Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение трансгенных растений сахарной свеклы и их молекулярно-биологический анализ

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Захарченко, Наталья Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая характеристика агробактериальных векторных систем

1.1.1. Структурно-функциональная организация Ti и Ri-плазмид

1.1.2. Гены вирулентности Ti и Ri-плазмид

1.1.3. Типы векторных систем

1.2. Методы трансформации растений

1.2.1. Методы агробактериальной трансформации растений

1.2.2. Методы прямого переноса ДНК в растение

1.3. Преимущества и недостатки различных методов генетической трансформации растений

1.4. Селекция трансформированных тканей растений

1.5. Экспрессия чужеродных генов и ее регуляция в трансгенных растениях

1.6. Успехи и перспективы генной инженерии растений

1.6.1. Метаболическая инженерия растений

1.6.2. Растения как продуценты целевых белков

1.6.3. Устойчивость к фитопатогенам

1.6.4. Устойчивость к насекомым вредителям и другим беспозвоночным

1.6.5. Устойчивость к гербицидам

1.7. Основные направления исследований в области клеточной биотехнологии сахарной свеклы

1.7.1. Клональное размножение

1.7.2. Сомаклональная изменчивость

1.7.3. Клеточная селекция

1.7.4. Соматическая гибридизация

1.7.5. Использование культуры пыльников и семяпочек

1.8. Генетическая инженерия сахарной свеклы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы и оборудование

2.1.1. Растительный материал

2.1.2. Оборудование

2.1.3. Реактивы, среды и ферменты

2.1.4. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.2. Методы

2.2.1. Электрофорез ДНК в агарозе

2.2.2. Электрофорез ДНКв полиакриламидном геле

2.2.3. Элюция ДНК из агарозного геля

2.2.4. Элюция ДНК из полиакриламидного геля

2.2.5. Лигирование

2.2.6. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр по Саузерну

2.2.7. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр из колоний на чашках

2.2.8. Получение радиоактивных меченых препаратов ДНК

2.2.9. Гибридизация по Саузерну

2.2.10. Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.2.11. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация

2.2.12. Индуцирование процессинга агробактериальной Т-ДНК экссудатами сахарной свеклы

2.2.13. Колонизация семян и растений сахарной свеклы метилотрофными бактериями Methylovorus mays

2.2.14. Агробактериальная трансформация сахарной свеклы

2.2.15. Перенос плазмидной ДНК при помощи конъюгации в клетки агробактерий

2.2.16. Перенос плазмидной ДНК при помощи конъюгации в клетки метилобактерий

2.2.17. Определение активности ферментов: неомицинфосфотрансферазы II (ЫРТII)

2.2.18. Определение нопалинсинтазной активности и атропина в транформированных растительных тканях

2.2.19. Анализ геномной ДНК трансгенных растений методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.2.20. Биотесты с белковыми экстрактами из трансгенных растений

2.2.21. Статистическая обработка результатов исследований

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка методов генетической трансформации сахарной свеклы

Beta vulgaris L.)

3.1.1. Изучение процессинга Т-ДНК агробактерий под действием экссудатов сахарной свеклы

3.1.2. Влияние содержания фитогормонов на эффективность регенерации побегов и образование корней

3.2. Генетическая трансформация сахарной свеклы

3.2.1. Неопластическая трансформация сахарной свеклы дикими штаммами агробактерий

3.2.2. Генетическая трансформация сахарной свеклы агробактериальной векторной системой, содержащей ген nptll

3.3 Влияние метилобактерий Methylovorus mays на эффективность регенерации эксплантов и скорость прорастания семян сахарной свеклы

3.3.1. Получение трансгенных растений, содержащих ген bar

3.4. Создание конструкций с геном антимикробного пептида цекропина Р1, пригодных для трансформации широкого круга растений 89 3.4.1. Перенос конструкций с геном антимикробного пептида цекропина PI из клеток агробактерий pGV3101 и А281 в растения сахарной свеклы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение трансгенных растений сахарной свеклы и их молекулярно-биологический анализ"

Актуальность работы. Совершенствование методов генетической трансформации растений и технологии рекомбинантных ДНК сделали возможным экспрессировать в растениях гены различных организмов, что открывает перспективы для создания растений с новыми уникальными свойствами.

В 1983 г. были опубликованы первые работы по получению трансгенных растений табака (Herrera-Estrella et al., 1983; Barton et al., 1983), содержавших в качестве чужеродных генов селективные маркеры устойчивости к антибиотикам и гены-репортеры. Через три года были проведены первые полевые испытания сельскохозяйственных трансгенных растений, а спустя десять лет генетическая инженерия растений предложила рынку десятки экономически важных трансгенных растений. В 1995 году в США получены первые разрешения на коммерциализацию трансгенных сортов растений и их продуктов. В настоящее время генетическая инженерия растений является составной частью современной молекулярной и клеточной биологии. К основным задачам генетической инженерии растений относятся: генетическая трансформация различных видов растений, экспрессия чужеродных генов и ее регуляция в клетках трансгенных растений. Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) принадлежит к важнейшим сельскохозяйственным культурам, являясь основным продуцентом сахара в зонах умеренного климата. Более 37% мирового сахара получают из этой культуры. Проводимые с сахарной свеклой селекционно-генетические работы направлены на повышение продуктивности и на обеспечение растений устойчивостью к фитопатогенам и различным биотическим и абиотическим стрессовым факторам (Корниенко и др., 1991). Относительно медленные темпы классической селекции новых сортов сахарной свеклы связаны с такими ее биологическими особенностями как высокая гетерозиготность, перекрестная опыляемость и двухлетний цикл развития. В настоящее время открывается реальная перспектива создания новых сортов принципиально новыми методами генетической инженерии.С помощью этих методов начато решение практических задач получения сахарной свеклы с повышенной сахаристостью, устойчивостью к свекловичной нематоде, вирусным инфекциям, насекомым-вредителям и гербицидам. Однако большинство этих задач решается пока в экспериментах на уровне трансформированных протопластов (Ingersoll, et al., 1996), и растений, культивируемых in vitro (Jacq, et al., 1992). Разработка методов регенерации целых растений из клеток и тканей в культуре in vitro является одним из необходимых условий получения трансгенных растений. Сахарная свекла относится к трудным для экспериментов in vitro видам растений (Tetu et al., 1987). Описанные примеры получения трансгенных растений сахарной свеклы немногочисленны. Информация о работах по генетической трансформации отечественных сортов сахарной свеклы вообще отсутствует.

Целью данной работы явилась разработка метода генетической трансформации отечественных сортов сахарной свеклы. Для выполнения этой работы решали следующие задачи:

1. Разработать методику регенерации растений сахарной свеклы из различных эксплантов и оценить регенерационный потенциал некоторых отечественных сортов.

2. Исследовать присутствие в экссудатах сахарной свеклы специфических сигнальных молекул, индуцирующих контролируемый vir-генами процессинг Т-ДНК. Определить сорта и экспланты сахарной свеклы с высокой vir-индуцирующей активностью.

3. Разработать методику генетической трансформации сахарной свеклы с помощью агробактериальных векторных систем.

4. Исследовать эффект ассоциативных метилобактерий Methilovorus mays на регенерацию и агробактериальную трансформацию сахарной свеклы.

5. Получить трансгенные растения сахарной свеклы, экспрессирующие наряду с селективными маркерными генами также гены, определяющие ценные хозяйственные свойства растений. Провести молекулярно-генетический анализ трансгенных растений.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Захарченко, Наталья Сергеевна

выводы

1. Разработана методика регенерации нескольких сортов растений сахарной свеклы отечественной селекции. Установлено, что оптимальным эксплантом для регенерации целых растений являются черешки сахарной свеклы.

2. В экссудатах различных тканей сахарной свеклы исследовано присутствие специфических сигнальных молекул, индуцирующих процессинг агробактериальной Т-ДНК. Максимальное содержание сигнальных молекул обнаружено в экссудатах черешков листьев сахарной свеклы.

3. Разработана методика генетической трансформации отечественных сортов сахарной свеклы с помощью агробактериальных векторных систем.

4. Колонизация сахарной свеклы ассоциативными метилобактериями повышает регенерационный потенциал растений и эффективность их генетической трансформации

5. Созданы векторные конструкции с геном антимикробного пептида цекропина Р1.

6. Получены трансгенные растения сахарной свеклы, экспрессирующие селективный маркерный ген nptll, ген устойчивости к гербициду фосфинотрицину bar и ген антимикробного пептида цекропинаР1. Проведен молекулярно-биологический анализ полученных трансгенных растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Успех получения трансгенных растений определяется двумя основными условиями: возможностью генетической трансформации клеток определенных видов растений и возможностью регенерации трансформантов до целых растений. Что касается регенерации сахарной свеклы, то у всех исследованных в настоящей работе сортов прямая регенерация побегов имела место на черешках листьев 2-месячных растений на среде МС, содержащей 0,3 мг/л БАП и 0,2 мг/л гиббереловой кислоты. Образование каллусов наблюдалось на среде МС, содержащей 2 мг/л БАП или 2,2мг/л ТДЗ. Регенерация побегов из каллусов наблюдалась на среде WPM, содержащей 1,0 мг/л БАП, 0,1 мг/л ИУК. Регенерация побегов из листовых дисков сахарной свеклы не наблюдалась. У регенерированных побегов корнеобразование происходило на среде МС, содержащей 3,0 мг/л НУК, а также при длительном культивировании на среде МС без гормонов. Интересно отметить, что у исследованных в настоящей работе сортов сахарной свеклы отсутствовала прямая корреляция между эффективностями побегообразования и корнеобразования (табл. 5,6).

Одной из причин неэффективной агробактериальной трансформации двудольных растений некоторых видов является отсутствие в их экссудатах специфических сигнальных молекул, индуцирующих процессинг и перенос в клетки растений Т-ДНК агробактериальных Ti- и Ri-плазмид. В экссудатах сахарной свеклы обнаружен умеренный уровень таких сигнальных молекул. Известно, что культуры агробактерий, индуцированные природным индуктором ацетосирингоном, трансформируют растительные клетки с более высокой частотой по сравнению с не индуцированными arpo бактериями. В связи с этим в нашей работе для инокуляции сахарной свеклы мы использовали агробактерии как предварительно индуцированные ацетосирингоном, так и не индуцированные (контроль). При обработке агробактерий ацетосирингоном эффективность трансформации была выше по сравнению с вариантом без обработки (табл. 8). Важно отметить, что лучшие для агробактериальной трансформации экспланты - черешки листьев сахарной свеклы, отличаются также и максимальным содержанием сигнальных молекул. Эффективность выхода трансформированных регенерантов в разработанном нами методе составляла 3% от общего числа эксплантов.

Нами было установлено, что экспланты сахарной свеклы из колонизированных метилобактериями Methylovorus mays растений проявляют повышенную частоту регенерации из них побегов (табл.9). Благодаря этому, колонизация растений сахарной свеклы метилобактериями представляется ценным приемом в системе ее генетической трансформации и последующей регенерации из эксплантов целых трансформированных растений. Трансформация эксплантов колонизированных растений отличалась увеличением выхода трансформированных побегов в два раза. Кроме того, использование канамицин-устойчивого штамма метило бактерий приводило к дополнительному увеличению выхода трансформантов на 2-3%. Конечная эффективность агробактериальной трансформации черешковых эксплантов сахарной свеклы, колонизированных метилобактериями, достигала 8-10%.

В настоящей работе трансформацию эксплантов сахарной свеклы, осуществляли агробактериальными бинарными векторными системами А. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pGA482), pGV3101 (pMP90RK, pGA482-35S-cec), A281 (pTiBo542, pGA482-35S-cec), pGV3101 (pMP90RK, pRK290). Регенерация побегов из трансформированных черешков листьев и каллусов сахарной свеклы проведена на селективной среде, содержащей 50 мг/л канамицина. На этой среде через две-три недели наблюдалось побегообразование. Удлинение периода селекции трансформантов от одной до пяти недель увеличивало долю выхода трансгенных побегов в общем числе полученных регенерантов. Следует отметить, что, хотя концентрация канамицина, практически полностью ингибирующая рост побегов сахарной свеклы, достигала 100 мг/л, мы проводили селекцию трансформантов при вдвое

1 n-:

IV J меньшей его концентрации. Это было вызвано тем, что у растений, подвергаемых сильному стрессу при росте на среде с канамицином, гигромицином и цефотаксимом, ДНК подвергается гиперметилированию. Известно, что метилирование регуляторных областей генов высших эукариот, в том числе и растений, выключает их экспрессию (Meyer et al., 1994), а изменение общей картины метилирования ДНК влияет на морфолого-физиологический тип растений (Buryanov et al., 1995; Finnegan et al., 1996; Kakutani et al., 1996; Шевчук с соавт., 2001). Таким образом, стрессовые воздействия антибиотиков на образованные de novo клетки трансгенных растений значительно повышают вероятность "замолкания" чужеродных генов, в том числе генов-репортеров и селективных маркеров. Селекция трансгенных растений на среде с умеренными концентрациями канамицина снижает стрессовую нагрузку и создает условия для их нормального роста и развития.

С этой же целью предположительно трансгенные побеги сахарной свеклы в настоящей работе укореняли на среде, содержащей пониженную по отношению к среде побегообразования концентрацию канамицина (25 мг/л). Хотя эти приемы селекции предположительно трансгенных канамицин-устойчивых растений сахарной свеклы не приводили к выходу растений только с истинной трансгенной природой, они позволяли их получать с достаточно высокой долей в полученной выборке.

Окончательное доказательство трансгенной природы растений сахарной свеклы были получены в экспериментах по ПЦР- анализу присутствия генов nptll, cecPl, bar, по энзиматической активности гена nptll, а также по антибактериальной активности гена цекропинаР1 (табл.9, рис. 26). Следует отметить, что среди канамицин-устойчивых растений сахарной свеклы сорта 187р47 этими методами не выявлены растения с истинной трансгенной природой, содержащие ген nptll (табл. 8, рис. 12). Эффективность трансформации различных сортов сахарной свеклы может зависеть от их генотипа и от свойств используемой агробактериальной векторной системы.

Эксперименты по трансформации исследуемых сортов сахарной свеклы дикими штаммами А. Ште/аЫет и А. rhizogenes показали, что они эффективно трансформируют различные экспланты всех сортов (табл. 8). Трансформированная природа полученных опухолевых и корневых культур была подтверждена тестами на их рост на безгормональных питательных средах и на их способность синтезировать специфические опины (рис. 9,10). В настоящее время для генетической трансформации растений сахарной свеклы применяется ограниченное число агробактериальных штаммов. Расширение круга агробактерий для генетической трансформации сахарной свеклы значительно увеличит возможности этого метода агробактериальной трансформации и, позволит преодолеть трудности трансформации некоторых сортов сахарной свеклы. Следует подчеркнуть возможность простого прямого использования диких штаммов агробактерий в разработанном нами способе генетической трансформации сахарной свеклы с помощью бинарных векторов. Это связано с прямой регенерацией побегов из черешковых эксплантов сахарной свеклы, трансформированных только "обезоруженной" Т-ДНК бинарного вектора. При использовании в бинарной векторной системе диких агробактериальных штаммов, для выполнения у/>-функции, возможны различные варианты перенесения агробактериальной Т-ДНК: перенос только Т-ДНК диких Ть и Ш- плазмид, одновременный перенос этих Т-ДНК и Т-ДНК бинарного вектора, перенос только Т-ДНК бинарного вектора. Как известно, экспрессия в трансформированной растительной клетке фитогормональных агробактериальных генов Т-ДНК вызывает ее опухолевое перерождение и неспособность регенерации до целого растения ^атЬгузкт е1 а1., 1983). Разработанный нами метод прямой регенерации побегов из черешковых эксплантов сахарной свеклы, таким образом, помогает провести прямой отбор трансформантов, содержащих только Т-ДНК бинарного вектора.

Разработанная в настоящей работе технология генетической трансформации сахарной свеклы может найти применение в проведении

107 фундаментальных и прикладных исследований по генетике и физиологии этой культуры. Полученные трансгенные растения различных отечественных сортов сахарной свеклы, экспрессирующие гены устойчивости к гербициду фосфинотрицину и антимикробного пептида цекропина Р1 уже нашли применение в селекционно-генетической работе во Всероссийском НИИ сахарной свеклы и сахара.

IOS

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захарченко, Наталья Сергеевна, Пущино

1. Атанасов А.И., Бутенко Р.И. Культура изолированных пыльников сахарной свеклы. // Физиология и биохимия культурных растений. 1980. Т12. №1. С49-56.

2. Бормотов В.Е., Свирщевская A.M. Сомаклональная изменчивость растений сахарной свеклы. // Всес. конф. по генетике соматических клеток в культуре, посвящен, памяти Шапиро А.И. (Новосибирск, 13-15 окт.1989): Тез.докл. Новосибирск. 1989. С. 12.

3. Бурьянов Я.И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений. // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 930-944.

4. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе.// МГУ, Москва, ФБК- Пресс. 1999. 160 с.

5. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в селекционном процессе. // Состояние и развитие сельскохозяйственной биотехнологии. Л. 1986. С. 29-38.

6. Бутенко Р.Г., Гостимский С.А. Изменчивость генома растительной клетки при культивировании в условиях in vitro. //Биотехнология. №.2. 1985. С. 79-85.

7. Горина И.Н., Гужова Н.В., Балнокин Ю.В., Тарханов И. А., Чивкунова О.Б., Мерзляк М.И. Возможные механизмы повреждающего действия корнееда на проростки сахарной свеклы. // Физиол. раст. 1995. Т.42. №.6. С. 899-904.

8. Губанова Н.Я., Дубровская О.В., Чугункова Т.В. Комплексная селекция in vitro на устойчивость клеточных линий кормовой свеклы к токсину возбудителя бактериоза к низким температурам // Биополимеры и клетка. 2000. Т. 16. №.2. С.

9. Доронина Н.В., Биоразнообразие и таксономия аэробных метилобакте-рий. Автореф. дис. на соискание ученой степени докт. биол. наук. Пу-щино. Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов РАН, 1999. 33с.

10. Доронина Н.В., Кудинова Л.В., Троценко Ю.А. Methylovorus mays-новый вид аэробных облигатных метилобактерий, ассоциированных с растениями//Микробиология. 2000. Т.69. С. 712-716.

11. Жук И.Т., Бобырь А.Д., Сахно Т.Н. Ослабление вирулентности вируса мозаики свеклы в культуре ткани сахарной свеклы. // Докл. ВАСХНИЛ. 1991. №1. С. 15-17.

12. Зинкевич В.Е., Богдарина И.Г., Рукавцова Е.Б., Мырхова М.И., Бурьянов Я.И. Ингибирование экспрессии гена немицинфосфотрансферазы II в протопластах табака с помощью антисмысловой РНК. // Докл. АН СССР. 1988. Т. 300.С. 727-730.

13. Зубенко В. Ф., Редько В. И., Ильенко И.И. Культура изолированных каллусных протопластов сахарной свеклы. // Применение биотехнологии в селекции с.-х. культур. (Ленинград, 11-13 окт.1988): Тез.докл.- М., 1988. С. 208-209.

14. Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Шепеляковская А.О., Ламан А.О., Бровко Ф.А., Троценко Ю.А. Факультативные и облигатные аэробные метило-бактерии синтезируют цитокинины. // Микробиология. 2000. Т. 69. №6. С.764-769.

15. Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Аэробные метилобакте-рии синтезируют ауксины.// Микробиология. 2001. №

16. Ильенко И.И., Яворская Т.К., Бех К.С., ГорбатюкЯ.В. Морфологическая и биотехнологическая характеристика сомаклональных вариантов сахарной свеклы. // Биотехнологические методы в селекции сахарной свеклы. М.: Агропромиздат. 1989. С.49-54.

17. Ильченко И.И. Микроклональное размножение и сохранение селекционного материала сахарной свеклы в культуре in vitro. // Физиология и биохимия культурных растений . 1983. Т16. №4. С. 351-355.

18. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микрокло-нального размножения растений. Киев: Наукова думка. 1992. С. 228.

19. Каляева М.А., Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Способность однодольных растений индуцировать процессинг агробактериальной Т-ДНК. // Физиология и биохимия культурных растений. 2000. Т.32. №3. С. 209218.

20. Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва: Высшая школа, 1990. С. 352.

21. Ли А., Тинланд Б. Интеграция Т-ДНК в геном растений: прототип и реальность. // Физиология растений. 2000. Т. 47. №.3. С. 354-359.

22. Маниатис Т., Фрич., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. 480с.

23. Парашина Е.В., Шаденков А.А., Лаврова И.В., Аветисов В.А. Использование гена защитного пептида (дефензина) из семян редьки для повышения устойчивости томатов к заболеваниям, вызываемым грибами.// Биотехнология. 1999. №6. С 35-41.

24. Пожар З.А., Тищенко Е.И. Болезни сахарной свеклы в 1978 году меры борьбы с ними. // Сахарная свекла. 1978. №3. С.31.

25. Поройко В.А., Рукавцова Е.Б., Орлова И.В., Бурьянов Я.И. Фенотипи-ческие изменения трансгенных растений табака с антисмысловой формой гена hmgl. Генетика. 2000. Т. 36. №.9. С. 1200-1205.

26. Редько В.В., Редько В.И. Особенности реакции сахарной свеклы на солевой стресс.// Генетические исследования сахарной свеклы. Киев. 1991. С.68-74.

27. Романов Г.А. Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности. // Физиол. раст. 2000.Т. 47. №3. С. 343-353.

28. Сидоров В.А. Биотехнология растений. // Клеточная селекция. Киев: Наукова думка. 1990. С.280.

29. Чугункова Т.В. Современное состояние проблемы клеточных технологий у свеклы. // Цитология и генетика. 1995. Т.29. №.3. С.81-91.

30. Шредер Д., Дегрев Г., Гернальстинс Д.П. и др. Перенос генов в клетки высших растений посредством Ti-плазмиды. // Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: Агропромиздат, 1987. С. 287-300

31. Ahuja M.R. Protoplast research in woody plants. // Silvae genet. 1984. V. 33. N.l. P. 32-37.

32. An G. Development of plant promoter expression vectors and their use for analysis of differential activity of nopaline synthase pomoter in transformed tobacco cells. //Plant Physiol. 1986. V.81. P. 86-91.

33. An G., Costa M.A., Ha S.-B. Nopalin synthase promoter is wound inducible and auxin inducible. // Plant Cell. 1990.V.2. P. 225-233.

34. An G., Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. Binary vectors. // Plant molecular biology manual. Ed.Gelvin S.B., Schilperoort R.A., Verma D.P.S. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1988. №.3. P. 1-19.

35. Arakava T., Chong D.K.X., Langridge W.H.R. Efficacy of a food plant-bases oral cholera toxin B subunit vaccine. // Nature Biotechnology. 1998. V.16. P. 292-297.

36. Armaleo D., Ye.G.N., Klein T.M., Shark K.B., Sanford J.C., Johnston S.A., Biolistic nuclear transformation of Saccharomyces cerevisiae and ofher fungi. // Current Genet. V.17. 1990. P. 97-103.

37. Atanassov A. Sugar Beet (Beta vulgaris L.). // Biotechnology in agriculture and forestry.-Berlin:Springer-Verlag. V.2. 1986. P. 462-470.

38. Bakkeren G., Koukolikova Nikola Z., Grimsley N., Hohn B. Recovery of Agrobacterium tumefaciens T-DNA molecules from whole plants early after transfer. // Cell. 1989. V.57. P. 847-851.

39. Baldarelli R.M., Lengyel J. A. Transient expression of DNA after ballistic introduction into Drosophila embryos. //Nucl. Acids. Res. V.18. 1990. P. 5903-5904.

40. Barton K., Binns A., Matzke A., Chilton M. -D. Regeneration of intact tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA to R1 Progeny. // Cell. 1983. V.32. P. 1033-1043.

41. Birnboim H.C., Doli J. A rapid a alkaline extracnion procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucleic Acids Res. 1979. V.7. P. 1513.

42. Bolivar F., Rodrigers R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heynecker H.L., Boyer K.W., Crosa J.H., Falkow S. Construction and characterization of newcloning vechicles. A multipurpose cloning system. // Gene. №2. 1977. P. 95113.

43. Bower R., Birch R.G. Transgenic sugarcane plants via microprojectile bombardment. Plant J. V.2. 1992. P. 409-416.

44. Bradford M.M. A rapid and sensitive method of the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding//Anal. Biochem. 1976. V.72. P. 248-254.

45. Buryanov Y.I., Zakharchenko N.S., Shevchuk T.V., Bogdarina I.G. Effect of the M-EcoRII methyltransferase-encoding gene on the phenotype of Nicoti-ana tabacum transgenic cells. // Gene. V.157. 1995. P.283-287.

46. Caboche M., Deshayes A. Utilization de liposomes pour la transformation de protoplastes de mesophylle de E.coli leur conferant la resistance a la kanamycine. IIC. R. Acad. Sci. 1984. Ser. III. P. 663-666.

47. Carr J.P., Marsh L.E., Lomonossoff G.P., Sekiya M.E., Zaitlin M. Resistance to Tobacco Mosaic Virus induced by the 54-kDa gene sequence requires expression of the 54-kDa protein. // Molecular Plant -Microbe Interact. 1992. V.5. P. 397-404.

48. Catlin D.W. The effect of antibiotics on the inhibition of callus induction and plant regeneration from cotyledons of sugarbeet (Beta vulgaris L.). // Plant Cell Reports. №.9. 1990. P. 285-288.

49. Chang S.S., Park S.K., Kim B.S., Kang B.I., Kim D.U., Nam H.G. Stable genetic transformation of Arabidopsis thalicma by Agrobacterium inoculation in planta.//Plant J. 1994. V.5. P. 551-558.

50. Cheng M., Fry J.E., Pang S., Zhou H., Hironaka C.M., Duncan D.R., Conner T.W., Wan Y. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. //Plant Physiol. 1997. V.115. P. 971-980.

51. Cheung A., Bogorad L., Van Montagu M., Shell J. Relocating a gene for herbicidal tolerans: a chloroplast gene is converted into a nuclear gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 85. P. 391-395.

52. Christensen B., Fink J., Merrifield R.B., Mauserall D. Channel-forming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes .// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.85. 1988. P. 50725076.

53. Christou P., Ford T., Kofron M. The development of a variety-independent genetransfer method for rice. // Trends Biotech. V. 10. 1992. P. 239-246.

54. Christou P., Mc Cabe DE., Martinell B.J., Swain W.F. Soybean genetic engineering-commercial producnion of transgenic plants. // Trends Biotech. 1990. V. P. 145-151.

55. Clewell D.B. Helinski D.R. Supercoiled circular DNA protein complex in E.coli: purification and conversion to an open circular DNA form. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1969. V.62.P. 1159-1166.

56. Close T,J.,Rodowsky P.M., Kado C.I., Winans S.C., Yahotsky M.F., Nester E.W. J. Bacterid., 1987. V.169.P. 5113-5118.

57. Clough S.J., Bent A.F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. //Plant J. 1998. V.16. P. 735-743.

58. Comai L., Sen L.C., Stalker D.M. Altered aro A gene product confers resistance to the herbicide glyphosate. // Science. 1983. V.221. P.370-373.

59. Crossway A., Hauptli H., Houck C. et al. Micromanipulation techniques in plantbiote.chnology. //Biotechnology. 1986. V.4. P. 320-334.

60. Curel E., Wren M.J. In vitro developmen from leaf explants of sugar beet (Beta vulgaris L). Rhizogenesis and the effect of sequential exposur to auxin and cytokinin. // Annals of Botani. V.75. 1995. P. 31-38.

61. D'Halluin K., Bossut M., Bonne E., Mazur B.,Leemans J., Botterman J. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris L.)and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants. // Biotechnology. V.10. 1992. P. 309-314.

62. Day A., Debuchy R., Van Dillewijn J., Purton S., Rochaix J.D. Studies on the maintenance and expression of cloned DNA fragments in the nucleargenome of the griin alga Chlamydomonas reinhardtii. II Physiol.Plantarum. V.78. 1990. P. 254-260.

63. De Block M., Botterman J., Vanderviele M., Dockx J., Van Montagu M., Leemans J. Engineering herbicide resistance in plants by expression of a detoxifying enzyme. //EMBO J. 1987. V. 6. P. 2513-2518.

64. De Greef W., Jacobs M. In vitro culture of the sugarbeet: description of a cell line with high regeneration capacity. // Plant Science Letters. V. 17. 1979. P. 55-61.

65. De Paolis A., Mauro M.L., Pomponi M., Cardarelli M., Sparo L., Costantino P. Localization of agropine-synthezing function in the TR-region of the root inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. //Plasmid. V. 13. 1985. P. 17.

66. Ditta G., Stanfield S., Gorbin D., Helinsky D.R. Broad host range DNA cloning system for gram-negativ bacteria-construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 7347-7349.

67. Doley W.P., Saunders J.W. Hormone-free medium will support callus production and subsequent shoot regeneration from whole plant leaf explants in some sugarbeet (Beta vulgaris L.) populations. // Plant Cell Reports. V. 8. 1989. P. 222-225.

68. Draper J., Davey M.A., Freeman J.P. et al. Ti plasmid homologous sequences present in tissue from Agrobacterium plasmid transformed petunia protoplasts. // Plant Cell Physiol. 1982. V. 23. P. 451-458.

69. Ebskamp M.J.M., van der Meer I.M., Spronk B.A., Weisbeek P.J.M. Accumulation of fructose polymers in transgenic tobacco. // Bio/Tehnology. 1994. V. 12. P. 272-275.

70. Eckstein J., Artsaenko O., Conrad U., Peisker M., Beyschlag W. Abscisic acid is not necessarily required for the induction of patchy stomatal closure. // J. Experiment.Botany. 1998. V. 49. P. 611-616.

71. Edwards D.L., Payne J., Soares G.G. Novel isolates of Bacillus thuringiensis having activity against nematodes. //U.S. Patent 4,948,734. 1990.

72. Elliott M.C.,Broun S.J., Fowler M.R.,et al. Genetic enginiering of sugar beet. //Plant Physiol. 1990. V. 11. №.4. P. 14-17.

73. Fall R. Cycling of methanol between plants, methylotrophs and atmosphere // Microbial growth on CI compoundsz / Eds M. E. Lidstrom, F.R. Lidstrom, F.R. Tabita. Dordrecht: Kluwer. Acad., 1996. P.343-350.

74. Feldmann K.A., Marks M.D. Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: A non-tissue culture approach. // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 208. P. 1-9.

75. Feitelson J.S., Payne J., Kim L. Bacillus thuringiensis: insect and beyond. // Bio/Technology. 1992. V.10. P.271-275.

76. Finnegal E.J., Peacock W.J., and Dennis E.S. Reduced DNA methylation in Arabidopsis thaliana results in abnormal plant development I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V.93. P.8449-8454.

77. Flawell R.B. Inactivation of gene expression in plants as a consequence of specific sequence duplication. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 3490-3491.

78. Ford-Iloud B.V., Bhat S. Problem and prospects for the use of protoplast in beet breeding. // Gen. Manipulat .Plant Breed. Proc. Jnt. Symp. Berlin. 1986. P. 437-440.

79. Freytag A.H., Anand S.C., Rao-Arelli A.P., Owens L.S. An improved medium for adventitions shoot formation and callus induction in Beta vulgaris L. in vitro. // Ibid. 1988. V. 7. №1. P. 30-34.

80. Freytag A.H., Wrather J.A., Erichsen A.W. Solt tolerant sugarbeet progeny from tissue cultures challennged with multiple salt. // Plant Cell Pepts. 1990. V. 8. №.11. P. 647-650.

81. From M.E., Marrish F., Armstrong C., Williams R., Thomas J., Klein T.M. Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants. // Bio/technology. V.8. 1990. P. 833-839.

82. Fromm M., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V.82. P. 5824-5828.

83. Fulton G.L., Nunn D.N., Lidstrom M.E. Molecular cloning of a malyl coenzyme A lyase gene from Pseudomonas sp. strain AMI, a facultative methy-lotrophe. // Journal of Bacteriology. V.160. №2. 1984. P.718-723.

84. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrien requirements of suspension cultures of soubeanroot cells. //Exp. Cell Res. 1968. V. 50. P. 151-158.

85. Gan S., Amasino R.M. Inhibition of leaf senesens by autoregulated production of cytokinin. // Science. V. 270. 1995. P. 1986-1988.

86. Gergen J.P., Stern R.H., Wensink P.S. Filter replicas and permanent collections of recombinant DNA plasmids. //NAR. V. 7. №.8. 1979. P. 2115-2136.

87. Goska M. Sugar beet haploids in the in vitro culture. // Bull. Pol. Acad. Sci. Biol. Sci. 1985. V. 33. №.1-6. P. 31-33.

88. Gould J., Devey M., Hasegawa O., Ulian E.C., Peterson G., Smith R.H. Transformation of ley mays L. using Agrobacterium tumefaciens and the shoot apex. // Plant Physiol. 1991. V.95. P. 426-434.

89. Greisbach R.J. Protoplast microinjection/ZPlant. Mol. Biol. Report. 1983. V. l.P. 32-37.

90. Gutierrez R., Macintosh G.C., Green P.J. Current perspectives on mRNA stability in plants: multiple levels and mechanisms of control. // Trends Plant Sci. 1999. V. 4. P. 429-438.

91. Hafte H., Whiteley H.R. Insecticidal crystal protein of Bacillus thuringiensis. //Microbiol. Rev. 1989. V. 53. P. 242-255.

92. Hancock R.E.W., Lehrer R. Cationic peptides: a new source of antibiotics. // Tib. Tech. 1998. V. 16. P. 82-88.

93. Harrison B.D., Mayo M.A., Baulcombe D.C. Virus resistance in transgenic plants that express cocumber mosaic virus satellite RNA. // Nature. 1987. V. 328. P. 799-802.

94. Haughn G.W., Smith J., Mazur B., Somerville C. Transformation with a mutant Arabidopsis acetolactat synthase gene renders tobacco resistant to sulfonylurea herbicides. // Mol. Gen. Genet. 1988. V. 211. P. 226-271.

95. Hauptmann R.M., Oxias-Akins P., Vasil V. et al. Transient expression of electroporated DNA in monocotyledonous and dicotyledonous species. // Plant Cell Report. 1987. V. 6. N4. P. 265-270.

96. Hererra-Estrella L., Depicker A., Van Montagu M., Schell J. Expression of chimeric genes transferred into plant cell using a Ti-plasmid -derived vector. //Nature. 1983. V. 303. P. 209-213.

97. Hoekema A., Hirsch P.B., Hookaas P. J. J., Schilperoort R.A. A binary plant vector strategy based on separation of vir and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid. //Nature. 1983. V. 303. P. 179-180.

98. Holland M.A. Occam s razor applied to hormonology. Are cytokinins produced by plants? Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 865-868.

99. Holland M.A., Polacco J.C., PPFMs and other covert contaminants:is there more to plant physiology than just plant? // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V. 45. 1994. P. 197-29.

100. Holsters M., Silva B., Van Vliet F., Genetello C., De Block M., Dhaese P., Depicker A., Inze D., Engler G., Villaroel R., Van Montagu., Shell J. The functional organization of the nopalin Ti plasmid pTi C58. Plasmid. 1980. V. 3.P. 212-230.

101. Horsch R.B., Fry J., Hoffmann N., Rogers S.G., Fralev R.T. A simple and general method for transferring genes into plants. // Science. 1985. V. 227. P. 1229-1231.

102. Howard E., Citovsky V., The emerging structure of the Agrobacterium T-DNA transfer complex. // Bio.Essays. V. 12. 1990. P. 103-108.

103. Huangz., Tan S., Kiwi fruit. // Fruit trees. 1990. P. 407-417.

104. Huang Y., Nordeen R.O., Di M., Owens L.D., Mc Beath J.H. Expression of an engineered cecropin gene cassette in transgenic tobacco plants confers disease resistance to Pseudomonas syringae pv.tabaci. II Phytotathology. V. 87. №.5. 1997. P. 494-499.

105. Huffman G.A., White F.F., Gordon M.P.,Nester E.W. Hairy root inducing plasmid: physical map and homology to tumor inducing plasmids. // J. Bact. V. 157. 1984. P. 269-76.

106. Hull R., Davies J.W. Genetic engineering with plant viruses and their potential as vectors. // Adv. Virus Res. 1983. V. 28. P. 1-33.

107. Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Kapur R., Boman G.H. Insect immunity: isolation and structure of Cecropin D and four minor antibacterial components from Cecropia pupal. II European Journal of Biochemistry. V. 127. P. 207-217.

108. Ingersoll J.L., Heutte T.M.,Owens L.D. Effect of promotor-leader sequences on transient expression of reporter gene chimeras biolisticallytransferred into sugar beet (Beta vulgaris) suspension cells. // Plant Cell Rep. 1996. V. 15. P. 836-840.

109. Jacq B., Lesobre O., Sangwan R.S., Sangwan-Norreel B.S. Factor influensing T-DNA transfer in Agrobacterium- mediated transformation of sugarbeet. // Plant Cell Reports. 1993. №.12. P. 621-624.

110. Jacq B., Tetu T., Sangwan R.S.,Laat A., Sangwan-Norreel B.S. Efficient production of uniform plant from cotyledon explant of sugarbeet (Beta vulgaris L.). //Plant Breeding. V. 110. 1993. P. 185-191.

111. Jacq B.,Tetu T., Sangwan R.S., De Laat A. Sangwan-Norreel B.S. Plant regeneration from sugarbeet (Beta vulgaris L.) hypocotyls culture in vitro and flow cytometric nuclear DNA analysis of regenerants. // Plant Cell Reports. V. 11. 1992. P. 329-333.

112. Jahne A., Becker D., Jorn H. Genetic engineering of cereal crop plants: a review. //Euphytica. 1995. V.85. P. 35-44.

113. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusions: p-glucuronidase as a sensitivi and versatile gene fusion marker in higher plants. // EMBO J. 1987. V.6. P.3301-3307.

114. Jin S., Komari T., Gordon M. P., Nester E. W. Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281. // J. Bacterid., V.169. 1987. P. 4417-4425.

115. Johnston S. A., Anziano P.Q., Shark K., Sanford J.C., Butow R.A. Mitochondrial transformation in Yeast by bombardment with microprojectiles. Science. V. 240. 1988. P. 1538-1541.

116. Jung C., Kleine M., Fisher F., Herrman R. A nalyses of DNA from a Beta procumbens chromosome fragment in sugar beet earring a gene for nematode resistance. // Theor. and Appl. Genet. 1990. V.79. №5. P. 663-672.

117. Kado C.I. Molecular mechanisms of crown gall tumorigenesis. // Grit. Revs. Plant Sci. 1991. V10. №.1. P. 1-32.

118. Kakutani T., Jeddeloh J.A., Flovers S.K., Munakata K. Richards E.J. Developmental Abnormalities and epimutations associated with DNA hypo-methylations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V.93. P. 12406-12411.

119. Kallerhoff J., Perez P., Bouzoubaa S., Ben Tahar S., Perret J. Beet necrotic yellow vein virus coat protein-mediated protection in sugarbeet Beta vulgaris L.) protoplast. // Plant Cell Reports. 1990. V. 9. P. 224-228.

120. Kiss E. Agressivity of sugar beet rootrot pathogenes.D. Method of breeding for resistance. // Acta Agr.Hung. 1965. V. 14. №. 3-4. P. 327.

121. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanferd J.C. High-velocity microinjectiles for deliveringnucleic acids into living cells. // Nature. 1987. V. 327. P. 7073.

122. Koenig R. Moglchkeiten zur gentechnischen erzeugung von virusresistenzin pflanzen. // Nachrichtenbl. Dtsch. Pflanzenschutzdienst. (BRD). 1988. V. 40. №. 6/7. P. 88-92.

123. Konez C., Schell J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 204. P 383-396.

124. Koukolikova-Nicola Z., Shillito R.D., Hohn B., Wang K., Van Montagu M., Zambryski P. Involvement of circular intermediates in the transfer of T-DNA from Agrobacterium tumefasiens to plant cells. // Nature. 1985. V. 313. P. 191-197.

125. Krens F.A., Jamar D. The role of explant source and culture conditions on callus induction and shoot regenerations in sugarbeet (Beta vulgaris L.). // J. Plant Physiol. V. 134. 1989. P. 651-655.

126. Krens F.A., Zijlsta C., Molen W.V. D.l. Transformation and regeneration in sugar beet (Beta vulgaris L.) induced by «shooter» mutants of Agrobacterium tumefaciens. //Euphytica. 1988.V.39. №.2. P. 185-194.

127. Kubalacova M. Somatic embryogenesis and cytoplasmic sterility in Beta vulgaris L. var. saccharifera. //Biol. Plant. V.32. 1990. №.6. P. 414-419.

128. Lawrence W.A., Davies D.R. A method for microinjection and culture of protoplasts at very low densities. // Plant Cell Reports. 1985. V. 4. P. 33-35.

129. Lawson C., Kaniewski W., Haley L. Engineering resistannce to mixed virus infection in a commercial potato cultivar: resistance to potato virus X and potato virus Y in transgenic Russet Burbanch. II Bio. Techn. 1990. V.8. P. 127-134.

130. Lee J-Y., Boman A., Chvanxin S., Andersson M., Jornvall H., Mutt V., Boman H.G. Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 86. 1989. P. 91599162.

131. Lepoivre P., Carels N. Selection of sugar beet calli to obtain plants resistant to Cercospora beticola. // Nuel. Techn. And vitro Cult. Plant. Improv. Proc.Int. Symp. (Vienna, 19-23 Aug. 1985). Vienna, 1986. P. 305-308.

132. Lindsey K and Jones M.G.K. Transient gene expression in electroporated protoplast and intact cell of sugarbeet. // Plant molecular biology. V. 10. 1987. P. 43-52.

133. Lindsey., Gallois P. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens. II J. Exp. Bot. 1990. V. 41. №.226. P. 529-536.

134. Lloid, G. and McCown, B., Int. Plant Prop. Soc. Proc., V. 30. 1981. P. 421.

135. Lyon B.R., Llewellyn D.J., Huppatz J.L., Dennis E.S., Peacock W.J. Expression of a bacterial gene in transgenic tobacco plants confers resistance to the herbicide 2,4- dichlorophenoxyacetic acid. //Plant.Mol. Biol. 1989. V. 13. P. 533-540.

136. Mahn A.,Matzk A., Sautter C., Schiemann J. Transient gene expression in shoot apical meristems of sugarbeet seedlings afters particle bombardment. // Journal of experimental botani. V. 46. №.291. 1995. P. 1625-1628.

137. Mann V., Harker M., Pecker I., Hirschberg J. Metabolic engineering of astaxanthin production in tobacco flowers. // Nature Biotechnology. V. 18. 2000. P. 888-892.

138. Malik V. S., Saroha M.K. Marker gene controversy in transgenic plants. // J. Plant Biochem. Biotechnol. 1999. V. 8. P. 1-13.

139. Mannerlof M., Lennerfors B-L., Terming P. Reduced titers of BNYVV in transgenic sugar beets expressing the BNYVV coat protein. Euphytica. V. 90. 1996. P. 293-299.

140. Martemyanov K. A., Shirin A.S., Gudkov A.T. Synthesis, cloning and expression of genes for antibacterial peptides: cecropin, magainin, and bombinin. // Biotechnology letters. V.18. №.12. 1996. P. 1357-1362.

141. Mason H.S., Lam D.-K., Arntzen C.J. Expression of hepatitis B Surface antigen in transgenic plants. // Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 1992. V. 89. P. 11745-11749.

142. Mason H.S., Tacket C.O., Richter L.J., Arntzen C.J., Subunit vaccines produced and delivered in transgenic plants as «Edible Vaccines». // Res. Immunol. 1998. V. 149. P. 71-74.

143. Meyer P., Niedenhof I., ten Lohuis M. Evidence for cytosine methylation of non symmetrical sequences in transgenic Petunia hybrida //EMBO J. 1994. V. 13. P.2084-2088.

144. Montoya A.L., Chilton M.D., Gordon M.P., Sciaky D., Nester E.W. Octopin and nopalin metabolism in Agrobacterium tumefaciens and crown gall tumor cells: role of plasmid genes. // J.Bacteriol. V. 129. 1977. P. 101107.

145. Moore K.S., Bevins C.L., Brasseur M.M., Tomassini N., Turner K., Eck H., Zasloff M. Antimicrobial peptides in the stomach of Xenopus laevis. // The Journal of Biological Chemistri. V. 266. №.29. 1991. P. 19851-19857.

146. Muller-Rober B., Sonnewald U., Willmitzer L. Inhibition of sugar-storing tubers and influences tuber formation and expression of tuber storage protein genes. // EMBO J. 1992. V. 14. P. 660-666.

147. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures. // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

148. Nagata T., Ocada K., Kawazu T., Takeve I. Cauliflower mosaic virus 35S promoter directs S phase specific expression in plant cells. // Mol. Gen. Genet. V. 207. 1987. P. 242-244.

149. Owens L.D., Eberts D.R. Sugarbeet leaf disc culture: an improved procedure for inducing morphogenesis. // Plant cell tussue and organ culture. V. 31. 1992. P. 195-201.

150. Paul H., Van Deelen J.E.M., Henken B., De Bosh Th.S.M., Lange

151. W.,Krens F.A. Expression in vitro of resistance to Heterodera schachtii in hairy roots of an alien monotelosomic addition plant of Beta vulgaris, transformed by Agrobacterium rhizogenes. //Euphytica. V. 48. 1990. P. 153-157.

152. Paul H., Zijlstra C., Leeuwangh J.E., Krens F.A., Huizing H.J. Reproduction of the beet cyst nematode Heterodera schachtii Schm. on transformed root cultures of Beta vulgaris L. // Plant Cell Reports. V. 6. 1987. P. 379-381.

153. Pena A., Lozz H., Shell J. Transgenic rye plants obtained by injection DNA into young floral tillers. // Nature. 1987. V. 325. P. 274-276.

154. Petit A., Tempe J., Kerr A., Holstes M., van Montagu M., Shell J. Substate induction of conjugative activity of Agrobacteium tumefaciensTi plasmid // Nature. 1978. V. 271. P. 570-572.

155. Poirier Y., Nawrath C., Somerville C. Production of polyhydroxyalka-noates, a family of biodegradable plastics and elastomers, in bacteria and plant. //Bio/Technology. 1995. V. 13. P. 142-150.

156. Harvey B.L., Downey R.K. The inheritance of erucic acid content in rape-seed (Brassica napus). II Can. J. Plant. Sci. 1964. V. 44. P. 104-111.

157. Pollock K., Bartield D.G., Robinson S.J., Shields R. Transformation of protoplast-derived cell colomies and suspension cultures by Agrobacterium tumefaciens. II Plant Cell. Rep. 1985. V. 4. P. 202-205.

158. Potrykus I., Spangenberg G. Gene transfer to plants. Berlin. Springer. 1995.

159. Rober M., Geider K., Muller-Rober B., Willmitzer L. Synthesis of fruc-tans in tubers of transgenic starch deficient potato plants does not result in an increased allocation of carbohydrates. // Planta. 1996. V. 199. P. 528-536.

160. Roberts E.W., Hancock and Roberts L. Cationic peptides: a new sourse of antibiotics. //Tibtech February. 1998. V. 16. P. 82-88.

161. Roussi I., Dubois F., Sangwan R. S., Sangwan-Norreel B.S. In planta 2,3,5-triiodobenzoic acid treatment promotes high frequency and routine in vitro regeneration of sugarbeet (Beta vulgaris L.) plants. // Plant Cell Reports. 1996. V. 16. P. 142-146.

162. Russel D.R., Wallace K.M., Bathe J.H., Martmell B.J., Mc Cabe D.E. Stable transformation of phaseolus vulgaris via electric-discharge mediated particle acceleration. // Plant Cell Rep. V. 12. 1993. P. 165-169.

163. Sambrooc J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. NY: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989.

164. Sanders P. R., Sammons B., Kaniewski W. Field resistance to transgenic tomatoes expressing the tobacco mosaic virus or tomato mosaic coat protein genes. //Phytopathol. 1992. V. 82. P. 683-690.

165. Sanders P.P.,Wamter J.A., Barnason A.R., Rogers S.G., Fraleuuy R.T. Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants. // Nucleic Acids Res. V. 15. 1987. P. 15431558.

166. Sato F., Hashimoto T., Hachiya A., Tamura K., Choi K., Morishige T., Fujimoto H., Yamada Y. Metabolic engineering of plant alkaloid biosynthesis. // PNAS. V. 98. №1. 2001. P. 367-372.

167. Sawahel W., Onde S., Knight C., Cove D. Transfer of foreigh DNA into Physcomitrellapatens protonemal tissue by using the gene gun. // Plant Mol. Biol. Rep. V. 10. 1992. P. 314-315.

168. Schlangstedt M., Hermans B.,Zoglauer K., Schieder O. Culture of sugar beet (Beta vulgaris L.) protoplasts in alginate-callus formation and root organogenesis. // J. Plant Physiol. 1992. V. 140. №3. P. 339-344.

169. Schmit F., Oakeley E.J., Jost J.P. Antibiotics induce genome-wide hyper-methylation in cultured Nicotiana tabacum plants. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 1534-1540.

170. Scott R.J., Draper J. Transformation of carrot tissues derived from proembryogenie suspension cells: A useful model system for gene expression snudies in plants. // Plant Mol. Biol. 1987. V. 8. P. 265-274.

171. Seki M., Shigemoto N., Komeda Y.,Imamura J., Yamada Y., Morikawa H. Transgenic Arabidopsis thaliana plants obtained by particle bombardment-mediated transformation. // Appl. Microbio. Biotech. V. 36. 1991. P. 228230.

172. Sharma A., Sharma R., Imamura M., Yamakawa M., Machii H. Transgenic expressionof cecropin B, antibacterial peptide from Bombyx mori, conters enhanced resistance to bacterial leaf blight rice. // FEBS Letters. V. 484. 2000. P. 7-11.

173. Shaw C.H., Watson M. D., Carter G.H. The right hand copy of the no-paline Ti- plasmid 25 bp. Repeat is required for tumor formation. // Nucleic Acids Res., V.12. 1984. P. 6031-6041.

174. Sheehy R.E., Kramer M.K., Hiatt W.R. Reduction of polygalacturonase activity in tomato fruit by antisense RNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V.85. P. 8805-8809.

175. Sheikholeslam S.N., Weeks D.P. Acetosyrengone promotes high efficiency transformation of Arabidopsis thaliana explants by Agrobacterium tumefaciens.il Plant. Mol. Biol. 1987. V.8. P. 291-298.

176. Sheng J.S., Citovsky V.V. Agrobacterium plant-cell DNA transport have virulence proteins, will travel. // Plant Cell. 1996. V.8. №10. P.1699-1710.

177. Slater A., Fowler M.R., Kirby M., Scott N.W., Elliott M.C. Strategies for manipulation of sugar beet storage organ morphology. // Biotech-nol.Biotechnol. V.8. №3. 1994. P. 32-36.

178. Slater A., Scott N.W., Elliott M.C. Molecular tools for beet biotechnology.// Biotechnol.Biotechnol. V. 8. №3. 1994. P. 23-26.

179. Smith F.D., Harpending P.R., Sanford J.C. Biolistic transformation of procaryotes: factors affecting biolistic transformation of veri small cells. // J. Gen. Microbiol. V. 138. 1992. P. 239-248.

180. Southern E.M. Detection of specific sequences amond DNA fragments separated by gel electrophoresis. // J. Mol. Biol. 1975, V. 98. P. 503-517.

181. Spena A.,Hain R., Ziervogel V., Saedler H., Shell J. Construction of a heat-inducible gene for plants. Demonstration of heat-inducible activity of the Drosofilct hsp 70 promoter in plants. // EMBO J. 1985. V4. P. 27392743.

182. Stachel S.E., Messens., Van Montagu M., Zambryski P.C. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. //Nature. 1985. V. 318. P. 624-629.

183. Stachel S.E., Nester E.W.,Zambryski P.C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 83. 1986. P. 379-383.

184. Stalker D.M., McBride K.E., Malyi L.D. Herbicide resistance in transgenic plants expressing abacterial detoxification gene. // Science. 1988. V. 242. P. 419-423.

185. Stated A., Scott N.W., Elliot M.C. Molecular tools for beet biotechnology. //Biotechnol./Biotechnol. V. 8. № 3. 1994. P. 23-26.

186. Steinbiss H., Stabel P. Protoplast derived tobacco cells can survive capillart microinjection of fluorescent dye Lucifer Yellow. // Protoplasma. 1985. V. 16. P. 223-227.

187. Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity. // Nature. V. 292. №.5820. 1981. P. 246-248.

188. Stenman J.,Finne P., Stahls A., Grenman R., Stenman U.-H., Palotie A., Orpana A. Accurate determination of relative messenger RNA levels by RT-PCR. //Nature. Biotech. 1999. V. 17. P. 720-723.

189. Strittmatter G., Janssens J., Opsomer C., Botterman J. Inhibition of fungal disease development in plants by engineering controlled cell death. // Bio/ Technology. 1995. V. 13. P. 1085-1089.

190. Tavladoraki P., Benvenuto E., Frinca S., De Martinis D., Cattaneo A., Galeffi P. Transgenic plants expressing a functional singl-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack. // Nature. 1993. V. 366. P. 469472.

191. Tetu T., Sangwan R.S., Sangwan-Norrel B.S. Hormonal control of organogenesis and somatic embriogenesis in Beta vulgaris callus. // J. Exp. Bot. 1987. V. 38. P. 506-517.

192. Thomas H. Biotechnological advances in sugar-beet research. // Biopapers Journal july/august. 1991. P. 14-17.

193. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes. // Trend in plant science. V.l. 1996. P. 178-184.

194. Topfer R., Matzeit V., Gronenborn B., Schell J., Steinbiss H. A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions. // Nucl. Acids Res. 1987. Vol. 15. P. 5890.

195. Trifonova A., Atanassov A. Genetic transformation of sugar beet by Agrobacterium rhizogenes. //Biotechnol/Biotechnol. V. 9. №.2. 1995. P. 23-26.

196. Usami S., Morikawa S., Takedo J., Machida Y. Absence in monocotyledonous plants of the diffusible plant factors inducing T-DNA circularization and vir gene expression in Agrobacterium. //Mol. Gen. Genet. 1987. V. 209. P. 221-226.

197. Usami S., Okamoto S., Takebe I., Machida Y., Factor indusing Agrobacterium tumefaciens vir gene expression is present in monocotyledonous plants .// Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1988. V. 85. №.11. P. 3748-3752.

198. Voelker T.A., Worrell A.C., Anderson L., Bleibaum J., Fan C., Hawkins D.J., Radke S.E., Davies H.M. Fatty acid biosynthesis redirekted to medium chaiins iin transgenic oilseed plant. // Science. 1992. V. 257. P. 72-74.

199. Watad A.A., Yun D.-J., Matsumoto T et al. Microprojectile bombardment-mediated transformation of Lilium longiflorum. II Plant Cell Reports. 1988. V. 17. P. 262-267.

200. Watts J. W., King J.M., Stacey N.J. Inoculation of protoplast with viruses by electroporation. // Virology. 1987. V. 157. N1. P. 40-46.

201. White F.F., Nester E.W. Hairy root: encodes virulence traits in Agrobacterium rhizogenes in transferred to and expressed in axenic hairy root tissue. // Mol Gen. Genet. 1982. V. 186. P. 16-221 -I -11J J)

202. Wozniac C.A. and Owens L.D. Use of B-Glucuronidase (GUS) as a marker for transformation in sugarbeet. // Journal of sugar beet research. V.30. №4. 1993. P. 299-315.

203. Yamasaki Y. and Konno H. Beta vulgaris L,(Sugar beet): in vitro culture and the production of glucosidases. Biotechnology in agriculture and forestry. 28 Medicinal and Aromatic Plant 7 (eg. by Y.P.S. Bajaj). SpringerVerlag-Berlin-Heidelberg. 1994.

204. Ye G.N., Stone D., Pang S.-Z., Creely W., Gonzalez K., Hinchee M. Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta Vacuum infiltration transformation. // Plant J. 1999. V. 19. P. 249-257.

205. Yun D.-J., Hashimoto T., Yamada Y. Metabolic engineering of medicinal plants: transgenic Atropa belladonna with an improved alkaloid composition. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.89. 1992. P. 11799-11803.

206. Zambryski P., Joos N., Genetello C., Leemans J., Van Montagu., Shell J. Ti-plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. // EMBO J. 1983. V. 2. P. 2143-2150.

207. Zhang C.L., Chen D.F., MeCormac A.C., Scott N.W., Elliot M.C., Slater A. Use of GFP reporter as a vital marker for Agrobacterium mediated transformation of sugar beet (Beta vulgaris L.). Il Mol. Biotechnol. 2001. V. 17. №.2. P. 109-17.

208. Kunik T., Tzfira T., Kapulnik Y., Grafiii Y., Dingwall C., Citovski V. Genetic transformation of Hela cell by Agrobacterium.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001 V.98. P. 1871-1876.1341. БЛАГОДАРНОСТИ

209. Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю Ярославу Ивановичу Бурьянову за консультации, внимание и непосредственную помощь в работе.