Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тестирование вируса некротического пожелтения жилок свеклы методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Тестирование вируса некротического пожелтения жилок свеклы методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот"

ВСЕРОССИЙСКИЙ КАУЧНО-ИССЛЕЛСЗАТЕЛЬСКИЯ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ

ЮЮТЕХНОЛОГИИ РАСХН __ — — — ' ;

_ На правах рукописи

'¡'¡СИ '

Кдячанко Оксана Леонидовна

ТЕСТИРОВАНИЕ ВИРУСА НЕКРОТИЧЕСКОГО ПОЗЕЛТЕНКЯ ЯИЛОК СВЕКЛЫ МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

03.00.23-Сиотехнодогия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой отепени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в лаборатории культуры тканей я генетической инженерии Института сахарной свеклн Украинской академии аграрных на£к.

Научный руководитель; академик АН Зкр^ны. доктор биологических наук

Глеба В.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

' Завриев С.Т.

доктор биологических наук Дорохов В.Д.

Ведувая организация - Институт ыикробиологии; и вирусологии им акад. Д. К.Заболотного ЙН Украины. к л-1

Защита диссертации состоится!" . I31993г.

в _____ час.на заседании Специализированного Совета Д.020.40.01 при

ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РЙСХН по адресу: 125206, г.Москва,ул.Тимирязевская д.42.

' ' .-'•' - ""-V .

С диссертацией иохно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РЙСХН.

Автореферат разослан " ^ 1993г.

Зченай секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Меликова С.А.

Актуальность проблемы. В последние годы существенную угрозу для: производства сахарной, свеклы во всех основных свеклосеющих страдах мира представляет ризомания - одно из наиболее опасных вирусных заболеваний.Впервые обнаруженная а северных районах Италии /Canova, 1959/, болезнь распространилась практически во всех стра-. яах Средиземноморья и Европы, отмечены очаги заболевания в Китае, (Ж, Японии. В начале 80-х годов ^изомания Сила зарегистрирована в Киргизии /Руженцова, 1984, 1987/, а затем в Казахстане /Кремендова И др.,1987/. В целом потери урожая при поражении сахарной свеклы ризоманией достигают в разных странах мира 50 --702' ',а сахаристость корнеплодов снижается ка 5- 1QS при содержании.сахара в здоровых корнеплодах - 17 - 187. /Власов и-др. ; 1985; Gozcteiewicz, 1988/.' _ V' ;; "-. •

, Ооновные признаки заболевания. развиваются на корнеплодах в виде чрезмераого. разрастания и некрогизации Соковых корешков и образования "бороды"» При этом главный корень частично или полностью разрушен. В Киргизии обнаружен системный характер поражения сахарной свеклы ризоманией, при котором вирус локализуется в корневой ; части растения, тогда как в Казахстане распространен также сис-. темная инфекция о. проявлением пожелтения .г нектротизации жилок листьев /Власов, Акперлинов, 1990 /.

Японскими исследователями установлено, что возбудителем ризо-мании является многокомпонентный палочковидный вирус с разделенным ■ геномом, представленный четырьма типами РНК - вирус некротического пожелтения жилок свеклы /ВНПЙС/,; а его переносчиком и.реэерватором - плаамодиофоровый гриб Polymyxa betas Keskin /Tamada, ; Baba, 1973/. Вирусные частицы разделяют на три, или четыре класса. Разные . 1 . изоляты, полученные в лабораториях мира, отличаются по модальным длинам частиц ; определенной длины внутри иэолята - /Al Musa, Mlnk,1981;. Власов й др.,1985; Fraenkel-Conrat, 1986/.

Меры борьбы с ризоманией малоэффективные, единственным перспективным V.;методом, является создание устойчивых сортов сахарной свеклы /Кох, 1992/. В этой связи необходимо иметь надежный и высо-: кстубстаительный'метод вируса в раститёльнсм матери-.

-, але. 'tía'сегодняшний' день, для обнаружения вируса разработаны методы, позволяющие диагностировать заболевание визуально, методом . 'растений-¡мдикаторов, растений-приманок, иммуносорбентной элект-

ронной микроскопии, иммуноферыентного анализа и гибридизации нуклеиновых кислот о кДНК - зондами на твердых носителях. Поскольку вирус неравномерно распределяется в органах растений сахарной свеклы и содержится в очень низких концентрациях, предпочтение отдается таким высокочувствительны^, методам как иммуноферментный анализ /И®к/ и иетод молекулярной гибридизации нуклеиновых . кислот о i&HK - зондами на твердых носителях.

- Особого внимания заслуживает метод гибридизации нуклеиновых кислот Э2Р-мечешшми кДНК-зондами, с помощью которого может Сыть выявлено до 1 пг вирусоспецифической нуклеиновой . кислоты /Коегйг, 1386/, тогда как чувствительность ИФА составляет 1 Нг вируса на 1 мл экстракта УНеЬегГе-Bors et al., 1984; De BiajfSi 19В6/. Однако необходимость в высокомеченных предшественниках и ферментах для введения их в полинукдеотиды, а также в специальных условиях и оборудовании для проведения таких работ, . ограничивает возможности применения метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот в диагностических целях. В последние годы стал# использовать нерадиоактивные Сиотинилированные ДНК-зонды, которые не уступают то чувствительности 3ZP-меченным кДНК -зондам /Reisfeld et al., 1987; Мелдрайс и др., 1991/.

В литературе отсутствуют сведения о диагностике ВНПНС методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот-с использованием бяо-ткшшфовакшх ДНК-зондов. Кром^ того, мы не .обнаружили научных публикаций в странах СНГ о идентификации ВШШС методом гибридиза-цш нуклеиновых кислот с использованием 32Р-меченных кДЖ-зондов.

Цель и задачи исследования. Исходя из этого, цель диссертационной работы заключалась в "определении ЕНГШС методой молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с использованием згР. -меченных и биотинилированных ^ДНК-зондов в листьях и морфологических частях корнеплодов сахарной свеклы при системном и несистемном поражении растений ризоманией. ' 4 Для.достижения. поставленной, целг решали несколько: задач:

1. Идентификация геаома ВШШС-иголята•. К-88 .методсм Нозерн-блсг. гибридизации нуклеиновых кислот с 32Р-мечешшми кЗНК-аондаыи.

2. Определение ВШШС а' системно -и несистемно поражений -рзаоивнией растениях сахарной сгекгы методам Нозеря-блог и дот-гибридизации куклекновьх /кислст'дри йспользованод э2Р-меченннх «олеку- г

лярных эондов.

3. Разработка систеыы тестирования ВНПНС методом дот-гибридизации

нуклеиновых кислот с кДНК, меченной бистином. ■1. Сравнительное изучение выявлен;« ВНПНС методом гибридизации нуклеиновых югслст и иммунсферментнсго анализа в . варианте РАЗ-ПЛЗА. .

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые разработана система тестирования ВНШЕС методом молекулярной гибридизации' нуклеиновых кислот с использованием биотинилированных ДНК-азн-дов с последующей обработкой гибридиаационного фильтра конькгатсы стрелтаввдия-щелочная фосфзтаза. Установлено, что метод гибр;щига-ции РНК вируса с меченной биотипом кДКК не отличается по чувствительности от такового с использование 32Р-меченных кДНК-зондов.

С помощью гибридиаационного теста с 32Р-меченныыи кДНК-зондами установлено распределение вирусных РНК в морфологических частях корнеплодов сахарной свеклы о системным и несистемна заболевания. Показано, что метод молекулярной гиЗридизацш! нуклон-новых , кислот, позволяет / выявлять ' присутствие -вируса в латентном бессимптомном периоде инфеннцйп и может Сыть использован для ранней диагностики ризомаяии.

.Сравнение методов идентификации ВНПНС показало, что метод гиб-• ридизации нуклеиновых кислот при выявлении равных количеств вируса является Солее высокоспецифичныы и высокочувствительный, чеы ИСА в варианте РАЗ-ЕЫБА. Таким образом, метод гибридизации нуклеиновых кислот можно широко использовать в качестве диагностического теста на ВНШЕС в селекционно-генетической работе с сахарной свеклой и производственных посевах, а также для диагностики других патогенных вирусов^ ~

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доло— . жены. и обсуждались на конференции молодых ученых Института сахарной.свеклы УААН /Киев, 1993/; на II съезде Украинского общества физиологов растений /Киев, 1993/; на 1-м Учредительном /'/Ш/съез-де Украинского миирсЗяслогкческсго сбгестза /Одесса, 1533/; 'научны-: сешгнарак лаборатории .сисхимют вирусов Института жкрсСиологяя вирусологии им. А. Кирхекэтенна АН Латвии /Рига, 1991,1992/; научных семинара" лаборатории культуры ткани и генетическая инз^ер::;: Института сахарной свеклы УААН /Киев, 1992, 1533/.

4 - , - -

Публикации. ПО материалам диссертации опубликовано и подано в печать 6 научных работ. / Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Я.А.Мелдрайсу /Институт 'микробиологии и вирусологии им. А.Кирхензтейка, Рига, Латвия/ за й&мога и полезные советы, сказанные при выполнении работы, а .тзю^ благодарит др.1\2онарда /Институт молекулярной биологии, Страсбург, Франция/ за предоставление реломбинантных плазмид, к.б.н. Е.Б.Кременцову /Институт завиты растений РААН, Пушкин, ''Россия/ за предоставление . изолята ЕНПНС К-88, H.A.Васильеву /Институт сахарной свеклы УААН, Киев, Украина^ за псмось а проведении полевых опытов в Киргизии.и Казахстане.

Структура и объем работы. Диссертадая состоит иэ введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, методических,: рекомендаций и списка литературы, вклшающего 175 яаименоЦзий.. Работа изложена на страницах матшогисного текста и содержит 23' рисунков. ■ ,

; МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ../ ., '.. ■

Характеристика объектов исследования, зондов. Для анализа использовали корнеплоды сахарной овэкгы. сортов Киргизская односемянная 25 и Ялтутковская односемянная 30 с ярко выраженными симптомами заболеваний, а также листья растении сахарной свеклы, корешки растений - приманок сварной свеклы в возрасте. 15-ти, SO-ти и 45-ти дней, выраженные в ,"условиях светоустановки на почве зараженной P.betae К и ВНЕС /Кременцова и др. , 1987/, листья , Chrysanthemum carinatum и вироид карликовости хризантем.

Изолят ВКПЖС' К-83 был получен' и очищен в ■ лаборатории' »шсоп-лагменных и вирусных болезней Института заадты растений РААН /Пуа-гся, Россия/ и любезно предоставленный Е.Б.Кременцсвой. .;.

' В работе были исподьааваны следуете молекулярные зонды пре-. доставленные . др. :Т.5снардом'' ;/Институт молекулярной, биологии, " . Страсбург,Франция/: . ' '

■'; рЗЕ5. - рекс1.:б:-кгитная'.плагкша. .комплементарная^ РНК-1, - сконс- ' ..трупрована на оснрз^ плагмидного .а^кхсса ;'pUC9 •. и; . клонирована • по. SsmHi сайту рестрикции. .■'■/W •■

pSFli - р;ксм5;п-:зягн£л пл£5мада,' ;.; ко?лплемеятщ!кая'- РНК-2,-;; сюзструаретана на основе'. плаг^йного вектора pUC9 и / клонирована

. ' • - 5 -

по HindiII сайту рестрикции.

pBFll - рексмбинаятная плаэмида, комплементарная РНК-З, сконструирована на основе плазмидного вектора pUC9 и клонирована по Hindi II и Sinai сайту рестрикция. ., 1

. рЗР4 - рсксмСтаачтная плазмида, комплементарная РНК-4, сконструирована на основе плазмидного вектора pUCQ и клонирована по BamHl сайту рестрикцшг, Для трасформации использовали штамм E.coli HB 101. ; ■ ,

Суммарную РНК из корнеплодов и листьев сахарной свеклы экстрагировали по методике /Bouzoubaa et. al. 1986/ с модификациями и анализировали в 0.8Х агарозном геле /Rlkwood et.al. 1982/.

Вируснуя' РНК выделяли по методу /Rhicnards et.ai., 1985/ и анализировали 0,82 агарозном геле по методу /Rikwccds .et.al. 1982/. '

Приготовление комплементарных клеток E.coli я тоансйс-гяэпнэ плаамилнсй ЕИк провод:ш[ по методу /Манаажао и др,; 138-4/.

'■."Выделение плазмидной ДНК и приготовление зонссз. Для. зыделе-шм плазшянсй ДНК. использовали метод щелочного лизиса /Eimboin and Doly, 1979/ Радиоактиану» метку С 32РЗ.- дАТ<Э /"Изотоп",Тас-кент, "Узбекистан/ вводили а ДНК пробы в ходе реакции жя-трансдя-ции, используя набор для мечения ДКК /Amershan, Англия/ по рекомендациям поставщика.'.

. Биотиноауп метку/биотин-И/дАТО /"Фермент", 'Вилькяс, 'Дятза/ вводили'в пробы. ДНК в реакция" як-трансляции, используя на£ор'для ыечения ДНК /"Биопод", Москва, Россия/ по'рексмекдашям поставщика. " ■■■■..'■'•,'.•,. '

. ' 'Тябзидизааиа РНК на' фильтрах . с радиоактивно меченными КДНК-зондами проводили по методу /Themas, 1593/. ~ . ■. -

.Тибридиаацгзэ на фильтрах"с виотлнмдироаанньши ДНК-зсндами вы-*"> подняли, придерживаясь • рекомендаций Ренсфелда и . соавторов /Reisfeld et.ai. 1387/. . "

Опу?леле:--;е дне-?: метопом нгнаго"анализа з вариан-

те PA3-2L1SA -зргзгд:^:: ел /-.-ivaris, Сгсрег, 1555' -г псясльг-агкне.'-г д£г* -огненна 'егт --r/Bir'^rfSHcrr:! iелка'А :тз±;:лсн:к-

ка. Результата' оценивал:: фотсмегрическ:! на мксгсказальясм фстсует-.рз "Лпкнг»:" /S "Крзск^гз=ссс::.~/ г.: 'метод:::-:? Смыгля ;: .;с-аз?. /1535/. 'Kafcp г;:зг:-:с:г:"лоа - "сз-декпл У.:* -ыл

предоставленный Е.Б.Креыенцовсй /ИЭР РААН, Пушкин/.

Электронномикроскопические исследования проводили методом негативного контрастирования в модификации Раэвяэкиной и Поляковой /1967/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Обнаружение ВНГГОС методом гибридизации нуклеиновых кислот

Э2Р-меченными кДНК -зондами. 1.1. Характеристика изолята ВНПЕС К-58 и его гемс.унч." РНК.

Для- характеристики иэолята БНГНС К-83, который служил контро- ; лем в наших исследованиях, использовали метод электронной микроскопии, метод электрофореза в агарозном геле и гибридизации ну.клеино-вых кислот.

Результаты измерений вирусных частиц на микрофотографиях /рис.1/ показали, что изолят ЕН1ЙС К-83 состоит их четырех классов частиц с модальными длинами 50-65 км, 100 - 120 нм, 260 - 290 нм, 400 - 420 нм,что согласуется с литературными'данными /Кременцова, 1989/. Однако ло мнению азтороа частицы четвертого класса с модальной длиной 400 - 420 нм являются агрегатами частиц второго /100 -120 нм/ и третьего /260 '290 нм/. классов. При исследовании нами суммарной неденатурированной вирусной РНК иэолята ВНЩС К-88 мете дом электрофореза в Í.2Z агореззнем геле, оказалось, что она разделяется на 4 РНК с различной молекулярной массой.

При тестировании ВНПЖС методом .молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, наиболее сложную задачу представляет получение ДНК-копий, комплементарных РНК и клонирование их в плазмидах.. Поскольку-в ряде лабораторий мира уже получены рекомбинантные' плазми- * ды, содержащие нДКК ВШШС в своих исследованиях, мы воспользовались рекомбинантными плазктадаыи p3F4, pBF5, pBFll, pBF14, любезно предоставленными Г.Еонзрдом. Вставки плазмид после введения метки 32Р в>реакции ник-трансляции были использованы в качестве ткбридиэаци-онкых го:-:доз. Анализ рекскбгаакткых плзгмлд проводили г 0,3" aro-, рознсм геле, используя в качестве маркера A-Hirió. Для нараздиания Сольсего количества илазмид использовали трансформация, в ;E.coli. Выделенную плазмидную ДНК с вирусоспецифическаши вставками после-гидролизаферментами рестрикцииГВагН! и • Hindi Д, разделяли в 0,8* .

Рис.1. Микрофотография ВНШЮ негативное матрас: и гоь*.--.

Рис.г . Анализ геномных РНК ВНПЕС методом Нозерн-Ггс, гкбрвдизацни . В качестве пйридизацаонного зонда исполу г г.*. зиёсъ32 Р-мечеяных вставок плазкид рвге, рВП1, рВГ4, А,Б - денатурированные РНК ВНПЗЕ.

агарозном геле. Расчет длины полученных вставок кДНК вируса, а также первичная структура ллаамвд полностью совпадали с литератур--ными данными /Bouzoubaa et al., "1985, 168В, 1987/.

Методом Нозерн-блот гибридизации при использовании в качестве молекулярного зонда смеси .^Р-ыеченных вставок плазмид pBF-l, р5Р5, pBFll, pBFH была проведена иденпфкздия генома ВНПВС ' изолята К-88.. Реаульгаты гибридизации представлены на рис.2. Можно видеть, что вирусные РНК образуют гибриды со всеми соответсвующими «ДНК рекомбинантных- пдазыид.Таким сбраасы, геном изолята ВНПЕС К-В8 состоит из четырех РНК с различной молекулярной массой, . каждому юту которой соответствует определенный кдзсс частиц. 1.2. Исследование распределения вирусных ' РНК в морфологических частях корнеплода /методами Нозерн-блот и ; дот-гибридизац^.' нуклеиновых кислот. '-. ■ ,•■.'■■'.-■*'■ ' ■ '' \ . '

Для определения чувствительности метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с 3£Р-меченными кДНК-аондами на нитрсцед-люлозныв фильтры наносили РНК. ВНШС и сушарну» РНК, выделенную из • корнеплодов зараженной я здоровой сахарной свеклы. Результаты гибридизации представлены на рис.3. Как следует из приведенных данных чувствительность определенш ВНЕХС при дот-гибридизации составляет 5,2 пг РНК ВНПЙС. 'Для выявления присутствия ВНПНС необходимы нуклеиновые кислоты, полученные не менее, чем из 320 мкг ткани корнеплода. '. :'/""■■

Степень'специфичности связывания 32Р-ыеченных кЦКК-зондов оценивали посредством дот-гибридизации. Для анализа использовали РНК, экстрагированную из листьев здоровых хризантем и вироид карликовости хризантем /ВКХр/. Контролем служили РНК ВНПНС и РНК из лнстьез сачарнЬй свеклы с системным характером порзхейа ризомани-ей. Р^ультаты исследования показали!,'что положительная гибридизация регистрируется талька а случае нанесения на нитроцеляло?ный фильтр образцов, содержазцих РНК BHTÍE0 /рис. 4, .5/.'^специфическая пйр:киззция о'-РНК'другого ввдсзого происхождения.и ВКХр .полностью стсутствует /?;:с.4Г, i - 5 ; cnc.S'A/. V/ ' :]'"',.

• Для сгнзрухемя' ВК223 методсм гибридизация .нуккинсзых 'юшот з корнеплодах сахарной свеклы при.несистемном и системном поражения ps¿2TrK'íií pusOmcHuîh, ксслвдosssi лркалиозтзз вирусных РЬК в

i г з 4 ФФv"

Рио.З. Определение чувствительности метода дот-гибридизации . В качестве гибридКаащюнного зонда исподьаовали смесь 32Р-меченных вставок плазюед рВМ, рвге, рВП1, рВП4. А-денатурированяая РНК ВНПВС /1-0,00065;2-0,00013; 3-0,000026; 4-0,0000052 мкг/; Б-суммарная РНК из зараженной сахарной свеклы; В-суммарная РНК из здоровой сахарной свекш; /1-4 соответствует нанесевюо нуклеиновых кислот «выделенных из 0,04;0,008;0,001б;0,00032 г ткани корнеплода./

Рис.4. Результаты. определения специфичности связывания 32Р-меченных рекоыбинантных плазиид pBF4, pBF5, pBFll, pBF14 с вироидом карликовости хризантем ВКХр. А-ВКХр /1-2; 2-0,4; 3-0,008; 4-0,016; 5-0,0032; 6-0,00065 мкг/.В - РНК ВНШС Л-0,08;2-0,Ц16; 3-0,0032;4-0,СЮ065;5-0,0СШЗ;5-0,000026 мкг/.

G

Рио.5. Результаты определения специфичности связывания 32Р-меченных рекомбинантных пдаэмвд pBF4, pBFS, pBFll, pBF14 о РНК другого видового происхождения.А-РНК внпас /1-80;2-1в;3-3,2;4-0,б5; 6-0,13 нг/.Б,В-РНКиэ корнеплодов системно всаженной сахарной свеклы. Г-РНК из листьев здоровой хризантемы. /1-6 соответствует нвнесенив нуклеиновых кислот аз 0,04;0,008;0,0013;0,00032;0,000065 г ткани./

Рис.6. Результаты Нозерн-бдот гибридизации определения РНК ; -ВНШЮ в морфологических частях корнеплода несистемно зараженной сахарной свеклы. В качестве гнбрвдизацюнного зонда использовали смесь 32Р-ыеченных вставок шазшщ pBF-i, pBF5, pBFll, рВРП.1,6-аумызрная РНК ;:з боковых ксрезкав, 2-суммарная РНК иэ хвостовой части корнеплода З-сушарная РНК из переходной части собственно корня в хвостовую част ¿-суммарная РНК lia собственно кс^зя, 5-суымарная РНК из головки корна-плгда,6- РНК ВНПЗС кзолята К-33.

-- • .------.......- - --"-il - v ~~ •■

морфологических частях корнеплода й боковых корешках. При проведении Нозерн-блот гибридизации в,лунке 1.2Z агорозного геля вносили ! суммарную РКК, выделенную из каждой мсрфрохогической част корнеплодов' и боковых корейкой Пример гибридиэацги приведен на рис.6. Как видно, положительная гибридизация наблюдается во всех случаях j нанесения на нитроцеллюлоэный фильтр образцов нуклеиновых кислот. . Однако при Ноэеря-блот гибридизаций невозможно определить точнее количество вирусных: РНК. Кроме того, метод достаточно слоаан и растянут во времени. ,-..'. . При дот-гибридизации количество, вирусных РНК определяли з j .. титровке РНК ЕНПКС от 1 яг до 0.01 кг. Наличие затемненных пятен : на авторадиограмыэ свидетельствует о присутствии вирусной РНК, а I интенсивность затемнения пятен позволяет судить о ее количестве. ; Оказалось , что наибольшее количество вирусных РНК при несистемной поражении ризомаяией содержится в переходной части собственно кор, ня в хвостовую часть, а также в боковых корешках, что соответствует 1 нг; РНК ВНШС йзолятз К-83. . В верхней части корнеплода - головке, вирусная РНК не обнаруживается, что согласуется с литературными данными /Н111Ш1, Schlosser, 1984, 1986/. Пример гибридизации представлен на рис.7. В случае системного заболевания сахарной свеклы наибольшее количество вирусных РНК отмечается в верхней части ' корнеплода /до 1нг РНК ВНЕЕС/, как это оценивалось и passe . /НШпшп Schlosser, 1984,1986/. Наименьшее количество вирусных •РНК содержится в хвостовой части корнеплода и боковых корешках и - соответствует 0,01яг РНК ВНШЮ. Пример полученных ааторадиограггм приведен на рис.8.

При исследования распределения вирусных РНК в поперечных гонах морфологических частей корнеплодов, их содержание увеличивается в направлении от периферической зоны корнеплодз к '■ внутренней. Аналогичная- закономерность локализации вирусных РНК 'отмечается и . для поперечных зон корнеплодов при системной инвазии. Что часайтс? . боковых- керепка'в, вкусные РНК рзз.чсмеркс распределяются г.- их длине кеэазкеимо d хара-геса п-рач^ния ркасма^ей р=сте:-::с: га-хзргйэй свеклы.

; Выявленное особенности распределения вирусная РНК в рззл;гсе:'. -v морфологических частях к вонах' кернеалэдоа прк системном и несистемном заболева-чии сахарной свеклы ркземанией,.' слег/ет учитьеагг

•• 1' г д - '"Г"'' •

А> • I Г1 ^ : Б § в Г Л)

*. ■ 8 8 • I -V:■.

Рис.7. Результаты "определения ВНШС в мЬфологичесгарс частях корне- . ада и боковых корешках при использовании а качестве-гибридиэационного .' ,!Да смесь32 Р-мече*шых пдаэмид рВ?4,рВГ5,рВП1, рВР14.1-РНК ВНПКС \ *,0Д;0,01 нг /,2- РНК из переходной части собственно"корня в х'восто-э часть,3-сушлрная РНК из боковых корешков, 4-суммарная РНК из хвос-юй части корнеплода, 5-суммарная РНК из собственно корня 6-оуммарная I иэ головки корнеплода,/А-В соответствует нанесению РНК из 0,04;0,001 Х&6 г ткани корнеплода/.

" "" 1 * 3 ' 4 в

'в • 0

> в в о °

Рис.8. .Определение локализации РНК ВНПКС в морфологических ¡'частях} <зешгсда-системно-зараженной сахарной свеклы при использовании 'в ка - • гве гибридиэационного зонда смеси 32Р-меченных вставок пдаэмид рВР4, 5,рВР11,рВП4.1-РНК ВН1ШС 1;0,1; 0,01 нг ,2-РНК из головки корне-да,3-РНК кз собственно корня,4-РНК из хвостовой части корнеплода, 3НК их боковых корешков /А-В соответствует нанесению нукле:шовых кис-из 0,04;0,008;0,001В г ткани корнеплода/.■•.

.'.;.• , : V :". 13 - • '

при отборе образцов в проведении вирусологической экспертизы менее чувствительными методами диагностики.

1.3. Идентификация ВНПХС в латентном бессимптомном периоде инфэкзди.

Для анализа использовали РНК, выделенную из только рагчернув-дшхся листьев системно пораженной вирусом сахарной свеклы. Контролем служили РНК ВНШС и РНК, выделенная иа листьев здоровой сахарной свеклы. Из приведенных на рио.9 результатов дот-гибридизации можно видеть, что положительная гибридизация имеет меото только в случаях нанесения на нейлоновые фильтры образцов нуклеиновых кислот, выделенных иэ бессимптомных листьев эараяенных растений сахарной свеклы.

Ддя обнаружения ВНПЛС на ранних этапах онтогенеза растений сахарной свеклы использовали РНК экстрагированную из корешков растений-приманок в.возрасте 15-тя, 30-ти и 45-ти дней. Контролем служила РНК ВНШС. / Результаты исследований показали, что положительная гибридизация регистрируется при нанесении на нейлоновые Сдльтры всех исследуемых образцов РНК /рио.Ю/. Выявление присутствия ВНШС а составе'нуклеиновых кислого помощью гибридиэационно-га чтоста а32Р-ыеченными кДНК зондами в латентном бессимптомном периоде инфекции и на ранних этапах онтогенеза растений сахарной свеклы позволяет использовать метод дот-гибридизации для ранней диагностики ризомании, заболевания о длительным инкубационным периодом/основные признаки которого развиваются на корнеплодах к концу периода вегетации.

1.4. Обнаружение ВНШС в соке пораженных риэоманией растений сахарной свеклы.

Д1Я проведения анализа использовали сок из листьев и корнеплодов 60-ти дневных растений сахарной свеклы; произрастающих в полевых условиях. В результате предварительных экспериментов установлено, что оптимальным условиями денатурации являются : температура денатурации +65.С, время денатурации 10 мин, концентрация формальдегида 12 мкг на 100 мл сока; 1 Результаты гибридизации представлены на рис.11. Из приведенных данных .'следует, что БНПЗШ'обнаруживается как в неразведанном соке зараженных вирусом корнеплодов, так и при его 10-ти и 100-кратном разведении. Контролем служили РНК ЕНПЖС и сок корнеплодов зверовой сахарной-свеклы. Неспецифическая гибридизация. полностью отсутствует. Полная специфичность гибридизации

А

Б

В

1

4

2 3

I 4

§

Риа.9. Определение "РНК ВШШС методом дот-гибридизации в листьях, сахарной- овеклы в латентном бессимптомном периоде инфекции при использовании в качестве гибридизавдонного зонда смеси 32Р-мечэнных -вставок' плазмад pBF4, pBF5.1-PHK ВНШС 0,65; 0,13; 0,026 нг ,2,3-РНК из листьев-зараженной сахарной свеклы 4-РНК на листьев здоровой, сахарной свемо / А-В соответствует нанесению нуклеиновых кислот на 0,003; 0,001Ь; 0,00032г. растительного материала / "..:.'

■Рио.10. Определение ВНШС в корешках сахарной свеклы растений-,: приманок методом дот-гибридизации при использовании а качестве зонда, смеси Э2Р-меченных вставок плазмид pBF5, pBFll.\a-FHK из корешков сахарной свеклы з возрасте 30 дней,Б-РНК ВНШС /1-16;2-3,2}3-0,65;4-0; 13; 5-0,026 нг/;В-РНК из корешков сахарной свеклы в возрасте 45-ти.дней;1,;, Г-РНК кз кореаков.сахарной свеклы в возрасте 15-ти дней, Д-РНК иэ >rj ресхсз езхарнзй сзекаы /1-5 соответствует нанесения нуклеиновых кислот из 1;Q,2;С,04 > 0,С03;0,С016 г растительного материала./ •■■ • " .

' ". - 15- •

32Р-мечеяных кДИК ВНШС а вирусяш РНК из сока сахарной свеклы „ даст основания полагать,что данный метод можно широко использовать для диагностики риэомашш.

Таким образом «метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с радиоактивно меченными гнйридизациокными зондами позволяет надежна ' и на современном уровни идентифицировать ВНПЖС как в составе нуклеиновых кислот, так и а соке пораженной ризоманией сахарной свеклы. При этом, для диагностика ВНП5С следует использс-. вать дот-гибридизацип нуклеиновых кислот как простой и удобный ме-

2, Получение биотинилироваяидс кДНК зондов и их использование для

• тестирования ЕНПЗС. При выбора способа получения биотинилированных ДНК-зондов для обна-. ружения ВНПЯС мы отдали предпочтение фериантативному методу, кото. рьй исклвчает значительные потери зонда в ходе реакции, а также не приводит к неадекватном ' результатам, определений из-за изменения структуры модифицируемой ДНК /Reisfeld-et al., 1987/. Виотинияиро-вание плазмид проводили в ходе реакции ник-трансляции при исполь-, зовании ДНК волимеразы 1 E.coii и /биотив-И/ дУТФ. Время проведения реакции бьшо увеличено до 3 ч , исходя из того, что скорость включения бкотинилироваапых аналогов в ДНК значительно ыеньсе чем скорость включения радиоактивной метки. ' Очистку зонда от несэягаэ- " . пейса метки; проводит кутей гель-фильтрации на микроколонке о удь-трагелем АсА54 /Signa, ША/. Полученные зонды денатурировали • трехкратным выдерживанием в течение 1 мин на водяной бане с последующим охлаждением при О С. Денатурированные зонды при точечном нанесении на нейлоновые фильтры имели чувствительность - к окрашивание с использованием коньюгата стрептаавдин-щелочная фосфатаэа 2пг . /рт.12/. . , • '••' : V. ' г

При .выборе кхжыэгата для детекции ВНШС на фильтрах после гибридизации с Скотивнзировашаст ДНК-зондами мы руководствовалась литературными данкши о более, высокой чувствительности дететаа с использованием щелочной фосфатазы по сравнений с лерскси^азсй /Kèisfeld.et al., 1987; Адьжанова, Генералова, 1980/. Что касается биотин-связызагщл белков : стреятазидина и азэд;иа, последний является Солее распространенным и доступным агентом для выязлеюя тинадироззнньк. производных ну}ие1шоз^ кислот /Relsfàid, et. aL,

А б 'В

* * . ? ел*

Рио.11.Определение ВШШС в сока листьев сахарной свеклы методом дот - гибридизации при использовании в качестве ' аонда смеси 32Р -меченных вставок плазмид рВР4,рВР14.А,В-сок корнеплодов зараженной, сахарной свёклы;Е-РНК ВНШС/1-1б;2-3,2;3-0,65 нг/ в точках, нанесено 1-1,5; 2-0,015; 3-0,015 мкл.

| г з «

5 «

£ « ®

• V *

Рио.12. Чувствательнооть к окрашванип меченных биотипом вставок шшмид рвг4,рвг5,1йг11,рвг14..1-0,2;2-0,02;3-0,сю2;4-0,0002;5-0,000ь2; 5-0,0000002 мкг.« - / , ■'

1 2 3 4 3 8

Рис.13. Определение чувствительности метода дох-гибридизации при использовании Сиотинилированных вставок плазмид рВР4,рЕР5,рВР11, РВР14. А-РНК ВНПКС / 0,015; ;0,0032; 0,00065; 0,00013; 0,000026; 0,0000052 мкг/.В,В-РНК зараженной сахарной свеклы;Г-РНК здоровой сахарной свеклы /1-е соответствует нанесеюю РНК из 0,2;0,04;0,008; 0,0016;0,00032 г ткани/ ...

I

в Б

(

.. 8

I 3 3 4 в в

РГГТгг---

09Ф Ф

Ф • • •

;. \.

Рис. 14. Определение ВНПЗС методам дот-гибридизации при использовании биотинилированных вставок.плаамцд. рВР4. рВР5, рВРИ, рЕР?4. 1-РНК внпас / 3,2; 0,05¡ 0,13. нг/. 2,3,4-РНК зараженной сахарной свеклы; 5-РДК здоровой сахарной свеклы 6-РНК здоровой хризазтеыы /А-В соответствует нанесении РНК.из 0,2;0,04;0,008 г ткани./

' - 18 - t :•.■.-;*' 1987/. Однако при проведении предварительных экспериментов о ио-пользованием коньюгата аввдин-щелочная фосфатаза, ш наблюдали неспецифическую гибридизацию для нуклеиновых кислот здоровых растений сахарной свеклы, которая проявлялась независимо от их количества в пробе. О специфической гибридизации судили по интенсивности окрашивания в голубой цвет пятен в точках нанесения ; нуклеиновых кислот на нитроцеллюдоэных или нейлоновых фильтрах.

Для определения чувствительности дот-гибридизащш о- биотини-дированными кДНК-зондами на нитроцеллшоэиыа фильтры наносили вирусную РНК, выделенную из очищенного препарата изолята ВНШС К-88 и РНК из корнеплодов зараженной и здоровой сахарной свеклы.

Чувствительность составляла 5,2 пг пг РНК ВНПЯС /рио.13/. О степени неспецифического связывания биотишшгрованных ДНК-зондов с РНК другого видового происхождения судили по результатам гибридизации с РНК, выделенных из здоровых листьев хризантем /Chrysanthemum carlnatuin/. На , полученных авторадиограммах . /рис.14/. можно видеть, что неспецифическая гибридизация полностью отсутствует.

Полученные биотшшшровакшэ ДНК-зонды использовали для, идентификации ВНПНС в состава нуклеиновых кислот в беэсииптОмных листьях сахарной свеклы с системным характером поражения ризоыани-ей, а также в корешках растений-приманок в возрасте 15-ти, ЭО-ти и 45-ти дней. •

Как следует из представленных на рис.15 данных, положительная реакция имеет место только а точках нанесения РНК, выделенной иа бессимптомных листьев пораженной вирусом сахарной свеклы. В случае нанесения на,нитроцеллюлозкые фильтры РНК из листьев здоровой сахарной свеклы 'гибридизация отсутствует. Контролем- Служила РНК ; ВНШС. Положительная гибридизация о биотиншшрованныии ДНК-зондами регистрируется также во всех случаях нанесения на фильтр нуклеино-eic< кислот, выделенных из корешков растений-приманок сахарной свеклы рззнсго возраста. Пример гибридизации приведен на рис.18. Контролем служила FKK БНПНС. '•}'"'

Такш образсы метод дот-гибридизации нуклеиновых кислот с ¿н-отнкклирозакнкш ДКК-зондамя ка менее чувствителен, чем тот же ые- ' тод с ыечеккьаш кЯНК-зондаш и может быть использован для тестирования ВНЕС в состазе нуклеиновых кислот.-

A B B

- 2 P O,. ; j

3., » * ф-:

' ' ■ ' 4 '.''■"■

Рио.15. Определение ВШИС в бессимптомных листьях системно зараженной сахарной свеклы методом дот-гибридизации при использовании смеси биотинюшрованных вставок плагыид pBF5, pBFll.l-PHK ВНПЖС /3,2; 0,65; 0,13 нг/.2,3- РНК из зараженной сахарной свеклы;4-РНК из здоровой сахарной свеклы / А-В соответствует нанесению нуклеиновых кислот из 0,2; 0,04; 0,008 г растительного материала/. •

А

е в г-

> 2 3 4 5 в

♦.у »д*

• •

ж

Рис.18. Результаты определения ВНПЖС в корешках растений сахарной свеклы методом дот-гибридизации при использовании меченных биоти-ном вставок плазмид рЕР5,рВР11Л-РНК ВНПЖС /3,2; 0,65; 0,13 нг/. 2,3-РНК корешков растений в возрасте 45-ти дней;4,5-РНК корешков растений сахарной свеклы в возрасте 30-ти дней; б-РНК корешков в возрасте 15-ти дней /А-В соответствует нанесению нуклеиновых кислот из 0,04; 0,008-, 0,0016 г растительного материала/. •

/ - 20 - . • ' ' 3. Сравнение различных катодов диагностики ВНГШС. '

Бьшо проведено сравнительное изучение метода ИФА в варианте PAS-EL ISA, рекомендованного Для диагностики ВНШС ори оценке сортов на устойчивость к риаомании /Кремекцова, < 1989/ и метода дот-гибридизации нуклеиновых кислот, по чувствительности, выотроте проведения и удобству, применения. Методой дот-гибридизации о Э2Р-меченными ДНК-зондами былопроаиалиэированоЮО корнеплодов о яоно выраженными признаками ризоманш., Результаты исследования показали, что положительная' гибридизация отмечается в 100 случаях из 100 нанесенных на нейлоновые фильтры образцов РНК, выделенных из исследуемых корнеплодов. . Полученные авгорадиограммы на примере 8 корнеплодов приведены на рио. 17. Чувствительность метода составляла Б,2 пг РНК ВНПЗС. Процедура обнаружения ВНШС в составе РНК помощью 32Р меченного гибридизационного эснда занимает 1 - 7. су ток.. Неплановые или нитроцеллшозные фильтры а ; иммобилизованными на них РНК, могут хранится несколько месяцев, поэтомунх можно приготовить заранее..

При проведении гиОридизацхонного теста на ВКП2С с баотикшш-рованными ДНК зондами были получены аналогичные результаты. Пример гибридизации представлен на рио. 18. Реакция выявления ВНПЗС а ооо-таве нуклеиновых кислот о биотинилированными ДНК-зоядаш происходит в течение 1 - в ч. Чувствительность определения составляет 5,2 пг ВНШЕС. • . :"; '.•: ";'"•• ;.т •

Результаты определения ВКПЖС методом ИФА в варианта PAS-ELISA показали,что при обоих разведениях автясыворотки /1:200 и 1:400/ в 20 из ico проанализированных образцов обнаруживалась отрицательная реакция на ВНШС . Время проведения анализа занимает 10 ч.

Следует отметить, что.наряду с высокой спевдзфктаоЬтью и.более, высокий чувствительностью по сравнения о ЙФА в варианте PAS-ELISA метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кийлот >шеет и другие преимущества. Так, в отличие от получеаия поликлональных антител для j:ca с'использованием животных, главным образом,- кроликов, -i£HK получают за несколько часов в пробиркзх. Вместе с тем, если в случае }11А могут распознавать около 1" генетической информации о вирусном геноме, то кДНК расшифровывают вся генетическую информации /Koenig; 1386/. Благодаря развития методов клонирования чукероднои ДНК а плазмидэх » вирусных в е-юрах кДКК ысашо клонировать и разы-.

ь

' . А Б В

1

2 ФФ9

i 2 5 4. » § 1 • • «;. ■ 7,® в

рио.17; рис.18

7 ф*

8 9

Рис.17. Результаты обнаружения ЕНШС методом дот-гибридизации в состав» нуклеиновых кислот корнеплодов сахарной свеклы при использовании 32Р-меченных кДНК рекомбинантных плазмид рВГ4,рВГ5,рЕП1, рВП4. 1,3-10-РНК из зараженных корнеплодов сахарной свеклы; /А-В соответствует нанесению нуклеиновых кислот из 0,04; 0,008; 0,0016 г ткани корнеплода/. 2-РНК ВНШС/0,0032;0,00065;0,00013 мкг/.

Рио.18. Определение ВНПЖС методом дот- гибридизации в корнеплодах сахарной свеклы при использовании смеси биотинилированных рекомбинантных плазмид рВР4,рВР5,рВИП, рВР14.1-РНК ВНПЖС/ 0,0032 ; 0,00065; 0,00013 мкг/. 2-8-РНК из зараженных _ корнеплодов сахарной свеклы /А-В соответствует нанесению нуклеиновых кислот из 0,04; 0,008;0,0016 ткани корнеплода/.

' - 22 -

ножать в препаративных количествах в бактериях.

Наиболее существенный недостаток метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот о использованием 32Р-меченных кДНК-зондов состоит в том, что рекомбинантная плазмида, содержащая кДНК ВНШС и гибридизующаяся с вирусной ДНК, иммобилизованной на нитроцеллю-лозном или нейлоновом фильтре должна иметь радиоактивную метку, поэтому все работы по подготовке зонда и сам эксперимент со гибридизации нуклеиновых кислот'должны проходить в специально оборудованной лаборатории. Второй недостаток метода заключается в тем, что 32Р имеет период полураспада 14,5 дня, т.е. приготовленный зонд нужно использовать за сравнительно небольшой отрезок времени. Использование биотинилированшх рекомбинантных олазыид в качестве молекулярных зондов о последующей обработкой гибридизационно^,-фильтра коньюгатом сгрептааиднн-щеЛо'шая фосфатаза позволяет при иенять данный метод для идентификации..ВНПЖС в лабораториях, не имеющих специальных разрешении и оборудования для работы с радиоактивными изотопами. Дальнейшая разработка метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, упрощения и совершенствования этого уникального диагностического теота, позволит расширить сферу его использования для диагностики вируоных заболеваний.

выводы

1. Методом Нозерн-бют гибридизации установлено, что гевом изолята ВНШС К-88, циркулирующего в Киргизии и Казахстане состоит из 4 типов РНК.

2. Разработан метод дот-гибридизации нуклеиновых кислот, поз- воляющнй выявить ВНШОС в составе нуклеиновых кислот и в неочищенном сике сахарной свеклы. Чувствительность радиоактивного определения составляет 5,2аг РНК ВНШС. Использование нерадиоактивно¡Меченных биотинисфованных ДНК-зондов позволяет выявить ВНШС в состав? нуклеиновых кислот.

3. Показано, что пйридигацнокный тест с радиоактивно мечен-! ними и Снсглынлированньйш кДНК-зсндзыи пригоден для ранней диагностики БШЗС в латентном б&сааштсияои периоде. j

4.'Установлено распределение вирусных РНК в морфологических частях и. зонах корнеплодов схарнон свеклы при несистемном и снс-.

темной поражении вирусом растений. Показано, что в несистемно зараженной сахарной свеклы наибольшее количество вирусных РНК содержится в месте перехода собственно корня в хвостовую часть корнеплода, что соответствует 1нг РНК ВНПйС.а в системно заражеыой - в верхней части корнеплода - головке. .

6. Результаты исследований показали, что метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот при выявлении равных количеств вирусных РНК в 10 раз чувствительнее .чем метод ИФА в варианта PAS-ELISA. V

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кляченко О. Л. Использование метода дот-гибридизации нуклеиновых кислот для определения локализации вируса некротического пожелтение жилок свеклы //Стан та перспектива роавитку науки в ranyai бу-ряк1внвдтва/ Матер1али наукоао» конференщУ молодих вчених/.-Ки.в; 1993.- 0.7 - 11.

2. Кляченко 0. Л. Диагностика вяруса некротического пожелтения жилок свеклы //Стан та перспектиаи роэвитку науки в галуэ1 буряк1в-ництва / Матер1али иауковоУ кснференцИ' молодих вчених /.- Ки.в; 1993.- 0.11 - 1В. '

3. Кляченко О.Л. Moлeкyляpнá г1брвдизац1я ^ один 1з метод1в тесту-ванвн Bipycy некротичного пояовт1яня жилок буряк!в // Тез. доп. 11 а"1эду Украхяського товариства ф!э1олог1в рослин.-Ки1в,1993.

4. Кляченко О.Л. Диагностика ризоманш сахарной свёклы методом гибридизации нуклеиновых, кислот // Тез. док. 1 Учредительного съезда (VIII) Украинского микробиологического общества. - Одесса, 1993. •

Б. Кляченко О.Л. Мелдрайс Я.А., Глеба Ю.Ю.Нерадиоактивная диагностика вируса некротического пожелтения жилок свеклы методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот//Микробиологический журнал. - 1993 т. N. - /в печати/. '

6. Кляченко О.Л. Мелдрайс Я.А. ;-Кременшва Е.Б. Сравнение различных методов диагностики вируса некротического пожелтения жилок свеклы // микробиологический журнал. - 1993. - /в печати/

О

м