Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К ФУЗАРИОЗУ РАСТЕНИЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ (ГАПЛОИДНАЯ) И ОГУРЦА (МЕРИСТЕМНАЯ, КАЛЛУСНАЯ И МИКРОСПОРОГЕННАЯ)

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К ФУЗАРИОЗУ РАСТЕНИЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ (ГАПЛОИДНАЯ) И ОГУРЦА (МЕРИСТЕМНАЯ, КАЛЛУСНАЯ И МИКРОСПОРОГЕННАЯ)"

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К ФУЗАРИОЗУ РАСТЕНИЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ (ГАПЛОИДНАЯ) И ОГУРЦА (МЕРИСТЕМНАЯ, КАЛЛУСНАЯ И МИКРОСПОРОГЕННАЯ)

03.00.23. - БИОТЕХНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева и в лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии Костромской государственной сельскохозяйственной академии

Научный консультант - доктор биологических наук академик РАСХН В С Шеве 1уха

Официальные оппоненты доктор биологических наук, 1 рофессор

3 Б Шамина

доктор биологических наук Т И Дьячук

доктор биологических наук, А К Гапоненко

Ведущая организация Всероссийский научно-исстедовательский

институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

¿¿У О г г'.

Защита диссертации состоится —-—Оклибри-- 200ь года в

^ часов на »аседании диссертационного совета Д 220 043 10 при РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва И-^0 ут Тимирязевская, 49 Ученый совет РГАУ-МСХА имени К А Гимирязеп«

С диссертацией можно ошакомиться в ЦНБ РГЛУ-МСХ-Ч имени К Л Тимирязева

Автореферат разослан « сентября 2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

1 И Кар

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Основной целью селекционных программ является повышение урожайности сельскохозяйственных культур, создание новых сортов и гибридов, обладающих улучшенными качествами продукта, комплексной устойчивостью к болезням, вредителям и стрессовым факторам среды, менее требовательных к условиям возделывания соответствующих регионов страны.

Важнейшей задачей селекции по-прежнему остается сокращение сроков создания новых сортов и гибридов сельскохозяйственных культур. Создание их традиционными методами требует длительного времени и значительно больших затрат. Так, для получения одного районированного сорта озимой пшеницы, селекционеру Д.Л.Рудзинскому пришлось проработать сотни гибридных комбинаций и изучить десятки тысяч селекционных номеров, на что потребовалось 10 лет работы (Б.И.Сандухадзе, М.И.Рыбакова, З.А.МорозоваДООЗ). Современные уровень и темпы развития сельскохозяйственного производства диктуют поиск новых путей не только в селекции, но и в первичном и промышленном семеноводстве.

Из семейства Мятликовых (Роасеае) в структуре зерновых площадей России наиболее распространена пшеница (Triticum L.). Из сем. Тыквенных (Cucurbitaceae) - огурец. Посевы огурца и зерновых культур на огромных территориях во всех сельскохозяйственных регионах страны поражаются грибными болезнями. Среди них наиболее вредоносными являются фузариозные корневые гнили, септориоз и склеротиния, на огромных площадях поражающие посевы зерновых культур, в том числе озимой пшеницы и наносящие ущерб на сумму около 5 млрд. долларов (Сидоров A.A., 2001).

Несмотря на определенные успехи, имеющиеся в селекции озимой пшеницы на устойчивость к болезням, до сих пор не удалось вывести сортов или гибридов этой культуры, высокоустойчивых к фузариозным корневым гнилям. Использование генетических исследований и нетрадиционных методов селекции могут обеспечить решение этой задачи (Chepra,1996).

Большой теоретический и практический интерес для селекции представляет использование гаплоидии. Дня получения гаплоидов методами биотехнологии в культуре in vitro злаковых применяют: метод «бульбозум» (В.Н. Чистякова,2000), культивирование изолированных пыльников и микроспор - андрогенез in vitro (Batygina, Vasilyeva, 2003), андроклиния (Хохлов, 1976) - при этом растения образуются двумя путями - путем эмбриоидогенеза в пыльцевых зернЖ Н через о^рд^аМй Х&луса из клетэк пыльника; культивирование неог годотйфреяньК.АзаЕйМИряй^ёемяпоч гк

ЦНБ имени Н.И. Желсзмова Фонд научный литератур«

учньж литера.» ун*

M-Jbg^^r

(В Н Чистякова, Э Д Неттевич, Г В Гутяев 1994) Диплоидизация ran юидов, получаемых на основе Fl, сокращает сроки создания гомозиготных 1иний до 12 ют (В Н Чистякова, 2000) Быстрое создание гомозигот обпадающих комплексной устойчивостью к корневым гнитям и сспториоsv позвотяет опережать формообразовате 1ьный процесс в попутяциях >тих патогенов, что особенно важно при работе с озимы ми, дв\ четними и многолетними к\тьтурами Кутьтивирование 1енеративных структ\р in v itro. в частности пьпьника напрямую связано с решением проб чем морфогенеза, которые 5ависят от внутренних и внешних факторов Д 1я изучения андрогенеза in v itro и его использования в сетекции озимой мягкой пшеницы нсобхочима разработка теоретических и практических основ ку тьгивирования генеративных структур in vitro и, в первую очередь, и ¡учение проблем шбриоияогене за пыльника, выяв 1сние критических кериодов его развития, связанных с перек течением программы с гамегофитно!о пути на сиорофшныи и образованием гап юидных растении-рег енерантов

На основе дигаплоидов, но |ученных методом kv гьтуры пытьников в Китае создана серия новых сортов яровой пшеницы и риса (/hao et al , I9Q0) а во Франции зарегистрирован новый сорт пшеницы Horm (De Buv^er Y,Henrv Y et al ) В России создан сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 64 (Kusmenko.Djatchouk 1997) Проблеме получения гаплоидов зерновых паков посвящено множество жедериментальных работ, обзорных статей и монографий (Бутенко Р Г 1975 С\ханов 1983, Дьяч\>к. Дьячук 1989, Pauk, 1996 и др ) Однако несмотря на определенные успехи метота кутьтуры пьпьников, пока не создано сортов озимои мягкой пшеницы '^о связано с 1ем, что до настоящего времени не разработана ¡ффективная система получения гапчоидов при кутьгивировании пытьников различных генотипов |ерновых кутьгур нет воспроизводимых составов индукционных сред, не решены проблемы pei енерации, альбинизма и др

Обзор нерешенных методо Ю1ических проблем по вопросу ку оптирования in vitio пыльников и микросгор яровой мягкой пшеницы четко определи i д 1я нас границы изучения проб >емы андрогенеза m vitro в сетекпии о<имой пшеницы, имеющей большое народнохо!яйственное значение в Центральном Нечерноземье Применение классических методов получения исходного материала дня егтекции »той кутьтуры пока не дали необходимого рез\ тьтата

Цель и задачи исследований .

Цель наших исследований заключалась в обобщении теоретических и разработке прикладных аспектов применения гаплоидной биотехнологии на основе метода культивирования пыльников и микроспор, изучения особенностей андрогенеза in vitro сортов озимой пшеницы селекции НИИСХ ЦРНЗ (Немчиновка, Московская область), обладающих повышенной устойчивостью к токсину фузариозной корневой гнили.

Работа с огурцом предполагала разработку и применение меристемной, каллусной и микроспорогенной биотехнологий для получения устойчивых к фузариозу растений, отобранных на фильтратах культуральной жидкости (КФ) гриба Fusarium sp. и токсине Т-2 из Fusarium sp.

В процессе реализации поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1. Разработать биотехнологию получения андрогенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы.

2. Изучить возможности морфогенеза в культуре эмбриоидов и каллусных тканей мягкой пшеницы с озимым типом развития на основе собственных разработок.

3. Оценить влияние внутренних и внешних факторов, способствующих повышению уровня выхода гаплопродукции в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы.

4. Изучить взаимовлияние органических добавок и ацетона в составе жидких и агаризованных питательных сред на выход гаплопродукции в процессе андрогенеза in vitro озимой пшеницы.

5. Выявить факторы, положительно влияющие на гаплопродукцию озимой пшеницы и определить лимитирующие, затрудняющие процесс выхода зеленых регенерантов в культуре изолированных пыльников и микроспор.

6. Провести цитологический мониторинг этапов андрогенеза in vitro озимой пшеницы и цитофотометрический анализ ДНК с использованием возможностей светового микроскопа «Opton-15» и цитоспектрофотометра SMP-20 «Opton».

7. Разработать гаплоидную и микроспорогенную биотехнологии получения новых форм озимой пшеницы и огурца, отличающихся повышенной устойчивостью к токсину фузариозной корневой гнили.

8. Создать линии удвоенных гаплоидов, устойчивых к фузариозным корневым гнилям с целью использования их в селекционных программах лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (п.Немчиновка, Московская обл.).

9 Получить семена or устойчивых к фузариозу растении о »той пшеницы и огурца путем искусственного скрещивания и оценигь полученное семенное поколение на устойчивость к пато!ену

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1 Теоретическое и экспериментальное обоснование принципов оптимизации биотехнологии получения гаплоидов озимой пшеницы для сортов высокой хозяйственной ценности

2 Разработка и обоснование технологических аспектов ,»тя ку тьтуральной системы m vitro пыльник микроспора - на основе разработки условии стерилизации jkcii ijhioh подбора компонентов индукционных сред включая разтичные виды органических ^обавок

» Экспериментальное подтверждение Шсчимоети

низкотемпературного стресса и ацетона для массового выхода $е iciibix регенерантов в кутьтуральной системе пыльник-микроепора

4 Отработка схем еетекции m vitro с использованием токсина патогена фу ¡ариозиои корневой гнитн для отбора катлуеируюшич ran юидных структур отмой пшеницы и микроспорогенных тканеи oivpua

5 Оценка форм ошмой пшеницы и orvpna порченных в культ, ре п vitro и передача их производству (лаборатория селекции озимои пшеницы НИИСХ ЦРНЗ, пНемчиновка Московская об i, ГУСХП «Высоковскии», Костромская об л )

Научная новизна

Впервые для мягкой пшеницы с озимым типом развития разработана и испо 1ьзована биотехнология, обеспе швающая .iojiv4eHHe гаи шидов и дигаплоидов в i енетико селекционных программах НИИСХ ЦРНЗ для ускоренного создания форм устойчивых к фузариозным корневым i нилям Впервые проведено сравнительное исследование особенностей андрогенеза ш vitro и установлены общие принципы образования гаплоидов озимой пшеницы в системе андрогенез гиногенез При >том изучены i0 вариантов кульгуральных сред, содержащих различные виды органических добавок a также ацетона, предложена универсальная базовая ере л а для конвейерного отбора эмбриоидогенных структур способных к развитию зе теных растении-регенерантов Проведено комплексное изучение как внешних так и внутренних факторов влияющих ня эффективность гаплопродукции озимои пшеницы в kv ibrvpe пыльников и микроспор, показана относительно слабая роль низких по южите 1ьных температур ття эффективности андрогенеза

пшеницы с озимым типом развития и положительная роль присутствия в среде ацетона. Определены пути морфогенеза и основные факторы, как ускоряющие, так и лимитирующие процесс регенерации зеленых гаплоидов в культуре in vitro. Изучено морфологическое строение каллусных и эмбриоидогенных структур в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы и выявлены новые их типы. В процессе разработки эмбриологических основ андроклинии озимой мягкой пшеницы, установлены четыре типа апертур микроспор, нехарактерных для этой культуры.

Таким образом, впервые предложена технология получения диплоидизированных гаплоидов мягкой пшеницы с озимым типом развития, позволяющая максимально сократить сроки создания чистых гомозиготных линий до 1-го года, что особенно важно для этой культуры в условиях Центрального Нечерноземья.

Предложен экспресс-метод оценки огурца на устойчивость к фузариозным корневым гнилям по прорастанию пыльцевых трубок на средах, содержащих токсин гриба Fusarium sp.

Практическая ценность работы.

Разработанные технология создания андрогенных гомозиготных линий и методы тестирования гаплоидных растений озимой пшеницы по характеристикам андрогенеза и устойчивости к грибным болезням использованы в селекционном процессе лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (п.Немчиновка, Московская обл.) для создания сортов, устойчивых к корневой гнили. В Федеральный институт промышленной собственности поданы заявки на «Технологию (Способ) создания форм мягкой пшеницы с озимым типом развития методами гаплоидной биотехнологии» и «Состав индукционной среды для получения гаплоидных растений озимой мягкой пшеницы». Полученные теоретические и практические разработки по сравнительному влиянию различных органических добавок, включая ацетон, аминокислоты, крахмалы и др., активно используются при чтении лекционного курса по предмету «Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции» на кафедре хранения, переработки и товароведения продукции растениеводства РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, а также отражены в 8-ми лабораторно-практических занятиях в разделе «Клеточная биотехнология и биоинженерия» Лабораторного практикума по сельскохозяйственной биотехнологии, изданного коллективом авторов под редакцией зав.кафедрой с/х биотехнологии РГАУ - Московская с/х академия имени К.А. Тимирязева, академика РАСХН B.C. Шевелухи для студентов, бакалавров, магистров и аспирантов агрономических специальностей (Москва, 2004); в разделе

«Микробиотехнология» Тестовых заданий по дисциплине «Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции» дня студентов высших сельскохозяйственных учебных заведений по специальности 311200 (110305) - Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции

Ас .N">1720595 (СССР) на «Способ ктонального микроразмножения растении огурца ( Cucumis sativus L )» Маркова (Лаврова) HB , Бутенко РГ (1991) и методика жспресс анализа огурца на чстоичивость к фузариозным корневым гнилям по прорастающим на токсичных средах пыльцевым тр\бкам применяется в селекционной работе ГУСХГ1 «Высоковский» Костромской обл Костромского р-на для размножения оздоровленного селекционного материала (Л 42 * и Л 29 _ ) в семеноводстве широкорайонированного для ¡имних тептиц гибрида Fl I рибовчанка-безвирусная

Апробация работы

Результаты работы и основные положения диссертации доложены на ежегодных научно-практических конференциях факультета Агробизнеса Костромской ГСХА (1499-2003 гг), Ш-й Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, октябрь 2004) научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава Гехнотогического факультета РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева (Москва декабрь 2004) on the Third Moskow international Congress «Biotechnology btate of the art and prospects ol development», March, 14-18, 2005), заседаниях кафедры сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева (2004-2006 гг )

Личный вклад соискателя Разработка программы исследовании по докторской диссертации с озимой мягкой пшеницей, ее выполнение и использование в селекционном процессе НИИСХ ЦРНЗ проводились автором во время обучения в очной докторантуре на кайедре сельскохозяйственной биотехнологии РГ АУ-МСХА имени К А Тимирязева и в лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии Костромской государственной сельскохозяйственной академии При оформлении научных публикаций постановке проблемы диссертации участие автора было определяющим

Связь работы с крупными научными программами

Диссертационная работа выполнялась в соответствии с утвержденной 24 03 2003 г темой докторской диссертации и Программой лаборатории селекции озимои пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (Московская область п Немчиновка) «Селекция озимой пшеницы в создании форм, устойчивых к болезням»

Автор выражает глубокую и сердечную благодарность: научному консультанту, академику РАСХН, заведующему кафедрой сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, д.б.н., профессору Виктору Степановичу Шевелухе за постоянное внимание к работе по теме диссертации; академику РАСХН, Президенту союза селекционеров России и зав. лабораторией селекции озимой пшеницы, д. с,-х.наук Баграту Исменовичу Сандухадзе и ст.н.с. этой лаборатории, к.с.-х.н. Бугровой Валентине Васильевне за подбор хозяйственно-ценного селекционного материала озимой пшеницы (семена и растения-доноры) в годы исследований; доктору биологических наук Чистяковой Валентине Николаевне, к сожалению, безвременно ушедшей от нас, за постоянное внимание к работе в 2000 году.

Автор также благодарит коллег, которые принимали участие в обсуждении результатов экспериментов: д.б.н. Каранову Светлану Лаврентьевну (Институт физиологии растений РАН), зав.отделом биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН, д.б.н., профессора МГУ имени М.В. Ломоносова Александра Михайловича Носова; профессора Венского Университета микробиологии и генетики (Австрия), д.б.н. A.A. Тураева; научных сотрудников отделов Болезней зерновых культур и Микологии и иммунитета ВНИИ фитопатологии (п.Голицино, Московская обл.), к.б.н. Коломиец Тамару Михайловну, к.б.н.Санину A.A. и к.б.н. Койду М.А.; профессора факультета биохимии и биотехнологии Университета им. Мартина Лютера (г.Халле, Германия) Юргена Кранца, зав.лабораторией биотехнологии ВНИИ риса (г.Краснодар), к.б.н. Мухину Ж.М., декана технологического факультета РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, д.б.н., профессора Новикова Николая Николаевича; профессора кафедры сельскохозяйственной биотехнологии, д.с.-х.н. Пронину Наталию Борисовну; за методическую помощь при микроскопировании - руководителя центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, к.б.н Карлова Геннадия Ильича и ст.н.с. этого центра Андрееву Галину Николаевну, а также всех сотрудников кафедры с.-х. биотехнологии Университета за предоставленную возможность проведения данных исследований.

С особой теплотой и благодарностью отмечаю большое внимание и помощь, которые оказала мне в научном творчестве, особенно в выборе дальнейших научных исследований с изолированными клетками и тканями растений in vitro,

мой первый научный руководитель и наставник, академик РАСХН и чл,-корреспондент РАН, д.б.н., профессор Раиса Георгиевна Бутенко, безвременно ушедшая от нас в 2004 году.

Публикации. Полученные экспериментальные данные подтверждены 32 печатными работами, из них 2 - в зарубежных изданиях вкчючая Ас на изобретение и 2 заявки на единым патент РФ Учебно методическая литература представлена 5 изданиями

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения 7 пав вкчючающих обзор тетерагурных источников по проблеме, материалы и методы исследования и 5 г~ав с результатами исследований и обсуждениями Имеется также заключение, выводы, список цитированной пперлуры и приложения Объем основного текста работы составляет 45^ страниц, включая 62 рисунка и 50 табчиц Список использованной читерагуры вкчючает 420 наименований в том числе 370 на иностранных языках

2. Материалы и методы иссле юваннй Условия проведения исследований и методики

Эксперименты по культивированию изочированных тканей, клеток органов мягкой пшеницы и огурца, тестированных на устойчивость к Fusarium проводились в шборатории сетьскохо ¡яйственной биотехнологии, организованной автором на базе Костромской ГСХА при кафедре агрохимии почвоведения и зашиты растений Иссчедования по теме докторской диссертации, включающие создание удвоенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы, отобранных на средах ^ токсином Fusarium sp , с 2003 по 200ь годы продочжали на кафедре сельскохозяйственной биотехно ioiии РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

Цитотогическая часть лсстедований выполнялась с исио 1ьзованием возможностей микроскопов МБИ-15 и «Opton»-15 Анализ интерфазных ядер с помощью цитоспектрофоточетра SMP 20 «Opton»

Исходный материал и объекты исследовании Исходными формами для отработки метода культуры изочированных пыльников и микроспор, получения чистообразных структур из змбриогенной ткани озимой пшеницы, отработки схем кчеточной селекции m vitro с токсином фузариевой кислоты с 1ужи in растения 5 ти сортов озимой мягкой пшеницы (2п-42) Немчиновская 24, Галина Инна, Московская 34 и Памяти Федина подобранные по принципу их селекционной ценности, с контрастной устойчивостью к фузариозной корневой гнили и септориозу Коллекция изучаемых сортов озимои пшеницы в течение ряда чет исстедовалась на скороспе юсть и приспособгснность к условиям Нечерноземной юны России, а также на устойчивость к грибным болезням, продуктивность качество ¡ерна и наследование количества бе"Ка (Марченкова Сандухадзе Чавдарь 1996) i е оценивались те признаки, которые в условиях Центрального Нечерноземья

являются лимитирующими и представляют интерес для селекции (Сандухадзе, Рыбакова, Морозова,2003).

Селекционный материал прошел предварительную оценку на устойчивость к патогенам во ВНИИ фитопатологии, п.Голицино (Московская обл.): слабоустойчивые к корневой гнили сорта: Немчиновская 24 и Галина (контроль); среднеустойчивые - Инна, Память Федина и устойчивый на уровне стандарта сорт Московская 39.

Селекционный материал огурца — селекционные линии Л 42<5 и Л 299 широкорайонированного для зимних теплиц Р1 Грибовчанка любезно предоставлен гл. агрономом ГУСХП «Высоковский», к. с-х. н Долгим Василием Викторовичем.

В качестве объекта исследований в экспериментах по морфогенезу использовали:

1. пыльники, микроспоры и семяпочки, изолированные из стерильных колосьев-доноров озимой мягкой пшеницы в различные фазы онтогенеза растений;

2. меристемы молодых и плодоносящих растений огурца;

3. каллусирующие листовые экспланты стерильных проростков огурца;

4. пыльцу молодых огуречных растений

Схемы экспериментальных исследований Схема исследований в 2003 - 2006 годах включала следующие этапы:

1. Подбор селекционных генотипов озимой мягкой пшеницы (лаборатория селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ (Немчиновка);

2. Отбор в поле колосьев с сортов-доноров в фазе выхода в трубку по морфологическим признакам (июнь-июль);

3. Анализ стадии развития микроспоры под микроскопом;

4. Холодовую предобработку колосьев при пониженной положительной температуре +4-7оС в течение 4 — 17 дней (и без холодовой предобработки);

5. Подготовку колосьев к стерилизации;

6. Подбор стерилизующего агента и экспозиции для стерилизации колосьев;

7. Подбор питательных сред для культивирования эксплантов;

8. Последовательное выделение пыльников, семяпочек и культивирование их на жидких питательных средах для голодания и кондиционирования (совместно с семяпочками);

9. Выделение микроспор в среду центрифугированием; Ю.Эксплантирование пыльников, микроспор и семяпочек в темноте при

температуре 28-32 оС на жидких и агаризованных питательных средах

для каллусо- и морфогенеза, на средах с токсином фузариевой кислоты, содержащих в своем составе фикол 1-400, ацетон МЕЬ и мальгозу,

11 Отбор змбриоидных структур и дальнейшее ку 1Ьтивирование их на средах дтя регенерации с минеральной основой солей по I амборгу, Блейдзу дополненных 20% картофе 1ьным экстрактом и ацетоном в объеме 2,5% при температуре 23-25 оС в условиях интенсивного освещения,

12 Цило югический анализ птоидности полученных растений-регенерантов,

13 Яровизацию полученных растении-регенерантов при температуре 2 -4 оС не менее 60 дней, колхицинирование (0,2% раствор ко кицина в смеси с 0,03% папаином) и цитологический контроль плоидности

14 Пересадку регенерантов в почву (подогреваемые 7сп шцы лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРН1 п Немчиновка, Московская обл ) для получения семенного материала и внедрения в селекционные программы

Частный протокол экспериментальной работы с пыльниками и микроспорами озимой пшеницы представлен на рис 1

Колосья-доноры анализировали в поле по морфологическим признакам растений-доноров размер и цвел пыльника, степень плотности чешуи ко.1 оса Указанные морфологические критерии различались в зависимости от селекционного генотипа и метеорологических условий года Детально стадию развития микроспор анализировали в лаборатории с х биотехноло! ии иод микроскопом на давленых препаратах по методу Паушевой 3 И (1488)

Стерильные колосья помещали в среду (а не в стерильную воду1) сочержатцую '„ солей МС без регуляторов роста и выдерживали при пониженных положите тьных температурах -К! 4 оС в течение 0-17 тней, что исключало затраты труда на подрезание подгнивающих стеблей, прод тевало жизнеспособность микроспор и их «готовность» к вь.сыпанию на поверхность жидких, агаризованных сред

Подбор уетовий стерилизации колосьев в нашем эксперименте (97-100% кеинфипированных экенлантов) обеспечил возможность культивирования целых цветков, полностью освободил нас от трудоемкой процедуры вычленения пыльников, исключая механическое их травмирование

Без холодовой предобработки, Холодовая предобработка срезанных

введение в культуру in vitro в коловьев (t=+2-5"C) в течение 4,9 и

день срезки колосьев 17 дней -"" + - +-

Подготовка колосьев к стерилизации (подбор стерилизатора и

экспозиции); обрезка остей и колосковых чешуй " 1 " + --

Стерилизация колосьев и выдерживание в среде МС без гормонов J-3 месяца

♦

Выделение цветков (пыльников) и эксплантирование на индукционных средах

Выращивание донорных растений озимой пшеницы на полевых делянках НИИСХ ЦРНЗ, п. Немчиновка (лаборатория селекции озимой пшеницы)

Отбор колосьев с сортов-доноров в фазе «выхода в трубку» для каждого сорта отдельно в соответствии с метеорологическими условиями года

ЖИДКИЕ (роллер, 99 об. /мин.): МС или В5, 10% карт, отвар, мальтоза 30-70 г/л, сахароза 40-60 г/л, фиколл 400 100 г/л, кинетин 1,5 мг, 2,4-Д 3,5 мг/л и др.

АГАРИЗОВАННЫЕ: Блейдса или 1020% карт, отвар, 2,4-Д 0,5-1,0 мг/л, сахароза 6%, мальтоза 10%, агар (агароза, крахмал) 7%, ацетон (1=27-28 "С в темноте)

Получение растений-регенерантов (7-14 дней)

Рис. 1. Протокол получения растений-регенерантов озимой мягкой пшеницы в культуре пыльников и микроспор in vitro

Андроклинные структуры (калтусные, эмбриоидные, глобулярные), через 25-35 дней пересаживали на модифицированные среды лчя регенерации и культивировали при *9-16 оС, 16 час фотопериоде и освещенности 20 тыс ikc до образования растений-регенерантов

Калтусные культуры выращивали в темноте при температуре 28-33 оС, с периодичностью освещения 16/8 час сутки и относитечышй влажностью 80% Анлрогенные новообразования (эмбриоиды и каллусы) для постедующего гистологического анализа фиксировали на разных стадиях развития как in vitro, так и in vivo в фиксаторах Чемберпена и FAA (Батыгина и др. 1974) Гаплоидные регенеранты укоренячи на ai аршовашшх/жидких средах до образования хорошей корневой системы и яровизировали

Методы изучения андрогенных каллусирлющих структур па устойчивость

к фузариозу

Работу по сетекции гагпоидных ктеток озимой пшеницы in vitro на устойчивость к фузариозным корневым гнилям вели с чистым токсином ф\чариевой кистоты, полученным из Института и,на (г Торжок) 1а основу в работе по созданию устойчивых к фузариозу форм о ¡имой пшеницы быта принята методика, разработанная нами в ИФР РАН под ру ководством чч корр РАН и академика РАСХН Р Г Ьутенко дтя семейства тыквенные (Cucurbitaceae) и примененная во ВНИИССОК (Московская обл ) д 1я создания устойчивых к ¡тому патогену сортов и пбритов огурца (Маркова (Лаврова) HB, 1990) с использованием токсина Т-2 из I usarium ьрр

Гаптоидные растения регенеранты, достшшие фазы греч шетьев и имеющие хорошо развитую корневую систему, ко«ишшировали с целью их диптоидизации (5 часов на свету в смеси, состоящей из 0 2% котчицина и 0 03° о иапаина) и ярови ¡провали не менее ЬО дней при t - -^4 С

Диплоидные растения-регенеранты высаживали в почву В первые 3-5 дней растения содержали в щадящем температурном и световом режимах Дальнейшую ве1етацию проводили при температуре Н7 - 1 оС, 16-часовом фогоиериоде и освещенности 20-25 1ыс тюке в ус ювиях иодофеваемои тепчицы НИИСХЦРНЗ (п Немчиновка, Московская обл )

Особенности техники in vitro и условия выращивания жептантов сепекпионных тиний огурца, а также методы оценки интенсивности роста регенерантов в селекции oiypua in vitro на устойчивость к фузариозу, приведены в АС №1720595 (СССР) на Способ клонального микроразмножения растений огурца (Cucumis sativus L ) Маркова (Лаврова) Н В , Бутенко Р Г (1991)

Цитологические методы исследований

Для цитоэмбриологических исследований отбирали генеративные органы (пыльники, микроспоры) озимой пшеницы непосредственно перед введением их в культуру in vitro, развивающиеся в культуре in vitro, анализировали также андроклинные структуры (эмбриоиды, глобулы, каллусные ткани), зиготические зародыши и полученные из них растения-регенеранты. Для фиксации культивируемых пыльников мягкой озимой пшеницы и образующихся морфогенных структур использовали фиксаторы Чемберлена и FAA (Батыгина с соавт., 1974).

Методика для окрашивания веретена деления любезно предоставлена д.б.н. В.Н.Чистяковой (неопубликованные данные).

Полученные временные давленые препараты просматривали при помощи микроскопа МБИ-15 при увеличении объекта в 25х, 63х и под масляной иммерсией 100х при зеленом светофильтре.

Цитофотометрия ДНК

Анализ интерфазных ядер в корнях через 72 часа от начала замачивания проводили методом цитофотометрии ДНК. После фиксации корня в смеси этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение 3 час., зону корневой меристемы (до 1-2 мм) отделяли и помещали на 2 часа при 37 оС в мацерирующую смесь, содержащую целлюлазу и пектиназу (0,4 %), затем окрашивали по методу Фельгена в течение 4 часов. Окрашенные ядра клеток меристемы фотометрировали на цитоспектрофотометре SMP-20 «Opton» с объективом х16, окуляром х10 и зондом 8 х 10 мм. Стандарт 2С определяли по среднему содержанию ДНК в телофазе митоза, что соответствует G1 фазе, а 4С ДНК — по содержанию ДНК в метафазе, что соответствует G2 фазе. Ядра по содержанию ДНК, находящиеся между 2С и 4С, рассматривали как пребывающие в S-фазе. Выборка для каждой экспериментальной точки составляла не менее 70 ядер из 10 корешков.

Определение жизнеспособности клеток и продуктивности эмбриоидогекеза

Жизнеспособность клеток определяли по методу В.С.Шердакова (Паушева, 1974), основанном на выявлении фермента пероксидазы в жизнеспособных клетках. Использовали также красители: амидовый черный, эозин, анилиновый синий. При использовании этих красителей живые клетки не окрашивались, а мертвые, наоборот, окрашивались.

Для каждого генотипа учитывали общее количество гаплоидных структур (каллусов, эмбриоидов), а также зеленых регенерантов и альбиносов. Единицей учета являлся гаплоидный каллус, из которого регенерировало

растение При необходимости, каждая тиния мопа быть размножена с использованием культуры ткани растений

Статистическую обработку полученных результатов печи с применением программы bxcel

3. Технологические условия и показатели получения ушоенных гаплоидов в культуре изолированных пыльников и микроспор мягкой пшеницы с oiiiMbiM типом развития

В процессе экспериментов нами разработаны кржерии оценки стадии развития микроспор в пыльниках озимой мягкой пшеницы in vitro Анализ микроспор, проведенный с использованием в<пможностен светового микроскопа, позволил установить, что для одной выборки характерно наличие микроспор сЗ-5и 6-8 периодами развития (рис 2)

сш t

Q5 ^ ^

Цитологические характеристики периодов развития изолированных микроспор озимой мягкой пшеницы in vitro* 3 — превакуолярный; 4 — ранний вакуолярный; 5 - средний вакуолярный; 6 — поздний вакуолярный; 7 — ранний период созревания; 8 - поздний период созревания. Я — ядро; В - вакуоль; П -пора

Рис

В данном случае становится возможным соотнести каждую из стадий с длиной пыльника и, тем самым, представить как происходит процесс развития пы 1ыхы озимой мягкой ншеницы во времени

Анализ этапов развития пыльцы озимой мягкой пшеницы in vitro позволяет заключить, что продолжительность периода тетрад составляет 5 дней, тогда как период высвобождения микроспоры из каллозной оболочки происходит на 5-6-й дни. Превакуолярный период микроспора проходит между 6 и 8 днями развития; ранний, средний и поздний вакуодярный периоды развития микроспор озимой мягкой пшеницы по продолжительности, как правило, составляют 9-11,11-16и 16-18 дней соответственно.

Таким образом, наиболее продолжительными по времени оказались два важных для развития микроспор периода: вакуолярный период и период созревания. Продолжительность периода созревания микроспор у озимой мягкой пшеницы в культуре in vitro составляла 9-18 дней. Как известно, именно в этот промежуток времени происходят важные процессы синтеза запасных веществ и частичного обезвоживания пыльцы. Представленные нами схемы развития микроспор озимой мягкой пшеницы могут иметь важное значение для селекционера при проведении работ, связанных с выявлением причин стерильности зерновых злаковых культур, в том числе озимой мягкой пшеницы.

Установлено, что к повышению продуктивности эмбриоидогенеза in vitro у изученных сортов озимой мягкой пшеницы приводит культивирование пыльников, у которых значительная часть микроспор находится в поздней фазе развития (продуктивность эмбриоидогенеза достигала более 50% от числа культивируемых пыльников). Эмбриоиды в этом случае образовывались из микроспор более поздних фаз развития. Такая же закономерность наблюдалась и у других сортов во все годы исследований.

В данном случае сильновакуолизированная фаза микроспорогенеза принята за наиболее оптимальную для индукции прямого андрогенеза (эмбриоидогенеза) in vitro у изученных сортов озимой мягкой пшеницы, именно эта фаза оценивается нами как морфогенная.

Все изученные сорта различались также размерами микроспор, находящихся в сильновакуолизированной фазе развития. Имелись сорта с очень мелкими (сорт Галина) и крупными микроспорами (Инна, Московская 39). Доля их в выборке была различна. Установлено, что размеры микроспор и их ядер у этих сортов не могут служить диагностическим признаком при определении их компетентности к морфогенезу in vitro, так как и в слабовакуолизированной, и в сильновакуолизированной фазах микроспорогенеза имеются как мелкие, так и крупные микроспоры.

На экспериментальном материале изучались выборки культивируемых пыльников, продуцирующих и не продуцирующих эмбриоиды. Результаты исследования показали, что по морфометрическим характеристикам различий

между змбриоидогенными и неэмбриоидогенными пыльниками внутри изученных сортов не обнар>жено (табл 1)

Внутрисортовые различия у эмбриоидогенных и неэмбриоидогенных популяций микроспор укладываются в пределы ошибки эксперимента

Таблица 1

Размеры микроспор и их ядер у эмбриоидогенных и неэмбриоидогенных популяций микроспор у культивируемых пы шников озимой мягкой пшеницы

Сорт 1 Характеристика Кол во ' Размеры мкм г Изменчивость

I

пыльни

I I ^^ ^ | микроспор ( ядер | микроспор 1 ялер

(Х±Ш) Г (Ч±Ш) '

Инна )мбриоиаогенная 1 МП 42 5+0 6 12 4-0 Ь | 40 48 6-16

Инна Не1мбриоиао1снная | 159 I 4205^04 107-04 28 48 6-18

I Нем 24 г)мбриоидогенная 1 127 38.2±0 3 10 2±0 3 , 28 48 , 4-18

( Нем 24 I Не^мбриоидогенная | 126 i 40 2-0 3 i 1И+03 1 32 48 8-16 i

Таким образом, сог гасно полученным данным, оптимальной для индукции прямого андрогенеза (эмбриоидогенеза) и каллусогенеза in vitro у исследованных сортов озимои мягкой пшеницы является фаза сильновакуолизированной микроспоры Морфометрический анализ свидетельствует о том, что размеры микроспор и их ядер не могут служить диагностическим критерием компетентности микроспор к эмбриоидогснез\ in \itro

Влияние температурных воздействий

Началом культивирования пыльников многие авторы считают во «действие на изолированные колосья низкими положите гьнь/ми температурами (+3 -оС) в течение опреде lennoro времени (Горбунова и соавт, 1994, 199S 1497, Круглова и соавт, Анапияев, 2001, Дьячук, 2003)

Рассмотрев вышеприведенные литературные источники, хотелось бы обосновать нашу, несколько отличающуюся точку фения на роль чолодовои предобработки срезанных колосьев донорных растений до иноку шции их на пигате 1ьные среды

На примере культивирования изолированных пыльников некоторых сортов озимой мягкой пшеницы мы оценивали д ште ¡ьность воздействия низкой положительной температурой на колосья стерильных донорных растений, помешенных в безгормональную среду МС для «голодания» При этом учитывалось время, прошедшее от момента сре$ания колосьев до инокуляции пыльников на питательные среды В результате исследований было отмечено

что холодовая предобработка колосьев у всех изучаемых сортов озимой пшеницы не оказывала существенного влияния на выход новообразований -каллусов и эмбриоидов (табл. 2), но сохраняла жизнеспособность микроспор в изолированной культуре от 2-х недель до 3-х и более месяцев в зависимости от сорта. Этот момент является важным, так как позволял снизить аврал работы в сезон и использовать материал по мере необходимости. Мы считаем, что это качество значительно отличает мягкую озимую пшеницу от мягкой пшеницы яровых форм, у которых уже при продолжительности воздействия пониженными положительными температурами в течение 3-5 дней жизнеспособность микроспор снижается от 1% до 0% (Дьячук Т.И., 2003).

Доказано, что холодовое воздействие на экспланты перед инокуляцией их на питательные среды является большим стрессом для микроспор. Вопрос состоит в том, как реагируют микроспоры на действие температурного шока. Результаты проведенных нами экспериментов свидетельствуют, что деление ядер микроспор происходит только в тех из них, которые отрываются от орбикул, «выпадают» в полость гнезда пыльника (рис. За,б), а те микроспоры, которые остаются прикрепленными к орбикулам и через них - к стенке гнезда пыльника, к делению не приступают.

Микроспоры, находящиеся на средней фазе микроспорогенеза, чаще всего, остаются прикрепленными к тапетуму, и поэтому редко приступают к делению. Характерной особенностью микроспор поздней, сильновакуолизированной стадии развития является появление большого числа делящихся клеток, таких,

Рис. 3 а, б. Разрыв стенки пыльника и «самопроизвольный» выход микроспор из камер гнезда пыльника на индукционную среду (15 - 17 сутки культивирования). П - пыльник; М - микроспора; КМ — колония «самопроизвольно» вышедших на среду микроспор.

как клетки, находяшиеся на разных фазах митотического цикла, двуядерные, с равными и неравными ядрами

1аблица 2

Влияние продолжительности воздействия пониженной положительной

температурой на частоту индукции андрогенеза in vitro v озимой мягкой

пшеницы

I V»' ci-рт i Продолжите [ьность воздействия lvtkh

п, 0 4 ч 1 1< 17 1

1 1 1 п\ ' н" п | Н П "н п н ' П , н

1 п 1 1 шт 1 шт % 1 шт шт % шт , ШТ "а 1 I 11ГТ 1 шт L 1 1 шт 'шт % |

] Немчино 500 60/12 0 <00 1" <9 11 8 4)0 1 <8/11 6 <00 | <^'11 1 <00 | 42 8 4 1

j зская 24 1 1 1 | 0 1

1 2 ' Галина 1 500 7 0 500 1 29 < 8 <00 27 j 4 ( -00 1 21 4 2 <00 | 18 ,

♦ 1 Инна 1 500 7^15 0 500 60 12 0 500 1106 1 500 47 9 4 1 ; <00 ' 40 8 0 1

4 Мое ко вс ' 500 115 23 0 <00 1 102.20 4 «¡00 1 ЮО'20 0 r50l) 82 lb 1 5U0 82 16

' чая 34 1 1 1 ,4 4

1 * 1 Памяти 1 500 1 <0 10 0 <00 44 ') К <00 ' <0Л0 0 , <00 1 37 7 4 ' <00 | 29 < 8

1 Феяина i 1 1 1 1 1 1

П - пьпьников высажено f Г - новообразовании поч\че ю

Предобработка хочодом пыльников в фаю раннего и среднего периодов созревания микроспоры (без фиброзных утотщений в клетках шдотеция стенки гнезда пыльника) не проводит к эмбриоидогенезу in vitro Культивирование изолированных пыльников озимой пшеницы в поздней фазе микроспорогенеза индуцирует прямой андрогене i in vitro (рис 4, в)

в г

Рис. 4 (а-г). Каллусогенез и регенерация in vitro: Э — эмбриоид, Р - регенерация.

Наши исследования убеждают в том, что холодовая предобработка колосьев растений-доноров, напрямую не влияют на продуктивность эмбриоидогенеза in vitro, и ее влияние заключается лишь в том, чтобы извлечь резервную спорофитную генетическую информацию, способную предотвратить развитие микроспоры по гаметофитному пути и продолжить реализацию спорофитной программы.

Влияние состава питательных сред

Нами была исследована возможность повышения продуктивности эмбриоидогенеза в культуре изолированных пыльников при их культивировании на агаризованной и/или жидкой питательной среде с ацетоном (табл. 3).

Таблица 3

Влияние жидких и агаризованных питательных сред на эффективность эмбриоидогенеза in vitro (в %) в культуре изолированных пыльников

Сорта Жидкая+Фиколл 400, 5% Жидкая (крахмал кукурузн., без ацетона) Агаризованная (0,7% агароза/ агар+ацетон)

Галина 1,2 1,2 5,7

Инна 0,7 0.2 4,3

Московская 39 1.3 1,3 7,2

Памяти Федина 1.8 1.9 6,7

Немчиновская 24 0,3 0,3 7.5

Как видно из таблицы 3, продуктивность андрогенеза in vitro у пыльников, культивируемых на жидкой питательной среде без ацетона ниже, чем у пыльников, культивируемых на агаризованной или агарозной индукционных средах с ацетоном. Объяснение этому явлению открылось позже, когда мы

освоили цитологический мониторинг процесса культивирования Микроскопические исследования на световом микроскопе показали, что в самые первые дни культивирования стенки гнезда пыльника открываются из-за повышения тургора и старения эндотеция и все микроспоры «высыпаются» на поверхность индукционной среды

Жидкая среда, вернее, прямой контакт с ней, по-видимому, оказывает губительное действие для большинства микроспор вс тедствие юго, что большинство их тонет в питательной среде, и даже внесение крахмала рассчитанное только на то, чтобы удерживать пыльники на поверхности раздела среда-воздух, не сохраняет их жизнеспособности Введение ке гонов (ацетон) в агаризованные и агарозные питательные среды способствовало увлажнению поверхности сред, предотвращая их от пересыхания

Микроскопический анализ позволил также заключить, что в культуре «самопроизвольно» вышедших микроспор деление и развитие их начинается еще до выхода из полости камер пыльников Это обусловлено новыми, подобранными нами условиями выдерживания стерильных колосьев-доноров на средах без регуляторов роста при низких положительных температурах, вызывающих низкотемпературный стрессовый шок для содержащихся внутри колосьев пыльников и их «голодание»

Характерно, что через 20-25 дней от начала культивирования пыльников всех сортов озимой мягкой пшеницы на среде с ацелоном всегда наблюдали формирование, на которых в условиях освещения через 1^-18 дней формировались плотные структуры округло-овальной формы - эмбриоиды Пересадка !мбриоидов зеленого цвета на среды для регенерации приводила к формированию морфогенных структур, из которых впос 1едствии по тучали полноценные растения-регенеранты, большая часть из которых го результатам цитологического анализа имела таш-оидныи набор хромосом

Кроме вышеназванных условий особое место в штерагуре отводится углеводам, являющимся и источниками углерода, и осмотиком В результате проведенного нами эксперимента подтвердилось, что индукция процесса змбриоидогенеза в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой пшеницы зависит от введения в сред\ сахарозы, мальтозы и ацетона При молярной конценл-рации ацетона в среде 0,34 М была получена наибольшая продуктивность эмбриоидогенеза до 23 50,о у сорта I алина (л лблица 4)

Таблица 4

Влияние углеводов в составе питательной среды на эффективность эмбриоидогенеза in vitro (%) при стерилизации среды методом фильтрации

Сорта I Глюкоза 1 (0.26 М) Глюкоза (0,52 М) Сахароза (0.26 М) Мальтоза (0.26 М) Диоксиацетон (0.34 М)

Галина 1,3 0.02 14.3 16,8 23,5

Инна 2,1 0,1 16,2 18,5 22,7

Московская 39 2.4 0,8 22,2 15,7 20.2

Памяти Федина 1.2 0,4 5,6 7.8 18,5

Немчиновская 24 0,7 0.06 2.4 12.8 10.3

Исследованиями Датта и Вензел (Datta, Wenzel, 1987) установлено, что при автоклавировании часть дисахарида - сахарозы расщепляется на глюкозу и фруктозу, что делает данную среду наиболее благоприятной для культивирования микроспор in vitro даже при высокой концентрации сахарозы, так как расщепление ее на фруктозу и глюкозу происходит постепенно, в процессе культивирования. Поэтому, при повышенном содержании углеводов осмотическое давление среды увеличивается незначительно. Ацетон в подогретой до 45 °С среде разрушается, обогащая ее С02 Последний фактор является наиболее важным для сохранения жизнеспособности микроспор озимой мягкой пшеницы при культивировании их на индукционных средах №№8, 9 и 10 (Лаврова, 2005, 2006).

В научной литературе встречаются сообщения, что с помощью манипулирования концентрациями сахарозы можно получать растения пшенично-пырейных гибридов, у которых листья имеют вид «зебры», то есть идет чередование зеленых и белых полос. Такие растения получали Тувессон и соавт. (Tuvesson et al., 1993; В.Н.Чистякова, 2000 (личное сообщение).

Было интересно исследовать реакцию сортов на содержание в составе индукционной среды различных форм аммонийного и нитратного азота. Пыльники растений 5-ти сортов озимой пшеницы культивировались по схеме: 1) контроль — на индукционной среде с ацетоном; 2) на среде с ацетоном и заменой всех нитратных солей на аммонийные; 3) на среде с ацетоном и заменой всех аммонийных солей на нитратные. Все другие компоненты сохранены без изменения во всех вариантах эксперимента (pH среды 5,7 ед., 2,4-Д - 3,5 мг/л среды).

Как видно из таблицы 5, у большинства сортов озимой мягкой пшеницы эмбриоидогенез был • значительно более продуктивен на среде, в которой аммонийные соли заменены на нитратные формы. У этих сортов продуктивность эмбриоидогенеза на контрольной среде с ацетоном была ниже, чем на среде с нитратной формой, но выше, чем на аммонийной форме. Результаты культивирования пыльников сортов Московская 39 и Инна

показывают преимущество культивирования на контрочьной среде с ацетоном Пыльники сорта Памяти Федина проявити большую отзывчивость гри инокуляции их на питательную среду с ацетоном и аммонийными салями (габл 5) У сорта Галина процент эмбриоидогенеза был наибольшим на среде, дополненной ацетоном и нитратным азотом (14,7%)

Таблица 5

Интенсивность эмбриоидогенеза (%) в кутьтуре изолированных пыльников

озимой мягкой пшеницы на средах с разными формами азота_

Сорта '_Эмбриоидогенез при 3 5 мг I 2 4-Д _

с ацетоном__с ацетоном (N03)- с ацетоном

Мое конская 34 ~ 4 05__ 1 2 (__6 2 ^

Г алина 3 07 _2^3 _[4 7

Немчиновская 29 1 * ,_3 6 9 7

_ Инна 1 8 9 3 97 4 78 Памяти Федина ' 6 1__24 2 _ 6 2_I

Этот эксперимент далее будет нами продолжен и угтублен в тане расширения изучения регенерационной способности сортов и гибридов ошмой мягкой пшеницы, выращенной в устовиях in vitro, на риных минеральных фонах культу рал ьной среды Ацетон как фактор эффективности андрогенеза in vitro ознмон мягкой

пшеницы

Продотжая исследования направленные на оптимизацию питатетьнои среды, мы изучали действие различных концентраций ацетона добавленных к основе минеральных солей по прописи V1C (№8,9 10) Раничия сортов пшеницы в способности к эмбриоидогенезу, на наш взг 1яд обусювлены 1енетически В процессе экспериментов нами обнаружена различная способность одного и того же сорта к образованию эмбриоидов на средах опичаюшихся содержанием в них ацетона Это может говорить во-первых, о необходимости подбора оптимальных устовий индивидуально для каждого сорта, во-вторых, о возможности шачите 1ьно увечичить выход в кутьтуре in vitro эмбриоидогенных структур а, сдедоватечыю, и растении Так при иепо шзоваиии вариантов сред с концентрациями ацетона 0 26 М и 0,34 М, у сортов Московская 39 и Инна часть микроспор подвергается дошли итетьным равным дечениям, что ведет к формированию многоклеточных структур, которые в дальнейшем дают начало эмбриоидам Таким образом входящий в состав питательной среды ацетон в эшх концентрациях способств\е! инициации дополнительных равных детений микроспор в пыльниках пшеницы изученных сортов тем самым оказывая воздействие на развитие микроспор по нетрадиционному спорофитному пути что юворит о возможности регучяиии

лмбриоидогенеза в культуре пыльников пшеницы путем подбора оптимальной для каждого сорта концентрации ацетона в составе основной индукционной среды

1аким образом, очевидна различная ч\ вствительность сортов озимой мягкой пшеницы in vitro к содержанию ацетона в составе основной индукционной среды для культивируемых пыльников и микроспор

Цитологический мониторинг процессов культивирования изолированных пыльников пшеницы сорта Московская 39 характеризующегося высоким уровнем выхода тгориоидов, свидетельствует, что при культивировании пыльников с использованием инлукционных сред с малыми концентрациями О 02 0 04 М ацетона, наблюдается дегенерация абсолютного большинства микроспор уже к концу 3 суюк эксперимента, при >том отмечена дегенерация связника и гканси стенки гнезда пы гьников

Характерно, что в культуре изолированных пыльников и микроспор ошмои пшеницы всех 5-ги сортов мы наблюдали образование каллусной ткани сферического типа, на поверхности которой впоследствии возникали >мбриоидные структуры узловатой формы

Интсрссеи тол факт чло в доступной научной литературе мы не встретили ни о шого описания подобных лмбриоидогенных структур у сем Роасеае В дальнейших наших исследованиях мы планируем детально изучить >тот тип змбриоидогенеза По шоценные эмбриоиды во шикали только на индукционных средах, содержащих в своем составе диоксиацетон в конценлрациях 0 17 - 0 34 М

4. Морфо1енез в кульгуре андрогенной каллусной тканн озимой мягкой пшеницы и циголишческие особенности начальных панов развития

микроспор

Достаточно высокая концентрация ацетона в среде для культивирования вызывает v сортов оба типа морфогенеза в культуре микроспор прямого (>мбриоидогенез непосредственно на экспланте) и непрямого (в каллусной ткани) анлрогенеза in vitro (Лаврова 2004,2005) Обращает на ссбя внимание тот факт, 410 начальные этапы непрямого андрогенеза in vitro приводят к неравным делениям клеток, а »мбриоид уже на ранних -этапах своею развития (4 клетки) представлен четко организованной структурой, характеризующейся регу мрными клеточными делениями Эта тенденция сохраняется и в ходе дальнейшего развития эмбриоидов Кадлусогенез характерен только для тех случаев, когда воздействие ацетоном инициирует у микроспор усиленную пролиферацию и рост каллусной массы

В к у ibivpe изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы имеют место различные типы гаплоидных структур прозрачный

рыхлый каллус желтоватого цвета, как правило, не морфогенный; светло-желтый каллус, представленный оводненными клетками; глобулы и эмбриоиды на поверхности плотного гаплоидного каллуса; морфогенный каллус плотной консистенции, цвет которого варьирует от молочно-белого до желтого. Именно этот тип каллусной ткани был способен регенерировать полноценные гаплоидные растения в культуре in vitro озимой пшеницы.

Морфогенный каллус всех изученных сортов имеет сферическую структуру, светло-желтый цвет и плотную консистенцию.

Наши экспериментальные данные свидетельствуют о том, что каллусы на культивируемых изолированных пыльниках всех 5-ти изученных сортов озимой мягкой пшеницы появляются позднее эмбриоидов (обычно на 30-45 сутки от начала культивирования). Однако, культивирование сортов Московская 39 и Инна при концентрации ацетона в среде 0,26М приводит к интенсивному каллусогенезу уже в первые дни культивирования. Дальнейшее развитие эмбриоида выражается в образовании зародышеподобной структуры, которая возникала даже на питательной среде, индуцирующей эмбриоидогенез, а не регенерацию!

На поверхности пыльцевого зерна однодольных растений содержатся участки, лишенные экзины, иногда прикрытые оперкулумом. Через эти участки (апертуры) прорастают (при попадании пыльцы во влажную среду) пыльцевые трубки. Тип микроспоры закладывается еще на стадии тетрады. Известны четыре основных варианта расположения апертур, различающиеся друг от друга по ориентации борозд относительно экваториальной плоскости микроспоры.

В результате исследований по андрогенезу in vitro с озимой мягкой пшеницей было установлено, что на стадии тетрад (рис. 5, а), в период молодой микроспоры (рис. 5, б) и в поздний вакуолярный период могут быть выявлены все четыре типа апертур. В научной литературе мы не нашли ни одного установленного факта такого явления.

В целом, как в условиях in vivo, так и в культуре in vitro, для прорастания пыльцевой трубки необходимы вода или высокая относительная влажность, и в любом случае, обеспечение углеводами и минеральными солями. В культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы, примененная нами добавка во все индукционные среды ацетона в концентрациях 0,26-0,34М), обеспечила высокий выход новообразований как в каллусной ткани пыльников, так и в каллусной ткани микроспор (рис. 6, а, б). Именно ацетон, введенный в индукционные среды, обеспечивал их молекулярным кислородом и поддерживал высокую относительную влажность сред, приближая условия культивирования in vitro к стандартным полевым (in vivo). Дополнительное

введение в модифицированные нами среды по прописи Мурасиге-Скуга (Murashme, Skoog, 1962) кукурузного крахмала, маннита MES мальтозы и

" -о .. ^Ю

Г

О „^о

Б _

У

■с

* А

а б

Четыре варианта расположения апертур на поверхности микроспоры озимой мягкой пшеницы: моносулькатные(А), монокольпатные (Б), трехкольпатные(В), и пентакольпатные (Г).

а формирование тонкой экзины — примэкзины (ПЭК) микроспоры, синтез и отложение спорополленинового полимера (период тетрад) б) Формирование экзины (ЭК) в процессе отложения на поверхности спорополленина, синтезируемого клетками тапетума (период молодой микроспоры и поздний вакуолярный период — яйцевидное пыльцевое зерно) Рис 5 а б

Рис 6 а, б Лндрогенсз in vitro озимой пшеницы в a) kv ibivpe пыльников, б) к\ тьтурс микроспор

сахарозы в полной мере способствовало обеспечению минерального и углеводного питания культивируемого объекта - изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы.

5. Регенерация растений при андрогенезе in vitro у озимой пшеницы Как известно, лимитирующим фактором в развитии технологии культивирования изолированных пыльников и микроспор у мягкой пшеницы является низкая регенерационная способность генотипов.

Из всех исследованных генотипов наибольшей отзывчивостью в культуре in vitro обладали сорта Галина, Московская 39 и Инна (рис. 7).

35 ■ " " ..■-'.........- „.,.,; .;-.■- г-' - • „:.]" ,*----—-!

*25 :vJB;—п—— —-П~~—■— --—1 120 т_ '•■•-r- ; —тП-—-.т—i

m 15 - . - — ,. ---- ^И -----------..'

i f fet t le

Галина Инна Московская 39 Памяти Немчиновская

""е»"« 24 (иЭмбрйоиды ~

Сор™ | ■ регенераты

Рис. 7 Продуктивность морфогенеза у различных сортов озимой мягкой пшеницы: 1-Галина, 2-Инна, З-Московская 39, 4-Памяти Федина, 5-Немчиновская 24

Кроме подбора специальных сред для регенерации растений, исследователю приходится также разрабатывать технологию укоренения, яровизации и колхицинирования полученных гаплоидов, так как гаплоидные растения, полученные в культуре in vitro массово гибнут при колхицинировании, и кроме того, не все генотипы имеют тенденцию к удвоению числа хромосом. Возможно, среди погибших растений имелись генотипы с разной плоидностью. Однако, выжившие после колхицинирования растения, имели всегда диплоидный набор хромосом 2п=42, что подтверждает и цитофотометрический анализ ДНК (рис. 8).

Gl 9% S 33 i G2 57% Poly 2%

G' 22% S 51% Gl 22% Poly 6%

,1 Г

G 20 » S 26% G2 4C%

Poly 14%

в

Gi 26', S 26 <j G: 35е o Poly 13%

Распределение ядер клеток по периодам иигерфазы в корневой меристеме гаплоидов (а, б в, i) олимой пшеницы, а - Галина, б — Рис 8 Памяти Федина. в Инна г - Московская 39

Сроки яровизации для каждого сорта подбирали отдельно Установлено, что яровизация растений регенерантов в 1ечение 40 дней недостаточна для дапьнсише! о хорошего роста и развития растений в ус то пнях in vivo, что сказывается на свертывании листьев и ухудшении общего состояния растений вп ють до полной их гибели lio нашему мнению именно вопрос

продолжительности яровизации растений-регенерантов озимой мягкой пшеницы является головным в проблеме укоренения растений и получения полноценного колоса.

В течение вегетационного периода у регенерантов замеряли высоту куста (Ь), подсчитывали количество стеблей, Ь колосьев, количество колосков и зерен в колосе. Для всех высаженных в грунт теплицы регенерантов было характерно хорошее развитие вегетативной массы листьев и усиленное кущение растений.

В зависимости от сорта регенеранты различались по количеству стеблей и почти не различались по высоте куста. Наибольшую высоту колоса отмечали у растений-регенерантов сорта Инна (7 см). Высота колосьев сортов Московская 39 и Памяти Федина составила только 2,0 и 1,5 см соответственно, однако они имели выполненное зерно.

1

Рис. 9. Гаплоидная биотехнология создания форм озимой мягкой пшеницы

Из полученного зерна были вылечены зародыши, от которых получены растения R1, размноженные m vitro Эндосперм зерна изучается на содержание глиадинов (совместная работа с Институтом общей генетики г Москва) иодэтапы (рис 9)

Схема гаплоидной биотехнологии создания андрогенных дигаплоидов озимой мягкой пшеницы для применения в практической селекции »той культуры включает 8 основных этапов. каждый из которых подразде 1яется на

I этап - полевой отбор колосьев озимой пшеницы остистых и безостых сортов-доноров озимои пшеницы по комплексу морфологических признаков п фазе си 1ЬНовакуо тезированной микроспоры (1), подготовка колосьев к стерилизации (обрезка остей и колосковых чешуи), стерилизация цветков и/и ш выделение пыльников (2),

2 этап - жсп датирование цветков пыльников и ссмяпочек in vitro в жидкой индукционнои среде разрыв стенки пытьника и «самопроизвольный» выход микроспор в среду (3), осаждение микроспор центрифугированием и определение стадии развития микроспор под микроскопом (4),

1 лгал - ку 1ьгивирование микроспор на средах для лмбриоидогеиеза до образования много клеточных комплексов (5) и пыльников до образования каллусирующих гаплоидных структур сферического гипа (6), пос 1едовательный отбор точных змбриоидополобных структур и пересадка их на среды для регенерации,

4 этап орзаногенез в к\льгуре андрогеннои каллусной ткани и получение растении-регенерантов (8),

5 пап укоренение регенерантов in vitro (9)

6 этап — цитоло! ический и циюфогомегрический контроль плоидности регенерантов (10) и яровизация андрогенных гаплоидов при температуре 2 4 оС в течение 60 дней,

7 >тап - диплоидизация регенерантов колхицином, пересадка в почву и дорашияание (в зависимости ог сезона) в поле и ш в условиях подогреваемой теплицы (11) до получения колосьев (R0), (12) - R1 и R2 поко 1ений,

8 )гап - размножение растении-регенерантов R1 и R2 поколений методами биотехнологии андрогенез или змбриокультура зародыша

Преимущество гаплоидных культур состоит в том, что при диплоидизации гаплоидных растений образуются аьтоплоидныь ресеперанты. позволяющие гомозиготизировать любые, даже рецессивные мутации Анализ плоидности морфо! енных структур в культуре изолированных пыльников затрудняется тем, что необходимо подбирать специфические условия для отбора проб не нарушая целостности структуры Используя методы суспензирования клеток мы исследовали и юидность )мбриоидов морфо[енных и неморфогенных

каллусов. Оказалось, что все полученные в культуре in vitro новообразования -гаплоидной природы, а это значит, что ни клетки гнезда пыльника, ни связника, ни тычиночной нити не участвовали в морфогенетических процессах.

6. Клеточные технологии в селекционной работе с растениями семейства Тыквенные (Cucurbitaceae) В процессе проведенной работы удалось разработать и апробировать методику для создания в культуре ткани in vitro устойчивых к фузариозу растений огурца в расщепляющихся популяциях гибридов и популяциях коллекционных образцов (Markova (Lavrova) N.V. et al., 1989; Лаврова H.B., 2002). Полученные результаты позволили нам использовать возможные генетические изменения длительнокультивируемых клеток огурца в нашей дальнейшей работе с культурами и тканями огурца в пределах производственно-семеноводческих теплиц ГУСХП совхоза «Высоковский» Костромского района Костромской области, специализирующегося на выращивании овощной продукции.

Объектами исследований in vitro служили каллусные ткани; меристемы, вычлененные из 3-х-дневных семенных проростков и взрослых плодоносящих тепличных растений огурца 2-х селекционных линий (Л 42s и Л 299) широкорайонированного для теплиц Нечерноземной зоны F1 гибрида Грибовчанка. (Маркова (Лаврова), Бутенко Р.Г., 1990). В 2002 году для 3-го блока зимних теплиц тепличного комбината «Высоковский» в Лаборатории сельскохозяйственной биотехнологии Костромской ГСХА нами была оздоровлена и размножена партия селекционного материала огурца материнской (Л 29 у) и отцовской (Л 42 с? ) линий F1 гибрида Грибовчанка, получившего название F1 Грибовчанка — безвирусная. Семена селекционных линий (только 10 г) были предоставлены главным агрономом Государственного унитарного сельскохозяйственного предприятия - ГУСХП «Высоковский» Костромского района Костромской области, к. с-х. н. Долгим Василием Викторовичем в 2002 году.

Л 425 - генетически без горечи, устойчива только к оливковой пятнистости. Промежуточного типа цветения.

Л 29$ - генетически без горечи, устойчива к оливковой пятнистости и аскохитозу. Женского типа цветения. Гибрид F1 Грибовчанка при скрещивании этих линий характеризуется повышенной устойчивостью к резким колебаниям температур и обладает высокими вкусовыми качествами.

Предлагаемая биотехнология размножения растений огурца из каллусной и меристемной тканей, а также клональное размножение полученных экземпляров может представлять интерес для ускоренной селекции плохоплодоносящих и трудноразмножаемых гибридов, т.к. в процессе

сетекционной работы с огурцом часто возникает необходимость 'спасения" генотипов, отобранных в процессе селекционной работы, когда они находятся у лее в фазе цветения или плодоношения, а также в конце вегетации, когда растения гибнут от инфекции, вызываемой грибами из рода Риьапит ер (рис Ю)

Рис 10 Технологическая схема регенерации растений огурца (Cucumis sativus L ) из каллУснои и меристемной гкани и ктональное микроразмпоженис

I) стеритьны*. пророс гки енлрца

а регенерирукдяая кал тучная kv bTvpa из тестовых ичл ганюв и — мсристсмная KVTbT\pa ') i цветение Укорененных риенерантов огурца па-ученных в колтуснои kvibtvpe (Сеч размножения) б — укорененные рег-енеранты по ¡ученные из меристем (перед размножением 4) чериклоньт orvpja в kv шгуре in yitro высаженные в i ohbv регенеранты

6) начало п шдоношения ре1енерантов

7) потное птодоношение регенерате л orvpua в v^. овиях теплицы

7. Селекционные и биотсхноло! ические методы в создании форм озимой пшенииьРогурца, устойчивых к футариозу

Испочьзование к шточных технотогий в селекции на фитоустойчивость во ¡можно в отношении то 1Ько тех растений дтя которых разработаны устовия дифференциации и вторичной шфференцировки

Разработанные ранее условия морфогенеза растений огурца из каллусных и меристемных тканей, а также найденные условия эмбриоидогенеза в гаплоидной каллусной ткани озимой пшеницы, использовались нами в программе по созданию устойчивых к фузариозу форм растений.

Экспресс-оценку линейного материала огурца на устойчивость к фузариозу через культуру меристем проводили на средах с КФ и токсином Т-2 из Fusarium sp. Концентрация КФ Fusarium составляла 20% - для первичного культивирования и 50% - для повторных циклов. Оценка растений в конце вегетации в теплицах ГУСХП «Высоковский» показала 82,5 % не пораженных фузариозом растений. Пересаженные в грунт теплицы регенеранты нормально развивались и не имели признаков поражения фузариозом (бурой окраски корней).

Материал in vitro 2-х селекционных линий: Л 42 с? и Л 29 9, охарактеризованный нами по устойчивости к КФ Fusarium sp., тестировали на средах с токсином Т-2 из Fusarium sp. При проращивании семян (для получения апикальной ткани) мы наблюдали совпадение между отбором на КФ и токсине Т-2. Так, обе линии были достаточно устойчивы к токсину Т-2 (едва заметное снижение жизнеспособности проростков наблюдали при концентрации токсина 50 мкг/мл у женской линии).

Для более жесткого отбора концентрация токсина Т-2 была увеличена до 100 мкг/мл. Интересно, что введение в селективную среду токсина Т-2 в этой концентрации вызывало изменение морфологии меристем, а длительное культивирование - нарушение полярности роста корней, утолщение стебля, изменения листовой пластинки и образование розеток листьев на апикальном конце. В данном случае подтверждается мутагенное действие токсина Т-2 в концентрации выше 70 мкг/мл среды.

Морфологическое описание растений гибрида Грибовчанка Fl-безвирусная, полученном от скрещивания женской (Л 29 5) и мужской (Л 42 с?) линий, выращенных в культуре in vitro из меристем и отобранных на селективных средах показало, что они имели угловатосердцевидную форму листа, простой тип опушения завязи, белое опушение, гладкую поверхность, темно-зеленую окраску зеленца и др. показатели. По урожайности плодов оздоровленный гибрид Fl Грибовчанка-безвирусная значительно превысил стандарт. Урожайность плодов с куста составила 7,1 кг/м (st — 3,2 кг/кв.м). Плоды имели длину 22 см, ширину — 4,5 см, диаметр семенной камеры — 5 см. Семена R1 поколения были выполненными, их всхожесть составила 100%. Устойчивость R1 поколения также подтвердилась. Кариотипический анализ подтвердил диплоидный характер полученных регенерантов (2п=14).

Селекцию in vitro с сортами озимои пшеницы проводили на сублетальной и летальной конценлрациях токсина - 50 и 100 мкг/мл соолвелственно, введенных в индукционные среды МСЛЧО- 2,4-Д с ацетоном (0,36 М) и без него Доказано преимущественное влияние ацетона на выход стеблевых структур в каллуснои ткани как изолированных пыльников, так и микроспор (в количестве от 5 до 9 штук в зависимости от сорла), тогда как на среде МС без добавления ацетона чис ю стеблевых структур у растении-регенерантов озимой мягкой пшеницы сокращалось до 3 4 штук

Селективный отбор на >тане формирования первичною каллуса на среде MCjNoIO, содержащей фузариевую кислоту в концентрации 50 мкг/мл, приводил к снижению образования андрогенной каллуснои ткани у сорта Немчиновская 24 ю 57,2 %, а у сорта Памяти Федина - до 26,1 % (табл 6) Однако при тгом у всех сформированных каллусных структур визуально можно было видеть ярко-¡еленые меристематическис очаги, из которых впоследствии регенерировали полноценные зеленые растения

Таблица о

Влияние токсина фузариевой кислоты на морфогенез андрогенных структур озимой пшеницы, контрастных по устойчивости к палогену корневой гнили

Сорт Концентрация Культивируемых I Потучено | Гибель

|ф\зариевоик кал ivcob шт морфогенных t клеток, "о I

| ! ты ми мл каллусов, шт |

Немчиновская 0 I 27 25 0

^ 24,контроль) ^ ^ j ^ 1 ч Г |

| Памяти ( 0 ' 23 27 Г о

Федина --^ ; ' р7 ' It I

Для подтверждения устойчивости in vitro последующий жесткий отбор каптирующих андрогенных структур проводили на селективной среде с концентрацией токсина фузариевои кислоты 100 мкг/м i В результате были отобраны решетентные гаплоидные каллусирующис структуры, выдерживающие концентрацию токсина 100 мкпмл среды

Каллус сохранивший жизнеспособность в течение 2-3 пассажей на среде с токсином ф> триевой кис юты в концентрации 100 мкг/мл регенерировал побеги которые развивались в полноценные растения и были также устойчивы к токсину гриба Регенеранты сорта Москокская 39 полученные в рез\ 1ьтате отбора на токсичных срелах при летальной концентрации токсина фузариевои ьислоты 100 мкг мл, в культуре in vitro различались разным типом жстовои пластинки

Таким образом, и в экспериментах с тканями огурца, и с озимой пшеницей, подтверждается мутагенное действие токсина фузариевой кислоты, введенного в селективные среды в концентрациях больше 70 мкг/мл.

Необходимо добавить, что у высаженных в условия подогреваемой теплицы НИИСХ ЦРНЗ резистентных регенерантов озимой пшеницы сорта Московская 39 при прохождении этапов онтогенеза произошел разрыв листовой пластинки по средней жилке.

Использование культуры пыльников и токсинов патогенов в работе по созданию форм огурца, устойчивых к грибным болезням

В современной биотехнологии значительный интерес представляют вопросы, связанные с более детальным изучением репродуктивных органов, в частности, пыльцы овощных растений. Известно, что в отдельном пыльцевом зерне содержится вся генетическая информация, необходимая для формирования гаплоидного растения, что широко используется в селекции для получения гомозиготных линий в системах in vitro. В этой связи может быть интересна пыльцевая селекция.

Многие авторы подчеркивают, что гаметофитная селекция имеет сходные подходы с культурой тканей и клеток растений in vitro (Лапченко, 1991), В обоих случаях селективный фактор применяется не на целом растении, а только на его части — ткани, клетке, небольшой группе генеративных клеток (в данном случае — пыльце).

Работу по пыльцевой селекции селекционных линий огурца начинали с отработки методики определения жизнеспособности пыльцы огурца. Для этого, в среду для культивирования жизнеспособной пыльцы МС-3 (Маркова (Лаврова), 1991) вводили раствор сахарозы в концентрации не менее 25%. Далее под микроскопом МБС-10 определяли жизнеспособную пыльцу (не позднее, чем через 30 мин. после помещения препарата под окуляр микроскопа). Недостатком метода являлся тот факт, что при помещении пыльцы в индукционную среду, пыльцевые трубки начинали лопаться, а поэтому сложно было промерить их первоначальные размеры и описать форму пыльцевых зерен, поэтому мы увеличили концентрацию сахарозы в питательной среде до 35%, при этом разрыва пыльцевых трубок не получали, а время просмотра образцов в этом варианте увеличивалось от 2 до 3-х часов.

Результаты наших исследований показали, что наиболее продуктивной была свежая пыльца, взятая с нижних ярусов цветков тепличных растений огурца. В результате экспериментов было установлено, что пыльца, взятая через 24 и 48 часов после раскрытия цветка, практически не прорастала на среде с сахарозой в любой концентрации (прорастало только около 1%

пыльцевых зерен) Не наблюдали также и прорастания пыльцы огурца, взятой за 24 часа до раскрытия мужского цветка

Вторым этапом работы являлись исследования но изучению действия разтичных концентраций токсина фузариевои кислоты - Г-2 на жизнеспособность пыльцы огурца и подбор дифференцирующей концентрации В работе также использовали пыльцу 2 ч селекционных линий огурца 42 "" и Л 21)', , для которых было характерно шачительное снижение ее жизнеспособности с увеличением концентрации токсина в среде Причем, уменьшение жизнеспособности пыльцы сопровождаюсь увеличением показателя деформации пыльцевых трубок (1аби 7)

Iаблица 7

Влияние различных концентраций токсина Т-2 в среде МС-3 на _жизнеспособность пытьцьг огурца 2-х селекционных линий

Г/оказате ш

Процент проросших пы 1ьцевых ¡ерен Всего

J 1ормалъных Деформированных

Полученные данные

Концентрация гоксииа I -2 чкг ч i

качестве

позволяют ¡аключить, что лш|иЬерслпируюшсй концентрации в работах по пыльцевой селекции огурца на еешкливных средах с токсинами патогена необходимо испо тьзовать концентрацию не менее 40 мкг ч т гоксииа Т-2 которая и является оптимальной для пыльцевой селекции огурца in vitro

Распространение корневых гнилей в теплицах часто провоцируют пониженные температуры воздуха и резкие перепады температур По-видимому, общая устойчивость растений к пониженным температурам может епособствоваль повышению устойчивости растении к корневым гнипям Поэтому паралте тьно с оценкой се 1екционных образцов на токсине Т-2 проводили отбор пыльцы огурца при пониженных положительных температурах

Предварительная оценка показала что прорастание пыльцы при пониженной температуре было {¿медленным у обеих селекционных линий (табл 8) Однако в течение дальнейшего культивирования (более 3-х часов культивирования) пыльцы наблюдалась тенденция к увеличению числа проросших пыльцевых зерен Поэтому д ш более точной опенки мы решили анализировать рост пыльцевых тр>бок в динамике с большей временной

экспозицией (до 24 часов). Пыльца линии Л 29 ? за сутки почти достигала контрольных показателей (74,1 %). Это мы объясняем тем, что микрогаметофит растения огурца менее чувствителен к пониженной температуре воздуха теплицы, чем растения in vivo.

Таблица 8

Холодостойкость пыльцы селекционных линий огурца на среде МС-3+25 % сахарозы в зависимости от временной экспозиции (2/24 часа)

Показатели Температур (конт] а +23-25 оС роль) Время, час. Температура +12-14 оС

<5 ? с? 9

Непроросших пыльцевых зерен, % 11,7 11,7 2 3 24 88,1 61,9 41,4 86,9 65,9 24,7

Проросших пыльцевых зерен, %: а) нормальных б) отстающих вроете 87,5 83,4 2 3 24 2,5 29,3 51,5 7,0 16,5 74,1

0,8 4,9 2 3 24 9,4 8,8 7,1 6.1 17,6 1,2

Таким образом, метод пыльцевой селекции позволяет значительно сократить время отбора селекционных генотипов по устойчивости к грибным болезням и может использоваться в селекции как экспресс-метод оценки селекционного материала на'иммунитет.

Оценка устойчивости регенерантов в условиях подогреваемой теплицы НИИСХ ЦРНЗ (озимая пшеница) и ГУСХП«Высоковский» Костромского р-на Костромской обл. (огурец) и получение семян R1 поколения

Регенеранты озимой пшеницы резистентных форм пересаживали в вазоны с почвой, содержащей споры патогена корневой гнили (Лаврова, 2000), а 23 марта 2006 года — в грунт теплицы лаборатории селекции озимой пшеницы НИИСХ ЦРНЗ. Регенеранты огурца, размноженные микрочеренкованием (R1 и R2 поколений) — в грунт экспериментальных теплиц ГУСХП «Высоковский» (Костромская обл). В конце вегетационного периода селекционный материал был оценен на устойчивость к фузариозу по 4-х-балльной шкале (Лаврова, 2002). Поражение корневой системы растений фузариозом у сортов озимой пшеницы Инна и Памяти Федина составило 1 балл. Сорт Московская 39 не имел видимых симптомов поражения фузариозом - 0 баллов. Восприимчивый (Немчиновская 24) и среднеустойчивый (Галина) сорта — погибли. Регенеранты Л 42S не имели видимых симптомов поражения фузариозом — 0 баллов, процент поражения женской линии Л 29$ составил 1 балл.

При оценке на патогенном фоне, регенеранты озимой пшеницы, отобранные на уровне гаплоидных каллусов на селективных средах с 50 - 100 мкг/мл

токсина фузарнекой кис юты и регенеранты огурца, отобранные на уровне меристем на селективных средах с 500/о КФ Fusarium sp и 50 мкг мл токсина Т-2 из Fusarium sp, сохранили достаточно высокую степень устойчивости к патогену фузариозной корневой гнили, а также они сохранили устойчивость к поражению мучнистой росой - 0,5 балла, бактериозом - 2 балла (огурец)

В фазе 1-го настоящего шста проводили учеты погибших от патогена растений и оценивали поражение корней Проведенная предварительная оценка пос ie однократного отбора показала, что RI семенное поколение растений Fl I рибовчанка безвирусная не имело видимых симптомов поражения фузариозной корневой гнилью (0 баллов) по сравнению с контро 1ем, корневая система которого имела поражение фузариозом — 3 балла

Для предварительной оценки R1 поколения озимой пшеницы на устойчивость к <Ьузариоз\ из семян R1 поколения были выч шнсны фе 1ые зародыши (змбриоку льтура) которые культивировали на среде MC без регу тторов роста содержащей ацетон в концентрации не менее 1Л % от объема среды Растения-psiенеранты были размножены в культуре in vitro по методу С Беккужиной (1949) и отобраны на средах с токсином фузариевой кислоты в концентрации мкг мл Устойчивость регенерантов к токсину in vitro также подтверди гась

Оценка устойчивости растений огурца, полученных от семян R1 поколения в условиях инфекционного фона зимней теплицы и получение семян R2 поколения

Семена R1 поколения И [ рибовчанка - безвирусная высевали в 2002 году в зимней б гочной теплице 1 УСХП «Высоковскии» Костромского р-на Костромской об 1 на фузариозаом фоне с местной популяцией гриба Fusarium •ф (F охуьрогшп F solani и F moniliforme)

Исс ¡едования проводили путем постановки лабораторных опытов в соответствии с требованиями «Методических рекомендации по прове тению опытов с овощными культурами в сооружениях защищенного грунта» (1976)

Ich личный груш сослоял из торфа и компоста (содержание органического вещества - 30 %), который отвечал требованиям такой овощной культуры, как огурец Во всех опытах проведены фено/ огические наблюдения при которых отмечены даты посева семян, появление единичных и массовых всходов, пикировки, бутонизации посадки начала и массового цветения, первого и последнего сбора плодов (Долгий В В 2003)

В конце ве1етационного гериода все растения быт описаны и оценены по устойчивости корневой системы к фузариозу Растения были с ибо- и

средневетвистые, смешанного типа цветения. Форма листовой пластинки 5-угольная, завязь над 9 листом. Плоды имели цилиндрическую форму, по характеру поверхности были крупнобугорчатые без рисунка, и гладкие с рисунком в виде белых полос до середины плода. Кора плодов тонкая. Вкус плодов - 5 баллов. Из плодов были получены семена R2 поколения в количестве 600 шт. Морфологических изменений от размножения растений методом культуры меристем с последующим отбором на селективных средах с КФ гриба и традиционным способом (через семена) у растений не отмечено.

После отбора устойчивых образцов на полулетальных и летальных концентрациях КФ гриба растения размножали с использованием метода культуры меристемы, а регенерированные из них растения — микрочеренкованием (лаборатория с/х биотехнологии Костромской ГСХА). Укорененные мериклоны передавали в ГУСХП «Высоковский» для получения семенного материала и изучения признака устойчивости к фузариозу в поколениях растений огурца, полученных методом отбора эксплантов меристем на селективных средах с КФ Fusarium sp.

Заключение

Суммируя экспериментальный материал можно заключить, что в селекции озимой мягкой пшеницы и огурца на устойчивость к фузариозным корневым гнилям, наряду с традиционными методами работы, эффективно применение методов in vitro с использованием селективных питательных сред, содержащих КФ и токсины грибов из Fusarium sp.

Селекция in vitro огурца по устойчивости пыльцевых трубок к токсинам Fusarium sp. позволит ускорить выведение устойчивых к фузариозу сортов и гибридов, тем более, что в результате проведенных исследований установлена положительная корреляция между угнетением роста пыльцевых трубок, интенсивностью прорастания пыльцы при пониженных положительных температурах и поражаемостью эксплантов на селективной среде с токсином in vitro.

Работу по созданию фузариозоустойчивых сортов (гибридов) озимой пшеницы целесообразно начинать с последовательного отбора каллусирующих и морфогенных пыльников селекционных и коллекционных образцов на питательных средах с добавлением токсина фузариевой кислоты из Fusarium sp. Получение жизнеспособных регенерантов из морфогенных структур и оценку их. устойчивости можно использовать как экспресс-метод в селекции озимой пшеницы для более точной и быстрой оценки селекционного материала на устойчивость к грибным болезням, что значительно ускорит и упростит селекционный процесс, сократит затраты на подготовку инфекционного фона с

патогеном и проведение заражения культурой патогена, что достаточно трудоемко

Рекомендации по использованию результатов нссле юваний

Новая схема создания фузариозоустойчивых форм мягкой озимой пшеницы биотехно lot ическими методами включает Ч основных этапов

1 >тап — отбор колосьев озимой мягкой пшеницы с сортов-доноров в поле но комплексу морфологических признаков подготовка колосьев к стерилизации, стери шзация цветков и иш выделение пыльников, определение лмбриогеннои стадии развития пыльцы под микроскопом,

2 >тап - жсплантирование пыльников и семяпочек m vitro в жидкои ин ivMinoHiiofi среде, осаждишс микроспор центрифугированием

3 этап - культивирование микроспор на средах для эмбриоидогенеза до образования мноюклел очных комплексов и пыльников до образования каллусирующих гаплоидных структур различного типа (наращивание материала) селекция in vitro морфогенных гаплоидных структур на средах, содержащих ацетон+токсин гриба, пересадка крупных эмбриоидов на среды для регенерации растении с токсином гриба и без него,

4 паи получение устойчивых раслсний-регенерантов

5 этап укоренение устойчивых perснерантов in vitro,

6 пап - цитологический контроль плоидности регенерангов и яровизация при температуре 2-4 оС в течение не менее 60 дней

7 )тап - дип юидизация рстенерантов колхицином (0,02%, 4-5 часов), пересадка ре!снерантов в почву и доращивание в теплице в естественных условиях или в условиях инфекционной теплицы с патогеном гриба, отбор устойчивых растений го хозяйственно-ценным и морфологическим признакам

8 этап оценка растений в конце вегетации с осмотром корневой системы и общей оценкой на \слойчивоеть к фу зариозу,

Ч этап получение семенного материала Ro, отбор ценных АДГ- шний (R1-R2) линии и передача селекционеру Внедрение в селекционные программы по созданию сортов устойчивых к грибным болезням

ВЫВОДЫ

1 На основе выяв 1ения цитоэмбриологических особенностей процессов лмбриоидогенеза и морфогенеза создана система культивирования in vitro изолированных пыльников и микроспор мягкой пшеницы с озимым типом развития на селективных средах с токсином патогена фузариозной корневой гнили и разработана 1анлоидная биогечно югия д гя прямого использования в практической селекции для созлания хозяислвенно-ценных сортов )той культуры, устойчивых к F oxvsporum, F monilitorme и Г ьо1аш Доказана целесообразность пос 1едовательного

отбора гаплоидных каллусных структур на селективных средах с высокими концентрациями токсина фузариевой кислоты (50 - 100 мкг/мл), возникающих в культивируемых клетках, способных к регенерации растений.

2. Впервые показано, что выдерживание стерильных колосьев озимой пшеницы в культуре in vitro на агаризованных питательных средах при низких положительных температурах (2-4 оС) сохраняет жизнеспособность микроспор до 3-х и более месяцев.

3. Впервые на озимой мягкой пшенице показано, что частота формирования андроклинных структур зависит от комплекса взаимосвязанных факторов: условий стерилизации донорных растений, предобработки колосьев низкими положительными температурами и выдерживания на средах МС без регуляторов роста, стадии развития микроспор и состояния стенок гнезда пыльника, а также применения ацетона в составе индукционных питательных сред.

4. Впервые показано, что микроспоры, находящиеся на поздней стадии развития, под действием индукционных сред МС №№ 8 - 10, содержащих ацетон, и низкотемпературного стресса перемещаются в полость гнезда пыльника. Только на индукционных средах с добавлением ацетона в концентрации 0,26 - 0,34 M микроспоры образуют эмбриогенные комплексы как путем прямого эмбриоидогенеза, так и в культуре длительнокультивируемой каллусной ткани.

5. Впервые в культуре изолированных пыльников и микроспор озимой мягкой пшеницы на среде с ацетоном в концентрации не менее 0,26 M получены эмбриоиды, морфогенные и неморфогенные каллусы нового типа, отличающиеся по морфологическим свойствам и анатомическому (сферическому) строению.

6. Впервые в культуре in vitro озимой мягкой пшеницы выявлены 4 типа апертур микроспор: моносулькатные, монокольпатные, трехкольпатные и пентакольпатные, через которые при культивировании микроспор in vitro на индукционных средах с ацетоном происходит прорастание пыльцевых трубок.

7. Впервые в изолированной культуре микроспор озимой мягкой пшеницы получены морфогенные каллусы с высокой способностью к эмбриоидогенезу (более 37,2 % в расчете на общее число культивируемых пыльников) на средах №8, 9 и 10, дополненных ацетоном, MES, агарозой и мальтозой.

8 Установлено мутагенное действие чистого токсина фузариевой кистоты при отборе in \itro резистентных андрогенных шний, что проявилось в рассеченности тистовой пластинки регенерантов сорт Московская 39, отобранных в жестких селективных условиях (100 мкг мп токсина)

ч Разработан ускоренный метод оценки селекционных генотипов orvpua и АДГ-линии озимой мягкой пшеницы на средах с токсином гриба Fusarium sp по темпу прорастания пыльцевых трубок в селективно и среде Предложен экспресс-метод оценки селекционного материала огурца (на примере Л 42 и -I 24 „ Г1 1 рибовчанка безвирусная) на чстоичивость к фузариоз\ in vitro с использованием КФ из F oxvsporum F moniliiormc F solam и токсина патогена

10 Доказано что показатели устойчивости к токсину фу¡ариевой кислоты изо шрованных меристем, кал ivciibix тканей и пыльцевых трубок (некротические явления, ютадьныи исход) коррелируют с устойчивостью вететируютцих растений, выращенных на инфекционном фоне с патогенами корневой гнили

11 Разработанные биотехнологии огурца (меристемная, каллченая и м и кроепоро генная) по ¡ко г я ют сократить селекционный процесс и включать в него ценные малоеемянные линии и сильно пораженные грибными бо 1езнями плодоносящие растения при необходимости их размножения для селекционных целей в работе на иммунитет

Список основных работ по теме диссертации Научные:

1 Маркова (Лтврова) Н В Ьуспко Р Г , Донец Н В Использование kv ibTvpbi меристемы ,i 1я клепального размножения огурца in vitro Док талы ВАСЧНИЛ - М , 1489 - Х<8 - С 11 14

2 Markova (Lavrova) V V Butenko R G , Donets N V L^e of meristem culture for clonal propagation of cucumber in vitro // Soviet Agricaltural fences - New \ ork, 1ЧХЧ - J\T> 8 -P 14-18

3 Маркова (Лаврова) HB К юналытое размножение огурца (Cucumis sativus L ), как метод сохранения ценных селекционных генотипов /' 1р Всесоюзной конференции Роль науки в интенсификации сельского чомиелва Омск, 1940 С 114-115

4 Маркова (Лаврова) HB Размножение in vitro селекционных линии огурца (Cucumis sativus 1 ) четойчивых к фузариоз\ // Тр Научно-нроизволсгвеннои конференции Одинцовского р-на Московской оба Ученые - ее Некому чомйслву Нечерноземной юны М, 1990 С 120 -122

5. Маркова (Лаврова) H.B. Использование биотехнологических методов в селекции огурца (Cucumis sativus L.) на резистентность к фузариозу, вызываемому грибами рода Fusarium // Тр. 1Y Всесоюзной конференции ученых по физиологии растительной клетки. Минск, 1990. С. 119 — 121.

6. Маркова (Лаврова) Н.В., Бутенко Р.Г., Донец Н.В. Способ клонального микроразмножения растений огурца (Cucumis sativus L.) // Заявка на изобретение РФ №4773443. Заявлено 12.12.89., положительное решение 31.01.91,- 12с.

7. A.C. №1720595 (СССР) на Способ клонального микроразмножения растений огурца (Cucumis sativus L.). Маркова (Лаврова) Н.В., Бутенко Р.Г., Донец Н.В. - Зарегистрировано в Госкомизобретений и открытий при ГКНТ РФ, 1991-3 с.

8. Лаврова Н.В. Экспресс-метод оценки селекционного материала огурца (Cucumis sativus L.) на устойчивость к фузариозу in vitro с использованием культурального фильтрата (КФ) и Т-2 токсина из Fusarium sp. // В кн.: Актуальные проблемы науки в АПК, Т.1 Кострома: изд. КГСХА, 2000. С. 43 - 45.

9. Лаврова Н.В. Использование методов in vitro в селекционной работе с растениями огурца (Cucumis sativus L.) // В кн.: Актуальные проблемы науки в АПК, Т.1 Кострома: изд. КГСХА, 2000. С. 32 - 35

10. Лаврова Н.В. Биотехнологические методы в клеточной селекции пшеницы на устойчивость к септориозу, вызываемому возбудителем Septoria nodorum // В кн.: Актуальные проблемы науки в АПК, Т.1 Кострома: изд. КГСХА, 2002. С. 33 - 35

11 .Лаврова Н.В. Селекция пшеницы in vitro на устойчивость к фузариозу // В кн.: Актуальные проблемы науки в АПК, Т.1 Кострома: изд. КГСХА, 2002. С. 36-38

12. Lavrova N.V. The working out biotechnology receiving haploided plants of winter wheat (Triticum aestivum L.) // Third Moskow international ment, March, 14-18, Moskow, Russia, 2005. Past 1. P. 264 - 265.

13. Лаврова H.B., Баранова E.H., Гулевич A.A. Динамика утилизации запасных веществ в условиях действия солей и осмотика //Известия ТСХА. - 2005. - №4 - С. 174 - 178

14. Лаврова Н.В. Практические аспекты андрогенеза in vitro озимой мягкой пшеницы // Вестник Костромского государственного университета им. H.A. Некрасова. - Кострома, 2005. - №11 - С. 124 - 126

15.Лаврова Н.В. Гаплоидная биотехнология в селекции озимой пшеницы // Вестник Костромского государственного университета им. H.A. Некрасова.-Кострома, 2005. -№11 - С. 134-137

16 Лаврова HB Ку штивирование тонированных пыльников и микроспор озимой пшеницы m vitro Вестник Костромского государственного университета им H Л Некрасова - Кострома, 2005 - -4« 12 - С 115 117

17 Лаврова HB Цито lot ические особенности начальных iuiob спорофитиого nvTii развития микроспор озимой пшеницы и Вестник Костромского пхлдарывенного университета им НА Некрасова -Кострома, 2005 - > 12 - С 125 - 127

18 Лаврова H В Me юлы in vitro в сече-кии и огурца (Cucumis sativus L ) на UMMVHUTCT Монография Деп в > 1ектронном изд БД < Дгрос» „V 02200510769 в ПТЦ «Информрегистр» >50 ВС - 2006 от 1 "¡ 07 06 - VI ->3 2- 120 с

19 Лаврова H В Теоретические и технотогические аспекты андроклинии мягкой пшеницы с ошмым типом развития ¡' Монография - Деп в пектронном изд ЬД «Агрос» .V 02200S70769 в НТЦ «Информрегистр» >45 ВС - 2006 от 13 07 06 - M - >3 2 - 183 с

20 Лаврова H В I аплои^ная биотехнология в селекции озимой пшеницы на устойчивость к грибнь м бо ie шям Практический комментарии - Jen и i ii-ктронном изд ЬД «Aipoc» N"02200510769 в H ГЦ «Информрыистр» >49 ВС - 2006 oí 15 07 06 - M - >3 2 53 с

21 Лаврова HB Биотехно тогические методы в создании форм паковых растений устойчивых к корневым гнилям токсины патогенов жеперименгальная ran гоидия и генетическая трансформация 1 Деп в ) leKipoiiHOM изд ЬД «Агрос» >02200510769 в НТЦ «Информрегистр» >47 ВС-2006 or Ь 07 06 - M -JV 3 2 - 26 с

22 Лаврова HB Перспективы развития гаплоидной биотехнологии в России а |я интенсификации генетико селекционных работ с зерновыми колосовыми паками Обзорная статья - Деп в э шктронном изд БД «Агрос» >02200510769 в НТЦ «Информрегистр» .Y46 ВС-2006 от И 07 06 -М ->3 2 20 с

2" Лаврова IIB Перспективы использования кузьтуры им 1ьников (микроспорогенез) и токсинов патогенов н ее !екции огурца на \стоичивоеть к грибным болезням // Деп в псктронном изд БД «Агрос» .V 02200510769 в H ГЦ «Информрегистр» >48 ВС-2006 от 13 07 06 - VI -V 3 2 - 8 с

24 Лаврова HB Технология (способ) получения новых секционных 1енотипов озимой мягкой пшеницы in vitro / Заявка на патент РФ .V roe регистрации 2006 112075^4

25.Лаврова H.B. Состав индукционной среды для получения гаплоидов озимой мягкой пшеницы in vitro II Заявка на патент РФ № гос. регистрации 2006/17500291

26.Лаврова Н.В. Технологические аспекты создания андрогенных гаплоидов озимой мягкой пшеницы // Монография. - М.: изд. ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2006 - 125 с.

27.Лаврова Н.В. Практические аспекты андрогенеза in vitro озимой мягкой пшеницы // Известия ТСХА. - 2006. - №4-■ .. .

Учебно-методические:

28.Лаврова Н.В. Сельскохозяйственная биотехнология. Часть 1. Клеточная инженерия: учебно-методическое пособие, Кострома: изд. КГСХА, 2000. -32 с.

29.Лаврова Н.В. Вопросы проведения учебной практики по фитопатологии для студентов факультета Агробизнеса // В кн.: Современные образовательные технологии в учебном процессе, Кострома: изд. КГСХА, 2001. С. 72-74

30.Лаврова Н.В. Программа учебной практики по фитопатологии: Учебная программа, Кострома: изд. КГСХА, 2002 - 19 с.

31 .Лабораторный практикум по сельскохозяйственной биотехнологии: Учебное пособие, М.: изд. МСХА, 2004, С. 11 - 31 (под редакцией академика РАСХН B.C. Шевелухи, в соавторстве — всего 8 авторов)

32.Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции; Тестовые задания, М.: изд. МСХА, 2005, 17 с. (электронное изд. размещено на сервере дистанционного обучения РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, М. - 2006 - 17 с.

Зак. 652.

2,75 печ. л.

Тир. 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44