Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методы IN VITRO для ускорения и облегчения селекционной работы с растениями огурца (CUCUMIS SATIVUS L. )

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Методы IN VITRO для ускорения и облегчения селекционной работы с растениями огурца (CUCUMIS SATIVUS L. )"

' ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛВДОМТЕЛЬСКШ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВШЮЙ БИОТЕХНОЛОГИИ ВЛСХНИЛ

На правах рукописи

МАЖОВА Наталья Владимировна

МЕТОДЫ Ш VITRO для УСКОРЕНИЯ И ОБЛЕГЧЕНИЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ РАБОТЫ С РАСТЕНИЯМИ ОГУРЦА ( CUCUMS SA/nVtfS I.) ■

(03.00.23 - биотехнология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандвдата биологических наук

Москва - 1991

Диссертационная работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Ордена Трудового Красного Знамени Института физиологии растений им.К.А.Тимирязева АН СССР и в лаборатории селекции и семеноводства тыквенных культур Всесоюзного Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур.

Научные руководители: -член-корреспондент АН СССР и академик

ВАСХНИЛ, доктор биологических наук,профессор Р.Г.ЕУТЕНКО

-доктор сельскохозяйственных наук,профессор О.В.ЮРША

Официальные оппоненты: -доктор сельскохозяйственных наук,профессор Г.И.ТАРАКАНОВ •

-кандидат биологических наук,ведущий научный сотрудник И.Я.МАРЬЯХИНА

Ведущее учреждение: НПО по овощеводству "Россия"

Научно-исследовательский институт овощного хозяйства

Защита состоится 1991 г. в // ' часов на за-

седании Специализированного совета Д.020.40.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени хавдидата биологических наук по специальности 03.00.23 - биотехнология при Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии.

Адрес: 127253, г.Москва, ул.Псковская, д.12, корпус А. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИСБ.

Автореферат разослан 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук (''-сЛ < С.А.Меликова

/

ОЙДАЯ ХАРАКТЕРИСТИК РАБОТЫ

Актуальность гег/ы. СсзременныЯ уровень и тейпы развития сельскохозяйственной науки диктуют поиск новых путей в селекции,первичном и пр удаленном семеноводстве экономически важных растений. На ХУ Между дрэдной конференции по биологии культивируемых клеток отмечалось, чтя биотехнолог должен работать в тесном сотрудничестве с селекционером. Важный раздел сельскохозяйстзанной биотехнологии - клеточные технологии, в том числе получение in vitro ценного исходного материала для селекции и быстрое клепальное его .размножение. Микроклональное размножение с помочью культуры меристем вошло d технологию селекционного процесса для капусты, томатов (ВК>1Л1МяГ), лука и чеснока (ВгШСССМ), односемянных тетршлоидных форм сахарной свеклы, пол,ученных в процессе рекуррентной селекции (ВНЛС). Благодаря достижениям клеточной биологии стало возможным получение in vitro растений-регенерантов с измененными признаками, среди которых селекционер может отобрать продуктивные, устойчивые к болезням формы и при этом в принципе сохранить положительные черты исходного сорта (Р.Г.БутенкоДУЙ4). Однако пока еце в литературе мало сведений о технологиях для семейства Тыквенных С Cucurbite-сеае). Из этого семейства в нашей стране как продовольственная культура наиболее распространен огурец ( Cucumia sativus L.}. Несмотря на определенные успехи,'имеющиеся в селекции огурца, до настоящего времени нэ удалось вывести сорта ми гибриды, устойчивые к фузариозному увядании. Техника традиционных селекционных методов требует здесь дополнения методами in vitro, среди которых особенно перспективна клеточная селекция. Культивируя клетки на среде с' высокими концентрациями селективных агентов - культуральных фильтратов (KS0 и токсинов патогена можно надеяться получить устойчивые растения и быстро клонировать их 1л vitro. Методика не нквла. еще широкого применения для овощных растений, но имеются положите-ьные примеры для зерновых и технических культур. К сожалению, многие технологии In /itro, хорошо разработанные для других культур, часто неэффективны для огурца. В доступных нам источниках, как правило, отсутствуют оптимизированные для сортов к гибридов огурца методы клонального кикроразмноже.доя и клеточной селекции.

Цель и задачи исследования. Цель» настоящего исследования,объектом которого является огурец, явилась разработка методов, принч-гых в биотехнологии для ускорения и облегчения селекционной работы.

Для достижения этой цели необходимо было раяить следующие задачи:'

1. Разработать кетоды культивирования меристем: а) из молодых проростков, полученных in vitro от семян; б) из вегетативных апикальных и лазушных почек тепличного растения в фазе плодоношения. Опт;(;/цзирова.гь условия клонального размножения пробирочных растений, возникших из меристем.

2. Получить первичные и длительно субкультивируемые каллусиые ткани сортов и гибридов огурца.

3. Оптимизировать условия регенерации растений из первичного каллуса и длительно выращиваемой к&члусной ткани.

4. Разработать селективные условия для отбора in vitro экс-плантов, устойчивых к фильтратам культуральной жидкости (КФ) и токсину T-í, ИЗ Pusarium ар.

Научная новизна. Впервые оптимизирован способ клонального мик-рораэмноженяя растений огурца ( Cucumis oativus L.) не только с использованием меристем малого размера проростков in vi tro, ио и взрослых плодоносящих растений (Заявка 4773443 подана в Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий, положительное решение от 31.01.91). Определены условия получения каллусных культур огурца, обладающих морфогенным потенциалом. Установлены различия между способностью сортообразцов к индукции каллусообразования, эмбриогенеза и регенерации растений. Впервые в культуре in vitro тыквенных растений получены селекционные формы огурца, характеризующиеся устойчивостью к фузариозу, вызываемому грибами рода Fusarium. Для этого были созданы специальные методы отбора жизнеспособных экс-плантов на средах с полулегальными и летальными концентрациями куль-турального фильтрата (tíí) и токсина 1-2 из Fusarium ер.

Практическая значимость и реализация результатов работы. Результаты проведенных исследований нашли практическое применение в селекционном процессе (лаборатория селекции и семеноводства тыквенных культур Шл селекции и семеноводства овощных культур, Москов- ■ екая обл.), что подтверждает представленный в диссертации акт о внедрении результатов работы.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на совместном заседании лабораторий ВНШСССК (1988,1990), заседаниях научно-методического Совета селекцентра ВНШССОК (1987-1990), на научном семинаре Отдела биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им.К.л.Тимирязева АН СССР (1989,1991), на

научной конференции молодых ученых ШО "Подмосковье" (1939).

Нубли.чации результатов исследований. Но тс.'/е диссертации опублик: ано 2 научные работы и 3-е тезисов докладов. Подана заявка на и^5ретение ),"' 4773443, положительное реаение от 31.01.91.

Структура к объем работы, рдосертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х экспериментальных глав, общего заключения, выв; нов, ст.ска литературы, включающего 210 наименований, в том числе 140 иностранных, приложение (акт о внедрении). Работа изложена на Гуй страницах машинописного текста, содержит 35 таблиц, 36 фотографий и 5 рисунков.

2. МАТЕРИАЛ Л .'¿¿ГОДУ НСГЛЭДЕШЬИ

2.1. Характеристика селекционного матариача огурца,

использованного в качестве объектов

Исходным формами для отработки метода микро.члонального раз-;лножения служили две линии: 29 ^ и Л 42*' (материнская и отцовская формы широкорайошрованного для выращивания в зимних и зесен-них теплицах партенокарпического гибрида Р1 Грибовчанка. В качестве исходного растительного материала для работы с каллусными тканями были использованы разные по происхождению гибриды: Р1 (Звенигородский I&28/95 J2x Pica ?2 1621/97) ,-F., (Звенигородский 147/99 х Московский тепличный 1624/244J., ); Р1 [(Звенигородский 2186/42 х 2137/10) х Московский тепличный 2179/7 х .Pica 2160/16)]; селекционная линия Л 420 и сорт Тепличный посредник. Аля отбора тканей in vitro на устойчивость к КЗ и токсину Т-2 из Fusarium зр. был использован сортовой и линейный материал огурца, прошедший тредварительную оценку на устойчивость к фузариозу на инфекционном ^оне с латогено:.'. Сюда относятся гибриды: Г-Кристалл X Summer (Р^), -5Ш, Г-588 (семья) (?4), Г-1409, Г-433 (iv); сорта: сорт-л95, бессемянка; инцухт-линии: Я 73, Я из Г-395, л 29.

2.2. Условия выращивания эксплантов и методы оценки интенсивности роста: получение и выращивание

растений--регенерантов

В качестве объектов в экспериментах по морфогенезу испальзова-и: I - апикальные меристемы 3-дневных стергаьных проросткоЕ огур-а, изолированные с двумя приг.юрднями (разчер 250-350 мкм); 2 -пикальные л пазушные меристемл вегетиругацих растений в фазе плодо-ошения размером 1-2 мм с 4-5 листовыуи зачатка;,ш; 3 - <]-рагмен:ч

'гипокотиля, семядоли, листа 7-ш дневных стерильных проростков огурца (размер ^>1 см). Работу по изолированию эксплантов и манипуляции с ними проводили в ламинарах-боксах типа КШ-1 И, операции с культурой гриба - в' микробиологических боксах, необходимые температурные режимы поддерживали в термостатах марки НЛ-П4.

Эксплантц и каллусные ткани выращивали на питательной среде МС, модифицирование 1 наш применительно к разным объектам и целям (табл.1). Семена проращивали на среде МС с 1% сахарозы. Пробирки и чааки с высаженными семенами, меристемами и каллусными тканями выращивали при температуре 26° + 1°С, относительной влажности.воздуха 71$ и осзещенности люминесцентными лампами ЛЗ-сЗО при интенсивности осчецения 5-в тыс.лкс. Длина светового периода составляла 16 часов в сутки.

Опыты проводили в 3-х кратной повторности. Данные обрабатывали статистически (доспехов Б.А.,1986).

Яри, культивировании апексов учитывали выживаемость на 3-й день после вычленения, высоту и степень облиственностл побега, длительность побегообразования (дни), при каздом черенковании учитывали число микрочеренкоь, стеблей, листьев, мездоузлий, почзк (вегетативных и репродуктивных). До высадки растений в почву учитывали процент укоренившихся в среде мериклонов, у высаженных в почву - число укорененных в почве.

Цри культивироьании каллусной ткани от эксплантов гипокотиля, листа, семядоли и меристем проводили анализ роста каллусной ткани по числу высаженных и образовавших каллус эксплантов, весу (мг) и интенсивности каллуоообразования, консистенции, цвету каллусной ткани, зависимости от генотипа растения, числу каллусов, образовавших побеги.

Пересадки. Регенеранты высотой 3-5 см с развитой корневой системой пересаживали в колбы на агаризованную питательную среду без регуляторов роста, а развившие 5-7 настоящих листьев - в торфо-пе-регнойные горяочки, увлажненные раствором микроудобрений. Выдержанные в течение 3 дней в условиях влажной камеры растения пересаживали в грунт зимней теплицы ВНШСССЖ, где за ними проводился общепринятый в лаборатории селекции и семеноводства тыквенных культур уход: полив, подкорми комплексными удобрениями, подвязка к шпагату, обработки против вредителей и болезней, сбор плодов.

Таблица I

Варианты питательных сред, использованных при культивировании тканей и клеток огурца (Сцсшзйз sativus L.) in vitro

компоненты сред

Концентрация в вариантах, мг/л

¿¡С : MC-I : МС-2: ЫС-3

-4 : ЙС-5 : ÜC-6 :ЙС-7 :X-d :Х-9 : ЫС-Ю : MC-II

лин.соли по .¿С «и и.соли по ;лС (1/2 н.) Витамины по iac (1962) Виташкы по Стаба (196а) Гидролизат каззииа Сахароза Нинетин 6~Б;Ш

10000

2.4-4

¿эатан -рибозид Л УК А-НУК

Гиббаралловая

кислота

5зрулловая

кислота

¿денин

Глицин

.'ЬНгМТ

лктквкрозаннай до..'аасн.уголь

лгас'-агао

+ +

20000 0,5

:,о 2,0

20000 20000 0,4 0,04

20000 0,04

40 2,0

7000 750О

30 • 2,0

10000 7500

1,0 ' 1,0

0,02

200 30000

0-2,0

200 30000

0,5

о,а

0-0,5 2,0

100 100

10000 7000

10000 7000

30000

0,1 0,4 0 5 0,8 1,0

0,5 2,0

30000 30000 0,4;2 0,4 0,0

1,0 0,5;2

0,5

1000

7000 7000 7000 7000 7500

2,0

IOCOO 7500

I

№ I

30000

10

7500

2.3. Создание селективных условий для отбора эксплантов на устойчивость к патогену корневой гнили

При выделении.патогена в чистой культуре использовали методические 'указания, разработанные з лаборатории биотехнологии ВНИИ кормов им.В.Р.Вильямса (I9Ó4). Видовой состав гриба был определен на кафедре низших растений ИГУ им.¡<1.В.Ломоносова и включал 3 вида: Р-.охуарогша, P.eol_ni, F.moniliforme, которые использовали для дальнейшей работы.

Популяция гриба выращивали на плотной среде Чапека. отбора устойчивых эксплантов использовали К5 в разведении 10-70,? и токсин Т-2 ("Serva") с концентрацией 5-200 мкг/мл. Устойчивость растеш'.П-регенерантов оценивали на инфекционном фоне с патогеном в условиях зимней теплицы ВН/МССОл по 5-балльной шкале (Юрина О.В., йзрганоза H.H.,I9ü5). Растения от семян R1-K2 поколений - по 4-балльной шкале (Ерина 0.3., Беляева В.Б.,198o).

3. РЕАЛИЗАЦИЯ IH VIМО ¡,ЮР£ОГЖОГО ПОТЗНЩАЛА ОРГАНОВ A TKAHü.i ОГУРЦА ( GUClíKIS SATIVU3.L.)

3.1. Люнальное шкроразмноаение генетически различающихся между собой селекционных образцов огурца

В связи с тем, чте при семенном размножении наблюдается расщепление гетерозиготных генотипов СУрадец il.vl., Ечиноза Т.Н. , а регенерация растений через культуру каллуса характеризуется длитель-ностьв получения регенерантов ( Llalepzy, Nadolska-Orzyk, Iito3) и риском потери генетической стабильности исходного материала (Загорска Н.А. и др.,1^б7), эффективным-приемом ускоренного размножения ценных для селекции и семеноводства форм огурца может стать микро-клональное размножение образцов с использованием культуры апикальной меристемы. Малый размер (250-300 мкм) изолированных меристем способствует при этом оздоровлении растений.

Рекогносцировочные опыты с вырациванием меристем проводили на среде Ыурасиге и Скуга, модифицированной нами для огурца. С цельы оптимизации среды для культуры тканей огурца проверяли концентрации всех физиологически активных веществ и, кроме того, изучали действие добавленного к среде активированного древесного угля, tí основе среды, содержащей минеральные соли по ИС, витамины по Стаба, 20 г/л сахарозы, 7,5 г/л агара ШС-1) добавляли в различных концентрациях и соотношениях между со'бой кинетин (0,05; 0,1; 0,4; 0,6; 1,0 мг/л);

' гиббереллов.уо кислоту (0,5; 1,0; 2,0; 3,0 мг/л), пде^нн (20,30,40, 50 мг/л), сахарозу (5,10,15,25,30 г/л), актиьированпый дрдпесный уголь 3,5,10,15 г/л).

Проведенные нами опыты показали большую роль добавления к среде активированного дрезесного угля. Без активированного угля процент жизнеспособных меристем бг.л низок. Оптимальной была концентрация активированного древесного угля 10 г/л. Анализ действия биологически активных компонентов: кинетина, гпбберелловой кислоты, аденина показал, что лучшие результат« по получению проростков из изолированных меристем наблюдали на среде с 0,4 мг/л кинетина, 30 мг/л аденина, 2 мг/л гибберелловой кислоты. На этой оптимизированной нами среде МС-2 (см.табл.I) наблюдалл формирование миниатюрных проростков через 3 дня после изолирования меристем и помещения кх на среду. В этой стадии проростки пересаливали ча среду мС-3 (см.табл.1) с уменьшенным количеством кинетина и добавлением ауксина (ДУЮ. Субкультивирование проростка, раззигаегося из меристемы, на эту среду через 3 дня было обязательным условием хорошего роста побега. Через 7-Ю дней на этой среде формировались миниатюрные растеньица высотой до 5 см с развитым листовым и корневым аппаратом. В качестве основного способа клоналького микроразмножения нами было выбрано микрочеренкование. Интенсивное размножение огурца черенкованием проводили в течение 4-х субкультивирований каждые 1014 дней на среде ЫС-4. За одно субкультивирозание мы могли получить до 5 растений от одной инициали, в течение 4-х субкультивирований расчетно - до 55 тыс. растения выбранного генотипа. Особенности клонального размножения пробирочных растений JI 29 £ и JI 42с' представлены в таблице 2.

Меристемы и черенки пробирочных растений д<ужской линии с первой и до четвертой субкультуры отличались хорошим укоренением побегов, интенсивным ростом корневой системы, уменьшением числа узлов побега (за счет большего растяжения мевдоузлий). Выращиваемые в тех же условиях меристемы и черенки пробирочных растений женской линии хуже укоренялись, к-'эли менее интенсивно развитую корневую систему, более короткие махдоузлия и увеличенное число узлов. Можно предположить, что различия меиду мужской и женской линиями генетически обуславливает разный баланс эндогенных фитогормонов (ауксина и цитэкининов), что и проявляется при развитии и росте объектов in vitro. Полученные результаты строго подтверждают, что половая

Таблица 2

-Характеристика пробирочных растений огурца линий Л 29 ? и Л 42 с?

Число субкультивированкй

Показатели

I

П

Ш

1У

Линия Линия Линия Линия Линия Линия Линия Линия 42 2У 42 29 42 29 42 29

1. Число листьев, шт. 6 12 7 9. 8 7 7' 9

2. Число узлов,

шт. 6 S 7 9 7-8 6 8

3. Интенсивность

корнеобразо ния (+)

ва-

•++++ +++ -Н-+-++ +++ +++++• ++++ +-Н-+ ++++

4. Число почек,

шт.

а) вегетативных 7

б) генеративных

5. Примечания междо-

узлия растянуты

4 I

б 4

. 2 12

б II

Интенсивность корнеобразозания в крестах (+): +++++ - корни полностью заполнили дно пробирки; ++-н- - сильная корневая система; +++ - развиты боковые и главные корни.

дифференцировка исходного растения полностью сохраняется в клоповом потомстве, полученном iu vitro.

Jjflя оптимизации условий укоренения использовали мериклоны, прошедшие 4 цикла микроразмножения. Растения перед высадкой в почву имели 7-9 настоящих листьев и хорошо развитую корневую систему. Пересаженные в вазоны с почвой огуречные растения приживались, цвели и плодоносили (рисЛ). Приживаемость растений в почве составляла в среднем 87-97$.

6

Рассматривая экспериментальный материал, изложенный з данном разделе, следует отметить ряд преимуществ метода кЛонального мик-рораз!. "жжения растения огурца, предложенного нами. Эти преимущества связаны, во-первых, с результатами оптимизации питательной среды, приведшей к значительному сокращению концентраций цитокининов в составе среды, что не только удепевляет процесс, но и гарантиру-ei большую стабильность генетических характеристик полученных клонов. Ватсным моментом язляется такие установление крайне благоприятного действия активированного угля. Внесенный в питательную среду в оптимальной концентрации активированный уголь не только ускорял процесс моррогенеза и роста меристем, но и нормализовал процессы развития растения. Изолирование меристем малого размера (250300 мкм) позволило освободиться от £>ольшинетЕа патогенов и вирусных инфекций. Интересен факт, установленный для пазушных меристем, изолированных от взрослых растений, показывающий, что с возрастом растения жизнеспособность меристемных зксплантэв несколько падает, но остается достаточно высокой и при переходе растений в репродуктивную фазу. С научной точки зрения интересны факты различного роста и развития побегов из меристем и черенков растений мужской и женской линий (табл.2).

На основании результатов, описанных в данной главе, предложена технология быстрого клонального размножения огурца с использованием апикальных меристем проростков и пазуыных меристем взрослых плодоносящих растений. Оба варианта могут найти применение в селекционной работе с огурцом, облегчая и ускоряя размножение используемых в селекционном процессе линий, гибридов, уникальных генотипов.

3.3. Каллусогенез у огурца ( Cucumis sativug L.) и изучение потенций к морфогенезу в первичной и длительно культивируемой каллусной ткани

В задачу нашей работы входило не только клонирование уникального селекционного материала, но и попытки использовать клеточные культуры огурца для создания вариабильньк форм. В нашем случае это попытка использовать технику in vitro для создания растений огурца, устойчивых к фузариозам. Для этого необходимо было разработать условия каллусогенеза и морфогенеза последнего как в первичной, так и длительно культивируемой каллусной ткани.

Предварительный опыт был проведен с эксплантами гкпокотиля гибрида (Звенигородский х Моск.тепличный) на среде МС-5. Лросер-

ка эффективности действия 6-БА11 в концентрациях от 0 до 2,0 мг/л и JL -ПУЛ в концентрациях от 0 до 0,5 мг/л в разных соотношениях между собой позволила сделать следующие выводы: даже на средах, в которых не было стимуляторов роста, мы наблюдали образование каллуса на Есех эксплантах и удовлетворительный его рост. Наиболее интенсивным был рост каллуса в варианте, содержащем 1,0 мг/л 6-БАЛ и 0,5 иг/л <Л-.ЧУК. '''месте с тем, образование мерксгематических очагов в каллусах мы наблюдали на значительно меньших концентрациях стимуляторов роста, ¿то были концентрации от 0 мг/л 6-БАЛ и 0,1 мг/л J. -НУК до концентрации 2,0 мг/л б-БяД и 0,5 мг/л «¿-НУК. Таким образом, этот опыт дал нам основания выбрать условия, приводящие к образованию первичного морфогенного каллуса поэтому, в следующих экспериментах с большим набором селекционных образцов: ^(Звениг. х Pica), i'1 (Звениг. х ¿1оск.тепл.j, Р1 (Звениг. x Моск.тепл. x Pica), j[ 4^0, сорт Тепличный посредник и использованием в качестве эксплантов фрагментов семядолей, гипокотилей и листьев, была использована среда iiiC-б, в которую в разных вариантах добавляли только 0,8 мг/л 6-Б<и1 или только 2,0 мг/л .¿-ЙУК, или оба стимулятора в этих концентрациях. Результаты этих опытов для разных селекционных образцов и разных эксплантов полностью приведены в диссертации., но в таблице 4 мы приводим данныз только для гипокотилей, которые по образованию каллуса и его морфогенной способности превосходили окспланти семядоли и листа. Образование первичного каллуса, локализованного на апикальном и базальном концах гипокотилей, фрагментов листьев и се^вдолой наблюдали на 10-й день. Через 17 дней в каллус-ных тканях, культивируемых на разных вариантах среды МС-6, наблюдали образование ;даниатюрных побегов. Число растеньиц различалось'в зависимости от генотипа исходного растения, типа экспланта и соотношения регуляторов роста в среде. Наибольшей морфогенной активностью характеризовались первичные каллусы, образовавшиеся из ткани гипокотиля. По способности к регенерации целого растения генотипы значительно различались. В качестве примера различной реакции селекционных образцов на условия каллусогенеза, мы и приводим данные' по гипокотилю (табл.4).

Таким образом, данные таблицы 4 показывают, что выбранные нами селекционные образцы -на всех вариантах с разными гормональными добавками образовывали первичный каллус, тогда как в случае органогенеза число зачатков, образующих корень и стебель, было различным

Таблица 4

Образование первичного каллуса и органогенез при экспланти-рс ании гипокотилей разных селекционных образцов

'л с

селекционных образцов

Среда ЬС-6 Число эксплан-с добавлени- тов ем, мг/л

Число каллусов образовавших

начальных образо- вавыих каллус корни зачатки стебля

I. 12 . 3

60 60 2. 24 8

3. 0 4

I. 12 8

60 60 2. 20 0

з. 0 0

I. 0 4

60 60 2. 25 0

3. 8 0

I. 0 4

60 60 2. 22 ■ 5

3. 0 16

I. 8 4

' 60 • 60 2. 48 12

3. 0 16 '

I. (Звени-гор. хИсз)

2. ?! (Звени-гор. х Моск.т.)

I

из

I

ю о*

3. г 1 (Звениг. х а ч. V Рт

4. Л 420

5. Тепличный посредник

е « «

3 1 I

I I I.

»о ^

I I I

00. О о

о N N

м С^ (ТЗ

для разных генотипов и варьировало от содержания фитогормонов в среде. Наши результаты не вполне согласуются с классической моделью индукции органогенеза при превышении в среде концентрации цитокини-нов над ауксинами. Наоборот, образование зачатков стебля мы наблюдали при внесении в среду одного ауксина или превышении его концентрации над кинетином. Однако данные других исследователей ( Ноуак, По-

1е2в1оУа> 1582; Тш1воп, ЗКаЫп, 1986), которым удалось получить регенеранты в каллусной ткани тыквенных культур только путем снижения в среде концентраций цитокининов, согласуются с нашими. Очевидно, такой эффект обусловлен особенностями культуры огурца и других тыквенных культур. В нашем случае процесс роста и развития побегов также зависел от генотипа (табл.5).

Регенеранты с нормальной ориентацией побега отсаживали на агат

Таблица 5

Морфологическая характеристика регенерантов огурца 5-ги селекционных генотипов, полученных из ткани первичного каллуса

п/п

Селекц. генотип

Число Высо- Число Корне-

побе- та наст, обра-

гов, побе-лист., зова-

ыт. га,см ит. на ниех I побег

Вступление Налив фазу бу- чие тонизации " органа 15-20 нов день вет-

- вле-

ния (усы)

есть (+)

нет (-)

Примечание

I. Р. (Ззениг.

х Pica) 16 5-7 3-4

2. (Звениг.

х Коек.т.) 5

3. (Звениг. х Моск.т. xPioa) 3

4. Сорт Тепличный посред- 26 ник

5. Л 420 • 16

5-7 Z-A

xxx

9-10 5 ххх З-о 6 х 3-5 4-7 х

края лист, пластинки некро-тизи-рованы

х КорнеобраЗование в крестах (макс, ххх)

ризованную среду ¿¿С без фигогормонов для укоренения. Через 30 дней роста на среде UC регенераты образовывали не менее 3-5 настоящих листьев, мощный стебель и уже в пробирках вступали'в фазу бутонизации (табл.5).

Регенеранты зацветали на стадии образования ими 3-5 настоящих листьев. По нашим данным, большинство цветков имело завязь, характерную для цветков женского типа. Процент1 укоренения в среде реге-нерантов различался незначительно и колебался от 1005? для генотипов Р} (Звениг. х Pi-ла), Л 420, сорта Тепличный посредник до 655 - для гибридов F-j (Звениг. х Моск.т. х Pica), (Звениг. х

Моск.т.). Полученные нами регенеранты огурца из первичной каллус-ной ткани пересаживали в почву и передавали в лабораторию селекции и семеноводства тыквенных культур ВНШССОК для оценки их хозяйст-

венно-ценных признаков. Наблюдения, проведенные в теплице 31 М'ЛССОК показали, что рвстения-регенеранты, полученные из первичного каллуса, не отличались от растений исходных форм.

Таким образом, было показано, что все генотипы, использованные нами, были способны регенерировать растения из первичного каллуса. Однако, для нааей цели, т.е. клеточной селекции, необходимо было индуцировать к морфогенезу не только первичные, но и субкуль-тивируемые ткани. Длительное выращивание каллуса в пересадочной культуре было необходимо: а) для накопления генетически измененных клеток и б) доказательств длительной устойчивости отобранных по определенному признаку клеток.

3.3.2. Способность к стеблевому морфогенезу пересадочных каллусов различных генотипов огурца

Длительно культивируемые тканл получали из перзичного каллуса, образованного из гипокотиля тех ке 5 генотипов. Для субкультивирования выбирали каллусы хорошо растущие и без ризогенеза. В течение первых Тй дней ткг;:ь росла на среде мС-о, затем кусочки ткани весом не более 60 мг переносили на среду для морфогенеза UC-7, дополненную регуляторами роста (wr/л): 6-БаП - 0,4; О,В; «¿-НУК -2,0; al. -НУК - 2,0 + 6-БАП - 0,5, либо на свежую среду ¡JC-ñ. Через 18 дней на среде ЛС-6 в каллусноя ткани отмечали появление темно-зеленых бугорков плотной ткани. Эти каллусы делили на 4 части и переносили для дальнейшего субкультивирования на среды ЫС-о,Ж-7. Пересадку проводили регулярно I раз в 3 недели в течение 3-х субкультивирований. Меристематические очаги, образующиеся в каллусной тканк, были в зависимости от генотипа или разбросаны (Гибриды), или сближены (сорт Тепличный посредник). На протяжении 3-х последовательных субкультивирований ткани, развившиеся на среде ЫС-6 и перенесенные на среду I/1C-7 образовывали меристематические очаги, число которых составляло 10-12 на 200 мг ткани. Пересадочная каллус тя ткань гибрида р1 (Ззенигор. х Моск.т. х Pica) была неспособна образовывать меристематические очаги уже при 2-м субкультивировании. Однако, во 2-м субкультивировании наблюдали стимуляцию стеблевого морфогенеза у селекционной линии Я 420 и сорта Тепличный посредник на среде МС-6, дополненной 6-ЕАП в концентрации 0,5 мг/л + J. -НУК в концентрации 2,0 мг/л; у гибрида (Звениг. х Моск.т.) на среде с »¿-НУК (2,0 мг/л) и сорта Тепличный посредник с 6-БАЛ (0,8 мг/л). Побеги формировались крайне редко и, как

'правило, из каллусной ткани светло-зеленого цвета с хорошим ростовым индексом. Наибольшее число регенерантов получено у сорта Тепличный посредник (7 на 10 кусочков каллусной ткани). При 3-м суб-культпзирозании на ту ге среду ¡¡IC-6 каллусные ткани всех испытанных генотипов полностью теряли способность к образовании меристе-матических очагов. Малая интенсивность образования побегов при суб-культигированки первичного каллуса, потеря способности к стеблевому морфогенезу уже при 3-й пересадке явилась серьезным препятствием Д1я использования каллусной ткани в селекции на устойчивость к фузариозу и получению устойчивых растений-регенерантов. Была сделана попытка усилить морфогенэтический потенциал пересадочных тканей путем использования в качестве эксплантов изолированных меристем.

3.3.3. Изучение морфогенного потенциала каллусной ткани, полученной кз апикальных меристем

Меристемы, вычлененные из 3-х дневных стерильных проростков, высаживали на питательную среду UC-7 с добавлением 6-БАЧ и oi -НУК, где культивировали в течение 2 недель. Каллус плотной консистенции и светло-зеленого цвета переносили на среду МС-8, содержащую 6-БАП и кинетин в-кон.0,4; 0,8 мг/л и 0,4; 2,0 мг/л соответственно. В течение 7-10 дней в каллусной ткани наблюдали появление темно-зеленых бугорков плотной ткани. В условиях эксперимента мы наблюдали большую количественную разницу между неорганизованным ростом кал' лусной ткачи из разных меристем в пределах одного варианта питательной среды и склонны объяснять это не только условиями вычленения меристемы, но и ее физиологическим состоянием в момент изолирования, В вариантах с кинетином в концентрации 2,0 мг/л число меристемати-ческих очагов в каллусной ткани зеленого цвета составляло 7-9 на 200 мг ткани. Развитие стеблевых зачатков из меристематических оча-.гов наблюдали на среде ¡йС-9, дополненной зеатином в концентрации 0,5 мг/л и —ПУК (0,5 мг/л). Побеги (1-2 на каллус)формировались в ткани хорошо растущих каллусов зеленого и ярко-зеленого цвета в в вариантах среды ¡.'С-9 с зеатином - 0,5 мг/л и при равных соотношениях оС-НУК и зеатина в концентрациях 0,5 мг/л. Однако, ни изолировать, ни укоренить эти побеги heim не удалось.

С целью увеличения морфогенетической способности, среду МС-9 дополняли глицином (2,0 мг/л), маннигом (30000 мг/л) я Aglio^ " (10 мг/л) (среда МС-Ю и MC-II, табл.1). На указанных средах ткань культивировали в течение I месяца. На среде MC-II с 10 мг/л -ic-.üj

из каллуса светло-коричневого цвета наблюдали образование зачатков побегов (3-6 на каллус). Таким образом, и в случае с меристемой, так же как л при использовании гипокотильных каялусоз в пересадочной культуре, мы могли вызвать начало морфогенеза побега, но не регенерацию растений, каллусы быстро теряли морфогенетнческую активность.

4. РАЗРАБОТКА СВШГИВНЫХ УСЛОВИЯ «ш ОТБОРА ЭХСШ1АНТ0В, УСТ0ЛЧ;«ШХ К ФИЛЬТРАТАМ ШЬТУРАЛЬНОЯ ШДКОСТИ ГРИБА • FU5A.aiUK И ТОКСИНУ Т-2 ИЗ PUSAIU'JU SP. ("SEHVA")

Неудача с получением растений-регенерантов из длительно культивируемых тканей, возникших на разных эксплантах, заставила нас искать иные подходы в селекции огурца in vitro на устойчивость к фузариозу.

Работа по отбору фузариозоустойчивых форм огурца включала:

I. Получение гриба фузариум в чистой культуре из пораженного тепличного растения огурца. 2. Получение и оценку активности куль-туральнзгс фильтрата (iw) iusariuin sp., подбор полулетальннх и летальных концентраций КЗ, стерильно введенных в культуральные среды. 3. Последовательный отбор на селективных средах жизнеспособных проростков из семян исходных селекционных генотипов и апикальных меристем, изолированных из 3-х дневных проростков. 4. Укоренение жизнеспособных регенерантов на средах МС без К5 Pusariun и пересадку в грунт теплицы на инфекционный фон с патогеном, оценку устойчивости регенерантов. 5. Получение ¡ц и а2 семенных поколений от устойчивых форм. Лзучали также влияние полулетальных и летальных концентраций чистого токсина Т-2 из iusarium sp. на рост проростков из семян и апикальных меристем.

4.1. Оценка активности и выбор оптимальной дозы КФ Fusarium, результаты опытов с проростками из семян и мерисгемннми тканями

Инкубацию гриба каждого из видов и смеси их осуществляли в течение 7,14,21 и 30 суток в термостате при t = 22°С без встряхивания. Наибольшей активностью в нашем эксперименте КФ всех 3-х видов Pusariun обладали на 7 сутки. Варианты селективных сред оценки устойчивости семяН и меристем содержали (%): 0 (контроль), 10, 20,50,70 разведения смеси ЛФ F.oxysporum, P.solani,F.monillforme. Экспланты меристем более чувствительны к действию КФ Fusarium,

чем семена. Бри культивировании меристем и семян на селективных средах ЬСЙ концентрация фильтрата гриба оказалась полулетальной дозой. Летальной в наяих экспериментах была концентрация Риэаг!-ил 702.

Таблица 6

Экспресс-метод оценки исходных^орм огурца на устойчивость к Фузариозу при отборе меристем на селективных средах с КФ Ризаг1иа вр. в сравнении с отбором растений в теплице на инфекционном фоне с патогеном

Исходные образцы

семей

Число меристем (шт.) Процент вина среде alC-2 + KS живаемости Fusarium в резуль- меристем тате отбора на среде

¡40-2*10 ?usarium

1-го

2-го

20£ 50% высаж. выжило выжило

2($ Ш

Оценка растений на инфекционном фоне з теплице, % выживших

1-ая 2-ая

в сЬазе в кон-1-го це ве-наст. гета-листа ции

I. Л 29,

(контроль) 492 17 5 0 29,4 0 23,5 2,11

2. Сорт Бес-

семянка 555 17 6 • 0 35,2 0 15,3 3,75

3. Г-395 I4Ü5 21 9 I 31,2 11,1 56,7 19,3

4. Г-1409 2007 2050 2040 15 в . 3 60,0 37,5 58,2 40,2

5. Г-443 743 715 385 14 8 7 57,1 67,5 61,6 25,1

6. Г-76 454 629 10 4 I 40,0 25,0 45,5 33,3

7. Г'-Кристалл 3724 х Suumier 15 2 0 13,3 0 26,9 19,2

Ö. Г-5Ш 671 765 12 10 10 . 33,3 100 83,0 82,5

С использованием изолированных меристем была проведена работа по экспресс-оценке сортового и линейного материала огурца на устойчивость к фузариозу. Дяя этого использовали Ризалит в концент-

• рациях 20/5 для первичного культивирозания и 50% для повторных цик-

лов. В результате оценки на селективной среде были отобраны гибриды Г-443, Г-5вЗ, характеризующиеся выживанием 87,5 и 100Л и не обнаружившие види.\;цх симптомов поражения фузариозом. Меристемы чувствительных к фузариозу образцов - сорт Бессемянка и ¿1 29 $ - на среде с К} погибли (табл.б).

Все гибриды, за исключением Г-538 и линии Л 29^ , расщеплялись в поколениях, однако, в большинстве случаев отбор меристем на селективных средах с КФ Fusarium отражал оценку растсний огурца в фазе настоящего листа и в конце вегетации на инфекционном фоне с патогенами. Можно считать, что отбор меристем и проростков из семян in vitro на инфекционном фоне с патогенами дает возможность быстро и точно определить устойчивость к поражению фузариозом также и корневой системы растений, тогда как существующие методы оценки селекционного материала на устойчивость к фузариозу в фазе 1-го настоящего листа в теплице давт'лишь относительное представление о степени устойчивости корневой системы растений к фузариозу.

4.2. ДсаОБые кривые на токсин 'Г-2 из Fusarium ар.

Материал in vitro 3-х генотипов, охарактеризованный нами по устойчивости к гй: устойчивый Г-588 (семья Ji» 765), среднеустойчи-вый Г-395 и неустойчивая линия Л 29^ , бил проверен нами также на средах с токсином Т-2 из Fusarium вр. в качестве селективного фактора. В работу включали также селекционный образец Harvest (¡(итай), устойчивость к фузариозу которого была нам не известна. При проращивании семян мы наблюдали хорошее совпадение между отбором на лО и токсине Т-2 (рис.2). Устойчивый селекционный образец -гибрид Г-586 не реагировал на высоки® дозы токсина до 100 мкг/мл, среднеустойчивый Г-395 имел JUigQ при концентрации токсина 85 мкг/мл, неустойчивая линия Л 2.9 ^ имела Д^д при концентрации токсина 10 мкг/мл. Селекционный образец ,P1 Harvest имел достаточно высокую устойчивость к токсину Т-2, Дд^о - 100 мкг/мл.

При использовании меристем устойчивого (Г-588), среднеустойчи-вого (Г-395) и неустойчивого (Л 2У$ ) селекционных образцов мы получили примерно такую же картину (рис.3). Селекционные образцы различались в показателях по зеличине побега, числу настоящих листьев.

Таким образом, наши данные могут свидетельствовать о возможности использования как rö, так и чистого токсина Т-2 для отбора устойчивых к самому патогену форм растений.

Число залз-hsспособных

проростков, %

1Í765

/Г-58У

□ Harveat

Г-355 ■

Концентрация

, мкг/мл *

Рис.2. Влияние концентраций Т-2 на жизнеспособность проростков из семян огурца 4-х селекционных генотипов

Число жизнеспособных меристем, %

Л 765 (Г-533)

А №765 /Г-583/

Г-395

Концентра-

1-.I 29 '-* ция т"2

5 10 25 50И f00 МКГ/МЛ

Рис.3. Влияние концентраций токсина Т-2 на жизнеспособность меристем огурца 3-х селекционных генотипов

4.3. Оценка устойчивости регенерантов в теплице на инфекционном фоне с патогеном и получение семян R1 поколения

Регенеранты резистентных форм в количестве 1-2 пт. пересаживали в вазоны с почвой, а 28 марта 1989 г. - в грунт теплицы ВНЖССОК на инфекционный фон с патогеном. В конце вегетационного периода селекционный материал бнл оценен на устойчивость к фузариозу по 4-х балльной шкале (Юрина, Беляева,1965). Поражение корневой системы фузариозом составило 4 балла для контроля (сорт 3S5), остальные селекционные образцы, отобранные на уровне меристем, в теплице на инфекционном фоне имели различный процент устойчивости к фузариозу: 2 семьи Г-443 (А"» 385, № 743) были практически устойчивы -I балл; секьк № 2050 (F-I40S), семья ;,"» 454 (Г-78) - 2 балла; семья

'№ 765 (Г-538) не имела видимых симптомов поражения фузарпозом -О баллов.

Таким образом, при оценке на инфекционном фоне регенерангц, отобранные на уровне меристем на селективных средах с ¿0/5 Л2 Fusarium имели достаточно высокуи устойчивость к патогену. Отобранные растения из меристем были также устойчивы к другим болезням. Поражение мучнистой росой - 0,5 балла, бактериозом - 2 балла. При отборе на К5> Fusarium sp. не было замечена влияния селективного фактора на морфологию высаженных растений. Все они были идентичны исходным, получаемым от семян растениям: слабоветвистые, преимущественно женского типа цветения.

От одного плода гибрида Г-588 765) удалось получить семена. Плод семьи № 765 имел длину 22 см, ширину 4 см, диаметр семенной камеры - 5 см. Окраска плода светло-зеленая, плод крупнобугорчатый (бугры редкие). Форма плода эллипсовидная, опушение белое. Все семена поколения были выполненными, всхожесть составила 100$.

4,4. Оцрния устоЯмиоостп растений от иемян поколения Г-568 (семья № 765) в условиях инфекционного фона с патогеном корневой гнили в зимней теплице и получение семян .поколения

Семена я1 поколения семьи 76о (Г-5ав) высевали в г. в зимней теплице БНЯИССО/i на фузариозном фоне с местной популяцией гриба фузариум ( F.oxyaporum, F.solani, F.monillforme). В конце вегетационного периода все растения были описаны и оценены по степени устойчивости корневой системы к фузариэзу (табл.7). Из 2-х плодов были получены семена r2 поколения в количестве 600 шт.

Данные табл.7 позволяют считать, что отобранные по устойчивости меристем и проростков in vitro к Fusarium растения сохраняют . это свойство в семенном поколении и, кроме того, метод отбора не влияет на морфо-физиологичеекиэ характеристики потомства.

Суммируя экспериментальный материал, изложенный в данной главе, можно заключить, что в селекции огурца на устойчивость к фуза-риозу помимо традиционных методов работы эффективно применение методов in vitro с использованием селективных питательных сред с К® Fusarium sp., токсином Т-2. Проращивание семян или получение жизнеспособных регенерантов из меристем, вьделенных из 3-х дневных проростков, на средах с Цф или токсином Т-2 из Fusarium ер. можно использовать как экспресс-метод в селекции огурца для более точной

Таблица 7

Описание семьи № 765 гибрида 588 при выращивании в теплице 8НШСС0К на фузариозном фоне с популяцией гриба Р.огуарогшп, Р.эо.Хап!, Р.пол3.11;?оггае

Наименование Ж» образца раст.

Наличие

горечи Характер б поверхности плодах зеленца

Оценка в Процент

конце ве- устойчи-

гетации вых рас-

Окраска на устой- тений

ррмрн чивос-ь без ви-семен- к фуг _ димых

ника риозу в симпто-оаллах мов поражения фузариоз.

Семья 765 после отбора на сел. средах с .$> гриба из апикальных меристем

I нет крупно- б й бугоочятый аельш 0

2 II * »1 » 0

3 II к и 0

4 И II II 0

5 « и 0

6 И и и 0

7 II II и — — -в— I

Г-588,отбираемый на патогенах исходный

материал семьи 765

нет

75Й

Селекц. № 148 I (контроль) 2

3

4

5

6

крупно- б й бугорчатый оель1И

3

3,5 3,5

4 3 I

0%

Примечание: балл 0 - без видимых симптомов поражения;

балл I - едва заметные поражения отдельных корней.

' оценки исходного материала, размножения его микрочеренкованнем, что значительно ускорит и упростит селекционной процесс, сократит затраты на подготовку грунта теплиц и проведение его заражения культурой патогена, что достаточно трудоемко.

8 результате проведенной работы по отбору эксплгнтов и расте-ний-регенерантов на K'i Fusariua sp. вьделена высокоустойчивая линия 765 из гибрида 5о8, от которой получены семена. На токсине Т-2 отобраны растения с повышенной устойчивостью к фузариозу от гибридов Г-395, Г-5&В; Л 29 и китайского образца ?1 Harvest из коллекции ВИР, работа на фузариозоустойчивость с которыми в лаборатории еще не проводилась.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Объект нашего исследования огурец Cucumis sativug L. не относится к числу растений, которые удобны для любых манипуляций с ними в культуре in vitro, что затрудняет создание клеточных технологий для облегчения и ускорения селс^псннш'о процесса, получения новых сортов и форм этого растения. Только в самоё последнее время появился ряд работ, в которых продемонстрирована возможность получения растений-регенерантов из изолированных протопластов и клеток, растущих в суспензии, а также описано получение трансформированных растений огурца с помощью векторов на основе Agrobac terim tuine-facien3 ( Chee, 1990; Slightoa, Chee, Sonsalea, 1990). Свою работу мы планировали как поисковую с целью разработки для огурца разных подходов, которые могли бы помочь селекционному процессу путем быстрого размножения генетически ценного материала огурца, получения вариантных форм растений-регенерантов (сомамонаяьных вариантов) ,-особенно вариантов, несущих гены устойчивости к патогенам и, наконец, разработкой методов селекции in vitro для огурца на устойчивость к Pusarium op.

В экспериментах на изолированных меристемах огурца нам удалось добиться успеха, оптимизировав состав питательной среды %расиге и Скуга (Ш) добавлением 30 мг/л аденина, что способствовало началу развития побега через 3 дня после изолирования и переноса на питательную среду меристем очень малого размера (250-300 мкм). Введение в состав модифицированной нами среды Ш дополнительно активированного древесного угля (10 г/л) значительно повысило жизнеспособность изолированных меристем ( <-■> 80%), нормализовало процесс роста побега и стимулировало образование и рост корней.

Разработанная технология позволяет за 4 последовательных черенкования пробирочных растений получить по расчетным данным от одной морлстемы 55СС0 клонально размноженных растений.

Клеточная селекцу.я на устойчивость к фузариозу, которая была одной из основных целей нашей работы, предполагала получение дедиф-ференцированных каллусных тканей ряда линий к гибридов огурца, с которыми водстся селекционная работа во ВНИЛСССМ. К сожалению, решить оту задачу полностью нам не удалось.

3 связи с этим, мы избрали другой подход для селек-;ии устойчивых к Ki и токсину форм огурца. В качестве источника генетического разнообразия по признаку устойчивости к фузариозу был использован традиционный метод гибридизации, обычный при получении более устойчивых к болезням форм огурца, но отбор-с использованием разных сортов, линий и гибридов проводился в асептических условиях на средах с добавлением КО или токсина. Предварительные данные, полученные наг.:и, показывало!-, что оценка устойчивости формы на инфекционном фоне с патогенами з теплице в ряде случаев коррелирует с устойчивостью меристем к КФ или токсину в условиях, in vitro и, таким образом, предложенный нами метод монет использоваться как экспресс-метод для оценю' селекционного материала на устойчивость к бузарио-зу. В ходе наших экспериментов на среде с И Fuaarium sp. были выделены устойчивые к фузариозу растения, полученные из меристем, • и от этих растений получены семена. Растения, выращенные из этих се-йян, так;;е оказались устойчивы к фузариозу при проверке их на инфекционном фоне с патогеном и сохранили свои морфологические характеристики. Отобранные на токсине Т-2 коллекционные и селекционные образцы в количестве 4 растений с высокой устойчивостью к фузариозу, будут использоваться в работе лаборатории селекции и семеноводства тыквенник культур ВНПйССОгС по созданию фузариозоустойчивых сортов.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны технологии клональнаго микроразмнонения растений огурца с использованием апикальных меристем 3-х дневных пробирочных проростков и пазушных меристем взрослых плодоносящих растений. Разработанные технологии позволяют за 4 последовательных субкультивирования расчетно получить от одной меристемы около 50 тысяч растений полностью идентичных исходному образцу..

2. Высокая шзнеспособность (80,о) апикальных меристем малых

размеров ( ^ 250 мкм), быстрый переход их к формированию побега, корнеобразованкю, нормальному развитию пробирочных растений без витрификации к ьекроза верхушек достигнуты оптимизацией питательной среды !£ добавлением 30 иг/л аденина и 10 г/л активированного угля.

3. Созданные технологии быстрого клонального микроразмножения огурца ускоряют селекционный процесс, позволяют включать в него ценные малосемянные линии и "спасать" гибнущие плодоносящие растения при необходимости их размножения для селекционных целей.

4. Гипокотили, семядоли и меристемы растений огурца разных линий и сортов легко образовывали первичные каллусы в ряде случаев способные к ризо- или гекмаорганогенезу. При эксплантировании фрагментов гипокотиля из образовавшихся зачатков побега удалось получить растения идентичные исходным.

5. Пересадочные каллусные ткани всех испытанных генотипов, вкращиваемые на средах с различными концентрациями ВДВ. были с.пл_ иибны образовывать только меристематические очаги, в которых очень редко начинали развиваться почки.

б. Предложен экспресс-метод оценки селекционного материала огурцов на устойчивость к фузариозу in vitro с использованием культурального фильтрата (К£) и Т-2 токсина Fusarium зр. Для ряда линий, гибридов и сортов огурца установлена положительная корреляция меаду степенью устойчивости in vitro изолированных меристем и прорастающих семян и устойчивостью растений этих генотипов к патогену в тепличных условиях. Разработана технология, позволяющая быстро отбирать устойчивые образцы и ускорять процесс создания фузариозоустойчивых сортов огурца.

7. В результате работы Еыделены высокоустойчивая к фузариоз-ному увяданию форма огурца № 765, два семенных поколения которой также сохранили устойчивость к патогену в условиях инфекционного фога в теплице ВНШССОК; на селективных средах in vitro в кульТуре меристем отобраны устойчивые растения из Г-395, неустойчивой линии Л 29^ и китайского образца Harvest.

Рекомендации практической селекции

I. Способ клонального микроразмножения растений огурца культурой апикальных меристем (250-350 мкм) 3-х дневных проростков,пазушных меристем взросли плодоносящих растений на среде №-2 с последующим микрочеренкованием каждые 10-14 дней на среде ''С-З.сле-

дует использовать для размножения сортового и линейного материала • огурца, образующего мало семян, и сохранения генотипов с ценными признака:.«. Это позволит в течение 4-х последовательных субкульти-внрован'.'.й получать расчетно от одной меристемы до 55 тыс.клонально размноженных растений.

2. Традиционный метод гибридизации, обычный при получении устойчивого к болезням различного селекционного материала, может быть дополнен экспресс-методом отбора меристем и проростков в асептических условиях в течение 7-10 дней на средах kC, MC-?. с добавлением 50$ КЗ или 50 мкг/мл токсина Т-2 из Fusarium sp. последующей оценкой пора-хания корней пробирочных растений фузариозом, размножением жизнеспособных регенерантов микрочеренкованием.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Маркова Н.В., Вутенко Р.Г., Донец Н.В. Использование культуры меристемы для клонального размножения огурца ia vitro // Доклады BAGXHi'UÍ. -1989. -I:'» 8. -C.II-I4.

2. Маркова H.B. Клональное микроразмножение огурца ( Cucumis eativus L.), как метод сохранения ценных селекционных генотипов // Роль науки в интенсификации сельского хозяйства: Тезисы докладов Всесоюзной конференции, апрель, 1989. -Омск. 1990. -С.114.

3. Markova K.V. , Butenko Ä.G., Donets Ii.7. Use of meristem culture for clonal propagation of cucuaiber in vitro // Soviet Agricultural BCienses.-H.-Y., 1989. -N 8. -C.Í4-1S.

4. Маркова H.B. Размножение in vitro селекционных линий огурца ( Cucumis sativas L.) из изолированных меристем // Молодые ученые - сельскому хозяйству Нечерноземной зоны: Тезисы докладов научно-производственной конференции Одинцовского р-на, Московской обл., январь. 1989. -1.1.. 1990. -С.125.

5. ilapsoва Н.В. Использование биогехнологических методов в селекции огурца £ Cucumis sativus 1>.) на резистентность к фуза-риозу, вызываемому грибаки рода Fusarium // Тезисы докладов 1У Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки, 15-20 апреля, I99G. -Минск, IS90. -С.120.

6. Маркова Н.В., Бутенко Р.Г., Донец U.E. Способ клонального микроразмнокения растений огурца ( Cucumis sativua L.)- // Заявка на изобретение № 4773443. Заявлено 12.12.89, положительное решение 31.01.91. - 12 с.