Экспериментальный морфогенез и биотехнология получения гаплоидов в культуре микроспор пшеницы

Анапияев, Бахытжан Бейсенбекович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментальный морфогенез и биотехнология получения гаплоидов в культуре микроспор пшеницы
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальный морфогенез и биотехнология получения гаплоидов в культуре микроспор пшеницы"

На правах рукописи

АНАПИЯЕВ БАХЫТЖАН БЕЙСЕНБЕКОВИЧ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ МОРФОГЕНЕЗ И БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДОВ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР ПШЕНИЦЫ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

06.01.05- селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2001

Работа выполнена в Институте физиологии, генетики и биоинженерии растений Национального центра по биотехнологии Республики Казахстан

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор,

член-корр НАН РК Рахимбаев И Р.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шамина З.Б

доктор биологических наук, профессор, Гапоненко А К

доктор сельскохозяйственных наук Смолин В П

Ведущая организация. Московский государственный университет им М В Ломоносова, Биологический факультет, кафедра физиологии растений

' .у

Защита состоится "У " 2001 г. в _" часов на заседании

Диссертационного Совета Д 220 043 10 в Московской сельскохозяйственной академии имени К.А. Тимирязева

Адрес: 127550, Москва, Тимирязевская ул д 49 Ученый совет МСХА

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦНБ МСХА.

Автореферат разослан _" Ї 2001 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ^ Г И Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современные направления селекции и генетики сельскохозяйственных культур ориентированы на использование достижений биотехнологии растений. Среди. биотехнологических методов ускорения селекционного процесса самым оптимальным и экологическим абсолютно безвредным является, применение > методов гаплоидной технологии. В частности показано, что отбор по маркерным признакам у гаплоидной технологии по сравнению с отбором в F4 было в 5-6 раз эффективнее (Howes et. al., 1998). Существующая гаметоклональная изменчивость наблюдаемая при применениии гаплоидов не может быть препятствием для использования гаплоидов в селекции пшеницы (Baenziger et. al., 1991). В настоящее время есть много экспериментальных примеров подтверждающих эффективность и применимость гаплоидной биотехнологии в селекции зерновых культур (Murigneux et. al, 1993). .. -

В экологической селекции пшеницы на устойчивость, новые линии и сорта наряду с устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды (засухоустойчивость, солеустойчивость, устойчивость к болезням и др.) должны сочетать в себе высокую урожайность и хорошие технологические качества зерна., Гаплоиды позволяют за короткое время получать из гибридных популяции гомозиготные, константные линии,' использование которых в селекционных программах значительно сокращает время получения новых высокопродуктивных сортов. Гаплоиды • являются уникальным и перспективным объектом для клеточной селекции и генетической инженерии растений. Установлено, что чужеродные гены (рекомбинантная ДНК) введенная в растительную клетку, в последующих репродукциях расщепляются по 'закону Менделя (3:1). Поэтому для генетической стабилизации трансформантов очень' эффективным и перспективным , в теоретическом и в практическом плане является использование гаплоидных клеток (Anapiyayev et. al., 1997). - '

, Для зерновых злаков разработано несколько методов получения гаплоидов (метод "бульбозум", культура репродуктивных органов) среди которых более эффективным для . массового получения растений-регенерантов является метод культуры изолированных пыльников и микроспор. Проблеме культуры изолированных пыльников и микроспор посвящено • множество экспериментальных работ и обзорных статьей и монографий (Бутенко, 1975, Хохлов и др., 1976; Шамина, 1981; Суханов, 1983; Дьячук, Дьячук, 1989; Picard et. al., 1990). .. Однако, несмотря на некоторые успехи в настоящее время этот метод все еще не находит широкого применения в практической селекции из-за недостаточного развития теоретических разработок, низкого выхода растений-регенерантов и других факторов. . - .

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сольског эз академии

Цели и задачи исследований. Целью данного исследования являются изучение закономерностей процессов морфогенеза и регенерации растений, разработка и усовершенствование гаплоидной биотехнологии в культуре изолированных микроспор пшеницы Для этого необходимо было решить следующие задачи

1 Выявление путей развития микроспор пшеницы in vitro, приводящих к образованию многоклеточных комплексов (МК), способных формировать эмбриоиды и морфогенные каллусы,

2 Цитоэмбриологические и биохимические исследования закономерностей процессов морфогенеза и регенерации растений из эмбриоидов и каллусных структур,

3 Разработка и усовершенствование гаплоидной биотехнологии в культуре микроспор пшеницы для получения эмбриоидов, морфогенных каллусов и растений-регенерантов из различных преспективных межсортовых, межлинейных, межвидовых и межродовых гибридов пшеницы,

4 Использование усовершенствованной гаплоидной биотехнологии в экологической селекции пшеницы на устойчивость к аботическим и биотическим факторам окружающей среды

5 Создание константных андроклиниых дигаплоидных линий (АДГ) и изучение их хозяйственно-ценных показателей и генетической стабильности

6 Внедрение высокопродуктивных АДГ линий в селекционные программы по созданию ценных форм и сортов пшеницы, устойчивых к неблагоприятным факторам среды

Научная новизна и практическая ценность Проведено комплексное физиолого-биохимическое, цитоэмбриологи-ческое и генетическое исследование с одноклеточного уровня микроспор, формирования многоклеточных комлексов по-этапно до организменного уровня дигаплоидных линий, что позволило разработать и усовершенствовать гаплоидную биотехнологию пшеницы В результате цитоэмбриологических исследований развития микроспор в культуре in vitro выявлены осовные пути формирование МК, способных формировать эмбриоиды и морфогенные каллусы - путь А1, путь В1 и путь Е При развитии микроспор по пути Е происходит образование МК путем прямого деления В процессе морфогенеза регенерация растений осуществляется через эмбриоидогенез (первичный, вторичный) и органогенез (геммогенез, гемморизогенез) В качестве биохимических маркеров морфогенеза могут быть использованы ключевые ферменты метаболизма, такие как, а-амилаза, нитратредуктаза, глютаматдегидрогеназа и ферментный комплекс малатдегидрогеназа -гл ютам ато ксал оацетатам и н отран сфераза

биотехнология, которая может быть успешно использована в практической селекции зерновых культур, клеточной селекции и генетической инженерии растений. Продемонстрированы возможности использования гаплоидной биотехнологии в экологической селекции пшеницы, на устойчивость к абиотическим (ржавчинные болезни и септориоз) и биотическим (селекция на засухоустойчивость) факторам < окружающей среды. Л Для создания засухоустойчивых АДГ линий использованы гибриды несущие гены RL1 и RL2, которые контролируют доминантный признак "свернутые листья". Исследованиями установлено, что введение указанных генов улучшают водный режим и способствуют повышению засухоустойчивости растений. Для экологической селекции пшеницы на устойчивость к ржавчинным (бурая, желтая, стеблевая) болезням и септориозу использован источник гена Lr 24, который- является эффективным для регионов , Казахстана возделывающих пшеницу. * ■•• ." „••

Разработанная и усовершенствованная гаплоидная биотехнология успешно использована в культуре микроспор > сортов и . межсортовых, отдаленных межродовых и межвидовых гибридов Triticum ' aestivum, ¿, Triticum durum, Aegilops cylindrica, Aegilops triaristata, , Triticum thimopheevi, Triticum turanicum, Triticum turgidum,Triticum dicoccoides, Triticum militina, Triticum ■ kihara. В . результате использования усовершенствованной гаплоидной биотехнологии созданы более 370 перспективных АДГ. линий из различных гибридов пшеницы., Выделены . ценные номера АДГ линий, которые по урожайности, устойчивости к . неблагоприятным факторам окружающей среды (засуха, ржавчинные болезни и др.), технологическим характеристикам зерна (содержание белка, клейковины, твердозерность и др.) значительно превосходят контрольные сорта. В результате исследования спектров запасных белков (глиадины, глютенины) в Н1-Н7 репродукциях показана генетическая стабильность и , чистота АДГ линий. Высокопродуктивные АДГ линий г внедрены в селекционный процесс, проходят конкурсное сортоиспытание и могут быть основой создания ценных линий и новых , сортов. Ценные дигаплоидные линии используются в прикладных и фундаментальных • исследованиях совместно с КазНИИ земледелия (п. Алмалыбак, Алматинская обл.), НИСХИ (пгт. Гвардейский, Жамбылская обл.), КазГНУ им. Аль-Фараби (г.. Алматы), Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина (г. Алматы), Институт общей генетики РАН (г. Москва),. _: Сельскохозяйственный университет ■ (г. Файсалабад, Пакистан), Международной - организации по улучшению пшеницы и кукурузы CIMMYT (г. Анкара, Турция), Институт исследова-ния пустынь университета им. Бен-Гуриона (г. Седе Бокер, Израиль), Институт биохимии университета им. Г. Гейне (г. Дюссельдорф, Германия) и др.. ,

Теоретические подходы и методические разработки усовершенствованной гаплоидной биотехнологии могут быть использованы и адаптированы и для

других важных сельскохозяйственных культур и видов растений, в клеточной селекции и генетической инженерии растений

Методы исследований и результаты работы включены в "Методические рекомендации по культуре пыльников и изолированных микроспор ячменя и пшеницы» (Кударов и др, 1990), в учебник "Биотехнология растений' (Валиханова, 1997) и используются при чтении спецкурсов 'Биотехнология растений", входящих в программы учебного процесса кафедры физиологии и биохимии растений Биологического факультета КазГНУ им Аль-Фараби, кафедры Биотехнологии Аграрного университета и других высших учебных заведений

Апробация работы. Результаты исследовании и основные положения диссертации докладывались на Международных, Всесоюзных и Республиканских научных конгрессах и конференциях конференциях молодых ученых КазГНУ (Алматы, 1988,1990), МГУ (Москва, 1989), Уфа (1989), Республиканской научно-практической конференции "Повышение продуктивности и устойчивости зерновых культур" (Алматы, Целиноград Алматы, 1988, 1990, 1991, 1999) Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алматы, 1988, 1989), Международном симпозиуме по эмбриологии и семенному размножению (Санкт-Петербург, 1990), 1I-IV съезде ВОФР (Минск, 1990, Санкт-Петербург, 1993, Москва, 1999), ! Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино-на-Оке, 1990), Всесоюзной конференции "Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды (Новосибирск, 1991), V конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991), И Международной конференции Биология растительных клеток и биотехнология (Алматы, 1993), VII Международном конференции Биология клетки растений m vitro Биотехнология и сохранение генофонда (Москва, 1997), Международной конференции «Состояние и перспективы развития биотехнологии растений» (Алматы, 1997), Международной конференции «Проблемы экологии АПК и охраны окружаюшей среды (Акмола, 1997, Тараз, 1998, Усть-Каменогорск, 2000), Международной научно-технической конференции «Почвозащитная система и зерновое пр-во на Евразииском континенте в XXI в (Акмола, 1998), 11 Международном конгрессе FESPP (Варна, Болгария, 1998) Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы стрессовых ответов у растений» (Москва, 1998), VI Международной конференции по развитию пустынных земель (Каир, Египет, 1999), Всероссийском симпозиуме по изучению генома и генетической трансформации растений (Иркутск, 1999), Международном симпозиуме по растению и биотехнологии (Тулуза, 2000), 11-ой Международной конференции по анеуплоидии пшеницы (Новосибирск, 2000), VI Международной конференции пшеницы (Будапешт, Венгрия, 2000), Втором Международном Балканском ботаническом конгрессе (Стамбул, Турция, 2000), Международной конференции по биотехнологии

(Степногорск, 2000); Международном семинаре презентации инновационных научно-технических проектов Биотехнология 2000 (Пущино; 2000); Научных семинарах кафедры физологии и биохимии растений КазГНУ. им.. Апь-Фараби, Лаборатории роста и устойчивости Института физиологии, генетики и биоинженерии растений, Центра биологических исследовании (Сегед, Венгрия), Биотехнологическом центре Венгрии (Годолло,, > Венгрия), Лаборатории по-г биотехнологии растений Национального института биотехнологии и генетической инженерии растений (Файсалабад, Пакистан), Интитуте . исследования пустынь университета Бен-Гуриона (Седе , Бокер, Израйль), расширенном семинаре отдела биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений (Москва, Россия).и кафедры биотехнологии МСХА им. К.А. Тимирязева (Москва, Россия). . ,

Публикации. Основные положения диссретации отражены в 97 печатных работах опубликованных в отечественных и зарубежных изданиях, включая две монографии и одну заявку на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 210 страницах . машинописного текста. Состоит из введения, основной части, включающей следующие разделы: обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты исследования - и их обсуждение, заключения, ■■ выводов, рекомендации по использованию полученных результаов и приложения. Содержит . 23 таблиц, 42 рисунков. Список использован-ны* источников содержит 373 ссылок, из них 217 на иностранных языках.; . . . .V;

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили растения следующих сортов мягкой яровой и озимой пшеницы . ТгШсит аезЧтт /,.: . Казахстанская .3; ^Казахстанская 4; Казахстанская 5; Казахстанская 7; .Казахстанская 10; .Казахстанская . 17; Лютесценс 70; Саратовская, 29; Саратовская 42; Эритроспермум 116; Красноводопадская 210; линия Грекум 476; Изогенная линия Ьг. 24; Алма-Атинская полу карликовая; Безостая 1 и их гибриды с участием моносомных линий (Табл.2.1Л). Межсортовые гибриды мягкой пшеницы с источником гена Ьг 24: Лютесценс 70 х Ьг. 24, Из; Казахстанская 17 х Ьг. 24, Рз; Межсортовые и межлинейные гибриды яровой и озимой мягкой пшеницы: Д - 6; Д - 7; Д - 33; Б - 5; Б - 10; 1758; 398; 248; 247; 205/96; К-6; 416; 5Д Ш - 3; 7А Ш-5; Ш6-Ш12; 23/96; 6/96; 2/96 и др

Использованы также отдаленные межродовые, межвидовые гибриды: Безостая 1 х Ае&1ор$ суИпс1пса\ Безостая 1 х Aegilops ¡пагшаю; Казахстанская 10 х ТгШсит ИторИееуг, ТгШсит решсит.х ТгШсит Шгатсит; ТгШсит ретсит х ТгШсит гиг&йит. ЦТ 304 х ТгШсит ЮИага Р2; ЦТ 304 х ЦТ 321 Р2; ЦТ 304 х ТгШсит (Псос. Р2; ЦТ 321 х ТгШсит Шага

ЦТ 314 X Triticum thimoph F2, ЦТ 683 x Triticum ikimoph F2 , Стекловидная 24 x Triticum Kihara F2; Жетысу x Triticum mihtina F2,

Сорта и гибриды твердой пшеницы Triticum durum Акшам, Харьковская 46, К 54954 х Загорка Fa, Гергана х Новинка 3 F6, К 21-025 х Загорка F6, Средец x 0109775 F3, Гергана х Айсберг Ь"(, Лозен х Новинка Fs; Гибриды использованы в нескольких (Fr F6) поколениях Для культуры изолированных пыльников и микроспор использованы и дигаплоидные линии АДГ 1027, АДГ 1034, АДГ 1053 и АДГ 1054, созданные нами с использованием гаплоидной биотехнологии Растения выращивались в полевых условиях Алматинской обл. на опытных участках КазНИИ земледелия и экспериментальных участках ИФГБР на темно-каштановой почве

Культуру изолированных пыльников и микроспор осуществляли по модифицированному методу (Анапияев Б Б и др, 1994) Для культивирования изолированных пыльников и микроспор пшеницы использовали как твердые, так и жидкие модифицированные среды на основе MC, N6 и Blaydes (Murashige & Skoog, 1962, Chu, 1978, Blaydes, 1966) Культуру изолированных микроспор осуществляли по методу Puolimatka и других (1996) с нашими модификациями (Анапияев, 2001)

Для цитоэмбриологических и биохимических исследований материалом служили генеративные органы (пыльники и микроспоры) пшеницы, развивающиеся in vivo и in vitro, андроклинные структуры (эмбриоиды, глобулы, каллусы) и зиготические зародыши. Постоянные микротомные препараты готовили по общепринятой методике (Паушева, 1988) Окраску проводили реактивом Шиффа с подкраской гемотоксилином по Эрлиху и алциановым синим. Все препараты анализировали и фотографировали под микроскопом (МБИ-15). Препараты для сканирования под электронным микроскопом (Hitachi, Japan) готовили по методике Sunderland и др, (1984) Цитоэмбриоло-гические исследования проведены совместно с сотрудниками лаборатории эмбриологии и репродуктивной биологии института Ботаники им В Л Комарова РАН (г Санкт-Петербург) согласно Договору о творческом содружестве

Для исследования устойчивости АДГ линий выращивали на инфекционном питомнике Казахского института земледелия им BP Вильямса (Алматинская обл ) и НИСХИ (Жамбылская обл ) В качестве инифицирукмцего агента использовали расы стеблевой Рисстш gramims Pers, желтой Рисстш striiformis West, бурой Рисстш recóndita Rob ex Desm В качестве возбудителя септориоза использовали две расы Septoria nodorum Berk, и Septoria tritici Desm Опыты и статистический анализ полученных результатов проводили по общепринятой методике (Рсалиев, 1999, Рсалиев, Сарбаев, 1999)

Для биохимического исследования андроклинных структур Экстракцию белков проводили 0,05 M трис-HCl буфером pH 7,5, содержащим 0,1 M KCl и 0,02 M меркаптоэтанола при температуре 4 °С в

течение 30 мин. Содержание белка определяли по Бредфорду (Bredford, 1972). Электрофорез глиадинов проводили по методу Попереля и др., (1989). Биохимическое изучение глютенинов проводили по методике описанной Булатовой (1989). Технологические свойства • зерна определяли общепринятыми методами по содержанию и качеству клейковины (Надиров, 1988). - • ...

Электрофоретическое определение амилолитических ферментов проводили по методу, предложенному Дарканбаевым Т.Б. и Фурсовым О.В. (1981) . Электрофорез в денатурирующих условиях проводили по методу Лэммли (Laemmly, 1970).

, Ферментативную активность нитратредуктазы in vivo определяли по модифицированному методу (Jones, Maire, 1984). Растительный материал или каллусную ткань помещали в реакционную смесь, содержащую SO мМ калий-фосфатного буфера, 100 M НАДН, конечный объем смеси составил 1 мл. Реакция начиналась добавлением раствора НАДН, в последующем, смесь инкубировали в течение 30 мин. при 26 0 С. Реакцию останавливали добавлением 0,12 % раствора нафтилэтилендиамина дигидрохлорида в дистиллированной воде. После развития окрашивания, через 15 мин. пробы спектрофотометрировали при 548 нм (Bekman, DU-64, USA). „ Активность нитратредуктазы in vitro определяли по модифицированному методу (Львов, Сафаралиев, 1988). : Расчет количества нитратов проводили, пользуясь градуировочной кривой, построенной на основе использовании в качестве стандарта дважды перекристаллизированной соли азотнокислого натрия. Активность нитратредуктазы выражали в наномолях нитрата, образовавшегося за 1 мин. в расчете на 1 г сырого материала. - •

Исследование активности глютаматдегидрогеназы проводили : по модифицированному методу (Султанбаев, 1991). Для определения активности ферментного комплекса „ малатдегидрогеназы . • и глутаматоксалоацетатаминотрансфераэы ФК [МДГ+ГОАТ] использовали метод описанный проф М.К. Гильмановым и др. (1990). ■ .

. Все экспериментальные данные анализированы и статистически обработаны с ■ применением общепринятых : методик • (Урбах, 1975; Валиханова и др., 1989; Суханов, 1987). •

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ МОРФОГЕНЕЗ И РЕГЕНЕРАЦИЯ

РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР ПШЕНИЦЫ IN VITRO 3.1. Развитие ммркоспор пшеницы in vitro ■ ■ - -

В настоящее время интенсивно исследуются механизмы переключения микроспор на спорофитную программу развития и пути деления микроспор, приводящих к формированию эмбриоидов и каллусных структур (Zeng, Ouyang, 1980; Суханов, 1983). Однако, вопрос о путях развития микроспор in vitro, приводящих к формированию андроклинных структур остается

нерешенным (Горбунова и др, 1993) В связи с этим нами проведены цитоэмбриологические исследования развития микроспор in vitro и формирования из них многоклеточных комплексов (МК), способных формировать эмбриоиды и каллусы в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы ш vitro

Результаты многочисленных наблюдений за развитием микроспор пшеницы in vitro позволили выявить ряд аномальных явлений и разрыв связи микроспор со стенкой пыльника и др Большинство микроспор приступало к процессам деления асинхронно В различные периоды развития микроспор наблюдалось слияние ядер, синхронное деление обеих клеток и другие явления. По результатам первого митотического деления, образующиеся структуры можно было подразделять по размерам клетки, их плотности и интенсивности окрашивания В первом случае (путь А) образовывались две «неравные» клетки, которые по размерам и плотности окрашивания отличались между собой Они были условно классифицированы на вегетативные (крупные и интенсивно окрашенные) и генеративные (мелкие) клетки

В первом типе «неравного» деления (путь А|) мы наблюдали как асинхронное, так и синхронное деление В последующем из активно делящейся вегетативной клетки образовывался многоклеточный комплекс (МК) Полость микроспор заполнялась крупными лепящимися клетками с хорошо выраженными клеточными стенками После 12-15 дней культивирования, МК имеющий вид сферы, по размерам в два раза превосходил исходные микроспоры

В тех случаях, когда после первого неравного деления происходило развитие генеративных клеток (путь Aj), вегетативная клетка уменьшалась в объеме и дегенерировала Генеративная клетка также претерпевала многочисленные деления и образовывала МК, заполняющий всю полость микроспор Однако для заполнения полости микроспор и их выхода из оболочки с формированием МК требуется больше времени и, следовательно, больше клеточных циклов депения, чем у вегетативных клеток На наш взгляд, это объясняется не только меньшими размерами генеративных клеток, но и их значительной детерминированностью по сравнению с вегетативными клетками

После первого неравного деления (путь Aj), которое встречалось реже, чем другие типы, также можно было наблюдать образование МК. При этом, как и при развитии по путям А| и Aj, не наблюдалось слияния вегетативных и генеративных клеток По отношению к поре микроспор расположение клеток также было различным

Во втором случае (путь В) после первого митотического деления образовывались «равные» клетки, которые не отличались между собой по размерам, плотности и интенсивности окрашивания При развитии по пути В| после «равного» деления, микроспоры вступали во второй митоз как синхронно, так и асинхронно В последующем из активно делящейся

/ "" :ч Шт.

Г ™ ' I j J 2 , '

Рис. 1. Развите микроспор пшеницы in vitro по пути Е.

1 -микроспора с плотной интенсивно окрашенной цитоплазмой, крупным центральным < ядром и тонкой оболочкой; 2-3 - деление микроспоры и формирование 2-х клеток, отделенных друг от друга клеточной стенкой; 4-6 — интенсивное деление клеток с формированием многоклеточной структуры.

вегетативной клетки образовывался многоклеточный комплекс (МК) Все клетки, заполняющие полость микроспоры (8-10 день культивирования) имели одинаковую форму и крупные размеры На 12-15 день культивирования общая оболочка сферы исчезала и формировалась глобулярная структура При развитии микроспор по пути В| для формирования МК требовалось меньше времени, как это наблюдалось при развитии микроспор по пути А]

При развитии микроспор после равного деления с образованием клеток генеративного типа (путь Вг), также происходит формирование МК, но гораздо медленнее Вегетативные клетки превосходили генеративные не только по размерам и плотности окрашивания, но и опережали их по времени развития и формирования МК

Однако после первых делений дальнейшее развитие микроспор не всегда приводило к формированию МК Данные наших исследований позволяют предположить наличие и третьего пути развития микроспор пшеницы in vitro, которая названа нами как эмбриогенный путь развития микроспор (путь Е) При этом происходит интенсивное деление клеток меристематического типа с образованием эмбриоидов и/или морфогенных каллусов, способных к регенерации растений (Рис.1) На наш взгляд путь Е является самым благоприятным для быстрого образования эмбриоидов, которые формируются уже на 18-23 день культивирования При этом иногда наблюдалось слияние клеток (эндомитоз) во время первого митотического деления. Это исключительно важный процесс, который может быть источником образования дигаплоидных клеток, спонтанных дигаплоидов, регенерирующих из дигаплоидных эмбриоидов и/или каллусных тканей обладающих эмбриогенной способностью

По результатам цитоэмбриологических исследовании нами составлена схема путей деления микроспор пшеницы in vitro (Рис 2)

Как правило, при культивировании можно встретить с различной частотой все пути развития микроспор При этом между ними, возможно, существует "конкуренция", что повышает вероятность существования некоего механизма регуляции процессов деления и развития микроспор

Таким образом, андроклиния (андрогенеза in vitro) является специфическим типом размножения, который осуществляется в результате реализацией генетической программы спорофитоного развития компетентных клеток микроспор в культуре in vitro Клетки вегетативного типа, как менее детерминированные по сравнению с клетками генеративного типа, могут развиться в МК, способные к формированию эмбриоидов и морфогенных каллусных клеток (путь А] путь Bi) Результаты

цитоэмбриологических исследований ПО 1ВОЛЯЮТ предположить наличие и третьего пути развития, который обозначен как путь Е При этом происходит образование МК путем прямого деления микроспор в культуре in vitro

Рис.2. Пути развития микроспор пшеницы и формирования многоклеточных • комплексов in vitro.

3.2. Первичный эмбриондогенез в культуре микроспор пшеницы

В культуре изолированных пыльников и микроспор эмбриондогенез по происхождению и способу возникновения подразделяется на первичный, когда эмбриоиды развиваются непосредственно из МК, и вторичный -развитие эмбриоидов происходит из каллусных клеток.

Начальным этапом формирования эмбриоида является возникновение МК из микроспор и формирование проэмбрио Проэмбрио связано со стенкой пыльника "суспензором", через который, возможно, обеспечивается обмен веществ и питание развивающейся структуры (Рис. 3.) Дальнейшее развитие и дифференциация проэмбрио приводили к формированию глобулы и эмбриоидов Нарушение связи через "суспензор" вело к задержке развития проэмбрио и дальнейшей их дегенерации, или к дедифференциации и каллусогенезу Образовавшиеся таким путем каллусы обладали

морфогенным потенциалом и регенерация растений из них происходила через вторичный эмбриондогенез и органогенез (геммогенез, гемморизогенез)

Через 2-3 недели от начала культивирования наблюдалось формирование глобул из проэмбрио, через 3-4 недели происходило образование эмбриоида Эмбриоиды представляли собой плотные структуры овальной формы, имеющие зачатки корневых и стеблевых апексов (Рис 3) Своевременная пересадка таких эмбриоидов на среды для регенерации приводила к формированию растений-регенерантов, большая часть которых имела гаплоидный набор хромосом

При задержке пересадки эмбриоидов и дальнейшем культивировании их на индукционной среде, содержащей 2,4-Д (0,5 мг/л), наблюдалась их дедифференциация и превращение в каллус В этом случае регенерация растений осуществлялась путем органогенеза

В некоторых случаях наблюдалось явление полиэмбрионии формирование сросшихся эмбриоидов в полиэмбриоид. Полиэмбриоиды характеризовались образованием общего корня, в то же время они имели несколько щитков и точек роста

На основании результатов многолетних исследований процессов эмбриоидогенеза нами составлена схема (Рис 4), на которой отражены пути возникновения, развития, а также морфогенетический потенциал различных андроклинных структур (МК, проэмбрио, глобула, эмбриоид), формирующихся из микроспор пшеницы в культуре in vitro Инициальная микроспора характеризуется центральным расположением ядра, утонченной и слабо окрашенной оболочкой В результате первого митоза образовывались две равные клетки, последующее деление которых

Рис.3. Эмбриоидогенез (первичный) в культуре изолированных пыльников пшеницы

1-развитие проэмбрио из многоклеточных комплексов (МК) с "суспензором" связанных со стенкой пыльника; 2-дальнейшее развитие проэмбрио, разрыв стенки пыльника; 3-нарушение связи "суспензора" и дегенерация глобулярной структуры; 4-формирование глобул из микроспор пшеницы; 5-эмбриоид с зачатком корневых и стеблевых апексов (первичный эмбриоидогенез). -■■••• ,

приводило к формированию МК и проэмбрио. При культивировании изолированных микроспор наблюдалось образование своеобразных комплексов, за счет агрегации клеток микроспор вокруг МК и проэмбрио Между клетками микроспор и развивающимися структурами были обнаружены связывающие тяжи

Проэмбрио способен дифференцироваться, превращаясь в эмбриоид В то же время, на этом этапе возможна их дедифференциация и формирование морфогенного каллуса Дедифференциация и частичная дегенерация формирующегося эмбриоида наблюдались и на глобулярной стадии развития. При частичной дедифференциации глобул процесс морфогенеза в дальнейшем осуществляется через органогенез Причем, при каллусировании и дегенерации апикальной части наблюдался ризогенез, что затрудняло регенерационный процесс или даже полностью его исключало При каллусировании и дегенерации базапьной части, наблюдался процесс образования почек - геммогенез При пересадке геммогенных структур на среды для образования корней (ИУК 0,5 мг/л) можно было регенерировать вполне нормальные растения

Нами было исследовано влияние на частоту процессов эмбриоидогенеза состава питательных сред и генотипа донорных растений (Табл 3 2 1)

Таблица 3 2 1

Влияние генотипа и состава питательных сред на частоту процессов эмбриоидогенеза

СОРТА СРЕДЫ

В1ау<1е8 N6 Мурасиге-Скуга

Кол-во культир пылышко в % выхода "Э" Кол-во Культивир пыльников % выхода "Э" Кол-во культивир Пыльннкоа % выхода ИЭ"

Казахстанская 3 350 0,44 450 0,19 277 0.74

Казахстанская 4 380 1,84 120 0 80 135 0 87

Казахстанская 5 435 1,15 405 0.13 495 0,40

Казахстанская 7 1035 0,19 375 0.26 165 0,00

Саратовская 42 405 0,00 600 0.00 450 ООО

Саратовская 29 300 0,67 120 0,00 255 0 19

примечание « — эмориоидогенез,

На питательной среде Вкуёев максимальное образование эмбриоидов отмечено у сортов Казахстанская 4 и Казахстанская 5, у которых выход эмбриоидов составил 1,84 % и 1,15 %, соответственно У данных генотипов формирование эмбриоидов на питательной среде N6 и Мурасиге-Скуга было значительно ниже Для сорта Казахстанская 3 оптимальным является

Эмбриоид

Регенерация растений;

Рис. 4. Эмбриоидогенез (первичный); Критические периоды развития эмбриоида и пути регенерация растений в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы (Схема). 15

использование питательной среды Мурасиге-Скуга При этом выход эмбриоидов составил 0,74 %, тогда как на питательной среде ШауёеБ и N6 этот показатель снижается ступенчатообразно и составили 0,44 % и 0,19 %, соответственно Для сорта Саратовская 29 оптимальной для процессов эмбриоидогенеза является среда В1аус1е5, где выход эмбриоидов был значительно выше по сравнению с другими средами и составил 0,67 % Для сорта Саратовская 42 все использованные среды не были благоприятными для протекания процессов эмбриоидогнеза

Таким образом, в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы в процессе эмбриоидогенеза можно выделить несколько основных стадий проэмбрио, глобул и и эмбриоид, которые являются критическими и определяют дальнейшие пути морфогенеза Регенерация растений может происходить непосредственно из эмбриоидов образовавшихся в процессе первичного эмбриоидогенеза, а также из морфогенных каллусов, в процессе вторичного эмбриоидогенеза и органогенеза (геммогенез, гемморизогенез)

3.3. Морфогенез и регенерация растений в культуре андроклинных каллусов пшеницы

Каллусы отличаются от эмбриоидов более поздним периодом образования (30-35 день) и состоят из тканей рыхлой консистенции без каких-либо признаков дифференциации (Рис 5) По морфологическому строению андроклинные каллусы отличаются между собой Так, у сорта Казахстанская 4 выделены каллусы трех типов желтовато-рыхлый, белый плотный и светло-зеленый оводненный

Однако не все каллусы, полученные из микроспор были способны к дифференциации Этим свойством обладали только белые плотные каллусы После третьего пассажа на их поверхности образовывались белые плотные зоны вторичной дифференциации Сначала на поверхности таких каллусов обособлялся эмбриональный клеточный комплекс (ЭКК), который отличался от окружающих тканей наличием мелких

меристематических клеток с крупными ядрами (диаметр клетки 40-44 мкм, ядра 8-16 мкм) Паренхимные клетки, окружающие такие меристематические очаги морфогенеза, имели более крупные размеры (60-80 мкм) В результате многократных делений из ЭКК образовывались глобулы, которые в дальнейшем формировали вторичные эмбриоиды. Эмбриоиды представляли собой биполярные структуры с зачатками корневого и стеблевого апексов По расположению вторичные эмбриоиды подразделены на два типа 1) образующиеся на поверхности каллуса, 2) внутри активно делящихся меристематических центров каллуса В начальной стадии развития вторичные эмбриоиды были тесно связаны с каллусом

На более поздних стадиях наблюдалось отделение вторичных эмбриоидов от каллуса У них закладывалась автономная от каллуса проводящая система

Рис. 5. Каллусогенез в культуре изолированных пыльников пшеницы ' " in vitro. '• - '> ,.:■.-;■■.

1-формирование рыхлого каллуса внутри пыльцевого • мешка; . '2-гемморизогенез; 3- формирование плотного морфогенного : каллуса глобулярной формы внутри пыльцевого мешка; 4- формирование зон вторичной дифференциации на поверхности морфогенного каллуса.

На последующих этапах эмбриоиды были способны регенерировать растения В процессе каллусогенеза также существуют критические периоды 1) более позднее их появление (30-35 день), 2)дедифференциа-ция вторичных эмбриоидов на стадии проэмбрио и глобул При нарушении полярности развития глобулярных структур наблюдался процесс органогенеза, при котором регенерация растений осуществлялась путем геммогенеза и гемморизогенеза При ризогенезе - дальнейшая регенерация растений очень затруднена, практический невозможна. В том случае, когда из каллусных структур не происходила дифференциация вторичных эмбриоидов и органогенных структур, в них наблюдался процесс гистогенеза.

В наших опытах были созданы андроклинные каллусные линии способные к процессам регенерации растений в течение длительного периолда культивирования (до 36 месяцев и более), которые хорошо рекомендовали себя и в получении протопластов в суспенционной культуре Нами проведено исследование влияния состава питательных сред и генотипа на процент выхода каллусных структур в культуре микроспор яровой мягкой пшеницы (Табл 3 3 1)

Таблица З З I

Влияние генотипа и состава питательных сред на на частоту процессов каллусогенеза

СОРТА СРЕДЫ

Blaydes N6 Мурасиге-Скуга

Кол-во кудияр. пыльников % выхода *К" Кол-во куликвлр шпшпя % выход* "К" Кол-во культтанр пыльников % выхода "К"

Казахстанская 3 350 0 22 450 0.47 277 0,16

Казахстанская 4 380 2,36 120 0.18 135 0 74

Казахстанская 5 435 0,69 405 0,98 495 0.40

Казахстанская 7 1035 0,38 375 0,80 165 1,21

Саратовская 42 405 0,25 600 1,66 450 0,44

Саратовская 29 300 0 67 120 2,50 255 0,39

Примечание «К» - каллусогенез

На среде В1ау«1е8 максимальное образование каллусных тканей отмечен у сортов Казахстанская 4, Казахстанская 5 и Саратовская 29, у которых выход каллусов составил 2,36 %, 0,69 % и 0,67 %, соответственно На среде N6 максимальное каллусообразование отмечено у сортов Саратовская 29, Саратовская 42 и Казахстанская 5 При этом образование каллусов в расчете на 100 пыльников составило 2,50 % , 1,66 % и 0,98 %, соответственно. На питательной среде Мурасиге-Скуга у сорта Казахстанская 7 наблюдался максимальное каллусообразование по сравнению с другими средами и составила 1,21 %

Рис. 6 . Процессы морфогенеза и регенерации растений

в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы in vitro (Схема).

Таким образом, цитоэмбриологическое исследование процесса каллусогенеза позволили выявить наличие трех различных путей морфогенеза

I )Эмбриоидогенез (вторичный)),

2)Органогенез (геммогенез, ризогенез, гемморизогенез),

3)Гистогенез

В культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы процесс регенерации может осуществляться путем эмбриоидогенеза (первичный, вторичный) и органогенеза (геммогенез, гемморизогенез) При регенерации растений в культуре андроклинных каллусов (вторичный эмбриоидогенез и органогенез) по сравнению с регенерацией из первичных эмбриоидов, отмечено повышение частоты регенерации дигаплоидных растений Этот факт является важным, поскольку исключает процедуру дигаплоидизации с помощью колхицина и способствует сохранению жизнеспособности растений-регенерантов Изменяя условия культивирования (состав питательных сред, гормоны, предобработка донорных растений и др), можно регулировать процессы морфогенеза и частоту формирования эмбриоидов, каллусных тканей и растений-регенерантов

В результате проведенных экспериментальных работ в культуре изолированных пылышков и микроспор пшеницы создана воспроизводимая модельная система для получения гаплоидов и стабильной регенерации растений, которая успешно может быть использована в практической селекции, клеточной и генетической инженерии

4. БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССОВ

МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ АНДРОКЛИННЫХ КАЛЛУСОВ

ПШЕНИЦЫ

4,1. Активность ферментов амнлолитического комплекса и морфогенетнческнй потенциал андроклинных каллусов пшеницы.

Ферментные системы являются одним из основных и важных информативных биохимических параметров для оценки морфогенетического потенциала растительных культур, которые в последнее время используются как маркеры процессов морфогенеза Среди них гидролитические ферменты часто используются для исследования и характеристики морфогенетического потенциала растительных клеток в культуре in vitro (Jam et al, I486, Swarnkar, Bohra, 1987)

Нами были исследованы электрофоретические спектры и активность ферментов амилолитическош комплекса андроклинных каллусов пшеницы классифицированные как морфогенные и неморфогенные по

вышеуказанному методу на различных гормональных режимах и сроках культивирования in vitro. В результате изучения общей амилазной активности в морфогенных и неморфогенных каллусах пшеницы

Таблица 4.1.1.

Изменение общей амилазной активности в андроклинных каллусах пшеницы (Е акт. в мл/час). •.

Возраст Культуры 2,4-Д ; „-; 4 , ИУК .

Неморфоген ->■• ный каллус > Морфогенаый каядус Неморфогенный каллус Морфо генный Какпус

10 дней 74,0 94,0 90,0 120,0

20 дней 92,0 136,0 216,0 174,0

30 дней 200,0 278,0 102,0 - 268,0

культивированных на питательной среде МСК (0,5 мг/л ИУК) и МСС (2 мг/л 2,4-Д) обнаружено, что данный показатель зависит не только от типа исследуемого каллуса, гормонального режима, но и от сроков культивирования. На питательной среде с 2,4-Д общая активность амилаз у неморфогенных каллусов повышается ступенчатообразно, • достигая максимального уровня 200,0 (Е акт. в мл/час) на 30 день культивирования (Табл. 4.1.1.). На этой среде активность данного фермента у морфогенного каллуса также повышается в зависимости от сроков культивирования и по данному показателю • " превышает неморфогенный' каллус, достигая максимального значения на 30 день культивирования, где уровень активности достиг 278,0 (Е акт. в мл/час).

На питательной среде с МСЯ (0,5 мг/л ИУК) максимальный' уровень общей амилазной активности у неморфогенного каллуса отмечается на 20 день культивирования (216,0) и затем на 30 день в два раза снижается достигая значения 102,0. У морфогенного каллуса общая ■ активность ферментов амилолитического комплекса постепенно повышается достигая максимального уровня на 30 день культивирования (268,0). При анализе результатов' исследования 'активности амилаз морфогенных каллусов, отмечается закономерность постепенного повышения активности ферментов на обеих исследованных питательных средах. У неморфогенного каллуса отмечена нестабильность активности ферментов амилолитического комплекса. : • :

Известно, что гибберелловая кислота стимулирует активность ферментов амилолитического комплекса. В связи с этим нами было иследовано влияние гибберелловой кислоты на уровень ' " активности - ферментов амилолитического комплекса и на морфогенетический' потенциал андроклинных каллусов пшеницы. Нами отмечено, что в начальный срок

культивирования на питательной среде МС (2 мг/л ГК) у неморфогенных и морфогенных каллусов проявляется значительное повышение активности ферментов Затем активность постепенно снижается в зависимости от продолжительности сроков культивирования. Установлено, что гибберелловая кислота, повышая активность ферментов амилолитического комплекса, не влияет на морфогенетическую потенцию неморфогенного каллуса в исследованный срок культивирования

В следующей серии экспериментов, нами изучено электрофоретический спектр ферментов амилолитического комплекса морфогенных и неморфогенных андроклинных каллусов пшеницы По сравнению с морфогенным каллусом у неморфогенных каллусов в электрофоретическом спектре изоферментов амилазы меньше компонентов и они слабо окрашены Установлено, что в морфогенных и неморфогенных каллусах проявляется активность изоферментов а-амилаз "прорастания" Это указывает на возможность синтеза этого фермента в процессе клеточной дифференциации и развития в культуре in vitro

4.2. Активность ннтратредуктазы у морфогенных и неморфогенных андроклинных каллусов пшеницы.

Активность ннтратредуктазы исследуются в культуре клеток растений в связи с морфогенезом и соматическим эмбриогенезом (Ramband, Rambour, 1989) Обнаружено, что нитратредуктазная активность в эмбриогенных структурах достигает высокого уровня Показано, что свет, нитраты, а гакже коферменты НАДН и НАДФН могут стимулировать повышение нитратредуктазной активности в культуре растительных клеток in vitro (Khan, et. al, 1984; Pnvallaet al, 1989)

Нами изучена активность ннтратредуктазы в морфогенных и неморфогенных андроклинных каллусах, полученных в культуре микроспор дигаллоидной линии АДГ 1027 В первой серии экспериментов изучали активность ннтратредуктазы в морфогенных и неморфогенных каллусах без каких-либо воздействий и факторов индукции Обнаружено, что у морфогенного каллуса активность ннтратредуктазы значительно выше по сравнению с неморфогенным каллусом, и составила 7,0 и 2,0 (нМ N03 мг белка/мин), соответственно (Рис 7)

На наш взгляд, высокую активность ннтратредуктазы в морфогенных каллусах можно объяснить тем, что они состоят в основном из активно делящихся клеток меристематического типа

Во второй серии экспериментов нитратредуктазную активность изучали после индукции светом. При этом отмечено, что индуцебельная активность ннтратредуктазы у неморфогенного каллуса резко повышается, превышая по этому показателю морфогенный каллус В этом эксперименте активность

35 л

. -30 • ж

-1 I

и ' ^ •

гм

О 20

.25

2 15

□ Неморфогенный каллус

н-

I Морфогенный каллус

Рис.7. Активность нитратредуктазы в различных типах каплусной ткани, полученных в культуре изолированных микроспор пшеницы. ■ . . .--."..

активностьНРбез индукции; 2-индукция светом; , индукция нитратом; 4 — индукция светом и нитратом. ...

нитратредуктазы у морфогенного и неморфогенного каллуса составила 15,0 и 20,0, соответственно.

В следующих сериях экспериментов была _ изучена активность нитратредуктазы у морфогенных и неморфогенных каллусов после индукции нитратом и при одновременном воздействии светом и нитратом. Было также обнаружено, что "нитрат и совместное воздействие светом и нитратом повышает нитратредуктазную активность неморфогенного каллуса больше по сравнению с морфогенным каллусом. Активность нитратредуктазы при

индукции нитратом и совместно нитратом и светом у неморфогенного и морфогенного каллуса составила 16,0, 32,0 и 12,0, 20,0, соответственно.

Таким образом, учитывая, что исследуемые морфогенные и неморфогенные каллусы были получены из микроспор, изолированных с одного донорного растения, и культивировались в одинаковых условиях, можно полагать, что выявленные нами различия в интенсивности биохимических процессов, на примере одного из ключевых ферментов азотного обмена — нитратредуктазы, находятся только лишь в связи с разным уровнем клеточной дифференциации и степени развития На основании полученных результатов исследования очевидно, что для оценки морфогенетического потенциала андроклинных каллусов пшеницы на ранних этапах культивирования, как один из биохимических критериев, можно использовать показатель активности одного из ключевых ферментов азотного обмена — нитратредуктазы.

4.3. Изучение активности глютаматдегидрогеназы в андроклинных каллусах пшеницы

Реакции, катализируемые глютаматдегидрогеназой, лежат на стыке азотного и энергетического обменов, вследствие этого данный фермент играет ключевую роль в метаболизме растений

Результаты наших исследований показали, что в бесклеточных экстрактах морфогенных каллусов обнаруживаются зоны глютаматдегидрогеназы, строго специфичной к коферменту NADP Зона NADP-глютаматдегидрогеназы обнаруживается только при проявлении с коферментом NADP и зависит от присутствия в проявляющей смеси глютаминовой кислоты - субстрата ГДГ При электрофоретическом разделении бесклеточных экстрактов обнаружено, что специфичная к коферменту NAD(P) глютаматдегидрогеназа обнаруживается как в морфогенных, так и в неморфогенных андроклинных каллусах пшеницы В то же время, глютаматдегидрогеназа специфичная к коферменту NADP (NADP-ГДГ) обнаруживается только в каллусных линиях на ранних этапах морфогенеза, характеризующихся как эмбриогенные В культуре гаплоидных морфогенных каллусов возможно имеются эндогенные факторы эмбриоидогенеза, которые стимулируют повышение активности специфичной к коферменту NADP глютаматдегидрогеназы

В заключение следует отметить, что глютаматдегидрогеназа, строго специфичная к коферменту NADP, непосредственно связана с формированием эмбриогенных структур на начальных этапах культуры гаплоидных каллусов пшеницы in vitro и может быть использована в качестве одного из биохимических маркеров морфогенеза

, 4.4. Изучение активности ферментного комплекса [МДГ+ГОАТ] для оценки морфогенетического потенциала андроклинных ...... ^ - , каллусов пшеницы..

Используемый в практике культивирования клеток и тканей растений отбор каллусных линий по морфологическим и цитоэмбриологическим признакам не в полной мере отражает картину процессов морфогенеза. В связи с этим, целью наших исследований явилось изучение активности ферментного комплекса [МДГ+ГОАТ], как возможного биохимического маркера ранних этапов морфогенеза в различных условиях (свет, темнота) культивирования андроклинных каллусных тканей пшеницы in vitro.

Ферментный комплекс. [МДГ+ГОАТ] в высших растениях осуществляет необратимое расщепление глютамата (Гильманов, 1990).

Результаты исследования показали, что активность ферментного комплекса [МДГ+ ГОАТ] значительно выше в морфогенных каллусах, которые были культивированы в темноте. На свету их активность была очень низкой и составила 120,0 и 7,2 (мкмолей НАДНг/мл. в мин), соответственно (Рис. 8). .

Рис. 8. Активность ферментного комплекса [МДГ+ГОАТ] у различных типов , андроклинных каллусов пшеницы'

1 -морфогенный каллус; 2-неморфогенный каллус; 3-ризогенный каллус. ■ гЦ - культура на свету; ■ - культура в темноте. - <.-■-. . • • V

Активность ферментного комплекса [МДГ+ ГОАТ] в неморфогенных андроклинных каллусах, выращенных на свету, была очень низкой по сравнению с морфогенным каллусом и составила - 2,4 (мкмолей НАДНг/мл в мин) В темноте у неморфогенного каллуса активность ферментного комплекса [МДГ+ГОАТ] не обнаруживается У риэогенного каллуса, культивированного в темноте, активность ферментного комплекса [МДГ ГОАТ] была высокой по сравнению с каллусами, культивировавшимися на свету и составила 96,7 и 4,5 {мкмолей НАДНг/мл в мин), соответственно (Рис 8).

Таким образом, изучена активность ферментного комплекса малатдегидрогеназы и глутаматоксалоацетатаминотрансферазы

[МДГ+ГОАТ] в морфогенных и неморфогенных каллусах, которые были получены в культуре микроспор пшеницы Показано, что ферментный комплекс [МДГ+ГОАТ] активно функционирует только в морфогенных каллусах, которые культивируются в темноте, а на свету активность ФК значительно ниже. Установлено, что изученный ферментный комплекс [МДГ+- ГОАТ] активно работает только в темноте У морфогенных каллусов, культивированных как на свету, так и в темноте, по сравнению с неморфогенным каллусом активность ферментного комплекса [МДГ+ ГОАТ] выше. Данный показатель является важным биохимическим критерием и может быть основой в использовании их в качестве одного из биохимических маркеров морфогенеза в культуре андроклинных каллусов пшеницы

5. БИОТЕХНОЛОГИЯ СОЗДАНИЯ АНДРОКЛИННЫХ ДИГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ПШЕНИЦЫ

На основе многолетних исследований физиолого биохимических закономерностей процессов морфогенеза и регенерации растений в культуре изолированных микроспор пшеницы in vitro была предпринята попытка оптимизировать гаплоидную биотехнологию применительно к используемым генотипам пшеницы (культурные и дикие виды, межсортовые, межлинейные, межвидовые, межродовые гибриды), к разным агрономическим типам (яровые, озимые), а также с учетом целей селекции (продуктивность, устойчивость к абиотическим и биотическим факторам)

Регламент культивирования микроспор состоит из множества взаимосвязанных этапов (Рис.9) Рекомендуется произвести высев гибридного материала в несколько сроков Агроклиматические условия юга Казахстана позволяют произвести высев до 3-х, а при благоприятных погодных условиях до 5-ти и 6-ти сроков Однако нужно учесть, что промежуток между последующими посевами должна быть не менее 15 дней Пыльники донорных растений первого срока высаживают на питательные

I Получение гнбрндов

Выращивание донорных растений

^Исрок^ срок]

----Отбор донорных растений —^

Пфаіа трубковання, вакуолизированная микроспора)

Холодовая предобработка (4-7С)

Культура микроспор на питательных средах N6, Вілусіеї, Мурасиге-Скуга, Гамборга Е нрн 27 С, темнота

Донорныс растения I срока

:редах |

-5, Г*»М, !Ч6Р]

Отбор оптимальной питательной среды для различных генотипов

Культурл микроспор ил отселектированных средах

Пересадка эмбриондов на среды для регенерации I |ДоноР"ые растения^ МСЯ (0.5 мг/л ИУК). 15*С, свет --- срока—^

¡Перес їдка к-іллусов и эмбриондов ні среды для каллусогенеза МСС (2 мг/л 2,4-Д), 27*С, темнота, свет

Яровизация растеннк-регенерантов озимых форм 2-4"С, 40 дней

Пересадка растении в жидкие среды Кнопя (0,5 мг/л ИУК). 15-20*С, свет

»□логический анализ растенни-регенерантов, Колщцнинрованне, (0,02 *А), 5 часов

\ Пересадка а почву, получение семенного материала / N ■

Репродукция 11«-Н|,отбор ценных линий. Создание АДГ линий, передача селекционерам. Внедрение в селекционные программы

КС, гт

Рис 9 Регламент гаплоидной биотехнологии создания гаплоидных клеточных систем и дигаплоидных линий в культуре микроспор пшеницы

среды разных типов: N6, Blaydes, Мурасиге-Скуга, Гамборга Б-5, N6M, N6P и культивируют в темноте при 27 °С. Через 20-25 дней можно отбирать пробирки с эмбриоидами и морфогенными каллусами. Пыльники и изолированные микроспоры от донорных растений второго и третьего сроков посева высаживают на. отобранные питательные среды с оптимальным сроком холодовой предобработки. При этом обеспечивается высокий процент выхода эмбриоидов, морфогенных каллусных клеток и растений-регенерантов.^ * * " . ~

Эмбриоиды пересаживаются на среды для регенерации MCR (0,5 мг/л ИУК) и культивируются при 15 °С на свету. Каллусы появляются позже эмбриоидов на 10-15 дней и пересаживаются на среду МСС (2 мг/л 2,4-Д), 27 °С. В зависимости от целей и задач экспериментов эмбриоиды также могут быть пересажены на . среду для каллусогенеза. При этом происходит, дедифференциация эмбриоидов и • образование морфогенных каллусов из которых могут регенерировать растения. . _

Пересадка растений-регенерантов в жидкую средыу Кнопа с 0,5 ИУК и выращивание регенератов при 15-20 °С на свету способствуют лучшему укоренению и облегчают кариологический анализ корешков и процедуру колхицинирования. После того, как растения-регенеранты дойдут до фазы кущения их можно пересадить в почву и выращивать при 27 °С с фотопериодом 16/8 часов для получения семенного материала. *

~ Все процедуры от посева донорных растений и до получения семенного ; материала " занимают .. 10-12 месяцев. . Схематически . весь регламент разработанной нами гаплоидной биотехнологии приведен на рис. 9,

. Усовершенствованная нами , гаплоидная биотехнология успешно использована для создания АДГ линий " в культуре микроспор сортов и межсортовых, отдаленных межродовых и межвидовых гибридов Triticum aestivum L. Triticum durum,' Aegilops cylindrica, Aegilops triaristata, Triticum thimopheevi, Triticum turanicum, Triticum turgidum,Triticum dicoccoides, Triticum militina, Triticum kihara. '

6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГАПЛОИДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ В ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ ПШЕНИЦЫ

6.1. Культура микроспор сортов и гибридов мягкой пшеницы , r (Triticum aestivum L.) . . .

Среди сортов -пшеницы, районированных в определенных агроклиматических условиях, необходимо выявлять генотип наиболее отзцвчивые к процессам андроклинии, которые могли бы быть донорами данного признака и максимально обеспечили бы потребность в дигаплоидных растениях - регенерантах из ценных гибридов и форм

Рис 10 Гормональная регуляция процессов морфогенеза в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы in vitro

1-эмбриоидогенез в культуре микроспор пшеницы (среда N6P 1 мг/л 2,4-Д),

2- эмбриоидогенез и каплусогенез в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы среда (N6P 1,5 мг/л 2,4-Д), 3- каплусогенез в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы (среда N6P 2 мг/л 2,4-Д): 4-"одноступенчатая" регенерация растений из полиэмбриоида в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы in vitro

испольэуемых в селекционных программах и фундаментальных генетических исследованиях (Рис. 10).

- Нами было изучено наследуемость высокой частоты андроклинии и регенерации растений у гибридов, в которых одним из родителей при скрещивании были отзывчивые и менее отзывчивые сорта. пшеницы. Максимальное количество андроклинных структур обнаружено у гибрида К-6 в Р| поколении (22,50 %). В последующих поколениях этот показатель резко снизился (Р2 9,73 %, Р3 11,42 %). У гибрида К-б материнской формой служил отзывчивый сорт мягкой яровой пшеницы Казахстанская 4, а отцовской - среднеотзывчивый сорт озимой пшеницы Красноводопадская 210. Результаты наших исследований показали, что у гибрида К-6 во всех испытанных поколениях частота индукции, андроклинных структур'было выше, чем.у родительских форм. Следует отметить, что у большинства гибридов наблюдалась максимальная частота'андроклинии в первом (Р|) поколении. , . • - , . ' .

Обнаружено, что высокая способность образовывать андроклинные структуры часто наследуется по материнской линии.: Так, у реципрокных гибридов, * полученных . от отзывчивого сорта Казахстанская 5 и неотзывчивого Грекум 476, более высокий выход структур обнаружен у гибрида Б-5 Б! (4,44 %). У , гибрида* Б-10 материнской формой служил неотзывчивый сорт Грекум'476. Выход андроклинных структур был почти в два раза ниже (2,56 %), чем у гибрида Б-5. При сравнении частоты индукции андроклинных структур'у гибридов Б-5 и Б-10 с родительскими сортами обнаружено, что у первого частота, андроклинии оказалась выше, чем у родительских сортов, В культур« микроспор' дигаплоидных линий обнаружено, что они не превышают по отзывчивости к процессам андроклинии донорные растения и 'гибриды. Максимальный выход эмбридоидов и растений-регенерантов обнаружен у АДГ 1027 и АДГ 1053, у которых выход эмбриоидов составил 1,39 % и 1,03 %, соответственно.

, В следующей серии экспериментальных4 работ с применением разработанной нами, гаплоидной биотехнологии для , культуры изолированных микроспор использовали гибриды яровой мягкой пшеницы (Табл. 6.1.2). .У исследованных ■ перспективных гибридов максимальный выход эмбриоидов отмечен у гибрида Казахстанская 10 х Казахстанская раннеспелая Р3 и Эритроспермум 841 х Эритроспермум 35 Р}, где выход эмбриоидов составил 6,84 % и 5,23 %, соответственно. Средний выход эмбриоидов отмечен у гибридов №1617, №1615-и.Казахстанская 10 х Эритроспермум 35 в Р| поколении, где процент эмбриоидогенеза на 100 пыльников составил 3,36 %, 3,33 % и 2, 88 % соответственно. Низкий выход эмбриоидов отмечен у гибридов №.1613 и №1625, где процент выхода • эмбриоидов составил 1,85 % и 1,53 %, соответственно. ; . Следует - отметить, ' что, . несмотря на низкую андрогенетическую способность у всех исследованных гибридов удалось получить эмбриоиды с применением разработанной нами гаплоидной биотехнологии (Рис. 10).

Таблица 6.1.2.

Эмбриоидогенез в культуре микроспор гибридов мягкой яровой пшеницы

Triticum aestivum L

Количество Количество %

Генотип Культивированных Подученных выхода

Оияяопдо Эмбриоидов эмбрюядм

Казахстанская 10 х 1631 47 2.88Ю.41

Эритроспермум 35, Рз

Снегири х Эритроспермум 35, Из 1332 3 0,97±0,26

Казахстанская 10 х Казахстанская 1565 107 6,84±0,64

Раннеспелая, Рз

Эритроспермум 841 х 459 24 5.23±1,03

Эритроспермум 35, К

Гибрид ЛЬ 1612 П 136 1 0,73±0,72

ГибридЛЬ 1613 П 323 6 !,85±0,74

Гибрид .№ 1617 И 470 17 3,36iO 83

Гибрид №1625 И 596 9 1,51±0,50

Гибрид № 1715 Р1 360 12 3,33±0,94

На основании полученных экспериментальных данных обнаружено, что выход андроклинных структур (каллусов и эмбриоидов) и частота регенерации зеленых растений-регенерантов зависит от комплекса факторов (генотипа донорных растений, состав питательных сред и др.). При скрещивании отзывчивых и неотзывчивых сортов пшеницы в потомстве сохраняется способность к высокой частоте образования андроклинных структур Установлено, что способность к андроклинии наследуется по материнской линии. В культуре микроспор дигаплоидных линий выявлена, что они не превышают по отзывчивости к процессам андроклинии донорные растения и гибриды

6Л. Культура микроспор сортов и гибридов твердой пшеницы Triticum durum

Как известно, сорта твердой пшеницы используются для производства макарон и как улучшитель мукомольных и хлебопекарных качеств муки, полученной из сортов мягкой пшеницы Поэтому нами было использована гаплоидная биотехнология для получения эмбриоидов в культуре микроспор сортов и гчбридов твердой пшеницы. В этой серии экспериментов максимальное количество эмбриоидов получено в культуре микроспор у гибридов твердой пшеницы Гергана х Айсберг Fe и Гергана х Новинка 3 F«, у которых выход эмбриоидов составил 7,67 % и 4,28 %, соответственно.

Средний выход эмбриоидов показали гибриды твердой пшеницы К 21-025 х Загорка Р6, К 54954 х Загорка Рб и Лозен 76 х Новинка Р6, у которых процент выхода эмбриоидов составил 3,78 %, 3,24 % и 2,05 %, соответственно. В культуре микроспор у гибрида Средец х К 0109775 Р6 не происходило образования эмбриоидов, что. по-видимому связано , с физиологическим состоянием - донорного растения. Из сортов твердой пшеницы сорт-Харьковская 46 был очень отзывчивым, у которого процент выхода эмбриоидов на 100 пыльников составил 3,25 %.

Таким' образом, результатам; наших экспериментов показывают применимость усовершенствованной нами * гаплоидной биотехнологии для использования в практической селекции и создания гомозиготных константных линий из сортов и гибридов твердой пшеницы.

6.3. Культура микроспор отдаленных гибридов пшеницы.

Среди различных методов изменения генотипа пшеницы одним из эффективных является отдаленная гибридизация, позволяющая передавать от дикорастущих видов культурным растениям экологическую пластичность, устойчивость ко многим болезням, высокое содержание белка в зерне и ряд других ценных признаков и свойств (Уразалиев, Кожахметов, 1983).

В первой серии экспериментов использовали; отдаленные межродовые гибриды Безостая 1 х Ле& суИпЫгка и Безостая 1 х Aeg. 1папз1а1а в Рз и Рб поколениях. Следует отметить, что ранние поколения гибридов по сравнению с поздними различались по частоте образования андроклинных структур и регенерации растений. Так, в Рз поколении гибрида Безостая 1 х Ае& суНпс/пса выход эмбриоидов составил 2,08 %, в Рб - 4,19 %, а у гибрида Безостая 1 х Ае^. ¡папэШа - соответственно 1,63 % и 2,28 %. Частота образования каллусных тканей у гибрида Безостая 1 х Aeg. суИпс1п'са в Рз поколении составила 0,83 %, а в р4 поколении увеличивалась до 1,55 %. Однако у гибрида Безостая 1 х Aeg. Ыапз1Ша частота образования каллусных тканей была не очень высокой, и в Р3 и Рб поколениях она составила 0,54 % и 0,51 %, соответственно. Максимальное количество растений-регенерантов получено у обоих гибридов в Р6 поколении. Выход зеленых растений-регенерантов у гибрида Безостая 1 х Aeg. СуНпёпса в Р3 поколении составил 0,41%, В ' Рб - 1,01%, соответственно.. У - гибрида Безостая. 1 х Ае2. гпагШма Рз и Р6 поколениях выход зеленых растений-регенерантов составил 0,19 . % и 0,34 %, соответственно. В наших экспериментах высокий процент выхода эмбриоидов обнаружен у гибрида ТгШсит регвгсит х ТгШсит Шгатсит. У гибрида Казахстанская 10 х ТгШсит (¡торИееУ! в Р) отмечены большой показатели выхода эмбриоидов (6,74 %) и высокая частота регенерации зеленых растений (2,14 %).

Табл 6 3 2

")мбрноидогенез в культуре микроспор отдаленных гибридов пшеницы

Количеств Количество

Гсвопш НуЛИИВНрО-ВИН оолучея-иых %

НЬГХ пыльников эибри-оидов

ЦГ 304 х ТгШсит К>Иага Ь 180 0 0,00±0,00

ЦГ 304 х ЦГ 321 Иг 144 5 3,47±1,52

ЦГ 304 х ТгШсит Лсос Р2 216 1 0,46±0,45

ЦГ 321 х Тггпсит Ю/гага Р2 126 9 7,14±2,28

ЦГ 314 х ТгШсит/кипорИ К2 90 2 2,22±1,55

ЦГ 683 ч ТгШсит ¡Ыторк Рг 54 4 7,40±3,36

Стекловидная 24 х ТгШсит Шкага Иг 198 9 4,54±1,47

Жетысу х Тгшсит тйШпа Р2 54 3 5,56±3,11

В следующей серии экспериментов исследовали частоту эмбриоидогенеза в культуре микроспор отдаленных гибридов пшеницы, созданных с участием ЦТ 304, ЦТ 314, ЦТ 321 и ЦТ 683, которые сами произошли из межродовых гибридов пшеницы (любезно предоставлены селекционерами КазНИИ земледелия Кожахметовым К К и др ) (Табл 6 3 2)

В этой серии экспериментов максимальный процент эмбриоидогенеза отмечен у гибрида ЦТ 683 х Тгшсит ¡ИипорИееу: И2 и ЦТ 321 х ТгШсит КЛага Рг Процент выхода эмбриоидов на 100 пыльников составил 7,40 % и 7,14 %, соответственно. Средний выход эмбриоидов отмечен у отдаленных гибридов Жетысу х Тгшсит тЛшпа Р2 и Стекловидная 24 х ТгШсит КЛага Т*2 Процент выхода эмбриоидов составил 5,56 % и 4,54 %, соответственно Низкий выход эмбриоидов отмечен у гибридов ЦГ 304 х ЦТ 321 Р2, ЦТ 314 х ТгШсит йпторИ Иг и ЦГ 304 х Тгшсит <1кос Р2, при этом выход эмбриоидов составил 3,47%, 2,2 2% и 0,46 %, соответственно

С те дует отметить, что наряду с зетеными растениями- регенерантами в культуре отдаленных гибридов пшеницы нами получены альбиносные и пестролистные растения Полученные растения-регенеранты отличались между собой и от донорных растений на поздних стадиях репродукции -по форме колоса и высоте растения Это, по-видимому, связано с гетерозиготностью микроспор гибридов Поскольку в каждом пыльцевом зерне проявляются различные генные комбинации от обоих скрещиваемых родителей, и растения, полученные из таких микроспор, проявляют признаки обоих родителей

Таким образом, показано, что частота образования андроклинных структур (эмбриоиды, каллусы) я зеленых растений-регенерантов зависит от комплекса факторов, прежде всего, таких как генотип, среда, поколения гибридов и др Выявлены отзывчивые в наших условиях генотипы, способные к процессам андроклинии, получены морфогенные каллусы.

эмбриоиды и растения-регенеранты, которые являются уникальным объектом для фундаментальных и прикладных работ и могут быть использованы в селекционных программах по созданию новых сортов и ценных форм пшеницы. - - : •

"77. ГАПЛОИДНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ В ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ ПШЕНИЦЫ

7.1. Использование гаплоидной технологии в экологической селекции пшеницы на засухоустойчивость

Объектами исследования служили перспективные гибриды мягкой озимой и яровой пшеницы (Triticum aestivum L), полученные с участием изогенной линий Грекум 476 - донора генов RL1 и RL2 контролирующих адаптивный признак "свертывание листьев", способствующих повышению засухоустойчивости (Омарова и др., 1995; Bogdanova, Polimbetova, 1998).

При озимом посеве максимальный выход эмбриоидов был отмечен у гибрида № 398 - (Альбидум 430 Н 303 х Грекум 476) х Альбидум 315, где выход эмбриоидов составил 3,90 %. У гибридов №416- Лютесценс (Ml 0748 х Грекум 476) х (Грекум 476 х Омская 9) х Омская 9, (ВС 5) и* 247 -(Грекум 476 х Омская 9) х Омская 9, (ВС 5) образования эмбриоидов не наблюдалось. Вероятной причиной этого может быть физиологическое состояние донорных растений, которое является одним из главных факторов, влияющих на андрогенез in vitro (Приходько, 1989).

Во второй серии экспериментов для' культуры изолированных пыльников использовали гибриды яровой пшеницы. При яровом посеве максимальный ' выход эмбриоидов был отмечен у гибридов 205/96 Карабалыкская 91 х Грекум 476 и 23/96 Актюбинская 91 х Грекум 476, (ВС1), с показателями выхода эмбриоидов 5,09 % и 3,51 %, соответственно.

Всего было регенерировано 37 растений, из которых зелеными оказались 27. Среди' зеленых растений были обнаружены спонтанно удвоенные дигаплоиды и гаплоидные растения, которые морфологически отличались друг от друга. Все образовавшиеся дигаплоиды' были представлены зелеными растениями. Полученные дигаплоидные линий успешно используются в экологической селекции пшеницы на засухоустойчивость в условиях жесткой богары Южного Казахстана. Данные АДГ линии имеют маркерный морфологический признак "свертывание листьев", который обусловлен наличием генов LR1 и RL 2, способствующих повышению засухоустойчтвости.' При повышении температуры воздуха листья этих' линий принимают игловидную цилиндрическую форму и сохраняют тургор в жаркие часы дня.

В следующей серии экспериментов были изучены элементы структуры урожайности АДГ линий в условиях жесткой богары Южного Казахстана Алматинской обл (7 1 3) По числу зерен выделились номера дигаплоидных линий АДГ 1051 и АДГ 1054, у которых данный показатель составил 54,0 и 52,7 По массе зерен с одного колоса АДГ 1045, АДГ 1051 и 1033, у которых данные показатели составили 2,57, 2,56 и 2,27, соответственно. По массе тысячи зерен значительно превосходили контрольные сорта и родительские формы дигаплоидные линий АДГ 1049, АДГ 1027, АДГ 1033 и АДГ 1057, при этом данные показатели составили 57,2, 51,9, 50,2 и 49,1, соответственно (Табл 7.1 3)

Таблица 7 13

'Элементы структуры урожайности АДГ линий пшеницы с адаптивными признаками

засухоустойчивости

[ енотип Высота стебля См Длина колоса. См Число колосков Число зерен в колосе Масса зерна 1 колоса Масса 1000 іерен

Грекум 476 105 4+4 15 9 2±0 47 20 4±0 98 51 8±4 26 2 13±0 23 42 1

Казахстанская-4 101 3±2 01 8 7±0 31 15 2±0 44 38 7±1 88 1 77±0 12 38 7

Саратовская-29 109 8±1 38 8,0±0 26 14 2±0 31 30.0±1 57 1 24±0 04 39 9

1 остиакум 88 88 7±1 68 10 0±0 29 21 0±0 80 53 3±5 50 2 30±0 29 42 8

АДГ 1057 101 4±2 54 10 9±0 31 17 4±0 51 49 2±2 85 1 87±0 10 49 1

АДГ 1054 И1 4±1 60 10 3±0 22 18 610 43 52 7±2 12 2 13±0 11 40 3

АДГ 1055 108 2±1 68 8 7±0 26 17 8±0 37 36 4±1.71 1 22±0 06 33 5

АДГ 1056 85 8±2 03 8 7±0 25 15 5±0 48 35 |±1 96 1 26±0 10 35 9

АДІ 1052 116 2±1 84 11 4±0 39 18 6±0 43 45 5±1 82 1 74±0 13 38 2

АДГ 1051 115 2±1 73 8 9±0 30 20 4±0 70 54 0±3 16 2 S6±0 18 47 1

АДГ 1049 113 4+1 38 И 8±0 38 17 2±0 60 39 3±3 26 2 16±0 16 57 2

АДГ 1048 92 7±1 76 11 1±0 19 15 8±0 58 41 5±1 28 1 75±0 08 42 1

АДГ 1044 88 8±| 14 9 9±0 18 16 6±0 43 36 5±0 90 1 14±0 05 31 2

АДГ 1045 125 8±2 33 10 2±0 23 20 8±0 44 49 8±2 19 2 57±0 16 50 1

АДГ 1041 94 2±1 08 8 9±0 19 14 7±0 32 30 3±0 71 1 22±0 04 40 3

АДГ 1036 100 1±1 14 10 1±0 34 14 4±0 40 33 8±2 01 1 40±0 07 37 6

АДГ 1034 101 2±3 27 11 5±0 46 15 6±0 49 38 4±3 09 1 45±0 16 36 2

АДГ 1033 102 8±1 92 8 6±0 35 18 0±0 65 43 3±2 58 2 28±0 18 50 2

АДГ 1027 134 7±2 21 10 6±0 27 17 8±0 58 44 5±1 83 2Л7±0 12 51 9

Таким образом, в нашей работе в качестве донора генов адаптивного признака коррелирующего с засухоустойчивостью была использована линия озимой мягкой пшеницы Грекум 476, который является донором доминантных генов 1ИЛ и ЯЬ2 контролирующий признак «свертывания

листьев» локализованных на хромосомах 6А и 4Д. Исследованиями установлено, что введение указанного признака другим сортам способствует повышению их засухоустойчивости. При изучении элементов структуры урожайности АДГ линий пшеницы выявлены перспективные номера АДГ линий (АДГ 1057, АДГ 1033, АДГ 1045, АДГ 1045),* которые могут быть использованы в качестве источников и доноров высокой продуктивности и устойчивости.

7.2. Использование гаплоидной биотехнологии в селекции пшеницы на устойчивость к биотическим факторам среды

Сильное поражение пшеницы ржавчинными заболеваниями значительно снижает урожай и ухудшает мукамольно-хлебопекарные качества зерна из-за снижения сожержания белков. Выход муки из зерна пораженных растений составляет 60 % по сравнению с зерном здоровых (Турапин, Мостовой, 1995). Из-за изменчивости патогена появляются новые расы, приводящие к активизации других генов вирулентности, поэтому перспективные сорта через некоторое время теряют свою устойчивость (Сейтхожаев и др., 1998). г Среди генов устойчивости к бурой ржавчине ген Lr 24 является одним из наиболее эффективных для нашего регина (Танкиманова, 1993). Поэтому у i исследованных гибридов одним из родителей была изогенная линия, несущая ген Lr.24, который локализован в хромосоме 3 DL и использован ' нами как источник гена устойчивости к ржавчинным болезням пшеницы.

При отдельном исследовании способности к процессам андроклинии изогенной линии -•источника гена Lr 24 и сортов Казахстанская 17 и Лютесценс 70, участвующих при скрещивании, выход эмбриоидов составил 1,52 %, 0,98 % и 1,34 %, соответственно. У гибридов Лютесценс 70 х I.r 24 1;3 и Казахстанская 17 х Lr 24 13 выход эмбриоидов составил 0,73 % и 0,78 %, соответственно.

Оценка адаптивности; андроклинных дигаплоидных линий к грибным болезням (бурая, желтая,. стеблевая ржавчина) и септориозу позволила : выявить устойчивые, слабо восприимчивые и восприимчивые номера АДГ линий. В первом опыте мы рассмотрели устойчивость АДГ линии к грибным болезням с использованием - наиболее распространенных местных рас Алматинской обл. (КазНИИЗ) и.Жамбылской обл. (НИСХИ) к. стеблевой, желтой и бурой ржавчинам (Puccirtia graminis, Puccinia striiformis, Puccinia recóndita, Septoría nodorum и Septoria tritici). "_' ..:'*'

Поражаемость стеблевой ржавчиной контрольных сортов и дигаплоидных линий составила от 40 ■% до 100 % (Табл. 7.2.2). Неустойчивыми к стеблевой ржавчине оказались контрольные сорта Саратовская 29, ■ Казахстанская - раннеспелая - и АДГ линия . 1052. Среднеустойчивыми оказались линии: АДГ 1051, АДГ 1049, АДГ 1048 и

АДГ 1033 Линии АДГ 1054, АДГ 1055 и АДГ 1057 показали высокую устойчивость

Таблица 7 2 2

Поражаемость видами ржавчины дигаплоидных линий яровой мягкой пшеницы (Инфекционный питомник)

№ каталога НИИ Jfe АДГ линия Генотип Виды ржавчины

Стеблевая Желтея « Буре»

Балл % Балл % Балл %

79878 Стандарт Казахст 3 4 40 4 10 4 60

Стандарт Казахст 4 4 60 4 50 4 40

79903 752 Саратов 29 4 100 4 60 4 50

79904 753 Каз раннее 4 100 2 10 4 10

809 1054 5/33 4 40 1 10 2 20

810 1055 5/3 4 40 2 10 2 20

812 1057 5/1-5 4 40 0 0 2 10

79907 1057 5/1-5 4 50 0 0 4 50

79906 1052 4/14-3 4 100 2 20 4 60

79908 1051 4/14-11 4 60 2 10 4 60

79909 1049 4/6 4 60 2 20 4 60

79910 1048 4/7 4 60 0 0 4 70

79911 1045 4/14-1 4 50 3 10 4 70

79912 1041 3/5-7 4 50 2 20 4 70

79914 1033 3/30-2 4 60 2 10 4 70

79915 1031 3/2-12 4 50 3 10 4 70

79916 1027 3/1-11 4 50 2 10 4 70

При воздействии на АДГ линии возбудителями рас грибных заболеваний желтой ржавчины (Puccinia struformis ¡Vest) выделены устойчивые номера АДГ 1057, АДГ 1048 и АДГ 1054 линии, которые по этим показателям значительно превосходили все контрольные сорта Нужно отметить, что АДГ 1057 показала высокую устойчивость к желтой ржавчине и в условиях Жамбылской обл (НИСХИ, №79907), и Алматинской обл (КазНИИЗ, №812) Наши совместные исследования с участием ученых Международной организации CIMMYT показали, что дигаплоидная линия АДГ 1057 («Аман») показывает высокую устойчивость к желтой ржавчине и в условиях Турции Высокую устойчивость к желтой ржавчине показали АДГ 1054, АДГ 1055, АДГ 1051, АДГ 1045, АДГ 1033, АДГ 1031 и АДГ 1027

При исследовании устойчивости АДГ линий к бурой ржавчине высокую устойчивость показали АДГ 1057, АДГ 1054 и АДГ 1055

Одной из актуальных проблем современной селекции является создание генотипов, проявляющих комплексную устойчивость к ржавчинным заболеваниям и септориозу При исследовании АДГ линий на устойчивость

к септориозу были выялеиы различные реакции исследованных образцов и контрольных сортов. Среди дигаплоидных линий относительную устойчивость поражаемости 1-го флагового листа показали АДГ 1052 и АДГ 1048 (42,5 %). Поражаемость 2-го флагового листа у большинства АДГ линий были на уровне 70 %. Поражаемость колоса септориозом была очень низкой у линии АДГ 1052 и низкой у АДГ 1057, АДГ 1048, АДГ 1049, АДГ 1033, АДГ 1031 и АДГ 1027. Следует особо отметить устойчивую к грибным заболеваниям и септориозу перспективную дигаплоидную линию АДГ 1057 ("Аман"), которая ; характеризуется свойством "свертывание . листьев", обусловленным наличием повышающих засухоустойчивость генов RL 1 и RL2. Кроме того, АДГ 1057 ("Аман") имеет антоциановую окраску, наличие которой может быть .причиной ' высокой устойчивости к/биотическим факторам окружающей среда и способствовать расширению адаптационных возможностей. Предполагается, что устойчивость пшеницы ко многим болезням, в том числе к ржавчине и пыльной головне связана с содержанием в растениях - веществ фенольной природы и их качественным составом (Богданова, 1997)..

Таким образом, при исследовании созданных . нами дигаплоидов на устойчивость к различным расам возбудителей грибных заболеваний в двух областях Южного Казахстана (Жамбылская обл. и Апматинская обл.) и в регионах Турции возделывающих пшеницу, выявлены устойчивые и перспективные номера АДГ линий к ржавчинным заболеваниям (АДГ 1057, АДГ 1054, АДГ 1055, АДГ 1048) и септориозу (АДГ 1052, АДГ 1057, 1048, АДГ 1048, АДГ 1049, АДГ 1033, АДГ 1031, АДГ 1027). Выделенные АДГ линии рекомендуются для использования в экологической селекции пшеницы на устойчивость к биотическим факторам окружающей среды.'

8. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК .....ДИГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ПШЕНИЦЫ

8.1. Изучение активности ферментов амилолитического комплекса в зерне андроклинных дигаплоидных линий пшеницы

Для быстрого отбора ценного материала и качественной оценки биологического качества зерна очень важным показателем является определение активности ферментов" и, особенно,, а-амилазы. Именно этот фермент определяет биологические,-хлебопекарные; и технологические показатели зерна. a-Амилаза определяет. жизнеспособность семян ; и их способность к прорастанию (Фурсов и др., 1987)."

; ¡ Поэтому было проведено изучение активности и электрофоретического спектра: ферментов амилолитического комплекса зерна андроклинных дигаплоидных линий (АДГ) мягкой яровой пшеницы.

Таблица 8 1 1

Урожайность и амилазная активность андроклинных дигаплондных линии пшеницы

S» АДГ Линия Генотип Урожайность 5 кв м Ел Ак/мл час х 10 5 Содержание белка мг/мл

Контроль

I 1025 Казахстанская 4 1 200 2 013*0,070 6,95*0,20

1 1067 Саратовская 29 I 500 2 090*0,069 6 35*0 16

АДГ линии

3 1027 (3) 3/1-11 1 350 2 469±0 074 8,10*0,27

4 1033 (4) 3/30-2 1,150 2,230*0,067 7 00*0,24

S 1034 (11) 3/2-19 1 150 2,129*0,074 7.40*0,26

6 1044 (21) 4/10 1 550 2,3) 4*0 069 7.20*0,27

7 1045 (22) 4/14-1 1 553 2 195*0 065 8,00*0 31

8 1046 (23) 4/2 5 1 400 2.229*0 066 7,40*0,25

9 1048 (24) 4/7 I 540 2 043*0,062 7,85*0 28

10 1050 (26) 4/2-1 I 300 2,437*0,085 7,65*0,32

11 1051 (27) 4/14-11 1 700 2 496*0 087 8,00*0,28

12 1052 (28) 4/14-3 1 620 2 339*0,077 7,80*0,36

В результате проведенных исследований было установлено, что полученные нами андроклинные дигаплоидные линии различаются по урожайности и ряду биохимических показателей Образцы АДГ 1044, 1045, 1048, 1051 и 1052 по урожайности превосходят контрольные варианты Эти образцы также превосходят такие контрольные сорта, как Казахстанская 4 и Саратовская 29 по содержанию белка (Табл 8 11)

Анализируя полученные данные по активности а-амилазы среди исследуемых образцов, можно отметить, что образцы АДГ 1044, 1045, 1048, 1051 и 1052 превышают контрольные варианты (сорта Казахстанская 4 и Саратовская 29) по этому показателю

Ишересным является образец АДГ 1027, который по активности а-амилазы и содержанию белка превышает все исследованные образцы, но уступает по урожайности Саратовской 29 Остальные образцы занимают промежуточное значение по различным параметрам - по урожайности, содержанию белка и по активности а-амилазы

При разделении белков опытных и контрольных образцов методом электрофореза в денатурирующих условиях принципиальных различий не обнаружено При выявлении полиморфизма амилолитических ферментов проявляется корреляция между активностью ферментов и интенсивностью окрашивания компонентов на электрофореграмме Резких отличий в компонентном составе также не обнаружено

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что полученные методом гаплоидной технологии новые перспективные дигаплоидные чинии пшеницы различаются по ряду физиологических,

биохимических и технологических параметров. Опытные образцы дигаплоидных линий АДГ 1027, 1044, 1045, 1048, 1051 и 1052 близки и даже превосходят контрольные стандартные сорта по ряду показателей, и могут быть использованы в генетико-селекционных работах для получения высокопродуктивных линий и сортов пшеницы и включены в селекционные программы. Особый интерес представляют андроклинные линии АДГ 1051, 1045 и 1027,"которые по всем параметрам превышают контрольный вариант. Указанные перспективные дигаплоидные линии переданы селекционерам и рекомендованы для использования в дальнейших генетических исследованиях и селекционных программах.

8.2. Урожайность, генетическая стабильность и технологические качества зерна аидроклинных дигаплоидных (АДГ) линий ; пшеницы

Основным критерием,' характеризующим новый сорт • наряду • с продуктивностью и устойчивостью к экстремальным факторам окружающей среды, является генетическая чистота и стабильность. Поэтому нами было проведено исследование спектра запасных белков (глиадины, глютенины) в нескольких репродукциях и технологических качеств (содержание клейковины, белка) зерна АДГ линий пшеницы. '

В процессе репродукции растений-регенерантов, полученных в культуре микроспор пшеницы из ценных и перспективных гибридов пшеницы, были созданы андроклинные дигаплоидные линии (Анапияев и др., 1990; Анапияев, 1988-1999). Исследованные дигаплоидные линии по содержанию белка и клейковины отличались от родительских форм. Так у стандартного контрольного сорта Казахстанская 4 содержание белка составило 16,3 %, а клейковины — 29,0 %. Содержание белка у аидроклинных дигаплоидов 5/10; 3/26-9 и 3/30-3 в НЗ репродукции составило 17,7%, 17,4% и 17,6%, соответственно, а содержание клейковины' составило - 42,0%, 38,0% и 39,0%, соответственно.' _ ' ' ' ■ -' '

Таким образом, основным критерием, определяющим' питательную ценность зерна пшеницы, является содержание белка и клейковины. В результате изучения технологического качества зерна АДГ линий установлено, что отдельные номера АДГ линий (5/10; 3/26-9 и 3/30-3) по содержанию белка и' клейковины значительно превосходят контрольные сорта. По этим показателям можно вести отбор АДГ линий на качество . зерна. Электрофоретический спектр глиадина обладает четко выраженной сортовой специфичностью и может служить маркером генотипа (Конарев, 1980). В связи с этим, нами проведены исследования электрофоретического спектра глиадинов АДГ линий пшеницы (Рис. 11 А). Целью предпринятого исследования было, изучение электрофоретических спектров глиадинов для

оценки чистоты и генетической стабильности полученных АДГ линий. По электрофоретическим спектрам андроклинных дигаплоидных линий в Н,-Н7 репродукциях не обнаружено существенных отличий, что указывает на генетическую чистоту и гомозиготность полученных растений

Рис 11 Электрофоретические спектры запасных белков андроклинных дигаплоидных линий пшеницы

А - электрофоретические спектры глиадина, Б - электрофоретические спектры глютенина, 1 - дигаплоидная линия АДГ 1027 Н„ 2 - дигаплоидная линия АДГ 1027 Н7 3 - дигаплоидная линия АДГ 1057 Н,, 4 - дигаплоидная линия АДГ 1057 Н,, 5 - дигаплоидная линия АДГ 1045 Н(, 6 - дигаплоидная линия АДГ 1045 Н,

Наряду с глиадиновыми компонентами также могут быть использованы глютенины для оценки генетической стабильности гомозиготности андроклинных дигаплоидных линий пшеницы Проведенные нами исследования электрофоретического спектра глютенинов у изученных андроклинных дигаплоидных линий пшеницы также показали идентичность спектров в Н,-Н7 репродукциях (Рис 11 Б)

При исследовании урожайности АДГ линий в течение 3-х лет были выделены перспективные номера (Табл. 8 2 2) По урожайности особо выделялись дигаплоидные линии АДГ 1045, АДГ 1027 и АДГ 1057, где средняя урожайность за 3 года составила 31,9 ц/га, 31,1 ц/га и 30,9 ц/га, соответственно Данные дигаплоидные линии выделялись и по массе тысячи зерен

2 3

4 5 6

,. , ^ Таблица 8.2.2.

Урожайность андроютинных дигаплоияных линий (АДГ) яровой мягкой пшеницы, Богара, Экспериментальный участок КазНИИ земледелия, Алматинская обл.,

Номер пожур. КазНИИЗ Номер АДГ линий Генотип Урожайность, 1 год. ц/га Урожайность, 2 год. ц/га Урожайность, 3 год. ц/га Средняя урожайность % урожайности к контроль» Маем 1000-зерен % к контролю

Стандарт Каз-4 24,0 25,0 24,0 24,3 100 38,7 100

479 • 1057 5/1-5 26,0 27,3 39,3 30,9 127,2 49,1 126,8

473 1054 5/33 - 27,6 ■ 26,5 35,0 29,7 122,2 40,3 104,1

472 1055 5/3 28,4 29,3 34,0 30,6 125,9 33,5 86,6

580 1056 5/1-3 26,0 . 25,3 32,1 27,8 114,4 35,9 92,8

533 1052 4/14-3 • 32,4 26,0 24,0 27,5 113,2 38,2 98,7

534 1051 4/14-11 • 34,0 27.3 28,0 29,8 122,6 47,1 121,7

535 - 1049 4/6 • 25,0 26,6 25,8 25,8 106,2 57,2 147,8

537 1048 4/7 30,8 28,5 27,8 29,0 119,3 42,1 108,8

470 1044 4/10 ' 30,6 28,0 27,0 28,5 117,3 31,2 80,6

538 1045 4/14-1 31,0 29,2 35,6 31,9 131,2 50,1 129,5

539 1041 3/5-7 18,0 26,5 25,9 23,5 ' 96,7 40,3 104,0 '

540 1036 ■ 3/2-19 19,6 27,0 23,0 23,2 95,5 37,6 97,2

481 1034 3/2-19 25,0 27,9 32,8 28,6 - 117,7 36,2 93,5

542 1033 • 3/30-2 23,0 30,0 24,0 25,7 105,8 - 50,2 129,7

543 1031 3/2-12 26,0 29,0 26,1 27,0 111,1 38,9 100,5

544 1027 3/1-11 28,0 29,6 35,7 31,Ь 127,9 51,9 134,1

Таким образом, изучена генетическая стабильность, спектры запасных белков (глиадины, глютенины) и урожайность АДГ линий пшеницы У АДГ линий в спектрах запасных белков в Н1-Н7 репродукциях существенных отличий не обнаружено, что свидетельствует о высокой генетической стабильности и гомозиготности полученных линий. Отобранные по засухоустойчивости в условиях жесткой богары и по устойчивости к болезням перспективные линии АДГ 1027, АДГ 1057, АДГ 1045, АДГ 1051 успешно проходят конкурсное сортоиспытание Эти высокопродуктивные дигаплоидные линии пшеницы, которые характеризуются хорошим качеством зерна и обладают генетической стабильностью могут служить основой для создания перспективных линий и новых сортов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время в связи с глобальными изменениями экологической обстановки нужно разработать быстрые и эффективные технологии селекции сельскохозяйственных культур на устойчивость к экстремальным факторам (засуха, болезни и др ) окружающей среды Среди сельскохозяйственных культур стратегический важными для экономики страны являются зерновые культуры На современном этапе практически исчерпаны возможности увеличения продуктивности и адаптивности сельскохозяйственных растений методами традиционной селекции В XXI веке в обеспечении продуктами питания растущего быстрыми темпами населения Земли, решающую роль будут иметь современные усовершенствованные биотехнологические методы и методологии создания новых форм и сортов важных сельскохозяйственных культур, в том числе основной зерновой культуры пшеницы (Borlaug, 2000) Поэтому разработка и усовершенствование современных подходов и методов биотехнологии, а также изучение путей обеспечивающих эффективность применения новых разработок в практической селекции и генетике зерновых злаков является очень актуальным. Методом традиционной селекции для создания новых сортов зерновых культур в среднем требуется 10-12 лет Гаплоиды позволяют всего за 1-2 года создать из перспективных гибридов стабильные гомозиготные линии

Однако данная технология все еще не находить широкого практического применения, это связано с не разработанностью многих теоретических и методических вопросов, не отработанностью технологии массового получения растений-регенерантов, управление процессами морфогенеза и других До настоящего времени остается открытым вопрос о путях развития микроспор m vitro, которые в последующем могут формировать эмбриоиды и морфогенные каллусы способных регенерировать растения. Нами в результате цитоэмбриологических исследовании установлены основные пути

развития микроспор пшеницы in vitro приводящих к образованию МК, эмбриоидов и морфогенных каллусов (путь Ai, В|). \ Кроме вышеперечисленных путей мы - предполагаем наличие и третьего , пути развития микроспор в культуре in vitro обозначенный как путь Е. При этом формирование МК происходит путем прямого деления микроспор в культуре in vitro. • , , , .. „ ■ , .

Установлено, что регенерация растений в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы осуществляется через различные пути морфогенеза - эмбриоидогенез (первичный и вторичный) и органогенез (геммогенез и гемморизогенез). В процессе формирования эмбриоидов существуют критические периоды развития (формирование проэмбрио, стадия глобулы), . которые определяют дальнейший ход протекания процессов морфогенеза и регенерации растений. Ключевые ферменты метаболизма, такие как а-амилаза, нитратредуктаза, глютаматдегидрогеназа, ферментный комплекс глютаматдегидрогеназа и

глютаматоксалоацетатаминотрансфераза могут быть использованы в качестве биохимических маркеров морфогенеза в культуре андроклинных структур пшеницы (эмбриоиды, каллусы). В результате изучения физиолого-биохимических и.-; цитоэмбриологических особенностей процессов морфогенеза и регенерации растений в культуре микроспор пшеницы in vitro создана . воспроизводимая модельная система, разработана и усовершенствована гаплоидная биотехнология, которая может быть успешно использована в практической селекции для создания ценных дигаплоидных линий из перспективных гибридов (межсортовых, отдаленных межвидовых и межродовых) зерновых культур, в клеточной селекции и генетической инженерии растений. , . , • .

В результате проведенных исследований показана принципиальная возможность использования гаплоидной биотехнологии в экологической селекции пшеницы на устойчивость к .экстремальным факторам окружающей среды. Для создания засухоустойчивых дигаплоидных линий пшеницы были использованы гибриды созданные с использованием донора генов RL, 1 и RL . 2 (линия Грекум 476), - контролирующий признак "свертывание листьев" (Омарова и др., 1995). Исследованиями показано, что введение указанных генов улучшают водный режим и способствуют повышению засухоустойчивости пшеницы в аридных условиях.

Нами для культуры микроспор были использованы гибриды созданные с участием изогенной линии источника гена Lr 24. Данная линия создана на основе . сорта "Thatcher", который в селекционных программах часто используются в качестве источника гена Lr 24 (Sharma, Chawla, 1990). При исследований резистентности к ржавчинным и септориозным болезням в двух регионах Южного Казахстана (Алматинская обл., Жамбылская обл.) и Турции выявлены устойчивые и перспективные номера АДГ. линий пшеницы. ......

Таким образом, в результате использования разработанной гаплоидной биотехнологии были созданы ценные дигаплоидные линии из перспективных гибридов пшеницы, которые были использованы в селекционных программах. Среди АДГ линий обнаружены номера, которые по урожайности и по технологическим качествам зерна, устойчивости к ржавчинным болезням значительно превосходят контрольные сорта В спектрах запасных белков в Н| и Н7 репродукциях отличий не обнаружено, что свидетельствует о высокой генетической чистоте и стабильности исследованных АДГ линий пшеницы. В настоящее время перспективные номера дигаплоидных линий (АДГ 1027, АДГ 1057, АДГ 1045 и др) успешно проходят конкурсное сортоиспытание

ВЫВОДЫ

1 Андроклиния (андрогенез in vitro) является специфическим типом размножения, который осуществляется в результате реализации генетической программы спорофитоного развития компетентных клеток микроспор Реализация этой программы размножения зависит от целого комплекса разнообразных факторов (генотип и физиологическое состояние донорного растения, условия предобработки, состав питательной среды и др ), от сочетания которых зависит частота формирования андроклинных структур и растений-регенерантов

2 Клетки вегетативного типа как менее детерминированные по сравнению с клетками генеративного типа могут образовать многоклеточные комплексы (МК), способных к формированию эмбриоидов и морфогенных каплусных клеток (путь А] путь В|) Результаты цитоэмбриологических исследовании позволяют предположить наличие и третьего пути развития (путь Е) При этом происходит образование МК путем прямого деления микроспор в культуре in vitro

3 Формирование эмбриоидов и каллусных клеток в культуре микроспор in vitro могут происходить сопряженно. Изменяя условия культивирования (состав питательных сред, гормоны, предобработка донорных растений и др ) можно регулировать процессы морфогенеза и частоту формирования эмбриоидов, каллусных клеток и растений-регенерантов

4 В результате длительного культивирования андроклинные каллусы пшеницы сохраняют морфогенетический потенциал Регенерация растений осуществляется в процессе второичного эмбриоидогенеза и органогенеза (геммогенез, гемморизогенез) При этом происходит спонтанная диплоидизация и регенерация дигаплоидных растений с высокой жизнеспособностью

5. Эмбриоиды, морфогенные и неморфогенные каллусы отличаются между собой не, .только по морфофизиологическим свойствам и анатомическому строению, но и , по интенсивности биохимических процессов,' которые обуславливают и определяют их морфогенетический потенциал. . - ,-.-.. ; .,

6. Уровень активности ключевых ферментов метаболизма, таких как нитратредуктаза,' ■ глютаматдегидрогеназа, а-амилаза и, ферментного комплекса мапатдегидрогеназа и глютаматоксалоацетатаминотрансферазы могут быть использованы как биохимические маркеры на ранних этапах морфогенеза в культуре андроклинных структур (эмбриоиды, морфогенные и нефорфогенные каллусы) пшеницы. •,

7. На основе изучения физиолого-биохимических и цитоэмбрио-логических особенностей процессов морфогенеза создана воспроизводимая модельная система культуры изолированных пыльников и микроспор пшеницы in vitro и усовершенствована гаплоидная биотехнология, которая может быть . использована в практической селекции, клеточной . и генетической инженерии растений.

8. При скрещивании отзывчивых и неотзывчивых сортов пшеницы в потомстве сохраняется способность к высокой. частоте образования андроклинных структур. Установлено, что способность к андроклинии наследуется по материнской линии. У межсортовых гибридов высокий выход андроклинных структур отмечен в первых поколениях, у отдаленных гибридов в - F3-F6. В культуре микроспор дигаплоидных линий обнаружено, что они не превышают по отзывчивости к процессам андроклинии донорные растения и гибриды. -

9. Усовершенствованная . гаплоидная биотехнология - успешно использована в культуре микроспор сортов и межсортовых, отдаленных межвидовых и межродовых гибридов Triticum aestivum L, Triticum durum, Aegilops cylindrica, Aegilops triaristata, , Triticum thimopheevi, Triticum turanicum, Triticum turgidum, Triticum dicoccoides, Triticum militina, Triticum kihara. - Теоретические подходы и методические разработки усовершенствованной гаплоидной биотехнологии могут быть использованы и адаптированы и для других важных сельскохозяйственных культур и видов растений. > .

10. В экологической селекции пшеницы на устойчивость к абиотическим (гены RL 1 и RL2, контролирующий признак "свертывание листьев", способствующих повышению засухоустойчивости) и биотическим (источник гена Lr 24, обеспечивающий устойчивость к ржавчинным болезням) i факторам эффективным является использование гаплоидной биотехнологии. • ■•

технологическим характерискикам зерна (содержание клейковины, белка, твердозерность, и др ), устойчивости к засухе, ржавчинным и спеториозным болезням превосходят районированные в Казахстане сорта.

12 Изучена генетическая стабильность, спектры запасных белков (глиадины, глютенины) АДГ линий пшеницы У АДГ линий по спектрам запасных белков в Н1-Н7 репродукциях существенных отличий не обнаружено, что свидетельствует о генетической чистоте и гомозиготности полученных линий Высокопродуктивные дигаплоидные линий пшеницы внедрены в селекционные программы Отобранные на засухоустойчивость в условиях жесткой богары и на устойчивость к ржавчинным болезням перспективные дигаплоидные линий АДГ 1027, АДГ 1057, АДГ 1045, АДГ 1051 могут быть основой создания ценных линий и новых сортов.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для ускорения селекционного процесса рекомендуется использовать усовершенствованную гаплоидную биотехнологию.

1 Произвести высев донорного растения (межсортовые, отдаленные, межвидовые и межродовые гибриды и др ) в несколько сроков Промежуток между последующими посевами должна быть не менее 15 дней,

2 Использовать пыльники и микроспоры донорных растений первого срока для подбора оптимальных сроков холодовой предобработки и питательных сред (N6, Blaydes, Мурасиге-Скуга, Гамборга Б-5, N6M, N6P) Пыльники и изолированные микроспоры от донорных растений второго и последующих сроков посева высаживают на отобранные питательные среды с оптимальным сроком холодовой предобработки При этом обеспечивается высокий процент выхода эмбриоидов, морфогенных каплусных клеток и растений-ре генерантов,

3 Для регенерации растений эмбриоиды следует пересадить на питательную среду MCR (0,5 мг/л ИУК) и культивировать при 15 °С на свету Каллусы следует пересадить на питательную среду для каллусогенеза МСС (2 мг/л 2,4-Д) и культивировать при 27 °С

4 В зависимости от целей и задач экспериментов эмбриоиды также могут быть пересажены на среду для каллусогенеза (МСС) При этом происходит дедифференциация эмбриоидов и образование морфогенных каллусов, из которых можно многократно регенерировать спонтанные дигаплоидные растения,

5 Для определения морфогенетического потенциала андроклинных структур структур (эмбриоиды, морфогенные и нефорфогенные каллусы) рекомендуется использовать показатели уровня активности ключевых ферментов метаболизма, таких как нитратредуктаза, глютаматдегидрогеназа.

а-амилаза и ферментного комплекса малатдегидрогеназа и глютаматоксалоацетатаминотрансферазы; , »■• ..

6. В селекции - пшеницы рекомендуется использовать созданные в результате применения усовершенствованной гаплоидной биотехнологии 370 ' новых дигаплоидных линии в качестве исходного материала по отдельным и комплексу признаков;,

7. Дигаплоидные линий АДГ 1027, АДГ 1057, АДГ 1045 и АДГ 1051 рекомендуются использовать в качестве источников и доноров генов высокой продуктивности и устойчивости к биотическим и абиотическим факторам среды. -

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Анапияев Б.Б. Процессы морфогенеза в культуре пыльников пшеницы // Сб. Проблемы соврем, биол. МГУ, - M., 1989, - С. 73-77." ;

2. Анапияев Б.Б. Пути морфогенеза в культуре пыльников пшеницы // Тр. конф. Мол. учен. КазГу. - Алма-Ата, 1989, - С. 123.

3.Кударов Б.Р., Шамров И.И., Анапияев Б.Б. Структурные особенности морфогенетических изменений в культуре пыльников пшеницы // Матер. Всесоюзн. конфер. по биотехнол.злаховых культур. - Алма-Ата, - 1988, - С. 21-22. • ' •

4.Богуспаев К.К., Кударов Б.Р.,' Анапияев Б.Б. - Индукция гаплоидных растений в культуре пыльников пшеницы // Респ. конфер. фичиол. основы, повыш. устойчив, и

, продукт, с-х. растен.-Алма-Ата, Наука, - 1988, - С. 120-122.

5.Анапияев Б.Б., Богуспаев К.К., Кударов Б.Р., Рахимбаев И.Р. Использование культуры изолированных пыльников и микроспор в селекции пшеницы// Матер. Всесоюзн. конфер. по с-х. биотехнол. - Целиноград, - 1991, - С. 53-54. .

' б.Анапняев Б.Б., Кударов Б.Р., Есмагулов : К.Е., Богуспаев К.К., Каржасова A.B. Получение андроклинных гаплоидов пшеницы II Сб. научн. тр. Актуальные проблемы соврем. Биол. - Алма-Ата, КазГу, - 1991, - С. 24-25.

• 7.Рахимбаев И.Р., Богуспаев К.К., Батыргожин Б.А., Анапияев Б.Б. Разработка методов генетической трансформации клеток репродуктивных структур и приемов регенерации растений из них трансгенных растений // Тез. Докл. 1 Всесоюзн. Планово-отчетн. Конфер. по напр. Генная и клеточн. инженерия. Ноябрь-Декабрь, 1990 г. Пущино-на-Оке. - М., -1991,-С. 116. ' . " : • •

8.Анапияев Б.Б., Богуспаев К.К., Шегебаев О.Ш. Культура изолированных пыльников в селекции пшеницы // Биотехнология, прилож. к экспресс. информ. Новости науки Казахстана.- Алма-Ата, - 1991, - С. 33-34.

.. 9.Каржасова A.B., Кушнаренко C.B., Анапияев Б.Б. Выращивание растений-регенерантов в водной-почвенной культуре // Акт о внедрении завершен. НИР в учебн. процесс. В разделе Минеральное питание. Большой практикум, от. 6.07.1988.' ' -

Ю.Богуспев К.К., Тулегенова Б.Т., Аликулов З.А., Анапияев Б.Б. Активность нитратредуктазы как биохимический маркер морфогенеза в культуре изолированных микроспор пшеницы и ячменя // Матер. 2 Конфер. ВОФР. Минск, 1990, - Москва, -Наука,-1992,-С.28. . .

11 .Bogouspaev К.К., Kudarov B.R., Anapiaev B.B. Rachirabaev I.R. Division and embryogenesis in isolated microspores of wheat culture // Pr. XI Inter. Symp. Embryol. and seed reprod. - St. Petersburg. - Nauka, - 1992, - P. 86-87.

12 Kudarov В R, Anapiaev В В , Bogouspaev К К , Shamrov 11, Batygina T В Pat ways of morphogenesis in culture of wheat anther U Pr XI Inter Syrop hmbryol and seed reprod - St Petersburg - Mauka, - 1992,-P 294-295

13 Anapiaev В В . Aniceeva L A, Fursov О V Bogouspaev К К. Efectroforetic pattern and activity of et-amilase on the early morphogemc stages in the wheat microspore culture // Proc II Inter confer Biology of plant cell cult and biotechnol Almaty, - 1993,-P 40.

14 Anapiaev Bogouspaev К К, Iskakova K.M , Rachimbaev IR. Morphogenesis in culture of the wheat and barley microspores // Proc II Inter confer Biology of plant cell cult and biotechnol Almaty, - 1993,-P 39

15 Anapiaev В В . Valikhanova G J , Bogouspaev К К The factors influence on the processes of callus ogenesis and somatic embryogenesis in microspore culture of wheat // Актуальные проблемы соврем биол КазГу, - Алматы, - 1993, - Р 38-42

16 Anapiaev В В, Blohma ОМ, Yevdakova N, Kaliev АВ, Zairov А В Genetic transformation of Tnticum aestivum L by use haploid cells // Pr VII Inter Confer "Biology cells of plants in vitro Biotechnol and preservation of genofonds" Moscow 25-28 Nov 1997 -M,- 1997, P 241

17 Анапияев Б Б Процессы регенерации растений в культуре микроспор отдаленных гибридов пшеницы// Биотехнология Теория и практика - №4, - 1997, - С 20-23

18 Анапияев Б Б Экологическая селекция пшеницы биотехнологические аспекты Матер 2 ой Меясдунар Конфер Проблемы жологии АПК и охрана окр Среды Тараз Алматы - 1998 - С 94-96

19 Анапияев Б Б Особенности андрогенеза in vitro в культуре микроспор Tnticum aestivum L '/ Матер Межд Научно техн Конфер Почвозащитная система земледелия и зерновое np-во на Евразиисхом континенте в XXI в - Новосибирск, - 1998 - С 71-73

20 Анапияев Б Б Отбор на качество зерна дигаплоидных таний полученных в культуре микросгтр Tnticum aestivum L //Биотехнология Теория и практика. - 1998,-N 1-2 (5-6), -С 13-14

21 Чнапияев Б Б Современные направления экологической селекции пшеницы // Сб Проблемы агроэкологии на пороге XXI века. Алматы Бастау - 1998 -С 147-150

22 Anapiaev В В Morphogenesis m microspore culture of wheat and results use of haploid technology in selection// Uht Inter Congr FFSPP Varna Bulgaria 7-11 Sep -1998 P 69

23 Anapiaev В В . Pohmbetova F A , Bogdanova E D , Satybaldiev D Prospekts on haploid technology in breeding for Tnticum aestivum L resistance // Proc Inter Symp Molecular mechanisms of stress responses in plants Sept 2 Moscow -M.- 1998 -P 105

24 Анапияев Б Б, Сатыбалдиев Д Д. Богданова Е Д, Полимбетова Ф А Использование гаплоидной технологии в селекции пшеницы на засухо-устойчивость // Известия МН-АН РК Серия бнол и мед - 1999, № 5-6, - С 116-120

25 Анапияев Б Б, Кузовлев В А Особенности активности ферментов амилолитического комплекса и урожайность андроклинных дигаплоидных линии пшеницы// Биотехнология Теория и практика - 1999,-Л® 1-2 (9-10), -С 141-143

26 Анапияев Б Б, Сатыбалдиев Д Д, Богданова Е Д, Полимбетова Ф А Использование биотехнологических методов в экологической селекции пшеницы // Матер Межд. конф стратегия земледел на порогеXXI века п Алмалыбак 24-26 июня, - 1999, -С 141-143

27 Анапияев Б Б, HvpneiicoB И А , Абугалиев С Г и др , Результаты использования гаплоидной технологии в практической селекции Tnticum aestivum L Н Тез докл IV съедаОФРР Москва 4 9 0кт - 1999,-С 517

28 Anapiaev В В , Satybaldiyev D О, Bogdanova Е D , Pohmbetova F A Results use of haploid technology in selection of wheat for drought tolerance // Матер Научно-практической конфер Физиол-биохим и генет основы прод>ктив и устойчив растен - Алматы, -1999 -С 131-133

- 29.Анапияев Б.Б., Рахимбаев И.Р. Перспективы использовыания гаплоидных клеток в генетической инженерии ■ растений // Матер. Всерос. Симпоз. Изучение генома и генетическая трансформация растений, Иркутск, Россия, 1999, -С. 34.

30.Anapiaev В.В., Satybaldiev D., Bogdanova E.D., Polimbetova F.A. A haploids in the ecological selection of Triticum aestivum L. for resistance // Abstracts International Symposium New Frontiers in Plant Science and Plant Biotechnology, Tuluze, France, 2000. P. 57.

31.Anapiyayev B.B., Rsaliyev Sh.T., Sarbayev A.T., Satybaldiyev D.D. Rapid production of wheat lines resistant to rust and septoryoze diseases with the method of haploid biotechnology I/ Abstracts 11-th EWAC Conference, 24-28 July, 2000, Novosibirsk, Russia, P. 143.

32.Anapiaev B.B., Satybaldiev D., Bogdanova E.D., Polimbetova F.A Rapid production of lines and forms of wheat with drought resistance using haploid technology // Abstracts 6-th International Wheat Conference, Wheat in a Global Environment, 5-9 June, 2000, Budapest, Hungary, P. 306. •'

33.Anapiaev B.B., Satybaldiev D., Polimbetova F.A. A haploid technology in wheat selection for salt tolerance II Abstracts Second Balcan Botanical Congress, Istanbul, Turkey, May 14-18, 2000, P. 203.

34.Anapiaev B.B., Satybaldiev D., Bogdanova E.D., Polimbetova F.A. Haploid technology in ecological selection of Triticum aestivum L. for drought tolerance // Биотехнология. Теория и практика. 2000, N 1-2 (13), P. 37-41.

35.Anapiaev B.B. The effect of genotype on the frequency of regeneration of plants in a microspore culture of Triticum aestivum L. // R. J. of Genetics, 2000, - V. 36, - N 4, -P. 404407.

36.Богуспаев K.K., Ережепоа A.E., Анапияев Б.Б. Биохимические маркеры морфогенеза в кульуре изолированных пылыюков ячменя и пшеницы // Биотехнология. Теория и практика. 2000, N 1-2 (13), Р. 56-61. ' "

37.Сатыбалдиев Д.Д., Анапияев Б.Б., Богданова ЕЛ., Полимбетова Ф.А. Использование гаплоиднои биотехнологии в селекции пшеницы на продуктивность и устойчивость // Биотехнология. Теория и практика. 2000, N3-4 (14), Р. 137-138. :

38.Anapiyayev В.В., Satybaldiev D.D., Iskakova К.М. An efficency of haploid biotechnology for rapid selection of cereal crops // Biotechnology-2000. Seminar-Presentation of scientific and technical innovation projects. Pushino, 26-28 Sep. 2000. P. 115-116. .

39. Анапияев Б.Б., Рсалиев Ш.Т., Сарбаев A.T. и др.. Гаплоидная биотехнология в экологической селекции на продуктивность и устойчивость пшеницы (Triticum aestivum L.) //Продукционный процесс. Матер. Междунар. Конфер. - Орел, - 2001, - Т. 2, - С. 55-60

40. Анапияев Б.Б., Сатыбалднев Д.Д., Искакова К.М. и др., Ускоренная селекция пшеницы с применением гаплоидной биотехнологии И Проблемы экологии АПК. Матер. Междунар. конфер. - Усть-Каменогорск, - 2000, - С. 67-69.

41.Рахимбаев И.Р., Анапияев Б.Б. Гаплоидная биотехнология генетического улучшения зерновых культур//Вестник КазГНУ, -Алматы, - 2001, №1(13), - С. 36-39.

.. 42.Anapiyayev В.В., Satybaldiyev D.D., Bogdanova E.D., Polimbetova F.A. Haploid cell systems in ecological selection for resistance of Triticum aestivum L. //Proc. II Balcan Bot. Congr. Istanbul, - 2001, - P. 170-173.

43.Аналияев Б.Б. Гаплоидная биотехнология и перспективы ее использования в генетической инженерии растений //Коля. Монограф. ИФР СО РАН. - Иркутск, - 2000, в печати. v

44.Анапияев Б.Б., Сатыбалднев ДД, Исхакова К.М. Способ получения гаплоидных растений в культуре микроспор. зерновых , культур //Заявка , на патент Республики Казахстан. № гос регистрации 2000/13851.

45.Аналияев Б.Б. Культура микроспор и гаплоидная биотехнология пшеницы // Монография. Под. ред. Рахимбаева И.Р. — Алматы, - 2001,220 с.

Объем 3f2fhe4 л

Чак 320

Тираж 100 экз

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Анапияев, Бахытжан Бейсенбекович

ВВЕДЕНИЕ.

I.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Культура изолированных пыльников и микроспор зерновых культур: Современное состояние и перспективы.

II.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Объекты исследования.

2.2.Методы исследования.

2.2.1.Выращивание донорных растений.

2.2.2. Определение стадии развития пыльцы.

2.2.3. Холодовая предобработка колосьев, выделение и культивирование пыльников.

2.2.4. Культура изолированных микроспор пшеницы.

2.2.5. Пересадка андроклинных структур и получение растений-регенерантов.

2.2.6. Методы изучения АДГ линий на устойчивость к биотическим факторам среды.

2.2.7. Биохимические методы исследования андроклинных структур и семян дигаплоидных линии пшеницы.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ МОРФОГЕНЕЗ И РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ МЖРОСПОР ПШЕНИЦЫ IN VITRO

3.1.Развитие микроспор пшеницы in vitro.

3.2. Первичный эмбриоидогенез в культуре микроспор пшеницы.

3.3. Морфогенез и регенерации растений в культуре андроклинных каллусов пшеницы.

4. БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССОВ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ АНДРОКЛИННЫХ КАЛЛУСОВ ПШЕНИЦЫ.

4.1.Активность ферментов амилолитического комплекса и морфо-генетический потенциал андроклинных каллусов пшеницы.

4.2.Активность нитратредуктазы у морфогенных и неморфогенных андроклинных каллусов пшеницы.

4.3.Изучение активности глютаматдегидрогеназы в андроклинных каллусах пшеницы

4.4.Изучение активности ферментного комплекса [МДГ+ГОАТ] для оценки морфогенетического потенциала андроклинных каллусов пшеницы.

5. БИОТЕХНОЛОГИЯ СОЗДАНИЯ АНДРОКЛИННЫХ ДИГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ПШЕНИЦЫ

6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГАПЛОИДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ В

ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ ПШЕНИЦЫ.

6.1. Культура микроспор сортов и гибридов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L).

6.2.Культура микроспор сортов и гибридов твердой пшеницы Triticum durum.

6.3. Культура микроспор отдаленных гибридов пшеницы

7. ГАПЛОИДНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ В ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ ПШЕНИЦЫ

7.1. Использование гаплоидной биотехнологии в экологической селекции пшеницы на засухоустойчивость.

7.2. Использование гаплоидной биотехнологии в селекции пшеницы на устойчивость к биотическим факторам среды

8. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГО БИОХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ДИГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ПШЕНИЦЫ.

8.1. Изучение активности ферментов амилолитического комплекса в зерне андроклинных дигаплоидных линии пшеницы.

8.2. Урожайность, генетическая стабильность и технологические качества зерна андроклинных дигаплоидных (АДГ) линий пшеницы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспериментальный морфогенез и биотехнология получения гаплоидов в культуре микроспор пшеницы"

Актуальность проблемы» В настоящее время наблюдается тенденция увеличения объемов применения биотехнологических методов в растениеводстве, практической селекции и генетике, а также в промышленности, включая пищевую, энергетическую, фармакологию, и других важных отраслях народного хозяйства и областях научных дисциплин. В связи с этим, все большее значение приобретает одно из новых направлений растениеводства - биотехнология, где в качестве приоритетных звеньев выделяют разработку и освоение эффективных методов культуры клеток, тканей и органов растений, основанных на достижении фундаментальных исследований в области физиологии, генетики, ботаники, молекулярной биологии и других наук. Среди них особое внимание и практическую ценность для зерновых злаков представляет экспериментальная гаплоидия. Явление гаплоидии имеет важное теоретическое и практическое значение, поскольку доказывает, что генетическая информация, представленная только одним геномным набором хромосом, полностью обеспечивает реализацию программ онтогенеза.

Гаплоиды позволяют за короткое время получать из гибридных популяций гомозиготные, константные линии, использование которых в селекционных программах значительно сокращает время получения новых высокопродуктивных сортов. Гаплоиды являются уникальным и перспективным объектом для клеточной и генетической инженерии растений. Установлено, что чужеродные гены (рекомбинантная ДНК) введенные в растительную клетку, в последующих репродукциях оасшепляготся по закону Менжеля (3:11 Поэтому для генетической клеток в разработках в области генетической и клеточной инженерии растений.

Несмотря на изобилие литературных данных и научных обзорных статьей, отсутствуют крупные обобщающие, классифицирующие и анализирующие работы, посвященные гаплоидной биотехнологии, в особенности стратегически важной для экономики страны зерновых культур.

До настоящего времени в отечественной и зарубежной литературе, посвященной гаплоидной биотехнологии, наблюдается отсутствие единой терминологии для обозначения одного и того же процесса, что, конечно, затрудняет правильное понимание процессов и явлений, наблюдаемых в культуре микроспор зерновых и других важных сельскохозяйственных культур и различных видов растений. Например, в основном в зарубежных и некоторых отечественных работах, посвященных культуре микроспор и гаплоидной биотехнологии, используется термин «андрогенез» или «андрогенез in vitro» (Тырнов, 1986). Для обозначения полученных таким образом гаплоидов, также часто используется термин «андрогенные гаплоиды» (Петров, 1988). В данном случае, мы считаем правильным использовать термин «андроклиния» и классификацию происхождения гаплоидов, предложенных Хохловым и др. (1976).

Для описания процессов формирования эмбриоидов часто ошибочно используется термин «эмбриогенез», что часто приводит к путанице и неправильному пониманию прохождения данного процесса in vivo или in vitro. Исходя из того, что процесс «эмбриогенеза» происходит при половом размножении при развитии зародыша, правильно было бы использовать термин «эмбриоидогенез» для обозначения процессов, приводящих к формированию эмбриоидов в культуре in vitro (Батыгина, 1987).

Для зерновых злаков разработано несколько методов получения гаплоидов (метод "бульбозум", культура репродуктивных органов), среди которых более эффективным для массового получения растений-регенерантов является метод культуры изолированных пыльников и микроспор. Однако в настоящее время этот метод все еще не находит широкого применения в практической селекции пшеницы.

Современные направления селекции и генетики сельскохозяйственных культур ориентированы на использование достижений биотехнологии растений. Среди биотехнологических методов ускорения селекционного процесса самым оптимальным и экологический абсолютно безвредным является применение методов гаплоидной технологии. В частности показано, что отбор по маркерным признакам у гаплоидной технологии по сравнению с отбором в F4 был в 5-6 раз эффективнее (Howes et. al., 1998). Существующая гаметоклональная изменчивость наблюдаемая у гаплоидов не может быть препятствием для использования гаплоидной биотехнологии в селекции пшеницы (Baenziger et. al., 1991). В настоящее время есть много экспериментальных примеров, подтверждающих эффективность и применимость гаплоидной биотехнологии в селекции зерновых культур (Murigneux et. al., 1993).

В экологической селекции пшеницы на устойчивость, новые линии и сорта наряду с устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды (засухоустойчивость, солеустойчивость, устойчивость к болезням и др.) должны сочетать в себе высокую урожайность и хорошие телеологические качества зерна. Гаплоиды позволяют за короткое время получать из гибридных популяций гомозиготные, константные линии, использование которых в селекционных программах значительно сокращает время получения новых высокопродуктивных сортов. Гаплоиды являются уникальным и перспективным объектом для клеточной селекции и генетической инженерии растений. Установлено, что чужеродные гены (рекомбинантная ДНК) введенная в растительную клетку, в последующих репродукциях расщепляются по закону Менделя (3:1). Поэтому для генетической стабилизации трансформантов очень эффективным и перспективным в теоретическом и в практическом плане является использование гаплоидных клеток (Anapiyayev et. al., 1997).

Для зерновых злаков разработано несколько методов получения гаплоидов (метод "бульбозум", культура репродуктивных органов) среди которых более эффективным для массового получения растений-регенерантов является метод культуры изолированных пыльников и микроспор. Проблеме культуры изолированных пыльников и микроспор посвящено множество экспериментальных работ и обзорных статьей и монографий (Бутенко, 1975, Хохлов и др., 1976; Шамина, 1981; Суханов, 1983; Дьячук, Дьячук, 1989; Picard et. al., 1990). Однако, несмотря на некоторые успехи, в настоящее время этот метод все еще не находит широкого применения в практической селекции из-за недостаточного развития теоретических разработок, низкого выхода растений-регенерантов и других факторов.

Цели и задачи исследований. Целью данного исследования являются изучение закономерностей процессов морфогенеза и регенерации растений, разработка и усовершенствование гаплоидной биотехнологии в культуре изолированных микроспор пшеницы. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Выявление путей развития микроспор пшеницы in vitro, приводящих к образованию многоклеточных комплексов (МК), способных формировать эмбриоиды и морфогенные каллусы;

2. Цитоэмбриологические и биохимические исследования закономерностей процессов морфогенеза и регенерации растений из эмбриоидов и каллусных структур;

3. Разработка и усовершенствование гаплоидной биотехнологии в культуре микроспор пшеницы для получения эмбриоидов, морфогенных каллусов и растений-регенерантов из различных преспективных межсортовых, межлинейных, межвидовых и межродовых гибридов пшеницы;

4. Использование усовершенствованной гаплоидной биотехнологии в экологической селекции пшеницы на устойчивость к аботическим и биотическим факторам окружающей среды;

5. Создание константных андроклинных дигаплоидных линий (АДГ) и изучение их хозяйственно-ценных показателей и генетической стабильности;

6. Внедрение высокопродуктивных АДГ линий в селекционные программы по созданию ценных форм и сортов пшеницы, устойчивых к неблагоприятным факторам среды. Научная новизна и практическая ценность.

Проведено комплексное физиолого-биохимическое, цитоэмбриологи-ческое и генетическое исследование с одноклеточного уровня микроспор, формирования многоклеточных комлексов по-этапно до организменного уровня создания дигаплоидных линий, что позволило разработать и усовершенствовать гаплоидную биотехнологию пшеницы. В результате цитоэмбриологических исследований развития микроспор в культуре in vitro выявлены осовные пути формирования МК, способных формировать эмбриоиды и морфогенные каллусы - путь А1, путь В1 и путь Е. При развитиии микроспор по пути Е происходит образование МК путем прямого деления. В процессе морфогенеза регенерация растений осуществляется через эмбриоидогенез (первичный, вторичный) и органогенез (геммогенез, гемморизогенез). В качестве биохимических маркеров морфогенеза могут быть использованы ключевые ферменты метаболизма, такие как, а-амилаза, нитратредуктаза, глютаматдегидрогеназа и ферментный комплекс малатдегидрогеназа - глютаматоксалоацетатаминотрансфераза.

На основе изучения физиолого-биохимических и цитоэмбриоло-гических особенностей процессов морфогенеза и регенерации растений в культуре микроспор in vitro разработана и усовершенствована гаплоидная биотехнология, которая может быть успешно использована в практической селекции зерновых культур, клеточной селекции и генетической инженерии растений. Продемонстрированы возможности использования гаплоидной биотехнологии в экологической селекции пшеницы на устойчивость к абиотическим (селекция на засухоустойчивость) и биотическим (ржавчинные болезни и септориоз) факторам окружающей среды. Для создания засухоустойчивых АДГ линий использованы гибриды несущие гены RL1 и RL2, которые контролируют доминантный признак "свернутые листья". Исследованиями установлено, что введение указанных генов улучшает водный режим и способствует повышению засухоустойчивости растений. Для экологической селекции пшеницы на устойчивость к ржавчинным (бурая, желтая, стеблевая) болезням и септориозу использован источник гена Lr 24, который является эффективным для регионов Казахстана возделывающих пшеницу.

Разработанная и усовершенствованная гаплоидная биотехнология успешно использована в культуре микроспор сортов и межсортовых, отдаленных межродовых и межвидовых гибридов Triticum aestivum L, Triticum durum, Aegilops cylindrica, Äegilops triaristata, Triticum thimopheevi, Triticum turanicum, Triticum turgidum,Triticum dicoccoides, Triticum militina, Triticum kihara. В результате использования усовершенствованной гаплоидной биотехнологии созданы более 370 перспективных АДГ линий из различных гибридов пшеницы. Выделены ценные номера АДГ линий, которые по урожайности, устойчивости к неблагоприятным факторам окружающей среды (засуха, ржавчинные болезни и др.), технологическим характеристикам зерна (содержание белка, клейковины, твердозерность и др.) значительно превосходят контрольные сорта. В результате исследования спектров запасных белков (глиадины, глютенины) в Н1-Н7 репродукциях показана генетическая стабильность и чистота АДГ линий. Высокопродуктивные АДГ линий внедрены в селекционный процесс, прошли контрольное сортоиспытание и могут быть основой создания ценных линий и новых сортов.

Ценные дигаплоидные линии используются в прикладных и фундаментальных исследованиях совместно с КазНИИ земледелия (п. Алмалыбак, Алматинская обл.), НИСХИ (пгт. Гвардейский, Жамбылская обл.), КазГНУ им. Аль-Фараби (г. Алматы), Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина (г. Алматы), Институт общей генетики РАН (г. Москва), Сельскохозяйственный университет (г. Файсалабад, Пакистан), Международной организации по улучшению пшеницы и кукурузы С1ММУТ (г. Анкара, Турция), Институт исследования пустынь университета им. Бен-Гуриона (г. Седе Бокер, Израиль), Институт биохимии университета им. Г. Гейне (г. Дюссельдорф, Германия) и др.

Методы исследований и результаты работы включны в "Методические рекомендации по культуре пыльников и изолированных микроспор ячменя и пшеницы» (Кударов и др., 1990), в учебник "Биотехнология растений" (Валиханова, 1997) и используются при чтении спецкурсов "Биотехнология растений", входящих в программы учебного процесса кафедры физиологии и биохимии растений Биологического факультета КазГНУ им. Аль-Фараби, кафедры Биотехнологии Аграрного университета и других высших учебных заведений.

Апробация работы. Результаты исследовании и основные положения диссертации докладывались на Международных, Всесоюзных и Республиканских научных конгрессах и конференциях: конференциях молодых ученых КазГНУ (Алматы, 1988,1990); МГУ (Москва, 1989); Уфа (1989); Республиканской научно-практической конференции "Повышение продуктивности и устойчивости зерновых культур" (Алматы, Целиноград, Алматы, 1988, 1990, 1999). Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алматы, 1988); Международном симпозиуме по клеточной и генной технологии для зерновых злаков (Алматы, 1989); Международном симпозиуме по эмбриологии и семенному размножению (Санкт-Петербург, 1990); II-IV съезде ВОФР (Минск, 1990; Санкт-Петербург, 1993; Москва, 1999); 1 Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино-на-Оке, 1990); Всесоюзной научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (Целиноград, 1991); Всесоюзной конференции "Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды (Новосибирск, 1991); V конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991); II Международной конференции Биология растительных клеток и биотехнология (Алматы, 1993); Международной конференции «Аграрная наука на рубеже веков» (Акмола, 1997); VII Международном конференции Биология клетки растений in vitro. Биотехнология и сохранение генофонда (Москва, 1997); Международной конференции «Состояние и перспективы развития биотехнологии растений» (Алматы, 1997); Международной конференции «Проблемы экологии АПК и охраны окружающей среды (Тараз, 1998; Усть-Каменогорск, 2000); Международной научно-технической конференции «Почвозащитная система и зерновое пр-во на Евразийском континенте в XXI в. (Акмола, 1988); 11 Международном конгрессе FESPP (Варна, Болгария, 1998); Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы стрессовых ответов у растений» (Москва, 1998); VI Международной конференции по развитию пустынных земель (Каир, Египет, 1999); Всероссийском симпозиуме по изучению генома и генетической трансформации растений

Иркутск, 1999); Международном симпозиуме по растению и биотехнологии (Тулуза, 2000); 11-ой Международной конференции по анеуплоидии пшеницы (Новосибирск, 2000); VI Международной конференции пшеницы (Будапешт, Венгрия, 2000); II Международном Балканском ботаническом конгрессе (Станбул, Турция, 2000); Международной конференции по биотехнологии (Степногорск, 2000); Международном семинаре презентации инновационных научно-технических проектов Биотехнология 2000 (Пущино, 2000); Научных семинарах кафедры физологии и биохимии растений КазГНУ им. Аль-Фараби, Лаборатории роста и устойчивости Института физиологии, генетики и биоинженерии растений, Центра биологических исследовании (Сегед, Венгрия), Биотехнологическом центре Венгрии (Годолло, Венгрия), Лаборатории по биотехнологии растений Национального института биотехнологии и генетической инженерии растений (Файсалабад, Пакистан), Интитуте исследования пустынь университета Бен-Гуриона (Седе Бокер, Израиль), расширенном семинаре отдела биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений (Москва, Россия). Публикации. Основные положения диссретации отражены в 115 печатных работах,опубликованных в отечественных и зарубежных изданиях, включая две монографии и одну заявку на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 210 страницах машинописного текста. Состоит из введения, основной части, включающей следующие разделы: обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, заключения, выводы и рекомендации по использованию полученных результатов. Содержит 23 таблиц, 42 рисунков. Список использованных источников содержит 373 ссылок, из них 217 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Анапияев, Бахытжан Бейсенбекович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время в связи с глобальными изменениями экологической обстановки крайне необходимо разработать быстрые и эффективные технологии селекции сельскохозяйственных культур на устойчивость к экстремальным факторам (засуха, болезни и др.) окружающей среды. Среди сельскохозяйственных культур стратегически важными для экономики страны являются зерновые культуры. На современном этапе практически исчерпаны возможности увеличения продуктивности и адаптивности сельскохозяйственных растений методами традиционной селекции и генетики. В XXI веке в обеспечении продуктами питания растущего быстрыми темпами населения Земли решающую роль будут иметь современные усовершенствованные биотехнологические методы и методологии создания новых форм и сортов важных сельскохозяйственных культур, в том числе основной зерновой культуры - пшеницы (Borlaug, 2000; Altaian, 1999; Vasil, 1999; Уразалиев, 1998; Рахимбаев, 1999). Современная биотехнология относится к интенсивно развивающимся областям наукоемких технологий и способствует значительному прогрессу многих отраслей народного хозяйства. Поэтому разработка и усовершенствование современных подходов и методов биотехнологии, а также изучение путей, обеспечивающих эффективность применения новых разработок в практической селекции и генетике зерновых злаков, являются очень актуальными. Методами традиционной селекции для создания новых сортов зерновых культур в среднем требуется 10-12 лет. Для сокращения срока селекционного процесса и увеличения эффективности селекции активно начали применяться биотехнологические методы, среди которых особое место занимает гаплоидная биотехнология (Ни , Kasha, 1997; 1999; Holme et. al., 1999; Puolimatka, Pauk, 1999; Hansen, Andersen, 1998; Bruis et. al., 1996; Gustafson et. al., 1995; Hu et. al., 1995; Анапияев и др, 2000). Гаплоиды позволяют всего за 1-2 года создавать из перспективных гибридов стабильные гомозиготные линии.

Однако данная технология все еще не находит широкого практического применения, что связано с нерешенностью многих теоретических и методических вопросов, неразработанностью технологии массового получения растений-регенерантов, управления процессами морфогенеза и другими. В настоящее время для получения гаплоидов используются различные методы (Fisher et. al., 2000; Bagheri et. al., 2000; Kinyi et. al., 2000). Среди этих методов нам более эффективным для получения гаплоидов пшеницы является метод культуры микроспор пшеницы in vitro. Однако, несмотря на некоторые методические успехи, данный путь получения гаплоидов имеет некоторые малоизученные аспекты, которые могут иметь решающее значение в увеличении эффективности гаплоидной биотехнологии. До настоящего времени остается открытым вопрос о путях развития микроспор in vitro, которые в последующем могут формировать эмбриоиды и морфогенные каллусы, способные регенерировать растения (Резникова, 1984; Shimada, 1989; Tan, Holloran, 1980; Горбунова и др, 1993).

Нами в результате цитоэмбриологических исследований установлены основные пути развития микроспор пшеницы in vitro, приводящие к образованию МК, эмбриоидов и морфогенных каллусов (путь Аь В]). Кроме вышеперечисленных путей мы предполагаем наличие и третьего пути развития микроспор в культуре in vitro, обозначенный как путь Е. При этом формирование МК происходит путем прямого деления микроспор в культуре in vitro.

Установлено, что регенерация растений в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы осуществляется различными путями морфогенеза - эмбриоидогенез (первичный и вторичный) и органогенез геммогенез и гемморизогенез). В процессе формирования эмбриоидов существуют критические периоды развития (формирование проэмбрио, стадия глобулы), которые определяют дальнейшй ход протекания процессов морфогенеза и регенерации растений. Ключевые ферменты метаболизма, такие как а-амилаза, нитратредуктаза, глютамат-дегидрогеназа, ферментный комплекс глютаматдегидрогеназа и глютаматоксалоацетатаминотрансфераза, могут быть использованы в качестве биохимических маркеров морфогенеза в культуре андроютинных структур пшеницы (эмбриоиды, каллусы).

В результате изучения физиолого-биохимических и цитоэмбрио-логических особенностей процессов морфогенеза и регенерации растений в культуре микроспор пшеницы in vitro создана воспроизводимая модельная система, разработана и усовершенствована гаплоидная биотехнология, которая может быть успешно использована в практической селекции для создания ценных дигаплоидных линий из перспективных гибридов (межсортовых, отдаленных межвидовых и межродовых) зерновых культур, в клеточной селекции и генетической инженерии растений.

В результате проведенных исследований показана принципиальная возможность использования гаплоидной биотехнологии в экологической селекции пшеницы на устойчивость к экстремальным факторам окружающей среды. Среди экстремальных факторов засуха является одним из основных лимитирующих факторов, поэтому интенсивно ведутся селекционные работы по выведению засухоустойчивых линий и сортов зерновых культур (Chowdhury, 1990; Kohmetova, Urazaliev, 2000; Dong et. al., 2000; Kershanskaya, 2000; Anapiyayev et.al., 2000).

Для создания засухоустойчивых дигаплоидных линий пшеницы были использованы гибриды, созданные с использованием донора генов RL 1 и RL 2 (изогенная линия Грекум 476), контролирующих признак свертывание листьев" (Богданова, 2000). Исследованиями показано, что введение указанных генов улучшают водный режим и способствуют повышению засухоустойчивости пшеницы в аридных условиях.

Широко распространенными заболеваниями в регионах возделывания пшеницы являются бурая, желтая, стеблевая ржавчина и септориоз, которые в годы эпифитотии вызывают снижение урожая до 30 % и более. Химические методы борьбы с данными болезнями являются неэффективными, поэтому нужно вести постоянную селекцию на устойчивость к ржавчинным болезням и септориозу. Для создания резистентных линий и сортов пшеницы используются традиционные подходы селекции и современные методы молекулярной биологии и биотехнологии с привлечением гаплоидов (Bogdanova, 2000; Werner et. al., 2000).

Изучены и идентифицированы более 70 генов, отвечающих за резистентность пшеницы к ржавчинным болезням. Однако не все гены эффективны для использования в регионах Казахстана, возделывающих пшеницу. Среди них ген Lr 24 является эффективным, и часто используется в селекционных программах для создания резистентных линий и форм пшеницы (Keller et. al., 2000; Zavodna et. al., 2000; Boskovic et. al., 2000). Нами для культуры микроспор были использованы гибриды, созданные с участием изогенной линии - источника гена Lr 24. Данная линия создана на основе сорта "Thatcher", который в селекционных программах часто используются в качестве источника гена Lr 24 (Sharma, Chawla, 1990). При исследовании резистентности к ржавчинным и септориозным болезням в двух регионах Южного Казахстана (Алматинская обл., Жамбылская обл.) выделены устойчивые и перспективные номера АДГ линий пшеницы.

В результате использования разработанной гаплоидной биотехнологии были созданы ценные дигаплоидные линии из перспективных гибридов пшеницы, которые были использованы в селекционных программах. У АДГ линий изучены урожайность, технологические качества зерна (содержание белка, клейковины, твердозерность и др.), генетическая стабильность, спектр запасных белков (глиадины, глютенины) и другие хозяйственно ценные показатели. Среди АДГ линий обнаружены номера, которые по урожайности и по технологическим качествам зерна, устойчивости к ржавчинным болезням значительно превосходят стандартные контрольные сорта. В спектрах запасных белков в Н] и Н7 репродукциях отличий не обнаружено, что свидетельствует о высокой генетической чистоте и стабильности исследованных АДГ линий пшеницы. В настоящее время перспективные номера дигаплоидных линий (АДГ 1027, АДГ 1057, АДГ 1045 и др.) прошли контрольное сортоиспытание и после размножения будут переданы на Государственное сортоиспытание.

Таким образом, в результате проведенных комплексных исследований прослежен весь путь развития от стадии (одноклеточной) микроспоры до регенерации целого организма (МК, проэмбрио, глобула, эмбриоидогенез, каллусогенез), от гаплоидных растений-регенерантов до дигаплоидных линий. Выявлены основные пути формирования многоклеточных комплексов (путь Аь путь В] и путь Е), критические стадии развития андроклинных структур (проэмбрио, глобула, эмбриоид), установлены физиолого-биохимические особенности процессов морфогенеза на уровне ключевых ферментов метаболизма. Установлено, что частота процессов эмбриоидогенеза и регенерации растений зависит от целого комплекса факторов (генотип, условия предобработки, состав питательных сред и др.), которые в дальнейшем определяют морфогенетический потенциал андроклинных структур пшеницы.

Отмечено, что для индукции процессов эмбриоидогенеза важным является не только стадия развития микроспор перед культивированием т vitro, но и уровень дифференцированности и развития эмбриоида перед пересадкой на среды для регенерации. На основе углубленных исследований цитоэмбрио логических и физиолого-биохимических особенностей процессов морфогенеза и регенерации растений создана модельная система, разработана и усовершенствована гаплоидная биотехнология, которая успешно апробирована и использована в практической селекции пшеницы. В результате применения усовершенствованной гаплоидной биотехнологии созданы перспективные дигаплоидные линии пшеницы (АДГ 1027; АДГ 1045; АДГ 1051; АДГ 1057 и др.), которые внедрены в селекционный процесс и могут служить основой ценных линий и новых сортов. В результате проведенных исследований обоснованы перспективы применения усовершенствованной гаплоидной биотехнологии в клеточной селекции на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды и в генетической инженерии растений путем использования гаплоидных клеток в качестве реципиентных систем.

Таким образом проведено комплексное физиолого-биохимическое, цитоэмбриологи-ческое и генетическое исследование с одноклеточного уровня микроспор, формирования многоклеточных комлексов поэтапно до организменного уровня, что позволило разработать и усовершенствовать гаплоидную биотехнологию растений: культура микроспор, пути развития микроспор in vitro и формирования многоклеточных комплексов (МК), особенности процессов морфогенеза, эмбриоидогенез, каллусогенез, органогенез и пути регенерации растений, получение гаплоидных растений-регенерантов, создание андроклинных дигаплоидных линий (АДГ), отбор, репродукция, изучение устойчивости АДГ линий к неблагоприятным (биотическим и абиотическим) факторам среды, урожайности и технологических качеств зерна, изучение генетической стабильности и спектров запасных белков, внедрение АДГ линий в селекционный процесс и др.

В результате цитоэмбриологических исследовании развития микроспор в культуре in vitro выявлены осовные пути формирование МК, способных формировать эмбриойды и морфогенные каллусы - путь А1, путь В1 и путь Е. При развитиии микроспор по пути Е происходит образование МК путем прямого деления. В процессе морфогенеза регенерация растений осуществляется через эмбриоидогенез (первичный, вторичный) и органогенез (геммогенез, гемморизогенез). В качестве биохимических маркеров морфогенеза могут быть использованы ключевые ферменты метаболизма, такие как, а-амилаза, нитратредуктаза, глютаматдегидрогеназа и ферментный комплекс малатдегидрогеназа -глютаматоксалоацетат-аминотрансфераза.

На основе изучения физиолого-биохимических и цитоэмбриологических особенностей процессов морфогенеза и регенерации растений в культуре микроспор in vitro разработана и усовершенствована гаплоидная биотехнология, которая может быть успешно использовано в практической селекции зерновых культур, клеточной селекции и генетической инженерии растений. Продемонстрированы возможности использования гаплоидной биотехнологии в экологической селекции пшеницы на устойчивость к абиотическим и биотическим факторам окружающей среды. Для создания засухоустойчивых АДГ линий использованы гибриды несущие гены RL1 и RL2, которые контролируют доминантный признак "свернутые листья". Исследованиями установлено, что введение указанных генов улучшают водный режим и способствуют повышению засухоустойчивости растений. Для экологической селекции пшеницы на устойчивость к ржавчинным (бурая, желтая, стеблевая) болезням и септориозу использован источник гена Lr 24, который является эффективным для регионов Казахстана возделывающих пшеницу.

Разработанная и усовершенствованная гаплоидная биотехнология успешно использована в культуре микроспор сортов и межсортовых, отдаленных межродовых и межвидовых гибридов Triticum aestivum L, Triticum durum, Aegilops cylindrica, Aegilops triaristata, , Triticum thimopheevi, Triticum turanicum, Triticum turgidum, Triticum dicoccoides, Triticum militina, Triticum kihara. В результате использования усовершенствованной гаплоидной биотехнологии созданы более 370 перспективных АДГ линий из различных ценных гибридов пшеницы. Выделены ценные номера АДГ линий, которые по урожайности, устойчивости к неблагоприятным факторам окружающей среды (засуха, ржавчинные болезни и др.), технологическим характеристикам зерна (содержание белка, клейковины, твердозерность и др.) превосходят стандартные сорта. В результате исследования спектров запасных белков (глиадины, глютенины) в Н1-Н7 репродукциях показана высокая генетическая стабильность и чистота АДГ линий. Высокопродуктивные андроклинные дигаплоидные линий (АДГ 1027; АДГ 1045; АДГ 1051; АДГ 1057) внедрены в селекционный процесс, проходят конкурсное сортоиспытание и могут быть основой создания ценных линий и новых сортов.

Теоретические подходы и методические разработки усовершенствованной гаплоидной биотехнологии могут быть использованы и адаптированы и для других важных сельскохозяйственных культур и видов растений, в клеточной селекции и генетической инженерии растений. анатомическому строению, но и по интенсивности биохимических процессов, которые обуславливают и определяют их морфогенетический потенциал.

6. Уровень активности ключевых ферментов метаболизма, таких как нитратредуктаза, глютаматдегидрогеназа, а-амилаза и ферментного комплекса малатдегидрогеназа и глютаматоксалоацетатаминотрансферазы могут быть использованы как биохимические маркеры на ранних этапах морфогенеза в культуре андроклинных структур (эмбриоиды, морфогенные и нефорфогенные каллусы) пшеницы.

7. На основе изучения физиолого-биохимических и цитоэмбрио-логических особенностей процессов морфогенеза создана воспроизводимая модельная система культуры изолированных пыльников и микроспор пшеницы in vitro и усовершенствована гаплоидная биотехнология, которая может быть использована в практической селекции, клеточной и генетической инженерии растений.

8. При скрещивании отзывчивых и неотзывчивых сортов пшеницы в потомстве сохраняется способность к высокой частоте образования андроклинных структур. Установлено, что способность к андроклинии наследуется по материнской линии. У межсортовых гибридов высокий выход андроклинных структур отмечен в первых поколениях, у отдаленных гибридов в - F3-F6. В культуре микроспор дигаплоидных линий обнаружено, что они не превышают по отзывчивости к процессам андроклинии донорные растения и гибриды.

9. Усовершенствованная гаплоидная биотехнология успешно использована в культуре микроспор сортов и межсортовых, отдаленных межвидовых и межродовых гибридов Triticum aestivum L, Triticum durum, Aegilops cylindrica, Aegilops triaristata, , Triticum thimopheevi, Triticum turanicum, Triticum turgidum, Triticum dicoccoides, Triticum militina, Triticum kihara. Теоретические подходы и методические разработки усовершенствованной гаплоидной биотехнологии могут быть использованы и адаптированы и для других важных сельскохозяйственных культур и видов растений.

10. В экологической селекции пшеницы на устойчивость к абиотическим (гены ЯЬ 1 и ЯЬ2, контролирующий признак "свертывание листьев", способствующих повышению засухоустойчивости) и биотическим (источник гена Ьг 24, обеспечивающий устойчивость к ржавчинным болезням) факторам эффективным является использование гаплоидной биотехнологии.

11. На основе использования гаплоидной биотехнологии были созданы 370 перспективных андроклинных дигаплоидных линий пшеницы, отобраны высокопродуктивные номера АДГ линий, которые по урожайности, технологическим характеристикам зерна (содержание клейковины, белка, твердозерность, и др.), устойчивости к засухе, ржавчинным и спеториозным болезням превосходят районированные в Казахстане сорта.

12. Изучена генетическая стабильность, спектры запасных белков (глиадины, глютенины) АДГ линий пшеницы. У АДГ линий по спектрам запасных белков в Н1-Н7 репродукциях существенных отличий не обнаружено, что свидетельствует о генетической чистоте и гомозиготности полученных линий. Высокопродуктивные дигаплоидные линий пшеницы внедрены в селекционные программы. Отобранные на засухоустойчивость в условиях жесткой богары и на устойчивость к ржавчинным болезням перспективные дигаплоидные линий АДГ 1027, АДГ 1057, АДГ 1045, АДГ 1051 могут быть основой создания ценных линий и новых сортов.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для ускорения селекционного процесса рекомендуется использовать усовершенствованную гаплоидную биотехнологию:

1.Произвести высев донорного растения (межсортовые, отдаленные, межвидовые и межродовые гибриды и др.) в несколько сроков. Промежуток между последующими посевами должна быть не менее 15 дней;

2.Использовать пыльники и микроспоры донорных растений первого срока для подбора оптимальных сроков холодовой предобработки и питательных сред (N6, Blaydes, Мурасиге-Скуга, Гамборга Б-5, N6M, N6P). Пыльники и изолированные микроспоры от донорных растений второго и последующих сроков посева высаживают на отобранные питательные среды с оптимальным сроком холодовой предобработки. При этом обеспечивается высокий процент выхода эмбриоидов, морфогенных каллусных клеток и растений-регенерантов;

3. Для регенерации растений эмбриоиды следует пересадить на питательную среду MCR (0,5 мг/л ИУК) и культивировать при 15 °С на свету. Каллусы следует пересадить на питательную среду для каллусогенеза МСС (2 мг/л 2,4-Д) и культивировать при 27 °С.

4. В зависимости от целей и задач экспериментов эмбриоиды также могут быть пересажены на среду для каллусогенеза (МСС). При этом происходит дедифференциация эмбриоидов и образование морфогенных каллусов, из которых можно многократно регенерировать спонтанные дигаплоидные растения;

5. Для определения морфогенетического потенциала андрокпинных структур структур (эмбриоиды, морфогенные и неморфогенные каллусы) рекомендуется использовать показатели уровня активности ключевых ферментов метаболизма и азотного обмена, таких как нитратредуктаза,

166 глютаматдегидрогеназа, а-амилаза и ферментного комплекса малатдегидрогеназа и глютаматоксалоацетатаминотрансферазы;

6. В селекции пшеницы рекомендуется использовать созданные в результате применения усовершенствованной гаплоидной биотехнологии 370 новых дигаплоидных линии в качестве исходного материала по отдельным и комплексу признаков;

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Анапияев, Бахытжан Бейсенбекович, Алматы

1. Александрова Л.Г. Лукъянюк С.Ф. Морфогенез микроспор ячменя в культуре in vitro // Научн.-техн. Бюл. Всесоюзн. Селекц. Генет. Ин-та ВАСХНИЛ. -1990. №3, С. 27-30.

2. Анапияев Б.Б. Пути морфогенеза в культуре пыльников пшеницы // Тр. конф. Мол. учен. КазГу. Алма-Ата, 1989, - С. 123.

3. Анапияев Б.Б. Процессы морфогенеза в культуре пыльников пшеницы // Сб. Пробл. Соврем. Биол. МГУ, М., 1989Б - С. 73-77.

4. Анапияев Б.Б. Процессы эмбриоидогенеза в культуре пыльников пшеницы // Матер. Научн. конфер. Изучен, охран, и рац. использов. природ, ресур.-Уфа, 1989,-С. 130.

5. Анапияев Б.Б., Темирбеков С. ДДС-электрофорез андроклинных каллусов пшеницы // Тез. конф. мол. учен. КазГу, Алма-Ата, 1990, - С. 38.

6. Анапияев Б.Б., Кударов Б.Р., Рахимбаев Б.Р., Богуспаев К.К. Процессы регенерации рстений в культуре пыльников пшеницы // Матер. Всесоюзн. конфер. генет. механиз. устойчив, растен. к неблагоприятн. фактор, среды. -Новосибирск, 1991,-С. 83.

7. Анапияев Б.Б., Богуспаев К.К., Кударов Б.Р., Рахимбаев И.Р. Использование культуры изолированных пыльников и микроспор в селекции пшеницы// Матер. Всесоюзн. конфер. по с-х. биотехнол. -Целиноград, -1991, С. 53-54.

8. Анапияев Б.Б., Кударов Б.Р., Есмагулов К.Е., Богуспаев К.К, Каржасова A.B. Получение андроклинных гаплоидов пшеницы // Сб. научн. тр. Актуальные проблемы соврем. Биол. Алма-Ата, Каза0 университет^ -1991,-С. 24-25.

9. Анапияев Б. Б., Богу спаев К. К, Шегебаев О.Ш. Культура изолированных пыльников в селекции пшеницы // Биотехнология, прилож. к экспресс информ. Новости науки Казахстана. Алма-Ата, - 1991, - С. 33-34.

10. Анапияев Б.Б., Богуспаев К.К., Рахимбаев И.Р. Генетические исследования андроклинных гаплоидов пшеницы // Матер. VI съезда ВОГИС. Минск. - 1992, - С. - 6.

11. Анапияев Б.Б. Морфогенез в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы // Автореф. диссер. на соиск. канд. биол. наук. -Алма-Ата, 1992, - С. 25.

12. Анапияев Б.Б., Богуспаев К.К., Рахимбаев И.Р. Исследование запасных белков дигаплоидных линии пшеницы // Матер. II Междунар. конфер. биол. культивиремых клеток и биотехнол. растений. Алматы, - 1993, - С. 37.

13. Анапияев Б.Б., Тулегенова Б.Т. Биохимические маркеры морфогенеза в культуре микроспор пшеницы //Сб. научн. тр. АТУ им. Абая. -1993. С. 47.

14. Анапияев Б.Б., Богуспаев К.К, Рахимбаев И.Р. Электрофоретические спектры и содержание запасных белков в зерне дигаплоидных линии пшеницы // Матер. II съезаа физиол. раст. Санкт-Петербург, 1993, - С. 87.

15. Анапияев Б.Б. Особенности процессов регенерации растений в культуре изолированных микроспор Тгйюит аеБйуит Ь // Тр. Междунар. Конфер. "Аграрная наука на рубеже веков" 17-20 Окт. Акмола. 1997, - Т. 3, - С. 41.

16. Анапияев Б.Б., Блохина О.М., Калиев А.Б., Заиров С.З. Генетическая трансформация ТгШсит аеэЬунт Ь. с использованием гаплоидных микроспор // Тр. Междунар. Конфер. "Аграрная наука на рубеже веков" 17-20 Окт. Акмола. 1997, - Т. 3, - С. 42.

17. Анапияев Б. Б. Процессы регенерации растений в культуре микроспор отдаленных гибридов пшеницы // Биотехнология. Теория и практика. №4, - 1997,-С. 20-23.

18. Анапияев Б.Б. Экологическая селекция пшеницы: биотехнологические аспекты. Матер 2-ой Междунар. Конфер. Проблемы экологии АПК и охрана окр. Среды. Тараз. Алматы, - 1998. - С. 94-96.

19. Анапияев Б.Б. Особенности андрогенеза in vitro в культуре микроспор Triticum aestivum L. // Матер. Межд. Научно-техн. Конфер. Почвозащитная система земледелия и зерновое пр-во на Евразииском континенте в XXI в. -Новосибирск, 1998. - С. 71-73.

20. Анапияев Б.Б. Отбор на качество зерна дигаплоидных линии полученных в культуре микроспор Triticum aestivum L. // Биотехнология. Теория и практика. 1998, - N 1-2 (5-6), - С. 13-14.

21. Анапияев Б.Б. Современные направления экологической селекции пшеницы // Сб.: Проблемы агроэкологии на пороге XXI века. Алматы. Бастау. 1998. -С. 147-150.

22. Анапияев Б.Б., Сатыбалдиев Д.Д., Богданова Е.Д., Полимбетова Ф.А. Использование гаплоидной технологии в селекции пшеницы на засухоустойчивость // Известия МН-АН PK. Серия биол. и мед. 1999, - № 5-6 , -С. 116-120.

23. Анапияев Б.Б., Сатыбалдиев ДД., Богданова Е.Д., Полимбетова Ф.А. Гаплоидная технология в экологической селекции Triticum aestivum L. // Матер.конфер. посвящен, памяти М.А. Айтхожина. Алматы, - 1999, - С. 12.

24. Анапияев Б.Б., Кузовлев В.А. Особенности активности ферментов амилолитического комплекса и урожайность андроклинных дигаплоидных линии пшеницы // Биотехнология. Теория и практика. 1999, - № 1-2 (910), -С. 141-143.

25. Анапияев Б.Б., Сатыбалдиев Д.Д., Богданова ЕД., Полимбетова Ф.А. Использование биотехнологических методов в экологической селекции пшеницы // Матер. Межд. конф. стратегия земледел. на пороге XXI века. п. Алмалыбак. 24-26 июня, 1999, - С. 141-143.

26. Анапияев Б.Б., Искакова K.M., Богуспаев К.К. Влияние гелий-неонового и Рентгеновского облучения на выход эмбриоидов и каллусных структур в культуре микроспор пшеницы // Вестник КазГНУ им. Аль-Фараби. 1999,-С.

27. Анапияев Б.Б., Есбергенова Ж.С., Тулегенова Б.Т., Гилъманов М.К. Исследование биохимических маркеров морфогенеза в культуре андроклинных каллусов пшеницы // Тез. докл. IV съеда ОФРР. Москва. 4-9 Окт. 1999,-С. 516.

28. Аиапияев Б.Б., Тулегенова Б.Т., Есбергенова Ж.С. In vitro жагыдайында есимдж улпалары мен клеткаларыныц морфогенез жолдары // 1зденю. Поиск. 1999, - N 3, - Б. 36-40.

29. Анапияев Б.Б., Иурпешсов И.А., Тыныбаев Н.К. Бидай селекциясында гаплоидтык, технологияны крлдану нотижелер1 // Жаршы. 1999, - N 2, - Б. 81-87.

30. Анапияев Б.Б., Рахимбаев И. Р. Перспективы использовыания гаплоидных клеток в генетической инженерии растений // Матер. Всерос. Симпоз. Изучение генома и генетическая трансформация растений, Иркутск, Россия, 1999, С. 34.

31. Анапияев Б.Б. Гаплоидная биотехнология и перспективы ее использования в генетической инженерии растений // Кол. Монограф. -Иркутск, 2000, в печати.

32. Анапияев Б.Б., Искакова K.M., Богуспаев К.К. Влияние гелий-неонового и рентгеновского облучения на процессы эмбриоидогенеза и каллусогенеза в культуре микроспор пшеницы // Вестник КазГНУ, Алматы, - 2000, в печати.

33. Анапияев Б.Б., Тулегенова Б.Т., Есбергенова Ж.С. (Зспмдж у л пасы мен клеткаларыныц морфогенез процестершщ биохимиялык, ерекшел1ктер1 // Вестник КазГНУ, Алматы, - 2000, -№ 4 (12), - Б. 22-26.

34. Анапияев Б.Б., Рсалиев Ш.Т., Сарбаев А. Т., Искакова K.M., Сатыбалдиев ДД. Гаплоидная биотехнология в ускоренной селекции на устойчивость к ржавчинным болезням Triticum aestivum Е. П Биотехнология. Теория и практика. 2000, в печати.

35. Анапияее Б.Б., Искакова K.M., Рахимбаее И.Р. Гаплоидная биотехнология в ускоренной селекции на устойчивость к экстремальным факторам окружающей среды // Матер. Междунар. Конфер. по проблемам Арала. КазГНУ, - Алматы, - 2000, - С. 48-50.

36. Анапияее Б.Б. Культура микроспор и гаплоидная биотехнология пшеницы // Монограф. Под.ред. Рахимбаева И.Р. Алматы, - 2001, - 220 с.

37. Апелъ В.И. Создание исходного селекционного материала путем межвидовой гибридизации // Селекция сортов с-х. культур интенсив, типа. -Горки,- 1989, С. 51-54.

38. Базько Л.В. Влияние генотипа и основной среды на индукцию эмбриогенеза и регенерацию растений в пыльниковой культуре пшеницы // Прогресс в селекции озим, пшеницы как фактор интенсиф. пр-ва зерна. -Мироновка. 1988. - С. 38-42.

39. Банникова В.П., Хеедынич O.A. Шпилевая С.П. и др. Половые клетки и оплодотворение у покрытосеменных и водорослей // Киев, Наукова думка.- 1985,-С. 6-54.

40. Банникова В.П., Майстров П.Д., Барабанова Е.А. и др. Использование метода культуры тканей в отдаленной гибридизации злаковых // Цитогенет. зерн. культур. Таллин. - 1990. - С. 17-21.

41. Банникова В.П., Хвидынич O.A., Кровец Е.А. и др. Основы эмбриогенеза злаков // Киев, - Наукова думка. - 1991,- С. 176.

42. Батыргожин Б.А., Богуспаев К.К., Анапияев Б.Б. Получение и культивирование гаплоидных протопластов пшеницы // Матер. Всесоюзн. конфер. генет. механиз. устойчив, растен. к неблагоприятн. фактор, среды. Новосибирск, - 1991, - С. 86.

43. Батыгина Т.Б. Эмбриология пшеницы // Ленинград, Колос, - 1974, -С.206.

44. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. Атлас // Ленинград, Наука, - 1987, - С. 206.

45. Богданова Е.Д. Линии пшеницы устойчивые к твердой головне // Матер. Междунар. научно-практичесю конфер. Аграрная наука на рубеже веков. -Акмола, 1997,-Т. 3, - С. 39.

46. Богданова Е.Д. Создание изолиний мягкой пшеницы, несущих гены RL, контролирующие признак "свернутые листья" // Abstracts of the 11 -th EWAC Confer. Novosibirsk, Russia, 24-28 July, - 2000, - P. 51.

47. Богуспаев K.K., Кударов Б.P., Анапияев Б.Б. Индукция гаплоидных растений в культуре пыльников пшеницы // Респ. конфер. физиол. основы, повыш. устойчив, и продукт, с-х. растен. Алма-Ата, Наука, - 1988, - С. 120-122.

48. Богуспаев Б.Б., Анапияев Б.Б., Батыргожин Б.А., Рахимбаев И.Р. Факторы определяющие морфогенез и регенерацию растений в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы НИ Матер. Всесоюзн. конфер. по с-х. биотехнол. Целиноград, - 1991, - С. 60-61.

49. Богуспев К.К., Тулегенова Б.Т., Аликулов З.А., Анапияев Б.Б. Активность нитратредуктазы как биохимический маркер морфогенеза в культуре изолированных микроспор пшеницы и ячменя // Матер. 2 Конфер. ВОФР. Минск, 1990, Москва, - Наука, - 1992, - С. 28.

50. Богуспаев К.К., Ережепоа А.Е., Анапияев Б.Б. Биохимические маркеры морфогенеза в кульуре изолированных пыльноков ячменя и пшеницы // Биотехнология. Теория и практика. 2000, N 1-2 (13), Р. 56-61.

51. Богуспаев К.К., Анапияев Б.Б. Белки в идентификации дигаплоидных линии полученных в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы (T. aestivum) // Биотехнология. Теория и практика. 2000, N 3-4 (14), Р. 119-120.

52. Булатова К. М. Глютенины и глютениновые биотипы пшеницы // Автореф. Дис. Канд. Биол. Наук. Алма-Ата, - 1989, - С. 22.

53. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений // М., Наука, 1975, - С. 1-50.

54. Валиханова Г.Ж., Бабаев Р. А., Бишимбаева Н.К., Заирова А.С.Методологическое руководство по применению ЭВМ в НИРС по культуре тканей // Алма-Ата, КазГу, -1988,-С.31.

55. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений // Алматы, - Конжык, - 1996, 272 с.

56. Васильев C.B. Ускоренное получение гомозиготных линий яровой мягкой пшеницы методом культуры пыльников // Рекомбинац. Селекц. Раст. В Сибири. Новосибирск, - 1989, - С. 100-105.

57. Васильев C.B. Влияние генотипа яровой мягкой пшеницы на андрогенез в культуре in vitro // Матер. Всесоюзн. Научн. Конфер. По сельхоз. Биотехнол. Целиноград, -1991, - С. 61-62.

58. Васильев C.B. Влияние активированного угля и жидкой индукционной среды на андрогенез и регенерацию гаплоидных растений мягкой пшеницы // Селекция и семеновод, с-х. культур. Новосибирск, - 1996, - С. 53-57.

59. Внучкова В.А., Чеботарева Т.М. Оптимизация условий получения гаплоида пшеницы при посадке пыльников in vitro // Докл. ВАСХНИЛ, -1990, №5,-С. 6-9.

60. Гаман А.Л., Шек Г.О., Гамонов В.В. Выход гаплопродукции гибридов и сортов яровой мягкой пшеницы в зависимости от генотипов и питательных сред // Тез. Всесоюзн. Конф. По сельхоз. Биотехнол. Целиноград, - 1991, - С. 59.

61. Гапоненко А.К. Перспективы использования культуры клеток растений в селекции. Применение культуры пыльников и микроспор // Успехи совр. Генет. 1987, - №4, - С. 64-74.

62. Голубинский H.H. Биология прорастания пыльцы // Киев, Наукова думка,- 1974,-С. 369.

63. Горбунова В.Ю., Круглова H.H. Методические аспекты культивирования изолированных пыльников пшеницы // Препр. Докл. Уфа, - 1989, - С. 20.

64. Горбунова В.Ю., Круглова Н.И., Батыгина Т.Б. Андрогенез в культуре изолированных пыльников злаков: цитолого-эмбриологические аспекты // Успехи соврем, биол. 1993, - Т. 1, - Вып. 1, - С. 19-35.

65. Дарканбаев Т.Б., Фурсов О.В. Амилазы зерновых и регуляция их активности//Успехи биол. химии. 1982, - Вып. 146-С. 137-151.

66. Джори Б.М., Pao П.С. Экспериментальная эмбриология // В кн.: Эмбриология растений в генетике, селекции, биотехнол. Под. Ред. Ермакова И.П. М., Агропромиздат, - 1990, Т. 2, - С. 343-411.

67. Дъячук П.А., Дъячук Т.И., Кудашкина C.B. и др. Получение гаплоидных растений мягкой яровой пшеницы саратовских сортов в культуре пыльников // Доклады ВАСХНИЛ, 1986, - №5, - С. 3-4.

68. Дъячук Т.Н., Дъячук П.А., Духарев H.A., Козлова А.Ю. Культура пыльников пшеницы как возможный метод селекции // Тез. Докл. Всесоюзн. Конф. По биотехнол. Злаковых культур. Алма-Ата, - 1988. - С. 8-9.

69. Дъячук Т.Н., Дъячук П.А. Методические рекомендации по получению гаплоидных растений мягкой пшеницы в культуре пыльников // ВАСХНИЛ, М., 1989, - С. 37

70. Дъячук Т.Н. Культура пыльников и формообразовательный процесс у яровой мягкой пшеницы // Доклады ВОГИС, Саратов, 20-25 дек., 1994, Генетика, 1994, - С. 30.

71. Жангазиев А.С. Межвидовая гибридизация 28 хромосомных культурных видов пшеницы //Автореф. Дис. Канд. С-х. Наук. п. Алмалыбак, - 1987, -С. 25.

72. Загорска Н., Робева П., Димитров Б. И др. Индуцированный морфогенез и регенерация растений в культуре пыльников Medicago sativa // Культура клеток раст. И биотехнол. М., - Наука, - 1989, - С. 167-171.

73. Зайкина Т.Ф. Особенности культивирования пыльников пшеницы на жидких средах // Апомиксис и циотэмбр. Раст. Саратов, - 1987, - С. 111115.

74. Заиров С.З. Накопление и обмен белков в зерне пшеницы // Алма-Ата, Наука, - 1987,-С. 176.

75. Иванов Г.И., Ражду A.C. Оптимизация питательной среды для культивирования пыльников пшеницы // Тез. Всесоюзн. Конф. по с-х. Биотехн. Целиноград, - 1991, - С. 55-56.

76. Иванова C.B., Колесникова О.П. Особенности формообразо-вательного процесса у отдаленных гибридов пшеницы: Tr. comacticum х Tr. durum // Извест. ТСХА, Вып. 2, - 1988, - С. 46-51.

77. Каржасова A.B., Куишаренко C.B., Анапияев Б.Б. Выращивание растений-регенерантов в водной-почвенной куьтуре // Акт о внедрении завершен. НИР в учебн. процесс. В разделе Минеральное питание. Большой практикум, от. 6.07.1988.

78. Каржасова A.B., Анапияев Б.Б., Ихсанова Д.И. Выращивание растений-регенерантов зерновых злаков в условиях водной и почвенной культуры // Сб. научн. тр. Актуальные проблемы соврем. Биол. Алма-Ата, Казак университет^ - 1991, - С. 21-22.

79. Колдасова A.C., Шалахметова Г.А. Свойства ферментного комплекса необратимого расщепления глютамата и перспективы его применения в биотехнологии // Матер. Междунар. научн. конфер. посвященный 60-летию М.А. Айтхожина. Алматы, - 1999, - С. 45.

80. Конарев В.Г. Белки пшеницы // М., - Колос, - 1980, - С. 351. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры // - М., Колос, -1983,-С. 320.

81. Конарев В.Г. Белки как генетические маркеры в решении актуальных проблем растениеводства // Физиол. и биохим. культ, раст. 1987, - Т. 19, №4,-С. 315-321.

82. Кударов Б.Р., Шамров И.И., Анапияев Б.Б. Структурные особенности морфогенетических изменений в культуре пыльников пшеницы // Матер. Всесоюзн. конфер. по биотехнол.злаковых культур. Алма-Ата, - 1988, -С. 21-22.

83. Кударов Б.Р., Тивари Ш., Рахимбаев И.Р. Методические рекомендации по культуре пыльников и изолированных микроспор ячменя и пшеницы // М.: Колос, 1990, 34 с.

84. Кударов Б.Р., Анапияев Б.Б., Каржасова A.B. Изменчивость состава и соотношения белков пшеницы в процессе андрогенеза // V Конфер. биохимиков Ср. Азии и Казахстана, Ташкент, 1991, - С. 198.

85. Кударов Б.Р., Есмагулов К.Е., Анапияев Б.Б. Биохимическая гетерогенность каллусов в культуре пыльников пшеницы // Матер. 2 Конфер. ВОФР. Минск, 1990, Москва, - Наука, - 1992, - С. 111.

86. Кузовлев В. А. Свойства и регуляция ос-амилазы из зерновки кукурузы // Автореф. дисс. на соис. учен. степ. канд. биол. наук. Алматы, - 1994, - С. 20.

87. Кузнецова ТА., Муромцев Е.С. Гаметоциды регуляторы процессов формирования пыльцы // Тез. Докл. Второго съезда ВОФР, 24-29 Сент, 1990, Минск, - Москва, - 1990, - С. 49.

88. Левенко Б.А. Перенос генов и проблемы трансгенных растений // Физиол. и биохим. культур, растен. 1998, - Т. 30, - № 2, - С. 83-111.

89. Лейке Г., Лабес Р., Эртель К., Петерсдорф М. Использование культуры тканей и органов в селекции растений и производстве посадочного материала // М., Колос, - 1980, - С. 77.

90. Лукъянюк С.Ф., Игнатова С.А. Получение гаплоидов ячменя с помощью гаплопродюссеров // Метод, реком., Одесса, - ВСГИ, - 1988, -С. 17-20.

91. Любимова В.Ф. Проблемы отдаленной гибридизации растений // Ж. Общей биол., 1988, - Т. 49, - №6, - С. 792-800.

92. Львов Н.П., Сафаралиев П.М. О методах определения нитратредуктазной активности у растений // Физиол. раст. 1988, - Вып. 1, - С. 196-199.

93. Надиров Б. Т. Информативность технологических показателей в связи с селекцией на качество зерна пшеницы // Сб. тр. Селекция и урожай, -Алма-Ата, 1988, - С. 128-137.

94. Наволоцкий В.Д. Новый метод селекции ячменя // Информ. Бюлл. ВДНХ СССР. 1986, - 10, - С. 11.

95. Новолоцкий В.Д. Гаплоидия и селекция ячменя: результаты и перспективы // Физиол. и биохим. культ, растен. 1995, - Т. 27, - № 1-2, С. 99-102.

96. Ницще В., Венцелъ Г. Гаплоиды в селекции растений // М, - Колос,-1980,-С. 128.

97. Нумерова О.М., Першина Л.А. Цитогенетическая характеристика каллусной ткани и растений-регенерантов межродовых гибридов ячменя // Цитогенет. зерн. культур. Таллин, - 1990, - С. 79-84.

98. Новак Ф.И. Индукция гаплоидов в культуре тканей и их значения в селекции растений // В кн.: Культура клеток раст. в биотехнол. М., -Наука,- 1986,-С. 159-167.

99. Озолина Н.В., Кузеванов В Д., Котова Л.Г., Саляев Р. К. Электрофоретическое изучение белков в морфогенных и неморфогенных каллусах яровой пшеницы // Физиол. и биохим. культ, растен. 1995. - Т. 27, - № 4, - С. 254- 258.

100. Омарова Э.И., Богданова Е.Д., Полимбетова Ф.А. Регуляция потери воды при изменении структуры листового аппарата у мягкой озимой пшеницы // Физиология растений, 1995, - Т 42, - № 3, - С.435-437.

101. Паушева ЗП. Практикум по цитологии растений // М., -Агропромиздат, - 1988, - С. 271.

102. Пендинен Г.И. Особенности микроразмножения in vitro ячменно-пшеничных и пшенично-ржаных гибридов // В сб. научн. Тр. приют, ботан., генет. и селекц. ВИР, 1989, - №128, - С. 39-45.

103. Петров Д.Ф. Апомиксис в природе и опыте // Новосибирск: Наука, 1988,214 с.

104. Приходъко Н.И. Сравнительное изучение андрогенетических линий мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) и исходных образцов по некоторым хозяйственно полезным признакам // Научн-техн. бюл. ВИР. -1988, -№174, -С. 53-59.

105. Приходъко Н.И. Сборник научных трудов по прикладной ботанике, генетике и селекции.ВНИИ растениеводства.-1989.-128.-С. 86-89.

106. Поддубная-Арнолъди В.А. Общая эмбриология покрытосемен-ных растений // М., - Наука, - 1976, - С. 508.

107. Полевой В.В. Физиология растений // М., Высшая школа, 1989, - С. 464.

108. Попереля Ф.А., Асыка Ю.А., Ключко П.Ф. и др., Определение гибридности семян кукурузы по электрофоретическуим спектрам зеина // Доклады ВАСХНИЛ, 1983, -№3, - С. 2-4.

109. Разакберлин Б.С., Нурпеисов И.А., Булатова K.M., Рахимбаев И.Р., Анапияев Б.Б. Эффективность использования гаплоидной технологии в селекции пшеницы // Тр. Междунар. Конфер. "Аграрная наука на рубеже веков" 17-20 Окт. Акмола. 1997, - Т. 3, - С. 40.

110. Рахимбаев И.Р., Тивари Ш., Кударов Б.Р. Экспериментальная гаплоидия в культуре пыльников и микроспор зерновых злаков // Сельхоз. биол.1990,-№3, С. 44-55.

111. Рахимбаев И.Р., Тивари Ш., Бишимбаева Н.К., Кушнареико C.B., Азимова Е.Д. Биотехнология зерновых культур // Алма-Ата, - Гылым, -1992,-С. 240.

112. Рахимбаев И. Р. Клеточные технологии в селекции растений // Известия HAH PK. Сер. биол,- 1999,-№5-6,-С. 111-116.

113. Резникова С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника // -М., Наука, - 1984, - С. 173-207.

114. Рсалиев Ш. С. Групповая устойчивость мягкой пшеницы к видам ржавчины и септориоза // Материалы Междунар. научно-теор. конфер.Стратегия Земледел. и рстениевод. на рубеже XXI в. Алматы, Бастау, 1999,-С. 178-179.

115. Рсалиев Ш С., Сарбаев А. Т. Создание генофонда устойчивости пшеницы к болезням в Казахстане: достижения и проблемы // Материалы Междунар. научно-теор. конфер. Стратегия земледелия и рстениеводства на рубеже XXI в. Алматы, Бастау, 1999, - С. 182-183.

116. Сатарова Т.Н. Некоторые генотипические и онтогенети-ческие особенности реакции кукурузы в культуре пыльников // Цитолю и генет. -1997,-31, № 3, - С. 60-65.

117. Сатыбалдиев Д.Б., Богданова Е.Д., Полимбетова Ф.А., Анапияев Б.Б. Ускоренная селекция пшеницы на засухоустойчивость методом гаплоидной технологии // Тез. докл. IV съеда ОФРР. Москва. 4-9 Окт. -1999,-С. 688-689.

118. Сатыбалдиев Д.Д., Анапияев Б.Б., Богданова Е.Д., Полимбетова Ф.А. Использование гаплоиднои биотехнологии в селекции пшеницы напродуктивность и устойчивость // Биотехнология. Теория и практика. 2000, N3-4(14), Р. 137-138.

119. Сейтхожаев А.И., Сарбаев А.Т., Краснощекова Г. Б. Влияние внутривидовой изменчивости на устойчивость к ржавчинным болезням у пшеницы // Биотехнология. Теория и практика. 1998, №1-2 (5-6), - С. 8688.

120. Созинов A.A., Попереля Ф.А. Фракционный состав белка, белковость муки пшеницы и ее хлебопекарные свойства // Научно-техн. бюл. ВСГИ, -1972,-Вып. 18,-С. 34-40.

121. Соколов В.А., Шумный В.К. Технология гаплоидов в генетике и селекции растений // Вавил. наследие в совр. биол. М., 1989, - С. 247-269.

122. Столярова C.B., Дъячук Т.И. Методы культуры пыльников в межвидовой гибридизации пшеницы // Матер. Всесоюзн. научн. конфер. по с-х. биотехнол. Целиноград, - 1991, - С. 54-55.

123. Султанбаев Б.Е. Изучение механизма образования НАДФ-глютаматдегидрогеназы в прорастающем зерне пшеницы // Автореф. дис. канд.биол.наук. Алматы, - 1991, - С. 22.

124. Суханов В.М., Клочков В.В., Хохлов С.С., Тырнов B.C. Использование культуры пыльников для получения гаплоидов // Тр. II Всесоюзн. Конфер. по культуре клеток растений. Киев, 1978, С. 315.

125. Суханов В.М., Нестеров А.Ю., Тырнов B.C. Эмбриоидогенез в пыльниках пшеницы // Тез. Докл. З-Всесоюзн. конфер. Культура клеток растений. Абовян, - 1979, - С. 161.

126. Суханов В.М., Проскурин К. П. Получение мутантов из пыльцы табака. 1. Изменчивость растений на ранних стадиях развития. // Хим. и биол. нархоз. Саратов. 1979. - С. 81-82.

127. Суханов В.М. Андроклиния и ее особенности // Автореф. дис. канд. биол. наук, Саратов, - 1983, - С. 25.

128. Суханов В.М. Анализ критериев оценки частоты андроклинии // Апомиксис и цитоэмбр. раст. Саратов, - 1987, - С. 89-98.

129. Суханов В.М., Зайкина Т.Ф., Нестеров А.Ю. Получение андроклинных растений пшеницы и тритикале путем создания органогенных штаммов // В сб.: Апомиксис и цитоэмбр. раст. Саратов, - С. 3-13.

130. Соколов В.А., Шумный В.К. Технология гаплоидов в генетике и селекции растений // Вавил. наследие в совр. биол. М., 1989, - С. 247-269.

131. Танкиманова М.К. Моносомный анализ устойчивости пшеницы к бурой ржавчине // Автореф. дисс. на соискание канд. биол. наук. Алма-Ата.-1993, - С. 24.

132. Тародей И.В., Башарова Т.В. Использование гелий-неонового лазера для увеличения частоты гаплоидии в культуре пыльников пшеницы // Апомиксис и цитоэмбр. раст. Саратов, - 1987, - С. 13-19.

133. Турапин В.П., Мостовой В.А. Ржавчинные болезни зерновых культур в Республике Казахстан и борьба с ними. Алматы, - 1995, - С. 141.

134. Тырнов B.C. Андрогенез in vivo у растений //В сб.: Биология развития и управление наследственностью. М.: Наука, 1986, - С. 138-164.

135. Уразалиев P.A., Колсахметов К.К. Создание новых форм озимых зерновых культур путем отдаленной межродовой гибридизации для условий Казахстана // Сельхозбиология, 1983, - №6, - С. 46-50.

136. Уразалиев P.A. Экологическая стратегия Казахстана в области земледелия, растениеводства и водных ресурсов // Матер. 2-Ой Междунар. научно-практичес. Конфер. Проблемы экологии АПК и охрана окр. Среды. -Алматы, 1998,-С. 5-6.

137. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях // М., - 1975, - С. 220.

138. Фролова Л.В. Особенности популяции культивируемых клеток // В кн.: Культура клеток растений, М., - Наука, - 1981, - С. 5-16.

139. Фурсов О.В., Кузовлев В.А., Акаева М.М. Свойства и особенности амилаз зерна злаковых // Ферменты и качество зерна //. Алма-Ата: Наука, -1987, С. 41-61.

140. Хаберле-Борс Э. Гаплоидные спорофиты и функциональные мужские гаметофиты из культивируемой in vitro незрелой пыльцы табака //В кн.: Биол. Культ, клеток и биотехнол. Раст. М., - Наука, - 1991, - С. 146-157.

141. Хан X. Получение анеуплоидных и гетероплоидных растений в культуре пыльников // В кн.: Соврем, достиж. и молек. биол. хромосом и клеток, Алма-Ата, - 1989, - С. 771-781.

142. Хохлов С.С., Тырнов B.C., Гришина Е.В. и др. Гаплоидия и селекция // -М„-Наука,- 1976,-С. 221.

143. Шаврина ЗА. Желтая ржавчина пшеницы Puccinia striiformis West в республиках Средней Азии и Южном Казахстане // Автореф. Канд. дис., -1980,- С. 25 .

144. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор // В кн.: Культура клеток раст. М., - Наука, - 1981, - С. 124136.

145. Шерер Н.В. Влияние условий выращивания донорных растений на эффективность пыльниковой гаплопродукции // Матер. Всесоюзн. научн. конфер. по с-х. Биотехнол. Целиноград, - 1991, - С. 57-58.

146. Abadjieva М. Cytological investigation of Datura innoxia mill, plants obtained by androgenesis in vitro // Fertilization and embryogenesis in ovulated plants. VEDA, Bratislava, 1983, - P. 381-384.

147. Agache S., De Buser J., Henry Y., Snape W.J. Studies of the genetic relationship between anther culture and somatic tissue culture abilities in wheat // Plant Breed., 1988, - V. 100, N.l, - P. 26-33.

148. Agache S., Bachelier B., Buyser De.J., Henry Y., Snape J. Genetic analysis of anther culture responce in wheat using aneuploid, chromosome substitution and translocation lines // Theor. and Appl. Genet. 1989, - 77, - N 1, - P. 7-11.

149. Altman A. The plant and agricultural biotechnology revolution:where do we go from here? // In.: Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21-st Gentry. Kluwer Acad. Press. Niderlands. 1999, - P. 1-9.

150. Anapiaev Bogouspaev K.K., Iskakova K.M., Rachimbaev /. R. Morphogenesis in culture of the wheat and barley microspores // Proc. II Inter, confer. Biology of plant cell cult, and biotechnol. Almaty, 1993, - P. 39.

151. Anapiaev B.B., Valikhanova G.J., Bogouspaev K.K. The factors influence on the processes of callus ogenesis and somatic embryogenesis in microspore culture of wheat // In.: Actual probl. of modern, biol. KazGu. Almaty, - 1993, -P. 38-42.

152. Anapiaev B.B., Kaliev A.B. Use of the haploid cells in genetic transformation of Triticum aestivum L. // Proc. Inter. Conf. Status of Research on the plant genome. USA. San Diego. 1994.

153. Anapiaev B.B. Morphogenesis in microspore culture of wheat and results use of haploid technology in selection // Abstr. llht Inter. Congr. FESPP. Varna. Bulgaria. 7-11 Sep.- 1998.

154. Anapiaev B.B., Polimbetova F.A., Bogdanova E.D. , Satybaldiev D. Prospekts on haploid technology in breeding for Triticum aestivum L. resistance // Proc. Inter. Symp. Molecular mechanisms of stress responsesin plants. Sept 2. Moscow. -M.,- 1998. P. 46.

155. Anapiaev B.B., Satybaldiev D.D., Bogdanova, E.D., Polimbetova F.A. Haploid technology in ecological selection of Triticum aestivum L. // Тез.конфер. посвящен, памяти M.A. Айтхожина. Алматы, - 1999, - С. 12.

156. Anapiaev ВВ., Satybaldiyev D.D., Bogdanova E.D., Polimbetova F.A. Rapid production of lines and forms of wheat with drought resistance using haploid technology // Sixth Inter. Conf. Dry Lands. Egypt. Cairo. 22-27 Aug. -1999.

157. Anapiaev В.В., Satibaldiyev D.D., Bogdanova E.D., Polimbetova F.A. Haploid technology in ecological selection of Triticum aestivum L. for drought tolerance // Sixth Inter. Conf. Dry Lands. Egypt. Cairo. 22-27 Aug. 1999.

158. Anapiaev B.B., Satybaldiev D., Polimbetova F.A. A haploid technology in wheat selection for salt tolerance // Abstracts Second Balcan Botanical Congress, Istanbul, Turkey, May 14-18, 2000, P. 203.

159. Anapiaev B.B., Satybaldiev D., Bogdanova E.D., Polimbetova F.A. Haploid technology in ecological selection of Triticum aestivum L. for drought tolerance // Биотехнология. Теория и практика. 2000, N 1-2 (13), P. 37-41.

160. Anapiaev В. В. The effect of genotype on the frequency of regeneration of plants in a microspore culture of Triticum aestivum L. II R.J. of Genetics, 2000, -V. 36,-N4, -P. 404-407.

161. Anapiyayev B.B., Satybaldiev D., Bogdanova E.D., Polimbetova F.A. Haploid cell systems in ecological selection for resistance of Triticum aestivum L. II Istanbul, Turkey, 2000, in press.

162. Anapiyayev B.B., Rsaliyev Sh.T., Sarbayev A.T., Iskakova K.M., Salybaldiyev D.D. A use of haploid biotechnology in production of lines and cultivars Triticum aestivum L. resistant to rust diseases // Novosibirsk, Russia, 2000, in press

163. Andersen S.B., Due I.K., Olsen A. The response of anther culture in a genetically wide material of winther wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Breed., 1987,-N. 3, - P. 181-186.

164. Austran I.C., Bushuk W. Wheat gliadins: nomenclature and varietal identification // Ann. Technol. Agr. 1980, - V. 29, - N. 2, - P. 105-106.

165. Babbar S., Gupta S. Patwaus in pollen sporopyte development in anther culture of Datura metel and Petunia hibrids // Biets. Biol. Plantz. 1984, - 59, -N.3,-P. 475-488.

166. Bagheri A., Vessal S., Safanrejad A. The study of in vitro haploid production in chicpea (Cicer areitinum L.) // Abstracts 3 Inter. Crop Science Congress. 2000, - Hamburg, Germany, 17-22 Aug. - 2000, - P. 228.

167. Baenziger P.S., Keppenne V.D., Morris M.R. et. al, Quantifying gametoclonal variation in wheat doubled haploids // Cereal Research Communications. 1991. V. 19. N. 1-2. P. 33-42.

168. Barnabas B., Phaaler P.L., Covacs G. Direct effect of colchicine on the microspore embryogenesis to produce dihaploid plants in wheat {Triticum aestivum L) II Theor. and Appl. Genet. 1991, - 81, - P. 675-678.

169. Barnabas B., Szakacs E., Sagi L., Kovacs G. Kalluzszindokcio es nevenyreracio genetical javaitasanak lehetosegei busa (Triticum aestivum L.) anterakulturakban 11 Novenytytermeles, 1988, - 37, - N. 4, - P. 289-292.

170. Biddington N.L., Sutherland R.A., Robinson H.T. Silver nitrate increases embryo production in anther culture of Brusseles sprouts // Ann. Bot. (USA), -1988,- 62,-N.2,-P. 181-185.

171. Blacslee A.F., Belling J., Fasnham M.E. et. al., A haploid mutant in Jimson weed, Datura stromonium // Sci., 1922, - 55, - P. 646-647.

172. Blaydes D.F. Interaction of kinetin and various inhibitory in the growth of soubean tissue // Physiol. Plant. 1966, - 19, - P. 748-753.

173. Biladjiev P., Cuong P.V. Cytological and physiological studies of some varieties and F1 hybrids of rise, Oruza sativa, using the method of anther culture // Bionature, 1988, - 8, - N. 1, - P. 41-46.

174. Bogdanova E.D., Polimbetova F.A. Application of drought resistance adaptive traits as the spring wheat breeding strategy. IX International Wheat Genetics symposium, August,2-7, 1998. University of Saskatchewan, Canada, -1998,- P. 517.

175. Bogdanova E.D. Rust resistance in hexaploid wheat // Abstracts 3 Inter. Crop Science Congress. 2000, - Hamburg, Germany, 17-22 Aug. - 2000, - P. 99.

176. Bogouspaev K.K., Kudarov B.R., Rachimbaev I.R., Anapiaev B.B. Division and embryogenesis in isolated microspores of wheat culture // Pr. XI Inter. Symp. Embryol. and seed reprod. Leningrad. 3-7 Luly, 1990, - P. 23.

177. Bogouspaev K.K., Kudarov B.R., Anapiaev B.B. Rachimbaev I.R. Division and embryogenesis in isolated microspores of wheat culture // Pr. XI Inter. Symp.Embryol. and seed reprod. St. Petersburg. - Nauka, - 1992, - P. 86-87.

178. Bogouspaev K.K. Anapiaev B.B., Valikhanova G.J. The factors influence on the processes of callus ogenesis and somatic embryogenesis in microsporeculture of wheat // Bulletin . KSNU, Natural Science. Almaty, - 1997, - P. 168-173.

179. Boskovic J., Boskovic M., Babovic M., Jerkovic Z., Pesic V. Pyramiding strategy for durable resistance to wheat leaf rust pathogen // Abstracts 6-th Iner. Wheat Conference. Budapest. 2000, - P. 55.

180. Bredford M.M. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgramm quantities of protein ustilising the principle of protein // Ann. Biochem. 1976, - 72, - P. 248-254.

181. Bruis M.B.M., Rakoczy T.M., Snijders C.H.A. The effect of co-culture of wj\heat or barley ovaries on embryogenesis // Cereal Res. Comm. 1996, - N. 24 (4),-P. 401-408.

182. Buyser J., Henry Y. Induction of haploid plants through in vitro anther culture of haploid wheat (n=3x=21) // Theor. Appl. Genet. 1980, - 57, - P. 5758.

183. Buyser J., De Henry Y., Talev G. Wheat androgenesis: cytogenetical analisis agronomic performance of doubled haploids // Z. Pflanzenzucht, 1985, - 95, -N.l, - P. 23-34.

184. Buyser J., Henry Y, Lonnet P. et.al., "Florin": a doubled haploid wheat variety developed by the anther culture method // Plant Breeding. 1987, - 98, -P. 53-56.

185. Buyser De. J., Hachemi-Rachedi S., LemeeM.L. et. al., Aneuploid analisis of anther culture response in wheat // Plant Breeding, -1992, 109, - P. 339-342.

186. ChaemiM., Sarrafi A., Morris R. Reciprocal substitutions analysis of embryo induction and plant regeneration from anther culture in wheat (Triticum aestivum L.) II Genome, 1995, - 38, - N. 1, - P. 158-165.

187. Chen C.M. Chen C.C., Lin M.N. Genetic analisis of anther derived plants of rise // Genetics, 1981, - 97, - P. 20.

188. Chibbar R.N., ShulukJ., Georges F., Constabel F. Role of proline in somatic embryogenesis in cultured carrot cells // Plant. Physiol. 1987, - 83, - N.4, - P. 76.

189. Chibbar R.N., Shyluk J., Georges F., Mallard C.S., Constabel F. Esterase isozymes as markers of somatic embryogenesis in cultured carrot cells // J. Plant Physiol. 1988, - 133, - N. 3, - P. 367-370.

190. Chu C.C., Wang C.C., Sun C.S. et. al.t Investigation on the induction and morphogenesis of wheat (Triticum aestivum ) pollen plants // Ann. Bot. Sin. -1973.- 15,-P. 1-11.

191. Chu C.C. The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops // Proc. Symp. Plant tissue culture. Beijing: Science press, 1978, - P. 43-50.

192. Chu C.C., Hill R.D. An inproved anther culture method for obtaining higer friguency of pollen embryoids in Triticum aestivum L. // Plant. Science. 1988, -55.-P. 175-181.

193. Chu C.C., Hill R.D., Brule-Babel A.L. High frequency of pollen embryoid formation and plant regeneration in Triticum aestivum L. on monosaccharide containing media//Plant Science, 1990, - 66, P. 255-262.

194. Chuang C.C., Ouyang T. W., China H. et. al., A set of potato media for wheat anther culture // Proc. Symp. Plant tissue culture, Beijing: Science Press, -1978,-P. 51-56.

195. Choung P., Pauls K., Beversdorf P. High-frequency embryogenesis in male sterile plants of Brassica napus through microspore culture // Can. J. Bot. -1988,-N. 8,-P. 1676-1680.

196. Chowdhury R.K. A note on drought resistance in wheat // Wheat Information Service. 1990,-N. 70, - P. 1-3.

197. Cistue L., Ziauddin A., Simion E., Kasa K.J. Effects of culture conditions on isolated microspore responce of barley cultivar Igri 11 Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1995, - 42, - P. 163-169.

198. Clapham D. In vitro devepolment of callus from the pollen Lolium and Hordeum // Z. Pflanzenzucht. 1971, - 65, - P. 285-292.

199. Coppens L., Dewitte D. Esterase and peroxidase zymograms from barley (Hordeum vulgare L.) callus as a biochemical marker system of embryogenesis and organogenesis // Plant Sci. 1990, - 67, - N. 1, - P. 97-105.

200. Dale P.J. Pollen dimorphism and anther culture in barley // Planta, 1975, -127,-P. 213-220.

201. Deaton W.R., Mets S.G., Armstong T.A., Mascia P.N. Genetic analisis of the anther-culture responce of there spring wheat crosses // Genetics, 1987, - 116,-N. 1,-P. 26

202. Denis M. et.al., Expression of engineered nuclear male sterility in Brassica napus: genetics,morphology, cytology and sensitivity to temperature // Plant Physiol. 1993. 36. N.4, 1295-1304.

203. Denissen G.J., Den Nijs A.P.M. Effects of gamma irragiation on in vitro pollen germination of different Cucum species // Euphytica. 1987. - 36. - P. 651-658.

204. Ding-Gang H., Jun-Wen O. Callus and plantlet formation from cultured wheat anthers at fifferent developmental stages // Plant. Sci. Lett. 1984, - 33, -P. 71-73.

205. DodigD., Stojanovic Z., Dencic S., Quarrie S. Characterising wheat genetic resources for responses to drought stress // Abstracts 3 Inter. Crop Science Congress. 2000, - Hamburg, Germany, 17-22 Aug. - 2000, - P. 137.

206. Duncan D.R., Widholm J.M. Proline accumulation and its implication on cold tolerance maize callus // Plant. Physiol. 1987, - 83, - N. 3, - P. 703-708.

207. Dunwell J.M. Haploid cell culture // Ed. Dixon R.A. Plant cell cultures: Practical approach, Oxford, Washington DC: IRL Press, - 1985, - P. 21-36. Duysen M., Medich C. Anther culture of wheat and triticale // Proc. N.D. Acad. Sci.- 1987,-41,-P. 10.

208. Fisher E., Rober F.K., Geiger H.H. In vivo haploid induktion in maize: Using molekular markers to check segregation patterns and male gene transmission // Abstracts 3 Inter. Crop Science Congress. 2000, - Hamburg, Germany, 17-22 Aug. - 2000, - P. 215.

209. Foroughi-Wehr B., Friedt W., Wenzel G. Field experiments with anther derived lines of barley (Hordeum vulgare) and rye Secale cereale) // Plant Cell Cult. Crop. Impr. Proc. Int. Symp., Calcutta, 6-10 Dec. 1981, New York, -Lomdon, - 1983, -P. 475-483.

210. Frans P.F., de Ruijter N.C., Seed G.H. Izoenzymes as biochemical and cytochemical markers in embryogenic callus cultures of maize // Plant Cell Repts. 1989, - 8, - N. 2, - P. 67-70.

211. Guha S., Mageshwari S.C. In vitro production of embryos from anthers of Datura // Nature (Lund), 1964, - 204, - P. 497.

212. Guo H.P., Ouyang J. The effects of KN03 concentration in callus induction medium for wheat anther culture // Plant cell, tissue and org. Cult., 1988, - 12, -N.1,-P. 3-12.

213. Gustafson V.D., Baenziger P.S., Wright M.S. et. al., Isolated wheat microspore culture // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995, - N. 42 (2), -P. 207-213.

214. Haberle-Bors E. In vitro pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum L. and its relation to pollen sterility, sex balance and floral induction of the pollen donor plants // Planta, 1982, - 156, - P. 396-401.

215. Haberle-Bors E. In vitro haploid formation from pollena critical reviev // Theor. Appl. Genet, 1985, - 71, - P. 361-374.

216. Haberle-Bors E. Odenbach W. In vitro pollen embryogenesis and cytoplasmic male sterility in Triticum aestivum // Z. Pflanzenzucht, 1985, - N. 1, - P. 14-22.

217. Hans-Ulrich K. Zytologische charakterisiictung androgenetischer Entwicklungsphasen bei Weisen (Triticum aestivum L.) // Arch. Zuchtungsforsch, Berlin, 1987, - 17, - N. 5, - S. 297-307.

218. Hansen N.J.P., Andersen S.B. Efficient production of doubled haploid wheat plants by in vitro treatment of microspores with trifluralin or AMP // Plant Breeding, 1998, - 117, - C. 401-405.

219. Hansen N.J.P., Andersen S.B. In vitro chromosome doubling with colchicine during microspore culture in wheat (Triticum aestivum L) // Euphytica, 1998, -102, - P. 101-108,

220. Hansen N.J.P., Andersen S.B. In vitro chromosome doubling with cochicine during microspore culture in wheat (Triticum aestivum L). // Euphytica. 1998, -N. 102(1),-P. 101-108.

221. Hassawi D. et. al., Microspore development in the anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) // Cytologia, 1990, - 55, - N. 3, - P. 475-478.

222. Henry Y., De BuyserJ. Float culture of wheat anthers // Theor. Appl. Genet. -1983,- 60,-P. 77-79.

223. He Ding-Gang, Ouang J. W. Callus and plantlet formation from cultured wheat anthers ot different developmental stages // Plant. Sei. Let. 1984, - 33, -N. 1,P. 71-79.

224. Henry Y., De Buyser J., Guenegou T., Ory C. Wheat microspore embryogenesis during in vitro anther culture // Theor. Appl. Genet. 1984, - N. 2., - p. 439-442.

225. Hidaka T., Omura M. Origin and development of embryoids from microspores in anther culture of citrus // Jap. J. Breed. 1989, - 39, - N. 2, - P. 169-178.

226. Higgins P., Mathias R.J. The effect of the 4B chromosomes of hexaploid wheat on the growth and regeneration of callus cultures // Theot. And Appl. Genet. 1987, - 74, N 4, - P. 439-444.

227. Holme I.B., Olsen A., Hansen N.J.P., Andersen S.B. Anther and isolated microspore culture of wheat lines from nortwestern and eastern Europe // Plant Breeding. 1999,-N. 118(2), - P. 111-117.

228. Horner M., Street H.E. Pollen dimorphism origin and significance in pollen plant formation by anther culture // Ann. Bot. - 1978, - 42, - P. 763-777.

229. Howes N.K., Woods S.M., Townley-Smith T.F. Simulations and practical problems of applying multiple marker assisted selection and doubled haploids to wheat breeding programs // Euphytica. 1998, - 100, - P. 225-230.

230. Hu H., Hsi Z., Chia S. Chromosome variation of somatic cells of pollen calli and plants in wheat (Triticum aestivum L.) // Acta. Genet. Sin. 1978, - 5, - P. 23.

231. Hu H., Xi Z., Zhang J. et. al., Genetic investigation on pollen-derived plants in wheat (Triticum aestivum L.) // Acta. Genet. Sin. 1979, - 6, - P. 322.

232. Hu Z., Hi Z., OuyangJ. et. al, Chromosome variation of pollen mother cell of pollen-derived plants in wheat (Triticum aestivum L.) // Sci. Sin. 1980, - 23, -P. 905.

233. Hu Z.H., Sunderland N. Glutamine, inositol and conditioning factor in the production of barley pollen callus in vitro // Plant. Science. 1981, - 23, - P. 161-168.

234. Hu H. Genetic stability and variability of pollen-derived plants // I.S.K. Sen and Kenneth L. Giles (Ed ), Plant cell cult. In crop Impr., 1983, - New York. Plenum Press, - P. 145.

235. Hu H, Zheng J. Development of new variations via anther culture // In P.V. Amirato et. al., (ed). Handbook of plant cell cult. MacMillan Publishing Co. -New York, 1984, - P. 65-90.

236. Hu H. Wheat: Improvement through anther culture // Ed. by Bajaj Y.P.S. Biotechnology in Agr. And Forestry, Springer-Verlag Berlin, - Heidelberg, -1986,-2,-P. 55-72.

237. Hu T., Kasha K.J. Improvement of isolated microspore culture of wheat (Triticum aestivum L) throught ovary co-culture // Plant Cell Rep. 1997, - N. 16(8),-P. 520-525.

238. Hu T., Kasha K.J. A cetological study of pretreatments used to improve isolated microspore cultures of wheat (Triticum aestivum L) cv. Chris // Genome. 1999, - N. 42 (3), - P. 432- 441.

239. Jahne A., Becker D., Brettschneider R., Lorz H. Regeneration of transgenic, microspore-derived, fertile barley I I Theor. and Appl. Genet. 1994, -84, - P. 525-533.

240. Jain J.C., Shargoof P.D. Use of an aneuploid soybean cell culture to examine the relative importance of the GS.GOGAT system and GDH in ammonia assimilation // J. Plant Physiol. 1987, - 130, - N. 2-3, P. 137-146.

241. Jain R.K., Maherchandani N., Chowdhury V.K. Alpha-amylase and isoperoxidases in differantiating callus cultures of Datura innoxia. // Curr. Sci.1986,- 55,-N. 24,-P. 1244-1245.

242. Jiang J., Liu D. New hordeum-triticum hybrids // Cereal Res. Commun.1987,- 15,-N. 2-3,-P. 95-99.

243. Jiaun Z. et. al, Factors affecting the induction of pollen plants of Tr. aestivum x Tr. agropyron // Theor. and Appl. Genet. 1985, - 70, - N. 3, - P. 294-299.

244. Jones A.M., Petolino J.F. Effects of donor plant genotype and growth environment on anther culture of soft-red winter wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Cell Tissue and Organ Cult. 1987, - 8, - P. 215-223.

245. Jones IV., Maire M. The activity and stability of wheat nitrate reductase in vitro // Bot. Dep. University College., Ireland. 1984, - P. 385-387.

246. Junzhi Z. Application of anther culture technique to crop improvement in China // Plant cell cult. crop, improv. Proc. Int. Simp. 6-10 Dec. 1981, New York, London, - 1983, - P. 351-363.

247. Kao K.M. Plant formation from barley anther cultures with ficoll media // Z. Pflanzenphysiol, 1981, - 103, - S. 437-443.

248. Kao K.N., Horn D.C. A method for induction of pollen plants in barley // Proc. 5 th Int. Congr. Plant tissue cult. Tokyo, - Lake Yamanaka, - 1982, - P. 529-530.

249. Kaleikau E.K., Sears R.G., Gill B.S. Monosomoc analysis of tissue culture responce in wheat // Theor. and Appl. Genet. 1989, - 78, - N. 5, - P. 625-632.

250. Kay L.E., Basile D.V. Specific peroxidase isoenzymes are correlated with organogenesis // Plant Physiol. 1987, - 84, - N. 1, - P. 99-105.

251. Keller B., Stein N., Fenillet C. Compaarative genetics and disease resistance in wheat // Abstracts 6-th Iner. Wheat Conference. Budapest. 2000, - P. 52.

252. Kershanskaya O.I. Drought tolerance in wheat: photosynthesis and avoidance of stress // Abstracts 3 Inter. Crop Science Congress. 2000, - Hamburg, Germany, 17-22 Aug. - 2000, - P. 154.

253. Khan B.M., Dwivedi U.N., Rawal S.K., Magcarenhas A.F. In vivo nitrate reductase activity in dark- and light-grown sugarcane callus // Plant Cell Rep. -1984,-3,-N.4,-P. 138-141.

254. Kinyu M.G., Baenziger P.S., Kim KM., Nyangweso P. Improvement of rate of haploid embryo production in wheat x maize wide crosses // Abstracts 3 Inter. Crop Science Congress. 2000, - Hamburg, Germany, 17-22 Aug. - 2000, - P. 239.

255. Kohmetova A.M., Urazaliev R.A. Genotype-environment interactions and drought resistance in wheat hear-isogenic lines // Abstracts 3 Inter. Crop Science Congress. 2000, - Hamburg, Germany, 17-22 Aug. - 2000, - P. 79.

256. Kleiger Y., Schmid G., Winzeler H. La culture d'anthers: possibilités et limites dans la selection duble de lepeautre // Revwe suisse d'agriculture, 1986,- 18,-P. 305-311.

257. Kluth A., Becker D., Lorz H. Interintamce of transgenes in cereal plants // Eds Altman et. al., In: Plant Biotechnology and in vitro biology in 21st Century, Nitherland, 1999, - P. 159-164.

258. Kudarov B.R., Anapiaev B.B., Bogouspaev K.K., Shamrov /./., Batygina T.B. Patvvays of morphogenesis in culture of wheat anther 11 Pr. XI Inter. Symp. Embryol. and seed reprod. Leningrad. 3-7 Luly, 1990, - P. 212.

259. Kudarov B.R., Anapiaev B.B., Bogouspaev K.K., Shamrov /./., Batygina T.B. Patways of morphogenesis in culture of wheat anther // Pr. XI Inter. Symp. Embryol. and seed reprod. St. Petersburg. - Nauka, - 1992, - P. 294-295.

260. Macdonald M.V., Handwiger M.A., As lam F.N., Ingram D.S. The enhancement of culture efficiency in Brassica napus ssp. Oleifera Metzg. (Sinsk.) using low doses of gamma irradiation // New Phytol, 1988, - 110, - P. 101-107.

261. Meija S.J., Morgant V., DiBona D.E., Wong J. Plant regeneration from isolated microspores of Triticum aestivum //Plant Cell Reports, 1993, - 12, - P. 149-153.

262. Mets S.S., Sharma H., Armstrong Т., Mascia P. Chromosome doubling and aneuploidy in anther-derived plants from two wither wheat lines // Genome, -1988,- 30,-P. 177-181.

263. Miao Z. Изучение мейоза у растений полученных из пыльцы гибридов F1 октоплоидов Triticum-Agropyron с мягкой пшеницей // Acta. Genet. Sin. -1987, 14,-P. 25-30.

264. Miao Z., Zhuang J., Ни H. Ezpression of various gametic types in pollen plants regenerated from hybrids between Triticum Agropyron and wheat // Theor and Appl. Genet; - 1988, - 75, - N. 3, - P. 485-491.

265. Mizonobe G., Komatsu S., Araci H. et. al., Stadies on tissue culture in Asparagus officinals L. //J. Fac. Agr. Hokkaido Univ, 1990, - 64, - N. 2, - P. 176-182.

266. Moieni A., de Vallavielle-Pope C., Sarrafi A. Potential use of doubled haploid lines for the screening of resistance to yellow rust (Puccinia striformis) in hexaploid wheat // Plant Breeding, 1997,- 116, - № 6, - P. 595-597.

267. Muller G., Vahi U., Wiberg A. Die nutzung der anthereiikiüturmethode im zuuchtprozeb von winterweizen // Die Bereineuer Winterweizendh-Linen mit 1 AL-1 rs-Translokation Plant. Breed. 1989, - 103, - N. 1, - S. 81-87.

268. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioasseys with tobacco tissue //Physiol. Plant. 1962, - 15, - P. 473-497.

269. Murigneux A., Baud S., Beckert M. Molecular and morphological evaluation of doubled-haploid lines of maize. 2. Comparison with single-seed-descent lines //Theor Appl Genet. 1993. V. 87. P. 278-287.

270. Navarro-Alvares W., Baenziger P.S., Eskridge K.M. et. al., Addition of colchicine to wheat anther culture media to increase doubled haploid plant production // Plant Breeding. 1994, - 112, - P. 192-198.

271. Nitsch J.P. Experimental androgenesis in Nicotiana // Phytomorphology, -1969,- 19,-P. 389-404.

272. Nitsch C. Pollen culture: A new technique for mass production of haploid and homozygous plants // In.: Kasha K.J. (ed) Haploids in higer plants. Advances and potential. Univ. Guelph. - Canada, - 1974, - P. 123-135.

273. Nitsch C. Culture of isolated microspores // In.: J. Reinert and Bajaj (ed) Plant cell, tisue and organ cult. Springer - Verlag, - New York, - 1977, - P. 268-278.

274. Olsen F.L. Induction of microspore embryogenesis in cultured anthers of hordeum vulgare. The effects of ammonium nitrate, glutamine and asparagine as nitrogen sources // Carlsberg Res. Commun. 1987, - 52, - N. 6, - P. 393-404.

275. Ouyang T.W., Ни H., Chuang C.C., Tseng C.C. Induction of pollen plants from anthers of Triticum aestivum L. cultured in vitro // Sei. Sin. 1973, - 16, -P. 79-95.

276. Ouyang J.W. et. al., Чувствительность пыльниковых культур к температуре культивирования у Tr. aestivum. 1. Генотипическая изменчивость чувствительности к температуре культивирования // Ичуань. Hereditas. 1983, - 5, - Р. 14-16.

277. OuyangJ., He D., Feng L., Sia S. The response of anther culture to culture temperature varies with growth conditions of anther-donor plants // Plant Science, 1987, - 49, - P. 145-148.

278. Ouyang J. IV., Liang H., Jia S.J., et. al, Studies on the chromosome ddoubling of wheat pollen plants // Plant Science. 1994, - 98, - P. 209-214.

279. Face G.M. et. al,, Anther culture of maize and the visualization of embryogenetic microspore by fluorescent microscopy // Theor. Appl. Genet. -1987,-73, P. 863-869.

280. Pescitelli S.M., Johnson C.D., Fetolino J.F. Isolated microspore culture of maize: effects of isolation technique, reduced temperature, and sucrose level // Plant Cell Reports, 1990, - 8, - P. 628-631.

281. Picard E., Buyser de J. Obtention de plantules haploides de Tr. aestivum L. a partis culture d'anthers in vitro // C.R. Acad. Sci. 1973, - 277, - P. 1463-1466.

282. Fin K., Anceau C.; Seilleur P. Amelioration des techniques androgeniques par modification des conditions de croissance des plantes donneuses d'anthers chez Tr. aestivum L. em THELL // Bull. Rech. Agron. Gembloux. 1989, - 24, -N. 2,-P. 213-217.

283. Potrykus I. Gene transfer to cereals: an assessment // Biotechnology. -1990, -6,-P. 535-542.

284. Powell W. Et. al., Variation in the agronomic characters of microspore derived plants of Hordeum vulgare cv. Sabarlis // Heredity. 1984, - 52, - N. 1, -P. 17-23.

285. Powell W. The influence of genotype and temperature pretreatment on anther culture responce in barley (Hordeum vulgare L.) // Plant cell tissue and org. cult. 1988,- 12,-P. 291-297.

286. Prakash J., Giles K. Induktion and growth of androgenic haploids 11 Int. Rev. Cytol. Orlando, V. 107, 1987, - P. 273-292.

287. Puolimatka M., Laine S., Pauk J. Effect of ovary co-cultivation and culture medium on embryogenesis of directly isolated microspores of wheat // Cereal Res. Comm. 1996, - 24, - P. 393-400.

288. Puolimatka M., Pauk J. Impact of explant type, duration and initiation time on the co-culture effect in isolated microspore culture of wheat (Triticum aestivum L). // Plant Physiol. 1999, - N. 154 (3), - P. 367-373.

289. Raghavan V. Developmental strategies of the angiosperm pollen: a biochemical perspective // Cell Differentation. 1987, - 21, - N. 4, - P. 213-226.

290. Raghavan V., Nagmani R. Cytokinin effects on pollen embryogenesis in cultured anthers of Hyoscuamus niger // Can. J. Bot. 1989, - 67, - N. 1, - P. 247-257.

291. Ramband C., Rambour S. Partial characterization of nitrate reductase in carrot cells: chanes in enzymatic activity during somatic embryogenesis // Plant. Physiol, and Biochem. 1989, - V. 27, - N. 2, - P. 235-243.

292. Rao N.M., MethaA.R. In vitro growth and nutrition of Datura anther callus // Indian. J. Plant. Physiol. 1968, - 11, -N. 2, - P. 181-187.

293. Rose J,, Dunwell J., Sunderland N. Anther culture of Lolium temulentum, Festica pratenses and Lolium x Festica hybrids. II. Anther and pollen development in vivo and in vitro // Ann. Bot. (USA). 1987, - 60, - N. 2, - P. 191-214.

294. RashidA. Pollen dimorphism in relation to pollen plant formation // Physiol. Plant. 1984, - 58, - N. 4, - P. 544-548.

295. Ritala A., Aikasalo R., Aspegren K. Et. al., Transgenic barley by particle bombardment. Inheritance of the transferred gene and characteristics of transgenic barley plants // Euphytica. 1995, - 85, - P. 81-88.

296. Rout J., Sarma N., Rao G. Effect of potato-2 medium on anther culture of interspecific rice hybrids // Ann. Bot. (USA). 1989, - n. 6, - P. 621-624.

297. Sagi F. In vitro modszerek alkalmazasa a gabonafelek nemesiteseben. II. Haploid-indukoio, gametoklonals variacio // Novenytermales. 1987, - 36, - N. 5,-P. 385-394.

298. Salmenkallio-Mcirttila, Kurten U., Kauppinen V. Culture conditions for efficient induction of green plants from isolated microspores of barley // Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1995, - 43, - P. 79-81.

299. Scaffer L. Recovery of heritable variability in anther-derived doubled-haploid rice // Crop. Science. 1982. - 22. - N. 6, - P. 1160-1164.

300. SchafferG., Baenziger P., WorleyJ. Haploid plant development from anthers and in vitro embryo culture of wheat // Crop. Sci. 1979, - 19, - P. 687-702.

301. Schmid J., Keller E. Effect of a gametocide on the induction of haploids in Tr. aestivum // Pr. Int. Sym. Genetic Manipulat. In Plant Breed. Eucarpia. Sep. 8-13, 1985. Berlin, - 1986, - P. 347-349.

302. Schimada Т., OtaniM. Сортовые различия по способности к регенерации зеленых растений из пыльцевых зародышей пшеницы // Jap. J. Breed.1989,-39,-N. 2,-P. 187-194.

303. Schimada T. Microspore development during in vitro anther culture of wheat // Wheat Information Service. 1989, - N. 69, - P. 46-48.

304. Sharma J.P. Chawla H.S. Ribonuclease activity and soluble proteins in Lr isogenic lines of wheat (Triticum aestivum L) Wheat Information Service.1990,-N. 70,-P. 7-10.

305. Singsit C., Hanneman R. Haploids of tetraploid (2n=4x=48) Mexican potato species their extraction, cytology and crossability I I Amer. Potato J. - 1987, -64, - P. 469-482.

306. Snape J. W. Golden calves or white elephants? Biotechnologies for wheat improvement // Eds.H.J. Braun et.al., Wheat: Prospects for Global Improvement, 1998, - P. 273-283.

307. Sorvari S., Schider O. Influence of sucrose and melibiose on barley anther culture in strach media// Plant. Breed. 1987, - 99, -N. 2, - P. 164-171.

308. Souvre A., Albertini L., Autran J. Le grain de polen des angiospermes. Apports de la biopalynologie et perspectives biotechnologiques // Bull. Soc. Bot. FR. Actual Bot 1987, - 134, - N. 1, - P. 87-112.

309. Stöger E., Fink С., Ffosser M, Haberle-Bors E. Plant transformation by particle bombardment of embryogenic pollen // Plant Cell Rep. 1995, - 14, - N. 5,-P. 273-278.

310. Sun C, Chu С., Li H. Electron microscope observation of microspore division of wheat in vitro //Acta. Bot. Sin. 1983, - 25, - P. 295-300.

311. Sunderland N. Strategies in the improvement of yields in anther culture //In.: Proc. Symp. On Plant Tissue Cult. Science Press. Peking. 1978, - P. 65-86.

312. Sunderlant N. Comparative studies of anther and pollen culture // Columbus. Ohio Stat. Univ. Press. 1979, - P. 219-230.

313. SunderlandN., Xu Z. Shed pollen culture in Hordeum vulgare // J. Exp. Bot. 1982,- 33,-P. 1086-1095.

314. Sunderland N. On the use of microspore for genetic modification // Plenum Press. New York. London, - 1983, - P. 315-332.

315. Sunderland N., Huang В., Hills G. Disposition of pollen in situ and it's relevance to anther. Pollen Culture // J. Exp. Bot. 1984, - 35, - N. 153, - P. 521-530.

316. Swarnkar P., Bohra S., Chandra N. Biochemical changes during androgenesisin Datura innoxia //Curr. Sei. 1987, - 56, -N. 14, - P. 730-731.

317. Swarnkar P.L., Bohra S.P., Chandra N. a-Amylase activity and morphogenetic potential in callus cultures of Solanum surattense // Curr. Sei. -1987,-56,-N.17,-P. 905-906.

318. Tan B.H., Halloran G.M. Some cytological aspects of diploid wheat anther culture // Wheat Information Service. 1980, - N. 51, - P. 15-18.

319. Tivari S., Rachimbaev I. Androgenesis from microspore to plant // Изв. AH Каз.ССР. 1991, - №3, - С. 9-15.

320. Touraev A, Indrianto A, Wratschko I, Vicente O, Heberle-Bors E. Starvation and heat-shock-induced in vitro microspore embryogenesis in wheat (Triticum aestivum L.). Sex Plant Reprod 9, 1996, P. 209-215.

321. Touraev A., Vicente O., Heberle-Bors E. Induction of microspore embryogenesis by stress // Trends in Plant Sci. 1997, - 2, - P. 297-302.

322. Tsay S.S., Tsay H.S., Chao C. Cytochemical studies of callus development from microspore in cultured anther of rice // Plant Cell Rep. 1986, - 5, - P. 119-123.

323. Tsiijimoto H., Tsunewaki K. Gametocidal genes in wheat and it's relatives. Ill Chromosome location and effects of two Aegilops speltoides-derived gametocidal genes in common wheat // Genome. 1988, - 30, - N. 2, - P. 239244.

324. Tuvesson I.K., Ohlund R.C. Plant regeneration through culture of isolated microspores of Triticum aestivum L. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture, -1993,- 34,-P. 163-167.

325. Uhrig H. genetic selection and liquid medium conditions improve the yeld of androgenic plants from diploid potatoes // Theor. Appl. Genet. 1985, - 71, - P. 455-460.

326. VageraJ., JilekM. Specification of the effect of chelating complex of iron ions in androgenesis in vitro by means of cation-free minimal medium // Biol. Plant. 1984, - 26, - N. 2, - P. 121-127.

327. Vasil I.K. Plant biotechnology: Achievement and Opportunities at the Threshold of the 21-st Century // In.: Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21-st Centry. Kluwer Acad. Press. Niderlands. 1999, - P. 9-16.

328. Wang X., Ни H. The effect of potato -II medium for triticale anther culture // Plant Sci. Lett. 1984, - 36, - P. 237-239.

329. Wang L., Yuan M, Xu A. L-аланин стимулирует дифференциацию каллуса из пыльцы ячменя // Acta. Bot. Sin. 1988, - 30, - N. 5, - P. 558-561.

330. Wei Z.M. Pollen callus in Tr. aestivum // Theor. Appl. Genet. 1982, - 63, -P. 71-73.

331. Wilson H., Mix L., Foroughi-Wehr B. Early microspore division and subsequent formation of microspore calluses at high frequency in anther of Hordeum vulgare L. // J. Exp. Bot. 1985, - N. 108, - P. 227-238.

332. Xiao-ming Т., Qiu-hong L. The influence of hormones on microspore development of wheat anther culture in vitro // Acta Bot. Sin. 1987, - 29, - N. 3,-P. 314-319.

333. Xu Z., Huang В., Sunderland N. Culture of barley anthers in conditioned media// J. Exp. Bot. 1981, - 32, - N. 129, - P. 767-778.

334. Ye J., Harvey В., Kao K. Effects of 2,4-D and zeatin ribozide on pollen callus induction in barley anther culture // Can. J. Plant Sci. 1985, - N. 1, - P. 29-32.

335. Ye X., Yu Y. Изучение изменчивости у растений-регенерантов пшеницы. II. Цитологическая и морфологическая изменчивость в поколений R1 // Acta Genet. Sin. -1989, 16, - N.2, - P. 105-110.

336. Zavodna M., Gregova E., Silkova S., Kraic J. Marker assisted introduction and pyramiding of wheat leaf rust resistance genes Lr 19 and Lr 24 // Abstracts 3 Inter. Crop Science Congress. 2000, - Hamburg, Germany, 17-22 Aug. -2000,-P. 227.

337. Zeng J., Ouyang J. The early androgenesis in in vitro wheat anthers under ordinary and low temperature // Acta. Genet. Sin. 1980, - 7, - P. 165-173.

338. Zhang Y.I., Li D.S. Anther culture of monosomies in Triticum aestivum L II Hereditas (Beijing), 1984, - 6, - P. 7-10.208

339. Zhang L.J., Anceau C., Lepoivre P. et. al., An effecient method for the regeneration of wheat (tr. aestivum) from anther cultures // Bull. Rech. Agron. Gembloux. 1987, - 22, - N. 4, - P. 301-314.

340. Zhou H., Konzak S. Improvement of anther culture methods for haploid production in wheat// Crop. Sei. 1989, - 29, - N. 3, - P. 817-821.

341. Ziauddin A., Marsolais A., Simion E. and Kasha K.J. Improved plant regeneration from wheat anther and barley microspore culture using phenylacetic acid (PAA) // Plant Cell Rep., 1992, - 11, - P. 489-493.209

Информация о работе

Анапияев, Бахытжан Бейсенбекович
доктора биологических наук
Алматы, 2001
ВАК 03.00.23

Диссертация

Экспериментальный морфогенез и биотехнология получения гаплоидов в культуре микроспор пшеницы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы