Методы IN VITRO в селекции огурца (Cucumis Sativus L.) на устойчивость к фузариозу

Ткачева, Анна Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Методы IN VITRO в селекции огурца (Cucumis Sativus L.) на устойчивость к фузариозу
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Методы IN VITRO в селекции огурца (Cucumis Sativus L.) на устойчивость к фузариозу"

На правах рукописи

УДК 635-152:635.63.631.147

ТКАЧЕВА Анна Анатольевна

МЕТОДЫ IN VITRO В СЕЛЕКЦИИ ОГУРЦА (CUCUMIS SATIVUSL.) НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗУ

Специальности: 06.01.05 - селекция и семеноводство 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 2007

003053362

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский кдучко-ггселсдоватсльсхии ккститут овсщсиодства РссссльлОЗылйдстКгТ s 2002-2006 гг.

Поляков Алексей Васильевич

Примак Алексей Павлович

Калашникова Елена Анатольевна

ГНУ Всероссийский научно — исследова тельский институт селекции и семеноводства овощных культур

Защита диссертации состоится « 25 » январи 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.022.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте овощеводства по адресу: 140153 Московская обл., Раменский район, д. Верея, строение 500, ГНУ ВНИИО РАСХН.

Факс (49646) 2-43-64

E-mail: vniio@trancom.ra. www.vniio.com

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института овощеводства.

Автореферат разослан - црЬ » декабря 2006 года

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета

JI.H. Прянишникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из важных направлений селекции является создание форм, сортов и гибридов растений, устойчивых к биотическим факторам. Это обусловлено большими потерями урожая сельскохозяйственных растений, вызванными поражением их грибными, бактериальными, вирусными болезнями и повреждением вредителями. Снижение урожайности сельскохозяйственных культур до 30% является следствием широко распространенного и вредоносного заболевания-фузариоз (Коновалов Ю.Б., 1999). Наиболее перспективным способом зашиты растений от фитопатогенов является селекция, создание комплексно устойчивых сельскохозяйственных культур. Однако продолжительность периода создания сортов и гибридов достигает 10 и более лет, при этом часто степень устойчивости растений к вредным организмам является недостаточной и далеко не всегда отвечает требованиям производства (Калашникова Е.А., 2003).

Решение большинства практических задач селекции во многом может определяться эффективностью вовлечения современных методов в селекционный процесс. Значительное место в решении этих задач занимает клеточная селекция, основанная на отборе клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и регенерации из них растений (Поляков A.B., 2003; Калашникова Е.А., 2003).

При использовании методов клеточной селекции в нашей стране и за рубежом достигнуты значительные результаты: созданы устойчивые линии люцерны (Мезенцева О.Н., 1992) и льна (Поляков A.B., 2000; Пролетова Н.В., Поляков A.B., 2003) к фузариозу; томатов (Нгуен Х.М., 1991) и моркови (Калашникова Е.А., Ипатова Н.В., 2004) к альтернариозу; картофеля - к фигоф-торозу и бактериальной гнили (Калашникова Е.А., 2000). Благодаря достижениям клеточной селекции стало возможным получение in vitro растений-регенерантов с измененными признаками, среди которых селекционер может отобрать устойчивые к болезням формы и при этом сохранить положительные черты исходного образца (Бутенко Р.Г., 1999). Однако, несмотря на определенные успехи, имеющиеся в селекции огурца, до настоящего времени не созданы сорта и гибриды, устойчивые к фузариозлому увяданию. В связи с этим необходимо шире использовать в селекционном процессе методы in vitro.

Цель и задачи исследований

Целью исследований являлось усовершенствование методов in vitro применительно к культуре огурца для повышения эффективности селекционного процесса этой культуры и создания форм, характеризующихся повышенной устойчивостью к фузариозу.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- оптимизировать факторы, влияющие на морфогенетическую способность эксплангов огурца;

- разработать селективные условия для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к фильтрату культуральной жидкости (ф.к.ж.) гриба Fusarium oxysporum и фузариевой кислоте (ф.к.);

- усовершенствовать элементы методики экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на проращивании семян на ф.к.ж. гриба F. oxysporum и культивировании проростков in vitro на селективных средах, содержащих ф.к.ж. гриба F. oxysporum;

- оценить полученные от гибридов и линий формы огурца на устойчивость к фузариозу на искусственном инфекционном фоне с использованием традиционных методов.

Объект исследований - методы культуры ткани и органов в селекции огурца и методы селекции на устойчивость к фузариозу.

Предмет исследований - каллус, почки, побеги, сегменты растений, растения - регенераты, семена огурца.

Научная новизна. Усовершенствована методика экспресс-опенки огурца на устойчивость к фузариозу, основанная на культивировании семян и растений на ф.юк. и селективной среде, содержащей ф.кж. гриба F. oxysporum в концентрации 10% в условиях in vitro, позволяющая в течение 12 и 14 суток оценить селекционный материал и выделил, образцы с повышенной устойчивостью к фузариозу.

Усовершенствован метод клеточной селекции in vitro, основанный на ступенчатом культивировании эксплангов и трансплангов огурца на селективной среде, содержащей ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрации 10% и на среде без селективного фактора, позволяющий получать каллусные линии растения огурца с повышенной устойчивостью к фитопатогену.

Оптимизированы условия получения растений-регенерантов огурца. Подобран режимы стерилизации семян и сегментов растений для введения в культуру in vitro. Определено соотношение фитогормояов в питательной среде для культивирования эксплантов и трансплантов.

Практическая ценность работы состоит в том, что оптимизирован процесс получения растений - регенератов огурца in vitro на основе верхушечных почек, ги-покотильных сегментов и каллуса. Получены растения - регенераты, характеризующиеся повышенной устойчивостью к фузариозу. Разработаны и опубликованы методические рекомендации «Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию методами in vitro» (2006 г.).

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы

и предложения подтверждены экспериментальным и исследованиями, статистической обработкой полученных данных.

Апробащк! работы. Оспс.бкыс результаты лчспсримешалыюй работы по диссертации, выводы и предложения были доложены или представлены на Ш Международной конференции, посвящен) toit памяти Б.В. Квасникова (Москва, 2003), Международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (Москва, 2004), Международной научно-практической конференции «Проблемы научного обеспечения овощеводства юга России» (Краснодар, 2004), Ш Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2006).

Основные положения диссертации, выноснмые на защиту:

- элементы технологии получения растений-регенерантов огурца в условиях

/и xïÎfQ '

- система селективных условий для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к ф.к.ж. гриба F. oxyspomm и ф.к.;

- усовершенствованный метод экспресс-оценки огурца на устойчивость к фу-зариозу.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы, содержащего 155 наименований, в том числе 37 иностранных авторов и приложений.

Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 таблицами, 20 рисунками.

УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в тепличном грунтовом боксе «Селекцентра» и в условиях отдела биотехнологии ГНУ ВНИИО, расположенном в Раменском районе Московской области в период 2002 - 2006 тт.

В качестве исходного материала использовали 12 образцов огурца селекции ГНУ ВНИИО, характеризующиеся различной полевой устойчивостью к фузариозу: высокоустойчивые - гибриды F| Натали, Норд, Тополек; среднеустойчивые - гибриды Fi Восход, Кристалл, Костик, Дуняша, Рябинушка; слабоустойчивые - гибрид F! Зодиак; среднеустойчивые линии: J1-138, Л-340 и восприимчивая линия J1-113. Семена образцов огурца были

предоставлены заведующей лабораторией тыквенных культур отдела селекции ГНУ ВНИИО, кандидатом с.-х. наук Н.К. Бирюковой.

Лабораторные исследования проводили в соответствии с «Методическими указаниями по культуре ткани и органов в селекции растений» (Бутен-ко Р. Г., 1964; БутенкоР. Г., Хромова Л. М, Седнина Г.А., 1984).

Селекцию на устойчивость к фузариозу проводили согласно методике, описанной в статье «Разработка способа предварительной оценки растений огурца на устойчивость к фузариозу» (Настенко Н.В., Шмыкова H.A., Балашова H.H., Кушнерева В.П, 1994).

В опытах использовали питательную среду MS (Murashige Т., Skoog F., 1962), состав которой изменялся в зависимости от этапа культивирования.

В качестве селективного фактора использовали ф.к. и ф.к.ж. гриба F. oxysporum. Длительное культивирование гриба F. oxysporum осуществляли на агаризованной среде Чапека при температуре 4°С. Ф.к.ж. получали путем культивирования гриба в течение 30 суток на жидкой питательной среде Чапека при температуре 25°С.

Математическую обработку экспериментальных данных проводили на основе методов математической статистики по методикам, опубликованным у Б.А. Доспехова (1979).

Дисперсионный и регрессионный анализы проводили на ПЭВМ с использованием пакета программ БИОСТАТ и ECXEL 7,0.

Суммарное содержание фенольных соединений в растениях огурца, определяли в соответствии с «Колориметрическим методом с использованием реактива Фол и на-Дениса» (Запрометов М.Н., 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Оптимизация факторов, влияющих на морфогенетическую способность эксплантов огурца

1.1. Стерилизация семян и сегментов растений огурца дли введения в культуру in vitro

Стерилизация необходима для удаления с поверхности семян и сешентов ве-гсгирующнх растений инфекции, которая может развиться при дальнейшем культивировании эксплантов in vitro и вызвать поражение и гибель растительного материала В связи с этим цель данного этапа - получение стерильных проростков и эксплантов.

Проведенные исследования позволили подобрать режим стерилизации. Наибольшее число стерильных морфогенных проростков (86,7% от числа культивируемых) было получено при стерилизации семян раствором гипохлорита натрия в концентрации 1% и экспозиции 15 мин (рис. 1).

Исследования по изучению режимов стерилизации сегментов вегетирующих растений огурца 1% - ным раствором гипохлорита натрия в течение 10,15,20 и 25 ми-

нут показали, чго наибольший выход стерильны* морфогеннык экаишпов 170,0? ;>> наблюдался после Ю-минупюго воздействия стерилизующим вещесшом (рис, 2).

10 15 20 30 э^епо^ици^, минут

ЕЗ стерппьных '.цх ■ стерильных неморфогенных С] инфицированных

Рис. 1. С тернличания семян огурца ] % раствором I ипохлориха натрия

ПОЛУЧС КО

100 -I ЭС1 | »0 го ■ во 60 40

■¿и ю -о

ЭИСГ1С.1ИЦИЯ.

аз ст(;рилькыи * ' •::>!- 11.11.1' нйморфоген* |ыл ; , инф^цирок^нмых [

Рис, 2. Стерилизация сегментов вегетирукмцих растений огурца 1% раствором ш по хлор и та натрия

1.2, Обоснование выбора экс п лапт о в

Выбор экспланта играег существенную роль в проведении клеточной селекции. В наших исследования с целью изучения морфоге нети ческой активности огурца и получения морфогенного каллуса в качестве зкеплантов использовали апикальнйе почки, еёйялоли и гинокотнльные сегменты.

Проведенные исследования показали, что при культивировании апикальных почек на питательных средах М$-0 и М5-0.1 выявлены существенные различия по геммо и ризогенезу. Наибольшее число геммогенных экс-пдаитов (75%) получено на питательной среде М$-0,1, рнзогенных (33,3%) -

на среде МБ-О. Культивирование апикальных почек на исследуемых средах приводило к индуцированию каллусогенеза. При пассировании семядолей на питательную среду МБ - 0, морфогенные экспланты не образовывались. Однако на питательной среде МБ - 0,1 морфогенез отмечен у 16,6% эксплантов. При культивировании гипокотильных сегментов на этих средах наибольшее число каллусогенных эксплантов (47%) образовывалось на среде М8-0,1, на которой геммогенных экспланты не образовывались (табл.1).

Таким образом, установлено, что для получения морфогенного каллуса огурца в качестве первичных эксплантов эффективно использовать ги-покотильные сегменты.

1.3. Изучение влияния фнтогормонов на морфогенстическуго активность тканей огурна

Изучение влияния фитогормонов на морфогенетическую способность гипокотильных сегментов огурца проводили с использованием питательной среды МБ, содержащей 30 г/л сахарозы, 7 г/л агара. Гипокотильные сегменты огурца помещали на питательную среду с различным составом и концентрацией фитогормонов. Уже на 6-7 сутки культивирования на базаль-ной части гипокотильных сегментов образовывались утолщения в виде разросшихся тканей, на которых в последствии формировалась каллусная ткань от желтоватого и светло-желтого до темно-зеленого цвета.

Таблица 1 - Морфогенез огурца в условиях in vitro

Среда Экс-плант Изучено эксплантов, ШТ- Получено эксплантов, %, + Sp Число ночек на эксплант, X ср. .

всего геммогенных ризо-генных каллусогенных

MS-0* а.п. 24 87,5+6,7 54.2+10,2 33,3+9.6 0 0.4

с. 36 0 0 0 0 0

г.с. 36 25,0+7,2 0 25,0+7.2 0 0

MS-0,1** а.п. 24 83,3+7,6 75,0+8,8 8.3+5,6 0 1,9

с. 36 16,6+6,2 0 5,5+3.8 11,1+5,2 0

г.с. 36 47,2+8,3 10,0+5,0 0 47,2+8,3 0,3

Примечание: а.п.- апикальные почки, е.- семядоли, г.с. - гипокотильные сегменты: * - МБ-О -безгормональная среда; **М5-0,1 - среда, содержащая 6-БАП и а-НУК в концентрациях 0,1 мг/л

Культивирование эксплантов огурца в условиях in vitro в течение 48 суток на среде MS, содержащей сахарозу в концентрации 30 г/л, агар-7 г/л и фитогормоны: 6- БАП, о-НУК и 2,4-D в концентрации 0,1 мг/л; а также 2 ip в концентрации 0,1 мг/л и 0,25 мг/л позволило получить морфогенный каллус у 11,1 % - 30,6% культивируемых тканей (табл. 2).

Таблица 2 - Морфогенез пшокотильных сегментов огурца в зависимости от концентрация! фигогормонов в среде (48 суток культивирования) (число морфогенных зксппянтов, %), п = 36

Гормоны 2,4-1> ¡з-НУК

концентрация, мг/л 0,1 0,5 1 2 од 0,5 1

21р 0,1 22,2+6,9 5,5+3,8 0 0 16,7+6 2 5,5+3,8 2.8+2,7

0,25 30,6+7,7 8,3+4,6 0 0 16,7+6.2 13,9+4,6 4,1+5,2

0,5 13,9+5,7 5,5+3,8 2,8+2,7 0 13,9+4,6 8,3±4,6 2,8+2,7

6- 0,1 11,1+5,2 2,8+2,7 0 0 25,0+7,2 11,1 ±5,2 2,8+2,7

БАП 0,5 8,3+4,6 0 2,8+2.7 0 13,9+4,6 5,5+3,8 11,1+5,2

1.0 8,3+4,6 2,8+2.7 0 0 16,7+6,2 19,4 ±6,6 8,3+4,6

Интенсивное образование морфогенного каллуса (75 - 100%) наблюдалось на трансплантах всех изученных образцов на среде МБ. содержащей 6-БАП в концентрации ОД мг/л и «-НУК - 0,1 мг/л. При культивировании на среде, содержащей 6-БАП в концентрации 0,1 мг/л и 2,4 Д - 0,1мг/л; а-НУК-0,1мг/л и 2 ¡р-0,5 мг/л; 2 ¡р - 0,25 мг/л число трансплантов, образующих морфогенный каллус не превышало 50% (табл. 3).

Таблица 3 - Морфогенез огурца при культивировании гипоксгальных сегментов на среде МБ с различным содержанием фитогормонов, п = 160

Линия, П10-ридр] Концентрация фшпшрмонов Число трансгпантов, образующих морфогенный каллус

шт. %+<*>

НагаггиР, 6-БАП - 0,1 мг/л + о-НУК - 0Дмг/л 120 75,0+.3,4

6-БАГ1 - 0,1 мг/л+2.4 Д-ОЛмг/л 40 25.0+3,4

а-НУК- 0,1мг/л +2 ¡р-0,5мг/д 50 31.3+3,6

2 ¡р-0Д5 мг/л+2,4 Д-ОДмг/т 60 373+3,8

Восход Р, 6-БАП - 0,1 мг/л +а-11УК -0,1 мг/л 140 87Д+26

6-БАП - ОДмг/л+2,4 Д-0.1мг/л 40 25,0+3,4

а-НУК-0,1 мг/л +21[>0_5мг/л 80 50,0+3,9

21р-0,25\с~/л +2,4 Д-0,1мг/л 60 37.5+3,8

Л-113 6-Б АП-0Д мг/л+а-ПУК-0 Д мг/л 160 100

6-БАП- 0,1 мг/л +2,4 Д-0.1 мг/л 40 25,0+34

аА 1УК- 0,1 мг/л+2 ¡р-0,5мг/л 40 25,0+3.4

2 ¡р-0Д5мг/л+2,4 Д-ОДмг/л 80 50,0+3,9

Таким образом, для получения хорошо пролиферирующеЙ морфо-генной каллусной ткани огурца необходимо использовать питательную среду М\ содержащую 6 - БАМ и «-НУ К в концентрациях 0.1 мг/л.

1.4. Получение растений-регенеранток огурца, укоренение и адаптация к помненным условиям

С целью повышения укореняем ости и эффективности размножения, побеги, полученные на основе эксплаитов, переносили на агар изо ванную питательную среду VIне содержащую фитогормоны. Через 30 суток ре ген е-ранты образовывали не менее 3—5 настоящих листьев и корней. Культивирование побегов на этой среде позволило получить 60 жизнеспособных ре гея е-рантое. в том числе 18 регенерантов от гибрида Р, Натали, 22 - гибрида Р, Восход и 20 - линии Л-113 (рис. 3).

Рис. 3. Укореияемость побегов растений огурца на питательной среде MS-0

Укорененные побеги адаптировали и пересаживали в сосуды с почвой. Морфологическая признаки растений -регенерантов в первые дни роста или адаптации отличались от проростков растений данных образцов, полученных из семян, размерами и формой листьев, цветом растений. Однако ко времени цветения все различия нивелировались и расте ни я—регенеранты не отличалась от обычных растений, полученных из семян.

2. Разработка селективных условий дли создания in vitro тканевых культур, устойчивых к фильтрату культуральной жидкости гриба F. ох-ysporum и фузарисвой кислоте

2.1. Изучение влияния концентрации фильтрата культуральной жидкости гриба R oxysporum на тканевые культуры огурца in vitro

Основным принципом клеточной селекции является длительное культивирование клеток и тканей в стрессовых условиях. Для исключения

возможности случайного отбора клеток, возникших вследствие физиологической адаптации или определенного их состояния дифференцировки, клетки возвращают в неселективные условия, а затем процесс культивирования кал-лусной ткани в селективных условиях возобновляют.

В наших исследованиях изучено влияние различных концентраций ф.к.ж. гриба Г. оху.чрогит на процесс дедифференциации клеток эксплантов образцов огурца. Первичную каллусную ткань получали от гипокотильных сегментов путем культивирования их на оптимизированных нами ранее питательных средах, содержащих ф.к.ж. патогена в концентрациях 2,5%; 5%; 7,5% и 10%.

Исследования, проведенные на каллусной ткани, полученной от стерильных проростков огурца, выявили общие особенности их поведения в стрессовых условиях, независимо от применяемой схемы селекции.

Таблица 4 - Морфогенез тканевых культур огурца в условиях in vitro на среде, содержащей фильтрат культуральной жидкости F.oxyspomm, п = 100

Концентрация ф.к.ж. % Получено морфогенных трансплантов Получено почек

всего в т.ч. с почками всего, шт. в т.ч. на 1 экспл., X ср.

шт. % шт. %

0 95 95+2,2 75 79+4,1 120 1,3

2,5 80 80+4,0 60 75+4,3 105 1,3

5 75 75+4,3 55 73+4,4 90 1,2

7.5 70 70±4,6 | 40 57±4,9 70 1,0

10 35 35-4,7 1 10 28+4,5 30 0,8

По результатам культивирования морфогенного каллуса на селективных средах, содержащих ф.к.ж. в концентрации 2,5%; 5%; 7,5% и 10% выявлены существенные различия по частоте образования почек и побегов. При этом в вариантах 2,5%; 5,0% и 7,5% ф.к.ж. не было отмечено существенного снижения морфогенетической активности каллусных клеток. Интенсивность морфогенеза снижалась более чем в 2 раза при культивировании эксплантов на среде с 10% ф.к.ж. по отношению к вышеперечисленным вариантам среды (табл. 4).

Последующее культивирование каллусной ткани на среде без селективного фактора (2 пассаж) привело к восстановлению пролиферирующей активности каллусных клеток.

При повторном культивировании (3 пасаж) каллусных клеток на среде с ф.к.ж. патогена наблюдалась гибель каллусной ткани и формирование рыхлой обводненной ткани. Присутствие в питательной среде ф.к.ж. гриба в различных концентрациях заметно ингибировало пролиферацию каллусной

ткани. С повышением концентрации ф.к.ж. уменьшался морфогенез на 2260% (табл.5).

Таблица 5 - Морфогенез каллусных культур огурца in vitro на среде, содер жащей фильтрат культуральной жидкости F. oxysporum, п = 150

Концентрация ф.к.ж. % Получено морфогеииых зкеплантов Получено ночек

] пассаж 2 нас саж 3 пас саж всего в т.ч. с почками всего, шт. в т. ч. с почками на 1 экспл.. X ср.

шт. % шт. %

0 0 0 150 100 143 95+1,8 164 1.1

10 69 46+4,1 60 86±2,8 62 0.8

10 0 147 98±1,1 138 94+1,9 140 1.0

10 111 74+3,6 56 50+4,1 62 0,6

5 0 0 147 98+1,1 141 95+1,8 148 1.0

10 108 72+3,7 59 41+4,0 64 0,6

10 0 135 90+2,4 128 94+1,9 128 1,0

10 105 70+3.7 90 86+2,8 76 0,7

10 0 0 144 96+1,6 136 94+1.9 146 1,0

10 90 60+4,0 79 87+2,7 80 0,8

10 0 138 92+2,2 132 95+1,8 143 1.0

10 120 80+3,3 84 70+3,7 87 0,7

Исследования показали, что получение устойчивых растений-регенерантов следует проводить путем культивирования каллусной ткани на среде MS, содержащей ф.к.ж. в концентрации 10% (табл. 5).

Культивирование каллуса на селективных средах в течение трех пассажей позволило отобрать каллусные линии, устойчивые к ф.к.ж. гриба F. ох-yspomm.

2.2. Изучение влияния фузариевой кислоты на морфогтнетическую активность тканей огурца при кульпшировании in vitro

Каллусные культуры первого пассажа культивировали на селективных средах, содержащих ф.к. в концентрациях 2,5 мг/л; 5,0 мг/л; 7,5 мг/'л и 10 мг/л. Снижение морфогенетической активности каллусных клеток происходило при увеличении концентрации ф.к. в среде до 7,5 -10,0 мг/л (табл. 7).

Через 20 суток морфогенный каллус, сформированный на основе ги-покотильных сегментов огурца, переносили на свежую среду без токсина и культивировали в течение 14 суток. Было отмечено, что каллусная ткань, сформированная на селективной среде, чаще всего была неоднородной и со-

стояла из рыхлых, с повышенной оводненностыо и плотных структурированных тканей со слабо выраженными меристематическими очагами.

Таблица б - Морфогенез тканевых культур огурца in vitro на среде, содержа-шей фузариевую кислоту F. oxysporum, п ~ 100

Концентрация ф.к., % Получено морфогенных эксплантов Получено ночек

всего в т.ч. с почками всего, шт. в т.ч. на 1 экспл., X ср.

шт. % IUT. %

0 100 100,0 90 79±4,1 135 1,4

2,5 100 100,0 80 75+4,3 120 1,2

5 100 100,0 75 73+4,4 95 1,0

7,5 95 95,0±2,2 50 57±4,9 85 0,8

10 60 60,0±4,9 25 28+4,5 40 0,4

В ходе эксперимента было выявлено, что у эксплантов, культивируемых на питательной среде, содержащей ф.к. в концентрации 10 мг/л наблюдали ингибирование морфогенетической активности, что позволило проводить отбор устойчивых клеток и получать на их основе побеги и регене-ранты (табл. 6).

Таблица 7 - Влияние фузариевой кислоты F. oxysporum на тканевые культуры огурца в третьем пассаже в условиях in vitro, п = 150

Концентрация ф.к. % Получено морфогенных эксплантов Получено почек

1 пас саж 2 пас саж 3 пас саж всего вт. ч.с почками всего, шт. в т. ч. на 1 экспл.. Хер.

шт. % шт. %

0 0 0 150 100 144 96+1,6 191 1,4

10 78 52+4,1 65 83+3,1 63 0,8

10 0 147 98+1,! 139 95+1,8 178 1.2

10 114 76+3,5 60 53+4,1 80 0,7

5 0 0 150 100 143 95+1,8 189 1.4

10 111 74+3,6 62 56+4,1 67 0,6

10 0 144 96+1,6 132 95+1,8 170 1.2

10 102 68+3,8 58 57+4,0 73 0,7

10 0 0 147 98+1,1 138 94+1,9 188 1,4

10 99 66+3,8 79 79+3,3 84 0,8

10 0 144 96+1,6 132 92+2,2 146 1.0

10 129 86+2.8 84 65+3,9 90 0,7

Третий пассаж каллуса проводили на селективной среде, содержащей ф.к. в концентрации 10,0мг/л, при этом было отмечено отличие в росте и развитии каллусов, сформированных первоначально на селективной и неселективной средах. Так, у каллуса, сформированного на селективной среде, при переносе вновь на среду с токсином наблюдали индукцию пролиферации каллусной ткани (табл. 7). В результате исследований было установлено, что при наличии в среде 10,0 мг/л ф.к., наблюдалось снижение морфогенеза.

Используя вышеперечисленные методы, нами были получены формы огурца, характеризующиеся повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию, которые в последующем оценивали в условиях искусственного инфекционного фона.

3. Усовершенствование экспресс-оценки огурца на устойчивость к фуза-риозу

3.1. Усовершенствование экспресс-оценки огурца на устойчивость к фу-зариозу, основанной на проращивании семян на фильтрате культураль-ной жидкости гриба Г. охуярогит

Существует метод предварительной оценки огурца на устойчивость к корневым гнил ям в лабораторных условиях, основанный на проращивании семян на фильтровальной бумаге, смоченной токсином Т - 2 гриба ох-узрогит. Однако этот метод не всегда доступен в связи с трудностями производства этого токсина. Поэтому нами была изучена возможность использования в качестве селективного фактора ф.к.ж. гриба Г. охуяропт при оценке устойчивости огурца к фузариозу.

Таблица 8 - Всхожесть семян и длина первичного корня 5 суточных проростков огурца при культивировании фильтрате культуральной жидкости, п=50

Лилия, гибрид Р] Концентрация ф.к.ж. К Взошло семян Дшшакорач, мм

охуярогшп, % шт. % Хер. %

Натали р! 0 50 100 595 100

10 49 98+1,9 30

50 2 4+2,7 02 03

100 0 0 0 0

0 48 96+2,7 54,6 100

Восход 10 46 92+3,8 15,6 28р

50 0 0 0 0

100 0 0 0 0

0 46 92+3,8 47,6 100

Л- ИЗ 10 41 82+5,4 93 19,5

50 1 2+!.9 1 2,1

100 0 0 0 0

В результате проведенных исследований выявлено, что при проращивании семян всех образцов на ф.к.ж. в концентрациях 50% и 100%, рост icop:;e?i был полностью ингибирован. При проращивании семян на 10%-ном автоклавированном ф.к.ж., наблюдалось существенное ингибирование прорастания. При этом обнаружены различия в прорастании семян разных образцов. У восприимчивой линии Л-113 длина корней была соответственно на 40% и 48% меньше по сравнению с более устойчивыми гибридами Fj Восход и Натали (табл. 8).

Наилучшие результаты были получены при проращивании семян огурца на ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрации 10%, что позволило получить селекционный материал с повышенной устойчивостью к фузариозу. Анализ полученных данных свидетельствует о возможности проведения экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу при использовании 10% -ного автоклавированного ф.к.ж. Предложенный метод является косвенной оценкой образцов на устойчивость к фузариозу и позволяет в лабораторных условиях ускоренно оценить селекционный материал на устойчивость к F. oxysporum и выявить растения огурца с повышенной устойчивостью к этому фитопатогену.

3.2. Усовершенствование экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанной на культивировании проростков In vitro на селективных средах, содержащих фильтрат культуральной жидкости гриба F. oxysporum

Для изучения влияния ф.к.ж. на корни растений огуриа использовали метод экспресс - оценки на устойчивость к фузариозу, основанный на культивировании в условиях in vitro проростков на селективных средах, содержащих ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрациях 2,5 мг/л; 5,0 мг/л; 7,5 мг/л и 10 мг/л.

В результате проведенных исследований наибольшее число хорошо развитых растений (87,2% и 67,5%) получено при культивировании семян на средах с 2,5% и 5% ф.к.ж., а на средах с 7,5% и 10% ф.к.ж. здоровые растения составили соответственно 51,2% и 42,7%.

Анализ полученных данных свидетельствует о возможности проведения экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу при использовании 10%-ного ф.к.ж.

3.3. Оценка огурца на устойчивость к фузариозу на искусственном инфекционном фоне

Растения, полученные в условиях in vitro первоначально оценивали на устойчивость к фузариозу на искусственном инфекционном фоне (опилки) в лаборатор-

ных условиях, затем отобранные наиболее развитые растения, высаживали в искусственный инфекционный фон, созданный в боксе «Селекцентра» ГНУВНИИО.

На растениях с повышенной устойчивостью проводили опыление методом инцухта. В результате скрещиваний получены семена от растений, выделенных из линий и гибридов от однократного и двукратного отборов.

Таблица 9 - Пораженностъ сеянцев огурца на искусственном инфекционном фоне

(древесные опилки)

Линия, гибрид Средний балл поражения линий и габрвдов

2003 г. 2004 г. 2005 г.

Наташ -к.у* 1Д 1,0 1,0

Л-113-к.п.** 3,7 3,6 3,6

Рябинушка F, 2,4 23 23

Рябинушка-1. однократный отбор (F2) - 1,8 1,7

Рябинушка-1-3, двукрашый отбор (F3) - - U

Дуняша F, 2,6 2,5 2,5

Дуняша - 1, од| юкрап 1ый отбор (Fj) - 2,0 1,9

Дуняша-1-2 .двукратный отбор (F3) - - 1,4

Примечание: *к.у -кошрапь, устойчивый к фузаригоу, **к.а- кошропь. восприимчивый к фузариозу

В целях уточнения устойчивости к фузариозу полученных форм огурца нами была проведена оценка растений, полученных после двукратного отбора Исследования показали, что средний балл поражения снизился с 2,6 до 1,4 (по четырех бальной шкале), следовательно, полученные формы характеризуются повышенной устойчивостью к фузариозу (табл. 9).

Селекция огурца на устойчивость к болезням должна, на наш взгляд, вестись ступенчато, т. е. путем постепенного придания селекционному материалу устойчивости к фитопаггогену с формированием иммунитета.

3.4. Коэффициенты корреляции признаков при сравнительной оценке устойчивости огурца к фузариозу

Для определения корреляционных связей анализировали средние показатели признаков гибридов Fi и форм огурца, полученных от однократного и двукратного отборов на ф.к.ж., используемом в концентрации 10%.

Анализ полученных данных показал, что устойчивость растений огурца, полученых при оценке на инфекционном фоне положительно коррелирует с устойчивостью растений на инфекционном фоне в тепличном фунтовом боксе (г = 0,961), а также с длиной корней растений, полученных при проращивании семян на среде с ф.к.ж. в концентрации 10% in vitro, и всхожестью семян при проращивании на искусственном инфекционном фоне (г = 0,759- О, 742). Всхожесть растений, полученных при оценке на искусствен-

лом фоне и in vitro на среде с ф.к.ж., положительно коррелировала (г = О, 615- 0, 878) со всхожестью и длиной корней растений, полученных при проращивании семян in vitro на ф.к.ж. и на среде с ф.к.ж. (табл. 10).

Эти данные свидетельствуют о том, что оценка растений по длине корня, а всхожести семян при проращивании на среде с 10%-ным ф.к.ж. в условиях in vitro, может быть успешно использована для экспресс—оценки огурца на устойчивость к фузариозу.

Таблица 10 — Коэффициенты корреляции показателей, полученных при использовании различных методов экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу

Методы оценки Проращивание семян на искусственном инфек-ц! юн ном фоне (/?? vivo) Проращивание семян на среде с ф.к.ж. in vitro Проращивание семян на ф.к.ж. in vitro

устойчивость, балл всхожесть, % всхожесть. % длина корня, мм всхожесть, % длина корня, мм

Оценка растений на иск. ин.ф. в т.г.б.(;п vivo)* устойчивость, балл 0,961 0,538 0,657 0,803 0,823 0,921

Проращивание семян на искусственном инфекционном фоне (in vivo) устойчивость, балл 0,7 0,774 0,904 0,9)9 0,951

всхожесть, % - 0,764 0,694 0,910 0.653

Проращивание семян на среде с ф.к.ж. in vitro всхожесть, % - - 0,802 0,864 0,803

длина корня, мм - - 0,841 0,823

Проращивание семян на ф.к.ж. in vitro всхожесть, % 0,921

Примечание: *- оценка растений на искусственном инфекционном фоне в тепличном грунтовом боксе (т vivo)

3.5. Биохимическая оценка растений огурца колориметрическим методом по суммарному содержанию фенольных соединений

Учитывая роль фенольных соединений в защите клеток от стрессового фактора, нами были проведены исследования по изучению суммарного со-

держания фенольных соединений в растениях, кул ьти в и ру ёйых в стрессовых условиях.

Исследования показали, что у изучаемых образцов ответная реакция чегы рехнедел ьных растений на действие стресс фактора (10% ф.к.ж. гриба Ь. охувротт) была различной. Так, у исходных растений суммарное содержанке фенол ьных соединений на селективной фоне увеличилось на 41 56% по сравнению с контролем {-без стресса1), а то время как у растений, полученных от двукратного — на 3-13 %. При этом содержание фенолов у растений, полученных из гибрида Р] Рябинушка, после однократного отбора «¿высилось на 20%, а у растений, полученных из гибрида I7, Дуняша - уменьшилось на 3%, При двукратном отборе суммарное содержание фенольных соединений снизилось соответственно на 36% и 44%.

а 5 -

V пистья □ гигюкогиги

Рис. 4. Суммарное содержанке фенольных соединений в растениях огурца, полученных при экспресс-оценке на устойчивость к Г. охузрогит на искусственном инфекционном фоне (древесные опилки)

Можно предположить, что воздействие ф.к.ж. патогена на растения форм огурца, полученных однократного и двукратно!-о отборов приводит к «запуску» программы защитной реакции, проявляющейся в увеличении сип-теза фенольных соединений. После двукратного отбора, вероятно, уровень фенольных соединений в клетках растений огурца настолько велик, что действие ф.к.ж. патогена не приводит к значительным его изменениям. Это свидетельствует о том, что растения потенциально способны выдержать высокие концентрации стресс-фактора, тем самым обладают повышенной устойчивостью к фитопатогену (рис. 4 и 5).

2.5 т

-Ё 1.S

-9- ц

0,5

Дукяша

ДуняшэРяби нункВя 6 инушЖ яби нушйя 6 инуш i

I F2

F3- 1

F3 -2

□ ГИПОКОТУ1ЛЬ

Рис. 5. Суммарное содержание фенольных соединений в растениях огурца, полученных при экспресс-оценке на устойчивость к t\ oxysporum в условиях in vitro

3.6. Экономическая эффект явность

Сравнение изученных экспресс - методов оценки показывает возможности ускоренной оценки и экономии селекционного материала. Способ оценки на ф,к.ж. н на селективной среде с ф.к.ж. ш vitro позволяет в 2Д - 2,5 раза сократить ее длительность и в 2 раза повысить производительность оценки образцов по сравнению с традиционной оценкой на искусственном инфекционном фоне. Затраты при экспресс - оценке на селективной среде с ф.к.ж. превосходят затраты при традиционной, однако в первом случае она более достоверна проводится с использованием меньшего количества семян.

Таблица II - Экономическая эффективность экспресс-методов на устойчивость к фузариозу (расчет на 100 образцов)

№ Показатели экономической эффективности Оценка на инфекционном фоне (опилки) Оценка растений

на селективной среде с ф.к.ж. in vitro на ф.к.ж. ' in vitro j

1 Длительность оценки. сутки 30 14 12 1

2 Количество семян для оценки, [ИТ. 30 5 .0 ;

3 Стоимость оценки 100 образцов. руб. 1291,55* 42 ¡2,42 879,14 i í

4 Производите л шоеть. образ-доь'смену 50 100 IDO i

Примечание: * - затраты вклточают стоимость электроэнергии (392,1руб.)

Таким образом, предложенный метод экспресс - оценки in vitro на сегодняшний день остается дорогостоящим. Однако он позволяет сократить время на проведение оценки и расход семенного материала.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны элементы технологии получения растений-регенерантов огурца в условиях in vitro, включающие оптимизацию условий стерилизации, выбор экспланта, усовершенствованную систему регенерации.

2. Стерилизация сегментов растений и семян, полученных in vivo, раствором гипохлорита натрия в концентрации 1% в течение 10 и 15 минут позволяет получать 85,0 - 97,5% стерильных эксплантов.

3. Культивирование тканей на среде MS, содержащей сахарозу в концентрации 30 г/л, агар -7 г/л и фитогормоны: 6-БАП - 0,1мг/л, а-НУК - 0,1 мг/л, сопровождается индуцированием геммогенеза у 54,2 - 75% эксплантов и трансплантов. Дальнейшее культивирование почек на аналогичной среде приводит к образованию жизнеспособных побегов, культивирование которых на безгормональнои среде сопровождается хорошим укоренением (72,0 -88,0%).

4. Разработана система селективных условий для получения in vitro растений - регенерантов с повышенной устойчивостью к фильтрату культурапь-ной жидкости гриба F. oxysporum и фузариевой кислоте, предусматривающая чередование культивирования тканей на селективной и неселективной средах.

5. Культивирование морфогенного каллуса на среде MS, содержащей сахарозу в концентрации 30 г/л, агар -7 г/л, 6-БАП - 0,1мг/л, а-НУК - 0,1 мг/л и фильтрат культуральной жидкости в концентрации 10% или фузарие-вую кислоту в концентрации 10 мг/л в течение 3-х пассажей, позволяет получать растения-регенеранты огурца с повышенной устойчивостью к фузари-озному увяданию.

6. Усовершенствованы элементы методики экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на проращивании семян на ф.к.ж. гриба F. oxysporum и культивировании растений in vitro на селективных средах, содержащих ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрации 10%. Устойчивость растений огурца, полученная при оценке на искусственном инфекционном фоне положительно коррелирует с устойчивостью, полученной в лабораторных условиях in vivo (г = 0,96), а также со всхожестью семян (г = 0,66 - 0,82) и длиной корней (г-0,80 - 0,92) при оценке in vitro.

зования фенолов (при двукратном отборе суммарное содержание фенольных соединений уменьшилось на 36% - 44%).

8. Усовершенствованные элементы методики экспресс - оценка позволяют в 2,1 - 2,5 раза сократить время необходимое для оценки селекционного материала и снизить расход семенного материала.

Предложения к использованию в селекционной практике и производстве

1. Для получения растений-регенерантов огурца, рекомендуется осуществлять культивирование эксплантов и трансплаитов на питательной среде MS, содержащей сахарозу в концентрации 30 г/л, агар- 7 г/л, 6-БАП, я-НУК в концентрации 0,1 мг/л. Сегменты растений и семена, полученные т vivo, стерилизовать раствором гипохлорита натрия в концентрации 1% в течение 10 и 15 минут;

2. Для проведения клеточной селекции и получения растений с повышенной устойчивостью к фузариозу рекомендуется чередование культивирования каллуса на селективной и неселективной средах. Концентрация селективного агента в среде составляет: для фильтрата культуральной жидкости 10%, для фузариевой кислоты - 10 мг;

3. Для проведения оценки огурца на устойчивость к F. oxysporum рекомендуется культивировать семена на среде или проращивать их на фильтровальной бумаге, содержащих фильтрат культуральной жидкости в концентрации 10%.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Ткачева, A.A. Оценка селекционного материала огурца на устойчивость к фузариозному увяданию в лабораторных условиях/А.А. Ткачева, A.B. Подяков//Селекция, семеноводство и биотехнология овощных и бахчевых культур/Сб. науч. трудов ГНУВНИИО.-М.,2003.-С.429-432 (доля участия 80%).

2. Ткачева, A.A. Регенерация растений огурца in vi/ro /A.A. Ткачева, A.B. Поляков'/Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур/ Сб. науч. трудов междун. научно-практической конференции ГНУ ВНИИО,- М., 2004.-С.118-121 (доля участия 80%).

3. Ткачева, A.A. Усовершенствованный метод оценки селекционного материла огурца на устойчивость к фузариозному увяданию/ A.A. Ткачева, A.B. Поляков, Н.К. Бирюкова//Проблемы научного обеспечения овощеводства юга России/Материалы междун. научно-практической конференции КНИИОКХ РАСХН .-Краснодар, 2004.-С.70-75 (доля участия 80%).

4. Ткачева, A.A. Получение регенерантов сельдерейных (Apiaceae), тыквенных (Ciwurbitaceae), капустных (Brassicaceae) и ряда цветочных культур in vitro!A.B. Поляков, И.И. Тарасенков, О.И. Федоришина, A.A. Ткачева, О.В.

Ильченко, H.H. Ананьина, H.H. Лебедева, М.И. Иванова, Т.В. Ларионова, И.Н. Боровикова// Биотехнология: состояние и перспективы развитияЯП Московский междун. конгресс (14 - 18 марта 2005 г.).-Москва, 2005.-С.286-287 (доля участия 10%).

Tkacheva, A.A. Obtaining regenerants of Apiaceae, Cucurbitaceae, Brassi-caceae and some flower crops in vitro/A..V. Poliakov, I.I. Tarasenkov, O.I. Fedor-ishyna, A.A. Tkacheva, O.V. Ilchenko, N.N. Ananina, N.N. Lebedeva, M.I. Ivanova, T.V. Larionova, I.N. BorovikovaZ/Biotechnology: state of the art and prospects of development/ III Moscow International Congress Moscow (March, 14 - 18,2005).- M., 2005,- P. 286 - 287 (доля участия 10%).

5. Ткачева, A.A. Использование наночастиц серебра в in vitro технологиях/ A.B. Поляков, О.И. Ситникова, О.В. Ильченко, A.A. Ткачева, H.H. Лебедева, О.Ф. Чикризова, A.A. Ревина//Селекция и семеноводство/Сб. науч. трудов по овощеводству и бахчеводству.-Т1.-М.:ГНУ ВНИИО, 2006.-С.265-272 (доля участия 10%).

6. Ткачева, A.A. In vitro размножение овощных и цветочных культур/ A.B. Поляков, A.A. Ткачева, О.В. Ильченко, H.H. Лебедева, О.Ф. Чикризова //Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира/ Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24 - 25 августа).- Волгоград, 2006.- С. 19 - 27 (доля участия 15%).

7. Ткачева, A.A. Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию методами in vitro!A.B. Поляков, A.A. Ткачева, И.И. Тарасенков, Н.К. Бирюкова/ЛТолучение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию (Методические рекомендации).-М.:ГНУ ВНИИО, 200б.-28с. (доля участия 70%).

8. Ткачева, A.A. Методы in vitro в селекции огурца на устойчивость к фузариозу/А.А. Ткачева//Картофелъ и овощи.-2006 - №8.-С. 28.

Подписано в печать 06.12.2006 г.

Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Кол-во знаков 38875. Заказ № 1730. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО "Полиграф-Бизнес" г.Раменское, ул.Красноармейская, 133/2.

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Ткачева, Анна Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Природа устойчивости растений к фитопатогенам и способы создания сортов, устойчивых к болезням.

1.2. Клеточная селекция растений на устойчивость к фитопатогенам

1.2.1. Использование тканевых и клеточных культур в селекции на устойчивость к фитопатогенам.

1.2.2. Использование патогенов в клеточной селекции растений

1.3. Селекция огурца на устойчивость к фузариозу.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. УСЛОВИЯ, ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ, СХЕМА И МЕТОДИКИ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ

2.1. Исходный материал.

2.1.1. Растительный материал.

2.1.2. Штаммы возбудителя фузариозного увядания огурца

F. oxysporum.

2.2. Схема исследований.

2.3. Методы исследований.

2.3.1. Методы выращивания растений.

2.3.2. Методики лабораторных опытов.

2.4. Условия выращивания эксплантов.

2.5. Методы оценки огурца на устойчивость к фузариозу.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Оптимизация факторов, влияющих на морфогенетическую способность эксплантов огурца.

3.1.1. Стерилизация семян и сегментов растений огурца для введения в культуру in vitro

3.1.2. Обоснование выбора эксплантов.

3.1.3. Изучение влияния фитогормонов на морфогенетическую активность тканей огурца.

3.1.4. Получение растений - регенерантов огурца, укоренение и адаптация к почвенным условиям.

3.2. Разработка селективных условий для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к фильтрату культуральной жидкости гриба

F. oxysporum и фузариевой кислоте.

3.2.1. Изучение влияния концентрации фильтрата культуральной жидкости F. oxysporum на тканевые культуры огурца in vitro.

3.2.2. Изучение влияния фузариевой кислоты на морфогенетическую активность тканей огурца при культивировании in vitro.

3.3. Усовершенствование экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу.

3.3.1. Усовершенствование экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на проращивании семян на фильтрате культуральной жидкости гриба F. oxysporum.

3.3.2. Усовершенствование экспресс - оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на культивировании проростков in vitro на селективных средах, содержащих фильтрат культуральной жидкости гриба F. oxysporum.

3.3.3. Оценка огурца на устойчивость к фузариозу на искусственном инфекционном фоне.

3.4. Коэффициенты корреляции признаков при сравнительной оценке методов на устойчивость к фузариозу.

3.5. Биохимическая оценка растений огурца на основании колориметрического метода суммарного содержания фенольных соеди- 97 нений

3.6. Экономическая эффективность.

ВЫВОДЫ.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ

ПРАКТИКЕ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Методы IN VITRO в селекции огурца (Cucumis Sativus L.) на устойчивость к фузариозу"

Актуальность темы. Одним из важных направлений селекции является создание форм, сортов и гибридов растений, устойчивых к биотическим факторам. Это обусловлено большими потерями урожая сельскохозяйственных растений, вызванными поражением их грибными, бактериальными, вирусными болезнями и повреждением вредителями. Снижение урожайности сельскохозяйственных культур до 30 % является следствием широко распространенного и вредоносного заболевания - фузариоз (Коновалов Ю.Б., 1999). Наиболее перспективным способом защиты растений от фитопатогенов является селекция, создание комплексно устойчивых сельскохозяйственных культур. Однако продолжительность периода создания сортов и гибридов достигает 10 и более лет, при этом часто степень устойчивости растений к вредным организмам является недостаточной и далеко не всегда отвечает требованиям производства (Калашникова Е.А., 2003).

При использовании методов клеточной селекции в нашей стране и за рубежом достигнуты значительные результаты: созданы устойчивые линии люцерны (Мезенцева О.Н., 1992) и льна (Поляков А.В., 2000; Пролетова Н.В., Поляков А.В., 2003) к фузариозу; томатов (Нгуен Х.М., 1991) и моркови (Калашникова Е.А., Ипатова Н.В., 2004) к альтернариозу; картофеля - к фи-тофторозу и бактериальной гнили (Калашникова Е.А., 2000). Благодаря достижениям клеточной селекции стало возможным получение in vitro расте-ний-регенерантов с измененными признаками, среди которых селекционер может отобрать устойчивые к болезням формы и при этом сохранить положительные черты исходного образца (Бутенко Р.Г., 1999). Однако, несмотря на определенные успехи, имеющиеся в селекции огурца, до настоящего времени не созданы сорта и гибриды, устойчивые к фузариозному увяданию. В связи с этим необходимо шире использовать в селекционном процессе методы in vitro.

Большая роль по увеличению урожайности огурца, улучшению качества и стабильности урожая отводится селекции. Снижение урожайности на 30

- 50 % является следствием широко распространенного и вредоносного заболевания - фузариоз. Ее вызывает ряд патогенов, основными из них являются грибы рода Fusarium: F. oxysporum, F. solani. Провоцируют болезнь резкие перепады температуры воздуха, переувлажнение почвы, пониженная температура. Источником инфекции являются компосты, рассадные смеси, недостаточно продезинфицированные грунты, растительные остатки, а также семена, где патоген находится в состоянии глубокого покоя. Причиной заболевания являются в основном фитотоксичные выделения возбудителя заболевания - несовершенного гриба F. oxysporum, вызывающие нарушения физиологического гомеостаза растений. Реже наблюдается трахеомикозная закупорка сосудов проводящей системы, приводящая к увяданию и гибели растений из - за нарушений водного обмена. (Будынков Н.И. и др., 1999; На-стенко Н.В. и др., 1994; Юрина О.В., 1986).

Традиционным методом селекции огурца на повышенную устойчивость к фузариозу является отбор устойчивых растений из гибридов и сортов в фазе первого настоящего листа на искусственном инфекционном фоне. Этот метод хорошо себя зарекомендовал, но он остается трудоемким и длительным.

Одним из путей решения этой проблемы является получение растений

- регенерантов, характеризующихся повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию. Их создание возможно с использованием методов биотехнологии.

Исходя из вышеописанных проблем, целью исследований являлось усовершенствование методов in vitro применительно к культуре огурца для повышения эффективности селекционного процесса этой культуры и создания форм, характеризующихся повышенной устойчивостью к фузариозу.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- оптимизировать факторы, влияющие на морфогенетическую способность эксплантов огурца;

Предмет исследований - каллус, почки, побеги, сегменты растений, растения - регенеранты, семена огурца.

Научная новизна работы. Усовершенствована методика экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанная на культивировании семян и растений на ф.к.ж. и селективной среде, содержащей ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрации 10 % в условиях in vitro, позволяющая в течение 12 и 14 суток оценить селекционный материал и выделить образцы с повышенной устойчивостью к фузариозу.

Усовершенствован метод клеточной селекции in vitro, основанный на ступенчатом культивировании эксплантов и трансплантов огурца на селективной среде, содержащей ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрации 10 % и на среде без селективного фактора, позволяющий получать каллусные линии растения огурца с повышенной устойчивостью к фитопатогену.

Оптимизированы условия получения растений-регенерантов огурца. Подобран режимы стерилизации семян и сегментов растений для введения в культуру in vitro. Определено соотношение фитогормонов в питательной среде для культивирования эксплантов и трансплантов.

Практическая ценность работы состоит в том, что оптимизирован процесс получения растений - регенерантов огурца in vitro на основе верхушечных почек, гипокотильных сегментов и каллуса. Получены растения - регенераты, характеризующиеся повышенной устойчивостью к фузариозу. Разработаны и опубликованы методические рекомендации «Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию методами in vitro» (2006 г.).

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены или представлены на III Международной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова (Москва, 2003), Международной научно - практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (Москва, 2004), Международной научно - практической конференции «Проблемы научного обеспечения овощеводства юга России» (Краснодар, 2004), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2006).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- элементы технологии получения растений-регенерантов огурца в условиях in vitro;

- система селективных условий для создания in vitro тканевых культур, устойчивых к ф.к.ж. гриба F. oxysporum и ф.к.;

- усовершенствованный метод экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу.

Публикации результатов исследований.

По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 8 работ. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы, содержащего 155 наименований, в том числе 37 иностранных авторов и приложений.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Ткачева, Анна Анатольевна

выводы

3. Культивирование тканей на среде MS, содержащей сахарозу в концентрации 30 г/л, агар -7 г/л и фитогормоны: 6-БАП - 0,1мг/л, а - НУК - 0,1 мг/л, сопровождается индуцированием геммогенеза у 54,2 - 75% эксплантов и трансплантов. Дальнейшее культивирование почек на аналогичной среде приводит к образованию жизнеспособных побегов, культивирование которых на безгормональной среде сопровождается хорошим укоренением (72,0 -88,0 %).

4. Разработана система селективных условий для получения in vitro растений - регенерантов с повышенной устойчивостью к фильтрату культуральной жидкости гриба F. oxysporum и фузариевой кислоте, предусматривающая чередование культивирования тканей на селективной и неселективной средах.

5. Культивирование морфогенного каллуса на среде MS, содержащей сахарозу в концентрации 30 г/л, агар - 7 г/л, 6 - БАП - 0,1 мг/л, а - НУК - 0,1 мг/л и фильтрат культуральной жидкости в концентрации 10% или фузарие-вую кислоту в концентрации 10 мг/л в течение 3-х пассажей, позволяет получать растения-регенеранты огурца с повышенной устойчивостью к фуза-риозному увяданию.

6. Усовершенствованы элементы методики экспресс-оценки огурца на устойчивость к фузариозу, основанные на проращивании семян на ф.к.ж. гриба F. oxysporum и культивировании растений in vitro на селективных средах, содержащих ф.к.ж. гриба F. oxysporum в концентрации 10 %. Устойчивость растений огурца, полученная при оценке на искусственном инфекционном фоне положительно коррелирует с устойчивостью, полученной в лабораторных условиях in vivo (г = 0,96), а также со всхожестью семян (г = 0,66 - 0,82) и длиной корней (г = 0,80 - 0,92) при оценке in vitro.

7. Проведение отборов на селективных фонах сопровождается повышением устойчивости селектируемого материала к фитопатогену (средний балл поражения снизился с 2,4 - 2,6 до 1,1 - 1,4) и снижением уровня образования фенолов (при двукратном отборе суммарное содержание фенольных соединений уменьшилось на 36 % - 44 %).

ПРЕДЛОЖЕНИЯ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ В СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ И ПРОИЗВОДСТВЕ

1. Для получения растений-регенерантов огурца, рекомендуется осуществлять культивирование эксплантов и трансплантов на питательной среде MS, содержащей сахарозу в концентрации 30 г/л, агар - 7 г/л, 6 - БАП, а -НУК в концентрации 0,1 мг/л. Сегменты растений и семена, полученные in vivo, стерилизовать раствором гипохлорита натрия в концентрации 1% в течение 10 и 15 минут;

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Ткачева, Анна Анатольевна, Москва

1. Аврова, А.О. Физиолого биохимические особенности взаимодействия томатов с Altemaria solani и селекция in vitro на устойчивость к альтернариозу: автореф. дисс. канд. биол. наук: ВИЗР, 1994 - 18 с.

2. Анненков, Б.Г. Клеточно тканевая культура огурца / Б.Г. Анненков, А.И. Ступина // Сиб. Вестник с. - х. Науки, 1997. - N 3 - 4. - С. 14 - 20.

3. Балашова, Н.Н. Токсины фузариума в культуре in vitro / Н.Н. Балашова, О.Б. Дараков, Н.Е. Гордей, А.И. Суржиу // Изв. АН МССР. Сер. биол. и хим. Наук, 1986. № 5. - С. 3 - 6.

4. Белякова, Г.А. Токсические метаболиты грибов и неспецифические ми-тотоксины / Г.А. Белякова, JI.M. Левкина // Миколог, и фитопатол, 1992. Т. 26. - Вып. 3. - С. 183 - 188.

5. Белякова, Г.А. Токсичность КФ грибов, вызывающих пятнистость на хлопчатнике / Г.А. Белякова, Б.С. Ермолинский, С.И. Свиридов // Вестник Московского ун-та, 1991. -№ 4. С. 56 - 61.

6. Берестецкий, О.А. Определение фитотоксичной активности культур микросеопических грибов / О.А. Берестецкий // Методы экспериментальной микологии. Киев, 1973. - С. 165 - 175.

7. Беттхер, И. Методы определения болезней и вредителей сельскохозяйственных растений / И. Беттхер, Т. Ветцель, Ф.В. Древе, X. Кеглер, К. Наумани, Б. Фрайер, К. Фрауэнштайн, Э. Фукс // Москва: Агропромиз-дат, 1987.-е. 79-130

8. Билай, В.И. Фузарии / В.И. Билай // Наукова думка. Киев: 1977. - 360 с.

9. Билай, В.И. Основы общей микологии / В.И. Билай // Вища школа. -Киев: 1986. - 14 с.

10. Бирюкова, Н.К. Простой хороший огурец / Н.К. Бирюкова, В. Леунова // М. Россия молодая, 1996. № 2. - С. 91 - 92.

11. Бирюкова, Н.К. Перспективные гибриды огурца селекции ВНИИО / Н.К. Бирюкова // М.: Мытищи, Семеновод, 2001.

12. Боровков, А.В. Метаболиты штаммов Fusarium oxysporum / А.В. Боровков, А.О. Барестецкий // Микология и фитопатология, 1983. т. 17. -вып. 4. - С. 349 - 358.

13. Будынков, Н.И. Фузариозное увядание огурца в защищенном грунте / Н.И. Будынков, Е.Ф. Никифорова, В.Н. Юваров // М.: Гавриш, 1999. N 6.-С. 16-17.

14. Бунин, М.С. Новые овощные культуры России / М.С. Бунин. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2002. - С. 190 - 208.

15. Бутенко, Р.Г. Клеточная селекция картофеля / Р.Г. Бутенко, JI.M. Хромова, Г.А. Седнина // Сельскохоз. Биология / М., 1983. № 11. - С. 347 -352.

16. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных протопластов, клеток и тканей в решении задач физиологии растений / Бутенко Р.Г. // Новые направления в физиологии растений / М., 1985. С. 16 - 32.

17. Бутенко, Р.Г. Методическими указаниями по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля / Р.Г. Бутенко, JI.M. Хромова, Г.А. Седнина // М., 1984.

18. Бутенко, Р.Г. Биотехнология растений: культура клеток / Р.Г. Бутенко // М.: Агропромиздат, 1989. 123 с.

19. Бутенко, Р.Г. Клеточная инженерия / Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф.Киркин // Биотехнология / М.: Высшая школа, 1987. 128 с.

20. Бутенко, Р.Г. Биотехнология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе / Р.Г. Бутенко // М., ФБК Пресс, 1999.-159 с.

21. Бутенко, Р.Г. Культура изолтрованных тканей и физиология морфогенеза / Р.Г. Бутенко // М., 1964.

22. Вавилов, Н.И. Проблемы происхождения, географии, генетики, селекции растений, растениеводства и агрономии / Н.И. Вавилов // Избр. тр. /М., 1965. т. V.- 786 с.

23. Ван дер Планк Я. Проблемы иммунитета культурных растений / Ван дер Планк Я // М.: Колос, 1972. 254 с.

24. Ван дер Планк Я. / Проблемы иммунитета культурных растений // М.: Колос, 1963 . 254 с.

25. Васильев, С.В. Практические аспекты применения достижений биотехнологии в рстениеводстве / С.В. Васильев // Рекомбинационная селекция растений Сибири / Новосибирск, 1989. С. 92 - 100.

26. Вердеревский, Д.Д. Пути использования иммунитета растений / Д.Д. Вердеревский // Селекция и семеноводство, 1968. 3. - с. 12 -13.

27. Германович, С.Т. Отбор клеточных линий клевера лугового, устойчивых к КФ Fusarium oxysporum / С.Т. Германович // Материалы конф. Молодых ученых и аспирантов / Новые идеи в растениеводстве, и пути их реализации / М., 1991.- С. 90-91.

28. Герматюк, Г.Т. Селекция и семеноводство овощных и плодовых культур / Г.Т. Герматюк, И.А. Шевцов, В.А. Кравченко, В.П. Роенко, A.M. Молоцкий // Киев, 1989. 318 с.

29. Гешеле, Э.Э. Основы фитопатологической оценки в селекции растений / Э.Э. Гешеле // М.: Колос, 1978. 208 с.

30. Гиренко, М.М. Цели и методы селекции зеленных и пряно вкусовых овощных культур / М.М. Гиренко, Ю.И. Мухонова // Бюллетень ВИР, Д., 1985.- вып. 48. - С. 17-19.

31. Гирко, B.C. Оценка устойчивости к действию КФ грибного патогена в культуре незрелых зародышей / B.C. Гирко, К.Г. Волощук // С. х. биология. - сер. Биология растений / 1993. - № 9. - С. 62 - 70.

32. Гостимский, С.А. Генетическая изменчивость клеток растений при культивировании / С.А. Гостимский // Успехи совр. Генетики, 1977. № 14 С. 48-63.

33. Гладков, Е.А. Получение газонных трав, толерантных к засолению и ионам меди, методами биотехнологии: автореф. дисс. . канд. биол. наук: МГУ, 2003. 20 с.

34. Глеба, Ю.Ю. Станет ли клеточная инженерия новой технологией в селекционном процессе? / Ю.Ю. Глеба // Импакт: наука и общество, 1987.- № 2. С. 59-67.

35. Гусева, Н.Н. Продолжая дело великого ученого / Н.Н. Гусева // Защита растений, 1987. № 12. - С. 16.

36. Данлади Дада Кута. Маркеры сортовой устойчивости к пирикуляриозу в каллусной культуре риса: автореф. диссерт. канд. биол. наук: М., 2000.-21 с.

37. Данлади Дада Кута. Маркеры сортовой устойчивости к пирикуляриозу в каллусной культуре риса: автореф. диссерт. канд. биол. наук: М., 2000.-21 с.

38. Диксон, Р.А. Изолирование и поддержание каллусных и суспензионных культур клеток / Р.А. Диксон // В кн.: Биотехнология растений: культура клеток. Пер. с англ. В.И. Негрука - под ред. Р.Г. Бутенко. - М.: М.В.О. Агропромиздат, 1989. - С. 33 - 51.

39. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта (с основами стат. обработки результатов исследований) / Б.А. Доспехов // М.: Колос, 1979. 416 с.

40. Дудка, И.А. Методы экспериментальной микологии / И.А. Дудка, С.П. Вассер // Под ред. В.И. Билай. Киев: Наукова думка, 1982. - 364 с.

41. Запрометов, М.Н. Фенольные соединения / М.Н. Запрометов // М.: Наука, 1993.-272 с.

42. Запрометов М.Н. Колориметрическим метод с использованием реактива Фолина Дениса / М.Н. Запрометов // М.: Наука, 1974.

43. Иванова, О.С. Клеточная селекция на инфекционном фоне для получения фузариозоустойчивых форм томатов / О.С. Иванова // Материалы Всесоюз. конф. по с/х биотехнологии / Целиноград, 1991. С. 97 - 98.

44. Иванова, Н.Г. Разработка селективного фактора для проведения клеточной селекции на устойчивость к Corynebanium sepedorium / Н.Г. Иванова // Использование клеточной технологии в селекции картофеля /М., 1987-С. 26-28.

45. Игнатова, С.А. Культура in vitro биотехнологический прием для создания фузариозоустойчивых форм люцерны / С.А. Игнатова, С.Ф.

46. Лукьянюк, Т.К. Овсюк // Тез. докл. Всесоюз. Конф. Применение биотехнологий в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине/М., 1988.-С. 153 155.

47. Ильина, П. Р. Повышение устойчивости селекционных сортов льна-долгунца к фузариозу в процессе первичного семеноводства / П.Р. Ильина // Тр. ВНИИЛ. вып. 5. - 1958. - с. 33

48. Калашникова, Е.А. Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням: Дис. Док. Биол. наук: М.: ТСХА, 2003. 279 с.

49. Калашникова, Е.А. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к септориозу / Е.А. Калашникова // Сельскохозяйственная биотехнология /М.: Воскресенье, 2000. Т. -1. - С.61 - 71.

50. Катаева, Н.В. Клональное микроразмножение растений / Н.В. Катаева, Р.Г. Бутенко // М.: Наука, 1983. 97 с.

51. Кирай, 3. Методы фитопатологии / 3. Кирай, 3. Клемент // М.: Колос, 1974.- 145 с.

52. Кирай, 3. Результаты и перспективы использования биотехнологии в растениеводстве и защите растений / 3. Кирай, 3. Барабаш // Агропром. 1990.-№3.-с. 7-10.

53. Кирюхина, Р.И. Интенсивное растениеводство: проблемы иммунитета / Р.И. Кирюхина // Вестник с. х. науки, 1987. - № 5. - 36 с.

54. Кирьян, И.Г. Клеточная селекция клевера лугового на устойчивость к фузариозу / И.Г. Кирьян, В.В. Мазин // Тез. докл. 1 Всесоюзного симпозиума «Новые методы биотехнологии растений» / Пущино, 1991.

55. Коновалов, Ю.Б. Селекция растений на устойчивость к болезням и вредителям / Ю.Б. Коновалов // М.: Колос, 1999. 135 с.

56. Котляров В.В. Устойчивость сортов пшеницы к фузариозу и методы ее определения / В.В. Котляров // Селекция и семеноводство, 1986. № 6. -51 с.

57. Крылова, Т.В. Вирулентность местной популяции возбудителя ржавчины льна долгунца / Т.В. Крылова // Сб. трудов ВНИИЛ, 1994. - вып.28.29.-С. 47-56.

58. Куку шина, JI.H. Изучение оценки регенерантов картофеля по устойчивости к фитофторе in vivo и in vitro / J1.H. Кукушина, A.A. Дорошенко // Использование клеточных технологий в селекции картофеля / М., 1987.-С. 52-56.

59. Кунах, В.А. Изменчивость растииельного генома в процессе дедиффе-ренцировки и каллусообразования in vitro / В.А. Кунах // Физиология растений, 1999. т. 46. - № 6. - С. 919 - 929.

60. Курчакова, J1.H. Использование токсичности культуральной жидкости гриба Fusarium для отбора здоровых каллусов льна / J1.H. Курчакова // Селекция, семеноводство и агротехника возделывания льна долгунца /Торжок: ВНИИЛ, 1991.

61. Кучеренко, Л.А. Подходы к разработке технологии массовой регенерации растений in vitro / Л.А. Кучеренко // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений / М.: Наука, 1991. С. 232 - 242.

62. Лейке, Г. Использование культуры тканей и органов в селекции растений и производстве посадочного материала / Г. Лейке, Р. Лабес, К. Эр-тель, М. Петерсдорф // Пер. с нем. и предисл. Ю.Л. Гужова / М.: Колос, 1980. 77 с.

63. Лети Джое. Получение форм пшеницы (Triticum aestivum) устойчивых к грибу Septoria nodorum в условиях in vitro: автореф. дис. канд. биол. наук: М., 1998.-22 с.

64. Лети Джое, Влияние гриба S. nodorum и его метаболитов на прорастание семян пшеницы / Лети Джое, Е.А. Калашникова // Известия ТСХА, 1996.-Вып. 4.-С. 150-155

65. Литвинов, С.С. Сорта и гибриды овощных, бахчевых и цветочныхкультур селекции ВНИИО / С.С. Литвинов // Каталог/ М., 2002 99 с.

66. Лихачев, А.Н. Использование жидких питательных сред для получения моноспоровых культур грибов / А.Н. Лихачев // Микология и фитопатология, 1994. Т. 28. - Вып. 5. - С. 14 -16.

67. Лутова, Л.А. Каллусо и побегообразование у различных форм гороха Pisum sativum L. в условиях in vitro / Л.А. Лутова, Е.К. Забелина // Генетика, 1988. - т. XXIV. - № 9. - С. 1632 - 1640.

68. Маркова, Н.В. Методы in vitro для ускорения м облегчения селекционной работы с растениями огурца (Cucumis sativus) / Н.В. Маркова: ав-тореф. дисс. канд. биол. наук: НИИОХ, 1991 26 с.

69. Маруненко, И.М. Клеточная селекция картофеля на устойчивость к патогенам / И.М. Маруненко, А.А. Кучко // Междунар. Конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология" / Новосибирск, 1988. Ч. 1. 169 с.

70. Маруненко, И.М. Отбор генотипов, устойчивых к мокрым гнилям картофеля, методами клеточной селекции / И.М. Маруненко // Создание ииспользование исходного материала в селекции картофеля / Киев, 1992. -С. 62-70.

71. Масленников, С.Е. Получение устойчивых к корневым гнилям растений люцерны с использованием методов культуры каллусов и клеток / С.Е. Масленников // Соврем, достижения биотехнологии / Ставрополь, 1995.-С. 24-25.

72. Мезенцева, О.Ю. Использование тканевых и клеточных культур в селекции на устойчивость к фитопатогенам / О.Ю. Мезенцева // Селекция и семеноводство, 1990. № 4. - С. 59 - 62.

73. Мезенцева, О.Н. Получение клеточных линий пшеницы, устойчивых к токсинам фузариоза / О.Н. Мезенцева // Доклады научно практич. Конф. "Ученые Нечерноземья - развитию сельского хозяйства" / М., 1991.-С. 179- 183.

74. Мезенцева, О.Н. Создание исходного селективного материала люцерны и пшеницы устойчивых к фузариозу методом биотехнологии: автореф. дис. канд. биол. наук: М.: ТСХА, 1992. 15 с.

75. Миллер, С.А. Методы культуры тканей в фитопатологии: грибы / С.А. Миллер // Биотехнология растений: культура клеток. Пер. с англ. В.И. Негрука. - Под ред. и с предисл. Р.Г. Бутенко / М.: ВО Агропромиздат. 1989.-С. 259-274.

76. Монастырский, О.А. Токсины фитопатогенных грибов / О.А. Монастырский // Защита и карантин растений, 1996. № 3. - С. 5 - 7.

77. Муромцев, Г.С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, М.И. Прокофьев // М.: Агропромиздат, 1990. -384 с.

78. Настенко, Н.В. Разработка способа предварительной оценки растений огурца на устойчивость к фузариозу / Н.В. Настенко, Н.А. Шмыкова, Н.Н. Балашова, В.П. Кушнерева // 1994. С. 74 - 77.

79. Нгуен Хонг Минь Селекция in vitro на устойчивость к Fusarium oxysporum f. Sp. Lycopersici у томатов: автореф. дисс. канд. биол. наук /1. Минск, 1991.-21 с.

80. Никуленко, Т.Р. Токсины фитопатологических грибов и их роль в развитии растений / Т.Р. Никуленко, Д.И. Чкаников // М.: Агропромиздат, 1987.

81. Озерецковская, O.J1. Проблемы специфического фитоимунитета / O.J1. Озерецковская //Физиология растений, 2002 т.49 - № 1 .-С. 1-7.

82. Основные результаты научной деятельности ВНИИ фитопатологии за 1996-2000 гг.

83. Плащев, В.М. Клеточная селекция клевера и люцерны на устойчивость к фузариозному увяданию / В.М. Плащев // Гаметофитная и защитная селекция растений / Кишенев, 1987. С. 176 - 178.

84. Поляков А.В. Усовершенствование селекционного процесса льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) на основе использования биотехнологических методов: автореф. дисс. д-ра биол. наук / РАСХН, 1998. -50 с.

85. Поляков, А.В. Биотехнология в селекции льна / А. В. Поляков // Тверь: Формат, 2000. 180 с.

86. Попова, Т.Т. Вопросы методики выявления, создания и повышения болезнеустойчивости льна / Т.Т. Попова // Труды ВНИИЛ / Калинин: ВНИИЛ, 1958.-Вып

87. Простакова, Ж.Г. Воздействие токсина Fusarium oxysporum на прорастание пыльцы сои / Ж.Г. Простакова, А.И. Бронштейн, JI.H. Показань-ева // М.: МСХА, 1991, С. 78 87.

88. Расколиева, В.А. Использование методов биотехнологии в получении исходных форм моркови, устойчивых к патогенному грибу Alternaria radicina / М., Dr. Et. Е.: автореф. дис. канд. биол. наук / М.,2001 -18 с.

89. Раскалиева, В.А. Использование методов биотехнологии в получении форм моркови, устойчивых к альтернариозу / В.А. Раскалиева, Е.А. Калашникова // Сельскохозяйственная биотехнология / М.: Воскресенье, 2001.-т. 2.- С. 81-91.

90. Родева, В. Биологичен эфект на културални филтрати от различии изо-пати на Alternaria solani върху растение доматени растение in vitro / В. Родева, И. Станчева // Биотехнология, 1990. Т. 4. - № 3/4. - С. 27 - 30.

91. Рубин, Б.А. Биохимия и физиология иммунитета растений / Б.А. Рубин, Е.В. Архиховская, В.А. Аксенова // М.: Высшая школа, 1975.

92. Рудаков, O.JI. Новая форма проявления фузариозного увядания огурца в защищенном грунте / O.J1. Рудаков, Н.И. Будынков, Е.Ф. Никифорова // АГРО XXI, 1998. -N 10. С. 9 -10.

93. Семенов, А.Я. Инфекция семян хлебных злаков / А.Я. Семенов // М.: Колос, 1984.-94 с.

94. Сидоров, В.А. Биотехнология растений / В.А. Сидоров // Клеточная селекция / Киев.: Наукова Думка, 1990. 360 с.

95. Симонян, Т.Г. Исследование механизмов действия токсических веществ из гриба Bipolaris sorokihiaki на ункционирование фотосинтетического аппарата пшеницы / Т.Г. Симонян, Т.Ш. Адешвили // Тез. докл.

96. Всесоюз. Научно-техн. Конф. "Применение биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и ветеренарной медецине" / М., 1988. С. 153 -155.

97. Солодкая, JI.A. Методы создания форм клевера лугового с повышенной устойчивостью к раку / JI.A. Солодкая, Е.Ю. Новоселова // Сборн. Науч. Трудов ВНИИ кормов, 1989. Вып. 42. - С. 57 - 65.

98. Турбин, Н.В. Методические указания по селекции и семеноводству огурцов в защищенном грунте / Н.В. Турбин // М., 1976. С. 17-21.

99. Фадеев, Ю.Н. Действие токсической фракции веществ гриба на хлоропласта яровой пшеницы / Ю.Н. Фадеев, Т.Ш. Адеишвили // Достижения науки и техники АПК, 1990. № 1. - С. 19 - 20.

100. Фролова, JI.B. Динамика клеточных популяций в культуре ткани Vicia tabacum В кн.: Культура клеток растений / JI.B. Фролова, З.Б. Шамина //Труды II Всесоюзн. Конф./Киев:Наук. Думка, 1978.-С.27-32.

101. Хотин, Ю.А. Сохранение инфекционных свойств возбудителя ризокто-ниоза риса при культивировании на искусственных питательных средах / Ю.А. Хотин, Т.М. Полякова // Микология и фитопатология, 1991. Т. 25.-Вып. 1.-С. 80-84.

102. Шамина, З.Б. Генетическая изменчивость растительных клеток in vitro -В кн.: Культура клеток растений / З.Б. Шамина // Труды II Всесоюзн. Конф. / Киев: Наук. Думка, 1978. С. 80 - 93.

103. Шаяхметов, И.Ф. Особенности регенерации растений пшеницы из каллусной ткани выращенной на фоне фитотоксинов / И.Ф. Шаяхметов // 1 симпозиум Новые методы биотехнологии растений / Пущино, 1991.

104. Шаяхметов, И.Ф. Биологически активные метаболиты из культураль-ного фильтрата Fusarium oxysporum в связи с клеточной селекции злаков на устойчивость к фитопатогенам / И.Ф. Шаяхметов // Микология и фитопатология, 2001. - № 6. - С. 13 -14.

105. Шаяхметов, И.Ф. Особенности каллусообразования и регенерации растений в культуре незрелых зародышей яровой твердой пшеницы / И.Ф. Шаяхметов, Ф.К. Иштерякова, М.М. Хабирова, // Сельскохозяйственная биология, 1988. № 4. - С. 125 - 130.

106. Шаяхметов И.Ф., Биотехнология растений / И.Ф. Шаяхметов // УФА: Рио Баш ГУ, 2004. С. 6 - 99.

107. Шевелуха, B.C. Новая биотехнология в селекции и растениеводстве / B.C. Шевелуха // Вестник с / х науки, 1986. № 2. С. 25 31.

108. Шевелуха, B.C. Сельскохозяйственная биотехнология / B.C. Шевелуха //Москва, 2003.- 470 с.

109. Шевелуха, B.C. Сельскохозяйственная биотехнология / B.C. Шевелуха //Москва, 2003.- 470 с.

110. Шевелуха, С. Рост растений и его регуляция в онтогенезе / B.C. Шевелуха // М.: Колос, 1992. 594 с.

111. Шевелуха, B.C. Сельскохозяйственная биотехнология / B.C. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.С. Воронин // М.: Высшая школа, 1994.-18 с.

112. Шевченко, Ф.П. Повышение устойчивости сортов к болезням / Ф.П Шевченко // Селекция и семеноводство, 1950. 8. - С. 19 - 20.

113. Шкларов, А.П. Условия внешней среды и урожайность огурца в открытом грунте / А.П. Шкларов, // "Овощеводство". Сборник научных трудов/Минск, 1998.-вып. 10.- С. 107- 109.

114. Юрина, О.В. Селекция огурца на устойчивость к болезням / О.В. Юри-на // Плодоовощное хозяйство, 1986. Т - 3. - С. 36 - 37.

115. Ячевский, А.А. Перспектива фитопатологических исследований в отношении болезней льна / А.А. Ячевский // Сб. трудов I совещания по селекции льна и конопли / JL, 1929.

116. Allard, R.W. Principles of Plant Breeding / R.W. Allard // John Wilei. New York, 1960.-P. 11-50.

117. Bar, H. Untersuchungen iiber die Wirkungsweise der Fusarinsaure / H. Bar // Phytopathol. Z., 1963. 48. - P. 149 - 177

118. Barakat, M.N. Plant regeneration from protoplast-derived tissues of Linum usitatissimum L. (flax) / M.N. Barakat, E.C. Cocking // Plant Cell Rep, 1985.-V. 4.-P. 164- 167.

119. Barker, H.D. Study of wilt resistance in Flax / H.D. Barker // Minn. Apr. Exnt. Sta Tech. Bui. 20,1923

120. Briggs F.N. / F.N. Briggs, P.F. Knowles // 1967

121. Daub, M.E. Tissue culture and the selection of resistance to patogens / M.E. Daub // Ann. Rev. Phitopathol, 1986. V. - 24. - P. 156 - 186.

122. Deadon, W.R. Expressed resistance to black shankamong tobacco callus cultures / W.R. Deadon, G.J. Keyes, G.B. Collins // Theer. And Appl. Genet., 1982.-V.-63. P. 65-70.

123. Durin, R.D. The biochemistry of fungal and bacterial toxins and their modes of action / R.D. Durin // Biochemistry Plant Pathology. Ed J. A. Callow, 1983.-P. 137- 162.

124. Foroughi Wehr, B. Pflanzenshuts / B. Foroughi Wehr, K. Stalle, D. Nachr // 1985.-V. 37.-P. 170- 173.

125. Johnson R., / R. Johnson, C.N. Law //1975

126. Haberlach, G.T. Modification of Disease Resistance of Tobacco Callus Tissues by Cytokinins / G.T. Haberlach, A.D. Budde, L. Sequeira, J.P.

127. Helgeson // Plant Physiol, 1978. V. 62. - № 6. - P. 522 - 525.

128. Hartman, G.L. Selection of alfalfa cell lines and regeneration of plant resistant to the toxin (S) produced by Fusarium oxsisporum / G.L. Hartman, T.Y. McCoy // 1984. vol. 34. - 31. 2. - P. 183 - 194.

129. Hedin, P.A. Biotechnology for Crop Protection / P.A. Hedin, J.J. Menn // Washington. Amer. Chem. Soc, 1988. 379 p.

130. Yoder, O.C. Toxins in Plant Disease / O.C. Yoder // New York, 1981. P. 45 -77.

131. Lupotto, E. Z. Pflanzenphysiology / E. Z. Lupotto // 1983. V. 111. -.95p.

132. Ludwig, R.A. Toxin production by Helminthosporium sativum P.K. et B. fnd its significance in disease development / R.A. Ludwig // Can. J, 1957. -Vol. 35.-№3.-P. 291 -304.

133. Mirocha, T.J. Mycotoxins ansthe Fungi that produce them / T.J. Mirocha // (Proc. of Amer. Phytophthora., 1986.

134. McCoy, T.J. Cytogenetic analysis of plants regenerated from oat (Avena sativa) tissue cultures: high frequency of partial chromosome loss / T.J. McCoy, R.L. Phillips, H.W. Rines // Can. J. Genet. Cytol, 1982. V. 24. - P. 37-50.

135. Murashige Т., Skoog F. A. revised medium for rapid growth and biossays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant, 1962. V. 15. - № 13. P. 473 -497.

136. Chawa H.S. Thea. Appl. Gen. / H.S. Chawa, G. Wenzel // 1987 v. 74. p. 841 -845.

137. Chawa H.S. Thea. Appl. Gen. / H.S. Chawa, G. Wenzel // 1987 v. 74. p. 841 -845.

138. Nichterlein, K. Genotypic and exogenous factors affecting shoot regeneration from anther callus of linseed (Linnum usitatissimum L.) / K. Nichterlein, H. Umbach, W. Friedt // Institute of Agronomy and Plant Breeding, Giessen. -1991.-P. 125 128.

139. Robinson R.A. / R.A. Robinson // 1976

140. Scowcroft, W.R. Use of Tissue Culture and Protoplasts in Plant Pathology / W.R. Scowcroft, P.F. Larkin, R. Brettell // Syndey, New York, 1983. P. 139- 162.

141. Chawa H.S. Thea. Appl. Gen. / H.S. Chawa, G. Wenzel // 1987 v. 74. p. 841 -845.

142. Smith, G.A. Biotechnology and Ecology of pollen / G.A. Smith // New York, 1986.-P. 83 -88.

143. Stakman E.C. / E.C. Stakman//1954

144. Toyoda, Y. Phytopathol / Toyoda Y., et. al. // Soc. Janan, 1984. V. 50. - P. 538 - 540.

145. Turner, W.B. Fungal metabolities / W.B. Turner // Lond., Acad. Press, 1971. P. 29-36.

146. Wheeler, H. Plant. Dis. Rep / H. Wheeler, A.S. Williams, L.G. Young // 1971.-vol. 55, 8.-P. 667-671

147. Van Der Plank J.E. / J.E. Van Der Plank //1963

148. Vocho, H. Induced mutations and genetic correlations between scab risistance and sole agronomic characters in wheat / H. Vocho, F. Hirai // GTh International Wheat Genetics Semposiun. Japan, 1983. - 39 p.

Информация о работе

Ткачева, Анна Анатольевна
кандидата сельскохозяйственных наук
Москва, 2007
ВАК 06.01.05

Диссертация

Методы IN VITRO в селекции огурца (Cucumis Sativus L.) на устойчивость к фузариозу - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы