Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование 3'-нетранслируемой области вируса некротического пожелтения жилок свеклы в качестве индуктора устойчивости к ризомании

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Использование 3'-нетранслируемой области вируса некротического пожелтения жилок свеклы в качестве индуктора устойчивости к ризомании"

На правах рукописи

Виноградова Светлана Владимировна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ З'-НЕТРАНСЛИРУЕМОЙ ОБЛАСТИ ВИРУСА НЕКРОТИЧЕСКОГО ПОЖЕЛТЕНИЯ ЖИЛОК СВЕКЛЫ В КАЧЕСТВЕ ИНДУКТОРА УСТОЙЧИВОСТИ К РИЗОМАНИИ

03.01.03 — молекулярная биология

2 6 апр ш

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2012

005019215

005019215

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центре «Биоинженерия» Российской академии наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Аграновский Алексей Анатольевич,

кандидат биологических наук Камионская Анастасия Михайловна

Официальные оппоненты:

Карпова Ольга Вячеславовна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова", биологический факультет, профессор кафедры вирусологии

Долгов Сергей Владимирович, доктор биологических наук, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, заведующий лабораторией генной инженерии растений.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 24 мая 2012 года в /'/час, на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан 19 апреля 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В мировой практике рентабельность выращивания сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) во многом зависит от эффективности борьбы с болезнями и вредителями этой культуры. Сахарная свекла поражается рядом вирусных заболеваний, из которых наиболее экономически значимыми являются ризомания (вызываемая вирусом некротического пожелтения жилок свеклы -Beet necrotic yellow vein benyvirus, BNYVV) и желтуха (Beet yellows closterovirus, BYV). Ризомания регистрировалась практически во всех районах возделывания культуры в Старом и Новом Свете (McGrann et al., 2009). При поражении ризоманией сахаристость корнеплодов снижается от 8% до 50-60% (Asher, 1993), а снижение урожайности может достигать 30-90% (Johanson, 1985).

Успех борьбы с ризоманией зависит от создания устойчивых сортов, гибридов и линий, в том числе полученных путем внедрения источников устойчивости к BNYVV генно-инженерными методами.

Экспрессия в растениях фрагментов З'-нетранслируемой области (З'-НТО) вирусных РНК геномов имеет определенные преимущества, поскольку вирусные РНК стабильны в течение короткого времени и не являются иммуногенами. З'-НТО BNYVV представляет интерес в качестве нового индуктора устойчивости к ризомании на основе посттранскрипционного умолкания генов или сайленсинга (post-transcriptional gene silencing, PTGS). Для индуцирования сайленсинга часто используют трансгенную экспрессию шпилечной или двунитчатой РНК (Hamilton et al., 1998; Chuang and Meyerowitz, 2000; Johansen and Carrington, 2001). Шпилечные конструкции, содержащие фрагменты вирусного генома, применялись ранее для создания трансгенных растений сахарной свеклы, томата, огурца и дыни, лайма (Lennefors et al., 2006; Fuentes et al., 2006; Pandolfini et al., 2003; Leibman et al., 2011; Lopez et al., 2010). Было показано, что устойчивость в этих случаях индуцируется благодаря

PTGS, что подтверждается присутствием в трансгенных растениях siPHK. В настоящей работе мы сравнивали устойчивость модельных трансгенных растений Nicotiana benthamiana, экспрессирующих двунитчатую форму З'-НТО генома BNYVV, и растений, экспрессирующих мРНК гена белка оболочки (БО) этого вируса.

Цель и задачи работы

Целью работы было изучение З'-НТО генома BNYVV в качестве индуктора PTGS и устойчивости к ризомании в трансгенных растениях.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. конструирование бинарных векторов, обеспечивающих экспрессию в растениях инвертированных повторов З'-НТО BNYVV, формирующих шпилечную структуру (BNYVVsil), или мРНК гена БО (BNYWcp);

2. оценка подавления транзиентной экспрессии «мишени» (ген GFP, несущий З'-НТО BNYVV) за счет индукции PTGS транскриптом BNYWsil в растениях N. benthamiana;

3. получение трансгенных растений N. benthamiana, экспрессирующих одновременно BNYVVsil (или BNYVVcp) и ген bar, обеспечивающий устойчивость к гербициду BASTA;

4. определение уровня устойчивости к BNYVV трансгенных растений гомозиготного поколения Т2.

Научная новизна

Создана конструкция, несущая ген bar устойчивости к гербициду BASTA, и инвертированные повторы фрагментов З'-НТО BNYW (BNYVVsil), индуцирующие сайленсинг в растениях. Эффективность этой конструкции для индукции PTGS показана с помощью метода транзиентной коэкспрессии конструкций «мишени» (ген GFP, несущий З'-НТО BNYVV) и «индуктора» BNYVVsil.

Впервые получены трансгенные растения N. benthamiana, в которых подтверждена экспрессия трансгенной вставки в поколениях Т0 и Т2. В трансгенных растениях Т2 доказана индукция PTGS при транзиентной экспрессии «мишени» (ген GFP - З'-НТО BNYYV).

Проведена оценка устойчивости трансгенных растений поколения Т2 к механической инокуляции BNYVV. Растения Т2 BNYVVsil проявляли толерантность к инфекции BNYYV, симптомы вирусной инфекции развивались на них с задержкой. Таким образом, подтверждена возможность использования BNYVVsil как потенциального источника устойчивости к ризомании в растениях сахарной свеклы.

Практическая значимость

На модели растений N. benthamiana показана возможность получения трансгенов, сочетающих признаки устойчивости к гербициду и вирусной инфекции. Толерантность к ризомании была основана на стабильной экспрессии в растениях двунитчатых форм З'-НТО BNYVV. Экспрессия в модельных трансгенных растениях двух кДНК, введенных с помощью одного бинарного вектора, показывает возможность получения трансгенных растений сахарной свеклы, несущих два ценных признака — устойчивость к гербициду и к инфекции BNYVV.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на Международной конференции «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва-Звенигород, 2011), XXIV Зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2012 г), «9th International congress of plant pathology» (Турин, Италия, 2008), 4th International Conference and Exhibition «RNAi2009: ncRNA: Bridging Biology and Therapy» (Оксфорд, Великобритания, 2009), 3rd International Symposium on Plant Protection and Plant Health in Europe (Берлин,

Германия, 2009), Inernational Conference «Plant transformation technologies II» (Вена, Австрия, 2011).

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе две статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и включают 56 рисунков и 5 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы из 250 источников и приложения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Конструирование бинарных векторов, содержащих кДНК фрагменты

генома BNYVV

Бинарные конструкции были задуманы таким образом, чтобы в трансгенных растениях экспрессировались две целевых вставки, каждая под контролем независимого 35S промотора. Во всех конструкциях использовали ген bar, обеспечивающий устойчивость к гербициду BASTA. Конструкция pBI_BAR_BNYVVsil (Рис. 1А), содержала кДНК фрагмента З'-НТО BNYVV (геномные позиции 4427-4613, GenBank Х73476.1), в прямой и обратной ориентации, разделенные интроном ubil. Конструкция pBI_BAR_BNYVVcp содержала ген БО BNYW (Рис. 1Б). Секвенирование кассет экспрессии не обнаружило замен в нуклеотидной последовательности.

А

RB 35S BAR NOS-T 35S BNYVVsil INTR BNYVVsil' NOS-T LB

Б

RB 35S BAR NOS-T 35S BNYVVcp NOS-T LB

Рис. 1. Структура кассеты экспрессии плазмид pBI_BAR_BNYVVsil (А) и pBI_BAR_BNYVVcp (Б). RB и LB - правая и левая границы Т-ДНК; 35S - промотор вируса мозаики цветной капусты; bar - ген фосфинотрицинацетилтрансферазы Streptomyces hygroscopicus; NOS-T - терминатор гена нопапинсинтетазы; BNYVVsil - кДНК З'-НТО геномной РНК BNYVV; INTR - интрон гена кукурузы ubil; BNYVVsil' - кДНК комплементарной последовательности З'-НТО BNYVV; BNYVVcp - кДНК гена БО BNYVV.

Для оценки индукции сайленсинга экспресс-методом фрагмент З'-НТО BNYVV был клонирован в конструкцию pNR_GFP (любезно предоставленную Н.В. Равиным). Полученная плазмида pNR_GFP_BNYVVsil (Рис. 2) содержала ген GFP, несущий на 3'-конце НТО BNYVV («последовательность-мишень» для сайленсинга).

RB 35S AMV GFP INTR BNYVVsil NOS-T LB

_H_H>4

Рис. 2. Структура кассеты экспрессии плазмиды pNR_GFP_BNYVVsil. RB и LB -правая и левая границы Т-ДНК; 35S - промотор; NOS-T - терминатор гена нопапинсинтетазы; BNYVVsil - кДНК З'-НТО РНК BNYVV; AMV - трансляционный энхансер РНК-4 вируса мозаики люцерны; GFP - ген зеленого флуоресцентного белка; INTR - последовательность интрона гена Psk7 из Petunia hybrida (GenBank AJ224165).

Экспресс-оценка индукции сайленсинга фрагментом ЬШУУУвН с помощью транзиентной экспрессии в растениях N. ЪеЫЪлтшпа дикого типа

Для быстрой оценки эффективности созданных конструкций как индукторов сайленсига мы экспрессировали в растениях N. ЬемИапиапа дикого типа конструкцию-мишень (р1\'Я СРР_ВЫУ\/\/8П) и конструкцию-индуктор (рВ1_ВАК_ВЫУУУ811). На третий день после агроинокуляции наблюдали значительное снижение свечения вИР при одновременной экспрессии мишени и индуктора РТС$ (Рис. 3).

+

СРР вгчууувн

Рис. 3. Визуальная оценка транзиентной экспрессии мишени (pNR_GFP_BNYVVsil) и индуктора сайленсинга (pBI_BAR_BNYVVsil) по флуоресценции ОРР в листе.

Снижение экспрессии ОБР при совместной экспрессии мишени и индуктора было подтверждено Вестерн блот анализом (Рис. 4).

Лист 1 Лист 2 Лист 3

1

5

Рис. 4. Вестерн блот анализ суммарного белка, выделенного из областей листьев, инфильтрированных мишенью и индуктором (1, 3, 5) или только мишенью (2, 4, 6). Блот проявляли поликлональной антисывороткой к ОИР (первичные антитела) и конъюгатом антикроличьих с пероксидазой хрена.

Количественное измерение флуоресценции GFP показало снижение экспрессии примерно в 30 раз при одновременной инфильтрации мишени и индуктора (Рис. 5).

7000 60 00 5000 4000 3000 2000 1000 о

Рис. 5. Интенсивность флуоресценции GFP при транзиентной экспрессии мишени и индуктора сайленсинга (pNR_GFP_BNYVVsiI + pBI_BAR_BNYVVsil) (I); мишени pNR_GFP_BNYVVsil (2).

Результаты оценки экспресс-методом свидетельствуют о том, что конструкция-индуктор pBI_BAR_BNYVVsil имеет значительный потенциал как индуктор РНК сайленсинга in vivo.

Получение трансгенных растений N. beníhamiana, несущих кДНК фрагменты генома BNYVV

На первом этапе получения трансгенных растений подбирали концентрацию селективного агента в питательной среде для дальнейшей селекции трансформантов. В качестве селективного агента использовали фосфинотрицин (действующее вещество гербицида BASTA). Таким образом, ген bar устойчивости к гербициду, введенный в бинарный вектор, служил также для селекции трансформантов. Для отбора трансгенных растений оптимальная концентрация фосфинотрицина в питательной среде составила 4 мг/л.

На следующем этапе осуществляли трансформацию N. benthamiana штаммом A. tumefaciens GV3101, содержащим вектор рВ IB AR_B N Y V Vcp или pBIBARBNYVVsil. Через две недели после высаживания на селективную среду было отобрано 23 растения, трансформированных конструкцией

pBI_BAR_BNYVVcp, и два растения, трансформированных конструкцией pBIBARBNYVVsil.

Для идентификации растений, содержащих в геноме ген bar и BNYVV-специфические кДНК, трансформанты N. benthamiana проверяли с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для кодирующей области гена bar, BNYVVsil и BNYVVcp. Наличие гена bar и BNYVVcp показано в геноме 23 растений, а гена bar и BNYVVsil - в геноме двух растений, т.е. всех трансформантов, отобранных на первом этапе. Контаминация A. tumefaciens в этих растениях не выявлялась. Пять трансгенов со вставкой BNYVVcp (линии 4, 11, 16, 18, 19), и два со вставкой BNYVVsil (линии 126 и 139), отобрали для проведения дальнейшего анализа.

Анализ экспрессии трансгенной вставки в N. benthamiana поколения Т0

Трансгенные растения анализировали методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к BNYVVcp и BNYVVsil. Экспрессия трансгенной РНК была подтверждена в линиях 4, 11, 16, 18, 19 (bar - BNYVVcp), и в линиях 126 и 139 (bar - BNYVVsil) (Рис. 6). А Б

500( 300.

350 п.н.

S

500,

300, —

mm яшшт

фф т»< IЩ§ §§

200 п.н.

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7

В

500,

300, TZZ

"¡почить 140 п.н.

Wb 1Ш ив "**"—" ттш ЩЯШ^ %;r- Щн» ......* - ~

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рис. 6. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к гену bar (трансформанты pBI_BAR_BNYVVsil) (A); BNYVVsil (Б) и BNYVVcp (В). 1 - маркер молекулярной массы; 2 - проба ОТ-ПЦР без РНК. А: 3, 4 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из трансформантов 126 и 139; 5 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из растений дикого типа; 6 - ПЦР с плазмидной ДНК pBI_BAR_BNYVVsil. Б: 3 - ОТ-ПЦР с

суммарной РНК из растения дикого типа; 4, 5 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из трансформированных растений линий 126 и 139; 6 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из инфицированного BNYVV растения; 7 - ПЦР с плазмидной ДНК pBI_BAR_BNYVVsil. В: 3 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из растения дикого типа; 4-8 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из трансформированных растений линий 4, 11, 16, 18, 19; 9 - ПЦР с плазмидной ДНК pBI_BAR_BNYVVcp.

Экспрессию фосфинотрицинацетилтрансферазы (PAT; продукт гена bar) в трансгенных растениях также анализировали с помощью иммуно-биохимического теста. Экспрессия PAT была подтверждена в пяти трансформантах pBI_BAR_BNYWcp и в двух трансформантах pBI_BAR_BNYVVsil (Рис. 7).

PAT

Рис. 7. Иммунохроматографический анализ экспрессии PAT в трансгенных растениях N. benthamiana поколения Т0. Экстракты листьев: (1) N. benthamiana дикого типа; (2-6) трансформантов pBI_BAR_BNYVVcp линий 4, 11, 16, 18, 19, соответственно; (7 и 8) трансформантов pBI_BAR_BNYVVsil линий 126 и 139.

Оценка индукции сайленсинга фрагментом BNYWsil с помощью транзиентной экспрессии в трансгенных растениях N. benthamiana поколения Т0

Для оценки эффективности BNYWsil в качестве индуктора PTGS in vivo, трансгенные растения поколения Т0, несущие вставку BNYWsil, агроинокулировали «мишенью» PTGS pNR_GFP_BNYVVsil. На третий день анализировали уровень экспрессии GFP методом Вестерн блот анализа. Было показано снижение экспрессии GFP в трансгенных растениях То, инфильтрированных конструкцией-мишенью, в 2,5-3 раза по сравнению с контрольными растениями дикого типа (Рис. 8).

_ j J I У п d ■■■■■■II

1 2 3 4 5 6 7 8

Экстракт трансгенного Экстракт растения

растения дикого типа

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 8. Определение уровня экспрессии СРР с помощью Вестерн блот анализа. (1-3) -разведения суммарного белка, выделенного после экспрессии «мишени» рЫ11_ОРР_1Ш¥УУ5Н в трансгенном растении (без разведения, 1:5; 1:20); (4) - суммарный белок, выделенный после агроинфильтрации трансгенного растения рЫЯ_СРР; (5-7) -разведения суммарного белка, выделенного после экспрессии р^_ОРР_ВКУУУ8Й в растении дикого типа; (8) - белок, выделенный после агроинфильтрации растения дикого типа pNR_GFP. Блот проявляли поликлонапьной антисывороткой к вРР (первичные антитела) и конъюгатом антикроличьих с пероксидазой хрена.

Получение и анализ трансгенных растений № ЬеШИатгапа поколения Т, и Т2

От трансгенных растений ВЫУУУзП и ВЫУУУср поколения 1 о получали семена Т, и высаживали на селективную питательную среду. По расщеплению популяции Т1 определяли количество трансгенных вставок в поколении Т0 (Таблица 1).

Таблица 1. Расщепление популяции трансгенных проростков поколения Т,

Количество Количество

Трансгенная линия устойчивых к фосфинотрицину неустойчивых к фосфинотрицину Предполагаемое расщепление 2 * X факт

проростков проростков

4 23 477 15 1 2,89

И 29 471 15 1 0,17

ВОТУУср 16 39 461 15 1 2,05

18 25 475 15 1 1,85

19 9 491 63 1 0,14

ВОТУУвП 126 5 495 63 1 1,03

139 124 376 3:1 0,01

* X2 Факт - фактическое значение критерия Теоретическое значение ус для каждой выборки 3,84.

Расщепление 3:1 в популяции поколения Т1 указывает на наличие одиночной трансгенной вставки в Т0, расщепление 15:1 - двух трансгенных вставок, 63:1 - трех трансгенных вставок. Таким образом, можно предположить, что линии ВЫУУУср-4, 11, 16, 18 несут две трансгенных

вставки, линии ВЫУУУср-19 и ВЫУУУ5П-126 - три вставки, а линия ВЫ У V 139 - одну вставку.

Растения Ть устойчивые к фосфинотрицину, адаптировали к тепличным условиям и получали гомозиготное поколение Т2. Для дальнейшей работы были отобраны две гомозиготные линии со вставкой ВЫУУУэЛ - 126.4 и 139.17, и пять гомозиготных линий со вставкой ВЫУУУср - 4.15, 11.24, 16.5, 18.17 и 19.5.

Анализ экспрессии трансгенной РНК проводили методом ОТ-ПЦР. В линиях 126.4 и 139.17 была подтверждена экспрессия ВЫУУУвП (Рис. 9А), а в линиях 4.15, 11.2, 16.5, 18.17 и 19.5-ВЫУУУср (Рис. 9Б).

А Б

Рис. 9. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к BNYVVsil (А) и BNYVVcp (Б). 1 - маркер молекулярной массы; 2 - ПЦР в отсутствие матрицы; 3 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из растений дикого типа; А: 4, 5 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из трансформантов 126.4 и 139.17, соответственно; 6 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из растения, инфицированного BNYVV. Б: 4-8 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из трансформантов 4.15, 11.24, 16.5, 18.17 и 19.5, соответственно; 9 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из растения, инфицированного BNYVV.

Экспрессия PAT была подтверждена во всех трансгенных линиях поколения Тг с помощью иммуно-биохимического теста (не показано).

Таким образом, нами были получены трансгенные растения N. benthamiana BNYVVsil и BNYVVcp поколения Т2, стабильно экспрессирующие вирус-специфические РНК - З'-НТО и ген БО BNYVV, соответственно - и ген PAT.

Анализ устойчивости трансгенных растений N. benthamiana поколения Т2 к механической инокуляции BNYVV

Устойчивость трансгенных растений изучали с помощью механической

инокуляции BNYVV (изолят Je-09) 12 растений каждой линии. Через 7 дней

после инокуляции (д.п.и.) проводили полуколичественное определение РНК

13

ВЫУУУ в трансгенах и растениях N. ЬепЛат1апа дикого типа методом ОТ-ПЦР, который позволил обнаружить растения с достаточно высокой концентрацией вирусной РНК (Рис. 10). Анализ этих растений с помощью сэндвич-ИФА с поликлональной антисывороткой к ВЫУУУ не выявил вирус в экстрактах. Очевидно, низкие концентрации вируса, накапливающиеся через неделю после инокуляции, находятся вне пределов чувствительности ИФА.

А

200>

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Б

2001

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Рис. 10. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к геному BNYVV, на матрице суммарной РНК из трансгенных растений N. benthamiana поколения Тг. 1 - маркер молекулярной массы ДНК; 2 - проба ОТ-ПЦР без РНК; (А) 3 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из здорового растения N. benthamiana; 4-15 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из инокулированных BNYVV растений N. benthamiana дикого типа; 16 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из инфицированного BNYVV растения С. quinoa. (Б) 3-14 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из инокулированных BNYVV трансгенных растений N. benthamiana линии BNYVVsil 126.4; 15 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК из инфицированного BNYVV растения С. quinoa. Электрофореграммы подвергались сканированию и обработке количественных данных по интенсивности полос с использованием программы TINA 2.0.

Результаты ОТ-ПЦР анализа эффективности заражения вирусом линий BNYVVsil-126.4 и BNYVVsil-139.17, а также нескольких трансгенных линий Т2 BNYVVcp приведены на Рис. 11. Подсчитывая процент инфицированных от общего числа инокулированных растений, условно незараженными считали растения, для суммарной РНК которых интенсивность специфичной полосы в ОТ-ПЦР была в четыре и более раз слабее, чем в инфицированном контроле. Линии BNYVVsil-126.4 и BNYVVcp-4.15 показывали наиболее значительное снижение процента зараженных растений по сравнению с контролем (Рис. 11).

Среди остальных линий, экспрессирующих мРНК БО ВЫУУУ, через неделю после инокуляции количество инфицированных растений было сравнимо с контролем (11.24, 16.15) или даже превышало контроль (линия 19.5) (Рис. 11).

ВОТУУср

% 100

зараженных растений 80

60

40

20

0

—

гп гп

126.4

139.17

4.15

11.24

16.15

18.17

19.5

Рис. 11. Количество зараженных растений трансгенных растений N. ЬепЛатгапа на 7 д.п.и. ЕИЧУУУ (% от общего количества инокулированных растений каждой линии)

Через 14 д.п.и. растения анализировали методом сэндвич-ИФА с поликлональной антисывороткой к ВКУУУ (Рис. 12А). По результатам анализа можно выделить линию ВМУУУвИ-126.4, для которой наблюдали статистически достоверное снижение концентрации вируса по сравнению с контрольными растениями. Среднее значение титра вируса было приблизительно в два раза меньше в растениях линии ВКУУУбИ- 126.4, чем в контроле (Рис. 12А). Количество инфицированных растений в этой линии было на 34% меньше, чем в контроле (Рис. 12Б). Инфицированными считали растения, при анализе экстракта которых в ИФА значения ОГ)4о5 двукратно превышали СГО405 Для здорового растения. Количество инфицированных растений трансгенных линий ВМУУУср-4.15, 11.24 и 19.5 было несколько меньше, чем в контроле (снижение на 9-25%).

А

OD«

BNYVVsil

BNYVYcp

"N /—

Интервал

OÜ405

К 126.4 139.17 4.15 11.24 16.5 18.17

0,214),68 0,18-0,42 0,26-0,50 0,20-0,52 0,19-0,61 0,21-0,81 0,22-0,61

% 100 зараженных 90 растений 80 70 60 50 40 30 20 10 О

BNYjVVsil

BNYVVcp

4.15

Рис. 12. Анализ ВКУУУ в трансгенных растениях N. ЬешИатгапа поколения Т2 методом ИФА (14 д.п.и.). К - инокулированные ВИУУУ растения дикого типа; 126.4, 139.17 - инокулированные растения ВМУУУзИ; 4.15, 11.24, 16.5, 18.17 и 19.5 - инокулированные растения BNYVVcp. А: Столбец диаграммы соответствует значению 00<ю5 для экстракта каждого инокулированного растения. Значения ОВ405 для экстрактов здоровых растений составляли 0,08-0,09. Б: Количество зараженных растений (% от общего количества инокулированных растений линии).

Визуальные симптомы инфекции BNYVV проявлялись на 18-21 д.п.и. (Рис. 13). Через 21 д.п.и. проводили визуальную оценку степени пораженности растений по двум критериям: гофрированность листа и мозаика листа. Симптомы инфекции у трансгенных растений BNYVVsil были менее выражены, чем у контрольных растений. По сравнению с контролем, наиболее слабое развитие симптомов гофрированности и мозаики листьев наблюдалось на растениях линий BNYVVsil-126.4 и BNYVVcp-4.15 (Табл. 2). Выраженность симптомов на линиях BNYVVcp-11.24, 16.5 и 19.5 не отличалась от контроля

(Табл. 2). Эти наблюдения не противоречат оценке титра вируса на 14 д.п.и. (Рис. 12).

Рис. 13. Симптомы ВИУУУ на контрольных и трансгенных растениях N. Ьешкат1апа на 21 д.п.и. (1) здоровое ВЫУУУ растение N. ЬешИапиапа дикого типа; (2) инокулированное ВИУУУ растение N. Ьшкапйапа дикого типа; (3-9) ипокулированные ВЫУУУ трансгенные растения: (3) ВИУУУср-16.5; (4) ВЫУУУвН-Ш. 17; (5) ВЫУУУср-4.15; (6) ВМУУУср-18.17; (7) ВЫУУУср-11.24; (8) ВЫУУУм1-126.4; (9) В1ЧУУУср-19.5.

По результатам ИФА, на 21 д.п.и. тестируемые растения всех линий ВМУУУвП и ВИУУУср содержали вирус (Рис. 14). При этом наименьший титр вируса по сравнению с контролем был в линиях BNYVVsil-139.17 и ВЫУУУср-19.5 (Рис. 14).

01Ъ

ВОТУУвН

BNYVVcp

126.4 139.17

11.24

18.17

19.5

Рис. 14. Анализ ВЫУУУ в трансгенных растениях N. ЬетИатгапа поколения Тг методом ИФА через 21 д.п.и. Столбец диаграммы соответствует значению СЮ405 для экстракта каждого инокулированного растения. Значения СЮ405 для экстрактов здоровых растений составляли 0,10-0,11. К - инокулированные ВЫУУУ растения дикого типа; 126.4, 139.17 - инокулированные ВОТУУ трансгенные растения ВЫУУУхП; 4.15, 11.24, 16.5, 18.17, 19.5 - инокулированные ВЫУУУ трансгенные растения BNYVVcp.

На 28 д.п.и. растения трансгенных линий ВМУУУвП-126.4 и ВКУУУвН-139.17 также показывали достоверно меньшее развитие симптомов (Табл. 2), однако вирус выявлялся в этих растениях с помощью ИФА (данные не показаны). Линии ВЫУУУср на 28 д.п.и. не отличались от контроля по интенсивности симптомов (Табл. 2). Эти растения также содержали вирус, выявляемый ИФА.

Суммируя данные наблюдений за инокулированными трансгенными растениями, можно выделить линию ВНУУУвИ-126.4, которая проявляла наибольшую устойчивость к инфекции ВИУУУ в условиях механической передачи вируса. Количество зараженных растений этой линии на 7 и 14 д.п.и. было, соответственно, на 42% и 34% меньше, чем в контроле. Кроме того, в зараженных растениях ВМУУУз11-126.4 титр вируса был примерно в два раза ниже, чем в контроле и в других трансгенных линиях. Из всех тестированных растений, симптомы вирусной инфекции были наиболее мягкими на растениях линии ВМУУУбП- 126.4 в течение 28 д.п.и. Линия ВЫУУУбП-Ш.П также проявляла определенную толерантность к вирусной инфекции.

Таблица 2. Визуальная оценка симптомов инфекции BNYVV на 21 и 28 д.п.и.

21 д.п.и. 28 д.п.и.

Линия Мозаика Гофрированность Мозаика Гофрированность

листьев листьев листьев листьев

Контроль 0/10/2* 0/12/0 0/9/3 0/9/3

126.4** 8/3/1 7/5/0 5/7/0 0/12/0

139.17 2/8/2 1/7/4 2/10/0 0/12/0

4.15 7/3/2 . 3/9/0 4/7/1 1/10/1

11.24 4/8/0 1/10/1 2/10/0 0/11/1

16.5 0/4/8 0/10/2 0/11/1 0/8/4

18.17 0/3/9 0/5/7 0/11/1 0/11/1

19.5 2/3/7 0/12/0 1/11/0 0/12/0

♦Количество растений - без симптомов вирусной инфекции / со средне выраженными симптомами / с сильно выраженными симптомами.

**Клетки таблицы, выделенные фоном - наиболее выраженное ослабление симптомов по сравнению с контролем.

По-видимому, толерантность к BNYVV в линиях, экспрессирующих BNYVVsil, была обусловлена индукцией механизма PTGS. Различие степени толерантности BNYVVsil-126.4 и BNYVVsil-139.17 может отражать количество трансгенных вставок в этих линиях (Табл. 1). Ранее была показана зависимость уровня устойчивости трансгенных растений к различным вирусам от количества вставок в геноме и накопления трансгенного транскрипта в клетках (Goodwin et al., 1996; Pang et al., 1996; McDonald et al., 1997; Tennant et al., 2001). Гемизиготные и однокопийные растения, как правило, менее устойчивы к вирусам, чем гомозиготные растения и растения с несколькими копиями трансгена.

При наблюдении за инфицированными BNYVV трансгенными линиями, экспрессирующими BNYVVcp, была зарегистрирована задержка развития

симптомов инфекции вируса. Однако, в отличие от трансгенов BNYVVsil, в трансгенах BNYVVcp задержка была более короткой (до 7 дней). Конструкции, содержащие ген БО BNYW, ранее были использованы для трансформации N. benthamiana (Andika et al., 2005). Однако 18 из 19 полученных трансгенных линий Ti не отличались от контроля по проявлению симптомов, и лишь у одной линии наблюдали задержку развития симптомов инфекции.

Таким образом, нами были получены модельные трансгенные растения Nicotiana benthamiana, экспрессирующие ген устойчивости к гербициду BASTA и потенциальный источник устойчивости к вирусу ризомании, двунитчатую форму З'-НТО генома BNYYV. Созданная генетическая конструкция pBI_BAR_BNYVVsil может найти применение для получения трансгенных растений сахарной свеклы, сочетающих толерантность к ризомании и устойчивость к гербициду. Наличие в селекционной линии двух генов позволяет ускорить селекционный процесс, исключая необходимость проведения дополнительных скрещиваний или трансформаций для сочетания двух признаков в одном генотипе.

ВЫВОДЫ

1. Сконструирован бинарный вектор pBI_BAR_BNYVVsil, несущий под контролем двух независимых 35S промоторов кДНК двухцепочечных инвертированных фрагментов З'-НТО BNYVV, разделенных интроном ubil, и кДНК гена bar.

2. Сконструирован бинарный вектор pBI_BAR_BNYVVcp, несущий под контролем двух независимых 35S промоторов вставку кДНК белка оболочки BNYW и кДНК гена bar.

3. Методом транзиентной экспрессии конструкции «индуктора» (BNYVVsil) и «мишени» в растениях N. benthamiana дикого типа показано 30-кратное снижение экспрессии GFP, что указывает на возможность эффективной индукции сайленсинга двунитчатой формой З'-НТО генома BNYVV.

4. Получены трансгенные растения N. benthamiana, трансформированные вектором pBI_BAR_BNYVVsil. В трансгенных линиях наблюдали экспрессию транскрипта BNYVVsil и продукта гена bar, PAT, обеспечивающего устойчивость к гербициду BASTA.

5. Получены трансгенные растения N. benthamiana, экспрессирующие транскрипт гена белка оболочки BNYVV и PAT продукт гена bar.

6. В гомозиготном поколении Т2 выделена толерантная линия BNYVVsil-126.4, обладающая частичной устойчивостью к инфекции BNYVV в условиях механической передачи вируса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Виноградова C.B., Камионская A.M., Ракитин A.JL, Аграновский A.A., РавинН.В., Атабеков И.Г., Скрябин К.Г. Использование З'-нетранслируемой области РНК геномов вируса некротического пожелтения жилок свеклы и вируса желтухи свеклы в качестве индукторов посттранскрипционного умолкания генов. //Доклады Академии Наук. 2011. Т. 439. № 6. С. 831-834.

2. Виноградова C.B., Камионская A.M., Зиновкин P.A., Аграновский A.A., Скрябин К.Г. Использование технологии экспрессии в растениях кДНК гена белка оболочки вируса желтухи свеклы для получения трансгенной устойчивости. // Доклады Академии Наук. 2012. Т. 443. №2. С. 240-242.

3. Vinogradova S., Rakitin A., Kamionskaya A., Agranovsky A., Ravin N. Development of strategy for pathogen-derived resistance in Nicotiana benthamiana to beet yellows and beet rhizomania viruses. // 9th International congress of plant pathology. Torino (Italy). 2008. P. 263.

4. Виноградова C.B. Трансгенные растения Nicotiana benthamiana, экспрессирующие З'-нетраслируемые области РНК вирусов желтухи и ризомании сахарной свеклы в качестве мишеней для посттранскрипционного умолкания генов. // Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Звенигород. 2008. С. 74-75.

5. Vinogradova S., Rakitin A., Kamionskaya A., Agranovsky A., Ravin N. Transgenic Nicotiana benthamiana plants, expressing the 3'-untranslated RNA regions of Beet yellows virus and Beet necrotic yellow vein virus as targets for post-transcriptional gene silencing. // 4th International Conference and Exhibition «RNAi2009: ncRNA: Bridging Biology and Therapy». Oxford (England, UK). 2009. P. 17.

6. Vinogradova S., Rakitin A., Kamionskaya A., Agranovsky A., Ravin N. Strategy for pathogen-derived resistance in Nicotiana benthamiana to Beet yellows virus and Beet necrotic yellow vein virus. // Proceeding of the 3rd International Symposium on Plant Protection and Plant Health in Europe. Crop Plant Resistance to Biotic and Abiotic Factors: Current Potential and Future Demands. Berlin (Germany). 2009. P. 262.

7. Vinogradova S., Rakitin A., Kamionskaya A., Agranovsky A. Expressing the BYV and BNYVV sequences to Induce PTGS-based resistance. // Programme and abstracts of the Inernational Conference «Plant transformation technologies II». Vienna (Austria). 2011. P. 69.

8. Виноградова C.B. Использование технологии вирус-зависимой устойчивости для создания трансгенных растений, устойчивых к ризомании. // Тезисы докладов II международной школы-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях». Москва-Звенигород. 2011. С. 28.

9. Виноградова С.В. Экспрессия фрагмента З'-нетранслируемой области вируса некротического пожелтения жилок свеклы для индуцирования устойчивости к ризомании. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIV зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва. 2012 г. С. 89.

Подписано в печать 16.04.2012 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 8 (495) 785-00-38, 8 (926) 850-53-16 www.autoref.ae-print.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Виноградова, Светлана Владимировна, Москва

61 12-3/912

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» Российской академии наук

На правах рукописи Экз._

Виноградова Светлана Владимировна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 3'-НЕТРАНСЛИРУЕМОЙ ОБЛАСТИ ВИРУСА НЕКРОТИЧЕСКОГО ПОЖЕЛТЕНИЯ ЖИЛОК СВЕКЛЫ В КАЧЕСТВЕ ИНДУКТОРА УСТОЙЧИВОСТИ К РИЗОМАНИИ

Специальность: 03.01.03 - молекулярная биология

Научные руководители: доктор биологических наук

A.A. Аграновский кандидат биологических наук A.M. Камионская

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012

Оглавление

1 Список сокращений..................................................................................................................5

2 Введение....................................................................................................................................8

2.1 Актуальность проблемы..................................................................................................8

2.2 Цель и задачи работы.....................................................................................................Ю

3 Обзор литературы...................................................................................................................11

3.1 Ризомания сахарной свеклы..........................................................................................11

3.1.1 Географическое распространение BNYVV.........................................................11

3.1.2 Вредоносность и экономическое значение BNYVV..........................................13

3.1.3 Растения-хозяева BNYVV.....................................................................................14

3.1.4 Симптомы заболевания ризоманией....................................................................16

3.1.5 Способы переноса и распространения вируса....................................................18

3.1.6 Морфология частиц и организация генома.........................................................21

3.1.7 Типы и изоляты BNYVV.......................................................................................27

3.1.8 Способы предотвращения распространения ризомании....................................29

3.1.9 Устойчивость к вектору P. betae...........................................................................31

3.1.10 Селекция на устойчивость к BNYVV..................................................................31

3.2 Использование трансгенных растений для индукции вирусоустойчивости............34

3.2.1 Трансгенная устойчивость, обусловленная экспрессий в растении гена белка оболочки вируса................................................................................................................35

3.2.2 Трансгенные растения, экспрессирующие репликазные гены..........................37

3.2.3 Трансгенная устойчивость, основанная на экспрессии транспортного белка. 39

3.2.4 Трансгенная устойчивость, обусловленная экспрессией антител к вирусам... 41

3.2.5 Устойчивость, обусловленная активацией системной приобретенной устойчивости (SAR) растения..........................................................................................42

3.2.6 Вирусоустойчивость растений, обусловленная "замолканием генов".............45

3.2.7 Заключение.............................................................................................................49

4 Материалы и методы..............................................................................................................51

4.1 Конструирование бинарных векторов, содержащих кДНК фрагменты генома BNYVV....................................................................................................................................51

4.1.1 Питательная среда, использованная для культивирования Escherichia coli и A. tumefaciens.....................................................................................................................51

4.1.2 Получение электрокомпетентных клеток Е. cotí................................................51

4.1.3 Трансформация компетентных клеток Е. coli.....................................................51

4.1.4 Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli....................................................52

4.1.5 Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот...........................................52

4.1.6 Выделение ДНК из агарозного геля.....................................................................53

4.1.7 Трансформация A. tumefaciens..............................................................................53

4.1.8 Клонирование кДНК гена БО BNYVV для конститутивной экспрессии в растениях...........................................................................................................................54

4.1.9 Клонирование кДНК З'-нетранслируемой области РНК-2 BNYVV для конститутивной экспрессии в растениях........................................................................58

4.1.10 Клонирование конструкции-мишени для PTGS.................................................60

4.1.11 Оценка эффективности использования для индукции сайленсинга фрагментов BNYVVsil с помощью транзиентной экспрессии в растениях

N. benthamiana дикого типа.............................................................................................62

4.1Л 2 Выделение растворимого белка из растительного материала...........................63

4.1.13 Вестерн блот анализ...............................................................................................63

4.2 Методики, использованные при работе с культурой in vitro N. benthamiana...........64

4.2.1 Растительный материал.........................................................................................64

4.2.2 Питательная среда, использованная для поддержания растений культуры in vitro и агробактериальной трансформации....................................................................64

4.2.3 Введение семян в культуру in vitro......................................................................64

4.2.4 Определение концентрации фосфинотрицина для селекции in vitro трансформантов N. benthamiana, содержащих ген bar.................................................65

4.2.5 Трансформация N. benthamiana с помощью A. tumefaciens...............................65

4.2.6 Отбор фосфинотрицин-устойчивых регенерантов на селективной питательной среде.............................................................................................................66

4.2.7 Клональное микроразмножение в условиях in vitro...........................................66

4.2.8 Адаптация растений к почвенным условиям......................................................66

4.2.9 Получение поколения Ti и Т2 трансгенных растений N. benthamiana..............67

4.3 Анализ наличия и экспрессии трансгенных вставок в растениях N. benthamiana .. 68

4.3.1 Выделение суммарной ДНК из растительного материала.................................68

4.3.2 Выделение суммарной РНК из растительного материала.................................68

4.3.3 Проведение реакции обратной транскрипции.....................................................69

4.3.4 Проведение полимеразной цепной реакции........................................................69

4.3.5 Анализ наличия трансгенной вставки в трансформантах..................................70

4.3.6 Анализ экспрессии трансгенной вставки методом ОТ-ПЦР.............................70

4.3.7 Вестерн блот анализ экспрессии трансгенной вставки......................................71

4.3.8 Иммунохроматографический анализ экспрессии PAT в трансгенных

растениях...........................................................................................................................

4.3.9 Оценка индукции сайленсинга фрагментом BNYVVsil с помощью транзиентной экспрессии в трансгенных растениях N. benthamiana поколения То и Т2 72

4.4 Анализ устойчивости трансгенных растений N. benthamiana поколения Т2 к механической инокуляции BNYVY......................................................................................73

4.4.1 Получение инокулюма BNYYV на растениях N. benthamiana дикого типа.... 73

4.4.2 Оценка устойчивости трансгенных растений к BNYVV в условиях теплицы 74

4.4.3 Обнаружение BNYVV методом ОТ-ПЦР............................................................74

4.4.4 Обнаружение BNYVV методом ИФА..................................................................75

4.4.5 Обнаружение BNYVV с помощью Вестерн блот анализа.................................76

Результаты и обсуждение......................................................................................................77

5.1 Конструирование бинарных векторов, содержащих кДНК фрагменты генома

BNYVV....................................................................................................................................77

5.2 Оценка индукции сайленсинга фрагментом BNYVVsil с помощью транзиентной экспрессии в растениях N. benthamiana дикого типа..........................................................79

5.3 Получение трансгенных растений N. benthamiana, несущих фрагменты генома

BNYVV....................................................................................................................................80

5.3.1 Агробактериальная трансформация N. benthamiana и отбор трансформантов ..80

5.3.2 Определение наличия целевой вставки в геноме трансформантов N. benthamiana методом ПЦР...........................................................................................

5.4 Молекулярный анализ трансгенных растений N. benthamiana поколения Т0..........86

5.4.1 Анализ экспрессии (транскрипции) трансгенной вставки методом ОТ-ПЦР........86

5.4.2 Иммунохроматографический анализ экспрессии PAT в трансгенных растениях N. benthamiana поколения То.........................................................................87

5.4.3 Вестерн блот анализ трансгенных растений BNYVVcp....................................88

5.4.4 Оценка индукции сайленсинга фрагментом BNYVVsil с помощью транзиентной экспрессии в трансгенных растениях N. benthamiana поколения То... 89

5.5 Получение и анализ трансгенных растений N. benthamiana поколения Ti и Т2.............89

5.6 Получение инокулюма BNYVV...................................................................................95

5.7 Анализ устойчивости трансгенных растений N. ЬеШкат1апа поколения Т2 к механической инокуляции ВКУУУ......................................................................................-

6 Выводы..................................................................................................................................1С

7 Список литературы...............................................................................................................11

8 Приложение 1........................................................................................................................1 -

1 Список сокращений

35S промотор каулимовируса мозаики цветной капусты

bar ген фосфинотрицинацетилтрансферазы Streptomyces hygroscopicus

BCIP/NBT 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат/пкго blue tetrazolium

BNYVVsil кДНК инвертированных повторов З'-нетранслируемой области BNYVV, формирующих шпилечную структуру

BNYVVcp кДНК гена белка оболочки BNYVV

BSA бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin)

Cb карбенициллин

Cf цефотаксим

СТАВ цетилтриметиламмония бромид (cetyltrimethylammonium bromide)

DIECA Na диэтилтиокарбонат натрия

dNTPs дезоксирибонуклеотиды

dsPHK двуцепочечная (double stranded) РНК

Gent гентамицин

GFP зеленый флуоресцирующий белок (green fluorescent protein)

IgG иммуноглобулин

Km канамицин

LB питательная среда Luria-Bertani

MES 2 (Т^-морфолино)этан сульфоновая кислота

MQ вода, прошедшая очистку в системе очистки воды MILI-Q (Millipore)

MS питательная среда Мурашиге-Скуга (Murashige - Skoog)

NOS терминатор гена нопалинсинтетазы

OD оптическая плотность (optical density)

ORF открытая рамка считывания (open reading frame)

PAT фосфипотрицин-Н-ацетилтрансфераза

PDR патоген-зависимая устойчивость (pathogen-derived resistance)

PTGS посттранскрипционное замолкание генов (post-transcriptional gene silencing)

RFLP полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (restriction fragment length polymorphism)

Rif рифампицин

RNAi РНК-интерференция

RTD домен белка, образующийся при рибосомальном проскоке слабого терминатора (readthrough domain)

SAR системная приобретенная устойчивость (systemic acquired resistance)

scFv вариабельный фрагмент антител (single-chain variable fragment)

SDS додецилсульфат натрия

siPHK короткая интерферирующая РНК (short interferring RNA)

SOC питательная среда для культивирования Escherichia coli «super optimal broth with catabolite repression»

SSCP полиморфизм конформации одноцепочечных фрагментов (single-strand conformation polymorphism)

To поколение трансгенных растений, полученное непосредственно в результате трансформации

Taq термостабильная ДНК-полимераза Thermus aquaticus

Tris трис(гидроксиметил)-аминометан

1 vir гены вирулентности

БАП 6-бензиламинопурин

БО белок оболочки

д.п.и. дни после инокуляции

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНКаза дезоксирибонуклеаза I

ИФА иммуноферментный анализ

кДа килодальтон

МТ домен метилтрансферазы

НСР наименьшая существенная разность

нт нуклеотид

НТО нетранслируемая область

НУК нафтилуксусная кислота

от обратная транскрипция

п.н. пара нуклеотидов

ПААГ полиакриламидный гель

ПОЛ домен РНК полимеразы

ПРО домен папаин-подобной протеазы

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК рибонуклеиновая кислота

РНКаза рибонуклеаза

тьт2 первое и второе поколение трансгенных растений, соответственно

ТБ транспортный белок

ТБГ тройной блок генов

ХЕЛ домен РНК хеликазы

ЭДТА этилендиамин тетраацетат

AMCV вирус пятнистой морщинистости артишока (Artichoke mottled crinkle virus)

AMV вируса мозаики люцерны (Alfalfa mosaic virus)

BaMMV вирус слабой мозаики ячменя (Barley mild mosaic virus)

BCLV вирус курчавости листьев свеклы (Beet leaf curl virus)

BCTV вирус курчавости верхушки свеклы (Beet curly top virus)

BMYV вирус слабого пожелтения свеклы (Beet mild yellowing virus)

BNYVV вирус некротического пожелтения жилок свеклы (Beet necrotic yellow vein virus)

BOLV вирус дубовых листьев свеклы (Beet oak-leaf virus)

BSBMV почвенный вирус мозаики свеклы (Beet soil-borne mosaic virus)

BSBV почвенный вирус свеклы (Beet soil-borne virus)

BtMV вирус мозаики свеклы (Beet mosaic virus)

BVQ Q вирус свеклы (Beet virus Q)

BYV вирус желтухи свеклы (Beet yellows virus)

CMV вирус огуречной мозаики (Cucumber mosaic virus)

CNV вирус некроза огурца (Cucumber necrotic virus)

CTV вирус тристецы цитрусовых (Citrus tristeza virus)

NMV вирус мозаики нарцисса (Narcissus mosaic virus)

PCV вирус кустистости земляного ореха (Peanut clump virus)

PEBV вирус раннего побурения гороха (Pea early browning virus)

PLRV вирус скручивания листьев картофеля (Potato leafroll virus)

PRSV вирус кольцевой пятнистости папайи (Papaya ringspot virus)

PVS S вирус картофеля (Potato virus S)

PVX X вирус картофеля (Potato virus X)

PVY Y BHpvc картофеля (Potato Virus Y)

RCNMV вирус некротической мозаики красного клевера (Red clover necrotic mosaic virus)

SHMV вирус мозаики конопли индийской (Sunnhemp mosaic virus)

TBSV вирус кустистой карликовости томатов (Tomato bushy stunt virus)

TCV вирус скрученности турнепса (Turnip crinkle virus)

TEV вирус гравировки табака (Tobacco etch virus)

TMGMV вирус мягкой зеленой мозаики табака (Tobacco mild green mosaic virus)

TMV вирус табачной мозаики (Tobacco mosaic virus)

TSWV вирус пятнистого увядания томатов (Tomato spotted wilt virus)

TYLCV вирус жёлтой курчавости листьев томатов (Tomato yellow leaf curl virus)

WC1MV вирус мозаики белого клевера (White clover mosaic virus)

WMV вирус мозаики арбуза (Watermelon mosaic virus)

ZYMY вирус желтой мозаики тыквы обыкновенной (Zucchini yellow mosaic virus)

2 Введение

2.1 Актуальность проблемы В мировой практике рентабельность выращивания сахарной свеклы {Beta vulgaris L.) во многом зависит от эффективности борьбы с болезнями и вредителями этой культуры. Из грибковых болезней сахарной свеклы наиболее вредоносными являются черная ножка (вызываемая Phoma betae, Pythium spp., Aphanomyceas cochlioides, Rhizoctonia solani), церкоспороз (■Cercospora beticola), альтернариозная листовая пятнистость (Alternaria alternata), ложная мучнистая poca (Peronospora farinosa), мучнистая poca (.Erysiphe betae), ризоктониозная корневая гниль (Rhizoctonia solani), пятнистость листьев {Ramularia beticola), фузариоз корней (.Fusarium spp.) (Agrios, 2005; Draycott, 2006; Harveson et al, 2009). Культура сахарной свеклы поражается и рядом вирусов, такими как вирус желтухи свеклы (Beet yellows virus, BYV), вирус курчавости верхушки (Beet curly top virus, BCTV), вирус мозаичности свеклы (Beet mosaic virus, BtMV), вирус курчавости листьев свеклы (Beet leaf curl virus, BCLV) (Smith and Hallsworth, 1990; Wisler and Duffus, 2000; Agrios, 2005; Draycott, 2006; Harveson et al., 2009).

Одно из наиболее опасных вирусных заболеваний культуры сахарной свеклы, резуха (ризомания), вызывается вирусом некротического пожелтения жилок свеклы (Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV). Ризомания регистрировалась практически во всех районах возделывания культуры в Старом и Новом Свете (McGrann et al, 2009). При поражении ризоманией сахаристость корнеплодов снижается от 8% до 50-60% (Asher, 1993; Henry, 1996; Johanson, 1985), а снижение урожайности может достигать 30-90% (Johanson, 1985; Шпаар, 2004).

На сегодняшний день успех борьбы с ризоманией зависит от выращивания устойчивых сортов, гибридов и линий, причем устойчивость может достигаться использованием как естественных, так и созданных генно-инженерными методами источников устойчивости к BNYVV.

Кроме методов классической селекции, с помощью которых были получены все современные сорта и гибриды сахарной свеклы, устойчивые к ризомании, существуют различные подходы генетической инженерии для дальнейшего увеличения устойчивости к этой болезни. Совокупность подходов, связанных с трансгенной экспрессией фрагментов вирусного генома, получила название патоген-зависимой устойчивости (PDR).

Ранее для создания трансгенной устойчивости к BNYVV использовали экспрессию в растениях последовательности гена белка оболочки (Mannerlof et al., 1996; Andika et al, 2005), инвертированных повторов гена репликазы (Lennefors et al, 2006; Pavli et al, 2010), RTD домена (Andika et al, 2005) и одноцепочечного фрагмента антител, специфичных к белку оболочки BNYVV (Fecker et al, 1997). В этих работах наблюдали частичную или полную трансгенную устойчивость к BNYVV.

Экспрессия в растениях фрагментов З'-нетранслируемой области (3'-НТО) вирусных РНК геномов имеет определенные преимущества с точки зрения безопасности, поскольку вирусные РНК, в отличие от белков, имеют короткое время полужизни и не являются иммуногенами. З'-НТО BNYVV представляет интерес в качестве нового индуктора патоген-зависимой устойчивости к ризомании. В настоящей работе для сравнения эффективности использования З'-НТО с ранее изученными индукторами в модельном растении Nicotiana benthamiana была также экспрессирована последовательность гена белка оболочки BNYVV. Кроме того, в трансгенных растениях был экспрессирован ген bar, обеспечивающий устойчивость к фосфинотрицину - действующему веществу гербицида BASTA.

2.2 Цель и задачи работы

Целью работы было изучение З'-НТО генома BNYVV в качестве индуктора PTGS и устойчивости к ризомании в трансгенных растениях.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. конструирование бинарных векторов, обеспечивающих экспрессию в растениях инвертированных повторов З'-НТО BNYVV, формирующих шпилечную структуру (BNYVVsil), или мРНК гена БО (BNYVVcp);

2. оценка подавления транзиентной экспрессии «мишени» (ген GFP, несущий З'-НТО BNYVV) за счет индукции PTGS транскриптом BNYVVsil в растениях N. benthamiana;

3. получение трансгенных растений N. benthamiana, экспрессирующих одновременно BNYVVsil (или BNYVVcp) и ген bar, обеспечивающий устойчивость к гербициду BASTA;

4. определение уровня устойчивости к BNYVV трансгенных растений гомозиготного поколения Т2.

3 Обзор литературы

3.1 Ризомания сахарной свеклы 3.1.1 Географическое распространение BNYYV

Ризомания (резуха) - заболевание сахарной свеклы, вызываемое вирусом некротиче