Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические свойства транспортных белков потекс- и гордеивирусов, кодируемых первым из трех генов транспортного модуля

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самуилова, Ольга Витальевна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 578.865:578.233.443

САМУИЛОВА Ольга Витальевна

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ ПОТЕКС- И ГОРДЕИВИРУСОВ, КОДИРУЕМЫХ ПЕРВЫМ ИЗ ТРЕХ ГЕНОВ ТРАНСПОРТНОГО МОДУЛЯ

(03.00.06-Вирусология)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Калинина Наталья Олеговна

Москва, 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений........................................................................5

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:

Структура плазмодесм....................................................................10

Общая характеристика межклеточного транспорта вируса в растении........15

Системы межклеточного транспорта вирусов в растении:

Вирус табачной мозаики.................................................................19

Вирус мозаики костра.....................................................................25

Вирус огуречной мозаики...............................................................27

Межклеточный транспорт вирусов с образованием

тубулярных структур.....................................................................30

Межклеточный транспорт вирусов с тройным блоком генов....................32

X вирус картофеля и родственные потексвирусы..................................34

Вирус штриховатой мозаики ячменя..................................................41

Вирус некротического пожелтения жилок свеклы..................................44

Вирусные РНК хеликазы

Три суперсемейства предполагаемых РНК хеликаз................................46

Консервативные мотивы.................................................................47

Характеристика вирусных хеликаз....................................................49

РНК хеликазаня активность РБК и ДНК вирусов..................................50

Участие хеликаз, в процессах не связанных с репликацией вирусов...........52

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Реактивы..................................................................................54

2. Ферменты.................................................................................54

3. Векторы для клонирования и бактериальные штаммы.........................55

4. Выделение плазмидной ДНК.........................................................55

5. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК.....................56

6. Расщепление ДНК рестриктазами...................................................56

7. Электрофорез в агарозном геле......................................................57

8. Извлечение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы........................57

9. Затупление концов фрагментов ДНК и лигирование...........................57

10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).............................................57

11. Очистка ПЦР-фрагментов электрофорезом в агарозном геле...............58

12. Амплификация на РНК-матрице...................................................58

13. Транскрипция in vitro................................................................59

14. Экспрессия гена 25 кДа транспортного белка ХВК...........................60

15. Хроматографическая очистка (Гис)6-транспортных белков

на №2+-нитрилотриацетатной агарозе.................................................60

16. Электрофорез белков в денатурирующих условиях...........................61

17. Перенос белков с полиакриламидных гелей на

нитроцеллюлозные мембраны..........................................................62

18. Субклеточное фракционирование растительного материала................62

19. Получение антисыворотки к 25 кДа

транспортному белку и иммуноблоттинг.............................................63

20. Анализ активностей АТФазы, ГТФазы, УТФазы..............................63

21. Фотохимическое связывание белков с нуклеозидтрифосфатами...........64

22. Анализ РНК-связывающей активности..........................................64

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Клонирование и экспрессия гена 25 кДа транспортного

белка ХВК и его делеционных вариантов в векторе pQE-ЗО.....................66

Аффинная хроматография 25 кДа белка ХВК и его

делеционных вариантов на Ni-HTA агарозе.........................................70

Анализ НТФазной активности 25 кДа белка ХВК..................................71

Анализ НТФазной активности мутантных вариантов

25 кДа белка ХВК..........................................................................82

РНК-связывающие свойства 25 кДа белка и его

делеционных мутантов...................................................................85

Экспрессия и очистка 63 кДа белка ПЛВМ и его мутантов......................91

Анализ НТФазной активности 63 к Да белка и его мутантов.....................94

Анализ РНК-связывающих свойств 63 кДа белка ПЛВМ и его

мутантных вариантов....................................................................100

Субклеточная локализация 25 кДа белка ХВК в

зараженных растениях..................................................................105

ВЫВОДЫ..................................................................................112

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................113

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ аденозинтрифосфат

БО белок оболочки

ВМБ вирус мозаики бамбука

ВМБК вирус мозаики белого клевера

ВМК вирус мозаики костра

ВМКГ вирус мозаики коровьего горошка

BMJIx вирус мозаики лисохвоста

ВМТ вирус мозаики турнепса

ВМЦК вирус мозаики цветной капусты

ВНМКК вирус некротической мозаики красного клевера

ВНПЖС вирус некротического пожелтения жилок свеклы

ВОМ вирус огуречной мозаики

ВТМ вирус табачной мозаики

ВШМЯ вирус штриховатой мозаики ячменя

ГТФ гуанозинтрифосфат

ДСН додецилсульфат натрия

ДТТ дитиотрейтол

ИПТГ изопропил-1 -тио-Р-Б-галактозид

кДа кило-Дальтон

КС клеточная стенка

НТФ рибонуклеозидтрифосфат

ОРТ открытая рамка трансляции

ПААГ полиакриламидный гель

ПД плазмодесмы

ПЛВМ полулатентный вирус мятлика

ППС предельная пропускная способность

ПЦР полимеразная цепная реакция

Рназин плацентарный ингибитор РНКаз

ТБ транспортный белок

ТБГ тройной блок генов

ТБГр белок, кодируемый тройным блоком генов

ТЕМЕД N, N, N', N' -тетраметилэтилендиамин

Т7 промотор транскрипции бактерофага Т7

УТФ уридинтрифосфат

ХВК X вирус картофеля

ЦТФ цитозинтрифосфат

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР эндоплазматический ретикулум

аа аминокислотные остатки

GUS ß-глюкуронидаза

2+

Ni-HTA нитрилотриацетат в комплексе с катионом Ni

SF суперсемейство

ts температурочувствительный

ВВЕДЕНИЕ

Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении является в настоящее время одной из наиболее изучаемых проблем в молекулярной вирусологии растений. Исследование молекулярных механизмов этого процесса, являющегося, по-видимому, частным примером общей физиологической функции транспорта макромолекул в растениях, имеет не только важное теоретическое значение, но и существенно для разработки эффективных способов защиты растений от вирусной инфекции.

Ключевую роль в процессе вирусного транспорта выполняют кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ), обеспечивающие перенос вирусного генома внутри клетки к плазмодесмам (ПД) - цитоплазматическим каналам, соединяющим соседние клетки растения, далее через ПД в здоровые клетки эпидермиса и мезофилла (межклеточный или ближний транспорт) и по сосудам флоэмы (дальний транспорт) (Carrington et al., 1996).

Реализация функции транспорта обеспечивается множественными функциональными активностями ТБ в процессе их взаимодействия с вирусными нуклеиновыми кислотами и различными вирусными и клеточными белками, участвующими в переносе вирусного генома. ТБ, кодируемые единственным геном у многих филогенетически далеких групп вирусов, несмотря на значительные отличия в первичной структуре, имеют сходные биохимические свойства. Например, для ТБ вируса табачной мозаики (ВТМ), вируса некротической мозаики красного клевера (ВНМКК) и вируса огуречной мозаики (ВОМ) было показано, что они эффективно взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами, связывают ГТФ; содержат сигнал локализации в ПД, увеличивают пропускную способность ПД и способны переносить вирусную нуклеиновую кислоту к/через ПД (Carrington et al., 1996; Ghoshroy et al., 1997). Известно, что за эти активности

ответственны функциональные субдомены ТБ, которые могут физически перекрываться.

Объектом настоящей работы являются ТБ, кодируемые первым геном тройного блока генов (ТБГ) представителей двух различных групп вирусов -потексвируса - Х-вируса картофеля (ХВК) и гордеивируса - полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ). ТБГ представляет собой особый транспортный модуль, перекрывающиеся гены которого кодируют три ТБ, обозначаемых как ТБГр1, ТБГр2, ТБГрЗ (Morozov et al., 1989; Solovyev et al., 1996). Предполагается, что активности ТБ, кодируемых единственным геном, разнесены между тремя ТБ вирусов, имеющих в своем геноме ТБГ (Morozov et al., 1991). ТБГр2 и ТБГрЗ являются высоко гидрофобными белками и ассоциированы с мембранами (Morozov et al., 1990, 1991; Donald et al., 1993) и клеточными стенками (Hefferon et al., 1997). ТБГр1 белок содержит семь консервативных аминокислотных мотивов, характерных для суперсемейства I РНК НТФаз/хеликаз (Gorbalenya and Koonin et al., 1993). Поскольку транспорт вирусного генома требует значительных затрат энергии практически на всех этапах этого процесса, наличие собственной АТФазной активности у ТБ, видимо, является эволюционным приобретением вирусов с ТБГ с целью повышения эффективности распространения вирусной инфекции в зараженных растениях. Детальное изучение биохимических свойств ТБГр1 белков и локализация субдоменов этих белков, ответственных за различные активности, важны как для изучения молекулярных механизмов транспорта вирусов с ТБГ, так и для понимания общих принципов функционирования системы транспорта макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) в растении.

Целью настоящей работы было исследование некоторых биохимических свойств ТБ, кодируемых первым геном ТБГ потексвируса ХВК и гордеивируса ПЛВМ, а также субклеточной локализации ТБГр1 белка

ХВК в зараженных растениях. В ходе исследования решались следующие задачи:

-получение бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных ТБ - 25 кДа белка ХВК и 63 кДа белка ГОШМ и серии их мутантных вариантов;

-изучение НТФазной и РНК-связывающей активностей 25 кДа белка ХВК и 63 кДа белка ПЛВМ и их мутантов;

-выявление функциональных суб доменов ТБГр1 белков, ответственных за эти активности;

-получение поливалентной антисыворотки к 25 кДа белку ХВК и изучение кинетики синтеза и субклеточной локализации этого белка в растениях табака ШсоНапа 1аЪасит, зараженных ХВК.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

При заражении растений вирусы проникают в ограниченное число первично инфицированных клеток. Для успешного развития инфекции необходимо, чтобы вирус из первично инфицированных клеток растения попал в близлежащие здоровые клетки. Для системного инфицирования растения вирус должен проникнуть в проводящую систему растения, а затем покинуть ее для дальнейшего межклеточного транспорта в незараженном листе. Данный обзор литературы посвящен проблеме межклеточного транспорта вирусов в растении.

Структура плазмодесм

Наиболее очевидным и, видимо, единственным путем перемещения вируса из клетки в клетку является его переход через плазмодесмы. ПД -тонкие цитоплазматические каналы, соединяющие соседние клетки растений - играют важную роль в коммуникации клетка-клетка и распределении воды и питательных веществ в растении (Deom et al., 1992). ПД, которые формируются в процессе цитокинеза (первичные ПД), первоначально возникают как тубулярные структуры, ограниченные цитоплазматической мембраной, диаметром около 25-30 нм (рис. 1). Внутри таких структур позже образуется аксиальный компонент, называемый десмотрубочкой, которая состоит из спрессованной мембраны эндоплазматического ретикулума двух соседних клеток (Overall and Blackman, 1996). С помощью высокоразрешающего электронного микроскопа были обнаружены белки, встроенные в плазматическую мембрану (Р2), и эндоплазматический ретикулум (PI). Эти белки соединяли "мостики" из белка, которые разделяют ПД на микроканалы (Overall and Blackman, 1996). В разрезе ПД делится на 10-20 дискретных цилиндрических каналов, каждый из которых имеет радиус 1,5-3,0 нм (Robards, 1975; Terry and Robards, 1987). При поперечном сечении ПД обнаруживается, что эти каналы образованы окружающими

десмотрубочку глобулярными структурами, каждая из которых имеет диаметр около 5 нм (Robarás, 1975).

мк

L Р2

Рис.2 Схема устройства сложной развлетленной

плазмодесмы (из Lucas and Gilbertson, 1994).

ДТ

Рис.1 Схема устройства плазмодесмы (из Lucas and Gilbertson, 1994). Сверху - продольное сечение, правее -поперечное сечение. КС - клеточная стенка, СП- срединная пластинка, ДТ- десмотрубка, МК-микроканал, PI, Р2, L - белки плазмодесм ПМ-плазматическая мембрана.

Механизм, контролирующий местоположение и плотность первичных ПД неизвестен, но показано, что во всех клеточных стенках в пределах меристемы первичные ПД представлены с высокой частотой расположения (Lucas and Gilbertson, 1994). ПД, обазующиеся после цитокинеза (вторичные ПД), формируются в результате слияния плазматических мембран. Простые вторичные ПД могут образовываться на новом месте в результате инвагинации плазматической мембраны и эндоплазматического ретикулума в клеточную стенку одновременно с двух сторон. Чаще сложные вторичные ПД (рис. 2) образуются из первичных (Ding et al., 1992). Формирование вторичных ПД необходимо для нормального функционирования листа. Блокирование образования вторичных ПД в клетках мезофилла табака коррелирует с началом ускоренного старения (Ding et al., 1993).

Белковый состав ПД до конца не изучен, однако, известно, что белки с молекулярными массами 26 и 27 кДа (РАР26 и РАР27) являются

компонентами ПД (Yahalom et al., 1991; Kotlizky et al., 1992). Эти белки иммунологически гомологичны белкам семейства коннексинов, выделенных из межклеточных соединений клеток животных. Клеточное фракционирование показало, что РАР27 содержится в мембранной фракции, а РАР26 ассоциирован с клеточными стенками. В центре десмотрубочки находятся белковые частицы, связанные нитчатыми структурами с белковыми глобулами на наружной поверхности эндоплазматического ретикулума, что помогает поддерживать структуру десмотубулы (Citovsky et al., 1993). Белковые глобулы на поверхности десмотубулы, вероятно, представлены актином, поддерживающим структуру ПД, так как актин был локализован в ПД и при обработке протеазами или цитохалазином, разрушающим актин, увеличивается диаметр ПД, особенно в районе "шеи" (участок ПД, плотно прилегающий к клетке) (Overall and Blackman, 1996). В области "шеи", а также в области центральной полости (у некоторых ПД есть в середине слегка увеличенная полость между плазматической мембраной и десмотрубочкой) обнаружены белковые спицы, соединяющие актиновые глобулы с белками плазмалеммы. Скорее всего, они состоят из миозина (Overall and Blackman, 1996; Citovsky et al., 1993).

В плазматической мембране в районе "шеи" есть якорные белки, взаимодействующие с сократительными белками и с предполагаемым внеклеточным сфинктером (возможно, эти внеклеточные структуры обеспечивают заякоривание компонентов ПД на клеточной стенке). Сократительные белки связывают плазматическую мембрану с

эндоплазматическим ретикулумом в районе "шеи" и представлены, по-

2_|_

видимому, центрином — С а -связывающим фосфопротеином, основным белком ряда нитчатых структур. Эти структуры быстро сокращаются при повышении внутриклеточной концентрации Са , а их удлинение АТФ-зависимо и сопряжено с фосфорилированием.

Результаты опытов по микроинъекции флуоресцентно-меченных молекул декстрана разного размера и данные электронной микроскопии показали, что предельная пропускная способность (ППС) ПД клеток мезофилла здоровых растений составляет 1 кДа, причем вычисленный радиус Стокса для молекул такой массы, равный 0,75 нм, соотносился с диаметром (1,5 нм) микроканалов (Wolf et al., 1989). Недавние эксперименты с использованием новых низкомолекулярных флуоресцентных красителей свидетельствуют о том, что ПД играют большую роль в процессе развития растений. Эмбрионы высших растений объединены в простой симпласт, где цитоплазма всех клеток соединяется между собой посредством ПД. В процессе развития растения отдельные группы клеток становятся изолированными, причем основную роль здесь играют именно ПД, которые по какой-то причине перестают функционировать. Такая изоляция приводит к тому, что отдельные компартменты растения функционируют независимо друг от друга, что позволяет рассматривать зрелое цветущее растение как мозаику симпластических доменов (McLean et al., 1997). При этом система является динамичной и в ответ на физиологические условия, условия внешней среды, ППС ПД может уменьшаться или полностью элиминироваться, предотвращая транспорт, либо увеличиваться, позволяя перемещаться через ПД большим молекулам (Ghoshroy et al., 1997).

Размер ПД значительно меньше размера вирусных частиц и произвольно свернутой нуклеиновой кислоты. Было обнаружено, что фосфоинозитиды, а также (З-глюкан (каллоза) способствуют уменьшению проницаемости ПД (Baron-Eppel et al., 1988; Wolf et al., 1989). Работы последних лет представили доказательства участия эндогенных макромолекул в изменении ППС ПД в растении. Например, показано, что транскрипционный фактор из кукурузы гомеодоменный белок KNOTTED 1 (KN1) передвигается из клетки в клетку. В процессе развития кукурузы мРНК, кодирующая KN1, выявляется во всех меристемных слоях, включая

наружный. Эксперименты по микроинъекции показали, что белок увели�