Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение регенерационной и трансформационной компетентности сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и создание трансгенных растений, устойчивых к гербициду Баста

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение регенерационной и трансформационной компетентности сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и создание трансгенных растений, устойчивых к гербициду Баста"

На правах рукописи

МИШУТКИНА Яна Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ РЕГЕНЕРАЦИОННОЙ И ТРАНСФОРМАЦИОННОЙ КОМПЕТЕНТНОСТИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (Beta vulgaris L ) И СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ГЕРБИЦИДУ БАСТА

Специальность 00 03 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003159G9G

МОСКВА-2007

003159696

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии растений Центра «Биоинженерия» РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Александр Константинович Гапоненко

Доктор биологических наук, зав лабораторией генетики культивируемых клеток Института физиологии растений им К А Тимирязева РАН Юлия Ивановна Долгих

Доктор сельскохозяйственных наук, профессор, зав. отделом биотехнологии ГНУ Всероссийского селекционно - технологического института садоводства и питомниководства Россельхозакадемии Валерий Александрович Высоцкий

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится " / " 2007 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 220.043 10 при РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, Тимирязевская ул, 49 Ученый совет РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

Автореферат разослан » /•¿¿ф?2007 года, и размещен на сайте

Университета www.timacad.ru

Ученый секретарь' диссертационного совета кандидат биологических наук У '/ Г И Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Сахарная свекла (Beta vulgaris L ) - важнейшая техническая культура, являющаяся сырьем для производства 35-40% сахара в мире В Российской Федерации это традиционный и основной отечественный источник получения сахара Ежегодно в РФ эту культуру высевают на площади около 1 млн га Однако за последние 15 лет произошло снижение урожайности и, как следствие, уменьшение производства сахара из сахарной свеклы и увеличение использования в качестве сырья импортного сахара-сырца (более 50%) Сложившаяся ситуация объясняется целым рядом экономических и агротехнических причин низкой эффективностью борьбы с патогенными микроорганизмами, сорняками и насекомыми-вредителями, отсутствием сортов и гибридов сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам, абиотическим и биотическим стрессам

Основная причина расходов при возделывании сахарной свеклы (более половины всех затрат) - это борьба с сорной растительностью Потери от сорняков в среднем составляют 25-30% урожая и более

Методы генной инженерии позволяют получать растения сахарной свеклы, несущие гетерологичные гены, что может значительно улучшать агротехнические свойства данной культуры

Первые трансгенные растения сахарной свеклы были получены в 1990 году (Lmdsey К, Gallois Р, 1990) Однако создание трансгенных линий до сих пор под силу только крупным международным биотехнологическим компаниям, инвестирующим большие средства в изучение молекулярно-генетических основ данного процесса Существует ряд факторов, ограничивающих эффективность генетической трансформации этой культуры Прежде всего, регенерация и трансформация сахарной свеклы является в значительной степени генотип-зависимым процессом К тому же большинство опубликованных работ по трансформации выполнены на сортах и гибридах иностранной селекции Все сказанное выше показывает необходимость разработки систем регенерации и генетической трансформации сортов и гибридов отечественной селекции с целью создания растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам

Цели и задачи исследования. Целью наших исследований являлось изучение регенерационной и трансформационной компетентности сортов и линий сахарной свеклы (Beta vulgaris L ) отечественной селекции и создание трансгенных растений/линий, экспрессирующих ген bar, определяющий резистентность к гербициду сплошного действия Баста (Либерти) Дальнейшее включение таких растений в селекционный процесс приведет к созданию гербицид-устойчивых сортов и гибридов

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи

1 Определить для каждого из исследуемых генотипов оптимальную комбинацию ростовых регуляторов и тип эксплантата с целью получения регенерации побегов in vitro с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации

2 Оптимизировать параметры проведения агробактериальной трансформации сахарной свеклы, используя для оценки системы транзиентной экспрессии маркерных генов

3 Разработать методику негативной селекции трансгенных клеток сахарной свеклы in vitro, основанную на устойчивости к фосфинотрицину (действующему веществу гербицида Баста), определяемую экспрессией гена bar

4 Получить трансгенные растения сахарной свеклы, несущие ген bar, обуславливающий устойчивость к гербициду Баста, и определить наличие экспрессии данного гена

5 Оценить устойчивость полученных трансгенных линий к действию гербицида Баста

Научная новизна. Разработан эффективный способ прямой регенерации побегов из семядольных узлов (достигнутая частота регенерации составила, в зависимости от генотипа, 35-61%) На основе этого способа регенерации разработана оригинальная система генетической трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens

Показано, что наиболее эффективным способом регенерации побегов in vitro для сахарной свеклы является прямое образование побегов из многоклеточных эксплантов При использовании данного способа частота побегообразования составила 35-97% (в зависимости от генотипа и типа экспланта), в то время как при регенерации через каллус 10-17,1%

Разработана эффективная система микроклонального размножения побегов, позволяющая получать более 500 клонов от одного растения сахарной свеклы за 2,5 месяца

Разработана система негативной селекции ш vitro трансгенных клеток, устойчивых к фосфинотрицину, позволяющая избежать возникновения химерных побегов среди первичных трансформантов

Практическая значимость полученных результатов. Полученные трансгенные линии сахарной свеклы российской селекции, устойчивые к гербициду Баста, являются ценным исходным материалом для селекционной работы

Разработанные системы регенерации и трансформации могут быть применены для получения трансгенных растений сахарной свеклы с другими хозяйственно-ценными генами

Разработанный способ микроклонального размножения сахарной свеклы может быть использован для оздоровления растений от вирусов, для сохранения и быстрого размножения ценного исходного материала, для скрининга генотипов сахарной свеклы на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам, в качестве источника эксплантатов для генетической трансформации и как способ «расхимеривания» (получения однородных по введенному гену растений после генетической трансформации многоклеточных эксплантов)

Разработанная схема селекционного процесса с трансгенной составляющей представляет практический интерес для современного свекловодства в РФ, поскольку создание трансгенных гибридов сахарной свеклы на основе ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивых к гербицидам, позволит не только снизить потери урожая и увеличить долю отечественного сырья на российских сахарных заводах, но и минимизировать возможный риск распространения трансгенной пыльцы на другие сорта и линии, а также близкородственные виды

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2-ой научной конференция Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы современной генетики» (Москва, 2003), на XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико- • химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), на Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, 2005), на Четвертом Московском международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ состояние и перспективы развития» (Москва, 2007)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 статьи и патент РФ на изобретение

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы

Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 36 рисунков и 145 библиографических ссылок '

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Растительный материал В работе были использованы сорта и линии сахарной свеклы отечественной селекции, широко районированные на территории Российской Федерации «Льговская односемянная 52», «Рамонская односемянная 47», «Черноземец», «РМС73», «Русь», «ЛБО 17» и «ЛБО 19» (ЛБО 17, ЛБО 19 являются родительскими линиями гибрида «СуперArpo») Среды. Растительный материал культивировался на питательных средах,

содержащих MS макро и микросоли (Murash:ge & Skoog, 1962), В5 витамины (Uamborg, 1970), углеводы, фитогормоны и регуляторы роста. Для селективных сред использовали цефатокейм (500 мг/л) и фоефинотрицин (РРТ) в различных концентрациях.

Регенерация н м и к рокл он ал ь но е размножение побегов in vitro.

Экепланты получали из асептических проростков, выращенных в культуре in vitro. Па компетентность к регенерации побегов тестировали четыре типа экеплантов: сегменты гипокотиля, семядоли, семядольные узлы и черешки листьев. Из сегментов гипокотиля и семядолей индуцировали морфогенный каллус, затем регенерировали побеги. Семядольные узлы и черешки листа использовали для прямой индукции побегообразования. Частоту регенерации проростков определяли как соотношение полученных побегов-регенерантов к общему числу экеплантов, высаженных на среду для регенерации.

Бактериальные штаммы и плазм иды. 13 работе использовали супервирулентную линию ГИД105 (Hood Y... i993), содержащую векторные Конструкции pNRGFPBAR (Равина П.В.), pVec035 (Becker D., 1990, Vaneanneyl G, 1990), pBAR (ПадегимаС Л.С., 1993, Грибова Т.Н.,, 2005):

Схема кассеты экспрессии pNRGFPBAR:

P-NOS ч~ \OS I 35S

NOS-T

Схема кассеты экспрессии pVec035:

- Äa—4

P-NOS ' 35S

Nos-T ■ [;■■ , ■

■ NOS-T

—

Схема кассеты экспрессии pBAR: _ _

35S Ч-' 1 MOS-T

Молекулярный_анализ. Интеграцию гетерологичных

последовательностей в геном сахарной свеклы определяли методом ПЦР. Оценку экспрессии маркерного гена gfp проводили с использованием стереомикроскопа с флуоресцентным модулем. Гистохимическое определение активности гена ni с/А (gits) проводили по методике S. Vitha (2003) с использованием 5-бром-4-хлор-3-индолилглюкуронида (X-Gluc). Наличие :этепрссеим гена bar ^ ф осфии отри ци и-ацетил-транс фераза ФАТ) определяли е помощью Trait LL Laser al Flow Test Kit (Strategic Diagnostics Inc.). Для проведения Саузерп ©лот-гибридизации (Southern, 1975) использовали N ем «флуоресцентную метку CDP-SVw Detection Module (Amersham Biosciences). Секвенировайие было проведено (группой Кузнецова Б.Ь.) по метолу Сэнгера (Sanger et.al., 1977).

Анализ устойчивости трансгенных линий к действию гербицида Баста. В условиях оранжереи листья анализируемых растений обрабатывали раствором гербицида Баста из расчета 3, 6 или 9 л/га Оценку степени повреждения листа проводили через 10 дней после обработки Ограниченные полевые испытания проводили на сертифицированном участке ВНИИФ (г Голицыно, Московская обл) Обработку посевов проводили гербицидом Баста из расчета 3 л/га Через 10 дней после обработки гербицидом производили оценку степени повреждения контрольных и трансгенных растений

Статистическая обработка экспериментальных данных. Полученные результаты экспериментов были обработаны с помощью стандартных методов статистического анализа

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Наличие эффективной и воспроизводимой системы регенерации побегов из каллусных культур или прямой регенерацией из меристемных зон является необходимым условием для получения трансгенных растений Нами проведена серия экспериментов для получения регенерации побегов in vitro с частотой, подходящей для разработки способа генетической трансформации сахарной свеклы

1. Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на частоту регенерации растений сахарной свеклы т vitro.

Индукция каллуса и регенерация растений при культивировании изолированных тканей in vitro зависит, прежде всего, от взаимодействия таких факторов, как генотип исследуемого объекта, состав питательной среды и тип экспланта Для определения типа экспланта наиболее подходящего для трансформации использовали 4 типа эксплантов компетентных к регенерации побегов двумя способами 1-ый способ - регенерация побегов из каллуса, полученного из сегментов гипокотиля или семядолей, 2-ой - прямая регенерация из черешков листа или семядольных узлов Для каждого типа экспланта и каждого из исследуемых генотипов определяли оптимальную комбинацию ростовых регуляторов с целью получения набольшей частоты регенерации побегов in vitro

1 1 Индукция образования морфогенного каллуса из сегментов гипокотилей. Для индукции каллусообразования использовали три индукционные среды, различающиеся содержанием фитогормонов и углеводов №1 (БАП (6-бензиламинопурин) 0,5 мг/л, НУК 0,1 мг/л, глюкоза 1%, фруктоза 1%, сахароза 1%), №2 (БАП 0,5 мг/л, НУК 0,1 мг/л, сахароза 3%), № 3 (БАП 0,5

мг/л, сахароза 3%) В процессе культивирования эксплантов на всех исследуемых средах отмечалось образование каллуса двух типов морфогенного (компетентного к регенерации растений) и неморфогенного Была показана зависимость частоты индукции каллусообразования из сегментов гипокотиля от состава индуцирующей питательной среды и генотипа (табл 1).

Таблица 1. Влияние состава питательной среды и генотипа на частоту индукции морфогенного каллуса из сегментов гипокотиля_

Генотип Среда № 1 Среда № 2 Среда № 3

Кол-во гипокотилей, шт Кол-во гипокотилей с морфогенным каллусом, шт Частота образования морфогенного каллуса, % Кол-во гипокотилей, шт Кол-во гипокотилей с морфогенным каллусом, шт Частота образования морфогенного каллуса, % Кол-во гипокотилей, шт Кол-во гипокотилей с морфогенным 1 каллусом, шт | Частота образования | морфогенного 1 каллуса, %

Льговская одн 52 120 24 20,00 ± 2,31 120 41 34,2 ± 5,87, 120 31 25,83 ± 5,39

Рамонская одн 47 150 29 19,33 ± 3,91 150 59 39,33 ± 2,91 150 37 24,67 ± 5,18

Черноземец 130 30 23,08 ± 3,92 130 42 32,31 ± 1,26 130 17 13,07 ± 2,51

РМС 73 140 55 39,28 ± 3,69 140 62 44,29 ± 4,30 140 60 42,86 ± 3,09

Русь 120 42 33,33 ± 2,67 120 46 38,33 ± 2,11 120 43 35,83 ± 2,64

ЛБО 17 130 15 11,53 ± 4,18 130 31 23,85 ± 2,65 130 45 34,61 ± 2,71

ЛБО 19 130 21 16,15 ± 3,34 130 37 28,46.± 3,-60 130 32 24,61 ± 3,45

Образование морфогенного каллуса происходило с частотой от 11,5% до 39,3% на среде № 1, от 23,9% до 44,3% на среде № 2, и от 13,1% до 42,9% на среде № 3 Для генотипов «ЛБО 19», «Рамонская одн 47», «Льговская одн 52» и «Черноземец» наибольшая частота каллусообразования наблюдалась на среде № 2 Интересно, что для генотипов «РМС 73» и «Русь» достоверного изменения частоты образования каллуса в зависимости от состава среды не наблюдалось, а для «ЛБО 17» наибольшая частота каллусообразования (34,6%) отмечалась на среде № 3, содержащей 0,5 мг/л БАЛ

Полученный морфогенный каллус использовался для дальнейшего изучения влияния фитогормонов на частоту регенерации побегов

1.2 Индукция образовании мпрфогенногл каллуса из семядолей, Для

Индукции каллусообразования из семядолей использовали те же индукционные среды, что и для сегментов гнпокотиля. В течение 3 месяцев культивирования образование каллуса не наблюдалось.

1.3 Регенерация побегов из морфогенного каллуса. Известно, что низкие концентрации экзогенной абсцизовой кислоты (АБК) стимулируют морфогенетическую активность культивируемых in vitro клеток.

Нами было проведено исследование влияния экзогенной АБК на регенерацию побегов из морфогенного каллуса с использованием различных концентраций АБК (0,5; 1; 2 и 4 мг/л) в питательной среде. Контрольный вариант среды не содержал АБК (рис. 1).

Рисунок 1. Влияние генотипа и различных концентрации АБК на частоту регенерации побегов из каллуса

во

'3 0.5 1 2 4

концентрация АБК (мг/л)

□ Льгоискня одн 52 epavOHCifap еди 47 □ iff рнс QPMC73 GPyci. ЕЭЛБ017 ОЛБО10

Частота регенерации побегов из морфогенного каллуса

варьировала ог 10% до 51% в зависимости от генотипа и состава среды (рис. 1). Присутствие ЛБК в концентрации от 0,5 до 2 мг/л. вызывало увеличение частоты регенерации побегов из каллуса для всех генотипов. Дальнейшее увеличение концентрации АБК вызывало ее снижение. Для генотипов «Черноземен», «РМС 73», <ЛБО 19» и «ЛБО 17» наибольшая частота образования побегов наблюдалась на средах с концентрацией АБК 0,5 и 1 мг/л, для генотипов «Льговская одн. 52», «Рамонская одн. 47» и «Русь» па средах с концентрацией 1 и 2 мг/л.

1.4 Регенерация побегов из семядольного узла. Нами был разработан оригинальный способ регенерации побегов из области семядольного узла. В

качестве экспланта использовали область семядольного узла длиной 1,5-2 мм, полученной путем отсечения корня и апекса побега с семядолями. Для определения влияния регуляторов роста цитокилипового ряда на частоту ПрЯмОЙ регенерации побегов из данного типа эксплантов использовали среды, содержащие БАП, кинетин и зеатнн в концентрациях 0,25 мг/л, 0,5 мг/л и 1 мг/л. Образование побегов происходило в различных зонах экспланта. Побеги образовывались как в центре, так и но всей окружности семядольного узла в количестве от 2 до 10 штук и более. Точное количество образующихся побег ов не поддавало«® подсчету из-за большой плотности их образования на поверхности экспланта.

Частота прямой регенерации побегов из семядольного узла составила от 9% до 61 % з зависимости от генотипа и состава среды (рис. 2).

Рисунок 2. Влияние различных концентраций кинегина, зеатина и БАП на частоту индукции побегов из семядольного узла

70

_ 60 £

| 50 з

В

а 40

х ф

130

(О

I 20

О п:

т ю

о

1) И II.S HI K0.Z5 КО.5 Kl zo.zs гай

концентрация гормонов (мг/л)

ЕЭЛыивсия ол1.52 в Рамонска* одн. 47 П Черно земец В РМЙ 73 □ Русь ВЛБО! 7

z I

0ЛЁО15

В - 6 бе-пиламинопурин (БАП), К - кипстин, 7. -¡сатин.

Наибольшая частота побегообразовании наблюдалась иа средах, содержащих БАП в концентрации 0,5 мг/л и 1 мг/л. Для генотипов «Льговская одн. 52», «Рамо некая одн. 47» и «Русь» побеги с большей частотой образовывались на среде содержащей 0,5 мг/л БАП. а для линий «Черноземен», «РМС 73», «ЛБО 19», «ЛБО 17» па среде 1 мг/л БАП.

1.5 Микроклональнее размножение. Для изучения компетентности сахарной свеклы к прямой регенерации побегов предполагалось использовать еще один тип экспланта - черешки листьев, В связи с этим возникла потребность в

постоянном получении листового материала С этой целью был разработан эффективный способ микроклонального размножения in vitro Семена проращивали на среде с ингибитором транспорта ауксинов - 2,3,5-трийодбензойной кислотой (ТИБК) и БАП (1 мг/л) для индукции образования пазушных почек Затем у проростков отсекали корешок с нижней частью гипокотиля и верхнюю часть проростка переносили на питательную среду, содержащую БАП (0,25 мг/л) для развития розетки листьев Образующиеся листья с почками разделяли и культивировали независимо для продолжения цикла микроклонального размножения В результате за 2,5 месяца нами было получено более 500 клонов сахарной свеклы, каждый из которых содержал розетку из 20-50 листьев

Полученные таким способом клоны можно непрерывно поддерживать в культуре in vitro, что позволяет значительно сократить сроки получения материала для культивирования за счет исключения стадии проращивания и образования листьев (20-40 дней)

1.6 Регенерация побегов из черешков листьев. На основе специфической морфологии микроклонов сахарной свеклы был оптимизирован способ получения эксплантов, показавших высокую компетентность к регенерации побегов Лист от микроклона отсекали таким образом, чтобы вместе с черешком оставалась область побега длинной 3-5 мм Листовую пластинку удаляли Для индукции регенерации побегов была использована среда содержащая БАП (0,5 мг/л) и НУК (0,1 мг/л) Побеги образовывались в основании черешка в количестве 1-3 шт, кроме того, было обнаружено явление множественного образования побегов вдоль жилки черешка и в местах срезов Частота регенерации побегов составила от 73% для сорта «Рамонской одн 47» и до 97% для линий «Русь» и «ЛБО 19» (табл 2)

Таблица 2 Влияние генотипа на частоту регенерации побегов из черешков листа

Количество черешков, шт Количество черешков с побегами, шт Частота регенерации, %

Льговская одн 52 200 163 81,50 ±4,22

Рамонская одн 47 200 146 73,00 ±6,06

Черноземец 200 172 86,00 ±3,77

РМС 73 200 185 92,50 ± 1,90

Русь 200 194 97,00 ±2,01

ЛБО 17 200 167 83,50 ±2,09

ЛБО 19 200 194 97,00 ± 2,56

Таким образом, было показано, что использованные в исследовании сорта и

линии сахарной свеклы достоверно различались компетентностью к регенерации побегов в культуре in vitro в зависимости от генотипа, типа экспланга и состава питательной среды.

Как известно, оптимальным объектом для получения грансгениых, нсхимерных растений являются протопласты и клетки каллуса, т.к. дают возможность получать растения-регенеранты из единичных трансформированных клеток. Наши исследования показали* что для сахарной свеклы частота регенерации побегов из каллуса у всех исследованных генотипов мала, а сам процесс является трудоемким и длительным. Нам не удалось получить образование каллуса из семядолей. Для гипокотилей наибольшая частота каллусообразования достигала 28,5-44,3%, а регенерация проростков из каллуса составила 29-51%. Таким образом, частота регенерации побегов при регенерации через каллус (кол-во полученных побегов/кол-во гипокотилей) составила 10-17,1%, что является малой величиной для поставленной нами цели. Гще одним лимитирующим фактором использования данного способа регенерации для разработки системы трансформации являлся фактор времени. Для получения побегов при культивировании гипокотилей через стадию образования каллуса требовалось 5-12 месяцев.

Для всех исследованных генотипов сахарной свеклы наиболее высокая частота побегообразования наблюдалась при прямой регенерации побегов (рис. 3).

Рисунок 3. Влияние генотипа и типа жепланта на частоту регенерации побегов* сахарной свеклы in vitro

í Льговская Рамомекая Черноземец РМС 73 Русь ЛБО17 ЛШ19

| ra»,í2 олн. 47 Виз ссмянолсй

J Dm гипокотилей (каттусообр х регенерация побегов из каллуса)

% ■ to семялольных узлок

з б из черешков листа

*- указана наибольшая частота регенерации побегов, не учитывая состав среды.

Частота регенерации побегов, в зависимости от генотипа, составила 7397% из черешков листа и 35-61 % из семядольных узлов. Кроме того, на данных экс л л антах наблюдалось множественное побегообразование. Время получения

побегов-регенерантов составило от 10 до 30 дней

Полученные результаты позволяют заключить, что для сахарной свеклы наиболее оптимальным способом регенерации является прямая регенерация побегов из многоклеточных эксплантов Для дальнейшей работы по оптимизации параметров трансформации нами были выбраны 2 типа эксплантов - семядольный узел и черешок листа

2. Определение оптимальных параметров агробактериальной трансформации сахарной свеклы на основе транзиентной экспрессии маркеных генов

Для подбора оптимальных параметров агробактериальной трансформации сахарной свеклы бычи использованы векторы экспрессии, содержащие репортерные гены gfp и uidA (gusj Конструкция pNRGFPBAR содержала селективный ген bar и gfp и мы планировали совместить селективный отбор на фосфинотрицине (РРТ) с визуальной оценкой экспрессии гена gfp Однако нами была выявлена высокая автофлюоресценция клеток сахарной свеклы, что делало невозможным использование гена gfp для оптимизации параметров трансформации

Были оптимизированы следующие параметры проведения агробактериальной трансформации 1) влияние времени от момента поранения экспланта до сокультивации с агробактерией (прекультивация эксплантов), 2) время сокультивации в жидкой среде, 3) время сокультивации на твердой среде (табл 3) Оценку наличия/отсутствия экспрессии маркерного гена проводили на следующие сутки после окончания сокультивации

Таблица 3. Влияние времени прекультивации и сокультивации в жидкой и на твердых средах на частоту транзиентной экспрессии uidA (gus)

Прекультивац ия эксплантов Время сокультивац ИИ в жидкой среде, мин. Время сокультивации на твердой среде, суток Кол-во экспл , шт Кол-во экспл с экспрессией gus, шт. Частота транзиент экспрессии, %

Без прекультивации 30 3 84 29 34,5± 1,90

4 84 29 34,5± 1,90

60 3 84 . 32 38,1±1,92

4 84 34 40,5±3,84

90 3 84 25 29,8±1,90

4 84 зароет агробактерией

Прекультивация 24 часа 30 3 84 41 48,8±3,81

4 84 43 51,2±1,90

60 3 84 50 59,5±3,81

4 84 56 66,7±1,90

90 3 84 47 56,0±1,90

4 84 зароет агробактерией

В результате были определены оптимальные параметры для трансформации эксплантов сахарной свеклы

1) прекультивация эксплантов за 24 часа до трансформации,

2) время сокультивации эксплантов с агробактерией в жидкой среде 60 мин,

3) время сокультивации эксплантов с агробактерией на твердой среде 4 суток

3. Определение оптимальной селективной концентрации фосфинотрицина т vitro

Известно, что эффективность методов генетической трансформации растений зависит от возможности осуществления конечного этапа - получения из клеток и тканей полноценных фертильных нехимерных растений Однако сам процесс трансформации и последующее продолжительное культивирование трансгенных многоклеточных тканей в условиях клеточной селекции значительно снижает морфогенную способность клеток Поиск оптимальной концентрации селективного агента, которая позволит избежать появления «эскейпов» (псевдотрансформантов) и химерных растений и в тоже время не будет отрицательно влиять на последующий морфогенез, является важнейшим этапом получения растений сахарной свеклы

Для трансформации сахарной свеклы была использована конструкция pBAR с геном bar, обеспечивающим устойчивость к фосфинотрицину, действующему веществу гербицида тотального действия Баста Для определения оптимальной селективной концентрации фосфинотрицина было проведено тестирование выживаемости исходных линий in vitro

Экспланты высаживали на среды для регенерации, содержащие различные концентрации селективного агента - РРТ (0,5, 1, 2, 4 и 8 мг/л) Оценку наличия выживших побегов проводили через 4, 8 и 12 недель (рис 4)

Оптимальной рабочей концентрацией фосфинотрицина для последующих экспериментов по трансформации была выбрана 2 мг/л, время селекции 8 недель, тк при данных условиях происходила 100% гибель контрольных (нетрансгенных) побегов

4 Получение трансгенных растений сахарной свеклы с геном bar

Используя полученные результаты, нами была проведена серия экспериментов по трансформации исследуемых генотипов агробактериальным штаммом ЕНА105, несущим вектор pBAR (табл 4)

Побеги, прошедшие селективный отбор, анализировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на наличие гена bar (рис 5) и vzr-reHOB агробактерии Для дальнейших исследований использовали побеги, показавшие

наличие гена bar и отсутствие v/V-генов агробактерии.

Рисунок 4. Выживаемость побегов на средах с различными концентрациями фосфинотришша

4 а

время (недель!культивирования

0,5 мг/л рр1 -А ■ 1 мг/П ppt —>«-2 мг/п ppl

-й M lin ppl - Э Mfin p[A

IÎCPo5- 2,53

Таблица 4. Результаты экспериментов no получению трансгенных

Генотип Кол-во ЭКСПЛ., шт. Кол-во pcicHcpsimiB после селекции, шт. Кол-во трансформа нтов(нодтв. ПЦР), шт. Частота трансфирм ¡щи и, % Кол-во XII мерных растений, шт.

РМС 73 307 10 3 0,97 3

Льговская одн- 52 484 15 5 1,03 5

Рамонская одн. 47 572 21 10 1,74 10

Рисунок S. Электрофоре!ический анализ ПЦР - продукт» побегов прошедших селекцию на фоефниеггрииине

1 2 3 4 5 6 ? В 9 10 11 12 13 14

Г? Ä

__ —т т'. | и.н.

Щ M

1,14 - Маркер длины фрагментов ДНК (1 ООЬр), 2 - Контроль реакции без ДНК, 3 -ПЦР на препарате ДНК рВАЯ, 4-13 - ПЦР на препаратах ДНК сахарной свеклы.

Полученные трапсформанты укореняли и высаживали в оранжерею. После образования 3-4 пар новых листьев каждый лист повторно анализировали е помощью ПЦР на наличие гена bar. В результате анализа было показано, что все 18 растений химерны, т.е. в части листьев подтверждено наличие гена bar, а

I

J

в части листьев ген bar не был детектирован

Таким образом, выбранная нами концентрация селективного агента оказалась недостаточно эффективной, т е часть нетрансгенных клеток и тканей выживала за счет трансгенных, что, по всей видимости, можно объяснить диффузией фермента ФАТ (из трансгенных клеток)

Для снижения вероятности появления химерных растений сахарной свеклы в последующих экспериментах нами были использованы более высокие концентрации селективного агента - РРТ - 4, 8 и 16 мг/л и увеличено время селекции с 8 до 12 недель Исследования проводили на растениях сорта Рамонская одн 47 В результате только при увеличении концентрации селективного агента РРТ до 16 мг/л нам удалось получить нехимерное растение (табл 5), во всех листьях которого был детектирован ген bar

Таблица 5. Результаты экспериментов по получению трансгенных растений сахарной свеклы с геном bar (селекция на 4,8 и 16 мг/л РРТ)

Концентрация селективного агента Кол-во экспл, ШТ. Кол-во регенерантов лосле селекции, шт Кол-во трансформантов (подтв ПЦР), шт Частота трансфер мации, % Кол-во химерных растений, шт.

4 мг/л 848 16 5 0,59 5

8 мг/л 541 8 2 0,37 2

16 мг/л 583 1 1 0,2 0

С использованием данной концентрации селективного агента, была проведена серия экспериментов по получению трансгенных растений с геном bar для других генотипов ЛБО 17, ЛБО 19, Льговской одн 52 и РМС 73 (табл 6)

Таблица 6 Результаты экспериментов по получению трансгенных растений сахарной свеклы с геном bar (селекция на 16 мг/л РРТ)_

Генотип Кол-во экспл., шт Кол-во регенерантов после селекции, шт Кол-во трансформа нтов(подтв ПЦР), шт Частота трансфер мации, % Кол-во химерных растений, шт

РМС 73 354 1 1 0,28 0

Льговская одн 52 421 6 5 1,19 0

ЛБО 17 355 3 3 0,85 0

ЛБО 19 337 1 1 0,30 0

Для уменьшения вероятности появления химерных растений все полученные трансгенные побеги пропускали через систему микроклонального размножения на среде с 16 мг/л РРТ Для этого побеги разделяли на отдельные

листья с черешками и из каждого черешка индуцировали регенерацию побегов Цикл повторяли 3-4 раза Клоны всех полученных трансформантов показали наличие гена bar

Наличие фосфинотрицин-ацетил-трансферазы (продукта гена bar) было показано для всех полученных трансформантов с помощью системы Trait LL Lateral Flow Test Kit, основанной на имунноферментном анализе

Клоны полученных трансгенных линий были протестированы m vitro на устойчивость к концентрациям фосфинотрицина (РРТ), превышающим летальную дозу для контрольных растений в 50, 100 и 200 раз - 100 мг/л, 200 мг/л и 400 мг/л соответственно (табл 7)

Таблица 7. Оценка устойчивости трансгенных линий сахарной свеклы к различным концентрациям фосфинотрицина in vitro_

Генотип № растения Концентрация фосфинотрицина в среде (мг/л)

100 200 400

Рамонская одн 47 Х47 1 +* + +

РМС 73 XV 73 1 + + +/-

Льговская одн 52 XVII 52 1 + + +/-

XVII 52 2 + + +/-

XVII52 3 + + +/-

XVII 52 4 + +/-

XVII 52 5 + + +/-

ЛБО 17 XIII 17 1 + + +/-

XIII17 2 + + +

XIII 17 3 + + +/-

ЛБО 19 XVIII19 1 + +/- +/-

* + растения фенотипически не отличаются от контрольных, ** +/- растения с признаками токсикации (частичные ожоги листьев, замедление роста)

Все линии показали устойчивость к концентрации 100 мг/л РРТ и не отличались от контрольных растений культивированных на среде без фосфинотрицина При культивировании на 200 мг/л РРТ у линий XVII 52 4 и XVIII19 1 наблюдались частичные ожоги листьев и замедление роста, однако все клоны сохраняли жизнеспособность При 400 мг/л подобные признаки регистрировали у всех линий, кроме Х47 1 и XIII17 2 Наши данные свидетельствуют о высокой устойчивости полученных линий (т к даже 2 мг/л фосфинотрицина в среде является летальной концентрацией для контрольных растений), а, следовательно, - о высокой экспрессии гена bar в гемизиготном состоянии

Для определения числа копий гена bar в наиболее устойчивых линиях X 47 1 и XIII17 2 была проведена блот-гибридизация по Саузерну (рис 6)

Результаты проведенного анализа показали, что у линии Х.47 J произошла единичная интеграция гена в растительной геном, а у линии XIII. 17.2 - двойная.

Для растения с единичной вставкой гена (Х.47,1) было проведено секвенирование ранее амгшифицированного фрагмента ДНК (Ьаг-специфичный ПЦР-продукт). Идентичность нуклеотидных последовательностей с

последовательностью гена bar составила 10!) %.

5. Оценка устойчивости трансгенных линий сахарной свеклы к действию гербицида Баста

ЗАКРЫТЫЙ ГРУНТ: На стадии образования 4 - 5 пары листьев, трансгенные и контрольные растения обрабатывали гербицидом Баста из расчета 3 л/га. Оценку степени повреждения листьев производили через 10 дней после обработки (рис, 7 а). Все контрольные растения погибали. Трансгенные растения, обработанные дозой гербицида 3 л/га, не имели признаков повреждений. Далее мы увеличили дозу гербицида в 2 и 3 раза (6 и 9 л/га соответственно)* Обработанные трансгевные растения имели частичные ожоги листьев (рис 7 б), однако даже такие высокие концентрации не вызвали гибели растений, что свидетельствует о высокой экспрессии гена bar даже в гемизиготном состоянии.

ПОЛЕВЫЕ УСЛОВИЯ: Была также проведена оценка устойчивости полученных транегенных линий То к гербициду Баста в полевых условиях. Обработку проводили из расчета 3 л/га. Следует отметить, что обработка гербицидом Баста оказала сильное токсичное действие на контрольные нетрансгенные растения, надземная часть которых полностью погибла в течение 10 дней. На большинство транегенных растений гербицид не оказал сильного токсического действия, хотя листья имели частичные ожоги (рис.7 в).

--

Рисунок 6. Саузерн-блоттннг грансгеиных растений*_ _

I 5(ЮГ)

М - Маркер длины фрагментов ДНК; К -Контрольное растение сахарной свеклы;

47.1 ■ Трансгенная линия Х.47,1

17.2 - Трансгснная линия XIII. 17.2 * — Совмещенное изображение результатов рестрикции (Ec<jRI) геномной ДНК и [2000 . блоттинг-[ гибридизации с фрагментом bar гена

М К 47.1 17.2

н

Щ

I

рансгенные растения

контроль

"йев'

трансгенные растения

контроль

Рисунок 7. ЗАКРЫТЫЙ ГРУНТ: Д. Трансгенные (опыт) и контрольные растения через 10 дней после обработки гербицидом Баста (3 л/га); П. 1 рансгенные (опыт) растения через 10 дней и осле обработки гербицидом Каста (6 и 9 л/га); ПОЛЕВЫЕ УСЛОВИЯ: В. Контрольные и транегенные растения через ¡0 дней после обработки гербицидом Баста (3 Л/га).

6. Схемы оптимизированного селекционного процесса сахарной свеклы е (ранегенной составляющей

Сахарная свекла является перекрестно-опыляемой культурой, поэтому цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) сахарной свеклы как объекта Селекционной работы с трансгенной составляющей. представляет исключительный интерес. Нами была разработана схема для оптимизации селекционного процесса с трансгенной составляющей (рис, 8).

Учитывая возможный риск распространения трансгенной пыльцы (горизонтальный перенос) на близкородственные вилы, конечная транс генная родительская форма в селекционном процессе должна быть стерильной. Однако использовать в качестве исходной для трансформации линию с

цитоплазматической стерильностью (ЦМС) нецелесообразно, так как в таком случае практически невозможно получить семенное потомство от самоопыления и, следовательно, гомозиготу по трансгену. В качестве исходных линий для селекционного процесса предлагается использовать фертильные трансгенные линии со свойствами закрепителей стерильности (линии О-типа).

Рисунок 8. Схема селекционного процесса с трансгенной составляющей

о ЦМС-пиния X С? (ЬагН —ч ^ I * 4 у, С О-тип линия \Садаогтыпение

Трансгенную линию О-типа Т5 скрещивают со стерильным аналогом (ЦМС.-линия). Полученное потомство обрабатывают гербицидом и отбирают устойчивые гомо- и гетерозиготы. Далее проводят серию насыщающих и анализирующих скрещиваний с целью получения гомозиготных (по гену bar) ЦМС-линиЙ. Каждое потомство обрабатывают гербицидом с целью отбора устойчивых к гербициду гомо- и гетерозиготных линий. Параллельно проводят получение гомозиготной по гепу bar О-тип линии путем еомооныления и анализирующих скрещиваний. Для получения семян промышленного гибрида гомозиготную по гену bar ЦМС-линию скрещивают с многосемянным опылителем (МО).

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что наиболее эффективным способом регенерации побегов in vitro для сахарной свеклы является прямой органогенез из многоклеточных

эксплантов При использовании данного способа частота побегообразования составила 35-97% (в зависимости от генотипа и типа экспланта), в то время как при регенерации через каллус 10-17,1%

2 Разработан эффективный способ регенерации побегов из семядольных узлов (частота регенерации составила 35-61%) и на его основе разработана оригинальная система агробактериальной трансформации

3 Разработан эффективный способ микроклонального размножения побегов, позволяющий получать более 500 клонов от одного растения сахарной свеклы за 2,5 месяца На основе использования микроклонов оптимизирован способ регенерации побегов из черешков листа (частота регенерации составила 73-97%)

4 Оптимизированы параметры агробактериальной системы трансформации с использованием супервирулентной линии Agrobacterium tumefaciens ЕНА 105 для отечественных сортов и линий сахарной свеклы прекультивация эксплантов 24 часа, время сокультивации эксплантов с агробактерией в жидкой среде 60 мин, на твердой среде 4 суток

5 Оптимизирована система селекции трансгенных клеток на фосфинотрицине (РРТ), позволяющая избежать возникновения химерных побегов среди первичных трансформантов Условия селекции концентрация РРТ в среде 16 мг/л, время селекции 12 недель Побеги, прошедшие селекцию, пропускают через систему микроклонального размножения на среде с 16 мг/л РРТ Для этого побеги разделяют на отдельные листья с черешками и из каждого черешка индуцируют регенерацию побегов Цикл повторяют 3-4 раза

6 Получены трансгенные растения сахарной свеклы сортов Рамонская односемянная 47, Льговская односемянная 52 и линий РМС 73, ЛБО 17 и ЛБО 19, экепрессирующие ген bar и показана их высокая устойчивость к действию гербицида Баста в условиях от vitro (400 мг/л РРТ), в условиях закрытого грунта (9 л/га) и полевых условиях (3 л/га)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Гапоненко А К, Маркеев А Н, Мишуткина Я В., Фадеев В С Пути и проблемы создания трансгенных растений важнейших сельскохозяйственных культур В книге Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений Краснодар, 2003 С 156-170

2 Мишуткина Я.В., Гапоненко А К Изучение морфогенеза сахарной свеклы в культуре in vitro Вторая научная конференция Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы современной генетики»

Москва, 2003 С 154

3 Gaponenko А К, Mishutkina Y.V. The development of an efficient regeneration and transformation systems for the transgenic sugar beat (Beta vulgaris L) production XVth International Plant Protection Congress, Beijing, China, May 1116,2004 P 704

4 Мишуткина Я.В., Гапоненко А К Определение концентрации фосфинотрицина для селекции т vitro трансгенных растений сахарной свеклы, несущей ген BAR, XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 2005 С 91

5 Гапоненко А К, Скрябин К Г, Мишуткина Я.В. «Способ получения генетически модифицированных растений сахарной свеклы с использованием Agrobacterium tumefaciens», Патент РФ № 2278162 Приоритет от 30 12 2004

6 Мишуткина Я.В., Трухина М С, Гапоненко А К Регенерация сахарной свеклы (Beta vulgaris L) in vitro Международная школа-конференция молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» Москва, 2005 С 194-195

7 Мишуткина Я.В., Гапоненко А К Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на частоту регенерации растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L J in vitro Генетика, 2006, том 42, № 2, с 210-218

8 Трухина М С, Мишуткина Я В, Гапоненко А К Индукция адвентивных побегов сахарной свеклы (Beta vulgaris L) in vitro Студенческая научная конференция им НИ Вавилова «Генетика, Селекция и Биотехнология» Москва, 2006 С 52-53

9 Мишуткина Я.В., Гапоненко А К Влияние абсцизовой кислоты на регенерацию побегов из каллуса сахарной свеклы (Beta vulgaris L) I(IX) Международная конференция молодых ботаников в Санкт-Петербурге Санкт-Петербург, 2006 С 174

10 Мишуткина Я.В. Агробактериальная трансформация сахарной свеклы (Beta vulgaris L) in vitro Материалы четвертого съезда Общества Биотехнологов России им ЮА Овчинникова Пущино, 2006 С 160-162

11 Мишуткина Я.В., Богомолов М А, Федулова Т П, Скрябин К Г Создание нового гибрида сахарной свеклы с участием трансгенной компоненты Четвертый Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ состояние и перспективы развития» Москва, 2007 С 236

12 Мишуткина Я.В., Гапоненко А К, Скрябин К Г Микроклональное размножение сахарной свеклы in vitro Сахарная свекла, 2007 № 7 С 28-29

1,25 печ. л

Зак. 736

Тир 100 экз

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мишуткина, Яна Владимировна

1. СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ.

2. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

• 3. ВВЕДЕНИЕ.

4. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

4.1 Биология и особенности селекции сахарной свеклы {Beta vulgaris L.).

4.2 Основные этапы генетической трансформации и получения генетически модифицированного растения (ГМР).

4.2.1 Культура клеток и морфогенез растений in vitro.

4.2.2 Влияние генотипа растения на компетентность к регенерации in vitro.

4.2.3 Влияние типа и состояния экспланта на морфогенез in vitro.

4 4.2.4 Влияние компонентов питательной среды на морфогенез растений in vitro.

4.2.5 Влияние условий культивирования клеток и тканей на процессы морфогенеза.

4.3 Клональное микроразмножение растений.

4.4 Генетическая трансформация растительных клеток.

4.4.1 Способы генетической трансформации растений.

4.4.2 Молекулярные механизмы и факторы влияющие на агробактериальную трансформацию.

• 4.4.3 Векторные системы на основе Ti-плазмид.

4.4.4 Бактериальные штаммы.

4.4.5 Гены, используемые для трансформации.

4.4.6 Селекция как этап трансформации.

4.5 Сахарная свёкла как объект генно-инженерных манипуляций.

5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1 Растительный материал.

5.2 Методы культивирования сахарной свеклы in vitro.

5.2.1 Состав сред и условия культивирования.

5.2.2 Получение стерильного растительного материала.

5.2.3 Изоляция сегментов гипокотиля и индукция образования каллуса.

5.2.4 Регенерация побегов из морфогенного каллуса.

5.2.5 Изоляция семядолей и индукция образования каллуса.

5.2.6 Индукция образования побегов из семядольных узлов.

5.2.7 Клональное микроразмножение.

5.2.8 Индукция регенерации побегов из черешков листа.

5.2.9 Укоренение побегов и адаптация растений к почвенным условиям.

5.3 Культура агробактерии.

5.3.1 Бактериальные штаммы и плазмиды.

5.3.2 Подготовка агробактериальной культуры к трансформации.

Ф 5.4 Трансформация и селективный отбор растений.

5.4.1 Сокультивация эксплантатов с Agrobacterium tumefaciens.

5.4.2 Определение оптимальной концентрации селективного агента

5.5 Молекулярно-генетический анализ.

5.6 Определение GFP свечения.

5.7 GUS окрашивание.

5.8 Анализ устойчивости трансгенных линий к действию гербицида Баста

5.9 Статистическая обработка данных.

6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

6.1 Получение стерильного растительного материала.

6.2 Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на частоту регенерации побегов in vitro.

6.2.1 Индукция образования каллуса.

6.2.2 Индукция образования каллуса из семядолей.

6.2.3 Регенерация побегов из морфогенного каллуса.

6.2.4 Регенерация побегов из семядольного узла.

6.2.5 Клональное микроразмножение побегов.

6.2.6 Регенерация побегов из черешка листа.

• 6.3 Оптимизация параметров укоренения побегов in vitro и адаптация растений из культуры in vitro к условиям искусственного климата.

6.4 Определение оптимальных параметров агробактериальной трансформации на основе транзиентной экспрессии маркерных генов

6.5 Определение оптимальной селективной концентрации фосфинотрицина in vitro.

6.6 Получение трансгенных растений сахарной свеклы с геном bar.

6.7 Оценка устойчивости трансгенных линий к действию гербицида Баста

6.8 Разработка селекционного процесса с участием трансгенной составляющей.

7. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение регенерационной и трансформационной компетентности сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и создание трансгенных растений, устойчивых к гербициду Баста"

Актуальность проблемы Сахарная свекла (Beta vulgaris L) важнейшая техническая культура, являющаяся сырьем для производства 3540% сахара в мире. В Российской Федерации это традициопный и основной отечественный источник получения сахара. Ежегодно в РФ эту культуру высевают на площади около 1 млн.га. Однако за последние 15 лет произошло снижение урожайности и, как следствие, уменьшение производства сахара из сахарной свеклы и увеличение использования в качестве сырья импортного сахара-сырца (более 50%) (Рисунок 1). Сложившаяся ситуация объясняется целым рядом экономических и агротехнических причин: низкой эффективностью борьбы с патогенными микроорганизмами, сорняками и насекомыми-вредителями; отсутствием сортов и гибридов сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам, абиотическим и биотическим стрессам. Рисунок 1. Данные Росстата по производству сахарной свеклы и сахарапеска. Производство сахарной свеклы в РФ в период с 1970-2005 (млн.т.) 35 30 25 Производство сахара-песка 7000 6000 5000 4000 If ,6 I 3000 2000 1000 2503 3196,6 !3096,7| 2646,4 К 20 1 I 15 10 1990 1995 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2005 Ш из импортного сырья 2006 S из отечественного сырья Более половины всех затрат при возделывании сахарной свеклы приходится на борьбу с сорной растительностью [1]. Засоренность посевов может доходить до 99%, из них 60% в средней и сильной степени [2, 3]. Потери от сорняков в среднем оцениваются в 25-30% от урожая, но реально они могут быть выше [4, 5]. В связи с этим, необходимым условием сохранения урожая является борьба с сорной растительностью. Такими методами по защите культуры от сорняков как севообороты, системы удобрений, механизированная обработка, ручная пронолка и др., невозможно полностью очистить поля от сорняков. Один из основных путей решения данной проблемы является химическая обработка посевов с помош;ью гербицидов. В связи с тем, что сахарная свекла обладает высокой чувствительностью к фитотоксическому эффекту многих гербицидов, обработку нроводят либо большой дозой однократно (до прорастания семян), что негативно сказывается на всхожести семян, либо небольшими дозами несколько раз на стадии прорастания семян (в течение 6 недель). Многократные обработки часто оказывают неблагоприятное воздействие, как на сами проростки, так и на окружающую среду. Методы генной инженерии отрыли возможность вводить в сахарную свеклу гетерологичные гены, улучшаюшие агротехнические свойства данной культуры, которые раннее невозможно было использовать в традиционной селекции. Создание устойчивых к гербицидам сортов и гибридов позволит решить проблему сорных растений, уменьшить время и частоту обработки полей и, тем самым, снизить экологическую нагрузку на окружающую среду [6]. В течение последних 2-х десятилетий с помощью генной инженерии были получены различные сельскохозяйственные виды растений устойчивые к гербицидам, в том числе и сахарная свекла [7, 8]. Однако создание трансгенных линий до сих пор под силу только крупным международным биотехнологическим компаниям, инвестирующим большие средства в изучение молекулярно-генетических основ данного процесса. В настоящее время существует ряд факторов, сильно ограничивающих возможности генетической трансформации этой культуры. Прежде всего, регенерация и трансформация сахарной свеклы является в значительной степени генотипзависимым процессом. К тому же большинство опубликованных работ по трансформации выполнены на сортах и гибридах иностранной селекции. Иностранные гибриды имеют ряд недостатков при выращивании в климатических условиях РФ: неустойчивы к заболеваниям в поле, склонны к загниванию корнеплодов при хранении [9, 10]. Это связано с тем, что сорт любой культуры обладает устойчивостью к патогенным организмам и вызываемым ими болезням для тех условий, в которых он был создан. Почвенно-климатические условия большинства европейских стран, в которых ведется селекция сахарной свеклы, существенно отличается от условий основных зон свеклосеяния Российской Федерации, как по видовому составу почвенной микрофлоры, так и по соотнощению в ней грибов и бактерий, а также по активности патогенных организмов [11]. К тому же гибриды иностранной селекции требуют большего периода вегетации и более высоких температур, чем климатические условия большинства свекловысевающих областей РФ. Данные факторы существенно влияют на заболеваемость иностранных сортов и гибридов. Создание сахарной свеклы устойчивой к гербицидам общего действия на основе сортов и гибридов Российской селекции даст возможность сократить потери урожая и увеличить доли отечественного сырья на российских сахарных заводах. Кроме того, применение гербицид устойчивых гибридов позволить снизить экологическую нагрузку на окружающую среду. В результате этого российская сахарная промышленность сможет постепенно заменить 50% используемого сахара-сырца на отечественное сырье. Все сказанное выше показывает необходимость разработки систем регенерации и генетической трансформации сортов и гибридов отечественной селекции с целью создания растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам. Этой главной цели и посвящена настоящая работа. Цели и задачи исследования. Целью наших исследований являлось изучение регенерационной и трансформационной компетентности сортов и линий сахарной свеклы {Beta vulgaris L.) отечественной селекции и создание трансгенных растений/линий, экспрессирующих ген bar, онределяющий резистентность к гербициду снлошного действия Баста (Либерти), Дальнейшее включение таких растений в селекционный нроцесс нриведет к созданию гербицид-устойчивых сортов и гибридов. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи: 1, Определить для каждого из исследуемых генотипов оптимальную комбинацию ростовых регуляторов и тип эксплантата с целью получения регенерации побегов in vitro с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации, 2, Оптимизировать трансформации сахарной параметры свеклы, проведения используя для агробактериальной оценки системы транзиентной экспрессии маркерных генов, 3, Разработать методику негативной селекции трансгенных клеток сахарной свеклы ш vitro, основанную на устойчивости к фосфинотрицину (действующему веществу гербицида Баста), определяемую экспрессией гена bar. 4, Получить трансгенные растения сахарной свеклы, несущие ген bar, обуславливающий устойчивость к гербициду Баста, и определить наличие экспрессии данного гена, 5, Оценить устойчивость полученных трансгенных линий к действию гербицида Баста, Научная регенерации новизна. из Разработан семядольных эффективный узлов способ прямой частота побегов (достигнутая регенерации составила, в зависимости от генотипа, 35-61%), На основе этого способа регенерации разработана оригинальная система генетической трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens. Показано, что наиболее эффективным способом регенерации побегов ш vitro для сахарной свеклы является прямое образование побегов из многоклеточных эксплантов. При использовании данного способа частота побегообразования составила 35-97% (в зависимости от генотипа и типа экспланта), в то время как при регенерации через каллус 10-17,1%. Разработана эффективная система клонального микроразмножения побегов, позволяющая получать более 500 клонов от одного растения сахарной свеклы за 2,5 месяца. Разработана система негативной селекции in vitro трансгенных клеток, устойчивых к фосфинотрицину, позволяющая избежать возникновения химерных побегов среди первичных трансформантов. Практическая значимость получениых результатов. Полученные трансгенные линии сахарной свеклы российской селекции, устойчивые к гербициду Баста, являются ценным исходным материалом для селекционной работы. Разработанные системы регенерации и трансформации могут быть применены для получения трансгенных растений сахарной свеклы с другими хозяйственно-ценными генами. Разработанный способ клонального микроразмножения сахарной свеклы может быть использовап: для оздоровления растений от вирусов; для сохранения и быстрого размножения ценного исходного материала; для скрининга генотипов сахарной свеклы на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам; в качестве источника эксплантатов для генетической трансформации и как способ «расхимеривания» (получения однородных по введенному гену растений после генетической трансформации многоклеточных эксплантов). Разработанная составляющей схема селекционного процесса с трансгенной представляет практический интерес для современного свекловодства в РФ, поскольку создание трансгенных гибридов сахарной свеклы на основе ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивых к гербицидам, позволит не только снизить потери урожая и увеличить долю отечественного сырья на российских сахарных заводах, но и минимизировать возможный риск распространения трансгенной пыльцы на другие сорта и линии, а также близкородственные виды. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2-ой научной конференция Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы современной генетики» (Москва, 2003); на XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005); на Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, 2005); на Четвертом Московском международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007). СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Гапоненко А.К., Маркеев А. Н,, Мишуткина Я.В., Фадеев B.C. Пути и проблемы создания трансгенных растений важнейших сельскохозяйственных культур, В книге: Трансгенные растения новое направление в биологической защите растений. Краснодар, 2003. 156-170. 2. Мишуткина Я.В., Гапоненко А.К. Изучение морфогенеза сахарной свеклы в культуре in vitro. Вторая научная конференция Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы современной генетики». Москва, 2003. 154. 3. Gaponenko А.К., Mishutkina Y.V. The development of an efficient regeneration and transformation systems for the transgenic sugar beat (Beta vulgaris L) production. XVth International Plant Protection Congress, Beijing, China, May 11-16,2004. P. 704. 4. Мишуткина Я.В., Гапоненко А.К. Определение концентрации фосфинотрицина для селекции in vitro трансгенных растений сахарной свеклы, несущей ген BAR, «Перспективные XVII зимняя молодежная физико-химической научная школа биологии и направления биотехнологии», Москва, 2005. 91. 5. Гапоненко А.К., Скрябин К.Г., Мишуткина Я.В. «Способ получения генетически модифицированных растений сахарной свеклы с использованием Agrobacterium tumefaciens», Патент РФ 2278162. Приоритет от 30,12.2004. 6. Мишуткина Я.В., Трухина М.С., Гапоненко А.К. Регенерация сахарной свеклы {Beta vulgaris L.) in vitro. Международная школа-конференция молодых ученых «Системная биология и биоинженерия». Москва, 2005. 194-195. 7. Мишуткииа Я.В., Гапоненко А.К. Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на частоту регенерации растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) in vitro. Генетика, 2006, том 42, 2, с. 210-218. 8. Трухина М.С., Мишуткииа Я.В., Гапоненко А.К. Индукция адвентивных побегов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) in vitro. Студенческая научная конференция им. П.И. Вавилова «Генетика, Селекция и Биотехнология». Москва, 2006. 52-53. 9. Мишуткииа Я.В., Гапоненко А.К. Влияние абсцизовой кислоты на регенерацию побегов из каллуса сахарной свеклы {Beta vulgaris L.) I(IX) Международная конференция молодых ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург, 2006. 174. 10. Мишуткииа Я.В. Агробактериальная трансформация сахарной свеклы {Beta vulgaris L) in vitro. Материалы четвертого съезда Обш,ества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Пущино, 2006. 160-162. 11. Мишуткина Я.В., Богомолов М.А., Федулова Создание нового гибрида сахарной свеклы с Т.П., Скрябин К.Г. трансгенной конгресс участием компоненты. Четвертый Московский международный «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития». Москва, 2007. 236. 12. Мишуткина Я.В., Ганоненко А.К., Скрябин К.Г. Микроклональное размножение сахарной свеклы in vitro. Сахарная свекла, 2007. 7. С,28-30.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Мишуткина, Яна Владимировна

7. ВЫВОДЫ

Показано, что наиболее эффективным способом регенерации побегов in vitro для сахарной свеклы является прямой органогенез из многоклеточных эксплантов. При использовании данного способа, частота побегообразования составила 35-97% (в зависимости от генотипа и типа экспланта), в то время как при регенерации через каллус 10-17,1%.

Разработан эффективный способ регенерации побегов из семядольных узлов (частота регенерации составила 35-61%) и на его основе разработана оригинальная система агробактериальной трансформации. Разработан эффективный способ клонального микроразмножения побегов, позволяющий получать более 500 клонов от одного растения сахарной свеклы за 2,5 месяца. На основе использования микроразмноженных клонов, оптимизирован способ регенерации побегов из черешков листа (частота регенерации составила 73-97%). Оптимизированы параметры агробактериальной системы трансформации с использованием супервирулентной линии Agrobacterium tumefaciens ЕНА 105 для отечественных сортов и гибридов сахарной свеклы.

Разработана система селекции трансгенных тканей, основанная на устойчивости к фосфинотрицину, позволяющая избежать возникновения химерных побегов среди первичных трансформантов. Получены трансгенные растения сахарной свеклы сортов «Рамонская односемянная 47», «Льговская односемянная 52» и линий «РМС 73», «ЛБО 17» и «ЛБО 19», экспрессирующие ген bar и показана их высокая устойчивость к действию гербицида Баста: в условиях in vitro (400мг/л РРТ), в условиях закрытого грунта (9 л/га) и полевых условиях (3 л/га).

Предложена схема оптимизированного селекционного процесса с трансгенной составляющей, позволяющая минимизировать возможный риск распространения трансгенной пыльцы на другие сорта и линии, а также близкородственные виды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мишуткина, Яна Владимировна, Москва

1. D'Halluin К., Bossut М., Bonne Е., Mazur В., Leemans J. and Botterman J. Transformation of sugarbeet {Beta vulgaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants // Biotechnology. 1992. V. 10. P. 309-314.

2. Mannerlof M., Tuvesson S., Steen P., Tenning P. Transgenic sugar beet tolerant to glyphosate // Euphytica 1997. V. 94. P. 83-91.

3. Балков И .Я. В новых условиях новые решения // Сахарная свекла. 2004. №4.

4. Спичак В.В., Дудкин В.М., Сапронов Н.М. Свеклосахарный комплекс России в 2005 году: некоторые итоги // Сахарная свекла. 2006. № 2. С. 2-5.

5. Апасов И. В., Парфенов A.M., Безлер Н. В. Сортовой состав сахарной свеклы и его влияние на эффективность свеклосахарного производства России // Сахарная свекла. 2004. №1.

6. Сурков Н.А., Турьянский А.В., Хмельницкий А.А., Кондратенко. Свеклопроизводство // Белгород. 2002.-160 с.

7. Мазлумов A.M. Пути увеличения производства сахарной свеклы // Воронежское издательство. 1993.^46 с.

8. Балков И. Я. Селекция сахарной свеклы на гетерозис//М.: Россельхозиздат. 1978.— 167 с

9. Хмельницкий А.А., Жуковский А.С., Черный А.Г., Чурсин А.С. Практикум по свекловодству. Учебное пособие // Белгород, БГСХА. 2004. -82 с.

10. Цыренов В.Ж. Основы биотехнологии: Культивирование изолированных клеток и тканей растений: Учебно-методическое пособие // Улан-Удэ: ВСГТУ, 2003. 58с.

11. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии//М.: Издательский центр «Академия». 2005. 208 с.

12. Ежова Т.А. Генетический контроль тотипотентности растительных клеток в культуре in vitro II Онтогенез. 2003. том 34. № 4. с. 245-252.

13. Stahl Y. and Simon R. Plant stem cell niches // Int. J. Dev. Biol. 2005. V. 49. P 479489.

14. Prem L., Bhalla Mohan B. Singh Molecular control of stem cell maintenance in shoot apical meristem // Plant Cell Rep. 2006. V. 25. P. 249-256.

15. Kut S.A., Evans D.A., Plant regeneration from cultured leaf explants of eight wild tomato species and two related Slanum species // In vitro, 1982. v.l8. p. 583 589.

16. Высоцкий В.А. Регенерационная способность изолированных меристематических верхушек черной смородины и вишни и методы получения из них целых растений // Л.: ВИР, 1978

17. Green С. Е., Phillips R. L., Plant regeneration from tissue cultures of maize // Ibid., 1975. v.15. p.417-421.

18. Sears R.G., Deckard E.L., Tissue culture variability in wheat: callus induction and plant regeneration // Crop Sci., 1982. v.22. p. 546 550.

19. Paterson K.E., Shoot tip culture og Helianthus annuus flowering and development of adventitious and multiple shoots // Am. J. Bot., 1984. v. 71. p.925 931.

20. Kaburu M'ribu, Veilleux K, Effect of genotype, explant, subculture interval and environmental conditions on regeneration of shoots from in vitro monoploids of a diploid potato species // Plant Cell Tissue Organ Culture, 1990. v.23. p. 171 173.

21. Dovzhenko A. Koop HU. Sugarbeet (Beta vulgaris L.): shoot regeneration from callus and callus protoplasts//Planta, 2003. V.217. P. 374-381.

22. Kut S.A., Evans D.A., Plant regeneration from cultured leaf explants of eight wild tomato species and two related Slanum species // In vitro. 1982. V.l 8. P. 583 589.

23. Witrzens В., Scowcord W., Downes R., Larkin P.J., Tissue culture and regeneration from sunflower (H. annuus L.) and interspecific hybrids (H. tuberosus x H. annuus) // Plant Cell Tissue Organ Culture. 1988. V. 13. P. 61 76.

24. Gurel E., Kazan K. Development of an efficient plant regeneration system in sunflower (H. annuus L.) // Tr. J. Botany. 1998. V. 22. P. 381-387.

25. Paterson K.E., Douglas, The role of ethylene in the regeneration of H. annuus (sunflower) plants from callus // Physiol. Plant. 1987. V. 71 P. 151 156.

26. Paterson K.E., Shoot tip culture og Helianthus annuus flowering and development of adventitious and multiple shoots // Am. J. Bot. 1984. V. 71. P. 925 931.

27. Tetu T, Sangwan RS and Sangwan-Norreel BS Hormonal control of organogenesis and somatic embryogenesis in Beta vulgaris callus//J Exp Bot Vol 1987. V. 38 (188). P. 506-517.

28. Алексеева JI. И. Оптимизация условий для морфогенеза картофеля в стерильной культуре В кн. Биология культивируемых клеток и биотехнология//Тез докл. Международной конференции, Новосибирск, 1988. с. 158- 159.

29. Никитина Н.И., Федоренко Т. С. Бороков А.Ю. Кульура неоплодотворенных семяпочек подсолнечника // НТБ ВНИИМК. № 3 (106), 1989. С. 14 16.

30. Антонова Т. С., Боровков А. Ю., Зезуль Т.Г., Краснянский С. Прямой соматический эмбриогенез из семядолей зрелых и незрелых зародышей подсолнечника// НТБ ВНИИМК, вып. 4 (103), 1988. С. 16 -21.

31. Evans D.A.Sharp W.R., Flick С.Е. Growth and behavior of cell cultures. Embryogenesis and organogenesis // In: Plant Tissue Culture: Methods and Applications in Agriculture, Ed. Thorpe Т., Academic Press, New York. 1981. P.45 -113.

32. Williams E. G., Maheswarwn G. Somatic embryogenesis: Factors influencing coordinated behavior of cells as an embryogenic group // Ann. Bot. 1986. V. 57. P. 443-462.

33. Wernicke, W., Brettell, R., Somatic embryogenesis from Sorghum bicolor leaves//Nature. 1980. V. 287. P. 138-139.

34. Gamburg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and defection of glucanases in cultures of wheat and barley // Canad. J. Biochem. 1968. v. 46. N 5. p. 417-421.

35. Nitsch J.P., Nitsch C. Science. 1969. V. 163. P. 85-87.

36. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P.473-497.

37. Gamborg O. The effects of amino acid and ammonium on the growth of plant cells in suspension cultures // Plant Physiol. 1970. V. 45. P. 372-375

38. Медведев С.С. Физиология растений: Учебник. СПб.: Изд-во С.-Петерб. Унта. 2004.-336 с.

39. Холодова В.П. Рост и метаболизм углеводов в культуре ткани растений. В кн: Культура клеток растений. М.: Наука, 1981.

40. Физиология растений: Учебник для студ. вузов / Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф. и др.; Под ред. Ермакова И.П. М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 640 с.

41. Чайлахян М.Х. Гормональная регуляция роста и развития высших растений // Успехи современной биологии. 1982. Т. 95. Вып. 1.

42. Полевой В.В. Фитогормоны. JI.: Изд-во Ленингр. ун-та. 1982. с 248.

43. Кулаева О.Н., Прокопцева О.С. Новейшие достижения в изучении механизма действия фитогормонов//Биохимия. 2004. №69. С. 293-310.

44. Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир, 1985. с.304.

45. Skoog F., Miller С.О. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro // Symp. Soc. Exp. Biol. 1957. V. II, P.l 18-131.

46. Arnold S Von, Hakman I Regulation of somatic embryo development in Picea abies by abscisic acid (ABA) // J Plant Physiol. 1988. V. 132. P. 164-169

47. Langhansova L., Konradova H., Vanek T. Polyethylene glycol and abscisic acid improve maturation and regeneration of Panax ginseng somatic embryos // Plant Cell Rep. 2004. V. 22. P. 725-730.

48. Linossier L, Veisseire P, Cailloux F, Coudret A Effects of abscisic acid and high concentrations of PEG on Hevea brasiliensis somatic embryos development // Plant Sci. 1997. V. 124. P. 183-191

49. Moghaddam B.E., Masbah M., Yavari N. The effect of in planta TIBA and proline treatment on somatic embryogenesis of sugar beet (Beta vulgaris L.) // Euphytica. 2000. V. 112. P. 151-156.

50. Катаева H.B., Аветисов B.A. Клональное размножение растений в культуре ткани. В кн: Культура клеток растений. М.: Наука, 1981.-168 с.

51. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве//Пер. с болг. Е.В. Дененко. Отв. Ред. Шумный В.К., Новосибирск, 1993. -241 с.

52. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение растений // IV всесоюзная конференция «Культура клеток растений и биотехнология». Кишинев, 1983.

53. Kamm, L. Liao, S. Kim, C. Hendrick, Z.-Y. Zhao, M. Dolan, F. Chumley, S. V. Tingey, J.-F. Tomb, M. P. Gordon, M. V. Olson, and E. W. Nester. The genome of the natural genetic engineer Agrobacterium tumefaciens C58//Science. 2001. V. 294. P.2317-2323.

54. Potrikus I. Gene transfer to plants: assesment of published approaches and results // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V. 42. P. 205-225.

55. Lindsey K. Plant transformation systems // Transgenic plants: a production system for industrial and pharmaceutical proteins. Edited by M.R.L. Owen and J. Pen. 1996.

56. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир. 2002. - 589 с.

57. Gelvin S.B. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. 51:223-56

58. Gelvin S.B. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool //Microbiology and molecular biology reviews. Mar. 2003. P. 16-37

59. Tzfira Т. T. and Citovsky V. Agrobacterium-mediated -genetic transformation of plants: biology and biotechnology // Current Opinion in Biotechnologyology. 2006. 17:147-154

60. McCullen C.A., Binns A.N. Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2006. 22:101-27

61. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. Саратов. Издательство «Слово». 2001. 256 с.

62. Citovsky, V., Zupan J., Warnick D., and Zambryski P. Nuclear localization of Agrobacterium VirE2 protein in plant cells // Science. 1992. V. 256. P. 1802-1805.

63. Dumas, F., M. Duckely, P. Pelczar, P. Van Gelder, and B. Hohn. An Agrobacterium VirE2 channel for transferred-DNA transport into plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 485-490.

64. Escudero J., Hohn B, Transfer and integration of T-DNA without cell injury in the host plant //The Plant Cell. 1997. V. 9. P. 2135-2142

65. Chumakov M.I., Kurbanova I.V. Localization of protein VirBl involved in contact formation during conjugation among Agrobacterium cells // FEMS Microbiol. Letters. 1998. V. 168. P.297-301.

66. Graves A.C.F., Goldman S.L. The transformation of Zea mays seedlings with Agrobacterium tumefaciens П Plant Molec. Biol. 1986. V. 7. P. 43-50.

67. Feldman K.A., Marks M.D. Agrobacterium-mediaXed transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non-tissue culture approach // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 208. P. 1-9.

68. Пухальский B.A., Смирнов С.П., Корыстылева T.B., Билинская Е.Н., Елисеева А.А. Генетическая трансформация пшеницы (Triticum aestivum L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens II Генетика. 1996. Т. 32. № 11. С. 1596-1600.

69. Гапоненко А.К. Способ получения трансгенных растений подсолнечника. Патент РФ № 2179187.2002.

70. Bidney D., Scelonge С., Martich J., Burrus M., Sims L., Huffman G. Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens // Plant Molecular Biology. 1992. V. 18. P. 301-313.

71. Bechtold N., Ellis J., Pelletier G. C.R. // Acad. Sci. Paris Life Sci. 1993. V. 316. P. 1194-1199.

72. Майсурян A.H., Овчинникова B.H., Долгих Ю.И., Степанова А.Ю., Терешонок Д.В., Мартиросян Ю.Ц., Харченко П.Н. Агробактериальная трансформация ячменя // Биотехнология. 2006. №3. С. 56-61.

73. Hellens R., Mullineaux P., Klee H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors October // Trends in Plant Science 2000. V. 5. №. 10.

74. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D. fi-glucuronidase from Escherichia coli as a genefiision marker // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. V. 83. P. 8447-8451.

75. Shimoura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and proporties of Aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromeduson, Aequorea // J. Cell Сотр. Physiol. 1962. V. 59. P. 223-239.

76. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., Cormier M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein // Gene. 1992. V. 111. P. 229-233.

77. Chalfie M., Tu Y„ Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science 1994. V. 263. P. 802-805.

78. Inouye S., Tsuji, F.I. Aequorea green fluorescent protein. Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein//FEB S Lett. 1994. V. 341. P. 277-280.

79. Brasileiro A.C.M., Aragro F.J.L Marker Genes for In Vitro Selection of Transgenic Plants // J. Plant Biotechnology. 2001. V. 3 (3). P. 113-121.

80. Joersbo M., Donaldson I., Kreiberg J., Petersen S.G, Brunstedt J., Okkels F.T Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet // Mol Breed. 1998. V.4.P. 111-117.

81. Haldrup A., Petersen S.G., Okkels F.T. The xylose isomerase gene from Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes allows effective selection of transgenic plant cells using D-xylose as the selection agent // Plant Mol Biol 1998. V. 37. P. 287-296.

82. Bevan M.W., Flavell R.B., Chilton M.D. A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation //Nature. 1983. V. 304. P. 184-187.

83. Herrera-Estrella L., De Block M., Messens E., Hernalsteens J.P., Van Montagu M, Schell J Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells // EMBO. 1993 V. 2. P. 987-995.

84. Van Den Elzen P.J.M, Townsend J., Lee K.Y., Bedbrook J.R. A chimaeric hygromycin resistance gene as a selectable marker in plant cells // Plant Mol Biol. 1985. V. 5. P. 299-302.

85. Vasil I.K. Molecular improvement of cereals//Plant Mol. Biol. 1994. V. 25. P. 925-937.

86. Haughn G.W., Smith J., Mazur В., Somerville C. Transformation with a mutant Arabidopsis acetolactate syntase gene renders tobacco resistant to sulfonylurea herbicides//Mol Gen Genet 1988. V. 211. P. 266-271.

87. Mourad G., Williams D., King J. A double mutant allele, crsl-4. of Arabidopsis thaliana encodes an acetolactase synthase with altered kinetics//Planta. 1995. V. 196. P. 64-68.

88. Comai L., Facciotti D., Hiatt W.R., Thompson G., Rose R.E., Stalker D.M. Expression in plants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosate //Nature. 1985. V. 317. P. 741-744.

89. Comai L., Sen L.C., Stalker D.M. An altered arok gene product confers resistance to the herbicide glyphosate // Science. 1983. V. 221 P. 370-371.

90. Mazur B.J., Falco S.C. The development of herbicide resistant crops // Annu. Rev. Plant Physiol. 1989. V. 40. P. 441-470.

91. Murakami Т., Anzai H., Imai S., Satoh A., Nagaoka K., Thompson C.J. The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 205. P. 42-50.

92. Lindsey K. Genetic manipulation of crop plants. J. Biotech. 1992. V. 26. P. 1-28.

93. Bellinder, R.R., R.E. Lyons, S.E. Scheckler, and H.P. Wilson. Cellular alterations resulting from foliar applications of HOE-39866. // Weed Sci., 1987. V.35. P.27-35.

94. Ridley, S.M. McNally S.F.// Effects of phosphinothricin on the isozymes of glutamine synthetase isolated from plant species which exhibit varying degrees of susceptibility to the herbicide. // Plant Sci., 1985. V.39. P.31-36.

95. Wanamarta G., Penner D. Foliar absorption of herbicides // Rev. Weed Sci. 1989. V.4. P. 215-231.

96. Дрейпер Дж., Скотт P., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений Лабораторное руководство // М.: «Мир». 1991 408 е., ил.

97. Butenko R.G., Atanassov A.I., Urmantseva V.V. Some feature of sugarbeet tissue cultures // Phytomorphology. 1972. V. 22. P. 140-143.

98. Welander T. Callus and root formation in explants of Beta vulgaris L. // Physiol Plant. 1974. V. 32. P. 305-307.

99. Hooker M.P., Nabors M.W. Callus initiation, growth, and organogenesis in sugarbeet (Beta vulgaris L.) // Z Pflanzenphysiol. 1977. V. 84. P. 237-246.

100. Bhat S.R., Ford-Lloyd B.V. and Callow J.A. Isolation and culture of mesophyll protoplasts of garden, fodder and sugarbeets using a nurse culture system: callus formation and organogenesis // J Plant Physiol. 1986. V. 124. P. 419-423.

101. Колодяжная Я.С., Дейнеко E.B. Получение регенерантов сахарной свеклы// Онтогенез. 2002. Том. 33. № 3. С. 170-175.

102. Банникова М.А., Головко А.Э., Хведынич О.А., Кучук Н.В. Регенерация растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) в культуре in vitro. Гистологическое изучение процессов регенерации//Цитология и генетика. 1995. Т. 29. №6. С. 14-21.

103. Фирсов А.П., Пиголева С.В., Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Регенерация побегов сахарной свеклы из листовых эксплантов // Биотехнология. 2004. № 1. С. 56-61.

104. Богомолова Н.М. Разработка метода получения трансгенных растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Рамонь 2002.

105. Kulshreshtha S., Coutts R.H.A., Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from mature sugarbeet (Beta vulgaris L.) zygotic cotyledons // Plant Growth Regulation. 1997. V. 22. P. 87-92.

106. Lindsey K. and Gallois P. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterim tumefaciens IIJ Exp Bot. 1990. V. 41. P. 529-536.

107. Grieve T.M., Gartland K.M.A., Elliott M.C. Micropropagation of commercially important sugar beet cultivars // Plant Growth Regulation. 1997. V. 21. P. 15-18

108. Ivic, S., Saunders J.W. and Smigocki A. Leaf disc callus from sugarbeet breeding lines for biolistic transformation // Am. Soc. of Sugar Beet Technologist Proceedings. 2001. V. 31.P. 214-217.

109. Ivic-Haymes S.D., Smigocki A.C. Biolistic transformation of highly regenerative sugar beet (Beta vulgaris L.) leaves // Plant Cell Rep. 2005. V. 23. P. 699-704.

110. Jacq B, Tetu Т., Lesorbe O., Sangwan R.S., Sangwan-Norreel B.S. Factors influencing T-DNA transfer in Agrobacterium-mQdiated transformation of sugarbeet//Plant Cell Rep. 1993. V. 12. P. 621-624.

111. Snyder G.W., Ingersoll J.C., Smigocki A.C., Owens L.D. Introduction of pathogen defense genes and a cytokinin biosynthesis gene into sugarbeet (Beta vulgaris L.)by Agrobacterium or particle bombardment // Plant Cell Rep. 1999. V. 18. P. 829— 834.

112. Kifle S., Shao M., Jung C.,Cai D. An improved transformation protocol for studying gene expression in hairy roots of sugar beet (Beta vulgaris L.) // Plant Cell Reports. 1999. V. 18. P. 514-519.

113. Joersbo M., Donaldson I., Kreiberg J., Petersen S.G, Brunstedt J., Okkels F.T Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet // Mol Breed. 1998. V. 4. P. 111-117.

114. Ingersoll JC, Huette TM and Owens LD Effect of promoter-leader sequences on transient expression of reporter gene chimeras biolistically transferred into sugarbeet (Beta vulgaris) suspension cells //Plant Cell Rep. 1996. V. 15. P. 836— 840.

115. Krens FA, Trifonova A, Keizer LCP and Hall RD The effect of exogenously-applied phytohormones on gene transfer efficiency in sugarbeet (Beta vulgaris L.) //Plant Sci. 1996. V. 116. P. 97-106.

116. Joersbo M., Mikkelsen J.D., Brunstedt J. Relationship between promoter strength and transformation frequencies using mannose selection for the production of transgenic sugar beet // Molecular Breeding. 2000. V. 6. P. 207-213.

117. Freytag A.H., Anan S.C., Rao-Ardelli A.P., Owens L.D. An improved medium for adventious shoot formation and callus induction in Beta vulgaris L. in vitro II Plant Cell Rep. 1988. V. 7. P. 30-34

118. Jacq B, Tetu Т., Sangwan R.S., Laat A.D. Sangwan-Norreel B.S. Plant regeneration from sugarbeet (Beta vulgaris L.) hypocotyls cultured in vitro and flow cytometric nuclear DNA analysis of regenerants // Plant Cell Rep. 1992. 11: 329-333.

119. Rady M.R., Ali Z.A. Comparison of physiology and anatomy of seedlings and regenerants of sugar beet//Biologia Plantarium. 1999. V. 42 (1). P.39-48.

120. Zhang C.L., Chen D.F., Elliott M.C., Slater A. Thidiazuron induced organogenesis and somatic embryogenesis in sugar beet (Beta vulgaris L.) // In Vitro Cell Div Biol Plant. 2001. V. 37. P. 302-310.

121. Hood E.E., Gelvin S.B., Melchers L.S., Hoekema A. New Agrobacterium helper strains for gene transfer to plants // Transgenic Res. 1993. V. 2. P. 208-218.

122. Becker D. Binary vectors which allow the exchange of plant selectable markers and reporter genes //Nucleic Acids. Res. 1990. V. 18. P. 203.

123. Падегимас JI.C., Шульга О.А., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum и Solanum tuberosum, устойчивых к гербициду фосфинотрицину // Мол. Биол. 1993. Т. 27. №4. С.947-951

124. Грибова Т.Н., Камионская A.M., Монахос Г.Ф., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений капусты белокочанной Brassica oleracea var. capitata с новыми агротехническими свойствами // Биотехнология. 2005. Т. 6. С.12-19.

125. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва «Мир». 1984 480стр.

126. Сайт Strategic Diagnostics Inc: www.sdix.com

127. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 1977. V. 84. P. 63-67.

128. Dellaorta S.L., Wood J., Hicks J.B. A plant DNA minipreparation: version II // Plant Mol. Biol. Rep. 1987. V. 1. P. 19-21.

129. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 3-17.

130. Vitha S. Histochemical localization of b-glucuronidase (GUS) reporter activity in plant tissues. Microscopy and Imaging Center, Texas A & M University http://www.tamu.edu/mic

131. Tetu T, Sangwan RS and Sangwan-Norreel BS Hormonal control of organogenesis and somatic embryogenesis in Beta vulgaris callus // J Exp Bot Vol. 1987. V. 38 № 188. P. 506-517.