyd B. and Newbury H. J. The effect of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. / / Plant Cell Reports. -1991. V. 9. - P. 671-675.

115. Gu Q., Kawata E. E., Morse M.-J. et al. A flower-specific cDNA encoding a novel thionin in tobacco. // Mol. Gen. Genet. 1992. - V. 234 - P. 89-96.

116. Gutierrez R., Macintosh G. C., Green P. J. Current Perspectives on mRNA Stability in Plants: Multiple Levels and Mechanisms of Control. // Trends Plant Sci. 1999 - V. 4. - P. 429-438.

117. Haldrup A., Petersen S. G., Okkels E. T. Positive selection: a plant selection principle based on xylose isomerase, an enzyme used in the food industry. / /. Plant Cell Rep. 1998. - V. 18. - P. 76-81.

118. Halmes-Davis R., Commai L., Nuclear Matrix Attachment Regions and Plant Gene Expression. // Trends Plants Sci. 1998. - V. 3. - P. 91-97.

119. Hamilton C. M., Frary Av Lewis C., Tanksley S. D. Stable Transfer of Intact High Molecular Weight DNA into Plant Chromosomes // Proc Natl. Acad. Sci. USA. -1996. V. 93. - P. 9975-9979.

120. Hanley Z., Slabas Т., Elborough К. M. The use of plant biotechology for the production of biodegradable plastics. / / Trends Plant Sci. 2000. - V. 5. - № 2. - P. 45-46.

121. Hansen L. N. Intertribal somatic hybridization between rapid cycling Brassica oleracea L. and Camelina sativa (L.) Crantz. // Euphitica. 1998. - V. 104. - P. 173-179.

122. Hansen M. Genetic variation and inheritance of tolerance to clubroot (Plasmodiophora brassicae Wor.) and other quantitative characters in cabbage (Brassica oleracea L.). // Hereditas. 1989. - V. 110. - P. 13-22.

123. HensKke R. B. and Shmidt F. R. J. Survival, distribution, and gene transfer of bacteria in a compart soil microcosm system. // Biol. Fertil. Soil. -1989. V. 8. -19-24.

124. James С. and Krattiger A. F. Global Review of the Field Testing and Commercialisation of Transgenic Plants 1986 to 1995: The First decade of Crop Biotechnology. IS AAA Brifs No.l. - Ithaca, NY ,USA: ISAAA, 1996. P.31.

125. Jejelowo O. A., Conn K. L. and Tewari J. D. Relationship between conidial concentrarion, germing growth, and phytoalexin production by Camelina sativa leaves inoculated zvith Alternaria brassicacea. // Mycol. Res. 1991. - V. 95. - P. 928-934.

126. Joersbo M., Okkels F. T. A novel principle for selection of transgenic plant cells: positive selection. // Plant Cell Rep. 1996. - V. 16. - P. 219-221.

127. Jun S. J., Kwon S. Y., Pack К. H. Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of fertile transgenic plants of Chinese cabbage (Brassica campestris spp. pekinensis cv. ''Spring Flavor"). // Plant Cell Rep. 1995. - 14. - 620-625.

128. Kaiser J. Ecology. Words (and axes) fly over transgenic trees. // Science. -2001. V. 292. - № 5514. - P. 34-36.

129. Kartha К. K., Michayluk M. R., Kao R. N. et al. Callus formation and plant regeneration from mesophill protoplasts of rape plants (Brassica napus L. cv. Zephir.). // Plant Sci. Lett. 1974. - V. 3. - P. 265-271.

130. Karunananda В., Singh A. and Kao T.-H. Characterisation of a predominantly pistil-expressed gene encoding a y-thionin-like protein of Petunia inflata. / / Plant Mol. Biol. -1994. V. 26. - P. 459-464.

131. Kimball S. L., Beversdorf W. D. and Bingam E. T. Influence of osmotic potential on the grown and development of soybean tissue culture.// Crop Sci. 1975. - V. 15. - P. 750 - 752.

132. Klimaszweska K., Keller W. A. High frequency plant regeneration from thin layer explants of Brassica napus. . / Plant Cell Tissue and Organ Culture. -1985. V. 4. - P. 183-197.

133. Klimaszweska K., Keller W. A. Somatic embryogenesis in cell suspension and protoplast cultures of Brassica nigra (L.) Koch.// J. Plant Physiol. 1986. - V. 122. - P. 251-260.

134. Kragh К. M., Nielsen J. E., Nielsen К. K. et al. Characterisation and localization of new antifungal cysteine-rich proteins from Beta vulgaris. // Mol. Plant. Microbe Interact. -1995. V. 8. - P. 424-434.

135. Kubicek Q. B. Panorama da biotechnologia nos EUA. // Biotec. Cien. & Desenv. Brasilia. 1997. - V. 1. - P. 38-41.

136. Kumpatla S. P., Chandrasekharah M. В., Iyer L. et al. Genome Intruder Scannig and Modulation Systems and Trans gene Silencing. / / Trends Plant Sci. 1998. - V. 3. - P. 97-104.

137. Laine E., Haicour R. Risque lies a la commersaliasation des Plantes Transgeniques? / / Cahiers Agricultures. 1998. - V. 7. - P. 546-556.

138. Laufs P., Autran D., Traas I. A. Chromosomal Paracentric Inversion Associated with T-DNA Integration in Arabidopsis. / / Plant J. 1999. - V. 18. - P. 131139.

139. Lazzeri P. A., Dunwell J. M. In vitro regeneration from seedling organs of Brassica oleracea var. italica Plenck cv. Green Comet. I.Effect of plant growth regulators. // Ann. Bot. 1986. -V. 58. - P. 689-697.

140. Lehrer R. J., Ganz T. and Selsted M. E. Defensins: endogens antibiotic peptides of animal cells. / / Cell. 1991. - V. 64. - P. 229-230.

141. Leshem В., Sahs T. Vitrified Dianthus-teratoma in vitro due to growth factor imbalance. // Ann. Bot. 1985. - V. 56. - P. 613-617.

142. Leshem В., Shaley D. P., Izhar S. Cytokinin as an inducer of vitrification in melon. // Ibid. 1988. - V. 61. - P. 255-260.

143. Lim H. Т., You Y. S., Park E. D. et al. High plant regeneration, genetic stability of regenerants, and genetic transformation of herbicide resistance gene (bar) in Chinese cabbage (Brassica campestris ssp. pekinensis). j j Proc. Int. Symp. on

144. Brassicas. Eds Thomas Gregoire and Antonio A. Monteiro. Acta Hort. 1998. P 199 208.

145. Logemann E., Wu S. C., Shroder J. et al. Gene activation by UV light, fungal elicitor or fungal infection in Petroselium crispum is correlated with repressin of cell cycle related genes. / / Plant J. V. 8. - P. 865-876.

146. Maliga P. Towards Plastid Transformation in Flowering Plants. // Trends Biotechnol. 1993. - V. 11. - P. 101-106.

147. Mattusch P. Kohlhernieanfalligkeit enes Chinakohlsortimetes. / / Gemuse. -1994. V. 6. - P. 357-359.

148. Matzke A., Neuhuber F., Park Y. et al. Homology-dependent gene silencing in transgenic plants: epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes. / / Mol. Gen. Genet. -1994. V.244 - P. 219-229.

149. Mendez E., Moreno A., Collila F. et al. Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free sistem of a novel thionin, y-hordothionin, from barley endosperm. // Eur. J. Biochem. -1990. V.194. - P. 533-539.

150. Metz T. D., Dixit R., Earle E. D. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of broccoli (Brassica oleracea var. italica) and cabbage (B. oleracea var. capitata). // Plant Cell Reports. 1995. - V. 15. - P. 287-292.

151. Meyer P., Heidmann I., Niedenhof I. Differences in DNA-methylation are assocated with a paramutation phenomenon in transgenic petunia. / / Plant J. -1993. V. 4. - P. 89-100.

152. Meyer P., Saedler H. Homology-dependent gene silencing in plants. / / Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1996. V. 47. - P. 23-48.

153. Miflin В., Napier J., Shewry P. Improving Plant Product Quality. / / Nature Biotech. 1999. - V. 17. - Suppl. P. BV 13-BV14.

154. Miki B. L., Labbe H., Hattori J. et al. Transformation of Brassica napus Canola Cultivar with Arabidopsis thaliana Acetohydroxyacid Synthase Genes and Analysis of Herbicide Resistance. / / Theor. Appl. Genet. 1990. - V. 80 - P. 449-458.

155. Mittelsten S., Afsar K., Paszkowski J. Release of epigenetic gene silencing by trans-acting mutations in Arabidopsis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -V. 95. - P. 632-637.

156. Moloney M. M., Radke S. Transformation and foreign gene expression in Brassica species. //US 5750871,1998.

157. Moloney M. M., Walker J., Sharma К. K. High Efficiency Transformation of Brassica napus Using Agrobacterium Vectors. / / Plant Cell Rep. 1989. - V. 8. -P. 238-242.

158. Moreno M., Segura A. and Garcia-Olmedo F. : Pseudothionin, a potato peptide active agains potato pahogens. / / Eur. J. Biochem. 1994. - V. 223. - P. 135 -139.

159. Murashige T. and Skoog F. A revised medium of rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiologia Plantarum. 1962. - V. 15. - P. 473497.

160. Murphy D. J. Production of Novel Oils in Plants. / / Cur. Opin. Biotech. -1999. V. 10. - P. 175-180.

161. Nacry P., Camilleri C., Courtial B. et al. Major-Chromosomal Rearrangements Inducted by T-DNA Transformation in Arabidopsis. / / Genetics. 1998. - V. 149. - P. 641-650.

162. Nap J. P., Bijvoet J. and Stiekema W. D. Biosafety of kanamycin-resistant transgenic plants. / / Transgenic Research. -1992. V. 1. - № 6. - 239-249.

163. Narasimhulu S. В., Chopra V. L. Species specific shoot regeneration response of cotyledonary explants of Brassicas. / / Plant Cell Reports. 1988. - V. 7. - P. 104 -106.

164. Narasimhulu S. В., Kirti S. В., Mohapatra T. et al. Shoot regeneration in stem explants and its amenability to Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer in Brassica carinata. / / Plant Cell Reports. 1992. - V. 11. - P. 359-362.

165. Oh B. J., Ко M. K., Kostenyuk I. et al. Coexpression of a defensin gene and a thionin-like via different signal transduction pathways in pepper and

166. Colletotrichum gloeosporioides interactions. // Plant Mol. Biol. 1999. - V. 41. -№ 3. - P. 313-319.

167. Ohlrogge J. Plant Metabolic Engineering: Are We Ready to Phase Two? / / Cur. Opin. Plant. Biol. 1999. - V. 2. - P. 121-122.

168. Osborn R. W., De Sanblanx G. W., Thevissen K. et al. Isolation and characterisation of plant defensins of Asteracea, Fabacea, Hippocastanacea and Saxifragacea. / / FEBS Lett. 1995. - V. 368. - P. 257-262.

169. Ovesna J., Ptacec L. and Opartny Z. Factors influencing the regeneration capacity of oilseed rape and cauliflower in transformation experiments. / / Biologia Plantarum. 1993. - V. 35 - № 1. - P. 107-112.

170. Penninckx J. A. M. A., Eggermont K., Terras F. R. G. Pathogen-inducted systemic activation of a plant defensin gene in Arabidopsis follows a Salicylic Acid Independent patway. // Plant Cell. - 1996. - V. 8. - P. 2309-2323.

171. Pental D., Pradhan A. K., Sodhi Y. S. Mykhopadhyay A. Variation amongst Brassica juncea Cultivars for condition for Agrobacterium-mediated Genetic Transformation. // Plant Cell Rep. -1993. V. 12. - P. 462-467.

172. Perennes C., Clab Nv Gugliem B. et al. Ars A3 a possible mediator in the signal transduction patway during agonist cell cycle arrest by salicylic acid and UV irradiation ?// J. Cell Sci. 1999. - V. 112. - P. 1181-1190.

173. Perl A., Shaul O., Galili G. Regulation of lysine synthesis in transgenic potato plants expressing a bacterial dihydrodipicolinate synthase in their chloroplasats. // Plant Mol. Biol. 1992. - V. 19. - P. 815-823.

174. Pua E.-C., Trinh Т. H. and Chua N.-H. High frequency plant regeneration from stem explants of Brassica alboglabra Bailey in vitro. // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1989,17:143-152.

175. Poirier Y. Production of New Polymeric Compound in Plants.// Cur. Opin. Biotech. 1999 - V. 10. - P. 181-185.

176. Poirier Y. Production of poliesters in transgenic plants. / / Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2001. - V. 71. - P. 209-240.

177. Prols F. and Meyer P. The methilation patterns of chromosomal integration regions influence gene activity of transferred DNA in Petunia hybrida. / / Plant J. -1992. V. 2. - P. 465-475.

178. Radchuk V. V., Klocke E., Ryscka U., Neumann M. Optimierung des Agrobacterium-vermittelten Gentransfers bei verschiodenen Brassicaceae. / / Vortrage Pflanzenzuchtung. -1998. V. 42. - P. 107-109.

179. Radke S. E., Andrews B. M., Moloney M. M. Transformation of Brassica napus L. using Agrobacterium tumefaciens: developmentally regulated expression of a reintroduced napin gene. // Theor Appl Genrt. 1988. - V. 75. - P. 685 - 694.

180. Ranee J. M., Tian W., Mathews H. et al. Partial desiccation of mature embryo-derived calli, a simple treatment that dramatically enhances the regeneration ability of indica rice.// Plant Cell Rep. 1994. - V. 13. - P. 647-651.

181. Raybould A. F. Transgenes and Agriculture: Going with the Flow. / / Trends Plant Sci. 1999. - V. 4. - P. 247-248.

182. Reichheld J.-P., Vernoux Т., Lardon F. et al. Specific checkpoints regulate plant cell cycle progression in response to oxidative stress. / / Plant J. 1999. - V. 17. - P. 647-656.

183. Richter L. and Kipp P. B. Transgenic Plants as Edible Vaccines. Plant Biotechnology./ Eds. Hammond J. et al. - Berlin : Springer, 1999. P. 159-176.

184. Salamini F. North-South Innovation Transfers. // Nature Biotech. 1999. -V.17. - Suppl. P. BV 11 - BV12.

185. Sanhis V., Agaisse H., Chaufaux J., Lereclus D. A. Recombiase Mediated System for Elimination of Antibiotic Resistance Gene Markers from Genetically Engineered Bacillus thuringiensis Strains. // Appl. Environ Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 779-784.

186. Schuller Т. H., Poppy G. M„ Kerry B. R., Denholm I. Potential Side Effects of Insect Resistant Transgenic Plants on Arhropod Natural Enemies. / / Trends Biotechnol. 1999. - V. 17. - P. 210-216.

187. Segura A., Moreno M., Garcia-Olmendo F. Novel defensin subfamily from spinach (Spinacia oleracea). // FEBS Lett. 1998. - V. 435. - № 2-3. -159-162.

188. Serageldin I. Biotechnology and Food Security in the 21st Century. / / Science. -1999. V. 285. - P. 387-389.

189. Sethi U. and Gua-Mukherjee S. Biochemistry and molecular biology of competence of plant cell differentiation and regeneration in vitro a review. // Current Science. - 1990. - V. 59. - № 6. - P. 308-311.

190. Shade R. E., Schroeder H. E., Pueyo J. J. et al. Transgenic pea seeds expressing the a-amilase inhibitor of the common bean are resistant to branched beetles. // Biotechnology. 1994. - V. 12. - P. 793-796.

191. Shagger H. and von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.// Anal. Biochem. 1987. - V. 166. - № 2. - 368-375.

192. Shaul O., Galili G. Threonine overproduction in transgenic tobacco plants expressing a mutant desensitized aspartate kinase of Eslierichia coli. / / Plant Physiol. 1992. - V. 100. - P. 1157-1163.

193. Shimoda S. Seeds in 1998 moving into a period of competitive disequilibrium. - ISTA news bull. Zurich: Intern. Seed testing assoc, 1998. V. 116. P. 27-29.

194. Shmit F., Oakeley E. J., Jost J. P. Antibiotics Induce Genome-Wide Hypermethylation in Cultured Nicotiana tabacum Plants //J. Biol. Chem. -1997. V. 272. - P. 1534-1540.

195. Shuppler U., He P.-H., John P. C. L. and Munns R. Effect of water stress on cell-division-cycle 2-like cell-cycle kinase activity in wheat leaves. // Plant Physiol. 1998. - V. 117. - P. 667-678.

196. Sing S. Inducted organ differentiation in hypocotyl segments callus and cell suspension cultures of rape Brassica napus campestris. / / Indian J. Exp. Biol. -1981. V. 19. - P. 658-660.

197. Sjodin С. Brassicacea, a Plant Family Well Suited for Modern Biotechnology. // Acta Agric. Scand. -1992. V. 42. - P. 197-207.

198. Skoog Fv Miller С. B. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro. / / Simp. Soc. Exp. Biol. 1957. - V. 11. - P. 118130.

199. Smith H. O., Wilcox K. W. A restriction enzyme from Haemophilus influenzae. Purification and general properties. / / J. Mol. Biol. 1970. - V. 51. - P. 379.

200. Srivastava V., Reddy A. S., Guha-Mukkerjee S. Transformation and regeneration Brassica oleracea mediated by an oncogenic Agrobacterium Tumefaciens. / / Plant Cell Rep. 1988. - V. 7 - 504-507.

201. Stam M., De Bruin R., Kenter S. et al. Post-transcriptional silencing of chalcone syntase in petunia by iverted transgene repeats. // Plant J. -1997. V. 12. - 6382.

202. Terras F. R. G., Eggermont K., Kovaleva V. et al. Small Cysteine-Rich Antifungal Proteins from Radish: Their Role in Host Defense. / / Plant Cell. -1995. V. 7. - P. 573-588.

203. Terras F. R. G., Schoofs H. M. E., De Bolle M. F. C. et al. Analysis of two novel classes of antifungal proteins from radish ( Raphanus sativus L.) seeds. / / J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P. 15301-15309.

204. Terras F. R. G., Torrekens S., Van Leuven F. et al. A new famili of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicae-species. / / FEBS Lett. -1993. V. 316. - P. 233-240.

205. Thanh N. Т., Siemens J.; Sacristan M.D. Regeneration und Transformation von Brassica oleracea-Linien,die in Vietnam angebaut werden . // Vortr.fur Pflanzenzuchtung. Bonn. 1996. - H.32. - S. 76-78 .

206. Thevissen К., Ghazi A., De Samblanx G. W. et al. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins. / / The journals of Biological Chemistry. 1996. - V. 271. - № 25 - P. 15018-15025.

207. Thevissen K., Terras F. R., Broekaert W. F. Permeabilization of fungal membranes by plant defensins inhibits fungal growth. // Appl. Environ Microbiol. 1999. - V. 65. - №12. - P. 5451-5458.

208. Thiery D. and Vaucheret H. Sequence homology requirements for transcriptional silencing of 35S transgene and posttranscriptional silencing of nitrite reductase (trans)gene by the tobacco 271 locus. // Plant Mol. Biol. -1996. V. 32. - P. 1075-1083.

209. Thomzik J. E., Hain R. Transgenic Brassica napus Plants Obtained by Cocultivation of Protoplast with Agrobacterium tumefaciens. // Plant Cell Rep. -1990. V. 9. - P. 233-236.

210. Tjallingii F. Testing clubroot-resistance of turnip in the Netherlands and the physiologic specialization of Plasmodiophora brassicae. / / Euphitica. 1965. -V. 14. - P. 1-22.

211. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from acrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some application. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

212. Tsukahara M. and Hirosawa T. Simple dehydration treatment promotes plantlet regeneration of rice ( Oryza sativa L.) callus.// Plant Cell Rep. 1992. -V. 11. - P. 550-553.

213. Van Elsas J. D. and Pereira M. T. P. R. R. Occurence of antibiotic resistance among bacilli in Brazilian soils and the possible invovlement of resistance plasmids. / / Plant Soil. -1986. V. 94. - 213-226.

214. Vaucheret H. Identification of a general silencer for 19S and 35S promoters in a transgenic tobacco plant: 90 bp of homology in the promoter sequences are sufficient for trans-inactivation. // C.R. Acad. Sci. 1993. - V. 316. - P. 14711483.

215. Vilitez A. M., Ballester A., San Jose M. S., Vieitez E. Anatomical and chemical studies of vitrified shoots of chestnut regenerated in vitro. / / Ibid. -1985. V. 65. - P. 177-184.

216. Vogel J., Somerville S. Isolation and characterization of powdery mildew-resistant Arabidopsis mutants. / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2000. V. 97. -№ 4. - P. 1897-1902.

217. Voorrips R. E. Plasmodiophora brassicae: aspects of pathogenesis and resistance in Brassica oleracea. // Euphytica. 1995. - V. 83. - P. 139-146.

218. Voorrips R. E. and Visser D. L. Examination of resistance to clubroot in accessions of Brassica oleracea using a glasshouse seedling test. / / Neth. J. PL Pathol. -1993. V. 99. - P. 269-276.

219. Vriesenga J. D. and Honma S. Inheritance of seedling resistance to clubroot in Brassica oleracea L. // HortScience. 1971. - V. 6. - P. 395-396.

220. Wang Y., Nowak G., Culley D. et al. Constitutive expression of pea defense gene DRR206 confers resistance to blackleg (Leptosphaeriamaculans) disease in transgenic canola(Brassica napus ). // Mol. Plant-Microbe Interact. 1999. - V. 12. - P. 410-418.

221. Waterhouse P.M., Wang M. В., Lough T. Gene silencing as an adaptive defence against viruses. // Nature. 2001. - V. 411. - № 6839. - P. 834-842.

222. Watson J. D., Crick F. H. C. Molecular structure of nucleic acids. A structure for deoxyribose nucleic acid. // Nature. 1953. - V. 171. - P. 737.

223. Wetherell D. F. Enchanced adventive embriogenesis resulting from plasmolysis of cultured wild carrot cells.// Plant Cell Tissue Org. Cult. 1984. - V. 3. - P. 221-227.

224. Willmitzer L. Plant Biotechnology: Output Trans the Second Generation of Plant Biotechnology Products Is Gaining Momentum. / / Cur. Opin. Biotech. -1999. - V. 10. - P. 161-162.

225. Wolf E. C. Beyond the Green Revolution. // Worldwatch. -1986. P. 73.

226. Wolfenbarger L. L., Phifer P. R. The ecological risks and benefits of genetically engineered plants. / / Science. 2000. - V. 290. - № 5499. - P. 2088-2093.

227. Yoshikawa H. Breeding for clubroot resistance of crucifer crops in Japan. / / Jpn. Agr. Res. Quart. 1983. - V. 17. - P. 6-11.

228. Yu J., Langridge W. H. A plant-based multicomponent vaccine protect mice from enteric diseases. / / Nat. Biotechnol. 2001. - V. 19. - № 6. - P. 548-552.

229. Zambriski P., Jools H., Genetello C. et al. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cell without alteration of their normal regeneration capacity. // EMBO J. 1983. - V. 2. - P. 2143-2150.

230. Zhang C. L., Chen D. F., McCormac A. C. et al. Use of the GFP reporter as a vital marker for Agrobacterium-mediated transformation of sugar beet (Beta vulgaris L.). // Mol. Biotechnol. 2001. - V. 17. - № 2. - P. 109-117.

231. Zuo J., Niu Q. W., Moller S. G., Chua N. H. Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants. / / Nat. Biotechnol. 2001. - V. 19. - № 2. -P. 157-161.141