Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЛИНИЙ БЕЛОКОЧАННОЙ КАПУСТЫ С НОВЫМИ АГРОТЕХНИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЛИНИЙ БЕЛОКОЧАННОЙ КАПУСТЫ С НОВЫМИ АГРОТЕХНИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ"

На правах рукописи

ГРИБОВА Татьяна Николаевна

СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЛИНИЙ БЕЛОКОЧАННОЙ КАПУСТЫ С НОВЫМИ АГРОТЕХНИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ

Специальность 03.00.23 - биотехнология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2006

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии Центра «Биоинженерия» РАН Селекционной станции им. Н Н Тимофеева РГАУ-МСХА им К А Тимирязева

Научный руководитель.

Официальные оппоненты

Ведущая организация

Доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН Скрябин Константин Георгиевич Кандидат биологических наук Камионская Анастасия Михайловна

Доктор биологических наук Аграновский Алексей Анатольевич

Кандидат биологических наук Ралдугина Галина Николаевна

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Защита состоится » шои~г- 2006 г в /5 часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 в РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева Адрес 127550, Москва, Тимирязевская ул, 49 Ученый совет РГАУ - МСХА имени К А Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в Іг Б РГАУ-МСХА

имени К А Тимирязева

Автореферат разослан « /Я» иии*- 2006 г

Ученый секретарь диссертационного советг кандидат биологические ,

Г И Карлов

Актуальность проблемы

Капусту белокочанную (Brassica oleracea var. capitata) выращивают в России повсеместно, практически во всех климатических зонах. Высокая продуктивность при известной простоте возделывания позволяет капусте белокочанной стабильно занимать третье место после злаковых культур и картофеля в отечественном сельскохозяйственном производстве [www.mosreg.ru/11820, 2006]. По содержанию в своем составе витамина С капуста белокочанная занимает одно из первых мест (до 45 мг\100 г), превосходя по этому показателю, например, лимоны (40 мг\100 г), и считается незаменимым его источником в зимнее время на большей части территории Российской Федерации.

В связи с этим, получение стабильного урожая капусты белокочанной является одной из важнейших задач отечественного растениеводства. Решение этой проблемы подразумевает как увеличение продуктивности культивируемых гибридов капусты, так и повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды [Ranjekar Р. et al., 2003].

Селекция белокочанной капусты в последние годы вышла на качественно новый уровень благодаря созданию гибридов Fl, которые оказались устойчивыми, высокоурожайными и соответствующими всем стандартам современного промышленного овощеводства [Монахос Г.Ф., 2003].

Сегодня для создания сортов и гибридов белокочанной капусты с новыми направленно измененными агротехническими свойствами в сочетании с методами традиционной селекции перспективным представляется использование методов генетической инженерии. Комбинация традиционных способов селекции и методов трансгенеза позволяет эффективно совместить полезные признаки, кодируемые вносимым геном, с набором выгодных сортовых характеристик, полученных благодаря многолетнему труду селекционеров.

Промышленное земледелие предполагает интенсивное использование гербицидов для борьбы с сорняками. Многие годы для борьбы с сорняками в период вегетации использовали гербицид «Семерон». В настоящее же время, в списке разрешенных к использованию препаратов, гербициды для обработки вегетирующих растений отсутствуют [Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в 2005 году].

Поэтому разработка схемы создания гибридов капусты, включающей трансгенную компоненту и получение на ее основе устойчивых к гербицидам растений, представляется весьма актуальной задачей. Таким образом, создание трансгенных гербицидоустойчивых гибридов Fi позволит полностью механизировать процесс выращивания этой культуры.

Цели и задачи исследования

- создать трансгенные фертильные аналоги родительских форм перспективных гибридов белокочанной капусты, несущие ген фосфинотрицин-ацетилтрансферазы {bar), г><у»г™»пипа1рщма y^-mimiin^ i» . i мцпшшi.uü*

на основе фосфинотрицина; j " . „„„.

4 - 1 имени К.А. Тимирязева

А - имени К.А. 1 ИМИрнэсви

Á~?)f>£/i/% ЦНБ имени Н-И. Железном

<4 ООЧУЗ \ ф0НД научный литературы

- разработать схему реакционного процесса с участием трансгенной составляющей дчя получения гибридов капусты белокочанной,

- разработать эффективные протокоты регенерации и трансформации для четырех чиний капусты бетокочанной отечественной селекции Гэс 2, Мег- 2, Зму 7, Дрв 2,

- получить трансгенные растения четырех линий капусты бетокочанной, экспрессируюших ген устойчивости к гербициду фосфинотрицину bar,

- провести молекулярно - биологический анализ полученных трансгенных тиний капусты (ПЦР-анализ, дот б пот гибридизация, опредечение кочичества копий Т-ДНК инсерций методом AL-PCR),

- провести лабораторные и ограниченные почевые испытания на проявление признака в поколении Т и проанализировать полученное расще-птение

Научная новизна

Впервые разработана схема сечекционного процесса с участием трансгенной составляющей для почучения гибридов капусты белокочанной На основании схемы определена точка причожения трансгенной технологии в традиционном сечекционном процессе, то есть, выбран компонент для генетической модификации

С использованием метода агробактериальной трансформации впервые по-тучены трансгенные фертильные аналоги стерильных родитечьскик форм четырех чиний капусты белокочанной

Впервые для молекулярной характеристики полученных трансгенных растений капусты бетокочанной применен метод почимеразной цепной реакции с пришитыми адаптерами (Adaptor Ligation-PCR)

Практическая значимость полученных резучьтатов

Разработанная схема сечекционного процесса может представлять важное практическое значение дтя РФ, поскольку создание трансгенных гибридов капусты бетокочанной, устойчивых к гербицидам, позволит снизить затраты ручного труда в процессе выращивания

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены

- как составная часть отчета по Государственному контракту Xй 43 050 11 1537 от «05» февраля 2002 г по теме «Изучение генетических основ получения трансгенных растений с заданными свойствами»

на 7-й Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003)

- на 2-й конференции общества генетиков и сечекционеров «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003)

на II Московском международном конгрессе «Биотехнология Состояние и перспективы развития» (Москва, 2003)

- на VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Москва, 2005)

- на 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005)

- на III Московском международном конгрессе. «Биотехнология. Состояние и перспективы развития» (Москва, 2005).

Публикации

По результатам исследования опубликовано шесть тезисов и две статьи, подана одна заявка на изобретение, в которых отражены основные положения диссертации.

Структура и объем работы

Работа изложена на /^¿страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, главы результаты и обсуждения и выводов; содержит таблиц, ¿О рисунков и библиографический список из /ЗОнаименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования

Материалом для работы служили растения четырех линий капусты, фер-тильные аналоги стерильных родительских линий с цитоплазматической мужской стерильностью: Зму 7, Гэс 2, Мег-2 (среднепоздние) и Дрв 2 (поздняя). В качестве эксплантов использовали гипокотили и семядольные листья 7-8 дневных проростков, выращенных в культуре in vitro. Для модификации растений капусты использовали метод агробактериальной трансформации [Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р./Москва «Мир». 1991 - 408 стр.].

Бактериальные штаммы и плазмиды

В работе использовали агробактериальный штамм GV3101, содержащий вектор рВаг, полученный удалением из исходной плазмиды pBIBar [Падегимас Л., Шульга O.A., Скрябин К.Г. //М)л.биол. т. 27. с. 947-951. 1993; Грибова Т.Н., Камионская А.М., Скрябин К.Г. // Биотехнология. Т.6, с. 12-19, 2005] кассеты экспрессии гена nptll. Плазмида рВаг содержит кассету экспрессии bar гена, под контролем 35S промотора и NOS терминатора. Экспрессия гена bar, кодирующего фермент фосфинотрицинацетилтрансферазу, обуславливает устойчивость к гербициду L-фосфинотрицину.

Трансформация и регенерация

Экспланты получали из проростков стерильных растений, выращенных в культуре in vitro.

Первичную селекцию регенерантов проводили in vitro на питательных средах с различной концентрацией селективного агента фосфинотрицина.

Алаптацию трансформантов к почвенным условиям проводили на гидропонной установке «Минивит-2»

Все полученные резупьтаты экспериментов были обработаны t. помощью методов математической статистики (дисперсионный анализ и метод [Доспехов Б А / М Агропромиздат 1985 - 351 с ил ]

Молекулярный анализ

Мол екучярно-генетический анализ трансформантов проводили при помощи ПЦР анализа со специфичными к трансгенной вставке праймерами с использование дот-блот гибридизации и AL PCR (adaptor ligation PCR)

ПЦР-анализ на наличие гена bar проводили с использованием специально подобранных и синтезированых праймеров Амплификацию проводили на ам-тификаторе «Терпик» («ДНК-технология», Москва)

В качестве метки при дот-блот гибридизации использовали зонды, меченые biotm-l 1-dUTP («Синтол», Москва), полученные методом ПЦР Детекпию проводили помощью щеточной фосфатазы, ковалентно связанной to стрепта-видином

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конструирование вектора рВаг для трансформации капусты белокочанной

Задачей первого этапа работы было удаление гена устойчивости к канами-цину nptll, находящегося под промотором nosP и терминатора nosT из вектора рВТВаг

1 2 3 4 5 6

Рис. 1. Рестрикционный анализ дериватов рВ1Ваг (негатив) (а) и карта вектора рВаг (6).

Дорожки

1 - продукт рестрикции плазмиды рВ/Ваг 2-7- продукты рестрикции дериватов рВ1Ваг 8 - маркер размера (л. НшаШ)

— J —

Согласно данным рестрикционного анализа (рис.1 а), полученные производные плазмиды pBIBar (дорожки 2-7 электрофореграммы) расщеплялись эн-донуклеазой рестриктции PstI на два фрагмента размером 6555 и 4412 п.н., что соответствует теоретически рассчитанному искомому размеру новой плазмиды, в то время как, исходный вектор pBIBar (дорожка 1) расщеплялся на три фрагмента размером 6555,4923 и 1947 п.н.

Карта полученной плазмиды рВаг размером 10967 п.н. представлена на рис. 1 б.

2. Разработка схемы селекционного процесса с участием трансгенной составляющей

Для решения поставленной цели, нам необходимо было определить, какую компоненту будущего промышленного гибрида необходимо трансформировать чужеродным геном.

Учитывая возможный риск распространения трансгенной пыльцы (горизонтальный перенос) на близкородственные виды, связанного с перекрестным опылением, мы определили, что конечной трансгенной родительской формой в селекционном процессе должна быть форма с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС). Однако с точки зрения селекционного процесса линию с ЦМС нельзя использовать в качестве исходной для трансформации, так как в таком случае невозможно получить семенное потомство от самоопыления и, следовательно, растение, гомозиготное по трансгену. Вместе с тем, с точки зрения классической генетики, проявление чужеродного гена у трансгенных растений рассматривается как доминантная мутация, а генотип растения - первичного трансформанта - с единичной вставкой трансгена определяется как геми-зигота.

Исходя из вышеизложенного, в качестве исходных для трансформации нами были выбраны линии, каждая из которых являлась фертильным аналогом стерильной родительской формы, используемой в селекционном процессе при создании перспективных, высокоурожайных российских гибридов.

Для использования в промышленных посадках гибридов F1 капусты белокочанной, созданных на основе полученных трансгенных растений, мы разработали схему селекционного процесса для получения трансгенных родительских форм с ЦМС будущего гибрида F1, гомозиготных по гену bar (рис. 2).

3. Изучение регенерационной способности различных типов эксплан-

тов.

Дтя анализа способности к регенерации различных частей растения использовали два типа эксплантов: семядольные листья и гипокотили.

В результате проведенных экспериментов было показано, что в качестве экспланта необходимо использовать гипокотили, т.к. при использовании семядольных листьев в качестве экспланта формирование морфогенного каллуса практически отсутствовало.

При использовании гипокотилей наблюдалось формирование чорфогенно-го калт>са и регенерация

Фертильный аналог стерильной линии, Т0

/ \

самоопылений'' \ скрещивание с ЦМС

„ - х г X Х^ормой и -Х)1* . і і

/ ч

отбор на проявление признака анализ аллель ного состояния трансгена по потомству, насыщающие скрещивания

I !

1 - I , ї п» ІІ I ' 1 ІИ! »

¡иг Hit ■■ * Отцовская

* ' і '» « • і X форма

>Г I 'I и < " Линия 2

і

размножение а теплице

размножение е поле

Поддержание родительских , ,

форм

Рис. 2. Схема селекционного процесса трансгенных растений для получения промышленных гибридов с ЦМС, устойчивых к гербицидам на основе фосфинотрицина

Ч 1 Изучение влияния фитогормонов на регенерационную способность чиний капусты белокочанной

С целью изучения влияния состава питательной срелы на образование каллуса и постедующее формирование регенерантов нами была разработана схема, состоящая 12 комбинаций питательных сред (табл 1) с различным сочетанием цитокишшов (БАЛ, кинетин), которая в дальнейшем была испытана для каждой изученной тинии Рабочий диапазон варьирования концентраций быт выбран на основании анализа литературных данных

Для оценки влияния комбинаций фитогормонов на образование калтуса и регенерацию исследовали следующие параметры образование морфогенного или неморфогенного каллуса, скорость формирования каллуса, возможность соматического эмбриогенеза, эффективность регенерации, % 3 11 Линии Гэс 2 и Зму 7

Наиболее результативными оказался вариант с концентрацией 6-БАП -2 мг/л и кинетина - 1 мг/л Средняя эффективность регенерации составила 86,70/о для тинии Гэс 2 и 81,1% для линии Зму 7 Таким образом, 11 вариант опыта, отражающий совместное действие невысоких концентраций кинетина и БАЛ был признан оптимальным дая линий Гэс 2 и Зму 7

Табл. 1. Варианты опыта (1-12) с различными сочетаниями фитогормонов для регенерации линий Гэс 2, Зму 7, Дрв 2и Мег-2

б-БАП, мг/л

Кинетин, мг/л 0 1,0 (0,5*) 2,0 (1,0*) 5,0 (2,0')

0 1 2 3 4

0,5 5 6 7 8

1,0 9 10 11 12

" - Концентрация 6-БАП для линии Дрв 2.

3.1.2. Линия Дрв 2

Проведенный статистический анализ различных вариантов концентраций фитогормонов в питательной среде по выбранным нами параметрам позволил предположить, что для эффективной регенерации линии Дрв 2 решающим фактором является тип применяемого цитокинина, в данном случае БАП, а его концентрация не имеет значения. Наиболее результативными оказались варианты с концентрацией БАП 0,5, 1 и 2 мг/л - 2, 3 и 4. Средняя эффективность регенерации составила 74,4%, 61,1% и 47,8%, соответственно.

Основываясь на эффективности регенерации, фенотипических характеристиках (форма, цвет листьев, габитус) и способности к укоренению полученных регенерантов, 2 вариант был признан оптимальным для линии Дрв 2.

3.1.3. Линия Мег-2

Для подбора оптимальной концентрации фитогормонов в среде по регенерации линии Мег-2 было проведено две серии опытов, поскольку при использовании стандартной схемы оптимизации, состоящей из 12 вариантов питательных сред, не удалось достичь достаточно высокого уровня регенерации, необходимого для проведения трансформации. После добавлен™ в питательные среды борной кислоты в концентрации 150 мг\л по предложенной схеме были проведены опыты по подбору оптимального сочетания фитогормонов, в которых оптимальным был признан 11 вариант.

3.2. Определение оптимальной концентрации селективного агента

В нашей работе для трансформации мы использовали генетическую конструкцию, содержащую селективный ген устойчивости к гербициду фосфинотри-цину (глюфосинат аммония).

Для определения эффективности гербицида фосфинотрицина как селективного агента в зависимости от генотипа, было проведено тестирование регенерантов каждой исходной линии на его действие. В результате были получены данные, при которых оптимальной концентрацией фосфинотрицина в питательной среде при отборе регенерантов для всех четырех линий была признана концентрация 5 мг/л.

Для выделения трансгенных растений в поколениях из большой выборки полученных семян, необходимо было определить предельную концентрацию гербицида в питательной среде для отбраковки нетрансгенных проростков.

— і —

Анализ данных по подбору концентрации селективного агента показал, что отбор грансгенных растений из семян при 100% гибели контрольных (нетранс-генных) растений необходимо проводить при концентрации фосфинотрипина 10 мг'л

4. Первичный молекл тярный анализ трансгенных растений капусты белокочанной

4 1 Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи ГГЦР анализа

В ходе проведения первых экспериментов по ПЦР-анализу по пученных ре-генерантов было отмечено наличие неспецифических фрагментов и стабая амплификация гена bar Ингибирование прохождения ПЦР происходите даже на плазмидной ДНК при добавлении раствора геномной ДНК не трансгенной катеты, что, возможно, связано с наличием ингибиторов неизвестной природы, выделяющихся вместе с ДНК капусты Поэтому, нами была проведена оптимизация параметров ПЦР реакции опробованы различные добавки (формамид пицерин, диметилсульфоксид, бетаин), повышающие специфичность реакции и использовано несколько вариантов праймеров

В результате проведенной работы были подобраны условия амптификации гена bar с наиболее подходящей парой праймеров bar 1-bar 2, что позволило использовать данный метод для анализа трансформантов капусты белокочанной

шШ !Ш ЗЯБ

: *" ■ •

2 ;-ї 4 5 6 7 ЛИК • 8 P.S.V4 ШО М

Рис. 3 Электрофоретический анализ продуктов ПЦР в 1% агарозном геле.

- слева направо.

- 1, 3, 4, 5, 6, 8 - ПЦР на препаратах ДНК из растений, не несущих ген bar, линия

Гэс 2,

-2,7- ПЦР на препаратах ДНК из растений, несущих ген bar, линия Гэс 2; -9- контроль; продукт ПЦР на плазмидной ДНК pBAR; -10- ПЦР в отсутствии ДНК матрицы,

-11- маркер молекулярной массы (DNA Ladder 1000 bp, Fermentas)

— «—

Таким образом, ПЦР анализ трансформантов, прошедших первичный отбор на среде с фосфинотрицином на наличие гена bar проводился по оптимизированной методике

В результате было отобрано 34 растения (иге) в которых амплифициро-вапся фрагмент ДНК соответствующего размера Пример электрофоретическо-го анализа продуктов ПЦР показан на рис 3

4 2 Выявление наличия гена bar в геноме растений капусты белокочанной при помощи дот-бтот гибридизации

Для уточнения резучьтатов ПЦР и гарантированного утверждения о наличии гена bar в отобранных растениях, мы дополнительно использовали метод дот-бтот гибридизации

Наши предположения относительно необходимости проверки полученных ранее результатов ПЦР анализа трансформантов подтвердились Так, например, для образцов V» 1,2,6 линии Мег-2, № 10, 25 линии Зму 7 и jV- 17, 26, 27, 28 1инии Гэс 2, отобранных по результатам ПЦР анализа как трансгенных, трансгенная природа методом дот - блот гибридизации не подтвердилась (рис 4)

О О

t 2 3 4 5 < 7 >

' . ® © О

9 10 11 12 13 14 IS к

W IS i 19

№ 'Л

Змкг 1 5 1 » 0 5 « »

3 - 5, 7 Я 11 -16,18,19 - образцы, в которых ген bar присутствует в геноме растения,

1 -2, 6,17 образцы, в которых ген bar не присутствует в геноме растения, 3 мкг - 0,5 - разведение ДНК трансгенного растения картофеля с геном bar, «-» - образец ДНК не трансформированного растения капусты; «+»- образец ДНК плазмиды рВаг

^

го it гг г) u zs zs 27

28 29 9Q 31

20-24- образцы, в которых ген bar присутствует в геноме растения, 25 -28 - образцы, в которых ген bar не присутствует в геноме растения,

29 - образец ДНК не трансформированного растения капусты,

30 - образец ДНК плазмиды рВаг,

31- образец ДНК трансгенного растения картофеля с геном bar,

Рис. 4 Пример анализа растений - регенерантов методом дот-блот гибридизации.

В результате проведения серии опытов по трансформации было получено 336 регенерантов, из которых после первичного молекулярного анализа, было отобрано 26 трансгенных растений четырех линий капусты белокочанной (табл. 2), таким образом, эффективность трансформации составила в среднем по всем четырем линиям 7,65 %.

Табл. 2. Результаты опытов по трансформации четырех линий капусты белокочанной.

Линия Количество, шт. Эффективность, %

эксплантов регенерантов трансформантов регенерации * трансформации **

Гэс 2 113 98 7 86,7 7,1

Мег-2 114 72 4 63,2 5,5

Дрв2 110 82 9 74,7 10,9

Зму 7 103 84 6 81,5 7,1

Итого 440 336 26 -

* - процент регенерантов к общему количеству эксплантов;

** - процент полученных трансгенных растений от количества регенерантов.

5. Определение количества копий трансгенной вставки методом AL-PCR.

5.1. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДНК с 5' конца ("правая граница Т-ДНЮ.

Для молекулярно генетической характеристики одного из полученных трансгенных растений капусты линии Мег-2 № 3117, отобранного по результатам первичного молекулярного анализа, нормально развитого, хорошо адаптировавшегося к условиям in vivo и включенного в схему селекционного процесса, мы использовали метод AL-PCR (adaptor ligation PCR). Метод включает в себя следующие этапы: рестрикцию геномной ДНК трансгенного растения, ли-гирование геномной ДНК с искусственно синтезированными адаптерами и два раунда ПЦР.

Дня проведения рестрикции мы использовали рестриктазы, формирующие в месте разрыва «тупые концы»: EcoR V, Dra III, Hpa I, Zrm I и Ssp I. Рестрик-ционную смесь лигировали с адаптером, затем, для увеличения количества фрагментов, содержащих Т-ДНК и геномную ДНК провели две последовательных ПЦР со специфическими праймерами на адаптер (АР) и, соответственно, правую границу Т-ДНК (RB, RB1).

В результате проведения второго раунда ПЦР были получены единичные фрагменты ДНК длиной около 160 н.п. в случае с рестриктазой Hpa I, около 180 н.п. в случае с рестриктазой EcoRV и около 900 н.п. в случае с рестриктазой Dralll (рис. 5).

Поскольку, вероятность образования фрагментов одинакового размера при перенесении (встраивании) более одной копии Т-ДНК крайне мала, следовательно, по количеству фрагментов, амплифицированных при проведении специфических ПЦР, можно определить копийность трансгенной вставки. Таким

образом, полученные нами резутьтаты анализа геномной ДНК анализируемого растения ,Ч°3117 методом АЬ-РСИ позволяют сделать вывод о наличии единичной копии Т-ДНК в геноме

1 2 3 4 5 М

Рис. 5 Электрофоретический анализ второй ПЦР на ДНК, обработанной рестриктазами EcoR V, Dra III, Нра I, Zrm I и Ssp I с праймерами API и RB2.

1 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная ресгриктазой Нра I,

2 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная ресгриктазой Ssp I,

3 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработённая ресгриктазой EcoR V,

4 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная ресгриктазой Dra III,

5 геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная ресгриктазой Zrm I, М - маркер размера 1000 н п

Посте секвенирования фрагментов ДНК размером около 160 н п (рестрик-таза EcoR V) око то 150 н п (Нра I) и 900 н п (Zrm III) было показано, что по-стедовательность фрагментов 150 н п и 160 н п включала в себя часть после-доватетьности 35S промотора, правую границу Т-ДНК (RB), постедоватечь-ность адаптера и заключенную между ними постедоватетьность (рис 6), которую мы проанализировали и не обнаружили гомологии с ДНК трансформирующего вектора рВаг

nptrtwep RB2

Рис. б. Секвенированная последовательность фрагментов, полученных при рестрикции эндонуклеазами EcoR V и Нра I.

Секвенированная посчедоватетьность фрагмента 900 н п содержала только неизвестную пос тедовательность ДНК, фланкированную с обоих концов

адаптерами. Сравнительный анализ, проведенный в банке последовательностей NCBI Blast данной нуклеотидной последовательности, полученной при обработке геномной ДНК капусты рестриктазой Dralll, выявил высокую степень гомологии с геномной ДНК Brassica napus var. napus и Brassica rapa var. pe-kinensis. Таким образом, мы сделали предположение, что в результате проделанной работы в данном случае мы случайным образом выделили и секвениро-вали фрагмент геномной ДНК капусты белокочанной.

5.2. Амплификация геномной ДНК, фланкирующей Т-ДНК с 3' конца (левая граница Т-ДНК )

Для анализа левой границы Т-ДНК была использована та же последовательность операций, что и для правой границы. Однако никаких специфических фрагментов при проведении ПНР на ДНК, обработанной всеми пятью используемыми рестриктазами, получено не было. Такие результаты позволили нам предположить, что отсутствие продуктов амплификации со специфическими праймерами на адаптер (АР) и область Т-ДНК, расположенную близко к левой границе (LB1, LB2), обусловлено делецией части Т-ДНК на 3* конце.

Предположив наличие делеции в районе 3' конца Т-ДНК, с помощью программы OLIGO, мы сконструировали специфические праймеры LB3 и LB4 на последовательность, близкую к 3* концу NOS терминатора. Используя вновь сконструированные праймеры LB3 и LB4, мы проанализировали рестрикцион-ные смеси по каждой используемой рестриктазе. После проведения ПЦР был получен единичный фрагмент в случае с рестриктазой Zrm I, размером около 300 н.п. Нуклеотидные последовательности праймеров LB3 и LB4 комплементарны последовательности, следующей в Т-ДНК после стоп кодона NOS-терминатора, следовательно, факт отжига и прохождения реакции свидетельствует о наличие целой последовательности регуляторного элемента (NOS-терминатора).

Результаты проведения двух последовательных ПЦР с праймерами LB4 и LB5 на ДНК, обработанной рестриктазами Zrm I, EcoR V, Нра I, Dra III, и Ssp I представлены на рисунке 7.

Проведенный анализ левой границы Т-ДНК, позволяет нам сделать вывод о наличие одной копии вставки в анализируемом геноме.

Поскольку, результаты определения копийности по правой и левой границе совпали, можно уверенно утверждать о наличии единичной копии Т-ДНК в анализируемом растении.

Для дальнейшего анализа был отобран клон, содержащий фрагмент размером 300 н.п., полученный при обработке геномной ДНК рестриктазой Zrm I. Сравнительный анализ данной секвенированной последовательности в банке последовательностей NCBI Blast показал высокую гомологию с последовательностями Brassica rapa subsp. pekinensis, Arabidopsis thaliana.

Следовательно, левая граница Т-ДНК также фланкирована растительной ДНК капусты, что свидетельствует об отсутствии в геноме растения-хозяина непереносимой части ДНК плазмиды.

Рис. 7. Электрофоретический анализ данных второй ПЦР на ДНК, обработанной рестриктазами Zrm\, EcoRV, НраХ, DraIII и Sspl с праймерами API и LB5.

М - маркер размера 1000 н п

1 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Zrm I,

2 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой EcoR V,

3 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Нра I,

4 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Dra III,

5 - геномная ДНК трансгенной капусты, обработанная рестриктазой Ssp I

6 Анализ первого семенного поколения трансгенных растений

6 1 Расщетение в первом семенном поколении от самоопыления трансгенного растения

Для проведения селекционного процесса по разработанной нами схеме, часть цветков индивидуального трансформационного события .N<>3117, обозначенного на схеме (рис 2) как «Фертильный ¿налог стерильной линии Т. bar -», была подвергнута самоопылению в условиях изоляции

В результате самоопыления были получены семена покотения Ti, которое, согтасно закономерностям настедования по Менделю должно было расщепляться на гетерозиготу (bar/ -), доминантную (bar/bar) и рецессивную гомозиготы (- / -), т е 3 1

Для изучения фактического расщепления, полученные семена первого поко тения проращивали на селективной среде с фосфинотрицином В резутьта-те, из 50 семян поколения Т] растения .4°3117 на долю рецессивной гомозиготы пришлось 41 растение, те неустойчивых растений оказалось больше, чем устойчивых Исходя из полученных данных, было выдвинуто предположение, что полученное расщепление соответствует 1 3, причем, одна доля растений (устойчивых) приходится на доминантною гомозиготу

Ранее в опытах с контрольными семенами была определена рабочая концентрация селективного агента фосфинотрицина 10 мг\д при которой обеспечивается 1000/о гибель не трансгенных проростков, однако при использовании данной концентрации для отбора трансгенных проростков в поколениях, возможно, нами не было учтено аллельное состояние перенесенного гена, то есть

происходила гибель гетерозиготных растений из-за недостаточного уровня экспрессии.

Для подтверждения предложенного нами расщепления 1:3 полученные данные были обработаны с помощью метода х2> в результате чего было получено, что х2факт. =0,1. Поскольку х2факт. < х2теор., нулевая гипотеза принимается, т.е. доля устойчивых растений к неустойчивым распределяется как 1:3, а полученные устойчивые растения, являются гомозиготными по гену bar.

6.2. Расщепление в первом семенном поколении от скрещивания трансгенного растения со стерильной родительской формой

Для перевода трансгена на стерильную основу и получения гомозиготной по гену bar линии, параллельно, с другой части цветков растения №3117 была собрана пыльца, которой опылили соответствующую стерильную форму (Линия ЦМС). В этом случае были получены семена поколения Ti с теоретически ожидаемым расщеплением на гетерозиготу (bar/-) и рецессивную гомозиготу (-/-), т.е. 1:1.

Для выбраковки неустойчивых растений был проведен анализ полученных семян на проявление целевого признака. По результатам анализа расщепления мы обнаружили, что, как и в случае с самоопылением, количество неустойчивых растений больше, чем устойчивых. Однако, в данном случае, несмотря на то, что статистический анализ соответствия экспериментальных данных теоретически ожидаемым показал расщепление 1:3 (х2факт. = 2,4), мы не можем утверждать, как в случае с самоопылением, что выжили только гомозиготные по трансгену проростки, т.к. их просто не могло образоваться результате скрещивания.

Полученные нами результаты расщепления, возможно, связаны со снижением уровня экспрессии гена bar в части гетерозиготных растений, что привело к их гибели на повышенной селективном фоне и смещению доли устойчивых растений в сторону неустойчивых, либо с особенностями района встраивания Т-ДНК в геном растения (гиперметилированный, гетерохроматиновый районы).

6.3. Анализ первого семенного поколения трансгенных растений на проявление признака устойчивости в условиях in vivo.

Полученные трансгенные растения (То) линий Зму 7 (4 шт.) и Дрв 2 (2 шт.), прошедшие первичный молекулярный анализ с помощью ПЦР и дот-блот гибридизации, были включены в селекционный процесс согласно разработанной схеме.

Поете проведения скрещиваний трансгенных растений и получения семян первого поколения, нам необходимо было отобрать гомо- и гетерозиготные по трансгену растения. Для этого, полученные от скрещиваний семена проращивали, проростки обрабатывали раствором гербицида «Баста». Статистическая обработка данных по методу %2 показала следующие результаты:

— IS

S расщепление в поколении Ть полученного от самоопыления растений №1,

№3, >6 линии Зму 7 и растений Х°1, >М линии Дрв 2 соответствовало 1 3 ■S расшетение в покочении Т, полученного от скрещивания с ЦМС формой

растении „Ч°1 .Ч»4 тении Дрв 2 соответствовало 1 1 ^ потомство растения .V°2 линии Зму 7, полученного от самоопыления, оказалось полностью неустойчивым к фосфинотрицину, что, скорее всею, свидетельствовало о замолкании перенесенного гена >же в первом поколении

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор выражает огромную признательность за неоценимую помощь в выполнении работы Григорию Федоровичу Монахосу, директору селекционной станции им Н Н Тимофеева, Ольге Альбертовне Шульге, руководителю группы генетической инженерии растений Центра «Биоинженерия» РАН и Геннадию Ильичу Карлову, руководителю Центра молекулярной биотехнологии - за ценные советы при планировании и проведении экспериментов

Всему коллективу Центра «Биоинженерия» РАН и, особенно, сотрудникам группы трансформации растений за помощь, понимание и поддержку

ВЫВОДЫ

1 Выявлены различия в реакции генотипов четырех линий капусты белокочанной отечественной селекции Гэс 2, Мег-2, Зму 7, Дрв 2 на воздействие фито-гормонов в процессе регенерации Эффективность регенерации 86,7° о для линии Гэс 2 и 81,5° о для линии Зму 7 достигается при содержании в питательной среде 6-Б \П - 2 мг/л и кинетина - 1 мг/л, 63,2% для линии Мег-2 -при концентрации борной кислоты -150 мг/л, 6-БАП - 2 мг/л и кинетина - 1 мг л, и 74,7% дтя линии Дрв 2 - 6-БАП 0,5 мг/л

2 Получено 26 трансгенных растений четырех линий Гэс 2, Мег-2, Зму 7, Дрв 2, экспрессирующих ген bar, которые включены в схему селекционного процесса по созданию трансгенного гибрида капусты белокочанной, устойчивого к гербицидам на основе фосфинотрицина

3 "Эффективность трансформации для линий Гэс 2 и Зму 7 составляет 7 1% для линии Мег-2 - 5,5% и для линии Дрв 2 - 10,9%

4 В процессе переноса Т-ДНК в геном растения №3117 (линия Мег-2) произошла деления участка 3' конца Т-ДНК, включая левую границу, не влияющая на функциональное проявление трансгена

5 Нуклеотидные последовательности, фланкирующие Т-ДНК растения N»3117, гомологичны с известными нуклеотидными последовательностями «GenBank» растительного происхождения (Brassica napus var napus Brassica rapa var pekinensis Arabidopsis thahanä), что указывает на интеграцию трансгена в геном растения

6. При самоопылении трансгенных растений доля устойчивых растений к неустойчивым распределяется как 1:3, причем устойчивые растения, являются гомозиготными по гену bar. При скрещивании трансгенных растений с ЦМС формами расщепление соответствует 1:1.

7. Разработанная схема селекционного процесса с участием трансгенной компоненты позволяет избежать не контролируемый выпуск в окружающую среду трансгенной пыльцы, поскольку основана на использовании линий с ЦМС.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Грибова Т.Н. Изучение влияния различных концентраций и сочетаний фитогормонов на регенерацию линий капусты белокочанной. - Сборник тезисов 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых. 2003. -С. 96.

2. Грибова Т.Н., Ракитин А.Л., Стародубцева А.М. Создание вектора для трансформации растений на основе плазмиды pBIBar. - Сборник тезисов 2" конференции МОГиС «Актуальные проблемы генетики», 2003, том 2, С.115-116.

3. Грибова Т.Н., Стародубцева А.М., Скрябин К.Г. Создание трансгенных линий капусты белокочанной с новыми агротехническими свойствами, -Материалы II Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития М.: ЗАО «ПИК «Максима», РХТУ им.Д.И. Менделеева, 2003 - часть I, С. 191-192.

4. Грибова Т.Н., Головешкина E.H., Камионская A.M. Изучение наследования трансгена в поколениях от самоопыления трансгена в первом поколении растений дикорастущей капусты белоцветковой — Материалы VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». 2005. 56с.

5. Грибова Т.Н., Головешкина E.H., Камионская A.M., Скрябин К.Г. Изучение наследования трансгена в поколениях от самоопыления трансгенных растений дикорастущей капусты белоцветковой. - Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 4.1. Москва, 2005.241с.

6. Грибова Т.Н., Камионская A.M., Скрябин К.Г. Получение трансгенных растений капусты с новыми агротехническими свойствами. - Сборник тезисов 9-ой Международной Пущинской школы - конференции молодых ученых, 2005, 343с.

7. Заявка на изобретение №2005110956 «Способ получение генетически модифицированных растений капусты белокочанной» дата приоритета 15 апреля 2005 г. Грибова Т.Н., Камионская A.M., Скрябин К.Г.

В. Грибова Т.Н., Камионская A.M., Монахос Г.Ф. Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений капусты белокочанной Brassica oleracea var. capitata с новыми агротехническими свойствами. - Биотехнология. Т.6, 2005, 12-19 с.

9 Грибова Т.Н., Камионская А М, Скрябин К Г. Оптимизация способа получения трансгенных растений капусты белокочанной Brassica oleracea var capitata - Прикладная биохимия и микробиология Т 5, 2006, в печати

Summary

Obtaining of Brassica oleracea var capitata transgenic plants with new atrrotechmcal properties

To genetic transformation of the following four cabbage lines Ges 2, Drv 2, Zmu 7, Meg-2 the strain Agrobactenum tumefaciens GV3101 carrying plasnud pBar with bar gene under the control of 35SCMoV promoter and NOS 3'terminator was used The influence of different phytohormones concentrations and condinons under which the regeneration efficiency reaches 63-87% were chosen It was shown that the mutual influence of both natural and synthetic kinds of cytokinin was demanded 26 transgenic plants were obtained on the base of optimized method of transformation via Agrobactenum tumefaciens The transgenic status of these plants was proved by PCR and dot-blot hybridization

These lines were bar gene hermzygotic For the first time the selective process scheme to obtain heterozygotic hybrid of cabbage with transgenic component was developed and applied

As result of the scheme the point of transgenic technology application in traditional selective process was defined Crossings were held and the first seed generation Ti was obtained

Тир 100 экз

1,0 печ л

Зак 354

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им К А. Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44