Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические свойства белков, участвующих в образовании транспортных форм у некоторых РНК-содержащих вирусов растений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Калинина, Наталья Олеговна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что транспортные белки, кодируемые первым геном тройного блока потексвирусов и гордеивирусов и содержащие семь консервативных НТФазно/хеликазных мотивов (ТБГ1 белки), обладают Мд2*-зависимой нуклеозидтрифосфатазной (НТФазной) активностью. Активность НТФазы обеспечивается первыми тремя консервативными мотивами.

2. Обнаружено, что ТБГ1 белки потексвирусов и гордеивирусов обладают хеликазной активностью. На примере ТБГ1 белка гордеивирусов показано, что они способны расплетать РНК-, но не ДНК-дуплексы, как в направлении 5'->3', так и в противоположном направлении.

3 Доказано, что ТБГ1 белок гордеивирусов состоит их двух функциональных доменов: N-концевого и С-концевого. Все известные ферментативные активности этого белка обеспечиваются в полной мере его С-концевым доменом, функционально сходным с полноразмерным ТБГ1 белком потексвирусов.

4. N- и С-концевые домены ТБГ1 белка гордеивирусов обеспечивают разные типы взаимодействия с РНК. В составе N-концевого домена картированы два кластера положительно заряженных аминокислот, отвечающих за «некооперативное» связывание с РНК. С-концевой домен гордеивирусов, как и полноразмерный ТБГ1 белок потексвируса, взаимодействуют с РНК кооперативно. Участок, ответственный за кооперативное связывание с РНК, локализован на N-конце белка потексвируса и в пределах N-концевого участка С-концевого домена гордеивируса, включая первые три консервативные мотива. Полноразмерный ТБГ1 белок гордеивирусов способен образовывать in vitro РНП-комплексы обоих типов.

5. Показано, что ТБГ1 белки потеке- и гордеивирусов способны образовывать in vitro гомоолигомеры. Участок, ответственный за олигомеризацию, перекрывается с участком, участвующим в кооперативном связывании белков с РНК.

6. Показано, что белок оболочки (БО) потексвируса (Х-вируса картофеля) обладает Мд2*-эависимой АТФазной активностью. Делеционный мутант БО, неспособный обеспечивать межклеточный транспорт вируса in vivo, ферментативной активностью не обладает. БО и вирионы ХВК способны связываться с микротрубочками in vitro. Вирионы ХВК индуцируют полимеризацию тубулина с образованием фенотипически нормальных • микротрубочек, собранных в характерные пучки, тогда как свободный БО индуцирует ■ образование аберрантных полимеров тубулина.

7. Показано, что независимый от БО транспорт геномной РНК бромовируса огуречной мозаики обеспечивается мутантным транспортным белком (ТБ) с делецией по С-концу, по-видимому, за счет значительного повышения эффективности его кооперативного взаимодействия с РНК. Предположено, что изменение свойств определяется изменением конформации мутантного белка, образующего in vitro РНП-комплексы, которые морфологически значительно отличаются от комплексов, образуемых ТБ дикого типа.

8. Показано, что белок межклеточного транспорта умбравируса взаимодействует с РНК по «некооперативному» типу, а белок дальнего транспорта - кооперативно, образуя комплексы различной структуры in vitro. Выявлена способность ТБ дальнего транспорта к олигомеризации.

9. Обнаружено, что ТБ дальнего транспорта умбравируса образует in vivo ; нитевидные РНП-частицы с участками спиральной структуры, содержащие вирусную РНК. , РНП-частицы обнаружены в составе аморфных включений преимущественно в цитоплазме ' клеток, ассоциированных с флоэмой. Предположено, что эти РНП-частицы участвуют в процессе транспорта вирусного генома по проводящей системе растения в качестве функциональной альтернативы вирионам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Захарьев В.М., Гизатуллин Р.З., Шульга O A., Катков B.C., Калинина Н.О., Тальянский М.Э., Атабеков И.Г., Скрябин К.Г. 1989. Создание трансгенных растений Nicotianum tabecum, устойчивых к Х-вирусу картофеля ДАН СССР, 309,1241-1243.

2. Дорохов Ю.Л., Карпова О.В., Калинина Н.О., Иванов К.И., Фролова О.Ю., Самуилова О.В., Родионова Н.П., Атабеков И.Г. 1996. Кодируемые тобамовирусами транспортные белки подавляют трансляцию геномных вирусных РНК in vitro. Доклады РАН, 349, 259261.

3. Kalinina N.O., Fedorkin O.N., Samuilova O.V., Maiss E., Korpela Т., Morozov S.Yu. and Atabekov J.G. 1996. Expression and biochemical analyses the recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBS Letters, 397, 75-78.

4. Самуилова O.B., Калинина H.O., Морозов С.Ю. 1997. Неструктурный 25 кДа транспортный белок обладает активностями АТФазы, ГТФазы и РНК-связывающего белка. Н-ой Биохимический съезд, Москва, Россия.

5. Samuilova O.V., Kalinina N.O., Morozov S.Yu. and Atabekov J.G. 1997. The 25-kilodalton protein of potato vius X has the characteristics of RNA-binding Mg2+-dependennt ATPase/GTPase. 16th Annual meeting of American society for virology, Montana State University, Bozernan, Montana, USA., 213.

6. Калинина H.O., Самуилова O.B., Федоркин O.H., Зеленина Д.А., Морозов С.Ю.1998. Биохимическая характеристика и субклеточная локализация транспортного 25 кДа белка Х-вируса картофеля. Молекулярная биология, 4, 686-691.

7. Samuilova O.V., Kalinina N.O., Solovyev, A.G., Savenkov ,E.I., Morozov S.Yu. 1998. Mapping of NTPase domain in TGBpl protein of hordei- and potexviruses. 17th Annual

Mapping of NTPase domain in TGBpl protein of hordei- and potexviruses. 17th Annual meeting of American society for virology, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada.

8. Morozov S.Yu., Solovyev A.G., Fedorkin O.N., Savenkov E.I., Kalinina N.O., Samuilova O.V., Schiemann J., Atabekov J.G. 1998. Studies on the functional properties of the movement proteins encoded by the triple gene block. Molecular mechanisms of stress responses in plant. International symposium. Moscow, Russia. 9. Solovyev A.G., Savenkov E.I., Grdzelishvili V.Z., Kalinina N.O., Morozov S.Yu., Schiemann J., Atabekov J.G. 1999. Movement of hordeivirus hybrids with exchanges in the triple gene block. , Virology, 253, 278-287.

10. Morozov S.Yu., Solovyev A G., Kalinina N.O., Rakitina D.V., Yelina N.E., Fedorkin O.N., Schiemann J. and Atabekov J.G. 1999. Structural and functional analogies in plant virus movement proteins: 7th Symposium "New aspects of resistance research on cultivated plants", Aschersleben, Germany.

11. Morozov S.Yu., Solovyev A.G., Kalinina N.O., Fedorkin O.N., Samuilova O.V., Schiemann J., Atabekov J.G. 19S9. Evidence for two nonoverlapping functional domains in the potato virus X 25K movement protein. Virology, 280,55-S3. 12. Morozov S. Yu„ Solovyev A. G., Kalinina N.O., Fedorkin O. N., Yelina N.E., Rakitina D.V., Makinen K., Merits A., Schiemann J. and Atabekov J. G. 2000. Structural and functional analogies between triple gene block and other plant virus cell-to-cell transport systems. Proceedings of the 7th Aschersleben Symposium, Aschersleben, Germany. Beitrage zur Zuchtungsforschung, 6,101-106. 13.Meritz A., Fedorkin O.N., Guo D., Kalinina N.O., Morozov S.Yu. 2000. Activities associated with the putative replication initiation protein of Coconut foliar decay virus, a tentative member of the genus Nanovirus. J. Gen. Virology, 81, 3099-3106.

14. Kalinina N.O., Rakitina D.V., Yelina N.E., Solovyev A.G., Morozov S.Yu. 2000. Multifunctional protein components of transport systems in general hordeivirus and potexvirus: evidence for subdomen organization of the movement TGB1 proteins EMBO Workshop, Plant viruses invasion and host defence, Crete, Greece, 77.

15. Kalinina N. O., Rakitina D. A., Yelina N. E., Zamyatnin A. A., Jr, Stroganova T. A., Klinov D. V., Prokhorov V. V., Ustinova S. V., Chernov B. K„ Schiemann J., Solovyev A. G., and Morozov S. Yu. 2001. RNA-binding properties of the 63 kDa protein encoded by the triple gene block of poa semilatent hordeivirus. J. Gen. Virol. 82,2569-2578.

16. Nurkiyanova K.M., Ryabov E.V., Kalinina N.O., Fan Y„ Andreev I., Fitzgerald A.G., Palukaitis P., Taliansky M. 2001. Umbravirus-encoded movement protein induces tubule formation on the surface of protoplasts and binds RNA incompletely and non-cooperatively. J. Gen. Virol. 82, 2579-2588.

17. Taliansky M„ Rybov E., Kalinina N., Robinson D., Roberts I., Oparka K. 2001. Umbravirus ORF3-encoded protein is a multifunctional RNA-binding protein that both stabilizes viral RNA and mediates its systemic spread. 20th Annual meeting of American society for virology, University of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, 139.

18. Rakitina D., Kalinina N., Yelina N., Solovyev A., Klinov D., Morozov S. 2001. Helicase, NTPase and RNA-binding activities of the 63 kDa protein encoded by the triple gene blok of poa semilatent hordeivirus. Abstracts of 27m Meeting of the Federation of European

Biochemical Societies, Lisbon, Portugal.

19. Morozov S. Yu., Kalinina N.O., Rakitina D.V., Yelina N.E., Solovyev A.G. and Atabekov J.G. 2001. Helicase activity and RNA-binding properties of the 63 kDa protein encoded by the triple gene blok of poa semilatent hordeivirus. Abstracts of 6th Internation! symposium of positive RNA viruses, Paris, France

20. Kalinina N. O., Rakitina D. A., Solovyev A. G., Schiemann J. and Morozov S. Yu. 2002. RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of the triple gene block. Virology, 29S, 321-329.

21. Rakitina D., Kalinina N., Solovyev A. and Morozov S. 2002. Movement protein TGBplnas RNA-helicase. Internation Union of Microbiological Societies World Congresses. The World of Microbes. Xltth international Congress of Virology. Paris, France, 506.

22. Serazev, Т., Nadezhdina, E. S., Shanina, N. A., Kalinina, N. O. and Morozov, S. Yu. Potato virus X virions and free coat protein differently interact with microtubules in vitro: promoting tubulin polymerization and competing with MAP2. Internation Union of Microbiological Societies World Congresses. The World of Microbes. Xllth International Congress of Virology. Paris, France, 1223.

23.Серазев ТВ., Надеждина EC., Шанина H.A., Калинина Н.О., Морозов С.Ю. 2002. Взаимодействие белка оболочки Х-вируса картофеля с тубулином и микротрубочками. Ill-й Биохимический съезд, Санкт-Петёрбург, Россия, 917.

24.Taliansky М., Roberts I.M., Kalinina N., Ryabov E.V., Raj S.R., Robinson D.J. and Oparka K.J. 2003. Ал umbraviral protein, involved in long-distance RNA movement, binds viral RNA and forms unique, protective ribonucleoprotein complexes. Journal of Virology,77,3031-3040.

25. Serazev T.V., Kalinina N.O., Nadezhdina E.S., Shanina N.A., Morozov S.Yu. 2003. Potato virus X coat protein interacts with microtubules in vitro. Cell Biology International, 27,271-272.

26.Gorshkova E.N., Erokhina T.N., Stroganova T.A., Yelina N.E., Zamyatnin A.A.Jr., Kalinina N.O., Schiemannn J., Solovyev A.G., Morozov S.Yu. 2003. Immunodetection and fluorescent microscopy of trangenically expressed hordeivirus TGBp3 movement protein reveals its association with endoplasmic reticulum elements in close proximity to plasmodesmata. J.Gen.Virol. 84,985-994.

27. Kalinina N.O. Analysis of biomolecular interactions between plant-virus-encoded and host proteins, and viral particles and proteins by surface plasmon resonance. 2003. Microbiology Today, 30,136-137.

28. Kalinina N. Roberts I.M., Ryabov E.V., Robinson D.J. Oparka K.J. and Taliansky M., 2003. An umbraviral long-distance protein forms unique, protective ribonucleoprotein complexes. 11th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. St.-Peferburg, Russia, 173.

29. Серазев T.B., Надеждина E C., Шанина H.A., Лещинер А Д.,.Калинина Н.О, Морозов С.Ю. 2003; Вирионы и белок оболочки Х-вируса картофеля взаимодействуют с микротрубочками и способствуют полимеризации тубулина in vitro. Молекулярная биология, 37,.6,1080-1088.

30. Kim S.-H., Kalinina N.O., Andreev I., Ryabov E.V., Fitzgerald AG., Taliansky M.E., Palukaitis P. 2004. The cucumber mosaic virus 3a protein C-terminal 33 amino acids affect virus movement, RNA-binding and inhibition of infection and translation. J.Gen.Virol. 85, 22i

230.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гипотеза об активном транспорте вирусного генома в растениях в форме рибонукпеопротецдных (РНП) частиц при участии вирус-специфических транспортных белков (ТБ) была сформулирована И.Г. Атабековым и Ю Л. Дороховым в 1984 г. В настоящее время получено значительное количество экспериментальных данных о растений до сих пор не удалось. Тем не менее, имеющиеся данные подтверждают, что ключевым этапом в реализации транспортной функции вируса является формирование особой формы вирусного генома, компетентной для транслокации внутри клетки, между соседними клетками растения и по его проводящей системе. Кроме того, стало очевидным, что транспортные формы вирусного генома структурно и функционально различаются у вирусов растений, принадлежащих к разным таксономическим группам, и даже одного и того же вируса на разных этапах транспорта (например, в процессе транспорта меиеду клетками эпидермиса и мезофилла и в процессе дальнего транспорта по проводящей системе растения).

В настоящей работе на примере РНК-связывающих ТБ вирусов различных таксономических групп мы попытались установить как общие закономерности, так и различия в свойствах ТБ, формирующих транспортные РНП-комплексы, и выявить структурные особенности этих комплексов.

Изученные ТБ (за исключением ТБГ1 белков двух классов) не имеют гомологии в аминокислотной последовательности, однако сходны функционально; их основным свойством является структурирование и неспецифическая упаковка РНК с образованием активного вирусного РНП-комплекса. В связи с этим можно выделить ряд общих свойств этих белков: 1) это основные белки, значение pi которых более 8,0; для них харастерно наличие кластеров и отдельных положительно заряженных функциональных аминокислотных остатков, вовлеченных в связывание с РНК; 2) в растворе эти белки обладают значительной РНК-связывающей активностью, образуя стабильные РНП-комплексы, устойчивые в растворах с высокой ионной силой; кроме того, эти белки обладают сродством к оцЦНК и дцРНК; 3) белки способны образовывать олигомеры; 4) есть все основания полагать, что именно конформация молекулы ТБ определяет его активность; 5) нельзя исключить, что пространственная структура РНК-связывающих доменов различных ТБ может иметь общие черты; 6) белок оболочки (БО) потексвируса X-вируса картофеля (ХВК), образующий транспортную форму (вирион), обладает рядом свойств ТБ - АТФ-связывающей и АТФазной активностями и способностью взаимодействовать с микротрубочками.

Изучение РНК-связывающих двойств ТБ и визуализация образуемых ими in vitro РНП-комплексов позволяет выделить два основных типа ТБ и образуемых ими структур: 1. ТБ первого типа кооперативно взаимодействуют с РНК и образуют комплексы, в которых молекулы белка плотными кластерами закрывают молекулу РНК, а участки свободной РНК встречаются достаточно редко (За, ЗадСЗЗ, ORF3 белки, НТФазно/хеликазный домен ТБГ1 класса I и ТБГ1 класса II). Очевидно, что для ремоделирования таких РНП-комплексов при транслокации через ПД требуются значительные энергетические затраты. В ремоделировании комплекса, видимо, участвуют клеточные шапероны (von Вагдеп et al., 2001; Aoki et al., 2003; Roberts and Oparka, 2003). Способствовать этому процессу может специальная модификация ТБ, приводящая к изменению его конформации и ослаблению РНК-связывающих свойств и/или степени кооперативное™ взаимодействия. Такие изменения могут обеспечиваться за счет фосфорилирования, подобно выявленному для ТБ вируса табачной мозаики (ВТМ) и некоторых других вирусов (Waigmann et at., 2000; Karpova et al., 1999; Kawakami et al., 1999; Matsushita et al., 2000), и/или связывания a, возможно, и гидролиза НТФ (АТФ или ГТФ) (Li and Palukaitis, 1996) при участии ферментов растения-хозяина. Этой же цели, видимо, служит присутствие АТФазы/хеликазы непосредственно в составе РНП-комплекса у ТБГ-содержащих вирусов класса I (гордеи: подобные вирусы).

2. ТВ второго типа образуют гибкие нитевидные комплексы, представляющие собой, по: видимому, отдельные молекулы белка или их небольшие кластеры, равномерно покрывающие молекулу РНК с достаточно протяженными и часто встречающимися участками свободной РНК (ORF4 белОк, N-концевой домен и полноразмерный белок ТБГ1 класса I). Способность тБ к олигомеризации может помогать формированию компактных РНП-глобул для последующей транспортировки внутри клетки. Следует отметить, что РНП-комплексы «некооперативного» типа образует основной структурный бело к эукариотических мРНП - р50. В определенных условиях (при низких молярных отношениях белок:РНК) "ТБ, кооперативно связывающие РНК, также способны образовывать РНП-комплексы «некооперативного» типа (Kiselyova et al., 2001). Представляется, что данный тип структуры имеет ряд преимуществ, так как позволяет легче (с меньшими энергетическими затратами) ремоделировать РНП-комплекс. Хотя и в этом случае для ремоделирования комплекса требуется участие клеточных ферментов и/или собственных ферментативных активностей ТБ. Дополнительным свидетельством в пользу существования подобной формы in vivo являются данные о том, что ORF4 белок умбравируса может комлементировать транспортную функцию ТБ «кооперативного» тта (За ТБ вируса огуречной мозаики) и БО ХВК, а также обнаружение в зараженных растениях гибких нитевидных вирионо-подобных РНП-часгиц с элементами спиральной симметрии, образуемых ORF3 белком умбравируса, и возможно, представляющих собой транспортную форму вирусного генома.

Таким образом, вирусы растений, которые не пользуются тубулами для транслокации вирионов мехеду соседними клетками, образуют транспортную форму двух типов - или РНП-комплекс, образованный ТБ (иногда при участии БО), или нитевидный вирион. Вирусы, образующие транспортный РНП-комплекс, могут принципиально отличаться по количеству и по свойствам ТБ (например, в случае ТБГ-содержащих гордеивирусов один из ТБ обладает активностью АТФазы/хеликазы). Возможные типы РНП-комплексов, образованных in vitro и in vivo, рассматривались выше. Однако, общим для всех этих вирусов является то, что размер их РНК не превышает 5-6 тыс. нуклеотидов, а транспортная система может быть эффективно заменена на единственный ТБ ВТМ-подобного типа, использующий для своего перемещения по растению исключительно клеточные системы транспорта.

Нитевидный вирион как транспортная форма представляет сложно организованную структуру с рядом дополнительных функций. Видимо, в зависимости от размера генома, «транспортный» вирион либо временно модифицируется ТБ (потексвирусы, размер РНК ХВК около 6,5 тыс. нуклеотидов) (Atabekov et al., 2000); либо содержит дополнительные вирусные белки (VPg-белок) и также временно взаимодействует с еще по крайней мере двумя вирусными белками (НС-Pro и CI), как это показано для лотивирусов (размер РНК около 10 тыс. нуклеотидов) (Carrington et al., 1998; Roberts et al., 1998; Dolja et al., 1994, - 1995; Rojas et al., 1997; Revers et al., 1999). В составе вириона кпостеровирусов (с наибольшим размером РНК от 15 до 20 тыс. нуклеотидов) с участием нескольких ТБ формируется специальная структура для обеспечения транспорта вируса (Napuli et al.,

2000; 2003; Dolja, 2003). Во всех этих случаях, по крайней мере, один из ТБ обладает активностью АТФазы/хеликазы/шаперона. Более того, метод временной комплементации показал, что БО потеке-, поти- и клостеровирусов обладают некими общими функциями, имеющими отношение к транспорту, которые прямо не связаны с инкапсидацией генома (Fedorkin et al., 2000; 2001). Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о том, что БО, формирующий «транспортный» вирион потексвирусов, обладает АТФ-связывающей, АТФазной активностью и взаимодействует с микротрубочками. Возможно, что все эти свойства имеют отношение к реализации транспортной функции вириона. В любом случае, транспортная система таких вирусов является уникальной и не может быть заменена единственным ТБ.

В целом, сравнительный анализ функций ТБ, принадлежащих к различным транспортным системам, и структуры образуемых ими РНП-комплексов, является новым шагом в понимании специфических особенностей транспортной формы вирусных геномов.