Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РАЙОНИРОВАННЫХ В РФ СОРТОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUML.) И ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, НЕСУЩИХ ГЕНЫ BAR И GST

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РАЙОНИРОВАННЫХ В РФ СОРТОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUML.) И ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, НЕСУЩИХ ГЕНЫ BAR И GST"

J} ^ar

На нравах рукописи

ФАДЕЕВ Виталий Сергеевич

ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РАЙОНИРОВАННЫХ В РФ СОРТОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUML.) И ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, НЕСУЩИХ ГЕНЫ bar И gst

Специальность 03.00.23 - биотехнология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2006

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии Центра "Биоинженерия" РАН

Научный руководитель Доктор биологических наук

Александр Константинович Гапоненко

Официальные оппоненты Доктор биологических наук

Ирина Васильевна Голденкова-Павлова

Доцент, кандидат биологических наук Александр Александрович Соловьев

Ведущая организация Институт Цитологии и генетики СО РАН

Защита диссертации состоится часов на заседании

диссертационного совета Д 220 043 10 в РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева Адрес. 127550, Москва, Тимирязевская ул, 49 Ученый совет РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ РГАУ-МСХА имени К А. Тимирязева _

Автореферат разослан " /У " 2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Г И Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Пшеница является главной сельскохозяйственной культурой для большинства населения умеренной климатической зоны. Подавляющее большинство сортов пшеницы создано традиционными методами селекции на основе использования генетического разнообразия исходных видов. Развитие генно-инженерных технологий призвано качественно изменить этот процесс путем вовлечения в селекцию единичных генов или группы генов из любых видов растений, животных, микроорганизмов, или даже аЪ initio синтезированных генов, которые могут быть введены в геном пшеницы для придания новых желаемых свойств.

Первая трансформация пшеницы методом биобаллистики осуществлена (Vasil et al, 1992). В настоящее время процесс создания трансгенных растений мягкой пшеницы (Т. aestivum L.) методом биобаллистической трансформации считается рутинным. Однако это справедливо лишь для некоторых сортов, отзывчивых к трансформации, таких как Bobwhite и Florida, но и в этих случаях эффективность трансформации не превышает 1-6% (Weeks I.T. et al, 1993, Chen W. P., et al, 1998, Uze M. et al, 1999, Jordan M.C 2000, Wright M., 2001).

Производство высококачественного продовольственного зерна пшеницы лимитируется в Российской Федерации абиотическими и биотическими стрессами. Среди биотических стрессов для злаков необходимо выделить экономически значимого вредителя пшеницы клопа вредная черепашка (Eurygaster integriceps Puton), затрудняющего получение высококачественного зерна в южных и юго-восточных регионах России. Экономические потери от клопа составляют миллиарды рублей ежегодно (Захаренко В.А., 2005). Поэтому создание устойчивых к неблагоприятным условиям среды сортов пшеницы представляется первостепенной научной и важнейшей экономической задачей.

Для практического применения генетической инженерии с целью улучшения важнейших культур необходимо иметь высокоэффективную систему генетической трансформации, адаптированную для районированных в РФ сортов, Увеличение эффективности трансформации ценных генотипов пшеницы может быть достигнуто при решении следующих задач:

1. повышение частоты регенерации растений in vitro;

2. оптимизация параметров генетической трансформации;

3. выбор наиболее эффективного способа селекции трансформированных клеток и регенерации истинных растений-трансформантов.

Известно, что поддержание гомеостаза глутатиона является одним из механизмов, обеспечивающих устойчивость растений к различным абиотическим стрессам. Поэтому генно-инженерные манипуляции с

фодотешлшотсп многообещающими лдя

метаболическим путем глутатиона

кмеки К.А. Тимчрязева 1ЦНБ имени Н.И. Жичсзнсва Фонд научай дитерэ^ут^

повышения устойчивости растений к стрессам Антистрессовые действия фермента глутатион-Я-трансферазы (GST) обусловлены детоксикацией свободных радикалов, возникающих при любых стрессах Ген gst был изолирован из генома Arabidopsis thaliana в группе профессора С Сопори (Международный Центр Генетической Инженерии и Биотехнологии, Нью-Дели, Индия) и любезно предоставлен нам для исследования

Цель исследования заключалась в оптимизации параметров генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой яровой пшеницы и получении трансгенных растений, несущих гены gst и bar, для определения устойчивости полученных растений к гербициду Баста и хлоридно натриевому засолению

Для достижения этой цели были поставлены стедующие задачи

1 Оптимизировать параметры ведения кучьтуры клеток и регенерации растений in vitro мягкой пшеницы сортов Лада Эстер Мис Норис и А чир

2 Оптимизировать параметры биобаллистической трансформации мягкой пшеницы сортов Лада Эстер и Мис

3 Провести сравнительный анализ эффективности трех методов негативной селекции (отложенной, градационной, регенерационной) трансгенных тканей пшеницы in vitro, дтя получения истинных трансформантов

4 Получить растения трансгенной пшеницы, несущей гены bar, gfp и bar gst а также изучить характер наследования введенных трансгенов

5 Выявить трансгенные растения, устойчивые к натриево-хлоридному засолению

Научная новизна Все представленные в диссертации результаты являются новыми и оригинальными

1 Впервые показан стимулирующий эффект кратковременного воздействия (48 ч ) пониженной температуры (-Ы°С) на частоту индукции морфогенетического каллуса

2 Впервые оптимизированы условия культивирования m vitro генотипов мягкой пшеницы Лада, Эстер Mue А чир, Норис районированных в 4 зонах РФ, для индукции морфогенного каллуса и регенерации растений in vitro

3 Впервые оптимизированы параметры биобаллистической трансформации мягкой пшеницы дтя широко возделываемых в четырех зонах РФ сортов Лада, Эстер и Мис

4 Впервые в РФ получены трансгенные растения мягкой пшеницы, несущие гены bar и gst

5. Проведен анализ наследования трансгенов в двух поколениях на примере сорта мягкой пшеницы Лада. Показано, что экспрессия gst может повышать уровень устойчивости растений пшеницы к хлоридно-натриевому засолению.

Практическая значимость Полученные в работе результаты имеют важное практическое значение:

— результаты данной работы показали возможность получения трансгенных растений, распространенных сортов мягкой пшеницы, несущих различные гетерологичные гены, в количествах необходимых для использования в селекционном процессе.

- получена выборка трансгенных растений мягкой пшеницы сорта Лада, несущих гены bar, обеспечивающий устойчивость к гербициду широкого действия Баста и ген антистрессового действия gst. Данные растения представляют интерес для изучения механизмов повышения устойчивости пшеницы к хлоридно-натриевому засолению.

Апробация работы Основные результаты работы докладывались на 2-ой научной конференции Московского общества генетиков и селекционеров "Актуальные проблемы современной генетики"; на конференции "Трансгенные растения — новое направление в биологической защите растений", Краснодар 2003 г.; на международном конгрессе XVth International Plant Protection Congress, Beijing, China, May 11-16, 2004; на международной конференции Second International Conference on Sunn Pest, 1С ARD A, Aleppo, Syria 19-22 July, 2004; На международной конференции "Развитие ключевых направлений сельскохозяйственной науки Казахстана: селекции, биотехнологии и генетических ресурсов" Астана, 3-7 августа 2004.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (13С наименований), изложена на /¿Ф страницах машинописного текста, содержит [£_ таблиц и 23 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Получение каллусной культуры и регенерация in vitro мягкой пшеницы. В работе использованы российские сорта яровой пшеницы Лада, Эстер, Норис, Мис, и Амир (автор к.с-х.н., Н.В Давыдова и др., НИИСХ РАСХН). Растения, использованные в эксперименте, выращивали в условиях теплицы при фотопериоде 16/8 ч, при температуре +25°С днем и +15°С ночью.

Для получения морфогенного каллуса в качестве экстанта использовали негретые зародыши, изолированные на 10-12 день после опыления, размер зародыши составлял 0 5-1 5 мм Зародыши помещали на среду для индукции морфогенного каллуса (А) содержащую МБ соли, В5 витамины, 2 мг/т 2,40, 30 г/л сахарозы и 8 г/л агар-агара

Культивирование каллусов на среде для регенерации проводили в течение двух недель при освещении 5000 тюке Морфогенный каллус, образующий побега, помещали в пробирки со средой дтя укоренения Культивирование побегов проводили в течение 4-6 недечь до образования первичных корней Укоренившиеся проростки пересаживали в перлит и помещали во влажную камеру на 7-14 дней По мере развития окрепшие растения переносили в почву до полного созревания в устовиях тепчицы

В работе использовали вектора экспрессии рзОРРВЛИ, рЬТмЮШ и рОБТВАЫ, сконструировал д б н Н В Равин

Г Ро1у-А

Схематическая карта плазмиды pUbilGUS

Act

mtron

nosj ■ Ubil

Схематическая карта плазмиды psGFPBAR ^ mtron - GST - nos3 ■ Ubii ^

Act

Схематическая карта плазмиды pGSTBAR

Биобаллистическая трансформация мягкой пшеницы В качестве микроносителя использовали вольфрамовые микрочастицы "М10", средний размер которых составляет 0,1-2,0 мкм Преципитация проводилась по методике кальций-спермидинового способа по Файнер (Finer J et al, 1992)

Для повышения выживаемости трансформируемой ткани проводили осмотическую пре- и пост обработку Экспланты культивировали на среде с повышенным осмотическим давлением в течение 4—6 часов до трансформации и 20-24 часа после трансформации

Биобаллистическая трансформация проводилась с использованием "генной пушки" PIG (Particle inflow gun) (Finer J et al, 1992)

Опредетение транзиентной экспрессии гена uidA (GUS) проводили методом гистохимического окрашивания растите чьных эксплантатов по (Jefferson et al, 1987) Для анализа препаратов использовали стереомикроскоп (Wild Leica, Heerbrugg, Швейцария)

Оценку gfp экспрессии (как транзиентной, так и стабильной) проводили при использовании стереомикроскопа с флуоресцентным модулем. Оценку экспрессии проводили на 2, 7 и 35 день после баллистической трансформации.

Все полученные in vitro растения ТО, устойчивые к фосфинотрицину (РРТ), оценивали на наличие последовательности гена bar, gst и nos 3' терминатора с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции).

Определение устойчивости полученных трансгенных линий пшеницы к гербициду широкого спектра действия БАСТА, который содержит фосфинотрицин (РРТ) в качестве активного компонента, проводили на растениях Т1, полученных самоопылением из трансгенных растений ТО.

Для оценки устойчивости полученных трансгенных растений к хлоридно-натриевому засолению получена кривая доза-эффект выживания контрольных нетрансгенных растений мягкой пшеницы сорта Лада при засолении. В последующем, проверку устойчивости трансгенных растений к хлоридно-натриевому засолению проводили на среде для проращивания содержащей 200 мМ/л NaCl. Полученные устойчивые растения оценивали на наличие копии гена gst (глутатион-Б-трансфераза) ПЦР анализом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Оптимизация ведения культуры тканей мягкой пшеницы in vitro Изучение взаимосвязи между частотой индукции морфогенетического каллуса in vitro и генотипом мягкой пшеницы

Известно, что морфогенетический потенциал растений обусловлен генотипом. Первоначально мы провели сравнительные исследования по изучению морфогенного потенциала для пяти сортов мягкой пшеницы. В эксперименте были использованы незрелые зародыши, изолированные на 10-12 день после опыления, размер которых варьировал в пределах 0.5-1.5 мм. К концу второй недели культивирования каллус разделяли на два типа: морфогенный каллус, компетентный к регенерации побегов — плотный, желтоватый, глобулярный, и неморфогенный каллус — рыхлый, водянистый, белый. Все исследуемые сорта мягкой пшеницы образовывали морфогенный каллус. С наибольшей частотой морфогенный каллус образует сорт Лада - до 75%, для сорта Мис частота образования морфогенного каллуса - 20%, сорта Эстер, Норис и Амир - 40-60% (Рис. 1.).

Влияние низкотемпературной обработки зерновок на частоту индукции морфогенетического каллуса

Известно, что на частоту индукции морфогенетического каллуса оказывают влияние тип и состояние экспланта, воздействие физических факторов и фитогормональный состав сред. Для оценки влияния

низкотемпературного шока на частоту индукции морфогенного каллуса, незречые зерновки подвергали обработке пониженной температурой в течение 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10 и 11 дней Далее изолировали незречые зародыши и культивировали их на среде (А) В последующем про водит и оценку частоты индукции морфогенного каллуса Полученные данные позволяют сделать вывод о повышении частоты индукции морфогенного каллуса при кратковременной (48 ч ) экспозиции эксплантов при температуре +4°С (рис 2) Для сорта Лада максимальные значения частоты индукции морфогенетического каллуса достигают 75 °о, для сорта Норис 60 % В качестве контроля использованы незрелые зародыши сортов Лада и Норис изолированные из зерновки сразу после срезания колоса незретого растения Обработка эксплантов низкой температурой более трех дней приводит к снижению образования морфогенного каллуса Как видно из полученных резучьтатов, частота образования морфогенетического каллуса на 1 и 4 день экспозиции одинакова, на 5 день эффективность воздействия снижается (рис 2)

100 0

Лада Эсгер Мис норис Амир Сорта пшеницы

К1 23459 10 11 Воздействие низкои температуры, дни

Рис. 1. Зависимость индукции Рис 2 Влияние воздействия низкой морфогенного каллуса от генотипа температуры на индукцию морфогенного мягкой пшеницы (Triticum aestiviim L) каллуса мягкой пшеницы сортов Лада и

Норис. К-коптроль

Изучение влияния различных фитогормонов и их концентрации в среде на частоту регенерации растений in vitro мягкой пшеницы

Общеизвестно, что регенерация пшеницы in vitro достигается удалением из культуральной среды, содержащей макро и микро соли по Мурасиге и Скуг, фитогормон 2,4-D (Vasil et al 1982, Гапоненко и др, 1984) Для повышения морфогенетического потенциала сортов яровой пшеницы Норис и Лада, которые отличаются высоким морфогенетическим потенциалом, проводили оценку влияния различных фитогормонов и их концентрации, путем сравнения частоты индукции регенерации побегов, корней, побегов с корнями и целых растений Состав используемых в работе сред представлен в (таблице 1) Первоначально в эксперименте отбирали морфогенетические каллусы, которые переносили на среды регенерации (1-10) и культивировали в течение двух

недель. В эксперименте отдельно учитывали экспланты, давшие побеги, корни, и экспланты, сочетавшие образование побегов и корней, также учитывали регенерацию растений в целом (рис. 3, 4.).

Таблица 1. Использованные среды для исследования влияния различных фитогормонов на частоту регенерации побегов in vitro мягкой пшеницы сортов Лада и

Среда Фитогормоны

1 Фитогормоны отсутствуют

2 Кинетин 0.5 мг/л (К 0.5)

3 Кинетин 1 мг/л (К 1)

4 6-бензиламино1гу рнн 0.5 мг/л (ВАР 0.5)

5 6-бензиламинопурин 1 мг/л (ВАР 1)

6 Нафтилуксусная кислота 0.5 мг/л (NAA 0.5)

7 Нафтилуксусная кислота 1 мг/л (NAA 1)

8 Индолилуксусная кислота 0.5 мг/л (IAA 0.5)

9 Индолилуксусная кислота 1 мг/л (IAA 1)

10 Осмотическая (сахароза 0.4 М, фитогормоны отсутствуют)

Как видно из представленных данных, частота побегообразования увеличивалась на средах, содержащих цитокинины: кинетин и ВАР (6-бензиламинопурин). Ауксины: NAA и IAA увеличивают частоту образования корней у морфогенного каллуса мягкой пшеницы (рис. 3, 4.).

Бм К 0.5 К1 ВАР 0.5 ВАР 1 NAA0.5 NAA1 IAA0.5 IAA 1 Осмос гормонов Фитогормональный состав среды

Рис. 3. Влияние различных фитогормонов и их концентрации на частоту регенерации побегов, корней и растений мягкой пшеницы сорт Норис

Без К 0.5 К1 ВАР 0.5 ВАР 1 NAA 0.5 NAA1 IAA 0.5 IAA1 Осмос гормонов Фитогормональный состав среды

Рис. 4. Влияние различных фитогормонов и их концентрации на частоту регенерации побегов, корней и растений мягкой пшеницы Лада

На основе полученных результатов была составлена оптимальная для регенерации растений среда, содержащая фитогормоны ВАР и кинетин в концентрации 1 мг/л, и чаа в концентрации 0,5 мг/л, эффективность которой тестировали с использованием сорта Лада Эффективность побегообразования из морфогенетического каллуса при использовании данной комбинации фитогормонов достигала 90 % Используемая для укоренения полученных побегов среда содержит Маа в концентрации 0,5 мг/ч, частота укоренения достигает 90 % (таблица 2)

Таблица 2 Оценка эффективности регенерации растений мягкой пшеницы сорта Лада с использованием культуралыюй среды с комбинированным фитогормональным составом_

Этапы ведения культуры Общее количество, шт Число регенерантов, %

Морфогенные каллусы 156

Каллусы с побегами 138 88,7 +/- 6.00

Укорененные регенеранты 136 87,2 +/- 5 21

Растения в перлите 136 87,2 +/- 5 21

2. Оптимизация параметров бнобаллистнческой трансформации растений мягкой пшеницы

Влияние биобаллистического воздействия на морфогенетический потенциал тканей мягкой пшеницы

Изучали влияние баллистической обработки на растительную ткань на среде для индукции каллусообрарования (А) на 4, 7, 10, 14 и 21 день культивирования. Оценку степени влияния, которое выражается в снижении способности к регенерации, производили через 7 дней после баллистической трансформации путем сравнения морфогенного статуса растительных эксплантатов, подвергнутых биобаллистике, и контрольных эксплантов, не подвергнутых баллистической обработке (вакуумом, резким повышением давления и ударом микрочастицами) В качестве контроля были использованы зародыши (для сравнения с эксплантатами на 4 и 7 день культивирования) и морфогенные каллусы (для сравнения с эксплантатами на 10, 14 и 21 день культивирования) Из представленных данных видно, что степень отрицательного влияния уменьшается с увеличением возраста экспланта с момента инициации каллусной культуры (рис 5)

Показано, что при баллистической трансформации морфогенетический потенциал зависит от генотипа Из трех исследуемых генотипов пшеницы культивируемые клетки сорта Лада наиболее устойчивы к баллистическому воздействию по сравнению с сортом Эстер и сортом \Лис, последний наименее устойчив к воздействию (рис 5 ) Нами показано, что оптимальным временем для баллистической трансформации мягкой пшеницы является 10-14 день с момента инициации культуры тканей пшеницы для всех исследуемых сортов

Следует отметить, что через 21 день с момента инициации культуры растительная ткань не чувствительна к биобаллистическому воздействию (рис. 5.). Однако известно, что с увеличением времени ведения культуры снижается компетентность к регенерации и увеличивается частота появления сомаклональной изменчивости мягкой пшеницы (Бабаева С. И др. 1995).

Время индукции культуры до эксперимента, дни

Рис. 5. Влияние баллистической трансформации на индукцию морфогенетического каллуса мягкой пшеницы в зависимости от времени предварительного культивирования экспланта

Оптимизация параметров баллистической трансформации мягкой пшеницы

Основа системы биобаллистической трансформации состоит в эффективной доставке векторных конструкций в клетки мишени, компетентные к регенерации растений. Однако проникновение металлических микрочастиц в клетку путем пробивания клеточной стенки наносит повреждения, связанные с разрушением клеточных структур. Таким образом, поиск оптимальных параметров сочетающих максимальную степень доставки векторных конструкций в клетки и при этом наносящих незначительные повреждения живой ткани является главной задачей оптимизации параметров трансформации.

Для оптимизации параметров баллистической трансформации сортов мягкой пшеницы проведена сравнительная оценка влияния двух физических параметров, влияющих на доставку ДНК (кассет экспрессии) в компетентные к регенерации проростков клетки каллуса, полученных из незрелых зародышей. Величина избыточного давления гелия при выстреле - 5, 6, 7 и 8 атмосфер, и расстояние от источника частиц (сопло фильтродержателя) до ткани мишени — 10, 12 и 14 см.

Для баллистической трансформации использовали векторную конструкцию риЫЮиБ, содержащую ген шс1А, кодирующий репортерный белок Р-глюкуронидазу, под контролем конститутивного убиквитинового кукурузного промотора.

В качестве биологического параметра, влияющего на частоту доставки кассеты экспрессии в компетентные к регенерации клетки, оценивали влияние

время культивирования растительного эксптанта до момента трансформации Морфогенные каллусы, полученные из незрелых зародышей на 4, 7, 10 и 14 после их посадки на среду индукции каллусообразования трансформировали методом биобаллистики Биобаллистическую трансформацию сорта Эстер проводили на 4, 7 и 10 день посте посадки на среду индукции каллусообразования

Оценка эффективности доставки генов проводилась с помощью выявления и подсчета количества синих участков - мест транзиентной экспрессии гена uidA через 48 часов после биобаллистической обработки Следует отметить, что выбор векторной конструкции pUbilGUS был не случаен, поскольку для репортерной системы p-глюкуронидазы разработана чувствительная методика оценки экспрессии in situ Гистохимическое окрашивание растительных эксплантатов проводилось по методике Джеферсона (Jefferson et al, 1987) с использованием реактиваX-gluc

Высокий уровень транзиентной экспрессии маркерного гена обнаружены при использовании трех пар параметров биобаллистики 5 атм и 10 см, 6 атм и 12 см, 8 атм и 14 см, (рис 6, (а-в)) Полученные резутьтаты свидетельствуют о том, что оптимальным для доставки кассет экспрессии является использование давления гелия 6 атм и 12 см расстояния до ткани мишени и морфогенетических каллусов на 10 и 14 день культивирования эксплантатов на среде индукции каллусобразования (А) Следует отметить, что количественный показатель (число участков транзиентной экспрессии) коррелирует с генотипом растения Так, для сорта Лада выявлено более 500 случаев доставки кассет экспрессии на -3-^1 мм' поверхности, а для сортов Мис и Эстер 223 3 и 366 3 соответственно Для сорта Мис также отмечен второй максимум транзиентной экспрессии соответствующий сочетанию параметров 14 см и 8 атм (рис 6 а-в) В условиях эксперимента сочетание параметров 10 см и 6 атм неэффективны для биобаллистической трансформации мягкой пшеницы Таким образом, впервые показано с использованием репортерной системы GLS, что оптимальным сочетанием физических параметров биобалтистической трансформации мягкой пшеницы с использованием биобаллистической пушки PIG являются расстояние от источника частиц до ткани мишени 12 см и давление гелия при выстреле 6 атм Оптимальным временем для трансформации являются 10-14 сутки с момента инициации культуры

4 7 10 U 4 7 10 14 4 7 10

Дни Дни Дни

Рис. 6 Определение онтнматмгого срока развития каллуса пшеницы для биобаллистической генетической трансформации пшеницы при использовании трех пар оптимизированных физических параметров ба тлистики

Мониторинг процесса трансформации путем исследования транзиентной и стабильной экспрессии гена gfp

Репортерная система GUS позволяет проводить анализ, только на фиксированном материале т situ и использование гена uidA в живых тканях для дальнейшего наблюдения за экспрессией репортерного гена uidA не приемлемо Для наблюдения динамики изменения транзиентной и стабильной экспрессией в клетках мягкой пшеницы использован репортерный ген gfp позволяющий производить in vivo оценку экспрессии трансгена

В этом эксперименте использована векторная конструкция psGFPBAR, которая содержит ген gfp под контролем конститутивного промотора и селективный ген bar обеспечивающий устойчивость к гербициду БАСТА

Транзиентная экспрессия маркерного гена gfp обнаруживается уже через 4 часа после баллистической трансформации Максимум транзиентной экспрессии гена gfp достигается через b 5 часов после трансформации и полностью исчезает через 17 дней Известно что, экспрессия gfp наблюдаемая позже данного срока, может считаться доказательством стабильной интеграции в геном реципиента (Potncus I et al, 1998)

Оценка наличия/отсутствия экспрессии маркерного гена gfp проводилась при помощи микроскопа с флуоресцентным модулем на 2 сутки и на 7 и 35 день посте бал мистической трансформации На второй день частота появления транзиентной экспрессии гена gfp составила 100 % от оцениваемых эксплантатов для всех исследуемых вариантов сетекции (рис 7 а-в, таблица 3) Частота выявления транзиентной экспрессии, опредетяемая на 7 день, составляет от 30 % до 70 % Стабильная экспрессия гена gfp, определяемая на 35 сутки в момент пересадки морфогенетических каллусов со среды индукции каллусообразования/селекции на среду регенерации/селекции, соответствовала 9-23 % Максимальные значения транзиентной и стабильной экспрессии gfp

п

гена соответствуют регенерационной методике селекции и превышают в два раза значения полученные для отложенной и градационной систем селекции, 13 % и 11 % соответственно (рис 7; таблица 4).

а о в г

Рис. 7. Оценка транзиентной и стабильной экспрессии гена gfp в тканях мягкой пшеницы: в незрелом зародыше (а) и каллусных тканях пшеницы (б,в) через 24 часа после биобаллистической трансформации, контрольный каллус (г) контрольный не трансгенный каллус мягкой пшеницы

3. Получение и анализ трансгенных растений мягкой пшеницы

Сравнительная оценка методик селекции трансгенных тканей пшеницы

Важным этапом получения трансгенных растений является их отбор на селективном агенте. Устойчивость к селективному агенту обеспечивается экспрессией гена селективного маркера. В настоящее время для растений предложено несколько таких генов, обеспечивающих устойчивость к ряду антибиотиков (канамицин, гигромицин и др.) или гербицидов («Баста», глифосат и др.).

В качестве селективного агента нами использован фосфинотрицин (активный компонент гербицида БАСТА), устойчивость к которому обеспечивается геном bar, который входит в состав конструкций psGFPBAR и pGSTBAR. Мы провели сравнительное изучение трех наиболее эффективных методик селекции варианты селекции, используемые в работе, представлены в таблице 3.

Таблица 3. Варианты селекции трансформантов мягкой пшеницы с использованием РРТ в качестве селективного агента_

Вариант селекции Градационная Тест 1 Отложенная Тест 2 Регенерационная ТестЗ

Индукция каллуса (РРТ мг/л) 1 неделя -1 2 недели -3 2 недели -5 1 неделя без РРТ 2 недели -5 2 недели —5 2 недели без РРТ

Регенерация (РРТ мг/л) S 5 5

Укоренение (РРТ мг/л) S 3 3

Время селекции, дни -98 дней ~92 дня ~70 дней

В эксперименте использованы два контрастных по морфогенетическому потенциалу сорта Лада и Мис. Морфогенные каллусы использованы в качестве экспланта для трансформации методом биобаллистики. Первоначально частоту образования предполагаемых трансформантов определяли на основании данных по количеству растений, полученных в результате отбора на

селективной среде in vitro Далее была рассчитана эффективность трансформации пшеницы на основании данных по ПЦР анализу геномной ДНК на наличие последовательности трансгена bar и nos 3 терминатора, для всех полученных первичных трансформантов (рис 8 (2, 3 ))

Градационная методика проведения се активного отбора тканей, прошедших трансформационные методы, опредетяется постепенным (пошаговым) увеличением концентрации селективного агента фосфинотрицина (РРТ) в среде Селективное воздействие на эксплант начинается на вторые сутки после баллистической трансформации Ткань с осмотической среды сразу переносится на среду селекции с 1 мг/т РРТ, концентрация которого на стадии индукции каллусообразования доводится до 5 мг/л Общее время проведения селективной обработки составляет 98 дней Использование методики градуированной селекции позволяет проводить строгий отбор истинных трансформантов Эффективность трансформации растений пшеницы, полученная с помощью методики градуированной селекции (тест 1 ), составляет О 85% для сорта Лада и 2 12% - для сорта Kfuc (таблица 4 )

Селективный отбор растительных тканей по методике отложенной или задержанной селекции (тест 2) начинается через 7 суток посте баллистической трансформации Обработанная каллусная ткань с осмотической среды переносится на среду индукции каллусообразования (А)

/ "Генная пушка" (PIG)

план-схема 2. Электрофореграмма ПЦР анализа грансгенных растений мягкой

пшеницы по bar гену 3 Электрофореграмма ПЦР анализа трансгенных растений мягкой

пшеницы по nos'3 терминатора

Рис. 8. План-схема баллистической трансформационной установки (PIG) (1), и электрофореграмма ПЦР анализа трансгенных растений мягкой пшеницы по bar гену (2) и, nos'3 терминатору (3 )

Задержка селективного воздействия на ткань проводится для увеличения количества клеток, в которых эффективно осуществлен процесс интеграции введенной ДНК в геном растения Увеличение общей массы трансгенной ткани повышает вероятность выживания во время селективного давления на растительный эксплантат Общее время селекции с использованием отложенной методики составляет 92 дня (таблица 3), эффективность

трансформации - 0.65 %, при том, что частота трансформации, рассчитанная по количеству первичных трансформантов, составляет 1,57% (таблица 4).

Таблица 4. Сравнительный анализ эффективности получения трансгенных растений мягкой пшеницы при использовании систем селекции__

Сорт Количество эксплантов на опыт Число / процент GFP+ каллусов после баллистики Количество первичных трансформантов/ частота трансформации, % Количество трансгенных растений / эффективность трансформации, %

7 дней 35 дней

Лада тест1 466 186/40 51 /10.9 4/0.85 4/0.85

Лада тест2 446 214/48 57/12.8 7/1.57 3 / 0.65

Лада тестЗ 140 98/70 32 / 22.9 9/6.43 7/5

Лада тестЗ 350 - - 23/6,57 17/4.86

Мис - тест 1 106 34/32 9/8.9 2/2.12 2/2.12

Мис - тест 2 104 44/42 10/9.6 1/0.96 -

Методика регенерационной системы селекции (тест 3) отличается тем, что отбор трансформированных тканей начинается со стадии регенерации. После баллистической трансформации ткань выдерживается на среде (А) в течение 10-12 дней. Длительное выдерживание ткани на среде индукции морфогенного каллуса позволяет исключить случаи транзиентной устойчивости, которая исчезает через 14 дней после трансформации. При пересадке каллусов на среду регенерации начинается процесс селекции (таблица 3). Известно, что гербицид РРТ , не ингибирует хлоропластную изоформу фермента глутамин синтетазы пшеницы (Г. aestivum L.), однако корневая изоформа чувствительна к воздействию данного гербицида. Таким образом, определяющее . воздействие гербицида на растительную ткань производится в момент регенерации/укоренения в течение 2-4 недель регенерации в зависимости от скорости развития побегов и в течение 4—6 недель на стадии укоренения. Развитие мощной корневой системы является главным качественным показателем устойчивости ткани к воздействию гербицида. Эффективность трансформации генетической конструкцией psGFPBAR с использованием регенерационной системы селекции составила 5%. Сходные результаты получены с использованием регенерационной системы при трансформации генетической конструкцией pGSTBAR, эффективность трансформации составила 4.86%, а частота трансформации, рассчитываемая на основе первичных трансформантов, получена 6,43% (таблица 4).

Методика регенерационной системы селекции в условии проведенного эксперимента показала максимальное значение эффективности трансформации

4 86%-5%, что значительно превышает эффективность трансформации, оцененную для градационной и отложенной системы селекции 0 85% и 0 65% соответственно (таблица 4)

Анализ наследования гена bar у трансгенных линий пшеницы Т1

Для изучения наследования устойчивости к гербициду БАСТА было оценено потомство 11 линий мягкой пшеницы из 23 линий ТО, прошедших селекцию и давших регенерацию на среде селекции/регенерации in vitro В числе анализируемых растений были использованы, как истинные трансформанты (линии 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11) подтвержденные ПЦР анализом на наличие копии гена bar (Рис 7 (2, 3 )) так и не содержащие последовательности гена bar те ложные трансформанты (1, 2,3,9)

Результаты проведенного опыта для поколения Т1 представлены в (таблице 5) Линии растений ложных трансформантов не были устойчивы к воздействию гербицида и увядали наравне с контрольными растениями исходного сорта Лада Устойчивость к гербициду была отмечена только у растений истинных трансформантов Для определения наличия копии bar гена у устойчивых растений был проведен ПЦР анализ растений GST 8, GST 10 и GST 11 (таблица 5)

В результате проведенного анализа определено, что два растения (GST10 и GST11), несли ген bar во всех выживших после обработки гербицидом растениях

Таблица 5 Анализ наследования устойчивости к гербициду БАСТА и ПЦР анализ наличия/отсутствия гена bar (для линий 8,10 и И) трансгенных растений мягкой

Название Количество Устойчивые Не Модель Х'тест

линии зерен ТО растения Т1 / ПЦ(>"+" устойчивые растения Т1

GST4 125 23 102 1/3 0 08836

GST5 37 25 12 3/1 0,296452

GST6 105 28 77 1/3 0,693282

GST7 47 31 16 3/1 0,152242

GST8 49 31/7 18 3/1 0.057827

GST10 103 62/62 41 3/1 0,00052

GST 11 93 72/72 21 3/1 0,590014

В результате проведенного анализа определено, что два растения (GST10 и GST11), несли ген bar во всех выживших после обработки гербицидом растениях По-видимому, причина устойчивости и выживания после обработки гербицидом растений линии GST8 определяется химерным строением растительной ткани Для всех растений линий GST10 и GST11, прошедших обработку гербицидом характерно наличие копии гена bar подтвержденное с помощью ПЦР

Определение устойчивости трансгенных растений Т1 поколения к хлоридно-натриевому засолению

Одной из целей работы было изучение влияние экспрессии гетерологичного гена gst, на солеустойчивость растений-трансформантов. Поэтому для трансформации использовали векторную конструкцию pGSTBAR, содержащую не только селективный ген bar, но и целевой ген gst, кодирующий синтез фермента глутатион-8-трансферазы. Антистрессовые действия фермента глутатионового цикла глутатион-Б-трансферазы обусловлены детоксикацией свободных радикалов органического происхождения, которые образуются в результате абиотических и биотических стрессов (засуха, засоление и т.д.).

В качестве предварительной оценки абиотического стресса нами выбрано засоление, или высокая концентрация соли в среде для проращивания семян.

С целью определения устойчивости к хлоридно-натриевому засолению полученных трансгенных растений нами получена кривая доза-эффект выживания контрольных растений полученных путем проращивания зрелых зерен на культуральных средах, содержащих NaCl. Для этой цели нами использованы различные концентрации хлорида натрия: 50 тМ, 100 шМ, 150тМ, 200тМ и 250тМ. В качестве контроля, использована среда, не содержащая NaCl. Для избежания неравномерного прорастания, зерна предварительно проращивали в стерильных условиях до размера побега 0,5 см и в последующем высаживали на среду, содержащую различные концентрации хлорида натрия. На среде с NaCl растения выращивали 7 дней с ежедневным замером длины побега.

Определено, что концентрация 200 mM NaCl оптимальна для оценки устойчивости к засолению у полученных трансгенных растений при прорастании семян. Контрольные, нетрансгенные растения на среде с 200 тМ NaCl росли медленно, до 3-4 см в неделю. Контрольные растения на среде, не содержащей NaCl, превышали размер 12 см.

Для оценки солеустойчивости выбраны трансгенные растения линий (13, 14, 16 и 22) Т1 поколения, полученные от самоопыления ТО. Согласно расщеплению, среди растений Т1 следовало ожидать разделения на устойчивые трансгенные растения, содержащие ген gst и неустойчивые, нетрансгенные растения (отрицательные гомозиготы). По истечению недели проращивания на среде с 200 mM NaCl, были определены устойчивые к засолению только растения GST 14 (Рис 8, 9; таблица 7) которые оценивали с помощью ПЦР на наличие гена gst (рис 10).

Рис. 8 Проростки, полученные из зерен растения GST14 проявившие устончивость к воздействию солн в концентрации 200 тМ (слева) в сравнении с не трансгенными контрольными растениями (с права)

Анализируемые трансгенные растения линии GST 14, как и ожидалось разделялись на две группы Первая группа растений опережала в развитии контрольные нетрансгенные растения, находящиеся на среде с 200 mM NaCl, соответствуют лункам электрофореграммы на рис 10 (а) 2-14 и 10 (б) 2-11, 13,14

Таблица 7. Оценка трансгенных растений на устойчивость к повышенному содержанию соли NaCl в среде____

Название Количеств Растения Т1 Растения Т1 не Модель x¡гест

линии о зерен ТО устойчивые к 200 mM NaCl устойчивые к 200 mM NaCl

GST 13 25 - 25 - -

GST 14 32 23 9 3/1 0,683091

GST 16 26 . 26 -

GST22 12 4 8 1/3 0.504985

Вторая группа, растений развивающихся наравне с контрольными нетрансгенными растениями, на среде с солью, соответствуют лункам пектрофореграммы на рис 10 (а) 15-17 и 10 (б) 12 Проведение ПЦР анализа показало, что только растения первой группы содержат ген gst определяющий устойчивость к абиотическим стрессам Таким образом, показано, что трансгенные растения, имеющие копию гена gst, проявляют устойчивость к засолению в среде для проращивания Растения, определенные как нетрансгенные по гену gst с помощью ПЦР анализа, не показывали устойчивости к хлоридно-натриевому засолению

s 14 " 12 § 10 ь. 0 в 1 « г 4 l2J 1 «о 1 «200 ! ■ 200 опыт GST 14

3 4 5 6 7 время проращивания, дни

Рис 9. Предварительная оценка устойчивости трансгенных растений к хлоридно-натриевому засолению 0 — нетрансгенные контрольные растения, выращенные на среде без соли; 200 — нетрансгенные контрольные растения, выращенные на среде с 200 mM NaCl; 200 опыт GST 14 — трансгенные растения линии GST14, выращенные на среде с 200 mM NaCl; Рис 10. Электрофореграмма ПЦР анализа трансгенных растений по гену gst, определяющему устойчивость к воздействию соли N801 а-1- М\УМагкег1 кЬ, 2-17 анализируемые образцы, 18 плазмида рСвТВАК 6-1- М\УМагкег1 кЬ, 2-14 анализируемые образцы, 15 негативный контроль пшеницы, 16 ММ, 17 плазмида рСвТВАЯ

выводы

1. Впервые показан стимулирующий эффект кратковременного воздействия (48 ч.) низкой температуры (+4°С) на частоту индукции морфогенетического каллуса.

2. Определен оптимальный фитогормональный состав среды для повышения частоты регенерации in vitro растений мягкой пшеницы сорта Лада (Triticum aestivum L.), позволяющий достигать регенерацию растений с частотой до 90%.

3. Оптимизированы параметры баллистической трансформации мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) сортов Лада, Эстер и Мис, с использованием биобаллистической установки PIG. Давление гелия при выстреле — 6 атм., расстояние от источника частиц до ткани мишени (каллус) — 12 см.

4. Определен оптимальный срок проведения генетической трансформации, который соответствует 10-14 суткам культивирования, после инициации морфогенетического каллуса.

5. Показано, что при использовании регенерационной методики селекции трансгенной ткани мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Лада возможно получение трансгенных растений мягкой пшеницы с эффективностью 5%.

6 Получена выборка трансгенных растений мягкой пшеницы сорта Лада, несущих гены gfp и bar (14 независимых трансгенных событий) и выборка из 17 трансгенных растений, полученных от независимых трансгенных событий несущих гены gst и bar

7 Показана устойчивость к гербициду широкого спектра действия БАСТА в Т1 поколении полученных трансгенных растений с генами gst и bar

8 Выявлена повышенная по сравнению с контролем устойчивость к 200 шМ хлорида натрия у растения Т1 поколения содержащего ген gst

1 Гапоненко А К , Маркеев А Н , Мишуткина Я В , Фадеев В С "Пути и

сельскохозяйственных культур " Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений Краснодар, 2003 С 156-170

2 Фадеев В С , Гапоненко А К "Оптимизация параметров баллистической трансформации пшеницы (Triticum aestwum L) 2-ая научная конференция Московского общества генетиков и селекционеров Актуальные проблемы современной генетики 2003 С 208

3 Гапоненко А К , Маркеев А Н , Нескородов Я Б , Фадеев В С "Модификация и моделирование метаболических путей III Съезд ВОГИС Москва 6-12 июня 2004 С 473

4 Гапоненко А К, Фадеев В С Использование эффективной системы баллистической трансформации дня почучения трансгенных растений мягкой пшеницы устойчивых к абиотическим стрессам Proceeding of the XVth International Plant Protection Congress, Beijing, China, May 11-16, 2004, P 512

5 Gaponenko А К, Fadeev V S Разработка системы генетической трансформации для создания растений мягкой пшеницы устойчивых к клопу вредная черепашка (Eurvgaster integriceps Put) ' Second International Conference on Sunn Pest, ICRDA, Aleppo, Syria 19-22 July,2004, P 37-38

6 Фадеев В С , Блинкова О В , Гапоненко А К "Оптимизация биологических и физических параметров биобаплистической генетической трансформации мягкой пшеницы (Triticum aestivum L) проводимой с использованием установки Particle Inflow Gun " Генетика, 2006, Т 42,№4 С 507-518

7 Фадеев В С Гапоненко А К ' Создание высоко эффективной системы генетической трансформации мягкой пшеницы дчя получения трансгенных растений устойчивых к клопу Вредная черепашка" Arab journal of plant protection, 2006, (in print)

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

проблемы создания трансгенных растений

важнейших

1,25 печ. л._Зак. 616._Тир. 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

I