Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфогенез в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Морфогенез в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы"

ГЛАВНЫЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

На правах рукописи УДК 581.1.035.

Л НЛ ПИЯ ЕВ Бахытжап Бейсенбекович

МОРФОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЫЛЬНИКОВ И МИКРОСПОР ПШЕНИЦЫ

03.00.12 — физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата, 1992

Работа выполнена в НИЛ биохимии обмена веществ растений при кафедре физиологии и биохимии растении биологического факультета Казахского государственного университета им. Аль-Фарабн.

Научный руководитель — доктор биологических наук,

профессор И. РАХИМБАЕВ

Официальные оппоненты: — доктор биологических наук,

К. Н. САРСЕНБАЕВ

— кандидат биологических наук, А. Р. ИСКАКОВ

Ведущее учреждение — Институт молекулярной биологии

и биохимии им. М. А. АИТХОЖИНА

Защита состоится 29 мая 1992 г. в 14.00 часов на заседании специализированного Совета при Главном ботаническом саде АН Республики Казахстан по адресу: 480070. Алма-Ата, Главный ботанический сад АН Республики Казахстан, ул. Тимирязева 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Главного ботанического сада АН Республики Казахстан.

Автореферат разослан « » _1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

С. Н. АЗАРЕНКО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гаплоиды позволяют получать из гибрид нах популяций гомозиготные, константные линии, использование кота рых в селецкданных программах значительно сокращает время выведешь ьових высокопродутаивных сортов. Для зерновых злаков разработан!) несколько методов получения гаплоидов, среди которых более эффективным для массового получения растений-регенерантов является метод культуры изолированных пыльников и микроспор. Проблеме экспериментальной гаплоидии и изучению ее физиолого-биохимических и генетических аспектов посвящено ряд работ (Бутенко, 1975; Хохлов и др., 1976; Шамина, 1981; Dunwell, 1985; Hu, 1986; Соколов, Шумный, 1969; Дьячук, Дьячук 1989; Picard et. al., 1990). Однако, несмотря на'определенные. методические успехи гаплоидная технология не находит еще широкого применения в практической селекции пшеницы из-за отсутствия соответствующих теоретических разработок (Александрова, Лунь янюк, 1990). Недостаточно изучены физиоло-биохимические и цитозмб риологические механизмы морфогенеза и регенерации растений культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы.

Цели и задачи .исследования. Основной целью настоящей работы баьо:

1) в теоретическом аспекте - изучение закономерностей мсрфоге неза и регенерации растений в культуре изолированных пыльников ü микроспор пшеницы;

2) в прикладном аспекте - совершенствование методов получении андроклинных дигаплоидов из различных сортов и гибридов пшеницы.

Для достижения намеченных целей необходимо было решить следую uijie задачи:

1) отбор отзывчивых генотипов, у которых процессы змбриоидо-генеза и каллусогенеза могут индуцироваться с высокой частотой;

2) изучение путей развития-микроспор пшеницы in vitro, приви-дящих к образованию андроклинных структур;

3) цитоэмбриологические и биохимические исследования заксии мерностей процессов морфогенеза и регенерации растений иа эмбрион-дов и каллусных тканей;

4) подбор оптимальных условий культивирования для поышкнин гаивноети гаплоидной технологии;

5) создание и передача дигаплоидных линий селекционным учреждениям для привлчения их в генетико-селекционные программы по созданию ценных исходных форм.

Научная новизна. Впервые показано наличие прямого змбриоидоге-нева в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы. Выявлены критические периоды процесса эмбриоидогенеза (стадия глобулы, проэмбрио), которые определяют дальнейший ход процессов морфогенеза и нуги регенерации растений (эмбриоидогенез, органогенез). Установлено опережающее развитие клеток вегетативного типа после первого "равного" деления микроспор (путь В1), из которых в дальнейшем формируются многоклеточные комплексы (МК). Установлена взаимосвязь между электрофоретическим спектром белков и степенью дифференциации андроклинных структур, развивающихся в культуре мужского гаметофи-та. По мере дифференциации и формирования эмбриоидов (первичных и вторичных), содержание в них белка увеличивается, а электрофорети-ческий спектр усложняется и достигают уровней их в зиготических зародышах.

Практическая ценность. Выявлены отзывчивые к андроклинии генотипы пшеницы (Казахстансгая 4; Казахстанская 5; К-б; В-Б), которые могут использоваться в качестве модельных объектов для изучения механизмов морфогенеза в культуре пыльников пшеница Модифицированы составы питательных сред дли культуры изолированных микроспор пшеницы, способствующих "одноступенчатой" регенерации растений и повышающих эффективность гаплоидной технологии. Получено 78 дигаплоидных линий пшеницы, среди которых выявлены номера, превышающие исходные генотипы по содержанию белка и клейковины (АДГ 4/14; 5/10; 3/30-1). Указанные дигаплоиды "рекомендуется включить в селекционные программы по созданию новых сортов пшеницы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алма-Ата, 1988), Международном симпозиуме по клеточной и генной технологии для зерновых злаков (Алма-Ата, 1989), на XI Международном симпозиуме по эмбриологии и семенному размножению (Ленинград, 1990), на II съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990), Конференциях молодых ученых (Алма-Ата, 1938; Уфа, 1989; Москва, 1989), на Всесоюзной научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (Целиноград, 1991), на У конференции биохимиков республик Сред-

ней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991). Материалы диссертации опубликованы в 9 работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 разделов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит 7 таблиц и 33 рисунка. Описок литературы включает 180 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили сорта Tr. aestivum: Казахстанская 3; Казахстанская 4; Казахстанская 5; Казахстанская 7; Казахстанская 10; Саратовская 29; Саратовская 42; Саратовская 52; Эри-трос пермум 116; Грекум 476; Красноводопадская 210; Алма-Атинская полукарликовая; Еезостоя 1 и их гибриды с участием моносошшх линий. Использованы также отдаленные (межродовые, межвидовые) гибриды: Безостая 1 х .Aeg-ilops. cylindrica; Безостая 1 х ¿egilops triaristata; Казахстанская 10 х Triticum timopheevi; Triticum persicum x Triticum turanicum; Triticum persicum x Triticum tureldum Гибриды использованы в нескольких (F1 - F6) поколениях. Все сорта и гибриды пшеницы для исследовании были предоставлены селекционерами Каз ЮТ земледелия согласно договору б творческом содружестве.

Методы исследования. Донорные растения выращивали в.поле на экспериментальных участках Казахского НИИ земледелия на темно-каштановой почве. Тепличные растения в осенне-зимний период выращивали в лаборатории искусственного климата, где температура поддерживалась в интервале ZZ-26 С, фотопериод составлял 16 часов.

Для культивирования пыльников и изолированных микроспор использовали как твердые, так и жидкие модифицированные среды Ш, Ш и Киьйдза (Murashige, Skoog.1962; Chu, 1978; Blaydes 1966). Во всех питательных средах рН - 5,8-6,0.

После 25-30 дней культивирования на индуцирующей среде образо-liijíiii.uiíob андроклишше структуры (каллусы, глобулы, эмбриоиди). Кал-

пересаживали на среду МО с 2 мг/л 2,4-Д; 100 мг/л ыэзошюзита; i по иг/л ДО; 20 г/л сахарозы; 7 г/л агара. Эмбриоиды пересашваям л i rpt-ДУ И? с 0,5мг/л ПУК; 20 г/л сахарозы; 100 мг/л мезоинооита; 7

г/л агара Эмбриоиды инкубировали в условиях периодического освещения (16/8 час. в сутки), изначально при 15-20 С, затем по мере появления растений-регенерантов их переносили в условия 27 С и относительной влажности 70-80%. По мере роста регенерантов и появления у ннх 3-5 листочков и хорошо развитых корней, их пересаживали в сосуды со смесью Кнопа, где доводили до стадии кущения и подвергали ди-гаплоидизации колхицином (0,02% р-р колхицина) по методу ваккум-инфильтрации (Лукьянюк, Игнатова, 1988). После дигаплоидизации растения-регенеранты переносили в грунт.

Для кариологическэго анализа использовали временные давленые препараты, приготовленные из меристематических зон культивируемых андроклишшх структур и кончиков корешков растений-регенерантов. Фиксацию проводили в смеси абсолютного спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. В качестве красителя использовали водный раствор фуксин-сернистой кислоты. Для получения монослоя-клеток использовали цитазу - смесь ферментов вилочковой железы виноградной улитки или смесь целлюлазы и пектиназы (1:1).

Цитоэмбриологические исследования проведены совместно с сотрудниками лаборатории эмбриологии Ботанического института им. В. JL Комарова (г. Санкт-Петербург) согласно договору о творческом содружестве. Постоянные микротомные препараты готовили по общепринятой методике (Паушева,1988). Окраску проводили реактивом Шиффа с подкраской гематоксилином по Эрлиху и алциановым синим. Все препараты анализировали и фотографировали под микроскопом (ЫБИ-15).

Для биохимического изучения андроклинных структур экстракцию белков проводили 0,05 М трис-HCl буфером рН 7,5,содержащим 0,1 М КС1 и 0,02М меркаптоэтанола. При температуре + 4 С в течении 30 минут. Содержание белка определяли по Брэдфорду (Bredford, 1972). Электрофорез проводили по методике Лзммли (Laemml i ,1970). Использовали прибор для вертикального электрофореза.в пластинах полиакрила-мидного геля (ПААГ). Нами была использована прерывистая система, состоящая из концентрирующего (верхнего) и разделяющего (нижнего) гелей. Концентрация мономеров верхнего геля - 4%. Буфер для верхнего геля содержал 0,125 М трис-HCL; 0,1% ДСН, рН 6,8. Концентрация мономеров нижнего геля - 12,5%. Буфер для нижнего геля содержал 0,375 М трис-HCL; 0,1% ДСН, рН 8,8. Гель после электрофореза (60 В; 120 В) окрашивали 0,25% раствором кумасси ярко-голубого G-250 в те-

чениэ 12 ч. Электофорез глиадинов проводили по методу использованной Попереля и др., (1989). Биохимическое изучение глютениноп проводили по методике описанной Булатовой (1989). Технологические свойства зерна определяли общепринятыми методами по содерамшп и качеству клейковины (Иадиров, 1988).

Бее экспериментальные данные проанализированы и статистистн-чески обработали с применением общепринятых методик (Урбах, 1975; Валиханоза и др. ,1989; Суханов, 1987).

3. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ФОРМИРОВАНИЕ АНДРОКЛШШХ .СТРУКТУР

3.1. Влияние состава питательной среды и физических факторов на каллусогенез и эмбриоидогенез

Испытаны различные сорта и гибриды пшеницы для отбора генотипов, способных с зысокой частотой образовывать андроклшшие структуры (каллусы, эмбриоиды, глсбулы) и регенерировать зеленые растения. С целью выбора оптимальной питательной среды, способной максимально индуцировать андроклинные структуры, были испытаны среди МС, N6 и Блейдза.

На питательной среде Блейдза -большинство испытанных генотипоь были способны.к индукции андроклинных структур. Максимальный выход эмбриоидов/каллусов обнарулкн у сортов Казахстанская 4 (1,84/2,36%) и Казахстанская 5 (1,15/ 0,69%). На питательной среде Мб наибольший выход эмбриоидов отмечен у сортов Казахстанская 4 (0,80%) и Казахстанская 7 (0,26%). Максимальный выход каллусов наблюдали у сортов Саратовская-29 (2,50%) и Саратовская-42 (1,66%). На среде МС максимальный выход эмбриоидов обнаружн у сорта Казахстанс!?ая 4 (0,87%), каллусов - у сорта Казахстанская 7 (1,21%).

Следовательно, для индукции процессов эмбриоидогенеза у сортов Казахстанская 4 и Казахстанская 5 наиболее благоприятной является среда Блейдза (Рис.4). Для процессов каллусогенеза для всех испытанных генотипов оптимальной является среда N6, что видимо обменяется высоким содержанием в ней 2,4-Д.

Известно, что холодовая предобработка колосьев оказывает пг.'Ло-яяошюе влияние на процессы эмбриоидогенел и кал.«усого!Ича ч культуре пильникор. Однако для каждого генотиич н*»?<5холич •>кег*ри-

ментальный подбор оптимального режима предобработок. Для этого срезанные колосья растений подвергали холодовой предобработке при 7 Сот 1 до И дней. У испытанных сортов и гибридов обнаружены значительные отличия по частоте образования андроклинных структур в зависимости от продолжительности холодовой предобработки. Так, если у гибридов К-6 И и Ш-5 Р2 максимальная частота андроклинии наблюдалась при 1 к 3-х суточной холодовой предобработке соответственно, то у гибрида Б-10 ?2 - при 8 сутках. У сортов Казахстнаская-5 и Ка-захстанская-4 оптимальными оказались 6-ти и 7-ми суточная предобработка соответственно. Наиболее отзывчивыми к холодовой предобработке при 7 С оказались сорт Казахстанская-5 и гибрид Ш-5, у которых процент Еыхода андроклинных структур составил 6,8% и 6,2% соответственно.

По результата;.« проведенных экспериментов установлено, что состав питательных сред и физические воздействия на генеративные органы (холодовая предобработка), оказывают влияние на процессы эмч-риоидогенеза и каллусогенеза в культуре пыльников пшеницы. Путем подбора оптимальных сочетаний этих факторов можно значительно увеличить отзывчивость микроспор к андроклинии в культуре изолированных пыльников пшеницы.

3. 2. Генотипические особенности андрошшнии.

Нами проведены исследования по выявлению отзывчивых сортов и гибридов пшеницы к процессам андроклинии и регенерации растений в культуре изолированных пыльников пшеницы. Среди испытанных генотипов максимальное количество змбриоидов и каллусов обнаружено у сортов Казахстанская 4; Казахстанская 5; Казахстанская 10 и Саратовская 29, у которых выход андроклинных структур.составил 4,01%; 6,98%; 2,64% и 2,98% соответственно' (Табл.1). Менее отзывчивыми оказались сорта Казахстанская 3 и Грекум 476, у которых выход андроклинных структур составил 0,88% и 0,84% соответственно.

Испытанные генотипы тагаке обнаружили различную способность регенерировать растения. Наибольшее количество растенлй-регенерантов получено у сорта Казахстанская 5, Казахстанская 4 и Саратовская 29, где частота регенерации растений составила 1,82%, 1,00% и 1,02% соответственно. По способности образовывать андроклинные структуры

■ Таблица. I.

Гене■■•«•¿кие с-обенности андроклинии в культуре изолированных «

пыльников пшеницы (среда ЕлеРдза, 0,5 мг/л 2,4-Д)

[Количество количество г ¡Количество 1

Г* Й И 0 т и п '.кудьтивиро- ¡полученных | % ¡полученных 1 %

4 ЬА V ^ Г* ¡ванных пыль- ¡андроклинных ¡растений- 1

! ни К ОБ. '.структур. ! ре гене рантов 1 (_

Казахстанская 3 1020 с у 0,Б8 -0,29 4 0.39 + 0,19

Казахстанская 4 2600 104 4,01 1 0,38 52 2,00 + 0,27

Казахстанская 5 7596 530 6,98 * 0,29 290 3,82 0,21

Казахстанская 10 530 14 2,64 0,69 8 1.51 + 0,52

Саратовская 29 1275 36 2,98 1 0,47 13 1,02 + 0,28.

Саратовская 42 2805 22 0,78 ± 0,16 7 0,25 + 0,09

КрасноЕОдопадская 210 896 II 1,21 ±■0,36 0 0,00 + 0,00

Гибрид К-6 Р 1 480 105 22,50 ± 1,50 57 11,87 + 1,46

Гибрид К-б Р 2 1365 . 134 9,73 0,80 58 4,25 + 0.54

Гибрид К-б Р з 2115 ' 241 11,42 * 0.69 132 6,26 + 0,52

Гиорид Е-5 Р 2 315 14 4,44 ± 1,16 •3 0,95 + 0,54

Гибрид Е-Ю Р з; 900 23 . 2,56 0,52 7 0,78 + 0,29

Гибрид Ы Ш-3 Р ? 2235 66 2,95 ± 0,35 16 0,72 + 0,17

Г.!бр!Д 7А Ш-5 Р 2 960 51 5,31 1 0,72 12 1.25 + 0,35

Гибрид Е-б Р 585 9 1.54 ~ 0,50 2 0,34 + 0.24

Гибрид Ш—II Р 1 390 4 1,03 1 0,51 т 0,26 + 0,25

и по частоте регенерации растений испытанные сорта пшеницы были условно подразделены на отзивчиеыэ (частота андроклинии от 2,0% и выше), менее отзывчивые (от 1,0% до 2,05) и неотзывчивые (менее 1.0%) генотипы.

Максимальное количество андроклиных структур обнаружено у гибрида К-6 в Р1 поколении (22,50%), в последующих поколениях этот показатель резко снизился (Г2 9.73%; РЗ 11,42%). У гибрида К-6 материнской формой служил высокоотзыг.чивый сорт мягкой яровой пшеницы Казахстанская 4, а отцовской - средьеотзывчивый сорт озимой пшеницы Красноводоиалскал 210. Результаты наших исследований показали, что у гибрида К-б во всех испытанных поколениях частота индукции анд-роклиннных структур была выше, чем у родительских форм. Следует отметить, что у большинства гибридов наблюдалась максимальная частота андроклинии в первых (П) поколениях.

При культивировании пыльников отдаленных межродовых' гибридов Безостая 1 х Аее. су11пс1г1са и Безостая 1 х Лег. 1г1гг!з1а1а (П, РЗ и Рб поколения) получены каллусы и эмбриоиды. Следует отметить, что ранние поколения гибридов по сравнению с поздники различались по частоте образования андроклинных структур и регенерации растений. Так, в РЗ поколении гибрида Безостая 1 х Ае®. суПЫпса выход эмбриоидов составил 2,08%, а в Рб - 4,18%. У гибрида Безостая 1 х Аее. тапз1а1а обнаружена такая же закономерность, где выход эмбриоидов составил в П 1,632 и 2,28%'в Рб поколении.' Максимальное число растений-регенерантов получено у обоих гибридов в Рб поколении. Выход зеленых растений-регенерантов составил 1,01% и 0,34%. В наших опытах с отдаленными гибридами частота андроклчнии виве в поздних поколениях (Рб), в то время как у внутривидовых гибридов наблюдалась обратная закономерность.

Растения-регенеранты, полученные в культуре пыльников отдаленных гибридов, различались между'собой и донорными растениями по форме колоса и высоте растения (Рис.7). Подобные результаты в культуре пыльников пшеницы получены у Ни (1936). Это видимо связано с тем, что микроспоры гибридов гетерозиготны. В каждом пыльцевом зерне проявляются различные генные комбинации от обоих скрещиваемых родителей. Поэтому растения, полученные из таких микроспор, проявляют признаки обоих родителей.

В литературе отмечается перспективность гибридов с применением

Triticum persicum (Столярова, Дьячук, 1991). В наших эксперимента.; более высокий процент выхода эмбриоидов обнаружен у гибрида Triticum persicum х Triticum turan icum. У гибрида Казахстанская 10 х Triticum timopheevi отмечен высокий выход эмбриоидов в Fl (6.74Z) и высогля частота регенерации растений (2.14Х).

В результате исследовании генотипических особенностей андроклинии нами получено 78 дигаплоидных линии пшеницы, которые переданы в Казахский НИИ земледелия им. В. Р. Вильямса для использования в ге-нетико-селекционных работах.

Таким образом, процесс андроклинии зависит от целого комплекса разнообразных факторов (генотип донорного растения, условия предобработки, состав питательной среды), от сочетания которых зависит частота выхода андроклинных структур и растений регенерантов.

4. Культура изолированных микроспор in vitro

В культуре пыльников пшеницы растения могут регенерировать не только из микроспор, но и из соматических клеток стенки пыльника. Культура изолированных микроспор на жидких средах позволяет устранить возможность образование андроклинных структур из сомат^ееких клеток. В связи с этим была проведена серия экспериментов по культивированию изолированных микроспор на лодкой среде. Самопроизвольный выход микроспор наблюдался на 3-5 сутки культивирования. Часть микроспор начинала делиться, находясь внутри пыльника и образуя многоклеточные комплексы (МК). На-жидкой среде Ыб наблюдалось увеличение частоты образования эбриоидов и каллусных структур по сравнению с твердыми агаризованными средами (Рис.1.). Максимальный выход эмбриоидов обнаружен при концентрации 2,4-Д 1 мг/л (ИХ), а каллусов -*

2 мг/л 2,4-Д (8,5%). Минимальное содержание 2,4-Д (0,5- 1 мг/л) стимулхфовало процесс эмбриоидогенеза как на твердых, так и на жидких питательных средах. При увеличении содержания 2,4гД от 1 до 2 мг/л выход эмбриоидов снижался,• тогда как частота калусогенеза повышалась. В наших экспериментах жидкие среды оказались более благоприятными для процессов андроклинии.

Нами такзгй проводились эксперименты по кондиционированию сред перед культивированием на них изолированных микроспор. В течение 35 дней до самопроизвольного выхода микроспор пыльники и завязи

А - каллусогенел

Рйо.1» Влияние концентрации 2Л-Д на еуход эмбраоидои и каллусов в культуре изолированных пыльникое и микроспор пшеницы.

Л

СЗ Казахстанская 4 (223 Казахстанская 5

.А

I

I

Л

Варианты опытов

РИс.2. Влияние крахмала 1.1), фиколла (.2) л аминокислот (.3) на выход эмбриаидов в культуре изолированных «икроспор пшеницы. I-крахмал (30 г/л); 2-фиколл (30 г/л); 3-фиколл 130 г/л), гистидин (.20 мг/л); глутакин ^.20 мг/л); 1/2 ч-контрояь;

культивировали совместно. Это время (3-5 дней) мы считаем периодом кондиционировали среды. Для количественного контроля степени кондиционирования нами использовано отношение пыльник/завязь. У сортов Казахстанская 4 и Казахстанская 5 максимальные пики образования эм-бриоидсв наблюдались при отношениях 1.5 и 2.0, где процент выхода эмбриоидов составил 18. 7Z и 14. 67% соответственно. При увеличении отношения пыльник/завязь процент выхода эмбриоидов постепенно снижался. Очевидно, для оптимизации условий индуцирования микроспор к развитию in vitro с последующим образованием из них эмбриоидов важное значение имеет степень кондиционирования (пыльник/завязь).

Проведена серия экспериментов с использованием аминокислот (глутамин, аргинин, пролин, гистидин) в культуре изолированных микроспор пшеницы in vitro. Не все аминокислоты, вводимые в жидкие питательные среды (20 мг/л), стимулировали образование эмбриоидов из микроспор.. Максимальная частота змбриоидогенеза наблюдалась на среде с гистидином и глутамином и соответственно равнялась 26,75% и 19,8%. ' . ..

Для увеличения выхода андроклинных структур использовали крахмал и фиколл (по 30 мг/л). Для сортов Казахстанская 4 и Казахстанская 5 более благоприятным оказалось применение фиколла, тогда как крахмал незначительно стимулировал процесс образования андроклинных структур (Рис.2!. Добавление в жидкую питательную среду ами нокислот, гистидина и глутамина (по 20 мг/л), фиколла (30 г/л), а тага? двухкратное уменьшение концентрации солей, содержащих азот ( Ш12504; КНОЗ), значительно стимулировало процесс змбриоидогенеза. Так, если на стандартной среде N6 выход эмбриоидов для сортов Казахстанская 5 и Казахстанская 4 составил 9,2% и 7,8% соответственно. то на модифицированной среде эти показатели увеличивались до 20,01% и 23,9%, соответственно (Рис. 2).

При культивировании изолированных микроспор на жидких средах происходила регенерация растений из эмбриоидов без предварительной пересадки их на среды для регенерации. Это явление, получившеее в литературе название "одноступенчатой" регенерации (Liang, Xu,1987), позволяет сэкономить время и площади в экспериментах для ыасо.окн о получения растений-регенератов в культуре пыльников и изолированных микроспор.

(зообшпл результаты данной серии экспериментов мсмгс. оделап

Eijвод, что для индукции процессов андроклинии более благоприятными < является жидкие среды (N6; 1 мг/л 2,4-Д). Степень кондиционирования и количество 2,4-Д,вводимых в среду, могут иметь решающее значение для индукции процессов эмбриоидо- и каллусогенеза. Аминокислоты гистидин и глутамин (20 мг/л) при уменьшении концентрации солей (1/ 2), содержащих азот, в питательной среде с добавлением фиколла (30 мг/л) стимулируют выход эмбриоидов и регенерацию из них растений.

Б. ПРОЦЕССЫ ШРЗОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЫЛЬНИКОВ И ЫИКРОСГОР ПШЕНИЦЫ

5.1. Развитие микроспор пшеницы in vitro

В культуре изолированных пыльников и микроспор in vitro некоторая часть микроспор отклоняется от гаметофитного пути 'и переключается на спорофитный путь развития. До настоящего времени вопрос о путях развития микроспор in vitro, приводящих к формированию ан-дрсюшнных структур, остается открытым. В связи с этим нами проведе ни цитозмбриологические исследования развития микроспор in vitro и Формирования из них многоклеточных комплексов (МК) в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы (Рис. 3). Культивирование осуществляли на стадии вакуолизированной микроспоры. В процесс деления было вовлечено более 70% микроспор. Однако часть из них на начальных сроках культивирования начинала дегенерировать или приостанавливала свое дальнейшее развитие.

По результатам первого митотического деления образуются структуры можно было подразделить по размерам к..;етки, плотности и интенсивности окрашивания. В первом случае (путь А) образовывали::?, две "неравные" клетки, которые по размерам и плотности окрашивания отличались между собой. Они были условно классифицированы на вегетативные (крупные и интенсивно окрашенные) и генеративные (мелкие) клетки. Во втором случае (путь В) после первого митотического деления образовывались "равные" клетки, которые не отличались между собой по размерам, плотности и интенсивности окрашивания.

После первого неравного деления (путь А) наблюдалось:

1) развитие и деление вегетативной клетки, генеративная клетка не развивалась или претерпевала 2-3 клеточных цикла, затем дегене-

6 К ^

лГГТкгг А- ■ ■ ; .. • > \!

ГО- РА

1-ис.З. Пути развития микроспор в культура, и формирования андроклинных структур.

1-вакуолизированная микроспора в момент введения в культуру; 2-развитие микроспор' по пути А^; 3-развитие микроспор по пути В£; 4-5-формироЕание ИК из вегетативных и генеративных клеток; 6-7-формирование аидроклинных структур в культуре изолированных микроспор пвекяцы; б-формироваы^а энбриондов и каллусов в культуре изолированных пыльников пионицы;

рироиала (путь А1);

2) к процессам деления приступала генеративная клетка, тогда как вегетагивкаэ клет)са приостанавливалась в своем развитии (путь А2);

3) после первого неравного митоза наблюдалось деление обеих клеток, как вегетативной так и генеративной (путь АЗ).

В первом типе неравного деления (путь А1) мл наблюдали как асинхронное, так и синхронное деление. В последующем из активно делящейся вегетативной клетки образовывался многоклеточный комплекс (МК). Полость микроспор заполнялась крупными дехякдмися клетками с хорошо выраженными клеточными стенками. После 12-15 дней культивирования МК. имеющий вид сферы, по размерам в два раза превосходил исходные микроспоры.

Во втором случае, когда после первого неравного деления происходило развитие генеративных клеток (путь А2), вегетативная клетка уменьшалась в объеме и дегенерировала. Генеративная клетка также претерпевала многочисленные деления и образовывала МК, заполняющий всю полость микроспор. Однако для заполнения полости микроспор и выхода клеток из микроспориаяьной оболочки и формирования МК треСу-тся больше времени, следовательно, больше клеточных циклов деления, чем у вегетативных клеток. На наш взгляд, это объясняется не только меньшими размерами генеративных клеток, • но и их более жесткой детерминированностью по сравнению с вегетативннми клетками.

При развитии и делении обеих клеток после первого неравного деления (путь АЗ), также можно было наблюдать образование № При этом также, как и при развитии по пути А1 и А2, не наблюдалось слияния вегетатитных и генеративных клеток.

При развитии по пути В1 после равного деления микроспоры нету пали во второй митоз как синхронно, так и асинхронно. В последующем из активно делящиейся вегетативной клетки.образовывался многоклеточный комплекс (МК). Все клетки, заполняющие полость микроспоры (8 -10 день культивирования), имели одинаковую форму и крупные размеры. На 12-15 дейь культивирования общая оболочка сферы исчезала 1! формировалась глобу.ирная структура. При развитии микроспор по пути В1 для образования эмбриоидов требовалось минимальное время (18-23 дня) по сравнению с другими путями развития. Аналогичное опережение образования МК и выхода его из стенки, микроспор наблюдалось и в

развитии вегетативных клеток после первого неравного деления (путь Л1). При развитии микроспор после равного деления с образованием клеток генеративного типа (путь В2) также наблюдалось формировали» МК, но с гораздо более поздним сроком образования. Вегетативные клетки превосходили генеративные не только по размерам и плотности, по и опережали их по времени развития и формирования №

При развитиии микроспор по пути В1 иногда наблюдалось слияние клеток во время первого митотического деления, которое могло быть источником дигаплоидных эмбриоидов и каллуснчх тканей. Как правило, при культивировании можно встретить с различной частотой все пути развития микроспор. Возможно между ними существует "конкуренция", что указывает на возможное существование механизма регуляции процессов деления и развития микроспор. Нами проведено исследование путей деления микроспор сорта Казахстанская 4 и гибрида К-6 на 7-е сутки культивирования для оценки частоты встречаемости различных типсв развития микроспор. Показано, что не все микроспор» приступали к делению: у сорта Казахстанская 4, доля делящихся микроспор составляла 44,3%, тогда как у гибрида К-б - 30,1%.

В процесс неравного деления (путь А) было вовлечено 27,8% микроспор сорта Казахстанская 4 и 23,ОХ гибрида К-б. Из них у сорт? Казахстанская 4 по пути А1 развивалось - 16,3?; микроспор; А2 - 12,4 A3 - 0,80%, а у ■ гибрида аналогичные показатели составили: 13.29Х; 9,11% и 0,58% соответственно. Как было отмечено выше, самим редко встречающимся типом развития микроспор in .vitro для обоих ге нотипов является путь A3. У сорта Казахстанская 4 по пути A3 развивалось 0,89а микроспор, тогда лак у гибрида К-6 лишь - 0,58%. Б процесс равного деления у сорта Казахстанская 4 и гибрида К-6 было вовлечено 10,47% и 7,11% развивающихся микроспор. Из них по пути В1 у сорта Казахстанская 4 и гибрида K-G развивались 8,58% и 2,3™% микроспор.

Как было отмечено выше, самым оптимальным для быстрого образования МК и андроклинннх структур является рглзвотие микроспор по пути И, поел* равного деления клеток вегетативного типа. Следовательно, первое митотич^ское деление кслроспор является критическим • периодом, который определяет в даяьнвйкм мор|огенетическую потен -дню и возможность реализации спорофитной программы развития.

- 16 - .

5.2. Процессы эмбриоидогенеза и каллусогенеза

При цитоэмбрнологичееком исследовании дальнейшего развития МК I швлены основные пути формирования андроклинных структур. Эмбрион- • догенез по происхождению и способу возникновения подразделяется на первичный, когда эмбриоиды развиваются непосредственно из МК, и вторичный - развитие эмбриоидов происходят из каллусных тканей.

На рис. 4 показано формирование эмбриоидов при культивировании пыльников пшеницы. В результате первого митоза образовывались две "равные" клетки, последующее деление которых приводило к формированию МК и глобулярных структур. При культивировании изолированных микроспор наблюдалось образование своеобразных комплексов, за счет агрегации клеток вокруг UK и глобул. Между клетками микроспор и развивающимися структурами были обнаружены связывающие тяжи. В культуре изолированных пыльников, начальным этапом являлось возникновение ЫК из микроспор и формирование глобулы. Глобула связана со стенкой пыльника "суспензором", через который, возможно, обеспечивается питание развивающейся структуры. Дальнейшее развитие и дифференциация глобул приводили к формированию проэмбрио и эмбриоидов. Нарушение связи через "суспензор" вело к задержке развития глобул и дальнейшей их дегенерации, или к дедифференциации и каллусогенезу.

Образовавшиеся таким путем каллусы обладали морфогенным потенциалом, и регенерация растений происходила через вторичный эмбриои-догенез и органогенез (геммогенез, гемморизогенез). На 2-3 недеда от начала культивирования микроспор наблюдалось формирование глобул, через 3-4 недели отмечалось образование эмриоидов из глобул. Зг,1бриоиды представляли собой плотные структуры овальной формы, имеющие зачатки корневых и стебельных апексов. Своевременная пересадка таких эмбриоидов на среды для регенерации приводила к формированию растений-регенерантов, большая часть которых имела гаплоидный набор хромосом (Рис.4). При задержке пересадки эмбриоидов и дальнейшем культивировании их на индуцирующей среде, содержащей 2,4-Д (0,5-2 мг/л), наблюдалась их дедифференциация и превращение в каллус. В этом случае регенерация растений осуществлялась через органогенез (Рис. б).

В'некоторых случаях наблюдалось явление полиэмбрионии - формирование сросшихся эмбриоидов. Нолиэмбриоиды характеризовались обра-

Рис.Эмориондогенез в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы.

Сторнирование глобулы; 2-развитие глобулы н формирование про-эмбрио; Э-формирование первичного эмбриоида лз микроспор пшеницы; ^-регенерация растений из полиэмбри&пда; 5-гаплоиднкй (,п=21 ; набор хромосом полученньх из первичных омбриоидов пшеницы; б-"одноступенчатая" регенерация растений в культуре изолированных микроспор пшеницы; 7-многорастковь;Я регонерант полученной из микроспор пшеницы;

к . Л» и • ' * • * . * М

.л.-*?

5-я:

-л» "V»

■I , к,<г«'

---., 'I. ................ . , ...Л-

/ • ]

/ И

"•Г'1-

,<••44

V

* *

Я - Ч- V ■

7> '

С®*:-.

•'■'З.'.у..-.I -.-.'Л :<

г - V/« Н-.

/;„ Л?Т :.

.г • . д;

гЛл г \ .

Ы

л*. Л'" Л. »•-.,

Рис.5. Вторк.чный эмбриоидогенез и органогенез в культуре микромикроспор пшеницы.

Г-форыироьание каллусов внутри стенки пыльнике'.; 2-4-форкировашш и разьмтие вторичных эмбрисшдои на пошрхноети и внутри норфоген-»¡их камусов; 5-1емшгелез; б-гем«оризогенез; 7-регенерация рас-танай из нор[огенних каллусов; 8-днгаплоидиый набор хро-

мосом расте ни й - ре i й по рантов пояучеипьл и:з г>тор.1чиьх зибриоилов пса ници.

зеванием общего корня, в то же время они имели несколько щитков, и точек роста.

Глобулы способны дифференцироваться, превращаясь в змбриоиды. В то же время па этом этапе возможна их дедифференцнация и формиро Еание морфогенного каллуса. Дедийеренцпя и чаетичная дегенерация формирующегося амбриоида наблюдалась и на стадии лроэмбрио. При частичной дедифф'зренциации проэмбрио, в дальнейшем процесс морфогенеза осуществлялся по пути органогенеза. .Причем, при каллусирова-нии и дегенерации апикальной части наблюд-гпся ризогенез, что затрудняло регенерационный процесс или даже полностью исключало. При каллусировании и дегенерации базальной части, наблюдался процесс образования почек - геммогенез. При пересадке геммогенных структур на среды для образования корней (ИУК 0,5 мг/л) можно было регенерировать вполне нормальные растения.

Каллуснне ткани отличались от эмбриоидов более поздним периодом появления (30-45 день) и состояли из тканей рыхлой консистенции, без каких-либо признаков дифференциации. По морфологическому строению эти каялуссы отличались между собой. Так у сорта Казахстанская 4 выделены каллусы трех типов; ж?лтовато-рыхлый, белый плотный, светло-зеленый обводненный.

Не все каллусы, полученные из микроспор были способны к дифференциации. Этим свойством обладали только белые плотные каллусы. После третьего пассажа на их поверхности образовывались белые плотные зоны вторичной дифференциации (Рис.5). Сначала на поверхности таких каллусов обособлялся эмбриональный клеточный комплекс (ЭКЮ, который отличался от окружающих тканей наличием мелких мэристимзти-ческих клеток с крупными ядрами (диаметр клетки 44 мкм. ядра 8-16 мкм). Паренхимные клетки, окружающие такие меристематические очаги, имели более крупные размеры (60-80 мкм). В результате многократных делений из РКК образовывались глобулы, которые в дальнейшем формировали вторичны- эмбриоиды. Омбрноиды приставляли собой биполярные структуры с зачатками корневого и стебглевого апексов. По расположению на каллусной ткани вторичные эч:>г.юидн были подразделены на • два типа: 1) образующиеся на поверхности гдллуса; 2) внутри активно делящихся меристематических центров. В начальной стадии развития вторичные змбриоиды были тесно связаны с калллусом, на более поздних стадиях наблюдаюсь их отделение. У эмбриоидов закладывалась

- 20 - ■

автономная.от каллуса проводящая система. На последующих этапах эм-бриоиды были способны регенерировать растения. При нарушении полярности развития глобулярных структур наблюдался процесс органогенеза, при котором регенерация растений осуществлялось через геммогенез и геммориаогенеа.

На основании полученных данных цитоэмбриологичесгах исследований процессов морфогенеза в культуре изолированных пыльников и микроспор пшеницы составлена схема путей регенерации растений из микроспор в культуре in vitro (Рис.6). Процесс регенерации мошт осуществляться через эмбриоидогенез (первичный, вторичный) и органогенез (геммогенез, геммориаогенеа). При регенерации растений через каллусогенез (вторичный эмбриоидогенез и органогенез) по сравнению с первичным эмбриоидогенезом, при котором в основном образуются гаплоиды, отмечено повышение частоты регенерации дигап-лоидных растений (Рис.5). Этот факт является важным, поскольку исключает процедуру колхицинирования и способствует сохранению жизнеспособности растений-регенерантов.

В культуре изолированных пыльников и микроспор можно выделить несколько основных стадии:, стадия глобулы и проэмбрио, которые являются критическими и определяют дальнейшие пути морфогенеза. Регенерация растений происходила как непосредственно из эмбриоидов, так и путем органогенеза - из морфогенных каллусов. Мэрфогенные каллу-си, полученные из микроспор, могут быть использованы как источники ценных гаплоидных линии в различных генетических, биохимических и физиологических исследованиях.

При изучении состава и содержания растворимых белков аидроклинных структур обнаружено, что по мере дифференциации электрофоре-тические спектры усложняются, особенно заметно в зоне высокомолекулярных белков (68 kD), а содержание белка увеличивается. Если у недифференцированных рыхлых каллусов содержание белка составило 1,2%, то у морфогенного - 2,9%. По мере дифференциации эмбриоидов (первичных и вторичных) злектрофоретический спектр и содержание белка увеличивалось, достигая уровня такового у зиготических зародышей (Рис.7).

Исследованные дигагишидные линии по содержанию белка и клей ковшш отличались от родительских форм. Так, у контрольного сорт; Казахстанская 4 содержание бел!« составило 16,3%, а клейковины

I

го

Рис.б. Процессы морфогенеза и регенерации растений в культуре изолированных пыльников л микроспор пшеницы (схема).

■Щ

I

<м см

Ъ 60

2 50 § 40

| 50

¡Ё 20

1,Ю

о ! п

3 ки

!з=э

Д

РТТ

■ \ --' - я

■рг

„"¿г 'г .'.и? г,.^- Ж Г- • ' • • -

а б В Г Д ,

а I 2361 23 а123«123 А 5

Ряс.8. Элдктрофоретаческие спектры глиадинъС СА) к глютенина СЕ) андроклинных дигаллсидкых линии П1е.-:и;;ы. а-донориое растение гибрид К-б; 1-дагаплоидкая линия АДГ 4/7 Я^ 2-АДГ 4/7 Н?; 3-АДГ 4/7 Н3; б-доксрнсе растение гибрид Е-5; 1-дигаплоидная линия АДГ 5/20 Нг; 2-АДГ 5/20 Н?; 3-АДГ 5/20 Н3; .

Рис.7. Элехтрсфоретические спектры (А) и содержание белка СЕ)

в андроклинных структурах пшеницы, а-рыхлый неморфогенный каллус; б-плотаый морфогеннкй-каллус; Б-первичяьЯ эмбрюид; г-вторичный эмбрисид; д-зиготический зародыш.

29,0%. Содержание белка у андроклинных дигаплоидов 5/10; Й/26-9 и 3 /30-3 в НЗ поколениях составило 17,7Х, 17,4Х и 17,6%, соответственно, а содержание клейковины составило - 42,0%; 38,0% и 39,0%, соответственно.

По результатам биохимического анализа качества зерна установлено, что андроклинные дигаплоидные линии по содержанию белка и клейковины значительно превосходят контрольные сорта. По этим показателям можно вести отбор дигаллоидных линий на качество яерна.

Проведены исследования электрофоретического спектра глиадииов андроклинных дигаллоидных линий пшеницы для оценки их генетической стабильности. По элетрофоретическим спектрам андроклинных дигаллоидных линий в Н1-НЗ поколениях не обнаружено существенных отличий, что указывает на чистоту и гомозиготность полученных растений.

Проведенные нами исследования злектрофоритического спвктрэ глютенинов у изученных андроклинных дигаллоидных линий также показали их идентичность спектров в HI-КЗ репродукциях (Рис.8).

ВЫВОДЫ

1. Среди испытанных 13 сортов и 15 гибридов пшеницы выявлены генотипы отзывчивые к процессам андроклинии: сорта Казахстанснгая 4 и Казахстанская 5, а также гибриды созданное с участием указанных сортов (К-6; Е-5; Б-10;). Указанные генотипы рекомендуется использовать в качестве модельных объектов в исследованиях по проблеме андроклинии.

2. Для культуры изолированных микроспор пшеницы наиболее благоприятной является модифицированная жидкая среда N6 (1 мг/л 2,4-Д; ЯО мг/л глутамин; 20 мг/л гистидин; 30 мг/л фиколл; 1/2 концентрации солей азота), а для для культуры изолированных пыльников - среда Блейдза (0,5 мг/л 2,4-Ю-

3. Развитие микроспор пшеницы in vitro осуществляется двумя путями деления: неравное (А;А1; А2; A3;) и равное (В;В1;В2;). Для быстрого образования эмбриоидов наиболее перспективным является развитие микроспор по пути В1, при котором происходит равное деле- • ние клеток вегетативного типа. Опережающее развитие вегетативных клеток приводит к формированию многоклеточных комплексов, из которых в последующем образуются андроклинные структуры (эмОриоиды и

каллусы).

4. Цитозмбриологическимм исследованиями установлено наличие прямого змбриоидогенева в культуре изолированных пыльников и микроспор пвюншш. В'развитии андроклинных структур выявлены критические периоды: а) первый митоз и последующее формирование Ш; б) стадия глобулы; в) стадия ирозыбрио. На критических этапах своего .развития эмбриоиды могут дедифференцироваться в каллус, в этом случае реге-аэрация растений происходит через вторичный эмбриоидогенез или органогенез (гемыогенеэ, гемморизогенез).

5. В зависимости от степени дифференциации и морфогенетичесгай интенции развивающихся андроклинных структур (рыхлые, морфогениие камусси, зибриоиды) содержание к состав растворимых белков значительно изменяется. По мере дифференциации и формирования эмбриоидов (первичные, вторичные) содержание белка возрастает и злектрофорети-чееиие спектры усложняются, достигая уровня их в зиготических зародышах.

6. Получено 78 дигаплоидных линии пшеницы, часть из которых по подержанию белка и клейковины превосходят контрольные сорта и могут рекомендоваться для включения в селекционные программы.

7. В элеотрофоретических спектрах запасных белков (глиадшш и глмгенины), у исследованных андроклинных дигаилоидных линий в Н1-НЗ репродукциях различий не обнаружено.

'Список работ; опубликованных по материалам диссертации

1. Богуспаев К. К., Кударов Б. Р. , Анапияев Б. Б. Индукция гаплоидны.; растений в культуре пыльников пшеницы. // Тез. докл. Респ. конф. Физиолого-генетические основы повышения устойчивости и продуктивности с/х растений. - Алма-Ата, 1988. - С. 121-122.

2. Кударов Б. Р., ' Шамров И. И., Анапияев Б. Б. Структурные особлмосл! норфогенетических изменений в культуре пыльников пшеницы. // Тез. докл. Всес. конф. по биотехнологии зерновых.зкаков. - Алн..-Ата, 1988. - С. 21-22.

У Анапияев Б. К Пути морфогенеза в культуре нулышксв пшеницы. /.' Тев. конф. мол. ученых и специалистов НазГУ. - Алма-Ата, 1Р88,-С. 123.

4. Анапияев Б. Б. Процессы эмСриодогенеза в культуре пыльников пше ницы. // Тез. докл. Всес. конф. мол. учеши: Изучение, охрана и рац. использование природных ресурсов. - Уфа, 1989. -С. 130.

5. Анапияев Б. Б. Процессы морфогенеза в культуре пыльников пшеницы. // Тр. 20 науч. конф. мол. ученых биол. фак. {¿ГУ: Проблемы современной биологии. •- МЬсква, 1989. - 0.73-77.

6. Bogouspaov К. К, Kudarov В. R. , Anapiaev В. В. , Rahimbaev I. R. Division and embryogenesis in isolated microspores of wheat culture. // Embryology and seed reproduction: XI Int. Sym. , -Leningrad, -1990. -P. 23.

7. Kudarov B. R., Anapiaev В. B., Bogouspaev К. K. , Sliawov 1. I. , Batygina Т. B. Pathways of morfogénesis in culture of wheat, anther. // Embryology and seed reproduction: XI Int. Sym. , -Leningrad. -1990. -P. 212.

8. Анапияев Б. Б., Богуспаев К. К., Кударов Б. Р., Рахимбаев И. Р. Использование изолированных пыльников и микроспор в селекции пшеницы. // Материалы науч. конф. по с/х биотехнологии. - Целиноград. 1991. - С. 53-54.

9. Анапияев Б. Б., Богуспаев К К., Мэгебаев О. Ш. Культура изолированных пыльников в селекции пшеницы. // Новости нау си Казахстана. - Алма-Ата, - 1991. - С. 33-34.

Формат бум. C0X84'/i6- Объем 1 п. л. Зак. 551 27.04.91 г. Тир. 100 Отпечатано на ротапринте в типографии Госплана КазССР. ул. Мира, 115.