Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация параметров генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой пшеницы (Triticum Aestivum L.) и изучение трансгенных растений, несущих гены bar и gst

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация параметров генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой пшеницы (Triticum Aestivum L.) и изучение трансгенных растений, несущих гены bar и gst"



На правах рукописи

ФАДЕЕВ Виталий Сергеевич

ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РАЙОНИРОВАННЫХ В РФ СОРТОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (TRTT1CUM AESTIVUML.) И ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, НЕСУЩИХ ГЕНЫ bar И gst

Специальность 03.00.23 - биотехнология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2006

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии Центра "Биоинженерия" РАН

Научный руководитель: Доктор биологических наук

Александр Константинович Гапоненко

Официальные оппоненты;

Доктор биологических наук

Ирина Васильевна Голденкова-Павлова

Доцент, кандидат биологических наук Александр Александрович Соловьев

Ведущая организация:

Институт Цитологии и генетики СО РАН

Защита диссертации состоится " 14 часов на заседании

диссертационного совета Д.220.043.10 в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Адрес: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49 Ученый совет РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева _

Автореферат разослан " ¡6 " 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Г.И. Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Пшеница является главной сельскохозяйственной культурой для большинства населения умеренной климатической зоны. Подавляющее большинство сортов пшеницы создано традиционными методами селекции на основе использования генетического разнообразия исходных видов. Развитие генно-инженерных технологий призвано качественно изменить этот процесс путем вовлечения в селекцию единичных генов или группы генов из любых видов растений, животных, микроорганизмов, или даже ab initio синтезированных генов, которые могут быть введены в геном пшеницы для придания новых желаемых свойств.

Первая трансформация пшеницы методом биобаллистики осуществлена (Vasil et al, 1992). В настоящее время процесс создания трансгенных растений мягкой пшеницы (7^ aestivum L.) методом биобаллистической трансформации считается рутинным. Однако это справедливо лишь для некоторых сортов, отзывчивых к трансформации, таких как Bobwhite и Florida, но и в этих случаях эффективность трансформации не превышает 1-6% (Weeks I.T. et al, 1993, Chen W.P., et al, 1998, Uze M. étal, 1999, Jordan M.C 2000, Wright M., 2001).

Производство высококачественного продовольственного зерна пшеницы лимитируется в Российской Федерации абиотическими и биотическими стрессами. Среди биотических стрессов для злаков необходимо выделить экономически значимого вредителя пшеницы клопа вредная черепашка (Eurygaster integriceps Puton), затрудняющего получение высококачественного зерна в южных и юго-восточных регионах России. Экономические потери от клопа составляют миллиарды рублей ежегодно (Захаренко В.А., 2005). Поэтому создание устойчивых к неблагоприятным условиям среды сортов пшеницы представляется первостепенной научной и важнейшей экономической задачей.

Для практического применения генетической инженерии с целью улучшения важнейших культур необходимо иметь высокоэффективную систему генетической трансформации, адаптированную для районированных в РФ сортов, Увеличение эффективности трансформации ценных генотипов пшеницы может быть достигнуто при решении следующих задач:

1. повышение частоты регенерации растений in vitro;

2. оптимизация параметров генетической трансформации;

3. выбор наиболее эффективного способа селекции трансформированных клеток и регенерации истинных растений-трансформантов.

Известно, что поддержание гомеостаза глутатиона является одним из механизмов, обеспечивающих устойчивость растений к различным абиотическим стрессам. Поэтому генно-инженерные манипуляции с метаболическим путем глутатиона представляются многообещающими для

t

повышения устойчивости растений к стрессам. Антистрессовые действия фермента глутатио H-S-траи сф еразы (GST) обусловлены детоксикацией свободных радикалов, возникающих при любых стрессах. Ген gst был изолирован из генома Arabidopsis thaliana в группе профессора С. Сопори (Международный Центр Генетической Инженерии и Биотехнологии, Нью-Дели, Индия) и любезно предоставлен нам для исследования.

Цель исследования заключалась в оптимизации параметров генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой яровой пшеницы и получении трансгенных растений, несущих гены gst и bar, для определения устойчивости полученных растений к гербициду Баста и хлоридно-натриевому засолению.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

1. Оптимизировать параметры ведения культуры клеток и регенерации растений in vitro мягкой пшеницы сортов Лада, Эстер, Мис, Норис и Амир.

2. Оптимизировать параметры биобаллистической трансформации мягкой пшеницы сортов Лада, Эстер и Мис.

3. Провести сравнительный анализ эффективности трех методов негативной селекции (отложенной, градационной, регенерационной) трансгенных тканей пшеницы in vitro, для получения истинных трансформантов.

4. Получить растения трансгенной пшеницы, несущей гены bar, gfp и bar, gst, а также изучить характер наследования введенных трансгенов.

5. Выявить трансгенные растения, устойчивые к натриево-хлоридному засолению.

Научная новизна Все представленные в диссертации результаты являются новыми и оригинальными.

1. Впервые показан стимулирующий эффект кратковременного воздействия (48 ч.) пониженной температуры (+4°С) на частоту индукции морфогенетического каллуса.

2. Впервые оптимизированы условия культивирования in vitro генотипов мягкой пшеницы Лада, Эстер, Мис, Амир, Норис районированных в 4 зонах РФ, для индукции морфогенного каллуса и регенерации растений in vitro.

3. Впервые оптимизированы параметры биобаллистической трансформации мягкой пшеницы для широко возделываемых в четырех зонах РФ сортов Лада, Эстер и Мис.

4. Впервые в РФ получены трансгенные растения мягкой пшеницы, несущие гены bar и gst.

г

5. Проведен анализ наследования трансгенов в двух поколениях на примере сорта мягкой пшеницы Лада, Показано, что экспрессия gst может повышать уровень устойчивости растений пшеницы к хлоридно-натриевому засолению.

Практическая значимость Полученные в работе результаты имеют важное практическое значение:

- результаты данной работы показали возможность получения трансгенных растений, распространенных сортов мягкой пшеницы, несущих различные гетерологичные гены, в количествах необходимых для использования в селекционном процессе.

- получена выборка трансгенных растений мягкой пшеницы сорта Лада, несущих гены bar, обеспечивающий устойчивость к гербициду широкого действия Баста и ген антистрессового действия gst, Данные растения представляют интерес для изучения механизмов повышения устойчивости пшеницы к хлоридно-натриевому засолению. ■

Апробация работы Основные результаты работы докладывались на 2-ой научной конференции Московского общества генетиков и селекционеров "Актуальные проблемы современной генетики"; на конференции "Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений", Краснодар 2003 г.; на международном конгрессе XVth International Plant Protection Congress, Beijing, China, May 11—16, 2004; на международной конференции Second International Conference on Sunn Pest, ICARDA, Aleppo, Syria 19-22 July, 2004; На международной конференции "Развитие ключевых направлений сельскохозяйственной науки Казахстана: селекции, биотехнологии и генетических ресурсов" Астана, 3-7 августа 2004.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (fSp наименований), изложена на $4 страницах машинописного текста, содержит /6 таблиц и ¿jj? рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Получение каллусноЙ культуры и регенерация in vitro мягкой пшеницы. В работе использованы российские сорта яровой пшеницы Лада, Эстер, Норис, Мис, и Амир (автор к.с-х.н., Н.В Давыдова и др., НИИСХ РАСХН). Растения, использованные в эксперименте, выращивали в условиях теплицы при фотопериоде 16/8 ч, при температуре +25°С днем и +15°С ночью.

Для получения морфогенного каллуса в качестве экспланта использовали незрелые зародыши, изолированные на 10-12 день после опыления, размер зародыши составлял 0.5-1,5 мм. Зародыши помещали на среду для индукции морфогенного каллуса (А) содержащую МЗ соли, В5 витамины, 2 мг/л 2,40, 30 г/л сахарозы и 8 г/л агар-агара.

Культивирование каллусов на среде для регенерации проводили в течение двух недель при освещении 5000 люкс. МорфогенныЙ каллус, образующий побеги, помещали в пробирки со средой для укоренения. Культивирование побегов проводили в течение 4-6 недель до образования первичных корней. Укоренившиеся проростки пересаживали в перлит и помещали во влажную камеру на 7-14 дней. По мере развития окрепшие растения переносили в почву до полного созревания в условиях теплицы.

В работе использовали вектора экспрессии рзОИРВАЯ, рЦЫ 1ОШ и рСЗТВАЯ, сконструировал д.б.н, Н.В. Равин

Ро1у-А

Схематическая карта плазмпды pUbilGUS Act intron j—^^—I nos3' -f Übil ^1 intron |

nos3'

Схематическая карта плазмнды psGFPBAR "И GSt"1H nos3*

intron

Ubil ►

intron

Схематическая карта плаэмиды pGSTBAR

Биобаллистическая трансформация мягкой пшеницы. В качестве микроносителя использовали вольфрамовые микрочастицы "М10", средний размер которых составляет 0,1-2,0 мкм. Преципитация проводилась по методике кальций-спермидинового способа, по Файнер (Finer J. et al, 1992).

Для повышения выживаемости трансформируемой ткани проводили осмотическую пре- и пост обработку. Экспланты культивировали на среде с повышенным осмотическим давлением в течение 4-6 часов до трансформации и 20-24 часа после трансформации.

Биобаллистическая трансформация проводилась с использованием "генной пушки" PIG (Particle inflow gun) (Finer J. et al, 1992):

Определение транзиентной экспрессии гена uidA (GUS) проводили методом гистохимического окрашивания растительных эксплантатов по (Jefferson et al, 1987). Для анализа препаратов использовали стереомикроскоп (Wild Leica, Heerbrugg, Швейцария).

Оценку gfp экспрессии (как транзиентной, так и стабильной) проводили при использовании стереомикроскопа с флуоресцентным модулем. Оценку экспрессии проводили на 2, 7 и 35 день после баллистической трансформации.

Все полученные in vitro растения ТО, устойчивые к фосфинотрицину (РРТ), оценивали на наличие последовательности гена bar, gst и nos 3' терминатора с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции).

Определение устойчивости полученных трансгенных линий пшеницы к гербициду широкого спектра действия БАСТА, который содержит фосфинотрицин (РРТ) в качестве активного компонента, проводили на растениях Т1, полученных самоопылением из трансгенных растений ТО.

Для оценки устойчивости полученных трансгенных растений к хлоридно-натриевому засолению получена кривая доза-эффект выживания контрольных нетрансгенных растений мягкой пшеницы сорта Лада при засолении. В последующем, проверку устойчивости трансгенных растений к хлоридно-натриевому засолению проводили на среде для проращивания содержащей 200 мМ/л NaCl. Полученные устойчивые растения оценивали на наличие копии гена gst (глутатион-5-трансфераза) ПЦР анализом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Оптимизация ведения культуры тканей мягкой пшеницы in vitro Изучение взаимосвязи между частотой индукции морфогенетического каллуса in vitro н генотипом мягкой пшеницы

Известно, что морфогенетический потенциал растений обусловлен генотипом. Первоначально мы провели сравнительные исследования по изучению морфогенного потенциала для пяти сортов мягкой пшеницы. В эксперименте были использованы незрелые зародыши, изолированные на 10-12 день после опыления, размер которых варьировал в пределах 0.5-1.5 мм. К концу второй недели культивирования каллус разделяли на два типа: морфогенный каллус, компетентный к регенерации побегов — плотный, желтоватый, глобулярный, и неморфогенный каллус — рыхлый, водянистый, белый. Все исследуемые сорта мягкой пшеницы образовывали морфогенный каллус. С наибольшей частотой морфогенный каллус образует сорт Лада - до 75%, для сорта Ыис частота образования морфогенного каллуса - 20%, сорта Эстер, Норис и Амир - 40-60% (Рис. 1.).

Влияние низкотемпературной обработки зерновок на частоту индукции морфогенетического каллуса

Известно, что на частоту индукции морфогенетического каллуса I оказывают влияние тип и состояние экспланта, воздействие физических

факторов и фитогормональный состав сред. Для оценки влияния

низкотемпературного шока на частоту индукции морфогенного каллуса, незрелые зерновки подвергали обработке пониженной температурой в течение 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10 и И дней. Далее изолировали незрелые зародыши и культивировали их на среде (А). В последующем проводили оценку частоты индукции морфогенного каллуса. Полученные данные позволяют сделать вывод о повышении частоты индукции морфогенного каллуса при кратковременной (48 ч.) экспозиции эксплантов при температуре +4°С (рис. 2). Для сорта Лада максимальные значения частоты индукции морфогенетического каллуса достигают 75 %; для сорта Норис 60 %. В качестве контроля использованы незрелые зародыши сортов Лада и Норис, изолированные из зерновки сразу после срезания колоса незрелого растения. Обработка эксплантов низкой температурой более трех дней приводит к снижению образования морфогенного каллуса. Как видно из полученных результатов, частота образования морфогенетического каллуса на 1 и 4 день экспозиции одинакова, на 5 день эффективность воздействия снижается (рис. 2).

Рис. 1. Зависимость индукции Рис. 2. Влияние воздействия низкой морфогенного каллуса от генотипа температуры на индукцию морфогенного мягкой пшеницы (Triticuni aestivum L) каллуса мягкой пшеницы сортов Лада и

Норис. К-контроль

Изучение влияния различных фитогормонов и их концентрации в среде на частоту регенерации растений ш vitro мягкой пшеницы

Общеизвестно, что регенерация пшеницы ш vitro достигается удалением из культуральной среды, содержащей макро и микро соли по Мурасиге и Скуг, фитогормон 2,4-D (Vasil et al 1982, Гапоненко и др., 1984). Для повышения морфогенетического потенциала сортов яровой пшеницы Норис и Лада, которые отличаются высоким морфогенетическим потенциалом, проводили оценку влияния различных фитогормонов и их концентрации, путем сравнения частоты индукции регенерации побегов, корней, побегов с корнями и целых растений. Состав используемых в работе сред представлен в (таблице 1). Первоначально в эксперименте отбирали морфогенетические каллусы, которые переносили на среды регенерации (1-Ю) и культивировали в течение двух

б

недель. В эксперименте отдельно учитывали экспланты, давшие побеги, корни, и экспланты, сочетавшие образование побегов и корней, также учитывали регенерацию растений в целом (рис. 3, 4.).

Таблица 1. Использованные среды для исследования влияния различных фитогормонов на частоту регенерации побегов in vitro мягкой пшеницы сортов Лада и Нор и с _

Среда Фитогормоны

1 Фнтогормоны отсутствуют

2 Кинетин 0.5 мг/л (К 0.5)

3 Кинетин 1 мг/л (К 1)

4 6-беизиламинопурин 0.5 мг/л (ВАР 0.5)

5 6-бензиламинопурин 1 мг/л (ВАР 1)

6 Нафтилуксусная кислота 0.5 мг/л (NAA 0.5)

7 Нафтилуксусная кислота 1 мг/л (NAA 1)

8 Индолилуксусная кислота 0.5 мг/л (1АА 0.5)

9 Мидолнлуксуеная кислота 1 мг/л (IAA 1)

10 Осмотическая (сахароза 0.4 М, фитогормоны отсутствуют)

Как видно из представленных данных, частота побегообразования увеличивалась на средах, содержащих цитокинины: кинетин и ВАР (6-бензиламинопурин). Ауксины: NAA и IAA увеличивают частоту образования корней у морфогенного каллуса мягкой пшеницы (рис. 3,4.).'

Без К0.5 К1 ВАР 0.5 ВАР 1 NAA0.5 NAA1 IAA0.5 гормонов Фитогормональный состав среды

IAA1

Осмос

Рис. 3. Влияние различных фитогормонов и их концентрации на частоту регенерации побегов, корней н растений мягкой пшеницы сорт Норис

80.0

■ Регенерация побеги Я Регенерация корни

■ Регенерация побеги с корнями В Регенерация растения

ВАР 0.5 ВАР 1 ЫАА 0.5 КАА1 1АА 0.5 Фитогормональный состав среды

Рис. 4. Влияние различных фитогормонов и их концентрации на частоту регенерации побегов, корней н растений мягкой пшеницы Лада

I

]

На основе полученных результатов была составлена оптимальная для регенерации растений среда, содержащая фитогормоны: ВАР и кинетин в концентрации 1 мг/л, и ИАА в концентрации 0,5 мг/л, эффективность которой тестировали с использованием сорта Лада. Эффективность побегообразования из морфогенетического каллуса при использовании данной комбинации фитогормонов достигала 90 %. Используемая для укоренения полученных побегов среда содержит ЫАА в концентрации 0,5 мг/л, частота укоренения достигает 90 % (таблица 2).

Таблица 2. Оценка эффективности регенерации растений мягкой пшеницы сорта Лада с использованием культуральной среды с комбинированным фитогормональным составом

Этапы ведения культуры Общее количество, шт Число регенерантов, %

Морфогенные каллусы 156

Каллусы с побегами 138 88,7 +/- 6,00

Укорененные регенеранты 136 87,2 +/- 5.21

Растения в перлите 136 87,2 +/- 5.21

2. Оптимизация параметров биобаллистической трансформации растений мягкой пшеницы

Влияние биобаллистического воздействия на морфогенетическиЙ потенциал тканей мягкой пшеницы

Изучали влияние баллистической обработки на растительную ткань на среде для индукции каллусообрарования (А) на 4, 7, 10, 14 и 21 день культивирования. Оценку степени влияния, которое выражается в снижении способности к регенерации, производили через 7 дней после баллистической трансформации путем сравнения морфогенного статуса растительных эксплантатов, подвергнутых биобаллистике, и контрольных эксплантов, не подвергнутых баллистической обработке (вакуумом, резким повышением давления и ударом микрочастицами). В качестве контроля были использованы зародыши (для сравнения с эксплантатами на 4 и 7 день культивирования) и морфогенные каллусы (для сравнения с эксплантатами на 10, 14 и 21 день культивирования). Из представленных данных видно, что степень отрицательного влияния уменьшается с увеличением возраста экспланта с момента инициации каллусной культуры (рис. 5).

Показано, что при баллистической трансформации морфогенетическиЙ потенциал зависит от генотипа. Из трех исследуемых генотипов пшеницы культивируемые клетки сорта Лада наиболее устойчивы к баллистическому воздействию по сравнению с сортом Эстер и сортом Мис, последний наименее устойчив к воздействию (рис. 5.). Нами показано, что оптимальным временем для баллистической трансформации мягкой пшеницы является 10-14 день с момента инициации культуры тканей пшеницы для всех исследуемых сортов.

Следует отметить, что через 21 день с момента инициации культуры растительная ткань не чувствительна к биобаллистическому воздействию (рис. 5.). Однако известно, что с увеличением времени ведения культуры снижается компетентность к регенерации и увеличивается частота появления сомаклональной изменчивости мягкой пшеницы (Бабаева С. И др. 1995).

100

1* "

§ £ 60

-8- I 40

а. 2

О 20 0

4 7 10 14 21

Время индукции культуры до эксперимента, дни

Рос. 5. Влияние баллистической трансформации на ицдукцию морфогенетического каллуса мягкой пшеницы в зависимости от времени предварительного культивирования экспланта

Оптимизация параметров баллистической трансформации мягкой пшеницы

Основа системы биобаллистической трансформации состоит в эффективной доставке векторных конструкций в клетки мишени, компетентные к регенерации растений. Однако проникновение металлических микрочастиц в клетку путем пробивания клеточной стенки наносит повреждения, связанные с разрушением клеточных структур. Таким образом, поиск оптимальных параметров сочетающих максимальную степень доставки векторных конструкций в клетки и при этом наносящих незначительные повреждения живой ткани является главной задачей оптимизации параметров трансформации.

Для оптимизации параметров баллистической трансформации сортов мягкой пшеницы проведена сравнительная оценка влияния двух физических параметров, влияющих на доставку ДНК (кассет экспрессии) в компетентные к регенерации проростков клетки каллуса, полученных из незрелых зародышей. Величина избыточного давления гелия при выстреле - 5, 6, 7 и 8 атмосфер, и расстояние от источника частиц (сопло фильтродержателя) до ткани мишени -10,12 и 14 см.

Для баллистической трансформации использовали векторную конструкцию рЦЫЮиЗ, содержащую ген шс!А, кодирующий репортерный белок р-глюкуронидазу, под контролем конститутивного убиквитинового кукурузного промотора.

В качестве биологического параметра, влияющего на частоту доставки кассеты экспрессии в компетентные к регенерации клетки, оценивали влияние

время культивирования растительного экспланта до момента трансформации. Морфогенные каллусы, полученные из незрелых зародышей на 4, 7, 10 и 14 после их посадки на среду индукции каллусообразования трансформировали методом биобаллистики. Биобаллистическую трансформацию сорта Эстер проводили на 4, 7 и 10 день после посадки на среду индукции каллусообразования.

Оценка эффективности доставки генов проводилась с помощью выявления и подсчета количества синих участков - мест транзиентной экспрессии гена uidA через 48 часов после биобаллистической обработки. Следует отметить, что выбор векторной конструкции pUbilGUS был не случаен, поскольку для репортерной системы ß-глюкуронидазы разработана чувствительная методика оценки экспрессии m situ. Гистохимическое окрашивание растительных эксплантатов проводилось по методике Джеферсона (Jefferson et al, 1987) с использованием реактива Х-glue.

Высокий уровень транзиентной экспрессии маркерного гена обнаружены при использовании трех пар параметров биобаллистики: 5 атм. и 10 см; 6 атм. и 12 см; 8 атм. и 14 см; (рис. 6, (а-в)). Полученные результаты свидетельствуют о том, что оптимальным для доставки кассет экспрессии является использование давления гелия 6 атм. и 12 см расстояния до ткани мишени и морфогенетических каллусов на 10 и 14 день культивирования эксплантатов на среде индукции каллусобразования (А). Следует отметить, что количественный показатель (число участков транзиентной экспрессии) коррелирует с генотипом растения. Так, для сорта Лада выявлено более 500 случаев доставки кассет экспрессии на -3-4 мм2 поверхности, а для сортов Мне и Эстер 223.3 и 366.3 соответственно. Для сорта Мис также отмечен второй максимум транзиентной экспрессии соответствующий сочетанию параметров 14 см и 8 атм. (рис. 6 а-в)

В условиях эксперимента сочетание параметров 10 см и 6 атм. неэффективны для биобаллистической трансформации мягкой пшеницы. Таким образом, впервые показано с использованием репортерной системы GUS, что оптимальным сочетанием физических параметров биобаллистической трансформации мягкой пшеницы с использованием биобаллистической пушки PIG являются расстояние от источника частиц до ткани мишени 12 см и давление гелия при выстреле 6 атм. Оптимальным временем для трансформации являются 10-14 сутки с момента инициации культуры.

ю

Дни Дни Дни

Рис. б Определение оптимального срока развития каллуса- пшеницы для биобаллистической генетической трансформации пшеницы при использовании трех пар оптимизированных физических параметров баллистики

Мониторинг процесса трансформации путем исследования транзиентной и стабильной экспрессии гена gfp

Репортерная система GUS позволяет проводить анализ, только на фиксированном материале in situ, и использование гена uidA в живых тканях для дальнейшего наблюдения за экспрессией репортерного гена uiäA не приемлемо. Для наблюдения динамики изменения транзиентной и стабильной экспрессией в клетках мягкой пшеницы использован репортерный ген gfp, позволяющий производить in vivo оценку экспрессии трансгена.

В этом эксперименте использована векторная конструкция psGFPBAR, которая содержит ген gfp под контролем конститутивного промотора и селективный ген bar, обеспечивающий устойчивость к гербициду БАСТА.

Транзиентная экспрессия маркерного гена gfp обнаруживается уже через 4 часа после баллистической трансформации. Максимум транзиентной экспрессии гена gfp достигается через 6,5 часов после трансформации и полностью исчезает через 17 дней. Известно что, экспрессия gfp, наблюдаемая позже данного срока, может считаться доказательством стабильной интеграции в геном реципиента (Potricus I, et. al, 1998).

Оценка наличия/отсутствия экспрессии маркерного гена gfp проводилась при помощи микроскопа с флуоресцентным модулем на 2 сутки и на 7 и 35 день после баллистической трансформации. На второй день частота появления транзиентной экспрессии гена gfp составила 100 % от оцениваемых эксплантатов для всех исследуемых вариантов селекции (рис 7 а-в; таблица 3). Частота выявления транзиентной экспрессии, определяемая на 7 день, / составляет от 30 % до 70 %. Стабильная экспрессия гена gfp, определяемая на 35 сутки в момент пересадки морфогенетических каллусов со среды индукции каллусообразования/селекции на среду регенерации/селекции, соответствовала 9-23 %. Максимальные значения транзиентной и стабильной экспрессии gfp

п

гена соответствуют регенерационной методике селекции и превышают в два раза значения полученные для отложенной и градационной систем селекции, 13 % и 11 % соответственно (рис 7; таблица 4).

Рис. 7. Оценка трапзнентной и стабильной экспрессии гена gfp в тканях мягкой пшеницы: в незрелом зародыше (а) и каллусных тканях пшеницы (б,в) через 24 часа после биобаллистической трансформации, контрольный каллус (г) контрольный не трансгенный каллус мягкой пшеницы

3. Получение и анализ трансгенных растений мягкой пшеницы

Сравнительная оценка методик селекции трансгенных тканей пшеницы

Важным этапом получения трансгенных растений является их отбор на селективном агенте. Устойчивость к селективному агенту обеспечивается экспрессией гена селективного маркера. В настоящее время для растений предложено несколько таких генов, обеспечивающих устойчивость к ряду антибиотиков (канамицин, гигромицин и др.) или гербицидов («Баста», глифосат и др.).

В качестве селективного агента нами использован фосфинотрицин (активный компонент гербицида БАСТА), устойчивость к которому обеспечивается геном bar, который входит в состав конструкций psGFPBAR и pGSTBAR. Мы провели сравнительное изучение трех наиболее эффективных методик селекции варианты селекции, используемые в работе, представлены в таблице 3.

Таблица 3. Варианты селекции трансформантов мягкой пшеницы с использованием РРТ в качестве селективного агента

Вариант селекции Градационная Тест 1 Отложенная Тест 2 Регенерационная ТестЗ

Индукция каллуса (РРТ мг/л) 1 неделя -1 2 недели -3 2 недели -5 1 неделя без РРТ 2 недели -5 2 недели -5 2 недели без РРТ

Регенерация (РРТ мг/л) 5 5 5

Укоренение (РРТ мг/л> 5 3 3

Время селекции, дни -98 дней Н92 дня —70 дней

В эксперименте использованы два контрастных по морфогенетическому потенциалу сорта Лада и Мис. Морфогенные каллусы использованы в качестве экспланта для трансформации методом биобаллистики. Первоначально частоту образования предполагаемых трансформантов определяли на основании данных по количеству растений, полученных в результате отбора на

селективной среде in vitro. Далее была рассчитана эффективность трансформации пшеницы на основании данных по ПЦР анализу геномной ДНК на наличие последовательности трансгена bar и nos'3 терминатора, для всех полученных первичных трансформантов (рис. 8 (2,3.)).

Градационная методика проведения селективного отбора тканей, прошедших трансформационные методы, определяется постепенным (пошаговым) увеличением концентрации селективного агента фосфинотрицина (РРТ) в среде. Селективное воздействие на эксплант начинается на вторые сутки после баллистической трансформации. Ткань с осмотической среды сразу переносится на среду селекции с 1 мг/л РРТ, концентрация которого на стадии индукции каллусообразования доводится до 5 мг/л. Общее время проведения селективной обработки составляет 98 дней. Использование методики градуированной селекции позволяет проводить строгий отбор истинных трансформантов Эффективность трансформации растений пшеницы, полученная с помощью методики градуированной селекции (тест 1), составляет 0.85% для сорта Лада, и 2.12% - для сорта Мис (таблица 4.).

Селективный отбор растительных тканей по методике отложенной или задержанной селекции (тест 2) начинается через 7 суток после баллистической трансформации. Обработанная каллусная ткань с осмотической среды переносится на среду индукции каллусообразования (А),

¿."Генная пушка" (PIG): план-схема

2. Электрофореграмма ПЦР анализа трансгенных растений мягкой лшеницы по bar гену

3. Электрофореграмма ПЦР анализа трансгенных растений мягкой пшеницы по nos *3 терминатора

Рис. 8. План-схема баллистической трансформационной установки (PIG) (1), и электрофореграмма ПЦР анализа трансгенных растений мягкой пшеницы по bar гену (2) и, nos '3 терминатору (3.)

Задержка селективного воздействия на ткань проводится для увеличения количества клеток, в которых эффективно осуществлен процесс интеграции введенной ДНК в геном растения. Увеличение общей массы трансгенной ткани повышает вероятность выживания во время селективного давления на растительный эксплантат. Общее время селекции с использованием отложенной методики составляет 92 дня (таблица 3), эффективность

трансформации - 0.65 %, при том, что частота трансформации, рассчитанная по количеству первичных трансформантов, составляет 1,57% (таблица 4).

Таблица 4. Сравнительный анализ эффективности получения трансгенных растений мягкой пшеницы при использовании систем селекции__

Сорт Количество эксплантов на опыт Число / процент GFP+ каллусов после баллистики Количество первичных трансформантов / частота трансформации, % Количество трансгенных растений / эффективность трансформации, %

7 дней 35 дней

Лада тест! 466 186/40 51 /10,9 4/0.85 4/0.85

Лада тест! 446 214/48 57/12,8 7/1.57 3 / 0.65

Лада тестЗ 140 98/70 32/22.9 9/6.43 7/5

Лада тестЗ gsí 350 - - 23/6,57 17/4.86

Мис - тест 1 106 34/32 9/8.9 2/2,12 2/2.12

Мне - тест 2 104 44/42 10/9.6 1/0.96 -

Методика регенерационноЙ системы селекции (тест 3) отличается тем, что отбор трансформированных тканей начинается со стадии регенерации. После баллистической трансформации ткань выдерживается на среде (А) в течение 10-12 дней. Длительное выдерживание ткани на среде индукции морфогенного каллуса позволяет исключить случаи транзиентной устойчивости, которая исчезает через 14 дней после трансформации. При пересадке каллусов на среду регенерации начинается процесс селекции (таблица 3). Известно, что гербицид РРТ не ингибирует хлоропластную изоформу фермента глутамин синтетазы пшеницы (Т. aestivum L.)> однако корневая изоформа чувствительна к воздействию данного гербицида. Таким образом, определяющее воздействие гербицида на растительную ткань производится в момент регенерации/укоренения в течение 2—4 недель регенерации в зависимости от скорости развития побегов и в течение 4—6 недель на стадии укоренения. Развитие мощной корневой системы является главным качественным показателем устойчивости ткани к воздействию гербицида. Эффективность трансформации генетической конструкцией psGFPBAR с использованием регенерационноЙ системы селекции составила 5%. Сходные результаты получены с использованием регенерационноЙ системы при трансформации генетической конструкцией pGSTBAR, эффективность трансформации составила 4.86%, а частота трансформации, рассчитываемая на основе первичных трансформантов, получена 6,43% (таблица 4).

Методика регенерационноЙ системы селекции в условии проведенного эксперимента показала максимальное значение эффективности трансформации

4.S6%~5%, что значительно превышает эффективность трансформации, оцененную для градационной и отложенной системы селекции 0.85% и 0.65% соответственно (таблица 4).

Анализ наследования гена багу трансгенных линий пшеницы Т1

Для изучения наследования устойчивости к гербициду БАСТА было оценено потомство 11 линий мягкой пшеницы из 23 линий ТО, прошедших селекцию и давших регенерацию на среде селекции/регенерации in vitro. В числе анализируемых растений были использованы, как истинные трансформанты (линии 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11), подтвержденные ПЦР анализом на наличие копии гена bar (Рис. 7 (2, 3.).) так и не содержащие последовательности гена bar, т.е. ложные трансформанты (1,2, 3, 9).

Результаты проведенного опыта для поколения Т1 представлены в (таблице 5). Линии растений ложных трансформантов не были устойчивы к воздействию гербицида и увядали наравне с контрольными растениями исходного сорта Лада. Устойчивость к гербициду была отмечена только у растений истинных трансформантов. Для определения наличия копии bar гена у устойчивых растений был проведен ПЦР анализ растений GST 8, GST 10 и GST 11 (таблица 5).

В результате проведенного анализа определено, что два растения (GST10 и GSTU), несли ген bar во всех выживших после обработки гербицидом растениях.

Таблица 5. Анализ наследования устойчивости к гербициду БАСТА и ПЦР анализ наличия/отсутствия гена bar (для линий 8,10 и 11) трансгенных растений мягкой пшеницы сорта Лада._____-

Название ЛИНИИ Количество зерен ТО Устойчивые растения Т1 / ПЦР*+" Не устойчивые растения Т1 Модель Затеет

GST4 125 23 102 1/3 0,08836

GST5 37 25 12 3/1 0,296452

GST6 105 28 77 1/3 0,693282

GST7 * 47 31 16 3/1 0,152242

GST8 49 31/7 18 3/t 0,057827

GST 10 103 62/62 41 3/1 0,00052

GST11 93 72/72 21 3/1 0,590014

В результате проведенного анализа определено, что два растения (GST10 и GST11), несли ген bar во всех выживших после обработки гербицидом растениях. По-видимому, причина устойчивости и выживания после обработки гербицидом растений линии GST8 определяется химерным строением растительной ткани. Для всех растений линий GST10 и GST11, прошедших обработку гербицидом характерно наличие копии гена bar, подтвержденное с помощью ПЦР.

Определение устойчивости трансгенных растений Т1 поколения к хлоридно-натрневому засолению

Одной из целей работы было изучение влияние экспрессии гетерологичного гена gst, на солеустойчивость растений-трансформантов. Поэтому для трансформации использовали векторную конструкцию pGSTBAR, содержащую не только селективный ген bar, но и целевой ген gst, кодирующий синтез фермента глутатион-З-трансферазы. Антистрессовые действия фермента глутатионового цикла глутатион-З-трансферазы обусловлены детоксикацией свободных радикалов органического происхождения, которые образуются в результате абиотических и биотических стрессов (засуха, засоление и т.д.).

В качестве предварительной оценки абиотического стресса нами выбрано засоление, или высокая концентрация соли в среде для проращивания семян.

С целью определения устойчивости к хлоридно-натриевому засолению полученных трансгенных растений нами получена кривая доза-эффект выживания контрольных растений полученных путем проращивания зрелых зерен на культуральных средах, содержащих NaCl. Для этой цели нами использованы различные концентрации хлорида натрия: 50 шМ, 100 шМ, 150шМ, 200шМ и 250шМ. В качестве контроля, использована среда, не содержащая NaCl. Для избежания неравномерного прорастания, зерна предварительно проращивали в стерильных условиях до размера побега 0,5 см и в последующем высаживали на среду, содержащую различные концентрации хлорида натрия. На среде с NaCl растения выращивали 7 дней с ежедневным замером длины побега.

Определено, что концентрация 200 mM NaCl оптимальна для оценки устойчивости к засолению у полученных трансгенных растений при прорастании семян. Контрольные, нетрансгенные растения на среде с 200 шМ NaCl росли медленно, до 3-4 см в неделю. Контрольные растения на среде, не содержащей NaCl, превышали размер 12 см.

Для оценки солеустойчивости выбраны трансгенные растения линий (13, 14, 16 и 22) Т1 поколения, полученные от самоопыления ТО. Согласно расщеплению, среди растений Т1 следовало ожидать разделения на устойчивые трансгенные растения, содержащие ген gst и неустойчивые, нетрансгенные растения (отрицательные гомозиготы). По истечению недели проращивания на среде с 200 mM NaCl, были определены устойчивые к засолению только растения GST 14 (Рис 8, 9; таблица 7) которые оценивали с помощью ПЦР на наличие гена gst (рис 10).

1б

Рис. 8 Проростки, полученные из зерен растения GST14 проявившие устойчивость к воздействию соли в концентрации 200 шМ (слева) в сравнении с не трансгснными контрольными растениями (с права)

Анализируемые трансгенные растения линии GST 14, как и ожидалось, разделялись на две группы. Первая группа растений опережала в развитии контрольные нетрансгенные растения, находящиеся на среде с 200 mM NaCl, соответствуют лункам электрофореграммы на рис. 10 (а) 2-14 и 10 (б) 2-11, 13,14.

Таблица 7. Оценка трансгенных растений на устойчивость к повышенному содержанию соли в среде_____

Название Количеств Растения Т1 Растения Т1 не Модель Хг тест

линии о зерен ТО устойчивые к 200 mM NaCl устойчивые к 200 mM NaCl

GST13 25 - 25 - -

GST14 32 23 9 3/1 0,683091

GST16 26 - 26 - -

GST22 12 4 8 1/3 0,504985

Вторая группа, растений развивающихся наравне с контрольными нетрансгенными растениями, на среде с солью, соответствуют лункам электрофореграммы на рис. 10 (а) 15-17 и 10 (б) 12. Проведение ПЦР анализа показало^ что только растения первой группы содержат ген gst, определяющий устойчивость к абиотическим стрессам. Таким образом, показано, что трансгенные растения, имеющие копию гена gst, проявляют устойчивость к засолению в среде для проращивания. Растения, определенные как нетрансгенные по гену gst с помощью ПЦР анализа, не показывали устойчивости к хлоридно-натриевому засолению.

Ю »200

■ 200 опыт GST 14

4 5 6

время проращивания, дни

Рис 9. Предварительная оценка

устойчивости трансгенных растений к

хлоридно-натриевому засолению

О - нетраисгеиные контрольные растения,

выращенные на среде без соли;

200 — нетрансгенные контрольные растения,

выращенные на среде с 200 шМ NaCl;

200 опыт GST 14 - трансгенные растения

линии GST14, выращенные на среде с 200

mM NaCl;

Рис 10. Электрофореграмма ПДР анализа трансгенных растений по гену gst, определяющему устойчивость к воздействию соли №С1 а-1- М\УМагкег1 кЬ, 2-17 анализируемые образцы, 18 плазмида рСвТВАЯ

6-1- MWMarkerl кЪ, 2-14 анализируемые образцы, 15 негативный контроль пшеницы, 16 ММ, 17 плазмида рС8ТВАК

ВЫВОДЫ

1. Впервые показан стимулирующий эффект кратковременного воздействия (48 ч.) низкой температуры (+4°С) на частоту индукции морфогенетического каллуса.

2. Определен оптимальный фитогормональныЙ состав среды для повышения частоты регенерации in vitro растений мягкой пшеницы сорта Лада {Triticum aestivum L.), позволяющий достигать регенерацию растений с частотой до 90%.

3. Оптимизированы параметры баллистической трансформации мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) сортов Лада, Эстер и Мис, с использованием биобаллистической установки PIG. Давление гелия при выстреле - 6 атм., расстояние от источника частиц до ткани мишени (каллус) - 12 см.

4. Определен оптимальный срок проведения генетической трансформации, который соответствует 10-14 суткам культивирования, после инициации морфогенетического каллуса.

5. Показано, что при использовании регенерационной методики селекции трансгенной ткани мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Лада возможно получение трансгенных растений мягкой пшеницы с эффективностью 5%.

is

6. Получена выборка трансгенных растений мягкой пшеницы сорта Лада, несущих гены gfp и bar (\А независимых трансгенных событий) и выборка из 17 трансгенных растений, полученных от независимых трансгенных событий несущих гены gst и bar.

7. Показана устойчивость к гербициду широкого спектра действия БАСТЛ в Т1 поколении полученных трансгенных растений с генами gst и bar,

8. Выявлена повышенная по сравнению с контролем устойчивость к 200 тМ хлорида натрия у растения Т1 поколения, содержащего ген gst,

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гапоненко А.К., Маркеев А.Н., Мишуткина Я.В., Фадеев B.C. "Пути и проблемы создания трансгенных растений важнейших сельскохозяйственных культур,'''' Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений. Краснодар, 2003. С, 156-170

2. Фадеев B.C., Гапоненко А.К. **Оптимизация параметров баллистической трансформации пшеницы (Triticum aestivum L)" 2-ая научная конференция Московского общества генетиков и селекционеров. Актуальные проблемы современной генетики 2003, С.208

3. Гапоненко А.К., Маркеев А.Н., Нескородов Я.Б., Фадеев B.C. "Модификация и моделирование метаболических путей", III Съезд ВОГИС Москва 6-12 июня 2004. С.473

4. Гапоненко А.К., Фадеев B.C. "Использование эффективной системы баллистической трансформации для получения трансгенных растений мягкой пшеницы устойчивых к абиотическим стрессам. " Proceeding of the XVth International Plant Protection Congress, Beijing, China, May 11-16, 2004, P.512

5. Gaponenko A.K., Fadeev V.S. "Разработка системы генетической трансформации для создания растений мягкой пшеницы устойчивых к клопу вредная черепашка (Eurygaster integriceps Put)." Second International Conference on Sunn Pest, ICRDA, Aleppo, Syria 19-22 July,2004, P.37-38

6. Фадеев B.C., Блинкова O.B., Гапоненко А. К. "Оптимизация биологических и физических параметров биобаллистической генетической трансформации мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.), проводимой с использованием установки Particle Inflow GunГенетика, 2006, Т 42,№4 С, 507-518

1,25 печ. л.

Зак. 616.

Тир. 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фадеев, Виталий Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I Обзор литературы

1.1 Ведение культуры соматических клеток и регенерация мягкой пшеницы in vitro

1.1.1 Зависимость частоты индукции каллуса и регенерации растений пшеницы от типа экспланта

1.1.2 Зависимость частоты индукции каллуса и регенерации растений пшеницы от генотипа

1.1.3 Влияние состава среды на частоту индукции каллусогенеза и регенерации растений пшеницы

1.2 Прямой перенос генов в злаки - биобаллистическая генетическая трансформация мягкой пшеницы

1.2.1 Параметры баллистической трансформации мягкой пшеницы

1.2.2 Маркерные гены

1.2.3 Селективные гены и системы селекции.

1.2.4 Селективный ген bar. Механизм действия

1.2.5 Негативная селекция трансгенной ткани пшеницы in vitro

1.3 Генетика устойчивости растений к абиотическим стрессам

1.3.1 Механизм действия гена глутатион S-трансфераза (GST). Разнообразие генов GST

ГЛАВА II Материалы и методы

2.1 Растительный материал. Получение морфогенетической каллусной культуры соматических клеток и регенерация in 38 vitro растений мягкой пшеницы

2.2 Выделение плазмидной ДНК, работа с бактерией е. coli

2.3 Протокол баллистической трансформация мягкой пшеницы

2.4 Создание векторной конструкции pGSTBAR

ГЛАВА III Оптимизация ведения культуры соматических клеток мягкой пшеницы in vitro

3.1 Влияние генотипа на частоту индукции морфогенетического каллуса мягкой пшеницы

3.2 Влияние обработки зерновок низкой температурой на частоту индукции морфогенетического каллуса

3.3 Изучение влияния различных типов фитогормонов и их концентрации в среде на частоту регенерации растений 59 мягкой пшеницы in vitro

ГЛАВА IV Получение и анализ трансгенных растений мягкой пшеницы несущих гены bar и gst

4.1 Влияние биобаллистического воздействия на морфогенетический потенциал тканей мягкой пшеницы

4.2 Оптимизация параметров баллистической трансформации мягкой пшеницы

4.3 Мониторинг процесса трансформации путем исследования транзиентной и стабильной экспрессии гена gfp 4.4. Сравнительная оценка методов селекции трансгенных тканей пшеницы

4.5 Анализ наследования гена bar у трансгенных линий пшеницы Т

4.6 Определение устойчивости трансгенных растений Т1 поколения к хлоридно-натриевому засолению

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация параметров генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой пшеницы (Triticum Aestivum L.) и изучение трансгенных растений, несущих гены bar и gst"

Пшеница является главной составляющей диеты для большинства населения умеренной климатической зоны планеты. Ежегодный мировой урожай пшеницы колеблется в пределах 550 - 590 миллионов тон. Для России хлебные злаки (пшеница, рожь и ячмень) является стратегическим продуктом, поскольку около половины населения страны получают 80% белка и 70% углеводов исключительно из хлебных и крупяных продуктов. Наращивание производства высококачественного зерна - основа для развития пищевой и перерабатывающей промышленности. Подавляющее большинство сортов пшеницы создано традиционными методами селекции, на основе использования генетического разнообразия исходных видов. За последние 40 лет показана возможность использования генов диких видов Triticum (дикой двузернянки) и растений рода Triticeae (например, ржи -Secale secale и Aegilops ventricosa) методами хромосомной инженерии. Это увеличило размах изменчивости доступный для селекционеров. Развитие генно-инженерных технологий должно продвинуть этот процесс значительно дальше, вовлекая в селекцию единичные гены или группы генов из любых видов растений, животных, микроорганизмов, и ab initio синтезированных генов, которые могут быть, введены в геном пшеницы для придания новых желаемых свойств. На сегодняшний день успешно проходят полевые испытания сотен (413 в США и более 300 в остальных странах) генетически модифицированных растений (ГМР) пшеницы. Испытываются растения, в которые введены гены устойчивости к грибковым заболеваниям, с измененным составом крахмала и запасных белков.

Впервые трансформация злаков баллистическим способом была осуществлена 1988 году под руководством Сенфорд и Клейн [1]. На данном этапе процесс создания трансгенных растений мягкой пшеницы {Triticum aestivum L.) методом биобаллистической трансформации некоторыми авторами объявлен рутинным, однако эффективность трансформации пшеницы не превышает 1-5 % и показана для нескольких высокоотзывчивых генотипов [2-6]. С конца 90-х годов разрабатывается методика агробактериальной трансформации пшеницы, но эффективность данного метода пока очень низкая и не превышает 1-2 % [7, 8], что является следствием того, что пшеница не входит в разряд природных растений-хозяев агробактерий. Увеличение эффективности генетической трансформации пшеницы для практического применения может быть достигнуто:

1. повышением регенерационного потенциала in vitro у широко распространенных сортов путем модификации состава среды и условий получения и ведения культуры соматических клеток;

2. оптимизацией параметров генетической трансформации и селекцией трансгенных клеток и регенерантов.

Существует отрицательная корреляция ухудшения качества белка пшеницы и увеличения урожайности сортов, создаваемых традиционными методами селекции. В настоящее время проводятся работы по изменению питательных и хлебопекарных качеств пшеницы методами генетической инженерии [9]. Улучшения хлебопекарных качеств зерна можно достичь повышением удельной фракции высокомолекулярных глютелинов и изменением соотношения различных форм крахмала (амилоза -амилопектин) в зерне. Это может быть обеспечено изменением экспрессии собственных генов запасных белков пшеницы глиадинов и высокомолекулярных глютелинов путем использования методов антисенс технологий и регуляции экспрессии генов запасных белков методом интерференции РНК, и, возможно, введением в геном пшеницы генов, выделенных из растений других видов рода Triticum [10].

Для России пшеница является, как сказано выше, стратегически важной и основной зерновой культурой. Поэтому создание устойчивых к неблагоприятным условиям среды сортов представляется первостепенной научной и важнейшей экономической задачей.

К числу важнейших абиотических стрессов в Российской Федерации относятся засуха и засоление почв. Более 50 % сельскохозяйственных угодий, занятых посевами пшеницы, требуют усиленной мелиорации.

Среди биотических стрессов для злаков необходимо выделить клопа вредную черепашку (Eurygaster integriceps Put.), который снижает урожайность ячменя на 20-30 % и пшеницы на 40-70 %. Кроме того, при повреждении клопом-черепашкой 1-2% зерновок значительно ухудшаются хлебопекарные качества зерна, которое переводится из разряда продовольственного в фуражное.

Одним из наиболее эффективных, а зачастую и единственным способом повышения толерантности растений к стрессам является генетическая инженерия. Генетическая трансформация растений позволяет использовать широкий круг генов повышающих устойчивость, выделенных из разных видов растений и микроорганизмов, для создания трансгенных растений, которые приобретают заранее спланированные свойства устойчивости к стрессам.

Известно, что поддержание гомеостаза глутатиона является одним из механизмов, обеспечивающих устойчивость растений к различным абиотическим стрессам [11, 12]. Поэтому генно-инженерные манипуляции с метаболическим путем глутатиона представляются привлекательной целью для повышения устойчивости растений к стрессам. Антистрессовые действия фермента глутатион-8-трансферазы (GST) обусловлены детоксикацией гидроперекисей. Важна роль фермента GST в защите клеточных мембран от перекисного окисления липидов и, как следствие, от воздействия активных форм кислорода. Установлена активность изоформ фермента по деактивации различных гербицидов. Исследования показали, что GST является сигнальной молекулой и потенциальным регулятором ультрафиолет-зависимого апоптоза клетки. Ген gst был клонирован из Arabidopsis thaliana в группе профессора С. Сопори (Международный Центр Генетической Инженерии и Биотехнологии, Нью-Дели, Индия).

Цель настоящего исследования заключалась в повышении частоты регенерации in vitro и генетической трансформации районированных в РФ сортов мягкой пшеницы; получении выборки трансгенных растений, несущих гены bar, gst, и определении устойчивости полученных растений к гербициду широкого действия Баста и хлоридно-натриевому засолению. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи.

3. Оптимизировать параметры ведения культуры клеток и регенерации растений in vitro мягкой пшеницы сортов Лада, Эстер, Мис, Норис и Амир.

4. Оптимизировать параметры биобаллистической трансформации мягкой пшеницы сортов Лада, Эстер и Мис.

5. Провести сравнительный анализ эффективности трех методов негативной селекции (отложенной, градационной и регенерационной) трансгенных тканей пшеницы in vitro, для повышения частоты получения трансформантов.

6. Получить выборки растений трансгенной пшеницы, несущей гены bar, gfp и bar, gst и изучить характер наследования введенных трансгенов.

7. Выявить трансгенные растения, толерантные к натриево-хлоридному засолению.

Научная новизна. Все представленные в диссертации результаты являются новыми и оригинальными.

1. Впервые показан стимулирующий эффект кратковременного воздействия (48 ч.) пониженной температуры (+4° С) на частоту индукцию морфогенетического каллуса.

2. Впервые оптимизированы условия культивирования in vitro генотипов мягкой пшеницы Лада, Эстер, Мис, Амир, районированных в 4 зонах РФ, и регенерации растений in vitro.

3. Впервые оптимизированы параметры (давление, расстояние до ткани-мишени, объем использованного газа) биобаллистической трансформации мягкой пшеницы для широко возделываемых в четырех зонах РФ сортов Лада, Эстер и Мис.

4. Впервые в РФ получены выборки трансгенных растений мягкой пшеницы несущих гены bar и gst.

5. Проведен анализ наследования трансгенов в двух поколениях на примере сорта мягкой пшеницы Лада, Показано, что экспрессия gst может повышать уровень устойчивости растений пшеницы к хлоридно-натриевому засолению.

Практическая значимость Полученные в работе результаты имеют важное практическое значение:

- на основании полученных результатов показана возможность получение достаточного количества трансгенных растений, полученных от независимых трансгенных событий, для широко распространенных сортов мягкой пшеницы, с сочетанием двух генов, необходимых для участия в селекционном процессе.

- полученная выборка трансгенных растений мягкой пшеницы, полученных от независимых трансгенных событий сорта Лада, несущих ген gst, представляет интерес для изучения устойчивости к хлоридно-натриевому засолению.

Апробация работы Основные результаты работы докладывались на 2-ой научной конференции Московского общества генетиков и селекционеров

Актуальные проблемы современной генетики" (Москва февраль 2003); на конференции "Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений" (Краснодар 2003 г.); на III Съезде ВОГИС (Москва 6-12 июня 2004 г.); на международной конференции Second International Conference on Sunn Pest, ICRDA (Aleppo, Syria 19-22 July, 2004); на международном конгрессе XVth International Plant Protection Congress (Beijing, China, May 11-16,2004).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 1 статья в рецензируемом научном издании, 1 статья находится в печати.

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (130 наименований), изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 29 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Фадеев, Виталий Сергеевич

ВЫВОДЫ

1. Впервые показан стимулирующий эффект кратковременного воздействия (48 ч.) низкой температуры (4° С) на частоту индукции морфогенетического каллуса.

2. Определен оптимальный фитогормональный состав среды для индукции регенерации in vitro растений мягкой пшеницы сорта Лада (Triticum aestivum L.), позволяющий достигать регенерацию растений с частотой до 90%.

3. Оптимизированы параметры баллистической трансформации мягкой пшеницы {Triticum aestivum L.) для сортов Лада, Эстер и Мис, с использованием биобаллистической установки PIG. Давление гелия при выстреле - 6 атм., расстояние от источника частиц до ткани мишени (каллус) - 12 см.

4. Определен оптимальный срок проведения генетической трансформации, который соответствует 10-14 суткам культивирования, после инициации морфогенетического каллуса.

5. Показано, что при использовании регенерационной методики селекции трансгенной ткани мягкой пшеницы {Triticum aestivum L.) сорта Лада позволяет получать трансгенные растения мягкой пшеницы с эффективностью 5%.

6. Получена выборка трансгенных растений мягкой пшеницы сорта Лада, несущих гены gfp и bar (14 независимых трансгенных событий) и выборка из 17 трансгенных растений, полученных от независимых трансгенных событий несущих гены gst и bar.

7. Показана устойчивость к гербициду широкого спектра действия БАСТА в Т1 поколении полученных трансгенных растений с генами gst и bar.

8. Выявлена устойчивость к 200 шМ хлорида натрия у растений Т1 поколения, содержащих ген gst.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что кратковременная обработка (48) ч. низкой температурой +4° С увеличивают частоту индукции МК для исследуемых сортов мягкой пшеницы Норис и Лада. Достигнутая частота индукции МК составляет для сорта Лада 74.3±10.51. Для сорта Норис частота индукции МК составила 58.4±15.20, также полученная при 48 часовой обработкой низкой температурой. Показано что наиболее эффективно МК образует сорт Лада до 75 %, сорт Мис показал более низкую частоту образования 20 %МК. Сорта Эстер, Норис и Амир занимают промежуточное положение в способности образовании МК 40-60 %.

В результате сравнения десяти различных регенерационных сред подобрана оптимальная среда для регенерации фертильных растений используемых генотипов. Оптимизированная среда содержит цитокинины: кинетин и 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрациях 1 мг/л: и ауксин: нафтилуксусную кислоту (НУК) в концентрации 0,5 мг/л. Оптимизированная среда позволяет получать растения-регенеранты мягкой пшеницы сорта Лада с эффективностью до 90%.

Выявлено, что степень отрицательного влияния баллистической трансформации уменьшается с увеличением возраста эксплантата с момента инициации культуры тканей in vitro. Сорт Лада наиболее устойчив к баллистическому воздействию на ткань, максимальное уменьшение образования морфогенного каллуса показано для сорта Эстер, сорт Мис занимает промежуточное положение по степени восприимчивости к баллистическому воздействию. Определен оптимальный период для баллистической трансформации мягкой пшеницы: это 10-14 день с момента инициации культуры тканей пшеницы всех исследуемых сортов.

С помощью использования репортерной системы GUS впервые показано, что оптимальным сочетанием физических параметров биобаллистической трансформации мягкой пшеницы с использованием баллистической конструкции PIG являются расстояние от источника частиц до ткани мишени 12 см и давление гелия при выстреле 6 атм.

При использовании методики регенерационной системы селекции получена наибольшая частота получения трансгенных растений, которая составила 4.86%-5%. При использовании градационной и отложенной системы селекции получена меньшая эффективность трансформации. Наблюдаемый, большой разброс данных в генеральной совокупности, определил статистическую недостоверность отличия результатов для отложенной и градационной систем селекции трансгенных тканей мягкой пшеницы.

Проведена оценка наследования устойчивости к гербициду БАСТА в концентрации 1% трансгенных растений поколения Т1. С помощью метода ПЦР анализа показано наличие копии гена bar в полученных растениях, что доказывает истинность растений-трансформантов. Для большинства линий трансгенных растений пшеницы получено расщепление 3:1, что соответствует моногенному расщеплению и показывает наличие одной вставки или множественной вставки трансгена в один локус генома растения-реципиента.

В предварительных опытах показано, что наличие гетерологичного гена gst может повышать уровень толерантности трансгенных растений пшеницы к хлоридно-натриевому засолению. Ген gst, выделенный из Arabidopsis thaliana, кодирующий фермент глутатион-Б-трансферазу, может повышать устойчивость к хлоридно-натриевому засолению.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фадеев, Виталий Сергеевич, Москва

1. Sanford J.C., Klein Т.М., Wolf E.D., Allen N. // Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process. II Journal of Particulate Science and Technology 1987, 5 P.27-37

2. Weeks I.T., Anderson O.D., Blechl A.E. // Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). II Plant Physiol. 1993, 1102, P. 1077-1084

3. Chen W. P., Gu X., Liang G. H., Muthukrishnan S. // Introduction and constitutive exspression of a rice chitinase gene in bread wheat using biolistic bombardment and the bar gene as a selectable marker. II Theor. Appl. Genet. 1998, V.97, P.1296-1306

4. Uze M., Potricus I. // Single-stranded DNA lin genetic in trasformation of wheat (Triticum aestivum): transformation freqency and integration patten. //Theor. Appl. Genet., 1999, V.99, P.487-495

5. Jordan M.C. // Green fluorescent protein as a visual marker for wheat transformation. И Plant cell report, 2000, V.19, P. 1069-1075

6. Cheng M, Fry J.E., Pang S., Zhou H., Hironaka C.M., Cuncan D.R., Conner T.W., Wan Y. // Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. II Plant Physiol 1997, V.l 15, P.971-980

7. Пухальский B.A., Смирнов С.П., Коростылева T.B., Билинская Е.Н., Елисеева А.А. // Генетическая трансформация пшеницы Triticumaestivum L. с помощью Agrobacterium tumefaciens II Генетика. 1996. T.32. №11. С. 1596-1600.

8. Sharp P. A. URN A Interference II2001 Genes Dev 15: 485-490

9. Marrs K.A. // The functions and regulation of glutathione S-transferases in plants. II Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1996, V.47, P. 127-158

10. Wernicke W., Brettell R. // Somatic embryogenesis from Sorghum bicolor L. leaves. //Nature, 1980, V.287, 5778, P.138-139

11. Shimada T. // Plant regeneration from the callus induced from wheat embryo. //Japan. J. Genetic, 1978, V.53, P.371-374

12. Shimada Т., Yamada Y. // Wheat plants regeneration from embryo cell cultures. //Japan. J. Genetics, 1979, V.54, 5, P.379-385

13. Dudits D., Nemet G., Haydu Z. // Study of callus growth and organ formation in wheat (T. aestivum L.) tissue cultures. II Can.J.Bot., 1975, V.53, P.957-963

14. Bhojwani S.S., and Hayward C. // Some observation and comments on tissue culture of wheat. И Pflanzenphisiol., 1977, V.85, 5. P.341-347

15. Chin J.C., Scott K.J. // Studies on formation of roots and shoots in wheat callus cultures. //Ann. Bot. 1977, V.41,173, P.473^177

16. Nabors M.W., Neyser J.N., Dykes T.A., De Mott K.J. // Long duration, high frequency plant regeneration from cereal tissue culture. II Planta, 1983, V.157, 5, P.385-391

17. Sasakuma Т., Kaneko R. // In vitro Treatment of cyclohexanol of cultured tissues ofT. aestivum L. II Seiken Ziho, 1985, V. 33. P. 1192-1199

18. Ahuja P.S., Pental D., Cocking // Plant regeneration from leaf base callus and cell suspension of T. aestivum L. // Z. Pflanzenziichtg, 1982, V.89, P. 139-144

19. Morrish I.V., Vasil I.K., Vasil V.K. // Development morphogenesis and genetic manipulation in tissue and cell cultures of the graminea. II Advantage in genetics, 1987, V.24, P.43 M99

20. Vasil V.K., Vasil I.K. // Somatic embryogenesis and plant regeneration from tissue culture pf Pennisetum americanum and P. americanum x P.puprpureum hybrid. II Am. J. Bot., 1981, V.68, P.864-872

21. Magnusson I., Bernman C.H. // Anatomical observations on somatic embryogenesis from scutellar tissue of immature zygotic embryos of Triticum aestivum L. II Physiol. Plant, 1985, V.63, P.137-145

22. Ozias-Akins P., Vasil I.K. // Plant regeneration from cultured immature embryos and inflorescences of Triticum aestivum L. (wheat) evidence for somatic embryogenesis. II Protoplasma, 1982, V.l 10,2, P.95-105

23. Nabors M.W., Neyser J.N., Dykes T.A., De Mott K.J. // Long duration, high frequency plant regeneration from cereal tissue culture. II Planta, 1983, V.157, 5, P.385-391

24. Bapat S.A., Joshi C.P., Mascarenhas A.F. // Occurrence and frequency of precocious germination of somatic embryos is a genotype depend phenomenon in wheat. II Plant Cell Reports, 1988, V.7, P.538-541

25. Sears R.G., Deckard E.L. // Tissue culture variability in wheat: callus induction and plant regeneration. II Crop Sci., 1982, V.22, P.546-550

26. Maddock S.E., Landcarster V.A., Risiott R., Franklin J. // Plant regeneration fron culture immature embryos and inflorescences of 25 cultivar of wheat (T. aestivum L.). И Jour. Of Experimental Botany, 1983, V.34, 144, P.915-926

27. Lasar M.D., Collins G.B., Vian W.E. // Genetic and environmental effects on the groht and differentiation of wheat somatic cell cultures. II The Journal of Heredity, 1983, V.74, P.353-357

28. Yurkova G. N. Levenko B. A. Novogilov P. V. // Induction of plant regeneration in wheat tissue culture. II Biochem. Physiol. Pflanzen., 1981, V.176, P.236-243

29. Tanzarella O.A., Greco B. // Clonal propagation of Triticum durum Desf. from immature embryos and shoot base explants. II Euphytica, 1985, V.34, P.273-277

30. Mathias R.J., Boyd L.A. // Cefotaxim stimulation callus growth, embryogenesis and regeneration in hexaploid bread wheat (T. aestivum L. em thell). II Plant Science, 1986, V.46, P.217-223

31. Purnhauser L., Medgyesy P., Gzako M., Dix P.J., Marton L. // Stimulation of shoot regeneration in Triticum aestivum L. and Nicotiana plumbaginiboliaviv. Tissue culture using the ethylene inhibitor AgNOi II Plant cell Reports, 1987, V.6, P. 1-4

32. Carman J.G. // Improved somatic embryogenesis in wheat by particle simulation of the in-ovulo oxygen, growth-regulator and dessication environments. //Planta, 1988, V.l, P.417-424

33. Galia C. Yamada Y. // A novel method for increasing the frequency of somatic embriogenesis in wheat tissue culture by NaCl and KCl supplementation. // Plant Cell Reports, 1988, V.7, P.55-58

34. Murashige Т., Skoog F. // A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. II Physiol Plant 1962, V.l5, P.473^97

35. Linsmaier E. M. Skoog F. // Organic grow factors requirements of tobaco tissue culture. II Phisiol. Plant., 1965, V.18, P.100-127

36. Гапоненко A.K., Мунтян М.И., Маликова Н.И., Созинов А.А. // Регенерация растений пшеницы Triticum aestivum L in vitro. II Цитология и генетика, 1985, Т.19, 5, С.335-339

37. Eapen S., Rao P.S. // Plant regeneration from callus cultures of wheat. II Plant Cell Reports 1982, V.l, P.215-218

38. Гапоненко А. К., Маликова Н. И., Охрименко Г. Н., // Получение соматических линий у злаков (Triticum aestivum L и Hordeum vulgare L.). //Докл. АН СССР, 1985, Т.238, №6, С.1471-1475

39. Elena Е. В., Ginzo H.D. // Effect of auxin level on shoot formation with defferent embryo tissues from a cultivar and commercial hybrid of wheat (Triticum aestivum L.). II J. Plant Phisiol., 1988, V.132, P.600-603

40. Кулаева О. H. // Фитогормоны как регуляторы активности генетического аппарата и синтеза белка у растений. II В кн. "Новые направления в физиологии растений". М., Наука, 1985, С.62-84

41. Finer J.J., Vain P., Jones M.W., McMullen M.D. // Development of the particle inflow gun for DNA delivery to the plant cells. II Plant Cell Reports, 1992, V.ll, P.323-328

42. Takeuchi Y., Dotson M., Keen N.T. // Plant transformation: a simple particle bombardment device based on flowing helium. II Plant Mol Biol. 1992, Feb;18(4) P.835-839

43. Sautter C., Waldner H., Neuhaus-Url G., Galli A., Neuhaus G., Potrykus I. // Micro-targeting: High efficiency gene transfer using a novel approach for the acceleration of microprojectiles. II Bio/Technology, 1991, V.9, P. 1080— 1085

44. Christou P., McCabe D.E., Swain W.F. // Stable transformation of soybean callus by DNA-coated gold particles. I I Plant Physiology, 1988, V.87, P.671-674

45. Lonsdale, D.M., Lindup S., Moisan L.J., Harvey A.J. // Using firefly luciferase to identify the transition from transient to stable expression in bombarded wheat scutellar tissue. I I Physiologia Plantarum, 1998, V.102, P.447-453

46. Vasil V., Castillo A.M., Fromm M.E., Vasil I.K. // Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. II Biotechnology, 1992, V.10, P.667-674

47. Vain P., McMullen M.D., Finer J.J. // Osmotic treatment enhances particle bombardment-mediated transient and stable transformation of maize. II Plant Cell Rep, 1993, V.12, P.84-88

48. Becker D., Brettschneider R., Lorz H. // Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scutellar tissue. II Plant J., 1994, V.5, P.299-307

49. Altpeter F., Vasil V., Srivastava V., Stoger E., Vasil I.K. // Accelerated production of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) plants. И Plant Cell Rep., 1996, V.16, P.12-16

50. Rasco-Gaunt S., Rilye A., Barcelo P., Lazzeri P.A. // Analysis of particle bombardment parameters to optimise DNA deliveryinto wheat tissues. II Plant Cell Report, 1999, V.19, P. 118-127

51. Gaponenko A.K., Finer J., // Sunflower (Helianthus annuus L.) transformation system via Particle Bombardment. И In vitro, 1994, 30:61 (P -1016).

52. Гапоненко А.К. // Баллистический способ трансформации подсолнечника II Патент Российской Федерации на изобретение, №2193066 от 20 ноября 2002.

53. Chalfie М., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C., // Green fluorescent protein as a marker for gene expression.!I Science, 1994, V.263, P.802-805

54. Chiu W, Niwa Y, Zeng W, Hirano T, Kobayashi H, Sheen J // Engineered GFP as a vital reporter in plants. II Curr. Biol. 1996, V.3, P.325-330

55. Gerdes H., Kaether C. // Green fluorescenst protein: application in cell biology. IIFEBS Letters, 1996, V.389, P.44-47

56. Pang S.Z., DeBoer D.L., Wan Y., Ye G. // An improved green fluorescent protein gene as a vital marker in plants. II Plant cell report, 1996, V.15, P. 832-836

57. Jefferson A., Kavamagh A., Bevan W. // GUS fusion: /?-glucuronidase as a sensetive and versatile gene fusion marker in higher plants. II The EMBO Jornal, 1987, V.6, P.3901-3907

58. Wilmink A, Dons J // Selective agents and marker genes for use in transformation of monocotyledonous plants. II 1993 Plant Mol Biol Rep 11:165-185

59. Ortiz J, Reggiardo M, Ravizzini R, Altabe S, Cervigni G, Spitteler M, Morata M, Elias F, Vallejos R // Hygromycin resistance as an efficient selectable marker for wheat stable transformation. II 1996 Plant Cell Rep 15:877-881

60. Witrzens B, Brettell R, Murray F, McElroy D, Li Z, Dennis E // Comparison of three selectable marker genes for transformation of wheat by microprojectile bombardment. II 1998 Aust J Plant Physiol 25:39-44

61. Franz, J.E., M. К. Мао, and J.A. Sikorski. // Uptake, Transport and metabolism of Glyphosate in Plants. II 1997 in Glyphosate: A Unique Global Herbicide. ACS monograph 189. p. 143-181.

62. Nafzinger E.D., Widholm J.M., Steinrucken H.C., Kilmer J.L. // Selection andcharacterization of a carrot line tolerant to glyphosate. I I 1984. Plant Physiol. 76:571-574.

63. Series on Harmonization of Regulatory Oversight in Biotechnology No. 11 //CONSENSUS DOCUMENT ON GENERAL INFORMATION CONCERNING THE GENES AND THEIR ENZYMES THAT CONFER TOLERANCE TO PHOSPHINOTHRICIN HERBICIDE. II ENV/JM/MONO(99) 13

64. Locci R. // Streptomycetes and Related Genera. II in: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Williams and Wilkins, Baltimore, 1989, P.2451-2508

65. Cross T. // Other genera. II in: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. S.T., Williams, ed. Williams and Wilkins, Baltimore, 1989, P.2586-2615

66. Bertges W.J., Kinney D.A., Pieters E.P. // Glufosinate ammonium: review and update. //North Cent. Weed Sci. Proc. Soc., 1994, P.49-57

67. Wild A., Manderscheid R. // The effect of phosphinothricin on the assimilation of ammonia in plants. II Z. Naturforsch, 1984, V.39c, P.500-504

68. Wild A., Sauer H., Ruhle W. // The effect of phosphinothricin (glufosinate) on photosynthesis I inhibition of photosynthesis and accumulation of ammonia. HZ. Naturforsch, 1987, V.42c, P.263-269

69. Krieg, L.C., Walker M.A., Senaratna Т., McKersie B.D. // Growth, ammonia accumulation and glutamine synthetase activity in alfalfa (Medicago sativa L.) shoots and cells treated with phosphinothricin. I I Plant Cell Rep, 1990, V.9, P.80-83

70. Wild A., Wendler C. // Effect of glufosinate (phosphinothricin) on amino acid content, photorespiration, and photosynthesis. II Pestic. Sci., 1991, V.30, Р.422Ч24

71. Downs C.G., Christey M.C., Maddocks D., Seelye J.F., Stevenson D.G. // Hairy roots of Brassica napus: I. Applied glutamine overcomes the effect of phosphinothricin treatment. I I Plant Cell Rep., 1994, V.14, P.37^10

72. Sauer H., Wild A., Ruhle W. // The effect of phosphinothricin (glufosinate) on photosynthesis II. The causes of inhibition of photosynthesis. II Z. Naturforsch., 1987, V.42c, P.270-278

73. Bellinder, R.R., R.E. Lyons, S.E. Scheckler, and H.P. Wilson. // Cellular alterations resulting from foliar applications of HOE-39866. II Weed Sci., 1987, V.35, P.27-35

74. Ullrich W.R., Ullrich-Eberius C.I., Kocher H. // Uptake of glufosinate and concomitant membrane potential changes in Lemna gibba Gl. II Pestic. Biochem. Physiol., 1990, V.37, P.l-l 1

75. Steckel G.J., Hart S.E., Wax L.M. // Absorption and translocation of glufosinate on four weed species. // Weed Sci., 1997, V.45, P.378-381

76. Mersey B.G., Hall J.C., Anderson D.M., Swanton CJ. // Factors affecting the herbicidal activity of glufosinate ammonium: Absorption, translocation,and metabolism in barley and green foxtail II Pestic. Biochem. Physiol., 1990, V.37, P.90-98

77. Haas P., Muller F. // Behaviour of glufosinate-ammonium in weeds. II Proc. Brit.Crop Prot. Conf—Weeds, 1987, P.1075-1082

78. Ridley, S.M. McNally S.F. // Effects of phosphinothricin on the isozymes of glutamine synthetase isolated from plant species which exhibit varying degrees of susceptibility to the herbicide. II Plant Sci., 1985, V.39, P.31-36

79. Wanamarta G., Penner D. // Foliar absorption of herbicides. II Rev. Weed Sci., 1989, V.4, P.215-231

80. Droge W., Broer I., Puhler A. // Transgenic plants containing the phosphinothricin-N-acetyltransferase gene metabolize the herbicide Lphosphinothricin (glufosinate) differently from untransformed plants. II Planta, 1992, V.187, P.142-151

81. Thompson J., Rao Mowa N., Tizard R., Crameri R., Davies E. // Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. 11 The EMBO Jornal, 1987, V.6, P.2519-2523

82. Wohlleben W., Arnold W., Broer I., Hillermann D., Strauch E., Puhler A. // Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces TU494 and its expression in Nicotiana tabacum. II Gene, 1988, V.70, P.25-37

83. Wohlleben W., Alijah R., Dorendorf J., Hillerman D., Nussbaumer B. Pelzer S. // Identification and characterization of phosphinothricin-tripeptide biosynthetic genes in Streptomyces viridochromogenes. II Gene, 1992, V.115, P.127-132

84. Wehrmann A., Van Vliet A., Opsomer C., Botterman J., Schulz A. // The similarities of bar and pat gene products make them equally applicable for plant engineers. //Nat. Biotechnology, 1996, V.14, P.1274-1278

85. United States Department of Agriculture, 1995, Environmental Assessment and Determination of Non-regulated Status Petition Number 94-357-0 IP (for glufosinate resistant corn).

86. AgrEvo USA, 1994, Petition for a determination of non-regulated status for glufosinate resistant corn (submitted to United States Department of Agriculture, Petition No. 94-357-0IP).

87. Vasil V., Sherri M. I/Stably transformed callus lines from microprojectile bombardment of cell suspension cultures of wheat. II Biotechnology, 1991,V.19, P.348-359

88. Iser M., Fettig S., Scheyhing F., Viertel K. and Hess D. // Genotype-dependent stable genetic transformation in German spring wheat varieties selected for high regeneration potential. II 1999. J. Plant Physiol. 154: 508516.

89. Manderscheid R., Wild A. // Studies on the mechanism of inhibition by phosphinothricin of glutamine synthetase isolated from Triticum aestivum L. //J. Plant Physiol., 1986, V.123, P.135-142

90. Aono M., Kubo A., Saji H., Tanaka K., Kondo N. // Enhanced tolerance to photooxidative stress of transgenic Nicotiana tabacum with high chloroplastic glutathione reductase activity. II Plant and Cell Physiology, 1993, V.34, P.129-135

91. Foyer C.H., Lelandais M., Kunert K.J. // Photooxidative stress in plants. II Physiologia Plantarum, 1994, V.92, P.696-717

92. Foyer С. H. Rennenberg H // Sulfur Nutrition and Sulfur Assimilation in Higher Plant. II Bern Switzerland, 2000, P. 127-153

93. Ulmasov T, Ohmiya A, Hagen G, Guilfoyle T. // The soybean GH2/4 gene that encodes a glutathione S-transferase has a promoter that is activated by a wide range of chemical agents. II Plant Physiol., 1995, V.108, P.919-927

94. Timmerman K.P. // Molecular characterization of corn glutathione S-transferase isozymes involved in herbicide detoxication. II Plant Physiol., 1989, V.77, P.465-471

95. Kampranis S.C., Damianova R., Atallah M., Toby G., Kondi G., Tsichlis P.N., Makris A.M. // A novel plant glutathione S-transferase/peroxidase suppresses Bax lethality in yeast. II J. Biol. Chem., 2000, V.275, P.29207-29216

96. Sari-Gorla M., Ferrario S., Rossini L., Frova C., Villa M. // Developmental expression of glutathione S-transferase in maize and its possible connection with herbicide tolerance. II Euphytica, 1993, V.67, P.221-230

97. Dixon D., Cole D.J., Edwards R. // Characterization of multiple glutathione transferases containing the GST I submit with activities toward herbicide substrates in maize (Zea mays L.). I I Pestic. Sci., 1997, V.50, P.72-82

98. Marrs K.A., Walbot V. // Expression and RNA splicing of the maize glutathione S-transferase bronze2 gene is regulated by cadmium and other stresses. I I Plant Physiol., 1997, V.l 13, P.93-102

99. Mauch F., Dudler R. // Differential induction of distinct glutathione S-transferases of wheat by xenobiotics and by pathogen attack. II Plant Physiol., 1993, V.l 02, P.l 193-1201

100. Richards H., Rudas V., Sun H., Conger B. // Construction of a GFP-BAR plasmid and its use for switchgrass transformation. II Plant Cell Report, 2001, V.20,P.48-54

101. Hess D., Dressier K., Nimmrichter R. // Transformation experiments by pipetting Agrobacterium into the spikelets of wheat (Triticum aestivum L.). II Plant Sci., 1990, V.72, P.233-244

102. Ou G., Wang W.C., Nguyen H.T. // Inheritance of somatic embryogenesis and organ regeneration from immature embryo cultures of winter wheat. II Theor Appl Genet, 1989, V.78, P.137-142

103. Mohmand A.S., Nabors M.W. // Comparison of two methods for callus culture and plant regeneration in wheat (Triticum aestivum L.). II Plant Cell Tissue Organ Cult., 1991, V.26, P.187-189

104. Mathias R. J., Fukui K. Law C.N. // Cytoplasmic effect on the tissue culture response of wheat (T. aestivum L.) callus. II Theor. Appl. Genet., 1986, V.72, P. 70-75

105. Immonen A.T. // Influence of media and growth regulators on somatic embryogenesis and plant regeneration of primary triticales. II Plant Cell Tissue Organ Cult., 1996, V.44, P.45-52

106. Kiarostami К. H., Ebrahimzadeh H. // Effect of cold treatment on precocious germination in somatic embryogenesis of wheat (Triticum aestivum L.). II New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 2001, V.29, P.209-212

107. Бабаева С. А., Петрова Т. Ф., Гапоненко А. К. // Цитогенетика культивируемых in vitro соматических клеток и растений регенерантов (Triticum aestivum L.) и (Triticum durum Desf). II Генетика, 1995, №3, C.61-68

108. Гапоненко А.К., Мунтян М.А.,Маликова Н.И., Созинов А.А., // Регенерация растений различных генотипов пшеницы Triticum aestivum L. in vitro. //Доклады АН СССР, 1984, т. 278 № 5, стр. 1231-1235.

109. Zhang P., Puonti-Kaerlas J. // PIG-mediated cassava transformation using positive and negative selection. II Plant Cell Reports, 2000, V.19, P.939-945

110. Jakson S.A., Zhang P., Chen W.P., Phillips R.L., Fribe В., Muthukrishan S., Gill. B.S. // High-resolution structural analysis of biolistic trasgene integration into genome of wheat. II Theor. App.Genet., 2001, V.103, P.56-62

111. Milligan A.S., Daly A., Parry M.A.J., Lazzery P.A., Jepson I. // The expression of a maise glutathione S-transferase gene in transgenic wheat confers herbicide tolerance, both in planta and in vitro. II Molecular Breeding, 2001, V.7, P.301-315

112. Филиппов M.B., Мирошниченко Д.Н., Славохотова A.A., Долгов С.В. // Разработка системы трансформации и получение форм пшеницы (Triticum aestivum L.) устойчивых к гербициду. // Достижение науки и техники, 2004 V.1,C.10-12

113. Miroshnichenko D., Filippov M., Dolgov S. // Genetic transformation of Russian wheat varieties for the biotic and abiotic stress resistance. II On line publications, 2005.

114. В заключение автор считает своим приятным долгом выразить глубокую благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук А.К. Гапоненко, а также своим коллегам по работе А.Н Маркееву, Я.В. Мишуткиной и Я.Б. Нескородову.