Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Андрогенез in vitro у яровой пшеницы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Андрогенез in vitro у яровой пшеницы"

На правах рукописи

ГОРБУНОВА ~ Г {5 ОД

Валентина Юрьевна

~ 3 МАЙ 2003

Л11ДРОГЕНЕЗ IN VITRO У ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ

03.00.15. - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Башкирском государственном педагогическом институте и Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

С.А. Гостимский

доктор биологических наук, П.Н. Харченко

доктор биологических наук, профессор И.П.Гавршпок

Ведущая организация: Ботанический институт РАН.

Защита диссертации состоится 21 апреля 2000 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 020.18.02 при Государственном научном центре РФ - Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова по адресу:

190000, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И. Вавилова.

Автореферат разослан " 20 марта" 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Э.А.Гончарова

/7 т. и, о п их.

Общая характеристика работы

Актуальность темы диссертации. В современных генетических, молекулярно-биологических, биотехнологических и селекционных исследованиях важнейших сельскохозяйственных культур существуют проблемы^ решение которых возможно только с помощью высокоэффективных методов, позволяющих выявить генетический потенциал растений.

Внедрение новых клеточных технологий в сочетании с методами классической генетики и селекции открывает большие перспективы и для практического использования, и для решения фундаментальных проблем генетики, биотехнологии и физиологии растений.

Сказанное в большей степени относится к методу культивирования изолированных пыльников, основанного на использовании явления андрогенеза in vitro - процесса образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна - гаметофита высших растений (Guha, Maheshvari, 1964). Этот уникальный феномен связан с переключением генетической программы развития спорогенных клеток с обычного для них гаметофитного пути на принципиально иной - спорофитный путь развития. Смены поколений (спорофитного на гаметофитное), характерной для растений in vivo, не происходит; а производные спорогешплх клеток - микроспоры и пыльцевые зерна ведут себя подобно зиготам ( Батыгина, 1978-1992; Горбунова и др.1993). Поэтому андрогенез in vitro рассматривается как особая система размножения растений (Суханов,1983), позволяющая ускоренно получать полностью гомозиготные растения-регенеранты при гомозиготизации гаплоидных растений, выращенных из микроспор гибридных форм в культуре изолировнных пыльников.

Использование в качестве объекта для данных исследований яровой мягкой пшеницы, имеющей огромное народнохозяйственное значение объясняется тем, что не разработаны высокоэффективные технологии массового получения гаплоидных растений. Основная причина этого - методические и методологические трудности, связанные с исследованием и использованием андрогенеза in vitro у представителей именно этого семейства.

Одной из принципиальных проблем считается низкая продуктивность андрогенеза in vitro. Перетасовка условий культивирования, состава питательных сред, особенно их гормональных компонентов, для яровой мягкой пшеницы не стала такой же продуктивной, как для культуры тканей двудольных.

До настоящего времени открыт вопрос об индукторах андрогенеза in vitro. Остается далекой от окончательного решения и ключевая проблема андрогенеза in vitro - механизм переключения генетической программы развития микроспор/ клеток пыльцевого зерна с гаметофитного пути на спорофитный. Не исследованы вопросы: каковы предпосылки этого явления в условиях in vivo, каковы

начальные этапы дифференциации микроспор на эмбриоидогенез и каллусогенез и каковы эндогенные факторы, предопределяющие выбор различных путей морфогенеза. Поэтому можно предположить, что исследование молекулярно-генетических особенностей ответной реакции экспланта на условия культивирования и баланса эндо- и экзогенных фитогормонов как в момент инокуляции экспланта в питательные среды, так и в процессе культивирования, являются решающими и для понимания дифферециальных путей морфогенеза. Изучение этих вопросов может иметь принципиальное значение, так как, знание механизмов "переключения" генетических систем развития микроспор, могло бы приблизить к возможности управления процессом морфогенеза в культуре изолированных пыльников и решению фундаментальной проблемы современной биологии - проблемы морфогенеза.

Цель исследования заключалась в выявлении возможности дифференциальной экспрессии генов, ответственных за реализацию спорофитной генетической программы развития микроспор а также в изучении роли эндогенных фитогормонов пыльника в регуляции спорофитного пути в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы.

В процессе реализации поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучение закономерностей нетрадиционной системы бесполого размножения

в культуре изолированных пыльников.

2. Исследование генетической изменчивости морфогенных образований и андроклинных удвоенных гаплоидных (АДГ) растений на молекулярном, хромосомном и геномном уровнях.

3. Изучение характера связи между генетической и фенотипической изменчивостью АДГ форм.

4. Выявление эндогенных факторов, влияющих на андрогенез in vitro и изучение

их роль.

5. Проведение цитологического мониторинга всего процесса культивирования

изолированных пыльников, используя возможности светового (СМ) и электронного микроскопов разных типов: сканирущего (СЭМ) и трансмиссионного (ТЭМ). Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Возможность реализации генетической системы гомофазного (спорофит -спорофит) пути развития микроспор в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы, прямым доказательством которого является получение чистых линий исходных сортов в культуре изолированных пыльников.

2. Осуществление процесса переключения генетической программы развития

микроспор с гаметофитного на спорофитный путь при экспрессии генов, участвующих в регуляции и функционировании этапов клеточного цикла.

3. Возможность создания в культуре изолированных пыльников различных клеточных систем с высоким мофогенным потенциалом: эмбриоидов и морфогенных каллусов. Формирование таких структур зависит от: фазы развития микроспор, эндогенного уровня фитогормонов в экспланте и концентрации 2,4-Д в питательной среде.

4. Возможность управления геномной изменчивостью с целью сохранения исходной плоидности ядер микроспор и формирование андроклинных удвоенных гаплоидных растений-регенерантов с нормальным набором хромосом. Это важный фактор культивирования изолированных пыльников такого сложного аллоплоида, какой является яровая мягкая пшеница.

5. Использование RAPD - ГТЦР анализа амплифицированных фрагментов ДНК

исходных и АДГ линий для молекулярно-генетического анализа изменчивости при андрогенезе in vitro.

Научная новнзна и практическая ценность работы состоит в проведенном впервые широком системном исследовашш роли эндогенных и экзогенных факторов, детерминирующих спорофитный путь развития in vitro у яровой мягкой пшеницы.

Впервые изучены и являются приоритетными: синтез в ревертазной реакции кДНК, на основе мРНК экспланта, дифференциально экспрессирующейся в ответ на предобработку изолированных пыльников низкими положительными температурами.

Впервые экспериментально продемонстрирована зависимость дифференциальных путей морфогенеза (эмбриоидогенез и /или каллусогенез) у яровой мягкой пшеницы от концентрации эндогенных фитогормонов, и зависимость индукции эмбриоидогенеза от концентрации 2,4-Д в питательной среде, адекватной эндогенному уровню фитогормонов в экспланте.

Выявлены и описаны закономерности формирования клеточных структур с различной морфогенной способностью и проведен комплексный мониторинг всех ключевых моментов культивирования изолированных пыльников. Использование методов световой и электронной микроскопии в сочетании с твердофазным иммуноферментным анализом фитогормонов позволило описать особенности морфогенеза в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы и показать, что синхронность многих изученных факторов: фаза развития микроспоры, ее эндогенные характеристики (развитие ядра, наличие вакуолей), состояние стенок гнезда пыльников (наличие фиброзных утолщений в эндотеции) и концентрация эндогенных фитогормонов в пыльнике в момент инокуляции их на питательные среды, являются ключевыми для успешного осуществления прямого андрогенеза in vitro.

С помощью RAPD - ПЦР метода исследован характер наследования фрагментов ДНК у АДГ форм.

Исследована динамика изменения градиентов концентраций фитогормонов в замкнутой системе пыльник - питательная среда в течение 21 дня и изучен характер наследования признака "содержание АЬК" у АДГ форм.

Проведен сравнительный анализ альтернативных путей морфогенеза в культуре изолированных пыльников. Определены, конкретизированы и визуализированы феиотипические и цитологические маркеры, соответствующие оптимальной для андрогенеза in vitro фазе микроспорогенеза.

Унифицирована терминология, используемая для описания процессов, происходящих при культивировании изолированных пыльников.

Разработана технология прямого андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы, которая защищена тремя авторскими свидетельствами.

Получены андроклинные удвоенные гаплоидные растения и линии, характеризующиеся высокой продуктивностью, засухоустойчивостью и скороспелостью.

Реализация результатов исследования заключается в том, что технология культивирования изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы внедрена в Башкирском НИИ земледелия и селекции полевых культур.

Андроклинные удвоенные гаплоидные гибридные линии, полученные в ходе проведения экспериментов в культуре изолированных пыльников испытываются в селекционных учреждениях Башкортостана.

Полученные теоретические и практические результаты активно используются при чтении курсов общей генетики с основами селекции, биотехнологии и сцецкурсов в Башкирском государственном педагогическом институте.

Личный вклад соискателя. Инициация программы исследования осуществлена автором. Результаты исследований, представленных в диссертации, получены при непосредственном личном участии диссертанта или под его руководством. Интерпретация результатов исследования и оформление выводов выполнены самостоятельно. Вклад автора был опреляющим и при написании научных статей.

Апробация работы. Основные положения настоящего исследования обсуждались и были представлены на 3,4, 5 съездах ВОГиС им. Н.И. Вавилова (Ленинград, 1977; Кишинев, 1982; Москва, 1987); Учредительном, 1 и 2 съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Минск, 1992; Саратов, 1994; СПб, 2000); Всесоюзных конференций: по генетике развития (Ташкент, 1980), по биохимии НК и метаболизму белка (Минск 1981), экологической генетике растений и животных (Кишинев, 1982, 1984, 1987, 1989, 1991); на 1 и 2 Всесоюзной школе-семинаре по иммуноферментному анализу фитогормонов (Уфа, 1989, 1991); 2 и 3 Всесоюзных съездах физиологов растений (Минск, 1990, СПб, 1993); Международных рабочих совещаниях по программе 5.1.1.1.

КПНТП СЭВ (Алма-Ата, 1988, 1990; Москва, 1990); Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988; Москва, 1989, 1990-1992; Алматы, 1993, 1999); на 11 Международном симпозиуме по эмбриологии и семенному размножению (Ленинград, 1990); на 12, 13 и 14 Международных конгрессах по половому размножению растений ( Ohio, 1992; Vienna, 1994; Lome, 1996); на международных конференциях: "Биология клеток растений in vitro, биотехнолопи и сохранение генофонда (Москва, 1997); "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998), "Клеточная и молекулярная биология растений" (Varna, 1998).

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, включающих: обзор литературных источников по проблеме, материалы и методы исследования и четырех глав с результатами и их обсуждением. Имеется также заключение, выводы и список цитированной литературы. Объем основного текста работы составляет 290 страниц, включая 61 рисунок и 46 таблиц. Список использованной литературы включает 465 наименований, в том числе 322 на иностранных языках.

Связь работы с крупными научными программами.

За время выполнения работы получены гранты следующих фондов: ГНТП "Новейшие методы биоинженерии" (1987-1993), "Приоритетные направления генетики" (1989), "Российского фонда фундаментальных исследований" (19941995, 1999-2001), Фонда "Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки" (1997-2000 гг.).

Автор выражает сердечную благодарность чл-корр. РАН Бутенко Р.Г., проф., д.б.н. Шаминой З.Б. и проф., д.б.н. Батыгиной Т.Б за инициацию данных исследовании.

Глубокую признательность диссертант выражает проф., д.б.н. Крупнову В.А., проф., д.б.н. .Вахитову В.А., к.б.н. Внучковой В.А. - к сожалению, скоропостижно ушедшей от нас, за постоянное внимание к работе. Также благодарит коллег, которые принимали участие в проведении экспериментов и обсуждении результатов: д.б.н. Кудоярову Г.Р., к.б.н. Круглову H.H., к.б.н. Геращенкова Г.А., к.б.н. Абрамова С.Н., Надольскую С.Н., Зарянову Л.Д., за неоценимую помощь при оформлении работы - к.б.н. Богданова М.Р., за методическую помощь при сканирующем электронном микроскогагровании -к.б.н. Г.Е.Титову.

Объекты и методы исследований

Исходным материалом служили районированные и перспективные для зоны Южного Урала сорта и линии яровой мягкой пшеницы; гибридные формы, полученные автором; а также селекционно-генетический материал, любезно предоставленный Е.Б.Буданпсиной (Гибрид 21, Линии 37,38), В.А.Крупновым

(почти изогенные линии), Ю.М.Козловым (Линия 35).

В работе использовали: общепринятые приемы культивироания изолированных органов растений (Бутенко, 1964), культуры изолированных пыльников пшеницы (Sunderland, 1971; Heberle-Bors, 1982; Суханов, 1983; Дьячук и др., 1988; Горбунова и др., 1986-1998).

Применяли общепринятые цито-гистологические методы (Бродский, 1966; Батыгина и др., 1974; Паушева, 1978) с незначительными модификациями (Горбунова, 1993).

Исследование веретена деления ядер микроспор выполнено по прописи Н.В.Шаминой (устное сообщение).

Иммуноферментный анализ фитогормонов в пыльниках проведен по методикам, разработанным Г.Р. Кудояровой и др.(1986-1992).

Молекулярно-генетические исследования проводились по методикам, модифицированным Г.А.ГеращенковЫм (1998).

Тотальную ДНК 4-х дневных этиолированных проростков пшеницы для RAPD-анализа выделяли по модифицированному методу Graham (1987). Полученную ДНК анализировали в 1% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Количество ДНК в образце определяли с помощью DNA mini-fluorom-eter фирмы Hoefer Scientific Instruments.

В работе использовали 15 праймеров длиной от 10 до 18 нуклеотидов. Полимеразную цепную реакцию ДНК проводили в амплификаторе Терцик МС2 (Россия), используя 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 0.2 мМ каждого dNTP, 10 pmol праймера, 10 нг ДНК, 2 ед Тац-поошмеразы в 1х PCR-буфере Бион, Россия). Температурный профиль полимеразиой цепной реакции был следующим: инициирующая денатурация ДНК - 94"С 3 мин, затем 3 цикла амплификации с мягким отжигом (94°С 0.5 мин, 38°С 1 мин, 72°С 1 мин), далее 30 циклов амплификации (93"С 0.5 мин, 48иС 1 мин, 72"С 1 мин), заключительная элонгация 72°С 5 мин. Необходимость проведения трех циклов амплификации с мягким отжигом была продиктована необходимостью увеличения синтеза гетеродимерных молекул. Оказалось, что некоторые праймеры проявляют неполную комплементарность ДНК-матрице. Поэтому в предварительных экспериментах было установлено, что мягкий отжиг не менял молекулярных спектров в сравнении с реакцией амплификации, при которой использовался только строгий отжиг. Для коротких праймеров: Ds, Grig-3, Gng-13, Р37 и Р42 отжиг вели при температуре 40°С в течение 0.5 мин. Полиморфность тестируемых локусов и генетические расстояния рассчитывали по формулам, приведенным в работах Ю.М.Сиволапа и др.(1998).

Статистическую обработку полученных данных проводили по общепринятым методикам (Рокицкий, 1974) с использовшшем пакета программ для IBM.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Зависимость андрогенеза in vitro от стадии развития микроспоры и состояния стенок гнезда пыльника

Исследователи, занимающиеся проблемами эмбриоидогенеза не пришли к единому мнению о фазе развития микроспор, наиболее адекватной для начала культивирования пыльников с целью получения гаплоидных эмбриоидных структур. Имеющиеся исследования свидетельствуют о том, что благоприятная фаза развития микроспор и пыльцевых зерен (и, естественно, благоприятный период в развитии пыльника в целом) в момент инокуляции - один из основных факторов, определяющих успешное культивирование изолированных пыльников как злаков, так и представителей других семейств. Микроспоры и пыльцевые зерна реагируют на условия культивирования только в пределах ограниченного промежутка времени. Согласно литературным данным (Wilson, et al., 1978; Sunderland et al., 1979; Wheatley et al, 1986; Hu, 1986; Schumann, 1987) и результатам наших исследований (Горбунова и совт., 1988,1997), у злаков фазой, оптимальной для индукции андрогенеза in vitro является фаза сильновакуолизированной микроспоры, соответствующая постмейотическому периоду в развитии пыльника или завершению этапа созревания пылышка.

Культивировали пыльники, микроспоры которых находились на разных фазах микроспорогенеза. Как показывают результаты, культивирование пыльников, болышшство микроспор которых находится на поздней фазе микроспорогенеза, приводит к повышению продуктивности эмбриовдогенеза. В то же время, чем больше микроспор, находящихся на средней фазе микроспорогенеза в пылышке, тем меньше морфогенных структур (табл.1).

Многолинейная корреляция выявила и то, что микроспоры больших размеров не обязательно расположены в крупных пыльниках, и наоборот; мелкие микроспоры не всегда принадлежат только мелким пыльникам. Показано также, что размеры ядер микроспор не зависят как от размеров пыльника, так и микроспор. В то же время, оба показателя не влияют на эмбрноидогенез in vitro. Не обнаружено прямой корреляции и между величиной ядер и продуктивностью эмбриоидогенеза.

Из результатов, приведенных в таблице 1, также следует, что фазы микроспорогенеза зависят и/или соответствуют размерам пыльника.

Примечателен тот факт, что чем больше мелких микроспор в пыльнике, тем ниже интенсивность эмбриоидогенеза. Наличие плохо окрашиваемых ацетокармином микроспор не способствует повышению продуктивности андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы.

11римечагелен тот факц 'по чем больше мелких микроспор в пыльнике, тем ниже интенсивность эмбриоидогенеза. Наличие плохо окрашиваемых ацетокармином микроспор не способствует повышению продуктивности андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы.

Таблица 1

Корреляционная решетка взаимосвязи цитологических параметров сорта Скала с продуктивностью эмбриовдогенеза

Признаки Размер пыльника Эмбриоидогенез

Размер микроспор 0,5143 0,0286

Размер ядер 0,1167 0,06124

Ранняя микроспора 0,3050 0,0650

Средняя микроспора 0,2777 -0,5401

Поздняя микроспора 0,5002 0,7000

Размер делящихся микроспор 0,4082 0,2500

Мелкие микроспоры 0,381 -0,182

Плохо окрашиваемые микроспоры. 0,239 -0,387

г > 0,4. значимо на 0,05% уровне

Согласно полученным данным, состояние стенки гнезда пыльника в момент инокуляции у всех исследованных генотипов яровой мягкой пшеницы, проявляющих отзывчивость на условия культивирования, сходна: начинается дегенерация клеток тапетума и среднего слоя, кутшшзация оболочек экзотеция, формирование фиброзных утолщений в оболочках клеток эндотеция (Горбунова, 1993)

Факту начала формирования фиброзных утолщений в оболочках клеток эвдотеция мы придаем особое значение. Установлено, что такие утолщения появляются синхронно с изменением популяции микроспор в пыльнике в сторону увеличения (более 50%) доли микроспор, находящихся в сильновакуолизированной фазе микроспорогенеза (рис. 1, ф). В целом, появление фиброзных утолщений характеризует начало качественного сдвига в развитии пыльников не только яровой мягкой пшеницы, но и тритикале и озимой ржи (Горбунова, 1992).

Таким образом, анализ литературных и собственных экспериментальных данных (Горбунова, 1992, 1993) позволил выявить следующие важнейшие особенности развития пыльника и микроспор, знание которых способствует унификации начальных этапов андрогенеза in vitro. К ним относятся:

1. Значительная морфологическая и функциональная гетерогенность популяции микроспор in vivo, характеризующая полиморфизм микроспор, находящихся в пыльнике в фазу поздней стадии развития микроспор. Определите четких цитологических и фенотипических критериев морфогенных микроспор позволяет повысить продуктивность эмбриовдогенеза в культуре изолированных пыльников. При этом, размер микроспор не является определяющей характеристикой морфогенности микроспор.

Рис. 1. Фаза сильновакуализированной (поздней) микроспоры: I - микроспора на средней стадии развития, П - микроспора на поздней стадии развития. Я -ядро, В - вакуоль, П - пора, Ф - фиброзные утолщения эндотеция; х 120.

**

М 12 34 567 8 9 10 Праймер Р-2

М 1 2 3 45 6789 10 Праймер Р-3

Рис.2. Дифференциальный дисплей кДНК сорта Жница. М- молекулярттй маркер, 1-10-варианты амплификации кДНК, четные - при обработке холодом.

2. При культивировании изолированных пыльников необходимо учесть, что наибольшая продуктивность эмбриоидогенеза достигается в тех пыльниках, большинство микроспор которых находится на поздней стадии развития, маркером которой является наличие большой вакуоли, развитого ядра в микроспоре и зрелого эндотеция в стенке гнезда пыльника.

3. Фенотипическим критерием для срезания колосьев перед предобработкой и инокуляцией является расположите кончика колоса на 1/5 расстояния между лигулой предпоследнего листа и флаговым.

Влняние низких положительных температур на андрогенез in vitro

Начальным этапом технологии культивирования изолированных пыльников является воздействие на изолированные колосья низкими положительными температурами (+3 - +7°С) в течение 4-7 дней.

Вопрос состоит в том, как реагируют микроспоры на воздействие температурного шока. Результаты проведенных нами экспериментов свидетельствуют, что деление ядер микроспор происходит только в тех га них, которые отрываются от орбикул и «выпадают» в полость гнезда пыльника. Те микроспоры, которые остаются прикрепленными к орбикулам и через них - к стенке гнезда пыльника, не приступают к делению.

Микроспоры, находящиеся на средней фазе микроспорогенеза, чаще всего, остаются прикрепленными к тапетуму и поэтому редко приступают к делению.

У пыльников, микроспоры которых находятся на ранних фазах микроспорогенеза, не развит эндотеций. то есть отсутствуют фиброзные утолщения, даже холодовая предобработка не приводит их к делениям. Они как бы "замирают" в своем развитии. Фенотипически эту фазу развития можно определить по соотношению расстояния между лигулой предпоследнего и флаговым листьями. Если кончик колоса, находящегося в трубке, располагается в середине вышеназванного расстояния, то это соответствует ранней, невакуолизировашюй фазе микроспорогенеза.

В литературе сосуществуют разноречивые мнения о влиянии этого приема на микроспоры культивируемых пыльников. Для внесения ясности в исследуемую проблему, мы изучили динамику изменения эндогенного содержание ИУК и АБК в пыльниках, начиная с момента срезания колосьев в полевых условиях и после 4,6,7.8 дней температурных воздействий на колосья донорных растений. Результаты эксперимента приведены в таблице 2. Сорта различались и по исходному уровню эндогенных фитогормонов, и по динамике накопления АБК и ИУК в ответ на воздействие холодового шока.

'Гак, у сорта Скала за 8 дней предобработки пониженной температурой концентрация ИУК в пыльниках увеличивалась в 14 раз, а концентрация АЬК в 6 раз. Сходные изменения в сторону увеличения концентрации эндогенных фитогормонов наблюдалась у всех изученных сортов. Это свидетельствует о

Таблица 2

Содержание фитогормонов в пыльниках при воздействии низкими положительными температурами

Сорт Число дней Фито гормоны, нг/г

воздействия ПУК АБК

0 2,25 + 0,15 38,36 ± 1,7

4 10,4 + 0,25 112,4 ± 1,2

Скала 6 25,4 ± 0,30 158,6 ± 1,2

7 30,2 + 0,30 192,2 + 1,3

8 28,4 ±0,35 187,2 ± 1,5

С-29 0 2,25 ±0,13 55,96 ±0,9

7 4,47 ± 0,20 70,9 ± 1,0

Sonalika 0 8,02 ±0,12 88,7 ± 1,1

7 45,4 ±0,16 120,8 ± 1,2

0 3,55 ±0,10 85,5 ± 0,9

Tr. Timoph 4 9,61 ±0,19 428,9 ± 1,8

6 7,63 ±0,15 538,5 + 2,1

8 13,6 ±0,14 761,4 ±2,2

Московская 35 0 1,36 ±0,10 27,04 ± 0,6

7 2,24 ±0,14 95,9 ±0,6

0 0,80 ±0,10 125,2 ± 1,1

Tr. Dirk Vrn 33 7 1,74 ±0,12 166,9 ± 1,2

8 2,24 ±0,14 170,6 ± 1,4

том, что холодовое воздействие является большим стрессом для микроспор и они "выпадают" в полость гнезда пыльника. В связи с этим, микроспоры "голодают". В то же время, возможности транскрипции в ядре в этот период также ограничены. Однако, происходит нечто удивительное: как видно из результатов наших исследований, в ответ на воздействие низкими положительными температурами, в пыльниках накапливается небольшое количество м-РНК. Пока происхождение ее не понятно: то ли она транскрибируется заново, то ли в цитоплазму поступает готовая м-РНК спорофита, как предполагает J. Dikinson (1987). Вполне вероятно, что предположение это неверно, так как, по последним данным молекулярно-генетических исследований, время полужизни мРНК составляет всего 15-30 мин.

И появление спорофитной генетической информации в микроспорах, которые еще находятся, по всей видимости, в фазе Gt клеточного цикла является решающей для дифференциации путей морфогенеза в культуре изолированных пыльников. Только те микроспоры, которые не прошли некую точку в фазе G,

клеточного цикла в момент срезания колосьев, могут развиться в многоклеточные образования эмбриоидоподобного типа, тогда как микроспоры, уже прошедшие эту точку, хотя и находятся в фазе О,, выполняют гаметофитную программу развития.

В связи с этим, было интересно исследовать наличие транскриптов, дифференциально экспрессирующихся в пылышках под влиянием пониженных температур. Поэтому, при изучении функциональной активности мРНК использовали метод дифференциального дисплея, состояццш из двух этапов: ревертазной реакции на основе полиА* мРНК и последующей полимеразной цепной реакции.

Различные варианты кДНК получали в ревертазной реакции на основе следующих Т-богатых якорных праймеров (табл.3). Использование Т-богатых якорных праймеров с динуклеотидным мотивом на 3'-конце необходимо для упрощения и сегрегации субпопуляций кДНК при синтезе цепей кДНК.

На сравниваемых матрицах кДНК была проведена полимеразная цепная реакция без Т-праймеров и с использованием комбинации четырех Т-богатых якорных праймеров с динуклеотидным мотивом на 3 - конце (в качестве 3 -праймеров) и 30 праймеров различной структуры с размером от 15 до 30 нуклеотидов (в качестве 5'- праймеров). Большая часть 5'- праймеров выбраны нами не случайно: некоторые из них составлены на основе нуклеотидных последовательностей, кодирующих ключевые белки клеточного цикла.

Амплнфицированные кДНК-варианты анализировали при помощи электрофореза в агарозно.м геле. Как показывают результаты эксперимента, основные компоненты амплификации накапливаются в диапазоне от 1700 п.н. и ниже. На рисунке 2 представлены электрофореграммы, полученные с использованием праймера Р-2 (на основе сс!с 25 протеннкиназы). В некоторых вариантах (треки 1,2- без Т25-праймера, треки 7,8 - с ТМС-праймером и треки 9, 10 - с ТМТ-праймером) хорошо видны отличия фрагментов амплификации кДНК. С праймером Р-3 (сс!с2 протешшшаза) также было выявлено небольшое отличие в спектрах амплифицированных фрагментов кДНК (треки 1,2 - без Т-праймеров и треки 3, 4 - с ТМ А-праймером).

Таблица 3

Т-богатые праймеры

N Якорные праймеры 5'~3' последовательность

1 Т25 ВюППЧ??;

2 ТМА В юйп-рвс-срс-117-М -а

3 тмв ВкЯш^с-срс-^-М^

4 ТМС ВЮПП-£8С^С-1|7-М-С

5 тмт ВюПп-^с-с^с-^-М-!

Учитывая то обстоятельство, что четкие различия между контрольными и исследованными вариантами обнаружены с помощью праймеров, ответственных за синтез протеинкиназ клеточного цикла, выделенная нами мРНК является транскриптом генов, специфически переключающих генетическую программу развития микроспор с гаметофитного на спорофитную.

Таким образом, из представленных результатов следует, что низкие положительные температуры индуцируют изменение функциональной активности м-РНК, результатом чего являются изменения как ориентации, так и конфигурации веретена деления, которые приводят к равному делению ядра микроспоры (рис. 3 а, б). В таких микроспорах подавляется экспрессия гаметофитной программы развития.

Цитологический мониторинг предобработки пыльников перед инокуляцией выявил появление клеток с двумя равными ядрами при разных положениях веретена деления по отношению к оси микроспоры: имелись равные ядра при перпендикулярном расположении оси деления ядра микроспоры относительно общей оси микроспоры (рис.3, б) и при другом, неперпендикулярном расположении взаимных осей (рис.3,а). При этом веретено деления микроспор равного митоза имеет конфигурацию зонта с совершенно одинаковыми сторонами. Направление осей веретена деления произвольное. Этот феномен может свидетельствовать о первичности появления спорофитной информации и независимости образования двух идентичных ядер от расположения осей деления и местонахождения ядра микроспоры: в центре или на периферии клетки. Как видно из приведенных микрофотографий, делящиеся ядра могут располагаться около поры микроспоры, в то же время, к равному делению приводит и деление ядра, расположенного в центре и на проксимальном конце клетки.

Те микроспоры, в цитоплазме которых появилась мРНК гаметофита или ядро которых миновало S фазу клеточного цикла до воздействия низкими температурами, продолжают реализацию гаметофитной программы развития, что приводит к неравным делениям ядра микроспоры (рис.3 в,г). Реализация программы гаметофитной генетической информации завершается вторым митотическим делением в пыльцевом зерне, при котором делится ядро генеративной клетки. Дальнейшее развитие таких микроспор зависит от состава питательных сред, но чаще всего, они развиваются по непрямому пути андрогенеза in vitro, результатом чего является каллусогенез.

Таким образом, равный гаплоидный митоз в микроспорах, зависит только от генетической информации о спорофитном пути развития, эксперессирующейся вследствие воздействия холода на постмейотическую микроспору, еще не приступившую к синтезу гаметофитной м-РНК.

Рис.3. Митотическое деление ядра микроспоры: а - конфигурация веретена деления раного митоза; б - спорофитное, равное деление ядра; в - конфигуращи веретена неравного митоза; г - неравные ядра и клетки, х 500. 1 - генеративная клетка, 2 - вегетативная клетка.

Эндо- и экзогенная регуляция аидрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы Чувствительность генотипов к 2,4-Д- Показано, что исследуемые генотипы по-разному реагируют на действие 2,4-Д. Самым чувствительным является сорт Sonalika, у которой стимулирующая рост доза 2,4-Д (СД >ск) равна 0,1 мг/л. Концентрация 2,4-Д, способная ингибировать ростовые процессы (ИД.0) для этого сорта равны 0,4 мг/л. На рисунке 4 приводятся также кривые доза-эффект для генотипа Московская 35, у которой соответствующие дозы равны 1,0 и 1,6 мг/л.

0 0,5 I 1,5 2 2.5 3 3,5 4 концентрация 2,4-Д мг/л

Рис.4. Кривые доза-эффект сортов: • - БопаИса, ■ - Московская-35.

Влияние концентрации 2,4-Д. При культивировании изолированных пыльников подбор оптимальных концентраций гормональных компонентов культуралыгой среды является ключевым этапом. Однако он носит случайный характер, т.е. исследователи проводят перебор широкого диапазона концентраций фитогормонов и их сочетаний друг с другом с целью найти наиболее удачную комбинацию фитогормонов для культивирования каждого генотипа.

Установлено, что 2,4-Д индуцирует образование различных морфогенетических структур в культуре изолированных пыльников: эмбриоидов и каллусов. Так, у сорта БопаШса на питательной среде, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,1 мг/л продуктивность эмбриоидогенеза достигала 151,8% по отношению к количеству инокулированных пыльников (табл.4). У сорта Скала на той же среде продуктивны 59,1% пыльников, а на среде с концентрацией ауксина 0,25 мг/л выход составил 41,67%, в то время, как на среде с содержанием 1,0 мг/л 2,4-Д - всего 11,1%. Для Линии 35 (Ша 66 х Кавказ) выход эмбриоидов был значительно выше на среде с содержанием 1,0 мг/л 2,4-Д (71,67%), чем на среде с концентрацией 0,25 мг/л (14%).

Таким образом, у всех исследованных сортов, кроме Линии 35, при концентрации 2,4-Д, в питательной среде, равной 1,5 и 2,0 мг/л интенсивность каллусогенеза выше интенсивности эмбриоидогенеза.

Культивировали также изолированные пыльники гибридных форм второго поколения. Оказалось, что почти все они проявляют отзывчивость к культуральным средам, соответственно той концентрации 2,4-Д, при которой наиболее отзывчива материнская форма. Такая тенденция сохраняется в этой

Таблица 4

Влияние концентрации 2,4-Д на морфогенез в культуре изолированных пыльников

Генотип Андтэогенез (%) при концентрации 2,4-Д (мг/л)

0, 1 0,25 0,5 1,0 1,5 2,0

Э К Э К Э К Э К Э К Э К

Sonalika 151, 8 0 82,8 5, 8 39,2 11,4 6,2 43,0 0 32,3 0 20, 5

Скала 59,1 0 41,6 0 28,1 14,0 11,1 16,1 0, 8 19,3 0 11,1

Саратовская 29 0 0 0,5 0 14,3 0 2, 12 7,1 2,2 16, 8 0 12,1

Линия 35 0 0 14,2 0 24,5 0 76, 1 0 19,1 13, 8 0,4 28,3

Башкирская 4 0 0 12,7 0 5, 8 4,2 8, 6 3,2 4,2 8,7 0,5 2,8

Московска я 35 0 0 0 0 2,4 1,2 12,5 1,7 3,1 8, 6 0 12, 6

Nalach 24,2 16,2 1,4 7,4 15,3 2,1 14,7 0 15,7

Э - эмбриоид, К - каллус

серии эксперимента у всех гибридных форм (рис.5). Например, если материнской формой является сорт Sonalika, продуктивность эмбриоидогенеза которой выше на питательной среде с низкой (0,25 мг/л) концентрацией 2,4-Д, то и гибридные формы более отзывчивы на этой же питательной среде.

У реципрокных гибридных комбинаций между сортами Sonalika и Жница в обоих направлениях скрещивания микроспоры оказались отзывчивыми и на питательной среде с более высокой концентрацией 2,4-Д. Такое же явление наблюдается и у гибридной комб!шации Sonalika х Московская 35.

Что касается комбинации скрещивания между сортами Najach и Sonalika, то это единственная гибридная форма, превысившая по продуктивности эмбриоидогенеза лучшую родительскую форму Najach.

Концентрация эндогенных фитогормонов в пыльниках. Исследователи давно пришли к мысли о необходимости учета уровня эндогенных фитогормонов в экспланте при культивировании (Wheeler, 1972). Но с тех пор эта мысль оставалась на уровне констатащш по ряду причин:

- во-первых, существуют методические трудности количественного определения фотогормонов. Имеющиеся методы определения фитогормонов очень трудоемки и требуют больших навесок используемого материала.

- во-вторых, сложность изучения гормональной регуляции морфогенеза связана также с интегральным характером морфогенетических процессов, их зависимостью от многих внешних и внутренних процессов (Бутенко, 1984).

Перспективы преодоления перечисленных методических ограничений

Рис. 5. Влияние 2.4-Д на продуктивность эмбриоидогенеза у яровой мягкой пшеницы: 1 - БопаШса, 2 - Жница, 3 - ЗопаИка х Жница, 4 - Жница х 8опа11ка, 5 - Московская -35, 6 - Московская 35 х БопаШса, 7 - БопаШса х Московская 35, 8 - Ыа]асИ, 9 - Najach х Московская 35,10 - ^асЬ х ЗопаШса

открывает использование метода твердофазного иммуноанализа, который повышает точность экспериментов за счет высокой специфичности отношений антител к фитогормонам (Кудоярова и др., 1986).

С помощью твердофазного иммуноферментного анализа фитогормонов изучаемый набор генотипов пшеницы исследован на содержание АБК и ИУК в пыльниках на разных фазах микроспорогенеза. Установлено, что объекты значительно различаются по концентрации эндогенных фитогормонов, особенно, в фазе поздней микроспоры. Сорта и линии яровой мягкой пшеницы расположены в таблице 5 в порядке убывания количества эндогенных фитогормонов. В том же порядке происходит смена соотношения интенсивности эмбриоидогенеза в пользу среды, содержащей 2,4-Д в количестве 1,0 мг/л. Следовательно, чем выше содержание эндогенных фитогормонов, тем меньшая концентрация экзогенного ауксина необходима для того, чтобы направить микроспоры по спорофитному пути развития. Так, у сортов БопаНса, Скала, Башкирская 4 и Симбирка частота образования эмбриоидных структур выше на среде, содержащей 0,25 мг/л 2,4-Д, чем на среде с содержанием ауксина 1,0 мг/л.

Сорта, расположенные до Тг. йторЬееу!, отличаются высоким содержанием эндогенных фитогормонов. Тг. 1ш1орЬееу1 включена в анализ как родительская форма Гибрида 21 и Линии 38. Эндогенное содержание фитогормонов у Гибрида 21 промежуточное между родительскими формами (Скала и Тг.1торЬееу1).

Сравнительное сопоставление экспериментальных данных, приведенных в таблицах 4,5 и рисунке 4 показало, что сорта яровой мягкой пшеницы (Sonalika, Скала), характеризующиеся высоким содержанием эндогенной ИУК и АБК, оказались более чувствительными к 2,4-Д и нуждались в небольшой концентрации 2,4-Д в среде, тогда как сорта с низким уровнем АБК и ИУК (Линия 35, Саратовская 29), напротив, требовали большие количества этого экзогенного гормона. Этот вывод подтвержден цитологическим мониторингом процесса андрогенеза in vitro у различных генотипов пшеницы при воздействии различных концентраций 2,4-Д (рис.6-9). Так, воздействие на пыльники, содержащие много ИУК и АБК, высокой концентрацией 2,4-Д (1,5-2 мг/л) вызывает усиленную пролиферацию микроспор, а затем - каллусогенез. В микроспорах этих же сортов, инокулированных на среды с низким (0,1-0,25 мг/л) содержанием 2,4-Д наблюдается множество митотических делений, ведущих к формированию сначала многоклеточных структур, а затем - эмбриоидов.

Таблица 5

Зависимость продуктивности эмбриоидогенеза от уровня эндогенной ИУК в пыльниках

Эмбриоидогенез (%),

Сорт Количество, нг/г концентрация 2,4-Д (мг/л)

ИУК АБК 0,25 1,0

Sonalika 502,4 + 6,4** 483,2+3,8** 82,8 6,2

Скала 401,2 + 2,2** 187,3+2,6** 41,6 21,1

Башкирская 4 282,9 + 3,9** 134,2+4,1** 12, 7 8, 6

Симбирка 248,6 + 3,9** 128,4+3,1** 10,8 0,4

Najach 174,1+2,4 117,5+2,7 31, 4 12,5

Tr. Timopheevi 202,2+1,4* 107,5+3,4** 14, 8 4,1

Пиния 35 104,4 + 1,2* 90,5+3,4* 14,0 71,7

Гибрид 21 93,6 + 2,8* 157,6+2,8** 9,5 11,9

Московская 35 71,1 + 1,3 30,1+3,2 9,8 12, 4

std

Tr. Dirk., VRN 63,5 + 1,2 54,8+1,9 18,5 56,8

33

Жница 62,9+1,5 78,2+1,8* 1,6 3,8

Ершовская 32 61,7 + 1,1 71,7+2,8 0,49 1,6

Саратовская 29 43,8 + 1,4 111,4+2,8** 0,5 2, 12

Линия 38 31,2 + 2,3** 97,4+3,5* 0 0

Башкирская 9 21,9 + 3,1** 58,4+1,8 4,5 13,0

* - значимо на 5% уровне; ** - значимо на 1% уровне.

Таким образом, нами впервые разработан метод оптимизации сред при помощи иммуноферментного анализа. Он является прямым методом, а метод выявления стимулирующих доз - косвенным. Оба эти метода хорошо дополняют друг друга и для большей достоверности лучше использовать оба метода в совокупности. Но в то же время, информации, полученной отдельно в каждом случае, вполне достаточно для индивидуального подбора оптимальных условий для эмбриоидогенеза в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы у различных генотипов.

Корреляция, рассчитанная по результатам, приведенным в таблице 5 показала, что у сортов, характеризующихся высоким уровнем эндогенных АБК и ИУК, оптимальной для индукции андрогенеза in vitro оказалась среда с меньшим содержанием 2,4-Д. И наоборот, сортам с низким уровнем эндогенных гормонов необходима питательная среда с высоким содержанием 2,4-Д. Так, если в экспланте высокое содержание ИУК, то в питательную среду необходимо добавлять меньше 2,4-Д (ИУК/эндогенная - 2,4-Д/экзогенная, г = - 0,83). Такая же тенденция взаимоотношений наблюдается между концентрацией эндогенной АБК и величиной экзогенной инъекции 2,4-Д в питательную среду (АБК/ эндогенная - 2,4-Д/экзогенная, г = - 0,77).

Влияние форм азота на морфогенез. Известно, что присутствие всех форм азота в питательной среде при выращивании растений в водной культуре стимулирует синтез и накопление в корнях цитокшпшов. В литературе имеются данные о том, что гормональная система растеши! может оказывать влияние на обмен азота в растениях. Так, показано (Кузнецов и др., 1986), что экзогенная обработка растений синтетическим цитокинином б-бензиламинопурином индуцирует синтез в них нитратредуктазы. С другой стороны, известно, что присутствие всех форм азота в питательной среде, стимулирует синтез" и накопление цитокининов (Любарская и др., 1982). Нами проведено исследование чувствительности сортов яровой мягкой пшеницы к различным формам азота как в условиях водной культуры, так и in vitro. При выращивании растений различных генотипов показано, что они значительно' различаются по способности реагировать на аммонийный и нитратный формы азота, что выражается в различной способности накапливать или синтезировать цитокинины и АБК в корнях и надземной части.

Пыльники растений этих сортов, выращенных в полевых условиях, культивировались по следующей методике: 1) контороль - на обычной питательной среде Potato П; 2) на среде Potato II с заменой всех нитратных солей на аммоншшые; 3) на среде Potato П с заменой всех аммонийных солей на нитратные. Все другие компоненты сохранены одинаковыми во всех вариантах эксперимента. Так, рН оставалась на уровне 5,7, а концентрация 2,4-Д - 0,25 мг в литре питательного раствора.

Как видно из данных таблицы 6, у большинства сортов яровой мягкой пшеницы эмбриоидогенез более продуктивен на среде, в которой аммонийные соли заменены на нитратные формы. У этих сортов продуктивность эмбриоидогенеза на стандартной среде Potato II шике, чем на среде с нитратной формой, но выше, чем на аммонийной форме. Культивирование пыльников сорта Скала успешнее на стандартной среде. Особая реакция у пыльников сорта Najach, которые проявили большую отзывчивость при инокуляции пыльников на питательную среду Potato II с аммонийными солями.

Таблица 6

Эмбриоидогенез (%) в культуре изолированных пыльниковна питательных средах с разной формой азота

Сорт Эмбриоидогенез при 0,25 мг/л 2,4-Д

Potato II Potato II (NH/) Potato II (NO3-)

Sonalika 3,01 0,8 4,55*

Жница 2,7 1,7 12,5

Московская 35- std 1,2 1,5 ИД

М-35 х Sonalika 5,26* 3,2* 8,6

Sonalika х М-35 7,41* 2,8 9,4

Саратовская 29 3,19 1,54 9,02

Скала 8,7* 2,82 3,45*

Najach 5,1 23,08** 5,19

* - значимо на 5% уровне; ** - значимо на 1% уровне.

Реципрокные гибрндные комбинации между сортами М-35 и Sonalika на стандартной и аммошшной среде превышали показатели обеих родительских форм.

Разработчики искусственной питательной среды Potato П (Chuang, Quang, 1978) значительно уменьшили концентрацию аммонийного азота, что не всегда способствует инициации эмбриоидогенеза увеличению морфогенеза. Поэтому, нами модифицирована эта среда, включением нитрата аммония в концентрации 1000 мг/л. Культивирование изолировнных пыльников на ней среде повысило продуктивность морфогенного каллусогенеза.

На самом деле, регуляция морфогенных процессов в культуре изолированных пыльников за счет компонентов питательной среды значительно сложнее, чем сказано выше. При исследовании изменчивости градиентов концентрации эндогенных фитогормонов в длительно, в течение 21 дня, культивируемых пыльниках и динамики изменения концентрации гормонов в питательной среде, происходящей синхронно, показывано наличие перемежающихся "волн" увеличения и уменьшения концентрации гормонов как

в пылышках, так и в питательной среде (Гобунова, 1993). В диссертации приводятся результанты этого исследования и обращается внимание на следующее обстоятельство: экспланты с высоким уровнем эндогенных ИУК и АБК способны саморегулировать морфогенные процессы даже при отсутствии экзогенных стимуляторов.

В табл1ще7 приводятся данные, конкретизирующие вышеприведенные результаты, в которой все характеристики подвергались стандартному многофакторному дисперсионному анализу. Результаты показали, что во всех случаях главным фактором, влияющим на продуктивность прямого андрогенеза in vitro, является генотип исследуемых растешш и предобработка пыльников перед инокулированием. Содержательным смыслом понятия "генотип" в данном случае является концентрация эндогенных фитогормонов.

Значительный вклад вносят такие сочетания факторов, как "генотип-фаза развития микроспор" и "фаза-предобработка". Наиболее существенное влияние оказывает также консистенция питательной среды. В этом эксперименте по каждому источнику варьирования выбирались не менее трех градаций признака, кроме "предобработки", по которой были только две градации: с предварительной холодовой обработкой перед инокуляцией пыльников и без нее.

Морфогенез в культуре изолированных пыльников При культивировании изолированных пыльников пшеницы отмечены два пути морфогенеза: эмбрноидо- и каллусогенез, которые связаны с формированием двух типов морфогенных структур - эмбриоидов и каллусов. Первый путь определен как прямой, а второй - непрямой, поскольку связан с трудоемким процессом множественных пересадок образовавшихся структур на различные питательные среды с целью получения растений-регенерангов.

Светооптнческие и ультраструктурные особенности строения клеток эмбрноида. Пыльники различных генотипов инокулировали на питательные среды с учетом индивидуальных особенностей эксплантов. Например, при культивировании пыльников сорта Sonalika использовали искусственную питательную среду с концентрацией 2,4-Д, равной 0,1 мг/л. Оказалось, что в первые же часы культивирования появляются двуядерные и двуклеточные образования (рис.ба), затем - четырехклеточные структуры (рис.66). На 7 сутки культивирования в гнездах пыльников наблюдается появление многоклеточных структур (МКС), располагающихся в пределах неповрежденной оболочки морфогенной микроспоры (рис.бв, 76). Этот этап образования МКС является одним из основных этапов морфогенеза в культуре изолированных пыльников по пути эмбриоидогенеза. Клетки этих структур характеризуются нами как мерисгемагические, поскольку имеют крупные ядра и тонкие клеточные стенки. МКС, разрывая оболочку микроспоры через 25-30 дней культивирования

Таблица 7

Дисперсионный анализ влияния генотипа и внешних факторов на продуктивность эмбриоидогенеза (в %) при различной температуре культивирования

Источник варьирования Число степеней свободы (сН) Средние квадраты (тБ)

28 °С 32 °С

Генотип (Г) 9 29,65* 7,90*

Среда(С) 14 0,9 9,5*

Фаза развития микроспоры (Ф) 2 112* 114*

Консистенция среды (К) 2 14,25* 11,9*

Предобработка (П) 1 179* 4,4*

Гх С 125 1,79* 0,76

Г х Ф 17 10,2* 9,8*

ГхК 17 0,62 1,2

Г х П 9 1,60 0,7

СхФ 27 1,4 1,8

С х К 27 9,48 3,01

СхП 13 0,91 3,7

Ф х К 3 0,9 2,3

ФхП 1 118* 121*

К х П 1 3,51 2,8

Случайная изменчивость 267 15,5 0,6

* - значимо на 5% уровне.

появляется на поверхности пыльника (рис.бг). По морфологическим показателям эмбриоид, полученный в культуре пыльников яровой мягкой пшеницы - это белая матовая структура шаровидной или булавовидной формы, нередко с «ножкой» (рис. 6д). Светооптический гистологический анализ эмбриоида (27 дней культивирования) пшеницы свидетельствует о наличии в составе этой структуры массы однородных меристематических клеток с крупными ядрами, расположенными в центре клетки и небольшим количеством цитоплазмы (рис.бв, 7а,б). Поверхность эмбриоида яровой мягкой пшеницы на поздней стадии развития по данным СЭМ, представляет собой комплекс плотно упакованных клеток с четкими границами (рис. бд). Клетки полусферической формы, они значительно мельче, достаточно однородны по своей морфологии и не сморщены, в отличие от клеток каллуса (рис. 8,9).

Проведенные нами электронно-микроскопические исследования клеток эмбриоида пшеницы (рис. 7в) подтверждают, что это клетки слегка вытянутой

Рис. 6. Прямой андрогенез in vitro: а -двуктеточная структура, х250; б - четырехклеточное образование, хЮО ; в - многоклеточная структура, х 120; г - эмбриоид на пыльнике, хЗО; д - эмбриоид, СЭМ, х 130; е - эмбриоцды в пробирке, П - пыльцевые зерна.

или округлой формы, прилегающие друг к другу. Цитоплазма электроноплотная, включает большое количество полирибосом, что свидетельствует о повышенной синтетической активности клетки. С другой стороны, клетки функционально независимы друг от друга. Многочисленные рибосомы связаны также с наружной мембраной ядерной оболочки. Ядра крупные, занимают центральное положение, объем их по отношешпо к объему клетки составляет примерно третью часть. Глыбки конденсировашюго хроматина равномерно распределены по всему ядру, ядерная оболочка нередко имеет инвагинации, что увеличивает площадь контактов ядра и цитоплазмы. Это состояние ядра говорит о синтетической активности клеток. Как признак готовности клеток к делению можно рассматривать наличие многочисленных пор в ядерной оболочке, возрастание ее контактов с конденсированным хроматином, поскольку с функционированием примембранного хроматина связывают шпщиацию репликации, а в некоторых случаях и транскрипцию ДНК (Ченцов, 1984). В некоторых клетках этого эмбриоида можно наблюдать ядрышко, находящееся в центре ядра. Вблизи ядрышка выявляются свободные от хроматина светлые зоны. Такое сочетание хорошо оформленного ядрышка при сильно инвагшшзированной оболочке ядра говорит о том, что клетка способна активно делиться (Ченцов, 1984).

По периферш! клетки и возле ядра можно наблюдать большое количество глобул липидной природы, расположенных в основном вдоль клеточной мембраны. Между осмиофипьными глобулами находится агранулярный эндоплазматичесюш ретикулум, появление которою можно связать с активным синтезом липидов в растущей и делящейся клетке.

Клетки эмбриоида содержат небольшое количество митохондрий, которые практически принадлежат новой генерации митохондрий, и обычной гетерогенности между ними не наблюдается. Форма их округлая, кристы неразвиты. Необходимо также отметить наличие амилопластов, располагающихся группами. Они имеют булавовидную или округлую форму и содержат крупные светлые зерна крахмала, что также свидетельствует о синтетической активности клеток эмбриоида. Тилакоиды отсутствуют.

Эмбриоды прорастают в дальнейшем в растения, пройдя через множество ступеней органогенеза (рис.7е).

Светооптические и ультраструктурные особенности строения клеток каллуса. Каллусы, образующиеся в культуре изолированных пыльников морфологически разнообразны. Отчетливо различаются два типа этих структур: компактные, узловатые, белого цвета (рис. 8а) и мягкие, рыхлые, водянистые каллусы (рис. 9), причем только каллусы первого типа способны к регенерации растений.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что каллусы появляются позднее эмбриоидов (на 30-45 сутки от начала культивирования

Рис. 7. Цитологический анализ поперечных срезов эмбриоидов: а - эмбриоид в полости гнезда, х250, б - сердцевидная форма эмбриоида в полости гнезда, х250, в, г - фрагменты клеток эмбриоида, ТЭМ х10500, д - дифференциация тканей, х350, е - продольный срез через почку, х250. Я - ядро, ЯЯ - ядрышко, ЯО - ядерная оболочка, А - амилопласт, Л - липидные включения, КО - клеточная оболочка, К - крахмальные зерна, МК - межклетник, М - митохондрия, ПС -полисома.

пыльников). Однако у сортов с высоким уровнем эндогенных фитогормонов в пыльнике, каллусогенез инициируется уже при концентрации 2,4-Д, равной 0,5 мг/л в первые дни культивирования.

Нужно отметить, что у сортов с высоким эндогенным уровнем фитогормонов каллусы, образовавшиеся на питательной среде с концентрацией 2,4-Д от 0,25 до 0,5 мг/л, были морфогенными и обладали регенерационной способностью. Каллусы же, индуцированные при концентрации 1,5 - 2,0 мг/л, имели рыхлую и водянистую консистенцию и были не способны к регенерации растений (рис.9,а). Визуальная оценка формы морфогенного каллуса показывает, , что она сплюснута и вытянута по длинной оси (рис.8а). Светооптический анализ этих образований выявил коренные различия в структурах эмбрноидов и каллусов. Клетки каллуса, в отличие от клеток эмбриоида, имеют неправильную форму. В строении этой структуры можно выделить две клеточные зоны -центральную и периферическую. Клетки каждой из этих зон различаются по морфологическим показателям - размеру, форме и степени окрашиваемости. Часть этих клеток мы рассматриваем как меристематические(рис.8б,в - М).

Рис. 8. Цитологическая характеристика морфогенного каллуса: а - каллус, СЭМ, х200, б,в - поперечный срез, х250, г - вторичные эмбриоиды на морфогенном каллусе, СЭМ, х86. ЦЗ - центральная зона, ПЗ - периферическая зона, Т - трубки.

Морфологическая вариабельность клеток морфогенного каллуса связана с генетической и морфологической неоднородностью клеток, потенциальные возможности которых реализуются различными путями: гистогенез (рис.8б,в), органогенез и эмбриоидогенез (рис.8г). В данном случае, речь идет о так называемых "вторичных" эмбриоидах (Шамров и др., 1988), которые, чаще всего, образуются на первичных каллусах при небольших концентрациях экзогенного гормона 2,4-Д.

Исследование поверхности неморфогенного каллуса яровой мягкой пшеницы сорта ЗопаПка с помощью СЭМ показало, что на поздней стадии развития (30 сут культивирования) он представляет собой структуру средней плотности, достаточно гомогенного состава. Характерна сморщенность поверхности этого новообразования, что особенно наглядно видно при большем увеличении объекта (рис. 96,в).

Отличительной чертой неморфогенной каллусной ткани является ее рыхлость, обусловленная наличием гипертрофированных межклетников (рис.9д). Тем не менее, при анализе каллусной ткани мы выделили две зоны клеток. Если рассматривать морфологию составляющих клеток, то видно, что по периферии каллуса расположены крупные, слабоокрашенные клетки, ядерный материал в них почти не представлен. Клетки расположены очень рыхло, создавая тем самььм водянистую текстуру поверхности каллуса (рис. 9а,г).

Ультраструктурные исследования клеток неморфогенного каллуса пшеницы свидетельствуют о следующем: цитоплазма насыщена органеллами, электронопрозрачна, включает в себя отдельные свободные рибосомы, которые редко агрегируются в полирибосомные комплексы. Множество митохондрий распределено по всей клетке. Строение их сложное, крнсты везикулярного типа заполняют весь матрикс (рис. 9д).

Отличительной чертой клеток немофогеиного каллуса является также и наблюдаемый в них автолиз. Начало процесса автолиза в лизосомоподобной структуре можно распознать митохондрии с сохранившейся разбухшей мембраной. Рядом с ней видна полуразрушенная митохондрия (рис. 9е).

На всех этапах культивирования мы регистрировали наличие множества погибших микроспор, находящихся и в пыльнике (рис.6 б), и на морфогенных структурах (рис.9б): видны оболочки дегенерировавших микроспор.

Кроме вышеописанных особенностей морфогенеза в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы мы наблюдали нехарактерные события, возникающие в процессе культивирования. Так, при исследовании андрогенных каллусов методом сканирующей электронной микроскопии нами был обнаружен интересный случай образования пыльцевых трубок (рис.8г,9б), о чем ссылок в литературе мы не встретили.

Интересен вопрос о том, каков способ форм!грования пыльцевых трубок

Рис. 9. Цитологическая характеристика неморфогенного каллуса: а -внешний вид, хЗО, б- внешний вид, СЭМ, х86, в - поверхность неморфогенного каллуса, СЭМ, хЗОО, г -поперечный срез, х150, д - фрагмент клетки, ТЭМ, х10000, е - автолиз в клетках, ТЭМ, х 15000. ЦЗ - центральная зона, ПЗ - периферическая зона, Т - трубки, МК - межклетник, М - митохондрии Л - лизосомоподобное образование.

среди клеток андрогенного каллуса пшеницы. На наш взгляд, каллус, берущий начало, от морфогенной микроспоры, в ходе своего раннего развития внутри гнезда пыльника среди множества других микроспор, «захватывает» часть микроспор в свою структуру и выносит с собой на поверхность пыльника. Внутри каллуса создаются физиологические условия для развития этих микроспор до зрелых пыльцевых зерен и прорастания их в пыльцевые трубки, так как появляются предпосылки для активации ядер пыльцевых зерен. Часть «захваченных» микроспор останавливается на стадии двухлеточного пыльцевого зерна, часть - дегенерирует.

Таким образом, при андрогенезе in vitro у яровой мягкой пшеницы, на путь морфогенеза вступает лишь малая часть популяции микроспор, подавляющая масса микроспор при культивировании либо дегенерирует, либо продолжает свое развитие по гаметофитному пути до зрелого пыльцевого зерна с последующим прорастанием в пыльцевые трубки.

Генетическая изменчивость при андрогенезе in vitro у яровой мягкой пшеницы. Показано, что на характер генетической изменчивости в культуре тканей влияет как концентрация гормонов в питательной среде, так и длительность экспозиции (Шамина, 1981). Зачастую считается, что вследствие этого происходят необратимые изменения генома культивируемой клетки (Щамина,1981; Кунах и др. 1985). Они выражаются в изменении плоцдности (Ни,1986), мутациях генов (Ананьев и др., 1986; Гостимскин, 1987-2000).

Геномные мутации, наряду с другими формами генетической изменчивости, играют большую роль в расширении генетической изменчивости вида. Использование таких мутантов не только в генетическом анализе и изучении наследования признаков, но и в практичесокй работе значительно расширяет арсенал методов исследователя. Имеется возможность регулирования частоты геномных мутаций и в культуре изолированных пыльников и она зависит от целей экспериментальных работ. Преимущество гаплоидных культур в том, что при диплоидизации гаплоидных растении образуются автоплоидные регенераты, позволяющие гомозиготизировать любые, даже рецессивные мутации. В случае появления анеуплоидной гаплоидной особи, при удвоении генома мы имеем, в результате, нуллисомик по определенной хромосоме.

Анализ плоидности морфогенных структур в культуре изолированных пыльников затрудняется тем, что необходимо подбирать специфические условия для отбора проб, чтобы не нарушать целостности структуры. Используя методы суспензирования и мацерации клеток исследовали плоидность эмбриоидов, морфогенных и неморфогенны каллусов. Оказалось, что все новообразования гаплоидной природы, то есть, ни клетей стенки гнезда пыльника, ни связника, ни тычиночной шгги не участвовали в морфогенетнческих процессах.

Результаты исследования показывают, что при культивировании

изолированных пыльников сорта БопаПка на среде, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,1 мг/л большинство образовавшихся структур - гаплоидные эмбриоиды, имеющие 21 хромосому в исследованных клетках. Наличие одного гаплоидного анеуплоида при колхицинировании не проявилось. Все удвоенные растения имели нормальный набор хромосом (табл.8).

Таблица 8

Геномная изменчивость при различных концентрациях 2,4-Д у сорта 5опаПка

2,4-Д, мг/л Количество

Морфогенных структур Регенерантов

N п-1 п-2 другие 2п (42) 2п-2 (40)

0,1 бШ 49 1 0 0 50 0

0,25 43 4 0 3 43 1

0,5 37* 4 2 6 37 1

1 15** 15** 8* 12 15 7

1,5 0 24** 7* 19 0 0

2 0 0 0 50** 0 0

* - значимо на 5% уровне; ** - значимо на 1% уровне.

При повьппешш концентрации 2,4-Д в индукционной среде достоверно увеличивается число морфогенных структур с нерегулярным набором хромосом, чаще всего - с анеуплоидным. В этих структурах возрастает и часота "других" нарушений, что выражается в слипании хромосом, безъядерности клетки и т.д. Такие новообразования неморфогенны и не способны к регенерации растений.

Особый интерес представляет изучение генетической изменчивости у ' "вторичных" эмбриоидов и полиэмбриоидов. При тщательном анализе регенерантов оказалось, что полиэмбриоиды и "вторичные" эмбриоиды раличаются по происхождению, хотя внешне их трудно различить. Полиэмбриоиды могут образоваться слипанием нескольких эмбриоидов и дальнейшим их разрастанием. "Вторичные" же эмбриоиды чаще всего, появляются на участках морфогенного каллуса. И в том, и в другом случае, они производят при регенерации растений потомство, не стабильное и по морфологическим признакам, и по числу хромосом в клетках. В первом случае это выражается в фенотипических различиях растений, так как произошли от микроспор с разным набором генов, а во втором - могут появиться и нуллисомики, и альбиносы. Поэтому, при генетическом анализе потомства растения-регенеранта основным правилом является индивидуальное исследование популяции зерен с каждого колоса. В противном случае, создается впечатление о расщеплении потомства андроклинного удвоенного гаплоидного растения.

Регенерацнонная способность генотипов яровой мягкой пшеницы в культуре изолированных пыльников

Как известно, лимитирующим фактором развития технологии культивирования изолированных пыльников является низкая регенерацнонная способность генотипов яровой мягкой пшеницы.

На рисунке 10 представлены данные о регенерационной способности различных генотипов. Из всех исследованных генотипов наибольшей отзывчивостью обладали гибридные формы с участием сортов Бопа^а и Жница.

Линия Фотос - это андроклинная дигаплоидная форма, выделенная из гибридной комбинации между сортами Жница и Московская 35. Она обладает уникальной продуктивностью эмбриоидогенеза. По всем другим показателям (урожайность, скороспелость и содержание белка) она превосходит не только родительские формы, но и стандартный сорт по нашей зоне. Эта линия проходит

Генотипы

Рис. 10. Продуктивность морфогенеза у различных генотипов: | |- эмбриоиды, | |- регенераты. 1-Соналика, 2-Соналика х Симбирка, З-Симбирка, 4- Сонора 64, 5-Сонора 64 х Симбирка, 6-Соналика х Фотос, 7-Соналика х Шафран, 8-Шафран, 9- Шафран х Соналика, 10-Фотос х Соналика, 11-Фотос, 12-Сонора 64 х Фотос.

в настоящее время Государственные сортоиспытания. Данные, приведенные на рисунке 10 показывают также, что гибридные формы с участием Фотоса имеют и высокую продуктивность эмбриоидогенеза.

В начале наших работ по культивированию изолированных пыльников не было никакого ориентира относительно состава питательных сред, адекватных для регенерации растений, кроме указания на определенные концентрации микро - и макросолей, и поэтому поиск причин низкой регенерационной способности генотипов привели нас к изучению концентрации эндогенных фитогормонов в эмбриоидах у различных сортов. Полученные результаты показали, что у наиболее продуктивных генотипов по признаку "регенерационная способность" регистрируется и высокий уровень всех эндогенных фитогормонов в эмбриоидах (табл.9). В то же время, наблюдается тенденция к уменьшению продуктивности регенерации растений у сортов, имеющих высокий суммарный пул эндогенных фитогормонов при высокой (1 мг/л) концентрации кинетина в питательной среде, и наоборот, сорта, которые характеризуются низким пулом эндогенных фитогормонов, тяготеют больше к среде с высоким содержанием кинетина. С другой стороны, суммарный выход растений регенерантов у сортов с высоким эндогенным уровнем АБК больше, чем у тех сортов, которые накапливают мало эндогенной АБК.

Таблица 9

Концентрация эндогенных фитогормонов в эмбриоидах.

Генотип Уровень эндогенных фитогормонов, нг/г Регенерационная способность (%), при концентрации кинетина в среде (мг/л)

цитокинины ИУК АБК 0,5 1,0

Sonalika 389 + 5 584 + 6 1338 + 3 52,4 25,4

Скала 378 + 4 424 + 5 1528 + 4 53,2 16,8

Жница 284 +2 440 + 4 764 + 3 31,4 36,8

Московская35 198 + 4 84 + 6 580 + 4 12,3 14,2

Najach 292 + 3 286 + 2 720 ±3 25,6 11,4

Селекционно-генетическая оценка андроклинных дигаплоидных линий яровой мягкой пшеницы

При использовании описанной выше технологии андрогенеза in vitro, при участи пяти человек, мы ежегодно получали более 1100 андроклинных удвоенных гаплоидных растений. В это число не включены регенеранты-альбиносы, моносомные растения и стерильные гаплоидные растения, устойчивые к удвоению через колхицинирование. Такие растения неизбежно появляются при любых экспериментах.

Ежегодно проводятся испытания полученных АДГ-линий в различных экологических условиях. Наиболее продуктивные дигаплоидные гибридные линии, отличающиеся скороспелостью, засухоустойчивостью и с хорошим каччеством белка используются в качестве исходного материала в НПО «Башкирское» (ОПХ Чишминское). Часть линий проходят конкурсное и Государственное сортоиспытание.

При изучении удвоенных гаплоидных линий, полученных методом андрогенеза in vitro in районированных сортов, установлено следующее:

а) между чистыми линиями исходных и удвоенных гаплоидных форм не наблюдается феношпических различий;

б) использование метода повторного культивирования линий, полученных из чистых линий сортов: Саратовская 29-АДГ-1, Саратовская 29-АДГ-2, Sonal ika-АДГ-1, Sonalika-АДГ-2 не приводит к увеличению частоты андрокгашии по сравнению с исходными формами. При скрещивании их с другими геноптами мы не наблюдали повышения mi продуктивности .морфогенеза in vitro, mi регенерационной способности генотипов гибридных форм. Исследована доля влияния генотипа на некоторые хозяйственно-важные признаки у яровой мягмэй пшеницы. Показано, что характеристики изученных признаков "продуктивная кустистость", "содержание белка" н " масса зерна с колоса" в большей степени зависят от изменяющихся условий года воспроизводства, чем от особенностей геношпов, хотя влияние последних достоверны и значимы. В то же время, показатели количества и качества производимого белка изученными сортами в большей степени зависят от особенностей генотипо.

. АДГ линии и популяция F5, отобранные по методу ОСП (одно семя с растения на потомство. Крупное и соавх, 1983), в некоторых случаях различаются существенно. Например, АДГ линия, полученная га юбнинации скрещивания между сортами Жница х Московская 35 превышает показатели другой линии, огбранной по методу ОСП по всем изученным признакам. Однако если большинство гибридных форм и доминируют нзд показателями обоих родительских компонентов скрещивания, то толы® некоторые линии (Жница х М-35, М-35 х АС-29, М-35 х С-52) могут конкурировать со стандартом по основным показателям структуры урожая (Горбунова, 1997).

Андроклинные дигаплоидные гибридные формы (табл.10) имели значительные преимущества перед сортом Московская 35 по длине колоса (Жница х Sonalika. Московская 35 х Sonalika), по числу зерен в колосе (Жница х Московская 35 и Жница х Sonalika). По массе зерен с колоса незначитеельное превышение показателей стандарта имели те же сорта. Масса 1 ООО зерен у трех гибридных комбинаций (Жница х Московская 35, Московская 35 х Sonalika, Московская 35 х Саратовская 52, Московская 35 х Саратовская 29). В то же время, имело место и проявление значительного отрицательного гетерозисного эффекта у АДГ (Симбирка х Московская 35, Саратовская 29 х Sonora 64).

Таблица 10

Степень фенотипического доминирования (Ьр) по элементам продуктивности у андроклинных дигаплоидных гибридных линий над родительскими формами (Р) и стандартом (Б^

Линия Число зерен в колосе Масса

зерен в колосе 1000 зерен

кР к 81 кР кБ1 КР

Жшща х М-35 +3,9 +0,3 +0,7 +0,2 +24,8 +19,4

М-35 х АС-29 +1,2 +1,3 +0,25 +0,2 +4,4 +2,2

М-35 х Бопа1 -0,5 -12,8 +0,29 -0,3 +16,6 +11,5

Жница х 8опа1 +14,1 -5,4 +0,9 -0,2 +10,8 +0,9

С-29 х 8оп-64 -5,5 -5,4 -0,05 -0,6 -1,6 -9,4

Симб х М-35 +1,7 -1,2 +0,1 ' -0,06 0 -0,4

М-35 х С-52 -1,5 -1,3 +0,15 +0,1 +7,4 +4,0

Очевидно, что при культивировании пыльников растений мы сталкиваемся с разнокачественностью гамет, обусловленной расщеплением, произошедшим в мейозе, фактически уже в Р2. Поэтому неизбежно вьпцепление гамет, в которых не всегда наличествует благоприятное сочетание генов количественных признаков, ответственных за продуктивность и другие качества. Безусловно, изменчивость по числу и массе зерен в колосе и содержанию белка детерменирована модификационной изменчивостью генотипов. Поэтому при отборе линий серьезное внимание уделяли признаку «число седиментации», характеризующему качество белка у гибридных форм (табл.11).

Ниже приводятся характеристики АДГ линий, полученных из пыльников одного гибридного растения ?! (данные второго года испытания).

Таблица 11

Характеристика АДГ лшшй по продуктивности и качеству белка

Линия АДГ Число зерен в колосе Масса 1000 зерен Содержание белка, % Число седиментации

Жшща х Московская 35 34,8+1,4 40,2+0,8 22,4+0,9 44,8+1,8

Жница х Московская 35 28,5+0,7 34,8+0,9 18,3+1,0 64,5+2,1

Жница х Московская 35 39,8+2,7 37,5+1,1 18,6+0,7 73,4+1,9

Жница х Московская 35 30,6+1,7 56,0+1,8 18,4+1,2 87,3+2,4

Жница х Московская 35 35,6+3,1 46,8+2,1 15,3+0,8 82,2+1,9

Жница х Московская 35 31,8+2,5 41,1+1,9 19,4+1,3 74,2+3,2

Жница х Московская 35 41,2+4,0 51,1+1,8 19,8+1,5 77,1+2,1

^асЬх Жница 36,1+3,1 43,1+2,1 24,3+1,8 ' 52,2+1,4'

Ма|асЬ х Московская 35 41,2+2,6 38,1+1,8 26,2+1,5 58,4+1,7

Ы^асЬ х ВопаНка 38,2+3,4 38,2+1,5 28,2+2,3 61,2+2,3

Данные, приведенные в таблице 11. показывают значительное превышение по содержанию белка АДГ-линий, полученных с участием сорта На]асЬ.

Таким образом, проведенное селекционно-генетическое исследование АДГформ указывает на однородность потомства, полученного с одного растення-регенерзнта. В то же время, эти линии различаются между собой по многим признакам. Во все годы изучения гомозиготные линии, полученные методом культивирования изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы, не показывают расщепления при повторных пересевах. Нами проводился генетический анализ наследования концентрации эндогенной АБК в пыльниках у сортов, гибридных форм первого и второго поколений,, а также их андроклинных дигаплоидных форм (табл. 12). Анализ показал, что исследуемые сорта значительно отличаются по содержанию АБК в пыльниках поздней фазы микроспорогенеза. У сорта Московская 35 эндогенное содержание АБК 78,6 нг/г пыльников, в то время как у сорта БопаНка - 483,2 нг/г пыльников. Реципрокные гибридные комбинации почти не различаются по этому показателю, хотя у гибридной формы БопаПка х Московская 35 в пыльниках накапливается большее количество АБК, чем у обратной комбинации скрещивания. Во втором поколении происходит выравнивание показателей в обоих направлениях скрещивания. Размах изменчивости признака широкий: от минимальных значений концентрации АБК (30 нг/г пыльников) до значительных - 345 нг/г пыльников. Популяция гибридных растений второго поколения включает самое большее число классов расщепления. Что же касается характеристики андроклинных дигаплоидных форм по уровню синтеза и накопления АБК, то прямая гибридная комбинация значительно превосходит показатели обратной комбинации скрещивания и его значения приближаются к характеристикам лучшей родительской формы. В этой комбинации скрещивания произведены отборы засухоустойчивых форм, поскольку сорт ЗопаНка характеризуется высокой засухоустойчивостью и скороспелостью в условиях Южного Урала. У отобранных форм обнаружен высокий уровень накопления эндогенного АБК.

Молекуляроно-генетические аспекты генетической стабильности

андроклинных дигаплоидных линий Использование молекулярных ДНК-маркеров отличается высокой технологичностью и возможностью одновременного анализа вариабельности большого количества локусов. Последнее качество особенно ценно для генетического тштирования лнний и сортов растений. Метод ЯАРО-ПЦР является быстрым и надежным способом контроля генетических изменений при создании новых форм растений не только методами биотехнологии, но и традиционными методами селекции.

Метод ЯАРО с использованием произвольных праймеров позволяет

Таблица 12

Распределение частот (%) содержания АБК в пыльниках (нг/г) in vivo у сортов Sonalika, Московская 35

и их реципрокных гибридных форм

00

Генотип Покол сние Цент] ральное значение классов

30 75 120 165 210 255 300 345 390 435 480 525 п X C.v.,%

М-35 45,0 42,5 2,5 50,0 78.6 16.8

Sonalika 4,7 7,1 23,0 54,2 11,0 50,0 483,2 15.4

Sonalika х М-35 F, 2,0 24,0 42,0 28.0 4,0 71,0 198.2 16,2

М-35 х Sonalika F, 7,4 19.4 32,0 29,1 12,1 65,0 145,4 16,6

Sonalika х М-35 АДГ 6,4 23,4 64,2 4,0 2,0 25.0 384.6 13.2

М-35 х Sonalika АДГ 6.3 18,3 71,4 4.0 25,0 150,8 13.8

Sonalika х М-35 F, 3,17 17.5 33,3 22,8 9.8 5,7 7,2 0.45 100,0 118,4 24.5

М-35 х Sonalika F, 2,97 22,4 28.4 23,9 10.2 5.4 4,9 1,3 100.0 111,8 23.1

получать молекулярные спектры амплифицированных ДНК-фрагментов, называемых фингерпринтами, пли молекулярными паспортами (Welsh et al., 199Ü).

Целью этого этапа работы являлось исследование молекулярно-генетической изменчивости сортов и линий яровой мягкой пшеницы, выращенных в культуре изолированных пыльников с помощью метода RAPD-

ПЦР.

Как следует из представленных данных (рис.11,12), для каждой из генотипических пар (исходной и АДГлшши) был присущ сходный молекулярный спектр амплификации, характеризующийся одштковым числом компонентов, так и их представленностью (мажорностью или минорностью ашишконов ДНК) по всем использованным праймерам.

Из 15 использованных праймеров только 11 показали полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК у различных форм, также сходные у каждой сравниваемой пары. При этом средний уровень полиморфизма составляет всего 20%, причем, максимальный уровень полиморфизма был отмечен для Р10 праймера - 50% (пыльцеспецифнческий ген кукурузы).

Из литературных данных известно, что большинство изученных RAPD-ампликонов проявляют себя как неаллельные доминантные маркеры (Rogowsky et al., 1992; linker et al.. 1993; Doves et al., 1992), хотя и отмечены случаи кодоминирования (1 inker et al., 1993). tí связи с этим, исследовали наследование молекулярных спектров при внутривидовой гибридизации. Изучали характер наследования RAPD-ПЦР локусов у гибрида Фотос, полученного при скрещивании сортов Жница и Московская 35. D молекулярных спектрах гибрида Фотос и его АДГ-линии при использовании праймера Р1 был обнаружен дополнительный компонент 250 пн, праймера Р8 - два дополнительных компонента: 750 и 900 пн, и праймера Р10 - три фрагмента: 550, 570 и 690 пн, отсутствующие у родительских форм. Вероятно, внутривидовая гибридизация при скрещивании сортов Жница и Московская 35 сопровождалась неменделевским наследованием повторов ДНК в геноме гибрида Фотос. Вполне вероят но, что появление дополнительных компонентов в молекулярном спектре АДГ формы данного гибрида явилось результатом кроссинговера.

С другой стороны, молекулярные RAPD-спектры гибридной формы Фотос, полученные с помощью праймеров Р2, РЗ, Р4,1'5, Р6, Р7, Р9, характеризовались кодиминашным наслсдиьанисм ки.мпинсншв |юди iсльскил ДНК'. Gimc i им, >ми наличие кодоминантных RAPD-маркеров представляет значительный интерес для генетичесюгх исследований.

Вместе с тем, специфические фрагменты амплификации встречались не только у гибрида Фотос. Так, в молекулярных спектрах Жницы и ее АДГ-линии детектировались ампликоны 630 пн с помощью Р1 праймера, отсутствующие у

Рисунок 11

Рисунок 12

Рис.11 RAPD-ПЦР-спектры линий и сортов яровой мягкой пшеницы, выявленные с помощью Р10 праймера.

L-Молекулярньщ маркер 1 Sonalika, 2 Sonalika -АДГ, 3 Саратовская 29, 4 Саратовская 29-АДГ, 5 Жница, 6 Жница-АДГ, 7 Фотос, 8 Фотос-АДГ, 9 Московская 35.

Рис.12 RAPD-ПЦР-спектры линий и сортов яровой мягкой пшеницы, выявленные с помощью Р6 праймера.

L-Молекулярный маркер 1 Sonalika, 2 Sonalika -АДГ, 3 Саратовская 29, 4 Саратовская 29-АДГ, 5 Жница, 6 Жница-АДГ, 7 Фотос, 8 Фотос-АДГ, 9 Московская 35.

—Sonalika — Фэтос —Саратовская 29 —Московская 35

0,11

J_L

0,092

Щ)з~ Жница

_L

-L-L

0,12 0,10 ' 0,08 0,06 0,04 0,02

Генетическое расстояние (О)

Рис.13 Дендрограмма, отражающая генетическое сходство между исследованными формами яровой пшеницы.

остальных генотипов. Только для фингерпринтов Sonalika нее АДГ-линии были характерны фрагменты 520 пн (Р4 праймер), 380 и 400 пн (Р6 праймер), а также полосы 630 и 900 пн (Р10 праймер).

Совпадение молекулярных спектров исходных форм и их АДГ-линий упростило задачу построения схем, отражающих сходство между анализируемыми образцами. На основании результатов RAPD-ПЦР, полученных с участием праймеров Р1, РЗ, Р4, Р6, Р8 и PIO, Grig-3, Grig-13, Ds, P42, P37, обеспечивающих полиморфизм молекулярных спектров ДНК, была рассчитана матрица значений генетического сходства (F) и построена дендрограмма генетического сходства между 5 генотипами яровой мягкой пшеницы. Как следует из представленной дендрограммы (рис. 13) Sonaiika наиболее обособлена от остальных форм пшениц (генетическая дистанция D=0.11). Интересным представляется факт генетической близости сортов Жница и Московская 35, имеющих показатель сходства D=0.04. При этом гибридная форма Фотос оказалась равноудаленной от обеих родительских форм, D=0.046.

В настоящей работе, используя RAPD-ПЦР-анализ, была оценена степень генетического сходства 5 генотипов яровой мягкой пшеницы и их АДГ-линий, полученных в культуре изолированных пыльников.. Нами был обнаружен незначительный внутривидовой полиморфизм, составивший 20% и показано, что разработанная технология прямого андрогенеза in vitro позволяет получать чистые линии любого сорта, подтверждением чего является отсутствие генетической изменчивости у андроклинных удвоенных гаплоидных форм, регенерированных из микроспор исходных сортов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые методом ревертазной реакции получена кДНК, анализ которой с использованием специфических праймеров методом полимеразной цепной реакции указывает на возможное участие в регуляции экспресиш спорофитной генетической информации в культуре изолированных пыльников ферментных систем клеточного цикла, в частности, протеинкиназ: cdc 25 и cdc 2.

2. Впервые показана дифференциальная экспрессия транскриптов, накапливающихся в микроспорах в ответ на воздействие пониженных положительных температур на пыльники яровой мягкой пшеницы поздней стадии мнкроспорогенеза. Эта спорофитная генетическая информация реализуется в перестройке веретена деления первого митоза к появлении микроспор с двумя равными ядрами, что характеризует начало прямого андрогенеза in vitro.

3. Впервые показано, что частота прямого андрогенеза in vitro (эмбрноидогенез) и пределы ее изменчивости обусловлены генотипическими факторами, важнейшим среди которых является эндогенный уровень фитогормонов в экспланте в момент инокуляции. Показана обратная зависимость

между эндогенными (в пыльниках) и экзогенными (в питательной среде) гормонами. Так, генотипам, имеющим высокий эндогенный уровень фитогормонов адекватны низкие концентрации 2,4-Д в питательной среде и наоборот. Такой подход к культивированию пыльников разных генотипов позволил повысить частоту прямого андрогенеза in vitro в среднем с 2,5% (до эксперимента) до 50-60% (после эксперимента) в расчете на общее число культивируемых пыльников.

4. Показано, что высокая чувствительность к 2,4-Д у сортов яровой мягкой пшеницы определяется генетически обусловленным высоким уровнем эндогенных фитогормонов в пыльниках, имеющих микроспоры поздней стадии микроспорогенеза и выражается в том, что у чувствительных сортов (Скала и Sonalika) наивысший уровень эмбриоидогенеза проявляется при культивировании их пыльников на питательной среде, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,1 мг/л. Эмбриоидогенез у этих сортов происходит и на безгормональной питательной среде. При увеличении концентрации 2,4-Д в питательной среде до 0,5 мг/л у этих сортов происходит каллусогенез.

У нечувствительных к 2,4-Д сортов уровень эндогенных ИУК и АБК сравнительно ниже. К ним относятся сорта Московская 35 и Линия 35.

5. Признак "концентрация эндогенных фитогормонов" наследуется как количественный. На основе учета характера наследования этого признака отобраны линии с высоким содержанием как ИУК, так и АБК и проведена селекциош1ая оценка андроклшщых удвоенных гаплоидов. Среди регенерантов выделены линии, имеющие высокий уровень АБК и характеризующиеся высокой засухоустойчивостью.

6. Определен и описан цитологический маркер поздней стадии микроспорогенеза: наличие фиброзных утошцеиий в стенке гнезда пыльника. Фенотипически это соответствует расположению кончика колоса на 1/5 расстояния между лигулой предпоследнего листа до флагового. Нами показано, что культивирование пыльников с такими параметрами приводит к увеличению продуктивности эмбриоидогенеза у яровой мягкой пшеницы

7. Впервые проведен полный цито-гистологический мониторинг дифференциальных путей морфогенеза в культуре изолированных пыльников и показано наличие принципиальных различий в начальных путях эмбриоидогенеза и каллусогенеза:

а) при эмбриоидогенезе первое деление ядра микроспоры приводит к образованию равных ядер и клеток, которые развиваются в многоклеточные структуры с упорядоченным расположением клеток, затем такие структуры прорастают в эмбриоиды;

б) на путь каллусогенеза вступают микроспоры, первое деление ядра которых неравное, что и обуславливает образование структур с нерегулярным,

неупорядоченным расположением клеток;

в) образование морфогенного и или/ немофогенного каллуса зависит от концентрации 2,4-Д в питательной среде. У всех исследованных генотипов неморфогенные каллусы формировались при высоких концентрациях 2,4-Д, равной 1,0 - 2,0 мг/л. У генотипов с высоким эндогенным уровнем фитогормонов появление неморфогенных каллусов зафиксировано и при 0,5 мг/л 2,4-Д.

8. Показано, что регенерационная способность генотипов индивидуальна и зависит также от взаимовлияния эндогенных (в экспланте) и экзогенных (в питательной среде) гормонов. При высокой концентрации гормонов в эмбриоидах регенерационная среда содержит низкие концентрации цитокшшна и, наоборот, при низком уровне эндогенных фитогормонов в экспланте регенерационная среда более насыщена цитокинином.

9. Показано, что молекулярные спектры ДНК у гибридной формы Фотос, характеризующейся уникальной продуктивностью морфогенеза в культуре изолированных пыльников, помимо ампликонов, свойственных родительским сортам Жница и Московская 35, содержат дополнительные полиморфные локусы.

10. Достижением разработанной авторами технологии прямого андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы является подбор таких условий культивирования изолированных пыльников, которые не вызывают гсНсТйЧсСкйл изменений в ДНК, доказательством чего является отсутствие у исследованных генотипов и их андрокпинных удвоенных гаплоидных линий молекулярного полиморфизма ДНК, изученного методом RAPD-ПЦР анализа ДНК с использованием 15 праймеров. Дашгый факт свидетельствует, с одной стороны, о возможности сохранения стабильности генома при культивировании изолированных пыльников, с другой - о соответствии факторов, воздействующих на экспланты при эмбриоидогенезе и регенерации растений его эндогенным характеристикам.

11. Выявлены особенности регуляции генетической изменчивости изолированных пыльников и получены андоклинные удвоенные гаплоидные линии яровой мягкой пшеницы, характеризующиеся высокой засухоустойчивостью, продуктивностью, хорошим качеством и высоким количеством белка и скороспелостью.

Список основных работ по теме диссертации

1. Горбунова В.Ю. Андроклиния у яровой мягкой мягкой пшеницы // Новые направления в биотехнологии. Москва, 1986. Пущино. С. 34.

2. Горбунова В.Ю. Андроклиния у изогенных линий яровой мягкой пшеницы //111 съезд ВО! иС. Москва, 1987. С. 110.

3. Горбунова В.Ю., Докичева P.A., Кужлева Н.Г., Башаркина Н.В. Андроклиния у сортов яровой мягкой пшеницы саратовского экотипа //

Сб.:Применение достижений биотехнологии в народном хозяйстве. Уфа: БФ АН СССР, 1987. С. 56-57.

4. Горбунова В.Ю., Кужлева Н.Г., Докичева P.A. Регенерация растений в культуре изолированных пыльников яровой пшеницы // Экологическая i енетика растений и животных. Тез. III Всесоюз. конф. Кишинев, 1987.

5. Садыков Б.Ф., Пропадущая Л.А., Ильина Л.Б., Горбунова В.Ю. Возможные пути активации ассоциативной азотофиксации в ризосфере у андрогенных линий пшеницы. Сельхоз. биология. 1987, № 6. С. 56-60.

6. Горбунова В.Ю., Круглова H.H. Методические аспекты культивирования изолированных пыльников пшеницы. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1988. 20 с.

7. Горбунова В.Ю., Докичева P.A., Надольская С.Н. Математическое обеспечение экспериментальных работ по культуре пыльников // Межд. конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология" Новосибирск, 1988. С. 227.

8. Горбунова В.Ю., Надольская С.Н., Башаркина Н.В., Кудоярова Г.Р. Способ получения растешш-регенерантов яровой пшеницы из пыльцы в культуре пыльников // A.C. №1628248. 1988, ДСП.

9. Горбунова В.Ю., Надольская С.Н., Башаркина Н.В., Кужлева Н.Г. Экзогенные ауксины и интенсивность эмбриогенеза у сортов яровой пшеницы / / Тр. межд. конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология" Новосибирск, 1988. С. 212-213.

10. Горбунова В.Ю., Кудоярова Г.Р., Надольская С.Н., Башаркина Н.В. Зависимость ростовой реакции растений на действие 2,4-Д от эндогенного гормонального статуса растений пшеницы разных генотипов // Всес.науч. конф. "Онтогенетика высших растений": Тез.докл., Кишинев. 1989. С.311.

И. Горбунова В.Ю., Башаркина Н.В., Надольская С.Н., Кудоярова Г.Р. Гормональная регуляция процессов эмбриоидогенеза при культивировании пыльников яровой пшеницы // Сб.: Иммуноферментньш анализ регуляторов роста растений. Уфа БНЦ УрО АН СССР, 1990. С. 85-89.

12. Кудоярова 1 IP., Докичева P.A., Башаркина Н.В. 1 орбунова В.Ю. Влияние низкой концентрации аммонийной и нитратной форм азота на содержание гормонов в дигаплоидных растениях пшеницы//Сб.: Иммуноферментньш анализ регуляторов роста растений: Применение в физиологии растений и экологии. Уфа: БНЦ УрО АН СССР 1990. С. 60-65.

13. Кудоярова Г.Р., Мустафина А.Р., Горбунова В.Ю. Взаимосвязь между выживаемостью и распределением гормонов в растениях пшеницы при обезвоживании: на примере дигаплоидов. // Сб.: Иммуноферментньш анализ регуляторов роста растений: Применение в физиологии растений и экологии. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1990. С. 41-46.

14. Gorbunova V.Ju., Nadolskaja S.N., Basharkina N.V., Kudojarova G.R. Abscisic acid and embryoidogenesis in spring wheat anther culture // XI

Int.Symp.Embryology and seed reproduction. Leningrad, 1990. P.82.

15. Kruglova N.N., Gorbunova V.Yu., Potapova N.N. Cyto and embryological aspects ol'wheat anther culture//Abstr. XI Int. Sympos. «Embryology and seed reproduction». Leningrad, 1990. P. 84.

16. Горбунова В.Ю., Надольская C.H., Башаркина H.B., Кудоярова Г.Р., Кужлева Н.Г. Способ получения растений-регенерантов пшеницы из пыльцы в культуре пыльников // А.С. № 1650051. 1991, бюл. № 19.

17. Круглова Н.Н, Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Периодизация развития пыльника злаков. Уфа: БНЦ УрО АН СССР, 1991. 8 с.

18. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Потапова Н.Н. Цитологическая характеристика культивируемых пыльников яровой мягкой пшеницы при различных концентрациях 2,4-Д в составе питательной среды // Всес.конф. "Экологическая генетика растений, животных, человека": Тез: докл. Кишинев,

1991. С.418

19. Горбунова В.Ю. Способ культивирования изолированных пыльников растений / А.С. № 1724688. 1992, бюл. № 13.

20. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н., Потапова Н.Н. Эмбриоидогенез в культуре пыльников пшеницы: цитолого-гистологические аспекты. Ч. 1. Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. 64 с.

21. Батыпша Т.Н., Круглова Н.Н, I орбунова В.Ю. Культура изолированных пыльников злаков с позиции экспериментальной эмбриологии растений (методологические аспекты). Уфа: БНЦ УрО РАН, 1992. 32 с.

22. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Потапова Н.Н. Цитолого-гнстологическая характеристика эмбриоидов и каллусов яровой мягкой пшеницы сорта Соналика // VI съезд ВОГиС: Тез. докл. Минск, 1992.

23. Надольская С.Н., Горбунова В.Ю., Башаркина Н.В. Роль абсцизовой кислоты в регуляции спорофитного пути развития у яровой мягкой пшеницы в культуре изолированных пыльников // II съезд ВОФР: Тез.докл. Москва, 1992. С. 145.

24. Kruglova N.N., Gorbunova V.Yu., Potapova N.N. Cytological and embryological aspects of wheat anther culture//Procced. XI Int. Sympos. «Embryology and seed reproduction». St.Petersburg, 1992. P. 292-293.

25. Kruglova N.N., Gorbunova VJu. Pollen embyoid and sexual embryo; simila Kiev and ditterence // XII Int. Congress on Sexual Plant reproduction. Kolumbus,

1992.

26. Galieva E.R., Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Ultrastucture of spring wheat embryoid and callus cells//Proceed. XI Int. Sympos. «Embryology and seed reproduction». St.Petersburg, 1992. P. 164-166.

27. Gorbunova V.Ju., Nadoiskaja S.N., Basharkina N.V. Abscisic acid and embryoidogenesis in spring wheat anther culture //XI Int.Symp.Embryology an seed

Reproduct (Proceedings). S.-Peterburg, 1992. P. 186-188.

28. Kruglova N.N., Gorbunova V.Ju., Potapova N.N. Cytological and embyological aspects oi why at anther culture // XI lnt.Symp.Embryology and seed Reptoduct (Proceedings). S.-Peterburg, 1992. P. 292-293.

29. Kruglova N.N., Gorbunova V. Yu. Pollen embryoid and sexual embryo: similarity and difference// XII Int. Congress «Plant reproductive biology. Pollen, ovules and seeds». Abstr. The Ohio State University, 1992. P. 36.

30. Горбунова В.Ю. Генетические предпосылки спорофитного пути развития микроспор злаков в условиях in vitro. Моиогр. Уфа: УНЦ РАН, 1993 г. 104 с.

31. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н, Батыпша Т.Б. Аидрогенез в культуре изолированных пыльников злаков: цитолого-эмбриодогические аспекты//Успехи соврем, биологии. 1993. Т. ИЗ. Вып. 1. С. 19-35.

32. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические основы аидрогенеза in vitro у злаков//Тез. докл. III съезда ВОФР. Ч. 1. СПб., 1993. С. 86.

3 3. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Сравнительный цитологический анализ эмбриоида и зародыша яровой мягкой пшеницы на ранних этапах их развития/ /Тез. докл. II междунар. (VI Национ.) конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология». Ч. 1. Алматы, 1993. С. 16.

34. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Потапова Н.Н. Влияние концентрации 2,4-Д на начальные этапы эмбриоидогенеза в культуре пыльников яровой мягкой пшешщы//Тез. докл. III съезда ВОФР. Ч. 2. СПб., 1993. С. 139.

35. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Влияние генетической детерминации уровня эндогеш£ых фитогормонов на выход андрогенных новообразований у пшеницы/Яенетика. 1994. Т. 30. Приложение. С. 34.

36. Батыгина Т.Б., Круглова Н.Н, Горбунова В.Ю. Андрогенез in vitro у злаков: анализ с эмбриологических позиций/Щитология. 1994. Т. 36. N 9-10. С. 993-1005.

37. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Андрогенез in vitro и амфимиксис: сравнительный ультраструктурный анализ развивающихся эмбриоида и зиготического зародыша яровой мягкой гпценицы//Сб. трудов междунар. симп. «Апомиксис у растений: состояние, проблемы и перспективы исследований». Саратов, 1994. С. 86-88.

38. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Androgenesis in vitro: physiological aspects of the phenomenon in cereales//Abstr. XIII Internat. Congress on Sexual Plant Reproduction. Vienna, 1994. P. 70.

39. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические аспекты андрогенеза in vitro у злаков//1'ез. докл. Ш Российск. симп. «Новые методы биотехнологии растений». Пущино, 1995. С. 18.

40. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Батыгина Т.Б. Эмбриоидогенез как путь

морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков//Успехи современ. биологии. 1995. Т. 115. Вып. 6. С. 692-705.

41. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Genetical determination of the cereals androgenesis in vitro: hormonal aspects//Procced. XIV Internat. Congress on Sexual Plant Reproduction. Lome, 1996. P. 146.

42. Kruglova N.N., Gorbunova V.Yu. Androgenesis in vitro and amphimixis: comparative analysis of the early stages in vvheat//Procced. XIV Internat. Congress on Sexual Plant Reproduction. Lome, 1996. P. 146.

43. Горбунова В.Ю., Круглова H.H. Индукция андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы. Оптимальная фаза микроспорогенеза//Известия РАН. Серия биол. 1997. N6. С. 668-676.

44. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Физиологические аспекты андрогенеза in vitro у злаков//Тез. докл. VII междунар. конф. «Биология клеток растений in vitro, биотехнология н сохранение генофонда». М„ 1997. С. 81.

45. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н. Цитолопгческий анализ начальных этапов морфогенеза в культуре изолированных пыльников пшетщы//Сб. трудов междунар. конф. по анатомии и морфологии растений. СПб., 1997. С. 348.

46. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Калпусогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков//Успехи современ. биологии. 1997. Т. 117. Вып. 1.С. 83-94.

47. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Микроспора как инициальная клетка морфогенеза в культуре in vitro пыльников пшеницы// Тез. докл. VII междунар. конф. «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». М., 1997. С. 117.

48. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Цитолого-гнстологический анализ эмбриоидов и каллусов пшеницы на ранних этапах развития//Сб. трудов междунар. конф. по анатомии и морфологии растений. СПб., 1997. С. 355-356.

49. Абрамов С.Н., Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Анализ андрогенных эмбриоидов и каллусов методом сканирующей электронной микроскоиии//'1'ез. докл. междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология». Минск, 1998. С. 135.

50. Куксо П.А., Веселое С.Ю.. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Фитогормональный статус пыльников яровой мягкой пшеницы на разных стадиях развития//Гр. межд. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология». Минск, 1998. С. 135.

51. Abramov S.N., Kruglova N.N., Gorbunova V.Yu. Wheat androgenic embry-oid and callus: data of scanning electron microscopy//Bulg. Journ. Plant Physiol.. Special issue. Varna. 1998. P. 15.

52. Gorbunova V.Yu., Kruglova N.N. Androgenesis in vitro in cereals: physiological aspects//Bulg. Journ. Plant Physiol. Special issue. Varna. 1998P. 68.

53. Kruglova N.N., Gorbunova V. Yu. Morphogenic microspore as the initial cell of morphogenesis in wheat anther culture in vitro//Bulg. Journ. Plant Physiol.. Special issue. Varna. 1998 P. 164.

54. Круглова H.H., Горбунова В.Ю., Куксо П.А. Морфогенез в культуре изолированных пыльников: роль фитогормонов//Успехи современ. биол. 1999.Т.119.Вып. 6. С.567-577.

55. Горбунова В.Ю., Круглова Н.Н., Абрамов С.Н. Индукция ацдрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы. Баланс эндогенных и экзогенных фитогормонов//Известия РАН. Серия биол., 2000,№2.

56. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Абрамов С.Н. Андрогенные эмбриоиды и каллусы пшеницы: данные сканирующей электронной микроскопии//Известия РАН. Серия биол., 2000, №3.

57. Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Абрамов С.Н. Андрогенный каллус пшеницы: данные цитолого-гистологического анализа методами световой и электронной микроскопии//Сб. тр. XI междунар. конф. «Изучение онтогенеза растений природных и культурных флор в ботанических учреждениях и дендропарках Евразии». Киев, 1999, с. 34-36.

58. G. Gerashchenkov, N. Rozhnova, V. Gorbunova.// Subtractive self-hybridization for the isolation of differentially expressed genes in cob of AT-1 line of maize with the autonomous development of embryo// Apomixis Newsletter.- 1999. No. 11-P. 21-25.

59. Горбунова В.Ю., Зарянова Л.Д. RAPD -ПЦР анализ особенностей организации генома яровой мягкой пшеницы при эмбриоидогенезе/Лез.докл II съезда ВОГиС, СПб.2000. С.144.

60. Геращенков Г.А., Горбунова В.Ю., Зарянова Л.Д., Рожнова Н.А., , Вахитов В. А. Молекулярно-генетические особенности организации генома при эмбриоидогенезе in vitro у яровой мягкой пшеницы// Генетика. 2000. Т. З6..№ 3.