Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение растений сахарной свеклы и капусты белокочанной с устойчивостью к микробным патогенам

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Получение растений сахарной свеклы и капусты белокочанной с устойчивостью к микробным патогенам"

005008279

На правах рукописи

ПИГОЛЕВА СВЕТЛАНА ВАСИЛЬЕВНА

ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ И КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К МИКРОБНЫМ ПАТОГЕНАМ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

1 9 Я Н В 2012

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2012

005008279

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии растений Филиала Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Н.С. Захарченко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

А.А. Кособрюхов А.Е. Филонов

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Защита диссертации состоится « 16 » февраля 2012 г. в 11-00 час, на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино, Институтская ул., 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук.

Автореферат разослан « января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Защита растений от фитопатогенов является актуальной задачей современной физиологии и биотехнологии растений. В настоящее время в сельском хозяйстве для этого используются различные комплексные подходы, такие как химические средства защиты, микробиологические методы, методы традиционной селекции, а также методы генной инженерии.

Одним из перспективных направлений в области повышения устойчивости растений к патогенам является трансформация растений генами, экспресирующими антимикробные пептиды и получение устойчивых к фитопатогенам трансгенных растений (Epple et.al., 1997; Liang et.al., 2000). Наличие селективных маркерных генов в трансгенных растениях может представлять потенциальную биологическую опасность, связанную с возможностью неконтролируемого переноса этих генов другим растениям и микроорганизмам. Существующие методы удаления селективных маркеров довольно трудоемки, поэтому разработка эффективных подходов получения безмаркерных растений представляет собой важную задачу биотехнологии растений.

В настоящее время для защиты растений от патогенов часто используются биопрепараты на основе микроорганизмов Bacillus, Azotobacter, Arthrobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Frankia. Многие из этих микроорганизмов обитают в ризосфере растений и способны синтезировать регуляторы роста растений, улучшать фосфорное питание растений, фиксировать атмосферный азот, индуцировать резистентность к фитопатогенам. Применение этих методов защиты растений эффективно, но имеет ряд недостатков. Обработка растений микробиологическими препаратами приводит к кратковременным положительным эффектам и требует нескольких обработок растений в период вегетации, поскольку такие микроорганизмы не способны устанавливать прочную ассоциативную связь с растениями. Наиболее удачным подходом к решению этой проблемы является применение комбинированного метода клонального микроразмножения растений и бактериальной колонизации растений полезными микроорганизмами in vitro, которые устанавливают прочную ассоциативную связь с растением и способствуют повышению его иммунитета.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является разработка методов защиты растений сахарной свеклы и капусты белокочанной от микробных фитопатогенов. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Отработать методы культивирования in vitro перспективных отечественных линий сахарной свеклы и капусты белокочанной. Оценить регенерационный потенциал различных типов эксплантов.

2. Провести генетическую трансформацию сахарной свеклы и капусты белокочанной искусственным геном антимикробного пептида цекропина PI (cecPl).

3. Разработать метод получения трансгенных растений, не содержащих селективных генов устойчивости к антибиотикам.

4. Подобрать условия и провести колонизацию растений сахарной свеклы и капусты белокочанной in vitro бактериями Methylovorus mays и Pseudomonas aureofaciens.

5. Исследовать влияние ассоциативных бактерий М. mays и P. aureofaciens на морфогенез растений и повышение их устойчивости к фитопатогенам.

Научная новизна. Изучен регенерационный потенциал 4 линий сахарной свеклы (325, 328, 330, 332) и 2 сортов капусты белокочанной (Зимовка 1474, Слава 1305) и отобраны линии и сорта с высокими регенерационными характеристиками. Оптимизирован метод трансформации растений с помощью агроинфильтрации семян. Получены трансгенные растения сахарной свеклы и капусты белокочанной, экспрессирующие антимикробный пептид цекропин PI.

Разработан метод получения и отбора безмаркерных трансгенных растений, основанный на анализе антимикробной активности экстрактов этих растений. Получены биобезопасные безмаркерные растения капусты белокочанной нового поколения. Растения сахарной свеклы и капусты белокочанной с геном cecPl проявляли повышенную устойчивость к бактериальным и грибным фитопатогенам Ervinia carotovora, Pseudomonas syringae, Sclerotinium sclerotiorum.

Влияние полезных микроорганизмов на развитие сахарной свеклы и капусты исследовали с помощью метода колонизации растений in vitro ассоциативными микроорганизмами в сочетании с клональным микроразмножением. Показано, что колонизация растений бактериями M.tnays и P.aureofaciens, стимулировала рост и морфогенез растений, благоприятно влияла на адаптационные свойства к условиям in vivo и повышала устойчивость растений к фитопатогенам и ксенобиотикам.

Практическая значимость. Использование трансгенных растений сахарной свеклы и капусты белокочанной с геном цекропина PI перспективно для повышения урожайности данных культур за счет усиления устойчивости растений к ряду грибных и бактериальных фитопатогенов. Создание безмаркерных трансгенных растений дает возможность избежать риска неконтролируемого переноса селективных генов другим растениям.

Метод колонизации растений in vitro полезными ассоциативными бактериями М. mays и P.aureofaciens в сочетании с микроклональным размножением позволит получить растения с высокой адаптационной способностью к условиям открытого грунта и с улучшенными физиологическими параметрами - корнеобразованием, скоростью роста, фотосинтетической активностью и повышенной устойчивостью к болезням.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), VI чтениях, посвященных памяти

академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2002), VI, IX, XIII, XIV, XV Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2002, 2005, 2009, 2010, 2011), Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), II Международных научно-практической конференциях «Актуальные проблемы биоэкологии» (Москва, 2008, 2010), Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009» (Пущино, 2009), Научном симпозиуме «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011), VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), Международной конференции «Человек и окружающая среда: друзья или враги?» (Пущино, 2011), VII Съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 37 печатных работ, в том числе 7 статей в рецензируемых журналах, 1 патент на изобретение, 6 статей в сборниках.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения и выводов и списка литературы. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, включая 11 таблиц, 41 рисунок; библиография содержит 261 ссылку.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительные объекты. В работе использовали растения сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) линии: 16, 325, 328, 330, 332 и 2083 (получены из ВНИИ сахарной свеклы и сахара имени A.A. Мазлумова, г. Воронеж) и капусты белокочанной (Brassica oleráceo var. capitata) сортов Зимовка 1474 и Слава 1305.

Бактериальные штаммы. В экспериментах использовали бактериальные штаммы Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404) (Hoekema et al., 1983), GV3101 (pMP90RK) (Zambryski et.al., 1983), Echerichia coli HB 101 (Маниатис и др.,1984), Methylovorus mays BKM В-2221 (Доронина и др., 2000), Pseudomonas aureofaciens BS1393 (Воронин и др., 2003) Pseudomonas pulida KT 2442::gfp и Pseudomonas aureofaciens (pTurboRFP), а также векторные плазмиды pGA482::cec PI (Захарченко и др., 2005), рВМ (Рукавцова и др., 2009). Использовали штаммы фитопатогенных

5

бактерий и грибов Erwinia caroiovora sb. carotovora В15, Pseudomonas syringae В1546, Sclerotinia sclerotiorum,.

Регенерация растений сахарной свеклы и капусты белокочанной. В экспериментах по микроразмножению сахарной свеклы использовали среду MC (Murashige a. Skoog, 1962), содержащую фитогормоны - 6-бензиламинопурин (БАП), индолил-уксусную кислоту (ИУК), а-нафтилуксусную кислоту (НУК) и ß-индолил-З-масляную кислоту (ИМК) в различных сочетаниях. Для капусты белокочанной использовали среду MC, дополненную фитогормонами БАП, зеатин, НУК, AgN03.

Растения культивировали при следующих условиях: фотопериод - 16/8 часов, температура - 24/26°С, освещенность - 150 мкМ/(м2с), длительность пассажа - 3 недели.

Эксперименты по трансформации проводили двумя методами: методом кокультивации эксплантов с суспензионной культурой агробактерий A. tumefaciens и методом вакуумной агроинфильтрации. Частоту трансформации определяли в процентах как отношение числа побегов, регенерировавших из эксплантов на селекционной среде к общему числу культивируемых эксплантов.

Получение безмаркерных трансгенных растений. Для трансформации растений использовали бинарный вектор рВМ, не содержащий селективного гена неомицинфосфотрансферазы II (nptll) для отбора растений (Рукавцова и др., 2009). Искусственный ген цекропина PI {cecPl) под промотором CaMV 35S клонировали в вектор рВМ, переносили в штамм А. tumefaciens LBA 4404 (pAL4404) и использовали для трансформации растений (Захарченко и др., 2005). Клонирование фрагментов ДНК в плазмидные векторы осуществляли по стандартным методикам (Sambrook et.al., 1989). Скрининг трансформантов проводили на неселективной среде методами детектирования цекропина PI в клетках растений, основанными на анализе антибактериальной активности растительных экстрактов.

Агроинфильтрация семян. Стерильные семена трансформировали в условиях вакуумной инфильтрации (Степанова, 2006). Для этого семена помещали в бактериальную суспензию (106 кл/мл) на 5 минут в условия вакуума при - 0,8 атм. Далее семена подсушивали на стерильной фильтровальной бумаге и размещали на агаризованной среде MC с фитогормонами. Через двое суток семена переносили на среду, содержащую селективные антибиотики. Растения подращивали в течение месяца в пробирках, анализировали и, после укоренения, высаживали в закрытый грунт станции искусственного климата «Биотрон».

Колонизация растений. Бактерии P. aureofaciens и М. mays выращивали в жидкой среде LB и Канеда, соответственно, в течение ночи на качалке (180 об/мин) при температуре 24°С. Разведенную суспензию наносили на листья стерильных растений сахарной свеклы и капусты из расчета 104— 105 колониеобразующих единиц (КОЕ) на

растение. Через две недели проводили тестирование растительных тканей (корней и побегов) на наличие в них микроорганизмов, которыми была проведена колонизация.

Измерение переменной флуоресценции хлорофилла в листьях растений. Флуоресценцию хлорофилла измеряли с помощью ХЕ-РАМ флуориметра ("Walz", Германия) в сопровождении программы Power Graph Professional 3.3. Измерения проводили на листьях сахарной свеклы, выращенных в условиях in vitro и in vivo. Для оценки максимального квантового выхода фотосистемы II использовали соотношение Fv/Fm. Начальный (F0) и максимальный (Fm) уровни флуоресценции были измерены на листьях растений, адаптированных в темноте 10-15 мин.

Анализ растений. Трансгенные растения анализировали с помощью антибиотической активности экстрактов растений (Ohshima, 1999), ПЦР и Вестерн-блот анализа. Анализ физиологических параметров роста и морфогенеза (Третьяков и др., 1990), устойчивость клеток растений к окислительному стрессу (Chance a. Maehly, 1955; Beauchamp a. Fridovich, 1971; Bates et al., 1973; Uchiyama a. Mihara, 1978; Королюк, 1988; Bellincampi et al., 2000), а также устойчивость растений к бактериальным и грибным фитопатогенам (Захарченко и др., 2005) проводили по стандартным методикам.

Статистическиий анализ данных проводили с помощью програмных пакетов Excel 2007 и Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Разработка метода клонального микроразмножения сахарной свеклы

Для оптимизации регенерации побегов из черешковых эксплантов сахарной свеклы использовались варианты среды МС, содержащей различные концентрации регуляторов роста и антивитрифицирующего агента ЕМ2 (Sigma). Зависимость морфогенного потенциала растений от концентрации цитокининов в среде изучалась на примере линии 332. При добавлении в среду МС 1,0 мг/л БАП частота регенерации составила 5,5-5,9%.

Повышение концентрации БАП до 2 мг/л увеличивало частоту регенерации до 21%, но вызывало витрификацию регенерировавших побегов. Добавление агента ЕМ2 не снимало этого эффекта. Только понижение концентрации БАП в среде до 0,4-0,5 мг/л позволило избежать витрификации и повысить частоту регенерации до 14,6-29,2% (данные не представлены).

Далее исследовали совместное действие цитокининов (БАП 0,4-0,5 мг/л) и ауксинов ИУК, НУК, ИМК на частоту регенерации побегов (табл. 1). Для линий 328, 332 и 330 наилучшие результаты получены при использовании НУК, а для линии 325 -при использовании ИМК. Максимальная частота регенерации побегов из листовых эксплантов линий 332, 328, 330 и 325 составляла от 17,6% до 50%.

Для индукции калусогенеза использовались линии 16 и 2083. Частоту регенерации побегов 50% получили на среде МС с добавлением 2 мг/л БАП.

Таблица 1.

Влияние гормонального состава среды на регенерацию листовых эксплантов сахарной свеклы

Линия № варианта Гормоны,мг/л Количество эксплантов, шт. Частота* регенерации,%

БАП ИУК НУК имк

330 1 0,4 0,1 - - 17 0

2 0,4 - 0,04 - 20 20 ±2,8

3 0,4 - 0,08 - 19 44,4 ±5,3

4 0,4 - 0,1 - 16 33,3 ±4,3

5 0,5 - 0,03 - 16 16,7 ±1,9

6 0,5 - 0,05 - 16 30 ±4,3

7 0,5 - 0,1 - 17 0

8 0,4 - - 0,04 18 0

10 0,5 - - 0,05 17 0

328 1 0,2 - 0,04 - 17 0

2 0,4 - 0,04 - 18 20

3 0,4 - 0,08 - 17 14,3 ±1,5

4 0,4 - 0,1 - 18 0

5 0,5 - 0,03 - 16 0

6 0,5 - 0,05 - 17 23,5 ±3,1

7 0,5 - 0,1 - 17 14,3 ±1,5

8 0,5 - - 0,04 16 18,4 ± 1,9

9 0,4 - - 0,08 22 0

10 0,5 - - 0,05 16 16,7 ±1,8

325 1 0,4 - 0,02 - 16 15,7 ±1,8

2 0,5 - 0,05 - 15 0

3 0,5 - 0,1 - 18 50 ±6,7

4 0,4 - - 0,04 16 46,7 ± 6,0

5 0,4 - - 0,05 15 0

6 0,4 од - - 17 42,8 ± 5,5

* Представлены средние арифметические значения результатов

трех независимых экспериментов и их стандартные отклонения

Таким образом, частота регенерации адвентивных побегов определялась генотипом сорта и гормональным составом среды. Линии 325, 330 характеризовались высоким регенерационным потенциалом.

Разработка метода клоналыюго микроразмножения капусты белокочанной

В качестве эксплантов использовали гипокотили растений капусты двухнедельного возраста. Исследованы 5 вариантов сред с добавлением AgNOз (ингибитор этилена), и фитогормонов (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние гормонального состава среды на регенерацию гипокотилей капусты белокочанной

Вариант, соеда Го ОМОНЫ, мг/л AgNOj мг/л Аденин мг/л Количество эксплантов, шт. Частота* регенерации, %

БАП Зеатин НУК

Сорт Зимовка 1474

1 К-1 2 2 1 0,5 - 40 12,5 ±0,5

2 К-2 1 1 0,5 0,5 - 50 34 ± 1,5

ЗК-З - 2 0,1 1 - 45 55,5 ±0,8

4 К-4 - 1 0,2 0,5 - 48 30 ±1,2

5 К-5 1 - 0,1 5 40 50 43 ±1,7

6К-6 - 2 0,5 1 - 58 77,6 ±1,4

Сорт Слава 1305

1 К-5 1 - 0,1 5 40 50 76 ±0,3

2 К-6 - 2 0,5 1 - 85 70± 1,1

ЗК-З - 2 0,1 1 - 83 93 ± 0,9

Варианты 1-4,6 - стандартная среда МС с фитогормонами, вариант 5 - х/г МС,

20 мг/л сахарозы и фитогормоны.

* Представлены средние арифметические значения результатов

трех независимых экспериментов и их стандартные отклонения.

Первые регенеранты появлялись после третьей недели культивирования. Высокая частота регенерации капусты сорта Зимовка 1474 и сорта Слава 1305 была отмечена на среде МС с добавлением - 2 мг/л зеатина, 0,1 мг/л НУК и 1 мг/л AgN03 (среда К-3).

Агробактериальная трансформация растений

В экспериментах по агробактериальной трансформации использованы линии сахарной свеклы 330, 325, имеющие более высокий регенерационный потенциал, чем линии 332 и 328, а также сорта капусты Зимовка 1474, Слава 1305.

В серии предварительных экспериментов нами была показана высокая чувствительность листовых эксплантов сахарной свеклы к цефотаксиму. При высоких концентрациях цефотаксима в среде (400 и 500 мг/л) происходило отмирание эксплантов. При снижении концентрации антибиотика в среде (200 и 250 мг/л) цефотаксим не оказывал негативного влияния на листовые экспланты, поэтому для элиминации агробактерий была использована концентрация цефотаксима 250 мг/л.

Трансформацию сахарной свеклы и капусты проводили двумя методами. Первый метод - кокультивация эксплантов (черешки листьев и участки гипокотилей) культурой агробактерий. Второй метод - вакуумная агроинфильтрация семян растений. При агробактериальной трансформации сахарной свеклы с помощью кокультивации черешковых эксплантов с агробактериями, получили единичные трансгенные растения, выросшие на селективной среде. Регенеранты капусты белокочанной, полученные методом кокультивации гипокотилей с агробактериями характеризовались отсутствием пигментов (хлорофила и каратиноидов). Молекулярно-генетический анализ не выявил сесР1-растений среди регенерантов капусты.

Более эффективным методом трансформации растений оказался метод вакуумной инфильтрации (Степанова и др., 2006). С его помощью была получена основная часть трансгенных растений сахарной свеклы и капусты белокочанной, содержащих ген сесР1. Трансформанты капусты получали с использованием двух вариантов культивирования: с добавлением в среду для регенерации ингибитора этилена - 1 мг/л AgNOз и без него. Более успешным оказался вариант без добавления AgNOз на этапе трансформации и селекции. Этот реагент добавляли в среду для лучшего роста растений через месяц после культивирования, когда начинали появляться регенеранты (среда К-3). Трансгенная природа полученных растений была подтверждена молекулярно-генетическим анализом. Укорененные растения высаживали в закрытый грунт теплицы для физиолого-биологических анализов и получения семян.

Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений, содержащих

ген сесР1

Наличие гена сесР1 в трансгенных растениях сахарной свеклы и капусты белокочанной было подтверждено методом ПЦР (рис. 1). Размер образующихся в результате амплификации фрагментов ДНК (102 пары нуклеотидов) соответствовал полному размеру гена сесР1.

102 п. н. —►

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Рис. 1. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений сахарной свеклы и капусты белокочанной, содержащих ген сесР1 под контролем промотора СаМУ 358.

1 - ДНК плазмиды рОА482-358-сес (контроль +);

2 - ДНК нетрансформированного растения (контроль -); 3-7 - ДНК трансгенных растений сахарной свеклы;

8-13 - ДНК трансгенных растений капусты разных линий.

ю

Экспрессию белка цекропина Р1 в трансгенных растениях сахарной свеклы подтвердили методом вестерн-блот анализа. Наличие одной полосы с молекулярной массой 3,4 кДа у исследуемых образцов соответствует полноразмерному пептиду цекропин Р1 (рис. 2). Уровень накопления целевого белка составлял 0,002-0,02 % от общего растворимого белка листьев трансгенных растений.

«— 3,4 кДа

1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Вестерн-блот анализ белковых экстрактов из трансгенных растений синтезирующих антимикробный пептид цекропина Р1. 1 - контроль (+) (20 нг синтетического цекропина); 2, 3 - белковый экстракт из трансгенных растений сахарной свеклы; 4, 5 - белковые экстракты из трансформированных растений капусты белокочанной;

6 - контроль (-) белковый экстракт из ^трансформированного растения. Экстракты из трансгенных растений проявляли повышенную антибактериальную активность к патогену Е. саго!огога по сравнению с экстрактами из нетрансгенных растений (рис. 3). Диаметр чистой зоны вокруг лунки трансгенного растения был не менее 5 мм, что указывает на наличие антибактериальной активности в клетках

Рис. 3. Ингибирующее действие экстрактов трансгенных растений на бактериальный патоген Е. саШоуога.

1 - зона действия экстракта трансгенных растений сахарной свеклы;

2 - зона действия экстракта трансгенных растений капусты белокочанной;

3 - экстракт контрольного растения.

Получение безмаркерных трансгенных растений капусты белокочанной

Трансформацию капусты белокочанной (сорт Слава) проводили методом вакуумной инфильтрации семян с агробактериями ЬВА 4404 (рАЬ4404), содержащими бинарный вектор рВМ с геном сесР1. Полученные растения капусты (400 проростков) анализировали группами по 10 проростков. Антибактериальную активность

исследуемого экстракта оценивали по наличию зоны отсутствия роста бактерий Е. сагоШога на агаризованной среде вокруг лунок (рис. 4).

Рис. 4. Анализ ингибирующей активности смеси растительных экстрактов (10 образцов из разных растений в одной лунке агарового блока) на рост бактерий Е. саго^гога. Использован метод радиальной диффузии.

*. . * ш ее«

• « • * « * * *

1|||И

с • ж С « Ф

• • » щш

В ходе исследования в девяти группах растительных экстрактов из сорока была обнаружена антибактериальная активность. Далее был проведен поиск в этих группах индивидуальных трансгенных растений ПЦР анализом белковых экстрактов. Размер амплифицированных фрагментов ДНК (102 п.н.) соответствовал размеру гена цекропина Р1 (рис. 6). В итоге, было выявлено 24 трансформанта.

102 п.н.

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Рис. 6. ПЦР - анализ безмаркерных трансгенных растений, содержащих ген сесР1.

1 -маркер ДНК;

2 - ДНК контрольного растения;

3-17 - ДНК трансформированных растений 18- ДНК плазмиды рОА482-358-сес контроль (+);

Таким образом, эффективность выявления трансформированных растений с помощью антибиотической активности составила около 6,3%. Экспрессия цекропина Р1 в трансгенных растениях подтверждена вестерн-блот анализом (рис. 5).

Рис. 5. Вестерн-блот анализ листьев отдельных растений капусты белокочанной.

1 - синтетический пептид цекропин Р1;

2 - 8 - экстракты трансформированных растений;

3,4 кДа

3 4 5

7 8 9

Полученные безмаркерные сесР1-растения синтезировали цекропин Р1 на среднем уровне около 0,005% от общего растворимого белка клетки, что делает возможным надежное применение использованных нами методов обнаружения таких растений в выборке из нескольких сотен регенерантов.

Трансгенные растения, экспрессирующие синтетический ген цекропина Р1, тестировали на устойчивость к некоторым бактериальным фитопатогенам. Анализ показал значительное повышение устойчивости сесР/-растений к бактерии Е. саго1о\ога. Уже через несколько часов после заражения на контрольных растениях были заметны следы повреждения - отмирание ткани, распространяющееся от места заражения вниз и вверх по стеблю, в то время как трансгенные растения оставались неповрежденными в течение 35 суток.

Влияние колонизации штаммами М. mays и P. aureofasiens на рост и морфогенез растений сахарной свеклы и капусты белокочанной

Влияние метилобактерий на прорастание семян сахарной свеклы (линия 325) и капусты белокочанной (сорт Зимовка) в условиях in vitro исследовали, инокулируя их бактериями Methylovorus mays и Pseudomonas aureofaciens. Семена проращивали на питательной среде MC без фитогормонов. Всхожесть колонизированных М. mays семян была на 20-25% выше, чем у неколонизированных. Влияние метилобактерий и псевдомонад in vitro на отдельные параметры роста сахарной свеклы и капусты исследовали на 14-дневных растениях. Микробиологический анализ показал наличие исследуемых бактерий во всех колонизированных растениях после нескольких циклов микроразмножения. Содержание бактерий М. mays и P. aureofaciens в листьях, корнях капусты белокочанной и сахарной свеклы составляло 1-3x103 КОЕ/см2.

Таблица 3.

Влияние колонизации штаммом М. mays на рост и морфогенез растений сахарной свеклы

Параметры Колонизированные растения Контрольные растения

Количество корней1 (шт.) 15 ± 0,1 10 ±0,2

Количество листьев2 (шт.) 13,7 ±0,2 8,4 ±0,6

Длина листьев3 (см) 8,9 ±0,1 6,2 ± 0,3

Растения, выжившие после высадки в условия теплицы4 (%) 92 ± 1,5 70 ± 1,1

- измерения проведены через 3-4 недели после колонизации; 2'3 - измерения проведены через два месяца после колонизации. Представлены средние арифметические значения результатов трех независимых экспериментов и их стандартные отклонения

Микроскопическое исследование локализации бактерий Р. pulida КТ 2442::gfp и Р. aureofaciens (pTurboRPP), экспрессирующих флуорисцентные белки GFP и RFP соответственно, также подтвердило присутствие этих бактерий на корнях и листьях растений. Эти данные свидетельствуют о стабильной ассоциации данных микроорганизмов с размножаемыми in vitro растениями.

Рис. 7. Влияние колонизации бактериями М. mays на ризогенез сахарной свеклы. 1,2 - колонизированные

растения 3,4 - контрольные растения

1 2 3 4 5 6

Рис. 8. Сравнение развития корневых систем у колонизированных растений капусты белокочанной (сорт Зимовка) 1,2- контрольные растения капусты белокочанной, через 6 дней после пересадки;

3 - 6 - растения капусты, выросшие из семян, колонизированных М. mays, 6 дней после пересадки.

Растения, колонизированные в условиях in vitro псевдомонадами и метилобактериями, при пересадке в открытый грунт проявляли повышенную скорость роста по сравнению с контрольными. Эксперименты по изучению влияния метилобактерий на регенерацию эксплантов сахарной свеклы показали, что

побегообразование у колонизированных эксплантов происходило на 20-30% интенсивнее, чем у неколонизированных контрольных эксплантов.

Нами исследовались различные морфолого-физиологические параметры растений сахарной свеклы, такие как скорость развития корневой системы, количество корней, количество листьев, длина листовой пластинки (табл. 3).

В ходе развития колонизированных метилотрофами растений сахарной свеклы и капусты белокочанной было отмечено, что они быстрее начинают формировать корневую систему после черенкования, по сравнению с контрольными растениями того же возраста и при одновременном черенковании. Колонизированные метилобактериями растения образовывали новые придаточные корни уже на шестой день после пересадки, в то время как контрольные растения образовывали новые корни через 8-14 дней (рис. 7-8). Кроме того, отмечалось увеличение длины листовой пластинки и большее количество листьев у колонизированных растений по сравнению с контрольными (табл. 3).

Проведена колонизация трансгенных растений сахарной свеклы (линия 325), экспрессирующих антибактериальный пептид цекропин Р1 ассоциативными бактериями М. mays. Содержание бактерий М. mays в листьях трансгенных растений составило 1,5-2,5*103 КОЕ/см2. Трансгенные растения сахарной свеклы сохраняли способность к колонизации ассоциативными микроорганизмами, что свидетельствует о безопасности таких растений для агробиоценозов.

Исследование фотоиндуцированных изменении выхода флуоресценции хлорофилла (Fv)

Анализ функциональной активности фотосинтетического комплекса растений сахарной свеклы показал, что колонизированные М. mays растения дольше сохраняли фотосинтетическую способность при длительной инкубации в условиях in vitro, по сравнению с контрольными растениями того же возраста (рис. 9). У растений измеряли величину Fv/Fm, характеризующую эффективность преобразования энергии в фотосистеме II (ФС-2). После 25 дней выращивания растений на среде МС без фитогормонов величина Fv/Fm была примерно на одном уровне у контрольных и колонизированных растений (0,78 и 0,79) и не отличалась от оптимальной. Дальнейшее выращивание растений без промежуточных пассажей (при постепенном истощении среды) приводило к значительному снижению фотохимической активности ФС-2 у контрольных растений до 0,69 (рис. 9). Это связано с повреждением комплексов ФС-2 и сопровождалось изменением в кинетике индукционной кривой флуоресценции (снижение интенсивности процессов фотохимического и нефотохимического тушения у контрольных растений). В то же время, у колонизированных растений величина отношения Fv/Fm при длительном выращивании в условиях in vitro сохранялась на

15

уровне оптимальных значений, что может свидетельствовать о полноценной работе фотосинтетического комплекса.

0,66 -0,64

1 2 ■ 25 суток а 35 суток

Рис. 9. Изменения отношения Fv/Fm в листьях неколонизированных растений сахарной свеклы (1) и в листьях колонизированных метилотрофами М. mays растений сахарной свеклы (2) в зависимости от длительности инкубации в условиях in vitro.

Анализ устойчивости к фитопатогенам колонизированных и трансгенных растений

Тестирование на устойчивость к патогенным микроорганизмам в системе in vivo растений, колонизированных Р. aureofaciens (через 2 месяца после высадки в закрытый грунт) проводили на отделенных листьях растений сахарной свеклы и капусты белокочанной (по 10 штук каждого варианта).

' Таблица 4

Тестирование устойчивости к патогенам растений сахарной свеклы

Патогены Контрольные растения Колонизированные растения* Трансгенные растения**

Пожелтение листьев Гибель листьев Пожелтение листьев Гибель листьев Пожелтение листьев Гибель листьев

Erwinia carotovora 3-е сутки 8-е сутки 7-е сутки 25-е сутки 7-е сутки 28-е сутки

Pseudomonas syringae 3-4-е сутки 10-е сутки 10-е сутки 27-е сутки 5-е сутки 20-е сутки

Sclerotinia sclerotiomm 5-е сутки 15-е сутки 10-е сутки 23-е сутки 10-е сутки 29-е сутки

* - растения, колонизированные бактериальным штаммом Р. аигео/ааепя ** - растения, трансформированные геном сесР1

Через три-пять суток после заражения бактериями Е. сагоШога (106 кл/мл) или Р. вугЬщае на контрольных листьях сахарной свеклы отмечалось пожелтение или ослизнение растительной ткани, в то время как листья колонизированных и трансгенных растений оставались без фенотипических изменений. К концу 7-15 суток поражение контрольных листьев составило 100% по площади (табл. 4). Гибель листьев трансгенных и колонизированных растений сахарной свеклы происходила на 20-29

сутки с момента заражения, что свидетельствует о повышенной устойчивости этих двух групп растений по сравнению с контрольными (табл. 4, рис. 11).

Таблица 5

Тестирование устойчивости к патогенам растений капусты белокочанной

Патогены Контрольные Колонизированные Трансгенные

растения растения* растения**

Пожелтение Гибель Пожелтение Гибель Пожелтение Гибель

листьев листьев листьев листьев листьев листьев

Erwinia 5-е сутки 10-е 12-е сутки 20-е Листья Листья

carotovora сутки сутки зеленые зеленые

Pseudomonas 13-е сутки 20-е 16-е сутки 30-е 30-е сутки 40-е

syringae сутки сутки сутки

Sclerotinia 5-е сутки 12-е 10-е сутки 21-е Листья Листья

sclerotiorum сутки сутки зеленые зеленые

* - растения, колонизированные бактериальным штаммом Р. aureofaciens

** - растения, трансформированные геном cecPl

После заражения листьев капусты белокочанной различными патогенами первые признаки болезни отмечались на 5-е сутки у контрольных растений, а у колонизированных растений - 12-16 сутки (рис. 12). Стопроцентное поражение контрольных листьев наступило на 10-20 сутки, в то время как у колонизированных - на 20-30-е сутки с момента заражения (табл. 5). Трансгенные растения, экспрессирующие ген cecPl, обладали повышенной устойчивостью к патогенам.

90

' so

N..

контроль контроль трансген. трансген. колонизир раст. раст раст.

Рис. 10. Устойчивость растений сахарной свеклы (слева) и капусты белокочанной (справа) к бактериальному патогену Е. carotovora.

« 60

контроль контроль трансген. трансген колопгзир раст раст раст

Рис. 11. Устойчивость листьев сахарной свеклы, высаженной в закрытый грунт, к патогену Е. carotovora В15.

1-4,- листья контрольных растений через 8 дней после заражения; 5-6 - листья растений, колонизированных Р. aurefaciens; 7-8 - листья трансгенных растений с геном cecPl.

Рис 12. Устойчивость листьев капусты белокочанной к фитопатогенам. 3 - лист контрольного растения через 6 суток после заражения Е. carotovora', 5 - лист контрольного растения через 22 суток после заражения S. sclerotiorum; 1,2,4, - листья трансгенных растений, после заражения Е. carotovora (6 сутки); 6-8 - листья трансгенных растений, после заражения S. sclerotiorum (22 сутки).

Это проявилось в полном отсутствии заражения листьев трансгенных растений капусты белокочанной патогенами Е. carotovora, Р. syringae, S. sclerotiorum в течение всего эксперимента (рис. 12).

Проведена фитопатологичеекая оценка поражения листьев слизистым бактериозом, вызываемый Е. carotovora. Степень поражения растений условно обозначалась в баллах, означающих процент от площади поражения листа (рис. 10). Контрольные растения сахарной свеклы проявили высокую степень поражения (7 баллов), капусты белокочанной - среднюю степень поражения (5 баллов), а колонизированные и трансгенные растения - слабую степень поражения (1-2 балла).

Исследование роста колонизированных растений в условиях дефицита азота и

витаминов

Культивирование растений на обедненной среде МС без витаминов и азота показало, что растения, колонизированные М. mays, более приспособлены к стрессовым условиям и продолжали рост в течение двух-трех месяцев, в то время как скорость роста контрольных растений замедлялась, они постепенно теряли зеленую окраску и

Рис. 13. Растения сахарной свеклы линии 325 через 2 месяца после переноса на среды без азота(1, 3) и витаминов (2, 4). 1,2- контрольные растения; 3,4- растения, колонизированные метилобактериями М. mays.

Имеются данные, подтверждающие физиологические основы положительного влияния метилобактерий на рост растений. Показано свойство метилобактерий синтезировать цитокинины, ауксины, витамины и полисахариды, а также способность этих бактерий к азотфиксации (Доронина, 2000; Иванова и др., 2000, 2001). Ярко-зеленая окраска листьев и рост растений на безвитаминных средах может еще объясняться тем фактом, что метилобактерии, продуцируя цитокинины, стимулируют функционирование хлоропластов. Положительное влияние метилобактерий на морфогенез растений, является результатом их комплексного метаболического воздействия.

Исследование влияние колонизации растений М. mays на устойчивость растений к окислительному стрессу, вызванному гербицидом паракватом

Установлено, что колонизированные метилотрофами растения обладают большей устойчивостью к окислительному стрессу. Активность ферментов-антиоксидантов у

погибали (рис. 13).

12 3 4

колонизированных растений была выше: супероксидцисмутазы (СОД) в 2,05 раза (рис. 14), а каталазы в 1,27 раза, чем в клетках контрольных растений. Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) под действием стрессора у колонизированных растений практически не изменился, в то время как у контрольных растений повысился в полтора раза (рис. 14), что может говорить о значительном повреждении мембран контрольных растений. Содержание перекиси водорода в клетках колонизированных растений до стресса было в два раза меньше, чем в клетках контрольных растений. В то же время, после обработки паракватом, вызывающим окислительный стресс, содержание Н202 повысилось в обеих группах. Однако, содержание перекиси в клетках колонизированных растений было значительно ниже, чем в контроле (на 55%), что должно существенно снижать повреждение клеток при стрессе.

■ кода ипавакват ввода Шпаракват

Рис. 14. Влияние параквата на активность супероксидцисмутазы (слева) и уровень перекисного окисления липидов (справа) у контрольных (1) и колонизированных растений (2).

Таким образом, получены трансгенные растения сахарной свеклы и капусты белокочанной с повышенной устойчивостью к фитопатогенам, экспрессирующие ген антимикробного пептида цекропина Р1. Показано, что метод колонизации растений in vitro полезными ассоциативными бактериями М. mays и P. aureofaciens в сочетании с микроклональным размножением можно эффективно применять для получения растений с высокой адаптационной способностью к условиям открытого грунта.

выводы

1. Разработаны протоколы регенерации и генетической трансформации растений сахарной свеклы и капусты белокочанной.

2. Получены трансгенные растения сахарной свеклы и капусты белокочанной, экспрессирующие искусственный ген антибактериального пептида цекропина Pl.

3. Разработан метод получения безмаркерных растений, основанный на использовании антибиотической активности цекропина Pl.

4. Показана повышенная устойчивость трансгенных растений сахарной свеклы и капусты белокочанной к патогенам Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae и Sclerotinia sclerotiorum.

5. Колонизация растений ассоциативными метилобактериями и псевдомонадами оказывает положительное влияние на морфогенез растений и повышает их устойчивость к фитопатогенам Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae и Sclerotinia sclerotiorum.

6. Трансгенные растения, экспрессирующие антибактериальный пептид цекропин PI, экологически безопасны и сохраняют способность к колонизации полезными ассоциативными микроорганизмами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах:

1. Фирсов А.П., Пиголева C.B., Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Регенерация побегов сахарной свеклы из листовых эксплантов // Биотехнология. № 1.2004. С. 56-61.

2. Рукавцова Е.Б., Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Юхманова A.A.,Чеботарева Е.А., Бурьянов Я.И. Получение безмаркерных трансгенных растений нового поколения // Доклады Академии наук. 2009. Т. 426. № 2. С. 261-264.

3. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Юхманова A.A., Бурьянов Я.И. Использование гена антибактериального пептида цекропина PI для получения безмаркерных трансгенных растений // Генетика. 2009. Т. 45. № 8. С. 1061-1066.

4. Пиголева C.B., Захарченко Н.С., Пиголев A.B., Троценко Ю.А., Бурьянов Я.И. Влияние колонирующих метилобактрий на морфогенез и устойчивость к эрвиниям сахарной свеклы и капусты белокочанной // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45. № 6. С. 670-676.

5.3ахарченко Н.С., Чепурнова М.А., Карнова Л.С., Захарченко A.B., Пиголева C.B., Пунтус И.Ф., Кочетков В.В. Влияние ассоциативных микроорганизмов на устойчивость томатов к фитопатогенам in vitro и in vivo // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2010. Вып. 1.С. 175-185.

6. Пиголева C.B., Захарченко Н.С., Ермошин A.A., Чепурнова М.А., Бурьянов Я.И Колонизация растений сахарной свеклы ассоциативными бактериями оказывает влияние на систему антиоксидантной защиты / Известия ТулГу. Естественные науки. 2011. Вып. 3. С. 210-219.

7. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Кочетков В.В., Чепурнова М.А., Дьяченко О.В., Лебедева A.A., Захарченко A.B., Пунтус И.Ф., Воронин А.М., Бурьянов Я.И. Влияние

ассоциативных псевдомонад и метилобактерий на рост и устойчивость растений к фитопатогенам и ксенобиотикам //Физиология растений. 2012. Т. 59. № 1. С. 89-98. Статьи в сборниках:

1. Пиголева C.B., Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Колонизация растений ассоциативными Микроорганизмами - экологически чистый метод повышения устойчивости растений к фитопатогенам // Сборник материалов международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологии». Москва. 2008. С. 174-176.

2. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Юхманова A.A., Захарченко A.B., Чепурнова М.А., Бурьянов Я.И. Влияние ассоциативных микроорганизмов на повышение устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды // Материалы Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды». Иркутск. 2009. С. 170-173.

3. Карнова Л.С., Чепурнова М.А., Пиголева C.B., Захарченко Н.С. Влияние ассоциативных микроорганизмов и генетической трансформации томатов на устойчивость к фитопатогенам // Сборник материалов международного форума студенческой и учащейся молодежи «Первый шаг в науку. 2010». Минск. 2010. С. 390393.

4. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Лебедева A.A., Фуре О.В., Чепурнова М.А., Захарченко A.B., Карнова Л.С., Лебедева A.A., Бурьянов Я.И. Разработка способов защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Инновационное развитие профессионального образования в условиях университетского комплекса». Бузулук. 2010. С. 1-6.

5. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Чепурнова М.А., Ветошкина Д.В., Локтюшов Е.В., Пунтус И.Ф., Бурьянов Я.И. Влияние ассоциативных микроорганизмов на рост и устойчивость растений к стрессовым условиям окружающей среды // Сборник трудов I Международной Интернет-конференции «Растения и микроорганизмы». 2011. С. 43-46.

6. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Кочетков В.В., Пунтус И.Ф., Чепурнова М.А., Ветошкина Д.В., Бурьянов Я.И. Использование полезных микроорганизмов для улучшения экологии промышленных городов // Сборник научных трудов 5-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов». Саратов. 2011. С. 125-127. Патенты:

1. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Юхманова A.A., Пиголева C.B., Рукавцова Е.Б., Чеботарева E.H., Гаязова А.Р. Рекомбинантная плазмида рВМ и способ получения с ее использованием безмаркерных трансгенных растений, синтезирующих целевые продукты. Патент РФ на изобретение № 2410433 от 02.06.2009. Опубл. 27.01.2011. Бюл. №3.

Заказ №98-А/12/2011 Подписано в печать 30.12.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пиголева, Светлана Васильевна, Пущино

61 12-3/460

ФИЛИАЛ УЧРЕЖДЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТА БИОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

Пиголева Светлана Васильевна

Получение растений сахарной свеклы и капусты белокочанной с устойчивостью к микробным патогенам

03.01.05 - физиология и биохимия растений

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Н.С. Захарченко

Пущино - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр

Список сокращений......................................................................................................................................6

Введение..............................................................................................................................................................................7

1. Обзор литературы..............................................................................................................................................10

1.1. Влияние стрессовых факторов внешней среды на морфогенез растений и способы их защиты................................................................................................................10

1.1.1. Окислительный стресс и система защиты растений............................10

1.1.2. Влияние антропогенных факторов........................................................................12

1.1.3. Воздействие абиотических факторов..................................................................13

1.1.4. Действие биотических факторов среды............................................................14

1.1.4.1. Влияние фитопатогенных грибов на растения........................16

1.1.4.2. Влияние фитопатогенных бактерий на растения..................18

1.1.4.3. Влияние вирусов на растения....................................................................19

1.1.4.4. Влияние фитопаразитов и насекомых на растения............20

1.2. Болезни сахарной свеклы и капусты белокочанной..............................................22

1.3. Методы защиты растений от патогенов и вредителей........................................24

1.3.1. Химические методы защиты растений............................................................24

1.3.2. Биологические методы защиты растений......................................................25

1.4. Колонизация растений ассоциативными микроорганизмами........................27

1.4.1. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, механизмы их положительного влияния на растения..............................................................................28

1.4.2. Факторы, влияющие на колонизацию Pseudomonas

ризосферы растений..........................................................................................................................30

1.4.3. Использование бактерий рода Pseudomonas для защиты растений от фитопатогенов........................................................................................................31

1.4.4. Аэробные метилотрофные бактерии рода Methylobacterium... 32

1.4.5. Перспективы использования метилотрофных бактерий....................33

1.5. Совершенствование сортов сельскохозяйственных растений методами генной инженерии................................................................................................................34

1.5.1. Методы трансформации растений......................................................................36

1.5.1.1. Методы прямого переноса ДНК в растения..................................36

1.5.1.2. Методы агробактериальной трансформации растений... 37

1.5.2. Использование генов антибактериальных пептидов для получения транс генных растений........................................................................................39

1.5.2.1. Использование генов цекропинов для повышения

устойчивости трансгенных растений к фитопатогенам........................40

1.5.3. Генетическая инженерия и биотехнология сахарной свеклы... 43

1.5.4. Генетическая инженерия и биотехнология капусты белокочанной............................................................................................................................................................45

1.5.5. Актуальность получения безмаркерных трансгенных

растений......................................................................................................................................................47

2. Материалы и методы......................................................................................................................................48

2.1. Материалы и оборудование..........................................................................................................48

2.1.1. Растительный материал....................................................................................................48

2.1.1.1. Характеристика биологических объектов......................................48

2.1.2. Бактериальные штаммы..................................................................................................49

2.1.3. Оборудование..............................................................................................................................49

2.1.4. Реактивы, среды, антибиотики..................................................................................50

2.2. Методы..................................................................................................................................................................54

2.2.1. Культивирование растений in vitro............................................................................54

2.2.2. Регенерация побегов растений............................................................................................54

2.2.3. Агробактериальная трансформация сахарной свеклы

и капусты белокочанной................................................................................................................................55

2.2.4. Выделение геномной ДНК из листьев растений in vivo......................56

2.2.5. Выделение ДНК из растений in vitro для ПЦР............................................57

2.2.6. Анализ геномной ДНК трансгенных растений методом ПЦР.. 57

2.2.7. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле..............................................58

2.2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле......................................................................58

2.2.9. Приготовление компетентных клеток Е. coli и их

трансформация плазмидной ДНК......................................................................................58

2.2.10. Приготовление компетентных клеток А^гоЪа^егшт Ште/аЫет и их трансформация плазмидной ДНК..................................................59

2.2.11. Вестерн-блот анализ........................................................................................................60

2.2.12. Анализ антибиотической активности экстрактов трансформированных растений..............................................................................................61

2.2.13. Колонизация растений ассоциативными микроорганизмами. 62

2.2.14. Биотесты на изолированных листьях и целых растениях............62

2.2.15. Измерение переменной флуоресценции хлорофилла........................63

2.2.16.Тестирование антибиотической активности

метилобактерий к эрвиниям............................................................................................................63

2.2.17. Выделение ферментов-антиоксидантов из растительных

клеток..............................................................................................................................................................64

2.2.18. Определение активности супероксиддисмутазы в

экстрактах растительных клеток............................................................................................64

2.2.19. Определение активности каталазы в экстрактах растительных клеток........................................................................................................................65

2.2.20. Определение активности гвояколовой пероксидазы..........................65

2.2.21. Определение перекисного окисления липидов......................................66

2.2.22. Определение перекиси водорода в клетках растений......................66

2.2.23. Определение содержания свободного пролина......................................66

3. Результаты и обсуждение..............................................................................................................................68

3.1. Разработка методов микроклонального размножения растений..............68

3.1.1. Микроклональное размножение сахарной свеклы..................................68

3.1.1.2. Регенерация побегов сахарной свеклы через

промежуточную каллу сную фазу..............................................................................74

3.1.2. Микроклональное размножение капусты белокочанной..................78

3.2. Агробактериальная трансформация растений............................................................80

3.2.1. Оценка чувствительности капусты к канамицину....................................81

3.2.2. Оценка чувствительности сахарной свеклы к канамицину............81

3.2.3. Агробактериальная трансформация растений сахарной свек-

лы и капусты белокочанной.................................................... 83

3.2.4. Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений..... 86

3.2.5. Разработка метода получения безмаркерных трансгенных растений........................................................................... 89

3.3. Колонизация сахарной свеклы и капусты ассоциативными микроорганизмами Methylovorus mays и Pseudomonas aureofasiens.......... 93

3.3.1. Исследование влияния трансгенных растений, экспресси-рующих антимикробный пептид цекропин PI на полезные ассоциативные микроорганизмы............................................. 100

3.3.2. Исследование роста колонизированных растений в

условиях стресса................................................................. 101

3.3.3. Анализ функционирования фотосинтетического аппарата растений........................................................................... 103

3.3.4. Тестирование устойчивости к патогенам трансгенных растений и растений, колонизированных Р. aureofasiens............... 105

3.3.5. Тестирование устойчивости к патогенам растений, колонизированных М. mays растений....................................... 110

3.3.6. Тестирование антибиотической активности метилобактерий

к Е. carotovora................................................................... 110

3.3.7. Тестирование устойчивости колонизированных растений сахарной свеклы к окислительному стрессу............................... 112

Заключение................................................................................. 116

Выводы................................................................................... 120

Список литературы....................................................................... 121

Благодарности.......................................................................... 148

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАП - 6-бензиламинопурин

НУК - а -нафтилуксусная кислота

2,4 Д - 2,4 -дихлорфеноксиуксусная кислота

ИМК - (З-индолил-З -масляная кислота

ИУК - индолилуксусная кислота

gus - ген ¡3- глюкуронидазы

сес Р1 - ген цекропина Р1

т.п.н., kb - тысяча пар нуклеотидов

As - ацетосирингон

Cf - цефотаксим

Km - канамицин

МС - среда Мурасиге Скуга

LB - среда Luria-Bertani

В5 - среда Гамборга

WPM - среда Woody Plant Media

кДа - килодальтон

CaMV - вирус мозаики цветной капусты

PGPR - Plant Growth-Promoting Rhizobacteria - ризобактерии,

способствующие росту растений

ФСП - фотосистема II

БСА - бычий сывороточный альбумин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

SDS - додецилсульфат натрия

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ДТТ - дитиотриетол

ВВЕДЕНИЕ

Повышение продуктивности сельскохозяйственных растений и их устойчивости к различным биотическим и абиотическим стрессовым факторам внешней среды является важнейшей задачей современной агробиотехноло-гии. Эта задача решается классическими селекционно-генетическими методами, методами генной инженерии и с помощью микробиологических методов. Селекционно-генетические методы способствуют созданию сортов и гибридов, обладающих комплексной устойчивостью к грибным, бактериальным и вирусным патогенам, повышению устойчивости к неблагоприятным абиотическим факторам среды. Недостатком классического селекционно-генетического метода является большая продолжительность времени для получения одного сорта (в среднем 10 лет), при этом происходит случайная комбинация генов растения и, как следствие, невелик выход нужных генотипов. Кроме того, невозможно переносить гены (признаки) из филогенетически отдаленных видов.

Ускорение селекционного процесса и повышение его эффективности может обеспечить использование генно-инженерных методов. Современные достижения генетической инженерии и молекулярной биологии позволяют переносить в растения гены, контролирующие ряд важнейших хозяйственно-ценных признаков без нарушения генетической целостности сорта и получать растения с повышенной устойчивостью к фитопатогенам за более короткие сроки.

В мире растет популярность биологических методов защиты растений от вредителей, сорняков и патогенов. Достоинства биологических методов заключаются в мягком подавлении патогенов (в отличие от химических средств), возможности предупреждать их размножение, в длительности действия методов и их безвредности для человека. Одним из эффективных и экологически чистых методов защиты растений от фитопатогенов является использование природных микроорганизмов, одни из которых являются антагонистами фитопатогенов, другие являются ассоциативными микроорга-

низмами, положительно влияющими на рост растений. Ассоциативные микроорганизмы способствуют эффективному потреблению растениями минеральных веществ, снабжают их витаминами и регуляторами роста и защищают от фитопатогенов и вредителей. В настоящее время уже применяются экологически чистые бактериальные препараты для стимуляции роста сельскохозяйственных растений и их защиты от болезней. К сожалению, список микроорганизмов невелик и ограничен некоторыми представителями бактерий родов Rhizobium, Azotobacter, Arthrobacter, Pseudomonas, Bacillus, микоризными грибами и грибами рода Trichoderma. Расширение этого списка является актуальной задачей современной биотехнологии.

Одними из важнейших сельскохозяйственных культур, которые поражаются рядом фитопатогенных микроорганизмов, являются сахарная свекла и капуста белокочанная.

Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) является основным продуцентом сахара в зонах умеренного климата. Более 37% мирового сахара получают из этой культуры. Проводимые с сахарной свеклой селекционно-генетические работы направлены на повышение продуктивности и на обеспечение растений устойчивостью к фитопатогенам и различным стрессовым факторам. Относительно медленные темпы классической селекции новых сортов сахарной свеклы связаны с ее биологическими особенностями - высокой гетерозигот-ностью, перекрестной опыляемостью и двухлетним циклом развития. В настоящее время открывается возможность повышения устойчивости растений к фитопатогенам новыми микробиологическими методами, а также создание сортов методами генетической инженерии. Описанные примеры получения трансгенных растений сахарной свеклы немногочисленны, так как, сахарная свекла относится к трудным для экспериментов in vitro видам растений. Разработка методов трансформации и регенерации целых растений из тканей в культуре in vitro является одним из важных условий для получения трансгенных растений.

Капуста белокочанная ценная овощная культура, обладающая высокими вкусовыми качествами и лечебными свойствами. За последние годы в результате селекционной работы значительно повысились агрохозяйственные качества этой культуры, что привело к повышению урожайности. Однако важно решать вопросы, связанные с повышением устойчивости растений капусты к грибным и бактериальным заболеваниям. Необходимо совершенствовать систему защиты растений данной культуры с помощью методов генетической инженерии и микробиологических методов с применением штаммов-антагонистов и природных ассоциативных штаммов бактерий.

В связи с этим целью нашей работы явилась разработка биологически безопасные методы защиты растений сахарной свеклы и капусты белокочанной от микробных фитопатогенов. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Оптимизировать методы культивирования in vitro перспективных отечественных линий сахарной свеклы и капусты белокочанной. Оценить ре-генерационный потенциал различных типов эксплантов.

2. Провести генетическую трансформацию сахарной свеклы и капусты белокочанной искусственным геном антимикробного пептида цекропина PI ОcecPl).

3. Разработать метод получения трансгенных растений, не содержащих селективных генов устойчивости к антибиотикам.

4. Подобрать условия и провести колонизации растений сахарной свеклы и капусты белокочанной in vitro бактериями Methylovorus mays и Pseudomonas aureofaciens.

5. Исследовать влияние ассоциативных бактерий М. mays и Р. aureofaciens на морфогенез растений и повышение их устойчивости к фитопатоге-нам.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Влияние стрессовых факторов внешней среды на морфогенез растений и способы их защиты

Стресс - это неспецифическая адаптационная реакция организма растения на действие неблагоприятных факторов. Выделяют три группы экологических факторов, вызывающих стресс у растений: абиотические - влажность, освещенность, температура, радиоактивное излучение, механические воздействия; биотические - действие вредителей и болезней, конкуренция между видами растений, влияние животных, цветение, созревание плодов; антропогенные - соли, газы, ксенобиотики (гербициды, инсектициды, фунгициды, промышленные отходы).

Сила стресса зависит от скорости развития неблагоприятной для растения ситуации и уровня стрессирующего фактора. При медленном развитии неблагоприятных условий растение лучше приспосабливается к ним, чем при кратковременном, но сильном действии. Чем выше способность растения изменять метаболизм в соответствии с окружающей средой, тем шире норма реакции данного растения и лучше способность к адаптации. Это свойство отличает устойчивые сорта сельскохозяйственных культур.

1.1.1. Окислительный стресс и система защиты растений

Устойчивость растений к фитопатогенам определяется способностью распознавать патоген и своевременно включать механизм защиты. В живых организмах существует многоуровневая система защиты от окислительного стресса, включающая антиоксидантные ферменты и низкомолекулярные ан-тиоксиданты. Защитными реакциями являются - направленное движение ор-ганелл и ядра к месту проникновения патогена, образование активных форм кислорода, механическое упрочнение клеточной стенки (отложение каллозы и лигнина), активация ферментов-антиоксидантов, синтез антибиотических соединений - фитоалексинов, часто сопровождаемый клеточным коллапсом и другие. Происходит накопление транскриптов защитных генов, таких как

глюконазы, хитиназы, дефензины, в инфицированных клетках и в окружаемых их тканях.

Супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, пероксидаза с