Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ И ИХ МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ И ИХ МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ"

жмт

На п/кнтх рукописи

ЗАХАРЧЕНКО Наталья Сергеевна

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ И ИХ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени * кандидата биологических наук

Пущино - 2001

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии растений Филиала Института биоорганичсской химии им, М.М. Шемякина и Ю.А Овчинникова РАН . *

Научный руководи ть: доктор биологических наук,

профессор Я И. Бурьянов

Официальные оппоненты: доктор биологический Наук,

С. Г. Качзолова доктор биологических наук, - профессор Г.А. Романов Вслущаи организация: Институ т обшей генетики РАН .

Защита диссертации состоится «» 2001 г.

в часов на таседании диссертационного совета

Д002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г Пушино, Морсковской обл., Институт бнофюики клетки РАН | >

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Институт&Ч^^^ биофизики клетки - V

Автореферат разослан «Л^/ » (¿^¿^/ТЛ-Л-О^и^ . 2001 г.

Ученый секретарь - ■"" . , '■ / .

диссертационного совета

К.6.Н,

у г , ту-

У ///С-1^ *" Д-И- Смолихииа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Совершенствование методов генетической трансформации растений и технологии рекомбинантных ДНК сделали возможным экспрессировать в растениях гены различных организмов, что открывает перспективы для создания растений с новыми уникальными свойствами. Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) относится к важнейшим сельскохозяйственным культурам, являясь основным продуцентом сахара в зонах умеренного климата. Про водам ые с сахарной свеклой селении о ня о-ген етичсс кие работы направлены на повышение продуктивности и на обеспечение растений устойчивостью к фитопатогенам и различным биотическим и абиотическим стрессовым факторам. Относительно медленные темпы классической селекции новых сортов сахарной свеклы связаны с такими ее генетическими характеристиками как высокая гетерозиготность, перекрестная опыляемость и двухлетний цикл развития.

В настоящее время открывается реальная перспектива создания новых сортов принципиально новыми методами генетической инженерии. С помощью этих методов начато решение практических задач получения сахарной свеклы с повышенной сахаристостью, устойчивостью к свекловичной нематоде, вирусным инфекциям, насекомым-вредителям и гербицидам (Thomas, 1991). Однако большинство этих задач решается пока в экспериментах на уровне трансформированных пртопластов (Ingersoll et al., 1996), и растений, культивируемых m vitro (Jacq et al., 1992).

Разработка методов регенерации целых растений из клеток и тканей в культуре m vitro является одним из необходимых условий получения трансгенных растений. Сахарная свекла относится к трудным для экспериментов in vitro видам растений (Tetu et al., 1987), Описанные примеры получения трансгенных растений сахарной свеклы немногочисленны. Информация о существовании методов генетической трансформации отечественных сортов сахарной свеклы вообще отсутствует. Вследствие этого возникает необходимость более широко проводить исследования по совершенствованию методов регенерации и генетической трансформации этой культуры.

Разработка методов генной инженерии сахарной свеклы будет способствовать проведению фундаментальных исследований по биохимии, генетике и физиологии этой культуры, что откроет перспективы по созданию новых сортов и генотипов.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось разработка метода генетической трансформации отечественных сортов сахарной свеклы. ___

1 ЦЕНТРАЛЬНАЯ" ' НАУЧЧлЛ l -

Для выполнения этой работы решали следующие задачи:

1. Разработать методику регенерации растений сахарной свеклы из различных эксплантов и оценить ре генерационный потенциал некоторых отечественных сортов.

2. Исследовать присутствие в экссудатах сахарной свеклы специфических сигнальных молекул, индуцирующих контролируемый vir- генами процессинг агробактериальной Т-ДНК. Определить сорта и экспланты сахарной свеклы с высокой vir• индуцирующей активностью.

3. Разработать методику генетической трансформации сахарной свеклы с помощью агробактериальных векторных систем.

4. Исследовать эффект ассоциативных метилотрофных бактерий Methyhvorus mays на регенерацию и агробактериальную трансформацию сахарной свеклы.

5. Получить трансгенные растения сахарной свеклы, экспрессирующие наряду с селективными маркерными генами также гены, определяющие ценные хозяйственные признаки. Провести молекулярно-генетический анализ трансгенных растений.

Научная новизна работы, В результате проведенных

исследований изучен регенерационный потенциал 4 сортов сахарной свеклы отечественной селекции - Ялтушковская 34, Льговская 52, 1&7р47 и N16. Отобраны сорта с высоким регенерационными характеристиками Исследуемые сорта сахарной свеклы проанализированы на присутствие у них сигнальных соединений, индуцирующих процессинг агробактериальной Т-ДНК. Определены сорта и экспланты с высокой индуцирующей активностью. Разработана методика колонизации метилобактериями Methylovorus mays растений, культивируемых in vitro. Установлено. что колонизация метилобактериями увеличивает эффективность к частоту регенерации сахарной свеклы. Применение методики колонизации в системе агробактериальной трансформации сокращает сроки культивирования и увеличивает частоту трансформации.

Проведено молекулярное клонирование гена антимикробного пептида цекропина PI в растительный вектор pGA482 под контроль 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Полученные плазм ида перенесены в штаммы агробактерий А281 и GV3101, Получень трансгенные растения сахарной свеклы, содержащие маркерный ген nptll ген bar устойчивости к гербициду фосфинотрицину (BASTA) i трансгенные растения, содержащие ген антимикробного пептндг цекропина PI. Проведен молекулярно-генетический анализ трансгенныэ растений.

Практическое значение работы. Разработанная система

трансформации может быть использована для переноса в геном сахарной

свеклы чужеродных генов, определяющих хозяйстве н но-цен н ые признаки, а также способствует проведению фу нда метальных исследований по генетике и биохимии этой культуры,, что открывает перспективы по созданию ее новых сортов и генотипов. Комбинированное использование бактериальной колонизации и агробактсриальной трансформации сошет основу для новых технологий культивирования растений in vitro.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на 111 и V конференциях молодых ученых (Пущино. 1998, 2(ЮI)ч на III. IV, V чтениях, посвященных памяти академика Ю,А. Овчинникова (Пущино. 1997, 1998. 2000). на II Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва. 2000), на VII Международной конференции «ht vi ira Plant Cell Biology, Biotechnology and Gennplasm Preservation» (Москва. 1997) и на Международной конференции «Molecular Mechanisms of Stress Responses in Plants» (Москва. 1998).

Структура » объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литераторы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на -ИЦ страницах машинописного текста, содержит 26 рисунка и 11 таблиц

Библиография содержит 228 источника, из которых зарубежной литературы I9.V

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования.

В исследованиях использовали 4 сорта сахарной свеклы (Beia vulgaris L.) отечественной селекции. Исходные стерильные растения получали из семян.

Питательные среды.

В работе использовали среды Мурасиге Скуга (Murasliige a. Skoog, 1962) и среду WPM (Lloyd a McCown. 1981 ). Регенерация растений сахарной свеклы.

В качестве эксплантов использовали различные части растений и проростков, которые культивировали на чашках Петри, содержащих 25 мл агаризованной питательной среды для регенерации, дополненной регуляторами роста. Культивирование проводили при интенсивности освещения 2000 люкс, температуре 25'С и фотопериоде 16 ч. В экспериментах учитывали два показателя - эффективность регенерации и чис-tq побегов на один регенерирующий эксплант. Эффективность регенерации определяли в процентах как отношение эксплантов,

регенерировавших побеги, к общему числу культивируемых экашигов В работе использовали стандартные методы статистической обработка (Лакнн. 11>1)0>, Биологической параллелью (повториостью) служили оди; чашка Петр» с 21» эксплантамн В таблицах представлены средин», арифметические и н\ стандартные отклонения из 5-7 опытов по -1 биологических повтори остей в каждом (п = 2-28). Ко.ншп jaiiiiH м е г i l i<)6 актер и и м 11.

В работе использован штамм нспигментированных мстилобактернг MethyUmmix mays L. ВКМ В - 2221 (Доронина. 2000). Выращивание бактерии проводили в течение суток при .47"С в срсдс К (Доронина. 1099 с метанолом до оптической плотности 1.5 (600 нм>- Семена v растительные экспланты обрабатывали I сут бактериально!» культурой i переносили на чашки Петри, содержащие питательные среды. Всхожесть семян оценивали через I нед культивирования как процент проросши> семян от общего числа семян, принятых та 100%. Бактериальные штаммы.

Для осуществления генетической трансформации экспланты свскль и но кул иро вал н различными агробактериальными штаммами:

- Agrobacterium tumefaciens штамм L В A44(U( р AL4404, pGA482) векторная плазм та которого pGA482 <Ап.. 1986) содержит reí неомнцинфосфотрансферазы (¡iptfí), экспрессируемый в растительны> клетках и придающий растениям устойчивость к антибиотику канампцнну.

- .J. tumefaciens штамм 3101(pMP90RK). векторная плазм нда которогс pGA482-35S-cec- содержит ген антибактериального пептида цекропищ PI (eeePI).

- .4, tumefaciens штамм A281(pTiBo542, pGA482-35S-cec) с гено\ цекропина Р1,

- .4. tumefaciens штамм GV3101(pMP90RK. pRK290), векторная плазмид; которого pRK290 содержит целевой ген bar, экспрессируемый i растениях и придающий растениям устойчивость к гербицид; фосфннотрицнну (BASTA).

-Л. tumefaciens С58, A. rhizogenes А4.

Для колонизации использовали штаммы метилобактерий:

- Methylovoiis mays ВШ В-2221

Methylovous mays ВКМ В-222! .содержа щий плазм иду рВХ 121 несущую селективный маркер устойчивости к канамицину. Агробактерии вьфащивали в течение ночи при 28°С на жидкой среде LB Метилобактерии выращивали при 37 °С на жидкой среде К.

Выделение плазмид и гнбрндшацмонный анализ,

Плазмидную ДНК выделяли по методу Бирнбойна и Доли (Bimboin a. Doly, 1979). Гидролиз ДНК рестриктазами проводили согласж

рекомендациям поставщиков, Стандартные методики но клонщювамшо фрашентш ДНК it плачмклных векторах детально описаны (Маниат lit н др.. llJH4). I Ic pet mc плазмид в агроСкктсрнм и мстилобактсрии осуществляли методом коныогацин (Van Haute el al.. 1'Ш: Kiilioii 1MX4) Плачмпдныс ДНК в l\.co/i идентифицировали. выделяя в небольших количествах и 'тем проводили гибридичацию на фильтрах по Саучерну (Маниатнс и др.. 1УК4). Суммарную растительную ДНК сахарной свеклы выделяли с использованием набора «Genomic DNA Purification Kit» (MB) Fermentas, Вильнюс). Меченный чонд для гибридизации на фильтрах по Саучерну получали нспольчуя набор «Mullipriitic DNA labelling systems» (Anierskim. Англия). Перенос ДНК на нейлоновую мембрану Hybond (Amcrsliani) проводили согласно рекомендациям фирмы изготовителя. Гибридизацию на фильтрах вели по методу Саучсрна. опнеанному (Маниатнс и др., 1984),

Эксперименты но трансформации проводили методом культивирования эксплантов с суспензионной культурой агробактернй. Частоту трансформации определяли в процентах как отношение числа побегов, регенерировавших из эксплантов на селекционной среде, к общему числу имеющихся эксплантов.

И »локирование нроцсссннга агробактернй Т-ДНК экссудатами сахарной cneicii.i.

В работе применяли метод «спасения плачмид» (Koukolikova-Nicola ct al.. 1985), основанный на использовании модифицированной Ti-плазм иды pGV3850 (Zambryski et al., 1983), содержащую между правой и девой границами бактериальный плазмидный вектор pBR322. Индуцирование процессии га Т-ДНК в модифицированной Ti-плазм ндс pGV385() прослеживается по вырезанию из нее низкомолекулярного фрагмента ДНК. в состав которого входит плачмида pBR.322.

Aiiajim растений-трансфер мантов и контрольных растений проводили несколькими методами; по росту в селективных условиях на средах, содержащих канамицин или фосфинотрицин (BASTA); Присутствие встроенных генов ир!И, bar, сесР) определяли с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР); Кроме того, экспрессию встроенного гена nptll определяли радиометрическим методом (Draper el al., 1988) по активности фермента нсомицинфосфотрансферазы II (NPT II), для определения эспрессии гена cecPl использовали метод биологического тестирования белковых эстрактов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОКСУЖДКНШ;

I. Ра1|)аГ«ика мснмон I шо ичсскон (рансфорчанмн с.пиртш скикмм {Не}а сн/дч/т

1.1. Изучение индукпнн нронсссиша Т-ДНК ¡и р<Ляк1С|»ий 110.1 лейсчиисм жссудапн» сахарном с не к. 11.1

Индуцирование процессинга Т-ДНК экссудатами сахарной свеклы в модифицированной Т1 плачмиде рОпрослеживали по вырезанию из нее низкомолекллярного фрагмента ДНК. в состав которого входит плачмида рВГ(122 Этот процесс тестировали различными методами

В первом методе проводили транс<1юрмацию клеток /;.с«/< тотальной агробактернальной ДНК и отбор трансформантов по селективному маркерному признаку плазмиды рВЮ22 - устойчивости к антибиотику ампициллину.

Во втором методе исполыовали б лот-гибр и д та цио н н ы и а нал и; тотальной а гроба ктср иа л ьн о й ДНК с помошью плазмиды рВЮ22 в качестве гибридизационного зонда, Сравнение эф^ктивности индукции процсссннга Т-ДНК экссудатами сахарной свсклы проводили по отношению к активности ЮОмкМ ацетосирингона (А51 Результаты трансформации клеток П.соИ НВ101 тотальной ДНК агробактерий. подвергнуты* воздействию экссудатов различных эксплантов сахарной свсклы, представлены в таблице I.

Все проаиадизоваиные нами экспланты характеризовались индуцирующей активностью, но в разной степени. Экссудаты черешковых эксплантов листьев проявляли более высокую индуцирующую активность по сравнению с другими эксплактами. Экссудаты растении проявляли также и сортовые особенности активности сигнальных индуцирующих соединений. Например, экссудаты черешковых эксплантов листьев сорта Ялтушковская 34 в несколько раз превосходили по активности экссудаты сорта 187р47, Результаты рестрикционного и гибр нд изацион н о го анализа ДНК трансформированных клеток Е.соН подтверждают присутствие в трансформантах различных молекулярных форм плазм ты рВЮ22 (рис. 1).

Таблица 1

Данные, по индукции г/г-области Тнплагмшш рСУ3850 экссудатами рашых органов растений сахарной свеклы*_

Факторы количество Трансформанты

индукции трансформантов Е.соН Е.саИ,% от варианта

с ацетосирингоном

Б с* индукции 0 0

Ацстосириигон 560 ± 30 100

(Аз)

Ялтшковская 34

Листья 10 + 0.5 2

Гипокотили 350+ 17 60

Черешки 470 ± 15 84

187р47

листья 10 ±0.5 2

гипокотили 22 ± 0.5 4

черешки 30 ± 0.5 5

Льговская 52

Листья 100 ±2 • 18

Гипокотили 150 ±5 26

Черешки 220 ±5 39

N16

Листья 94 ±3 .15

Гипокотили 115 ±4 20

Черешки 145 ±4 23

* Приведены средние арифметические значения и их стандартные ошибки.

А 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11A j 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

А Б

Рис. ]. Электрофорез плазм идя ой ДНК траисформантов Е.соН (А) и Слот- гнбр нднзацня по Саузерну с ДНК плат иды рВМ22 (Б). А - ДНК фага X, гидролизованиая жцонуклеазой ЕсоИ; нлтивная ДНК плшмнды р!Ш322; 2-П-плазмидные ДНК, выделенные из клонов клеток Е.со!I, трансформированных тотальной ДНК из индуцированнмх экссудатами растений или ацетосирингоном агробактерий С38С1(рОУ3850).

Нахождение в трансформированных клетках Е.соИ второй форМы плазмиды с более высоким молекулярным весом можно объяснить димерюацией модифицированных ДНК/рВК322. Днмерную природу ДНК подтверждают результаты ее расщепления рестрнкционными эндонуклеазами ЕсоШ, ВатН! и Нш(Ш1, приводящего к появлению мономерной формы ДНК рЕШ22 (Рис. 2). Прямой блот-гибридизационный анализ тотальной ДНК агробактерий тоже свидетельствует о присутствии в экссудатах сахарной свеклы сигнальных молекул, индуцирующих вырезание агробактериальной Т-ДНК (Рис. 3).

Рис.2 Рестрикционяын анализ плазмидной ДНК трансформантов В. coli. 1 - 4 - Гидролиз плазм иди ой ДНК клона Е. coli, трансформированного ДИК pBR322, Гидролиз эндонуклеазами EcoRI (1), Hindu) (2), BatnHl (3), без гидролиза (4); 5-3 Гидролиз плазмидной ДИК клона Е, coli, трансформированного тотальной ДНК агробактерий. Гидролиз эндонуклеазами: EcoRI (5), HindlH (6) и BamHI (7); без гидролиза (8); Маркер-ДНК фага X гндролизованного эндонуклеазой EcoRI (9).

"Ж.

ЯВ Рис. 3 Блот-гибридизацня тотальной ДНК

; агробактерни С58СЦрСУ3850).

индуцированных экссудатами сахарной свсклы, Дорожки: I- индукция экссудатами АН) —-i.St.ii.ii. черешков сахарной свсклы; 2 - без н иду к ци и; 1- индукция ацстосирингоном. ЩР 4 -индукция экссудатами листьев сорта

187р47.

1.2. Влияние содержания фитогормонов на эффективность регенерации побегов

В экспериментах по изучению влияния разных концентраций 6-бент ила мн но пурина (БАЛ), побегообразование наблюдали для всех исследуемых сортов сахарной свеклы только при использовании в качестве эксплантов листовых черешков (табл. 2), При этом происходила прямая регенерация побегов без стадии предварительного каллусообрззования. При использовании в качестве эксплантов листовых дисков побегообразование отсутствовало.

Среда А. содержащая 0.3 мг/л БАП и 0,2 мг/л гибберелловон кислоты (ГК), оказалась наиболее эффективной для всех исследуемых сортов. На этой среде максимальную эффективность регенерации проявлял сорт Льговская 52 (78 %), минимальную сорт N16 (34%) (табл.2). Индукцию каллуса наблюдали у всех эксплантов исследуемых генотипов на среде МС с 2мг/л БАЛ или 2.2мг/л тидиазурона (ТДЗ). На среде \VPK1 с 1мг/л БАП и 0.1 мг/л ннолилуксусной кислоты (ИУК) у одного из исследуемых нами сортов сахарной свеклы N16 удалось получить стабильну ю регенерацию побегов

Таблица 2.

Влняние содержания БАП в питательной среде А ни частоту регенерации побегов ш черешковых экепдантов (% от общего числа эксплантов*!

Сорт Концентрация 6-БАП в среде А**. мг/л

0 1 0.3 0.5 0,8 1.0

Яттушков- 12 ± 1 4S + 0 36 ± 0 30 ± 1 24 ±0

СКЛЯ .44

N16 Л ±0 34 ± 1 28 ± 1 22 ±1 19 ±1

187р47 2 ± 0 54+1 50 ± 1 38 ± 1 28 ± 1

Льгов-

ская 52 0 78 ± 1 60 ± 1 42 ± 1 40 ± 1

Приведены средние арифметические Hit грех биологических повтори остей и их стандартные отклонения. *' Среда Л - среда МС. содержащая 0.2 мг'л гибйерелловой кислоты

1.3 Генетическая трансформация сахарной свеклы

В настоящее время известны единичные работы по трансформации сахарной свеклы, в основном, это работы зарубежных авторов, которые выполнены на уровне трансформированных протопластов или после регенерации морфогенного каллуса. Существующие методы дают низкую частоту трансформации. Для сахарной свеклы отечественных сортов необходимо определить оптимальные условия агробактернальной трансформации и последующей регенерации трансформантов. Известно, что дикие агробактериальные штаммы более вирулентны, поэтому работу по определению эффективности трансформации сахарной свеклы мы начали с использования диких агробактериальных штаммов. 1.3.1. Неопластическая трансформация сахарной свеклы дикими штаммами агробактерий

Корончатые галлы и бородчатые корни получали методом культивации эксплднтов с агробактернями, а также методом агробаетериальной инокуляции стеблей целых проростков. В качестве эксплантов использовали черещки листьев, гипокотили и стебли. При трансформации дикими штаммами Л. Ште/ааепв С58 и А. rhizogenes А4 были получены корончатые галлы и бородчатые корни на всех взятых эксплантах. Следует отметить высокую эффективность трансформации сахарной свеклы этими штаммами. Так эффективность трансформации штаммом А. гите/аЫепь С58 сорта Льговская 52 составляла 89%, а иггамм А. гк1ю§епез А4 трансформировал сахарную свеклу сорта 187р47 с эффективностью 50,2%. Несколько независимых линий и корневых

культур были проанализированы на нолалинсинтазную активность и присутствие атропина. Все анализируемые ткани показали наличие соответствующих опинов и активностей, что подтверждает транс генную природу полученных галлов и корней.

1,3.2 IV пеги четкая трансформации сахарной свеклы агробактерналыми нектоцион системой, солсржащсй i cii щяII.

Для трансформации использовали различные агробактсриальныс штаммы, содержащие бинарный вектор pGA4X2, несущий ген npill,

КОДИруЮЩИН НСОМИЦИН<|ЮСфОТранСфСраЗу II. ЭффСКТИВНОСТЬ

трансформации сахарной свсклы зависела от а гроба ктср h;li ьно й индукции \>¡r~ функции ацетосирингоном. генотипа растений и штамма агробактсрий. Трансгенная природа растений сахарной свсклы сортов Ялтушковская 34 и Льговская 52 была подтверждена методом ПЦР.

На рис. 4 представлена элсктрофореграмма амплификации ДНК исследуемых образцов с праймерами для гена npiU, Размер образующихся в результате амплификации фрагментов ДНК (И00 пар нуклеотидов), соответствовал полному размеру гена лр! Ц.

1234 5 678

26,2

9Я 3,0

2 А ' 22 ' 1,2 -

0,9 "

Рис. 4. ПЦР-анализ ДНК сахарной свеклы с использованием прайм еров к гену прШ. Дорожки: 1 - маркерные фрагменты ДНК фага ХУМ1и I; 2 - ДНК нетрансформнрованного растения сорта Ялтушковская 34; 3, 7 - ДНК двух трансформированных линий сорта Ялтушковская 34; 4, 8 - ДНК двух трансформированных линий сорта Льговская 52; 5, 9 - ДНК двух трансформированных растений сорта 187р47; б - контрольная ДНК агробактерий ЬВА4404 (рАЬ4404, рвА 482).

fi трансформированных растениях сахарной свеклы обнаружена активность NPTII, На радиоавтограф (рис 5) представлены рсзулыаш определения noti активиоати.

1 2 3 4 5

Рис.5, Определение активности неомицинфосфотрансферазы II Дорожки: I - экстракт in контрольного нетрасформированного растения сахарной свеклы, сорт Ялтушковская 34, 2- бес клеточный экстракт штамма /1. tume/aaenx LBA4404 (PAL 4404. pGA4X2). экспрессируюшего ген npt //; 3, 4, 5 - экстракты из растений сахарной свеклы, сортов Ялтушковская 34. Льговская 52. сорт IК7р47. трансформированных штаммом Л, tumefaciens LB А4404 (PAL4404 pGA4K2),

Рсг^лшия побегов in трансформированных черешков листьев сахаргйй свеклы проведена на селективной среде, содержащей 50 яг/л Km. На этой среде через 2-3 недели наблюдалось побегообразование. Следует отметить, что. хотя концентрация канамицина. практически полностью ингибирующая рост побегов сахарной свеклы, достигала НЮ мг/л, мы проводили селекцию трансформантов при вдвое меньшей его концентрации. Это было вызвано тем, что у растений, подвергаемых сильному стрессу при росте на среде с антибиотиками, ДНК подвергается гиперметилированию. Метилирование регулятор ных областей генов растений выключает их экспрессию (Meyer et al„ 1994). а изменение общей картины метилирования ДНК влияет на морфолого-физиологический тип растений (Buryanov et al„ 1995; Finncgan cl al, 1996: Шевчу к с соавт.,2001). Поэтому селекция трансгснных растений на среде с умеренными концентрациями канамицина снижает стрессовую нагрузку и, следовательно, понижает вероятность "замолкания" чужеродных генов. С этой же целью трансгенныс побеги сахарной свеклы укореняли на среде, содержащей пониженную по отношению к среде побегообразования концентрацию канамицина (25мг/д).

2. Влияние метнлобактерий Methylovorus mays на эффективность регенерации н рост сахарной свеклы.

Эксперименты по изучению влияния метнлобактерий на регенерацию эксплантов сахарной свеклы показали, что регенерация побегов у колонизированных эксплантов происходило более интенсивно по сравнению с деколонизированными (контрольными) эксплантами (Табл. 3).

Таблица 3

Влияние колонизации метилобактериями на регенерацию побегов из черешковых эксплантов сахарной свеклы in vitro (% от общего числа эксплантов).

Сорт Без колонизации Колонизация

Ялтушковская 34 48 ±0 79 ± 1

187р47 54 ±1 67 ± 1

Льговская 52 78 ±1 83 ±2

N16 34 ±1 '56+1

Примечание. Приведены средние арифметические' величины из трех биологически* повторностей н их стандартные отклонения.

Тестирование сегментов листьев регенерантов ■ на присутствие метнлобактерий выявило стабильную ассоциацию метилотрофных бактерий с растениями, культивируемыми in vitro. Анализ показал их наличие как во всех исходно колонизированных эсплантах, так и в регенерантах сахарной свеклы, после нескольких пассажей культивирования культивирования in vitro. Содержание метнлобактерий на еденицу листовой поверхности составило 1 х 103 - 3. х 103 колониеобразующих единиц на 1 см2. Таким образом, колонизация метилобактериями сахарной свеклы, растущей in vitro приводит установлению стабильной ассоциации между этими бактериями и растениями.

При колонизации черенков растений метилобактериями наблюдали более интенсивный рост этих растений по сравнению с контрольными. При культивировании колонизированных растений на обедненной среде МС без витаминов, эффект положительного влияния метил »бактерий был наиболее заметен. Коэффициент размножения возрастал почти в два раза, причем наблюдали интенсивное корнеобразование, тогда как у

контрольных растений наблюдалось замедление скорости роста, уменьшение образования корней или их отсутствие. Получены данные о биосинтезе метилобактериями не только цитокининов и ауксинов (Иванова с соавт., 2000, 2001). а также витиминов и полисахаридов (Доронина, 2000). Положительное влияние метилобактерий на рост и морфогенез растений, вероятно, является результатом их комплексного метаболического воздействия.

2.1 Получение транстшых растений, экспрессирующнх ген bar.

Стимулирующий эффект колонизации метилобактериями растений сахарной свеклы на ее рост и морфогенез указывает на возможность включения этого приема в методы ее генетической трансформации. Мы исследовали влияние метнлобактериальной колонизации растений сахарной свеклы на эффективность их трансформации. Для агробактериальной трансформации использовали растения сахарной свеклы сорта Ялтушковская 34, предварительно колонизированные штаммом Kiethylovorus mays ВКМ В-2221. В качестве эксплантов брали черешки листьев сахарной свеклы как колонизированных, так и неколонизированных растений (контроль). Трансформацию проводили клетами Agrobactehurn tumefaciens pGV3101 с бинарным вектором pRK290, содержащим ген bar, кодирующий фермент фосфинотрицннацетилтрансферазу (РРТ). Этот фермент ацетилирует аминогруппу гербицида фосфинотрицина (BASTA) и тем самым обеспечивает его инактивацию. Через 48 час после обработки агробакгериями экспланты растений (опыт и контроль) переносили на среды для регенерации, содержащие антибиотик цефатоксим (250мг/я) и гербицид BASTA (20мг/л). Гербицидоустойчивые побеги сахарной свеклы отбирали по регенерации зеленых побегов. При использовании эксплантов колонизированных растений наблюдали повышенну ю в 3 раза эффективность регенерации побегов по сравнен то с неколонизированными растениями. Эффективность трансформации колонизированных эксплантов составляла 6-8% от общего числа регенерантов. Анализ ДНК растений методом ПЦР показал присутствие фрагмента гена bar в геноме клонов, обладающих устойчивостью к РРТ (Рис. 6).

Рис, 6. ПЦР анализ регснерантов сахарной свелы с использованием праймеров к rem bar.

Дорожки. -I. 9-Маркерные фрагменты ДНК pUC19/Msph 2-ДНК плазм иды pRK.290 (контроль+), 3-7-линии трансгенных растений. 8-ДНК ^трансформированного растения (контроль-)

Колонизированные мстилобастериями трансгенные растения быстрее образовывали корни и легче адаптировались к условиям in vivo. После переноса в почву отобранных в условиях in vitro устойчивых к гербициду растений сахарной свеклы их листья обрабатывали препаратом BASTA, в концентрации 1. 3. 10 и 20 мг/л Листья трансгенных растений выдержали обработку гербицидом в концентрации 10 мг/л, тогда как . нетрансфор миро ванные растения погибали уже при обработке гербицидом в концентрации 1 мг/л.

Создание конструкций с геном антимикробного пептида

цекропина Р1

Перенос генов антибактериальных пептцдов в растения служит одной из стратегий усиления их сопротивляемости различным микробным инфекциям. Высокая антибактериальная активность позволяет им выполнять функцию неспецифической иммунной системы. Проведенные исследования подтвердили перспективность использования таких пептидов в трансгенных растениях для повышения их устойчивости к патогенным микроорганизмам (Sharma et al., 2000; Ohsliiina el al.. 1999).

В нашей работе мы клонировали ген цекропина Р1 под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и перенесли его в растения сахарной свеклы. В качестве источника гена была использована плазмида рЕТ 2Id, содержащая синтетический ген цекропина PI (любезно предоставленную сотрудником Института Белка РАН J.X.H. А. Т. Гудковым). Пептид цекропин Р1 состоит из 3! аминокислотного остатка. Ген цекропина Р1 был заново синтезирован при помощи ПЦР с целью получения на концах гена удобных сайтов для

клонирования в векторы для трансформации растении Для леи цели были синтезированы праймеры к сайтам ВашН1 и В^Ш. Синтезированная конструкция с геном цекропнна Р1 имела размер 104 п.н. Схема, клонирования представлена на рис.7. Векторную плазм иду р[*Т103 расщепляли 1ЪВашН1 и смешивали с В^111-ВатН1 фрагментом гена цекропнна Р1 в соотношении 1:5. обрабатывали ДНК лнгачон фага Т4 в течение 12 ч при 14°С и смесью трансформировали клетки Н.соИ НВ КН. которые выссвали на среды с ампициллином. Выросшие клоны проверяли на наличие вставки методом гибридизации на чашках с геном цекропнна Р1 в качестве зонда. В результате анализа было обнаружено 4 клона с полож1гтсльным сигналом. Ориентацию клонированного фрагмента в рекомбинантных плашидах определяли по результатам совместного гидролиза рсстрнктазлми ВатНЬХЬл!. В случае встраивания В&Ш-ВатН1 фрагмента под промотор 355 в прямой ориентации выщеплялся фрагмент размером 104 п.н.. что соответствует полноразмерному гену цекропнна Р1.

. Дтя переноса клонированного гена цскропннаР! в бинарный вектор рСА 482. полученную плазм иду рйТ 103-ссс гидролнзовали ЯНикЛИ. вырезали кассету сес-ЗЗБ. выделяли из агарозы фрагмент 800 п.н. и липфовали его с ДНК плазмиды рвА 482, также гидрол изо ванной И-НшШН. Рекомбинантная плазм ид а. обозначенная как рОА482-355-ссс, в результате пиролиза дата два фрагмента: один по подвижности соответствовал линейной форме рйА482. другой - НтсИП-фрагменту плазмиды рЯТЮЗ-сес. размером 800п.н

Полученную конструкцию рСА482-355-сес. содержащую ген цекропнна Р1 и селективный маркерный ген неомицинфосфотрансфсразы П переносили методом коньюгащш в клетки Л^гоЬас!епит ¡ите/ааепь рСУ3101(рМР90КК) и А281(р"ПВо542) для последующей трансформации ими растений сахарной свеклы.

Гл-трм п ] кк тлкМт.^.лкПШШГМЛ!^^!!1!* ;шшю ас1(1$

«у'П

104 по.

ВшН

важн1 Веш

7

ВангШ

сестарт

ДНК-яиц»

Шя*Ш

СаМУЗЗЗ

ро1уА

К. ШИП

К.№гШ

ьв

«мш

ВмШ

т

сесгорш

СаМУ35£

ро(уА

Ямип . прШ

КВ

Рис. 7. Схема конструирования плазмид для трансформации растений, содержащих ген цекропнна Р1.

3.1. Перенос конструкций с геном антимикробного нентнда цекропнна Р1 ш клеток агробактернй рСУЗЮ! и А281 в растении сахарной свеклы

Полученную конструкцию рвА 482-3 55-сес-иеобходимо было перенести в клетки растений сахарной свеклы сорта Льговская 52, Агробактер иаль кую трансформацию колонизированных

метилобактернями эксплантов сахарной свеклы сорта Льговская 52 проводили генетической конструкцией рвА 482-358-сес. Регенераты, выросшие на селективных средах с канамицином и цефатоксимом, через два месяца переносили на среды, содержащие только селективный антибиотик канамицин и колонизировали штаммом метилобактерий, устойчивым к канамицину. Колонизация трансформированных эксплантов канамицикустойчивым штаммом метилобактерий приводит к дальнейшему повышению выхода трансгенных побегов на 2-3%, что составило 8-10% от общего числа регенерантов. Полученные

|р;шсф(>рмаи1кг «ы.ш подвергн\ты \ю.1ск> лярно-биолог ическомч анализ)

ПЦР-анализ показал присутствие фрагмента 1сна искропи на Р1 в кноме полученных клонов сахарной свеклы ( И)4 п н ) (рис X)

Рис.К. ПЦР анализ ДНК регенерантов с использованием праимеров к гену искрои и на (Ю4 п н.) Р1 Дорожки: I - Маркерные фрагменты ДНК плазмиды рЕЖ322/М\аГ; 2 -Маркерные фрагменты ДНК фага /./НтШП: 1 - ДНК плазмиды рСА482-355 ссс (контроль+); 4-6 - растительная ДНК линий сахарной свеклы, трансформированных конструкцией рСА4Х2-Ч55 ссс; 7 - растительная ДНК сахарной свеклы (контроль -)

Для определения экспрессии гена цекропина Р! в растениях сахарной свеклы использовали метод биологического тестирования (Парашина. 19У9). Для этого, полученные из листьев трансгснных и контрольных растений неочищенные белковые экстракты, добавляли к растущей культуре бактерий с известным титром, затем через 24 час по подсчету выросших колоний на чашках определяли степень ингибирования роста бактерий. При добавлении белковых экстрактов трансгенных растений к культуре бактерий рост бактерий замедлялся в 45 раз по сравнению с их ростом без экстракта. Экстракты из нетрансгенных растений проявляли некоторую антибактериальную активность, что связано с наличием в растениях собственных защитных пептидов (ВгагкЫасИсгсО!,, 1996).

Разработанная в настоящей работе технология генетической трансформации сахарной свеклы может найти применение в проведении фундаментальных и прикладных исследований по генетике и физиологии этой культуры. Полученные трансгенные растения различных отечественных сортов сахарной свеклы, экс пресс ирующие гены устойчивости к героицнду фосфинотрицину и ген антимикробного

12 3 4 5 6 7

пептида цекропина PI, уже нашли применение в селекционно-

гснстичсской работе во Всероссийском НИИ сахарной свеклы и сахара.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика регенерации нескольких сортов растений сахарной свеклы отечественной селекции. Установлено, что оптимальным эксплантом для регенерации целых растений являются черешки сахарной свеклы.

2. В экссудатах различных тканей сахарной свеклы исследовано присутствие специфических сигнальных молекул, индуцирующих процессинг агробактсриальной Т-ДНК. Максимальное содержание сигнальных молекул обнаружено в экссудатах черешков листьев сахарной свеклы.

3. Разработана методика генетической трансформации отечественных сортов сахарной свеклы с помощью агробактериальных векторных систем.

4. Колонизация сахарной свеклы ассоциативными метилобактериями повышает регенерационный потенциал растений и эффективность их генетической трансформации.

5. Созданы векторные конструкции с геном антимикробного пептида цекропинаР1.

6. Получены трансгенные растения сахарной свеклы, экспрессируюшие селективный маркерный ген прШ, ген устойчивости к гербициду фосфинотрицину bar и ген антимикробного пептида цекропина Р1. Проведен мо леку лярно-€ио логический анализ полученных трансгенных растений.

Список работ, 011 убд икоп an 11 ых tio теме диссертации.

1. Buryanov Ya, I.. Zacl\archenko N. S.. Shevchuk Т. V.. Bogdarina I. G. EfTcct of the M.EcoRJI inclhy I transferase - encoding gene on the plicnotypc of Nicoliana tabacum transgenic cells. // Gene, 1995, V, 157, P. 28.1-287,

2. Zacharchcnko N. S„ Buryanov Ya. I. Regeneration and genetic transformation of sugar beet (Beta vulgaris L). t! VII Int. Conf. « In vitro Plant Cell Biology, Biotechnology and Germplasm Preservation». Nov. 25-28. Moscow, Russia, 1997, C.259.

3. Каляева M.A., Захарченко H. С.. Бурьянов Я,И, Индуцирование процсссинга агробаетериалькой Т-ДНК экссудатами однодольных растений. // III чтения, посвященные памяти академика Ю. А. Овчинникова, 19-20 ноября, 1997. Москва-Пущино, С.26,

4. Buryanov Ya.I., Velikov V.A,, Zakharchenko N.S., Kalyaeva M.A. Peculiarities Of Agrobacterium Ti-plasmid transfer to plant and bacterial cells. // Int. Symp. «Molecular Mechanisms of Stress Responses in Plants». Oct. 28-1. 1998, Moscow, Russia. С. 110.

5. Захарченко H.C., Бурьянов Я,И, Генетическая трансформация сахарной свеклы {Beta vulgaris h.). Н Int Symp, «Molecular Mechanisms of Stress Responses in Plants», Oct 28-1, 1998. Moscow, Russia. P. 162

6. Рукавцова E. Б., Алексеева В. В., Золова О. Э., Поройко В. А., Захарченко Н. С„ Шевчук Т. В„ Темиров Ю. В., Бурьянов Я, И. Получение транс генных растений для фундаментальных и прикладных исследований. 1} IV чтения, посвященные памяти академика Ю. А. Овчинникова, 2-12 ноября, 1998, Москва-Пущино, С. 71

7. Тупикин С, И„ Захарченко Н. С„ Бурьянов Я, И. Влияние 5-

азацктидина на эффективность регенерации сахарной свеклы {Beta vulgaris L,), И III Конференция молодых ученых города Пущиио, 2730 апреля, 1998. Пущино, Россия, С. 178.

8. Захарченко Н.С., Каляева М.А., Бурьянов Я.И. Индуцирование процсссинга агробактериальной Т-ДНК экссудатами однодольных растений. // Физиология растений, 1999, Т, 46, №2, Р, 321-330.

9. Захарченко Н. С., Каляева М. А,, Иванова Е. Г., Бурьянов Я. И. Стимулирующее влияние метилотрофных бактерий на трансформацию растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и льна-долгунца (Liпит usitatissimum L.}. !l II Международная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве н ветеринарии», Москва, 18-19 октября. 2000. С. 191-193.

10. Захарченко Н.С.. Каляева М.А, Доронина Н.В., Рукавцова Е.Б., Алексеева В.В., Иванова Е.Г„ Троценко Ю.А. Бурьянов Я.И Изучение эффектов колонизации растений метклотрофными бактериями. И V чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова. «Бноорганика -2000», 13-20 ноября, 2000. Москва-Пущиио. С.93.

11. Захарченко Н.С.. Каляева М.А.", Бурьянов Я.И. Техника генетической трансформации различных сортов сахарной свеклы. // Физиология растений, 2000, Т,47. №1, С.79-85.

12. Каляева М.А., Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Способность . однодольных растений индуцировать процессинг агробакгериалъной

Т-ДНК. И Физиология и биохимия культурных растений, 2000, Т. 32. N3. С.209-218.

13. Каляева М. А.. Захарченко Н. С.. Доронина Н. В., Рукавцова Е. Б., Иванова Е. Г.. Алексеева В. В.. Троценко Ю. А.. Бурьянов Я. И. Стиму ляция роста и морфогенеза растений in vitro ассоциативными метклотрофными бактериями. // Физиология растений. 2001. Т. 48. N4. С. 595-599.

14. Кытманова М.В., Захарченко КС.. Мартемьянов К.А.. Гудков А.Т. Конструирование рекомбинангной плазмиды для трансформации растений, содержащей ген антибактериального пептида цекропина PL // V Конференция молодых ученых, Пущино. 16-20 апреля, 2001. С. 82. '

15. Шевчук Т.В.. Захарченко Н.С., Дьяченко 0!В., Бурьянов Я.И. Влияние

гена метилтрансферазы EcoRII на фенотип трансгенных опухолевых линий Nicotiana, tabacum н уровень метилирования последовательностей в их геноме. // Физиология растений. 2001. Т. 48. №4. С. 94-98.

Научное издание

Автореферат Н. С. Злхарчеико .

Налоговая льгота - общероссийски ¡i классификатор продукции ОК-О05-93, том 2; 953000 - книг» и брошюры

. 11.09.2001 г.' Заказ Э213Р. Тираж 100 экз. Усл. псч. л. 1,0.

Отпечатано с оригинала^ макета в Отделе научио-техиичоскон информации Путинского научного центра РАН

142290 г.Пушнно Московской обл., проспект Науки. 3, ОНТИ ПНЦ РАН.