Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация геномной РНК Х вируса шалота

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация геномной РНК Х вируса шалота"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

> ■ Л На правах рукописа

2 !\ а ИТ ;

РЯБОВ Евгений Витальевич

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМНОЙ РНК X ВИРУСА ШАЛОТА. (03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

МОСКВА - 1994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной вирусологии В!М! сельскохозяйственной биотехнологии РАСХИ.

Научный руководитель: доктор биологических ноу!

Завряеп С.К

Официальные оппоненты: доктор биологических нау!

Дороюв Л.Л. кандидат биологических ш Лунин В.Г.

Ведущая организация - Институт микробиологии РАИ

Защита диссертации сосотоится " нА 1994 г.

в _ час. на заседании Сяециализированого Совета Д.020.40,01 при

ВШИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 187550, г.Москва, ул.Тимирязевская, д.42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХИ.

Автореферат разослан " г.

Ученый секретарь .Специализированного Совете, кандидат биологических наук Меликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

руальность проблемы. Прогресс в исследовании фитовирусов в зчительной степени" связан с результатами исследований структуры зусных геномов, которые проводило в последнее десятилетие. Эта шые легли в основу изучения механизмов репликации и экспрессия эусных геномов, взаимодействия вируса с растениями и реносчикзми, транспорта вирусной инфекцию и т.д.. Сравнительный элиз последовательностей вирусных РНК дал возможность выявить погенетические отношения между группами фитовирусов и некоторые 1ектн 1« эволюции. Работы направленные на изучение структуры и этрессш геномов фитовирусов имеют также и и практическое ачение, поскольку являются основой для разработки принципиально вых методов звщиты растений от вирусной инфекции.

Тем не менее, вирусы, поражаицие многие группы растений, таются недостаточно изученными. В их число входят и вирусы стений рода АШш. Эти растения, в особенности те из них, торые размножаются вегетативно, обычно поражаются несколькими русами. Это связано с латентным характером инфекции и обепностями репродукции хозяев. Выделение и изучение отдельных мпонентов вирусных комплексов из данных растений осложняется тем, о вирусы сложно разделить используя традиционные подходы.

Темой настоящей диссертационной работы явилось иследование руктуры генома представителя ранее неизвестной группы фитовирусов X вируса шалота (ХВШ), являющегося основным компонентом вирусного мплекса, персиструвдего в растениях лука-шалота. Вирусы, дственные ХВШ, судя по результатам последних работ, поражают и угие виды рода. Следует отметить, что к началу этого исследования 991 г.) данные о структуре геномов вирусов растениий рода АНиЫ все отсутствовали.

(ель и задачи исследования. Целью настоящей работы было ¡ределение полной нуклеотидяой последовательности геномной РНК :Ш. В ходе исследования решались следующие специфические задачи:

клонирование и картирование ХВШ-специфических кДНК, ана первичной структуры клонированных фрагментов кДНК ХВШ, выясне. полной нуклеотвдной последовательности геномной РНК Xí сравнительное изучение кодируемых РНК ХВШ белков, экспрессия р* вирусных белков в E.colí, изучение особенностей экспресс З'-концевых генов ХВШ In vitro и in vivo.

Научная новизна работы. В настоящей работе определена полн структура геномдаПЖ ХВШ. Представлены данные о гомологии ря белков ХВШ с соответствующими генами, кодируемыми геномами карла-потексвирусов и особенностях организации генома ХВШ, позволят выделить ХВШ в новую группу фитовирусов. Экспрессия ряда концевых цистронов была исследована in vI tro и in vivo.

Практическая ценность работы. Данные о нуклеотидаой послед вательности ХВШ, первого отсеквенированнго представителя нов группы вирусов, обнаруженных в растениях рода Allium, могут бы1 использованы для создания основанных на методе ПЦР chcti тестирования ХВШ-подобных вирусов. Для этих целей также мог; использоваться сыворотки, полученные к рекомбшантным 42К белку белку оболочки ХВШ, экспрессированным в E.colí.

Апробация работы. Материалы исследований были представлены на шко; FIBS "Фундаментальные и прикладные проблемы фитопатологии." (Шт май 1994). Основные результаты работа отражены в четырех печати работах, список которых приводится в конце автореферата.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, глав "Обзс литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение* заключения, выводов и списка использованной литературы, вшшчащех библиографических ссылок. Работа изложена на 133 страницах содержит 22 рисунка.

¿

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Структурная организация геномной РНК ХВШ.

1.1.Стратегия определения нуклеотидной последовательности.

РНК выделяли из очищенного препарата ХВШ методом фенольной протеинизации (Proli et ai.,. 1981). Электрофоретаческая даижность РНК ХВШ соответствовала 8-9 kb.

ДНК комплементарную РНК ХВШ синтезировали по методу (Watson & ickeson, 1986) , используя в качестве затравки олиго((И?)12_18. купленную с помощью Т4 ДНК-полимеразн кДНК встраивали по Smal или .ncll сайтам в шгазмиды pGEU3z, pGEH5z или pGEUTz (Promega). >рвоначальный отбор клонов, содержащих фрагменты кДНК, ютветствувдие З1-концу РНК ХВШ, проводили методом гибридизации >лошй на фильтре с 32р меченной первой цепью кДНК ХВШ. 1травленной олиго

Клоны, содержащие кДНК 5'-концевых участков геномной РНК ХВШ, экже отбирались методом гибридизации колоний на фильтре. >следовательно в качестве зондов использовались радиоактивно гченные фрагменты кДНК ХВШ соответствующие областям геномной РНК зиболее удаленным от 3'-конца.

Были отобраны восемь плазмид, содержащих фрагменты кДНК, грекрывавдих всю геномную РНК ХВШ, за исключением 98 5'-концевых рклеотидов (Рис 3). Последовательность 5'-концевых нуклеотидов РНК ВШ была определена методом прямого дидеоксинуклеотидного нквенирования РНК обратной транскриптазой.

Протяженные кДНК вставки клонов укорачивали с помощь» кзонуклеазы III по протоколу Егаэе-а-Вазе system, Promega. уклеотидные плоследовательноста подученных серий клонов с днонаправлешшми делениями кДНК определяли методом идеоксинуклеотидного сиквенирования по Сепгеру (Sanger et al., 977), с использованием [а 32р]~ или {аЗЭр]&АТР я модифицированной НК полимеразы фага Т7 (Sequenазе, US Blochemicala).

.З.Кодирущие районы геномной РНК X вируса шалота.

РНК ХВШ протяженностью 8890 нт. (без учета поли(А) на '-конце) было выявлено шесть протяженных открытых рамок считывания ОРС), схематично представленных на Рис. 1.

5'-проксимальная ОРС геномной РНК ХВШ кодирует потенциалышА юлипептид длиной 1718 аминокислотных остатков и мол. массой 1Я4?;.'.

(195К белок). Эта рамка начинается с диа-кодона в положении 99 терминируется в положении 5252. Вторая ОРС (инициаторный кодон положении 5315, терминирующий в положении 6037) кодиру) потенциальный полипептид длиной 241 остаток с мол. массой 263 (26К белок); ОРСЗ (Аиа-кодоном в положении 6018, терминатор положении 6326) кодирует потенциальный белок длиной 103 остатков мол. массой 11254 (11К белок). Четвертая ОРС (инициаторный кодон положении 6440, терминируиций кодоном в положении 7579) кодиру« потенциальный полипетид длиной 380 остатков с мол. массой 422С (42К белок). 0РС5 (инициаторный и терминирунщй кодоны в положенш 7606 и 8392, соответственно), кодирует потенциальный белок длине 262 остатков с мол. массой 28486 (28К белок). 3'-проксимально? ' 0РС6 (АИС-кодон в положении 8394, терминирующий кодон в положен 8777) кодирует потенциальный белок длиной 128 аминокислотнь остатка с мол. весом 14741 (15К белок).

195К Ж 42К

кг НЕТ,

11К

Т5Г

¿000 рХ22

|ооо ¿ООО рХ43

рХ34

100020003000 рХЗ

__ ___

4000

рХбО

'рХ16

6000

-1 I

рХ55

рХЗ

|_1_I

рХ5

Рисунок 1. Схематическое изображение шести открытых рамо считывания геномной РНК X вируса шалота. Внизу изображен перекрывавдниеся клоны кДНК, использованные для секвенироваш

2.4.Анализ аминокислотных последовательностей потенциальных белков ХВШ. 2.4.1.195К белок. '

Ю-концевая часть потенциального 195К белка протяженность: отало 230 аминокислотных остатка обладает сходством с аналогичным) участками РНК-реплик аз Синдбис подобных вирусов. Наибольшее сходство обнаружено с указанными доменами потеке- (35-40%), карла (?.0*), КЯ1ШШО- (16%) и тимовирусов (27%), которые били обгедшшш в тшжшодобнув группу (Яогапоу о г а1., 1991). В последователыюст!

белка ХВШ выявляются охарактеризованные ранее (Иогапоу 1.,1991) консервативные мотивы, присутствующие в пвР1 белке са Синдбис и в . я-кощевих участках РНК-решшказ других бис-подобных вирусов (Рис. 2).

Экспериментально продемонстрировано, что пзР1 белок вируса бис обладает метилтрансферазной активностью и необходим для одукции вируса (М1 а1.,1989; И1 & 31;111а1М991).

SO-TimPGITTSPPATTSHTHAADKIXENDCIÍC-l G-LRRSKI- 8-PQNYCÍIKPKDViRYG-IT 50-D**G*»*A*N*YSIKL*****A*'I!***KI>*B-15-**PR*I>- 9-*»*VAI*»R*-*A**PKE*

54-K*SMA**YL«*YSAVY*S*PVC*TL**YT*Y-15-I*ER*b-11-Т7*НТУТЗА*Ш**ТШР V 54-W?TKS»VYb**»*YVN*S*PGC»TL»«HL»?-20-N*M**M- 9-H.*RLVTA*«RA*«*PLA

55-b*N5Y»*P»»GLGTSH*P*«*H«T**a!PL*C-15-M*P**?- 8-ЪК»»КШ*Ы*5Т*»Р-Р» i 20-QKSPPQPBVVAQQyTPND**RASIEúASKbIB-14-APABRM- 7~CYCP1ÍRS»B*FRMMK.YAS

: -12- LADTIiHPVSPRQLYHIíSMPKIÍBRLPATLVIJ'XEA.QHR-22- GGHGGGAYVHSYGTIr-X -12- IG*****bD*SYIVBT»QNC**»Cffi»Y****«*V**A?K-22- *N»»«***H«EPSH»-Q -33- PH»B»*YW*SKD*XD-»LDVMRPDK»HCW*Y*P*bb?K-23- D*VQSEG*QQPIÄG—G ,V -12- IH»BIHYW5RD«LEr-*LQVHRPKN»W*T*«P*P»IbAG-23- D*TRSES*TQPI»EM—G r - 9- im«AllíYYH*S«IKIl**LRK*Nb**»Y»S*»V*P*AHI5-22- B*»BA*S*NQPSDAH-S ) -66- GVKDbYWIGyDTTQPIí*SAMAGSYPAYN*N-WAD*KVXiB-35- SVG5TL-«PKHKASLQS

Рисунок 2. Сравнение н-концевой области аминокислотной

последовательности 1Э5К белка ХВШ (Бьтх) с консервативными участками предполагаемых метилтрансферазных доменов потексвирусэ - X вируса картофеля СРТХ), карлэвируса - М вируса картофеля (РУм), тимовируса - вируса желтой гэзаики турнепса (ТШУ), кэпилловируса - вируса хлортической пятнистости листьев яблони (АСЬЗУ) и метилтрансферазного домена вируса Синдбис. Аминокислотные остатки идентичные таковым в последовательности ХВШ обозначены звездочками (*). Пробелы (-) введены для оптимизации выравнивания. Указаны длины N-концевых участков не приведенных на выравявашга.

Центральная часть аминокислотной последовательности ипептида кодируемого 0РС1 ХВШ (остатки с 900 по 1150) обладает дством с предполагаемыми РНК-хеликазными доменами репликаз усов тимоподбной группы (Koonin and Doija, 1993). При этом большее сходство этой области 195К белка обнаружено с указанными енами потексвирусов (около 40$). Степень сходства дполагаемого РНК-хеликазяого 'додана ХВШ с таковыми дставителей других груш вирусов, обладающие РНК-pe отказами оподпобного тала, несколько ниже: 15-2056 с карла- и 16? с илло- и тамовирусными (см. Рис. 3). Показано, что *GKS' мотив сутг.твует в последовательностях всех белков, обладающих '-азной активностью и участвует в формировании тар-связъгояицего гтря. (Sarante et al.,1990). Прямо показано, что CI белок п.'кс

С" J

потивируса сливы в присутствии АТФ расплетает РНК дуплекс (Lain е al 1990,1991). Точечные мутации в NTP-связывавде м мотше последнего оказывают влияние на репродукцию вируса (Mirzalan аг Wirrmer, 1992; Teterlna et al.,1992).

ShVX 909 ?IAIHGAGGAGKSRAICT-7-DSraiTraiNbAKDV?-25-VTIi'DDGK -19-

PVX 729 ACV******S**»H»I*K-8-SD*TV*L**NE*KL*»-25-IV*»»«'K -19-

PVM 1160 IH»*V»a,?*S*«»'PLPKN-7-K*U)ííVS*RRA»AE*P-39-»T*b«EMQ -19-

ACISV 1152 IYG*?»PA*S***H*I*N-9-QGXKVIS*HRP*AK**-24-I»?*L*EIS -24-

TYIÍV 970 *VHPA*PA»C**TYPX*Q-7-KDPRySS**TE*RTB*-26-ILYI*EIY -19-

PPV 77 Drb*R**V*S*»#TG-U>-6-GHVIiIE**RP*AENT-51-SI***ECH -21-

ShVX AII/TGDQRQ-27-HCÍUJA!PHRQ-51 -NYAGCQGI/PLNHLTIII<-12-SDKVbYTA?SRA

PVX V#**DGS**-27-YX*«****N-52-T*****»»*KPKYQXVb-12-*AN*M»*»Ii***

PVM LP*T**PA«-28-NYKVKS»»P-65-TEGEST**»PM»G**yx-12-NERRWI»*LR*P

ACLSV lRCP«*PL*-27-KY*PQGY*P-67-TVSES**M»ISKRVI.yC-13-GANAAIV»IT»S

TYMV VIIL*PPL«-27-KYCWWSY*I-51-TISSS* * * »PCDPAI»V-13~*SANGLY»Iffi*S

PPT IIiKVSATPP-44-bVYV*SYNE-44-TIí[IEN*V**-I)IDY7Tr-29~íYGKRXQKIjG»V

Рисунок 3. Сравнение центральной части аминокислотно: последовательности 195К белка X вируса шалота (ShVX) < консервативными участками предполагаемых РНК-хеликаз PVX, PVM TYMV, ACLSV - тимоподобные РНК хеликазы; и покс вируса слив) (РРТ) - потиподобая РНК-хеликаза. Аминокислотные остатю идентичные таковым в последовательности ХВШ обозначен звездочками (*). Указаны расстояния до N- и С- концов ( 6e¡ учета протеолиза в случае aclsv, pvm и tymt).

С-концевая область аминокислотной последовательно™ предполагаемого 195К белка ХВШ протяженностью около 35! аминокислотных остатков (приблизительно с 1330 по 1610) содержи-ряд консервативных мотивов, характерных для РНК-зависимых РШ полимераз всех шшс-РНК содержащих вирусов. Наибольшее сходств« наблвдается с предполагаемыми РНК-полимеразными доменам; РНК-решшказ потексвирусов (45-50%) на всем их протяжении. Сходстве РНК зависимых РНК полимераз потеко-, карла-, тимо- и капилловирусоз позволяет объединить вирусы этих групп в отдельную группу более высокого порядка, так называемую тимо-подобнув группу (Rozanov е1 al 1990; Сдайгеззе et al 1990; Koonln, 1991; Koonln & Dolía 1993). Несомненно, ХВШ можно отнести к членам этой группы. Уровеж сходства указанного домена ХВШ с таковыми карла- и капилловирусов'-около 30%, тимовирусов - около 35%. На Рис. 4 показано сравнение аминокислотных последовательностей предполагаемых РНК-полимеразныз доменов тимо-подобных вирусов и вируса Синдбис.

I _II_

■X 1330 PDNAIAIÍNRSQWVKKI^KVGAHP-KAGQTISAÍKQBVTWyj^MAb^IJlKJffiBQ

; 1152 пв*я*МУ*1,***»*т*у**ь*ърк1«р****А.**у*от*м*?с.***н*м*уда*ОА

[ 1667 IvrriVAQI*S»**bCT*FX)NIíPRVA.-**A*S*VC*CJHA.*bCRPAPYMR*IEMKVHB SV 1500 »LDK*PL*N«*«IiCT»P**BFTBA-*****IAC*PHKILYEPSPWCR*'l!B!KrM!A. [V 1489 raiT,rVKl«A*A«tKVNDGGIPG-SW**C**I1AiMlIDY*I*YbGPVKK*Q*IFDNA ГО 2182 РМИ1Р VWDM* RD VKYTPGTKHTEERPKV mQAAEPMT АУЬСОТЖЮ/ШШГА

_III__. _IV_

TC HCffD№VPIMClM?PEQPNAPVMTKTOPDRPNYTSDYa'QYDC©QDAA?I^yiilRKAimbÜ

С P»*KE**»N**T**DDM3AWAbNN*N*S»*SLAN*«*AP»»**»G«tó»Q*»Vb**K*HC

! Vb»K*YY*HSGKGL«KLDAW-VK*GK***ICTB* * *EA?*A* * *EPIMA» *LBLMKY*R

j5V m«D*rí*HQRRNPSKr,ED«-ARRPSNGSICVE*»*»A?»V***HTI»A»*'mjj#»P*

IV №*P«IYSH*GK**N*LRDWCC^n<THST*KIAN**^A?****HGKSVTI/*AIi*MKR*N

ГО VbLPNI¡rPIaPI)M:jAXD*DAlIAHLPKQGD*VbET*IASF*K* **DAJíAIiTGyíIXJ2DLG

_V_

ГХ VPBDVXBPYK----PIKTH-AKTPI/MLAIMRIfiAEtjPTPDANTKCNIAYDAUíPRbGD

С I**EIIQA»I----D»»*N-»QI»**T*S*»*.»TG»»«*******C»«»*TKIK»DIPA

í l'S'UKD"----*»*«S-MSK*»*P**»*y*G*AS«*U»*IA*MLPT?M*YHIRa

LñT WDDR**QS*I----RMíCT-LGGR»«GP****FTG*PS**IiP**IiAIJíVPT?C*YEVP*

ÍY I«BHLICaííV----}Ib**N-VB*QP»P»TC*»*TG*PG»y*D**DY*L*yiYSQYDy»5

_VI___VII_

ГК DVR--ASYAGDDLVRDKACKKRAGWTifSESLPSbKARPbVTN-----KPDPCGWRIflRH

1С GTA—QV****»SAÍiDCVl>* VKlISPílRL*DKLI.**S**VI*QCiKKGSlV*E****LI*PK

í *EP—1С?** * *MC ASRRDQPTKKPAHPbDKIiK* * A* VQPVQPV—N* *T****HbCPD

CBV итр--1СР»**»мсА1дашг*1м?11ЕР1ь*к1.*»*А*Уш*-----KV*M***»**CCD

Itv G-P—IMVR»**SLI*ffi1LPTR}rD*PÜVI^RLH*RP*IJÍL*-----SH*L»**YYVGPA

STO KTSRGAAPI* * « NI IIÍG VTSCKEJÍAERC ATWIJJMEV» IIDAVIGE-RP * Y» * * G P ILQD

УХ GIVKSPItHíYCSLQLAbRLGKIDl^USYAIDYIM 11

X *VM*D*»K*irV'**K»*BAK*K]jKKCQD**E**bSY**DHK*SLn*Ii***KQCQA*T*'í- 21

ht *»Y*R*CO,VX®MCI*KBflífILSNCIDN»A«BVAY««K«*B*AVNRM*»B*VAA?YNC- 21

L5V *X,I*B»CbI*Blí*QV*IBN*raJíD\rrD**PbEFS***K**ERL»SHLBIEa*fJY*»VI,- 57

KV *CIRN*IA«PCK*MI*TOBDAL*DRRL**LTKmGHI.**5?SbWnJJP*TIIVQYQSAC- 79

ND SVTSTACRVADPIjaUJKI«RPLPAX)DM3E*RRR*LTJ3I»KAWPVGITGTIAVAV,ra- 39

Рисунок 4. Сравнение аминокислотных последовательностей С-концевого участка 195К белка X вируса шалота (ShVX) и предполагаемых РНК-полимеразных доменов потексвируса - X вируса квртофеля (PVX), карлавируса - М вируса картофеля (PVM), тимовируса - вируса желтой мозаики турнепса (TYMV), капилловируса - вируса хлортической пятнистости листьев яблони (ACLSV) и вируса Синдбис (SIN). Аминокислотные остатки идентичные таковым в последовательности ХВШ обозначены звездочками (*), Пробелы (-) введены для оптимизации выравнивания. Указаны расстояния до N- и С- концов ( без учета протеолиза РНК-решшказ).

Свидетельством в пользу участия указанных доменов вирусов членов тимолодобной группы в репликации РНК пока остается высо: сходство их последовательностей с последовательное РНК-полимеразных белков других групп вирусов и, в особенное консервация мотивов, участие которых в РНК репликации доказ прямо (Cankar and Porter, 1992; Kroner et al 1989; Inokushi Hiroshima, 1987)

1.4.2. 26K и 11K белки тройного блока генов.

Последовательности полипептидов, кодируемых 0РС2 и ОРСЗ X] 26К и 11К белков, соответственно, обладают высоким сходством последовательностями 25-26К и 11-12К белков тройного блока rei карла- и потексвирусов (Morozov et al.,1989).

Последовательность 25К бежа ХВШ содержит мотивы, характер для NTP-зависимых хеликаз, вкляная 'ОКБ' мотив, кото] присутствует в последовательностях всех белков, обладай NTP-азной активностью и участвует в формировании №ЕР-связывающ< Центра (Gorbalenya et al.,1988).

11К белок ХВШ аналогичен соответствующим белкам тройного бл< генов всех карла- и потексвирусов и 13-14К белкам фуро-гордеивирусов. Анализ гидрофобности 11К методом Кайта и Дули1 (Kyte and Boolittle, 1982) показал наличие длинных гидрофоб участков, характерных для мембран-связыващих белков. Дан участки также имекгг 12К и 7-8К белки тройного блока генов дру карла- и потексвирусов (Rupa3ov et.al. 1990) и 13-14К белки фуре гордеивирусов. 14К и 42К белки фуровируса некротического пожелте листьев свеклы были иммунологическими методами обнаружены in plat В мемранной фракции (Niebach-Kolsgen, et al. 1990). Возможно, 1 белок ХВШ непосредственно взаимодействует с мембранами так же i 12К, 8К белки ХВК и 7К белки МВК и SBK, мембранно-связываюи свойство которых было продемонстрировано in vitro (Morozov al.,1990, 1991).

Предполагается, что одной из возможных функций 25К, 11-12К 7-8К белков тройного блока генов явялется участие в межклеточ! транспорте вируса, поскольку потексвирус мозаики белого клевера, зкспрессирунций функциональный ' 25К белок, реплицировался протопластах, но не поражал растения системно (Beok et al., 1991 Нарушения структуры белков тройного блока генов гордеивир! ¡ьтриховатой мозаики ячменя и фуровируса некротического пожелте:

ок свеклы также приводили к потере способности вирусов к клеточному транспорту (Petty et al.,1990; Gilmer et al., 1992).

В РНК ХВШ OPC, Кодирующая полипептид гомологичный 7-8К белкам йного блока генов карла- и потексвирусов, не имеет инидиаторного [она, хотя прослеживается гомология аминокислотной ледователыюсти, кодируемой данной ОРС, с соответствующими псами карла-и потексвирусов. То же самое обнаружено в геномах В- и D- вирусов чеснока, (Г.или et al.,1993) и в геноме X вируса ии (Memelink et al.,1990). Возможно, для 7-8К белков этих )усов иницяаторгшм явялется не AUG, а другой ко доп. Нельзя сличить и то, что 7-8К белки этих вирусов не зкспрессируются. Это кет быть связано с особенностями межклеточного транспорта в зтениях семейства Liliaceae.

1.5. 42К белок.

Нзличйё гена, кодирующего белок с мол. массой 42К, кализовашого между генами тройного блока и белка оболочки личает его от близких по структуре карла- и потексвирусов. алогичный ген был также идентифицирован в охарактеризовааных зже 3'-концевых областях генома вирусов чеснока - GV-A, GV-B и -D, (Sumi et al., 1993) (См. выравнивание, приведенное нп Рис. 5).

В последовательностях 42К белков можно выделить два нсервативннх участка (подчеркнуты на Рис. 5). Первый - (позиции рэвнивания 111-178) наиболее консервативен - в нем около 70% татков консервативны или гомологичны. Второй включает С-концевую ласть 42К белков (начиная с позиции выравнивания 276); в нем нсервативны или гомологичны около 60Ж аминокислотных остатков. Во ;ех белках обнаруживаются протяженные, высоко вариабельные, ирофаяыше участки, предшествующие упомянутым консервативным ¡ластям (позиции приблизительно с 70 по 110 и с 250 по 270, [с. 5). Отсутствие гомологии 42К белков с каким-либо известным (лками делает затруднительными предположения об их функциях.

'К белок.

Расположение 0РС5 в геноме ХВШ и сходство аминокислотной >следовательности кодируемого ею полипептида с таковыми белков 5олочек ряда вирусов, в особенности потеке- и карлавирусов, озывант на то, что этот ген кодирует белок оболочки ХВШ. Бн-:> мазано, что рекомОинантный 27К серологически идентичен г'";: ■

л

10 20 30 40 50

ОУ-А МУХУПУНХЩАКРттГЛ'ЗХКБСЬ-----------------1ЖШТ1БЙКУГ«'У

вУ-В МТУАТУГОи^КУКШиШХНТРКМОЬ-----------------А0АЬ0МА0АТ1.1КБ

1*1 * II *» ** *

70 80 90 100 110

Б1гУХ DCVSLIJШJffiEетУ1ШI'NTIЛ£Ш^AEPa^G<UQTQIJÍQGPDEPDGШ^ШRT?FSШЛ

СУ-В

* * * ♦ *Ш*|

130 140 150 160 170

СУ-А У1)А№Ф1ЛУ}¥УИ'Аптррвт:шжвьуао^^

СУ-В АТаШЛУГтГРРАНУШЛ>АТ51^1Л^ ПШЛ!

СУ-Б ТНТХ^ЛГУРРАНУ1)УРРУТ1г1|СШдР0СШШЛШЗиШЛН1КННУ1)311Л)ШЖ

* н и тт ч *! и»! пши' г I*** и

190 200 210 220 230

БИУХ ШЖ1аСТР1£Р1«ВАУРТ1/1тШ?10ВВООК11Л^

СЛ-1 К5Р5СШ51£аХНАА1Л1У1Л;й2УГ&ЪУ5Ж0В.'ГВ18'г1)С1Р5Б5---КРЪ'С5ЬКА----;

су-в мауьыеа1«шккызь1ъсдахбеугбк1шзоа'гртьвш1ы.----ктьтбхеишж

ау-с ГО^аОТРЫЛШтЪУАИССКУВМУАТТО^К^

* I * * *** 1

250 260 270 280 290

су-в акь—хатгаоот'аараабмткрваат^шхчктьрхреак^гадскзуануерк!;

СУ-О 1КЫ)ЕМ'БАУАНА1ЛНР!1УТРУР1)™нРВА5ТШ)-1^АУСиО[1Р1'РРСРАУаТУ№К1»

I II **1 II* 1Ш1 * **

310 320 330 340 .350

ЗПУХ БР1РМ1)УТ(Н<РА5ТБ1ЮЛ>1ТУЕСВЕО?}ТК\Т№11ДД)ВОУ11Л£Ш1ЕТМЖХЙ111Р31 ОУ-А БКГРМХ)11аКРАБТАЖЖ1ДУТРЗР05ТТУЗУК1РВ1)аУ1ЯЛ,ЗПГ)1ЕТтпа0НУРЗГ ОУ-В Ш1РШ)УОД1ЖР5ТА1ЯЬгайтВВРАта^ СУ-1) ХЛШ'ИВХТСКРУБТАЫШШШЭТШОТИУ^

• Ш1* ш II 1*1 * * I I * **Ш *1 ** * *1*1 и

370 380

БНУХ ЬБЫНАКСРКтКРКаваЬС ОУ-А ЬАЬЬН0КСР№>1УК1КТН1>ЬС ОУ-В ЬАШЕКСРКР1УК1КССаЬС ОУ-Г> ЬА1хШонсркР1УК1канохл

• ♦♦* *** *»»»»* 4*

* * » »« 4 *» **

Т'исупок 5.Сравнение аминокислотных последовательностей 42К белков Хй1!,СУ-АгСУ-В и СУ-Й.Консервативные аминокислотные остатки отмечен

- *, гомологичные - *. Пробелы введены для оптимизации выравюшаяи Г-гллщьвая последовательность 42К СУ-Б не определена.

оболочки ХВШ и имеет ту же электрофоретическую подвижность.

Выраженная область сходства с последовательностями белков оболочки карла-, потеке-, попi-, капшто- и бимовирусов, частицы которых также нитевидны, включает приблизительно 180 С-концевых аминокислотных остатков.

Последовательность 27К белка ХВШ обладает высокой гомологией с соответствующими белками чесночных вирусов А,-в,-с и -D. Более 50% аминокислотных остатков являются либо идентичными, либо гомологичными. Однако при этом N-концевые области ы^отяжннностью 60-70 остатков (около 1/4 последовательности) являются очень вариабельными, что характерно для белков оболочки нитевидных фитовирусов (Dolja & Koonln, 1991).

2.4.7.15К белок.

" 3~проксимальная 0РС6 ХВШ кодирует белок с мол. весом 15К. Аналогично расположенные ОРС в геномах А,-в,-с и -D вирусов чеснока (Sumi et al.,1993), кодируют белки гомологичные 15К ХВШ Последовательности 15К белка ХВШ и родственных ему вирусов содержат области сходства с 12К белками карлзвирусов, включающие участок богатый остатками аргинина и два консервативных остатка цистеина (см. Рис. 6). Предполагается, что основной участок и следушие за ним четыре остатка цистеина 12К белков формируют так называемый цинк-связываиций "палец". Однако, в аминокислотных последовательностях 15К ХВШ и родственных ему вирусов расположение консервативных остатков цистеина и гистидина отличается от такового в 12К белках карлавирусов. Область явного сходства протяженнстью около 20 остатков включает только два из четырех остатков цистеина в карлавирусных белках, которые могут участвовать в координации иовд цинка.

Значение этих белков для развития вирусний инфекции остается неясным, хотя показано, что 12К МВК и ВВХ способны In vitro связываться с двуцепочечными и одноцепочечными РНК (Oraaistat et al., 1990; Левай, 1991). Предположительно, они принимают участие в регуляции транскрипции или трансляции аналогично Zn-содержащим клеточным белкам (Coleman,1992; Schmideskamp & Klevit, 1994; Petty et al.,1990; Gilmer et al.,1992).

He исключена возможность синтеза in vivo белка ХВШ, включающего последовательность 27К и слитого с ним 15К. Такой белок может синтезироваться в результате -1 сдвига рамки перед

терминирующим кодоном белка оболочки. Исследование экспрессии 3'-концевых генов карлавирусов, расположение генов белка оболочки и 12К белка которых не исключает возможности образования слитых продуктов, не дали однозначного ответа. Сообщалось, что продукт слияния белка оболочки и 12К белка М вируса картофеля синтезировался при in vitro трансляции данных генов (Gramatat et al., 1993). -1 сдвиг рамки считывания происходит, например, при трансляции gcsg-pol продукта у ретроврусов (Jacks et al.1988), РНК-репликаз диантовирусов ( Xiong & Lommel, 1989; Xiong et al.,1993; Ge et al., 1993; Ryabov et al., 1994). Следует, однако, отметить, что нуклеотидная последовательность участка возможного сдвига рамки считывашя в месте перекрывания ОРС, кодирующих белок оболочки и 15К ХВШ, отличается от последовательностей, характерных для сайтов -1 сдвига рамк у указанных вирусов. Кроме того, участок РНК ХВШ, лежащий ниже сайта вероятного сдвига рамки, не способен формировать жесткую шпилечную структуру, наличие которой, как правило, необходимо для -1 сдвига.

II II

ShVX 46- GTSKCAKJ^RARRYMiCPDCGAY-LTODHVCKRraSRSNSDClBVIHQGPAKIjY

GV-A 46- GTSKCAQTm^YNRCyECGA.Y-LLr)NllKCRIFVSRAaSDyLAVlH8<JPAKblI '

GV--B 46- GTSKCAARRRAKRYTOCPDCGAb-LfroDHYCKIMSIUSTDCUIVIKESjPAKbY

GY-C 46- GTSKCAARRRAKRYmCPDCGGY-IJJ^IVCKQFmUS?SCPNVlHEGPAKI.Y

GY-D 46- GVSKCAKlЖIШШYNRCPDCGAP-LVБGmадRVPVSRAÍ^SDYЬЛVItШlPAKI.Y

PYM 40- GRSKYAKRRRAISIARCHKC—YKLWPPiV---FTTH----CDNKHCV-POISY

CYC 39- GRSSYARKRRAUSLGRCHRC—YRYYPPI»P- -PRITR----CDNRTCV-PGISY

PYS 37- GRSTYBCKRRARSIGRCWRC—YRYYPP-----VCNSK-----CPNRTCR-PGI5P

LSV 66- GRSRYARRRRAbQlGRCERC—YRYYPP-----YCG5K.----CBNKTCR-PGISI

CLY .40- GKSKYARRRRAKSIAKCFRC---AY3PGF---YPTTR-----CDGKTCR-PGISA.

HelVS 43- GRSTYARRRRARSILRCERC—YRYYPPL---PFSKK------CDNRTCV-PGISY

f I *lt* II t * I*

Рисунок 6. Сравнение участков аминокислотных

последовательносней 15К белков ХВШ, А-, В-, С-, Б-вирусов чеснока и ¡2К белков карлавирусов. Консервативные аминокислотные остатки отмечены - », гомологичные - *. Пробелы (-> введены для оптимизации выравнивания.

2.5. Общие замечания к разделу 2.

Анализ последовательности геномной РНК ХЕШ показал, что кодируемый 5'-концевой ОРС потенциальный 195К белок содержит области сходства с метилтрансферазным, РНК-хеликазннм и полшеразтш доменами РНК-репликаз тимоподобного ша. При этом наибольшая степень гомологии обнаружена с таковыми РНК-репликаз потексвирусов. В последовательности 195К ХВШ, также как и в РНК-репликазах потексвирусов, отсутствует явно выраженный предполагаемый протеазный домен, характерный для РНК-репликаз тимо-, карла- и капилловирусов (Коогип & Ъо13а, 1993).

3*-концевая часть РНК ХВШ, а также родственных ему чесночных вирусов (ХВШ-подобные вирусы) (Били а1.,1993) имеет уникальную организацию. Помимо 25К, 11К и 27К белков, гомологичных потеке- и карлавирусным 25-26К, 11-12К белкам тройного блока генов и белкам оболочки, ХВШ-подобные вирусы имеют ген 42К белка, не имеющий гомологов среди всех известных белков, и'ген 15К белка, обладающий, характерным только для него, порядком расположения остатков цистеина и гистидаиа. Учитывая это, можно выделить ХВШ и родственне ему вирусы, обнаруженные позже, в новую вирусную группу.

Нужно отметить, что представители разных групп вирусов, обладающих РНК-репликазами тимоподобного типа, имеют значительные отличия в организации 3*-концевых (а также и 5'-концевых в случае тимовирусов) участков геномных РНК (см. Рис 7). Метшгтрансферазному, РНК-хеликазному и РНК-полимеразному доменом одного типа могут сопутствовать принципиально отличающиеся наборы генов, кодирующих белки ответственные за инкапсидацию генома, межклеточный транспорт, взаимодействие с переносчиками и т.д. (Коогип & 1993). С другой стороны, сходство между указанными

белками вирусов не всегда коррелирует с филогенией решшкативных белков, структурой и стратегией экспрессии генома и типом вирионной нуклеиновой кислоты (Ме1оЬег,1990; Кооп1п et а1., 1991; Кооп1п & Бо1^а,1993)• Так, в одно суперсемейство по наличию области статистически достоверного сходства, были объединены транспортные белки (или белки, участие которых в межклеточном транспорте предполагается) плюс-РНК содержащих тобамо-, тобра-, капилло-, комовирусов, ретроидвых каулимовирусов и геминивирусов, вирионы которых содержат одноцепочечную ДНК (см. Рис 17) (Кооп1п et а1,, 1991). Нельзя исключить, что белки объединенные в это суперсемсйство, имеют общее щюисхожденяе. Последовательности

хвш

195К

мт

HEL POL

25К 42К_ 27К

"Z2ÜOl5Ku)n

11К

Яг

гвк

166К

мт

_25К 8К 22К

liKli ' mil—)ПЛ5б~]

12К

мвк

иг

52 ЭК

ТШГ шг

_25К 7К 34К

TsnníiM:

1СШ,

12К

¡r

Чк

U)r

ВХПЛЯ ГЕТ

217К

1И шг

__2вК

вхмт

I 207К ВО l

Mt PROT HKL POL

4RNA*

Рисунок 7. Схема организации геномов вирусов, обладающих РНК репликазами тимотюдобного типа. Потексвипус - ХВК; карлавирус - МВК, капилловирус - вирус хлоротическои пятнистости листьев яблони (ВХПЛЯ); тамовирус - вирус желтой мозаики турнепса (ВХМТ). Открытые рамки считывания отмечены прямоугольниками. Указаны кодируемых ими белков. Участки гена РНК-репликазы, кодирующие мегалтрансферазный, протеазный, хеликазный и полимеразный домены соответственно обозначены мт, PROT, HEL и POL. БО - ген белка оболочки. ' tRNA.'-тРНК подобная структура, (А)„ - поли(А).

белков тройного блока генов, участие которых в межклеточном транспорте доказано, не имеют сходства с транспортными белками этого' суперсемэйства, что может отражать принципиальные различия в механизмах межклеточного транспорта между вирусами, обладающими транспортными белками разных типов. Следует отметить, что тройной блок генов имеют не только вирусы, РНК-репликазы которых относятся к тимоподобного типа, но также фуро- и гордеивирусы.

3. Исследование экспрессии 3* проксимальных генов ХВШ. 3.1. Анализ субгеномных РНК ХВШ. "

Экспрессия генов карла- и потекесвирусов, локализванных в этой области, осуществляется с помощью субгеномных РНК (сгРНК) (GuiJford & Förster,1986; Dolja et.al.,1987; Maokie et al.,1988; Monie & De Zoeten,1990). Вероятно, З'-концевые цистроны РНК ХВШ, аналогично карла- и потексвирусным, экспрессируются с помощью, по крайней мере, двух субгеномных РНК: сгРНК длиной около 3500 нуклеотидов для экспрессии тройного блока генов и, возможно, 42К бежа, и сгРНК длиной около 1500 нуклеотидов для экспрессии гена белка оболочки и, видимо, 15К белка.

Блот гибридизация тотальной РНК из растений шалота, зараженных ХВШ ХВШ-специфическим зондом показала что в листьях зараженных растений, кроме геномной РНК ХВШ четко обнаруживается только однв субгеномная РНК размером приблизительно 1500 нуклеотидов, вероятно, являющаяся субгеномной РНК гена капсидного белка и, возможно, 15К белка ХВШ. Субгеномные РНК-большего размера обнаружены не были.

В то же время установлено, (см. ниже), что 42К белок содержится в листьях растениий зараженных ХВШ, на уровне, достаточном для детекции методом иммуноблота. Возможно, в клетках синтезируется существенно меньше субгеномной РНК для синтеза белков генов тройного блока и 42К белка ХВШ, чем соответствующей сгРНК для синтеза белка оболочки.

3.2.Гп vitro трансляция З'-концевых генов ХВШ.

Для in vitro трансляции 0РС2Т 0РС4, 0РС5 и 0РС6 ХВШ, использовались синтетические РНК, синтезированные с помощью РНК-полимеразы фагов Т7 или SP6. Были использованы следующие плазмиды, содержащие вставки кДНК РНК ХВШ под контролем фаговых промоторов: рХ55 - с 5229 по 6135 нт, Т7 промотор; рХ5 - с 5500 по 7745 нт, Т7 промотор; рХ34, с 7430 по 8890, SP6 промотор; рСР15-1 -с 7560 по 8819 нт, Т? промотор; рСР15-2 С 7540 по 8616 нт, Т7 промотор.

Трансляцию полученных траяскрилтов проводили в лазате ретикулоцитов кролика с 353-метионином. Продукты трансляции трапскршггов разделяли в 15% ДСН-ПААГ и визуализировали радиоавтографически. Продукты трансляции транскриптов с длазмид

pGP15-1 и pCP15-2, разделенные d 15% ДСН-ПААГ, первносшш на нитроцеллюлозную мембрану и проявляли с помощью вирусспецифических антисывороток, а также радиоавтографнровали.

Как следует из приведенного на Рис.8 радиоавтографа, продуктом трансляции транскрипта с плазмдды рХ55, содержащего ген 26К белка является полипептид с мол. весом около 26К. Транскршгг с шюзмида рХ5, содержащий ген 42К белка, направляет трансляцию полипептида с мол. весом около 42К. РНК-матрицы, содержащие гены 27К и 15К белков, полученные при транскрипции линеаризованных плазмиды рХ34, pCPf5~f и рСР)5-2, направляют трансляцию белка с алекторофоретической подвижностью около 37К. Такой же подвижностью обладает зкспрессироважшй в E.colt рекомбинантный белок оболочки ХВШ. Кроме того методом иммуноблоттинга установлено, что продукт трансляции транскриптов с плазмид pCPI5-t и pCPtS, мигрирующий в геле как белок с мол. весом 37К, представляет собой белок оболочки ХВШ. Среда продуктов трансляции pCPt5-t и рСР15 не выявлялся белок, подвижность которого соответствовала бы подвижности рекомбинантного 15К белка. Не был обнаружен и продукт слияния белка оболочки в 15К, что можно Оы было допустить, предположив -1 сдвиг рамки перед тердагааторшм кодаом гена белка оболочки.

Рисунок 8. In vitro трансляция Pffií-траяскрилтов, содержащих 0РС2 (дорожка 1), 0РС4 (дорожка 2) и 0РС5 (дорожка 3). Дорожка 4 -отсутствие матрицы. Слева приведрпы молекулярные веса Оелковаых маркеров.

if,

3.3. Исследование экспрессии 42К, 15К белков и белка оболочки ХШ в растениях зараженных ХВШ.

Для исследования экспрессии 42К, 1ЬК белков и белка оболочки ХВШ in vivo и in vitro исспользовались антисиворотки, получешше к этим белкам экспрессрованшм в E.coll. Гены бел1юв были клонированы в плазмидах pQE (Diagen, GmbH). Для клонирования генов 42К и 15К белков ХВШ использовли фрагменты получешше в результате ПЦР амплификации кДНК-вставки РНК ХВШ плазмида рХ4Э с помощью соответствующих олигонуклеотидных праймеров. Для клонирования гена белка оболочки ХВШ - рестриктннй ÂvalII фрагмент кДНК вставки плазмида рХ34. Рекомбинант1ше белки, содержащие N-концевне полигистидиновоие последовательности, были экспресированы в Е.соК М15 lpREP41, хроматографчески очищены на N1-NTA агарозе по методике (Diagen, GmbH).

Из приведенных на Рис 9 иммуноблотнгов экстрактов из листьев индивидуальных растений двух линий шалота, проявленных с помощью антисывороток к белку оболочки ХВШ и 42К белку, следует, что 42К белок и вирусный белок оболочки ХВШ обнаруживается во всех анализируемых растениях. Электрофоретическая подвижность белков, выявляемых в иммуноблоте антисывороткой к 42К белку, несколько меньше подвижности рекомбинантного белка, что может быть связано с наличием полигистидинового "хвоста" на N-копцв молекулы. Электрофоретическая подвижность рекомбинантного 27К белка и белка, выявляемого в иммуноблоте антисывороткой к белку оболочки ХВШ, соответствовала подвижности полипептида с мол. весом 37К (Рис, 9).

Растения шалота, не содержащие белок оболочки ХВШ, не были обнаружены. В связи с этим, для доказательства того, что 42К белок присутствует только в растениях зараженных ХВШ, было тестированы растения различии сортов репчатого лука, который, в отличив от шалота, не инфицирован ХВШ или родственными ему вирусами тотально. Судя по результатам ишуноблоттингов экстрактов из листьев индивидуальных растений репчатого лука сортов Дагошэвский и Спасский, проявлегашх с помощью антисывороток к белку оболочки ХВШ и 42К белку (Рис. 10), белок с молекулярной массой около 42К выявляется антисывороткой против 42К белка ХВШ только в тех растениях, где содержится белок оболочки ХВШ,

Предполагаемый 15К белок ХВШ не был обнаружен с помощью Вестерн б лота ни в препаратах виру ста частщ, ни в листьях пораженных ХВШ ряс:тениях шалота.

12 345 6789 10

96 -67Ч

43 30 -

20 -14

I

9667

43 -302014 -

Г 7 ■

1 2 3 4 5 6 .7 8 9 10

» -

Рис. 9. Иммуноблоттинги экстрактов из листьев растений шалота пораженных ХВШ, проявленные антисыворотками к рекомбинантному белку оболочки ХВШ (А) и к рекомбинвнтному 42К белку ХВШ (В). Белки экстракта листьев линии 83 (дорожка 1) и белковые маркеры (дорожка 2) окрашены амидошварцем. Слева обозначены мол. веса маркерных белков. Экстракты из индивидуальных растений линии 83 (дорожки 3, 4 и 5) и лиши 107 (дорожки 6, 7, и 8), препараты рекомбинантных 42К белка ХВШ (дорожка 9) и белка оболочки ХВШ (дорожка 10).

1 2 3 4 5 6 7 _0„. 8 И) 11 12 13 14

96 67

43 -30

20

14

, I

1 г 3 4 5 6 7 6 9 10 11 1£ 13

96

67 -> .. 43

йЕЭ

го ■

♦г«» Ц-*

14

Рис. 10. Иммуноблоттинти экстрактов из листьев растений репчатого лука проявленные антисыворотками к рекомбинантному белку оболочки ХВШ (А) и к рекомбинантному 42К белку ХВШ (В). Слева обозначены мол. веса маркерных белков. Экстракты из индивидуальных растений лука сорта Даниловский (дорожш 1-3), шалота линии 83 (дорожка 4), растений лука сорта Спасский (дорожки 5-13) и препарат рекомбипантного 42К белка ХВШ (дорожка 14).

ю

I У

выводы.

1. Определена полная нуклеотидная последовательность геномной РЖ ХВШ протяженностью 8890 нуклеотидов (без учета поли(А) на 3'-конце). Выявлено 6 протяженных ОРС, кодирующих в 5' —► 3' направлении потенциальные белки с молекулярными массами 1Э5К, 26К, 11 К, 42К, 27К и 15К.

2. Установлено, что за исключением гена 42К белка, геном ХВШ содержит все элементы характерные для потеке- и/или карлавирусов. 1Э5К белок, кодируемый 5'-проксимальной ОРС, высоко гомологичен потексвирусным РНК решшказам; 25К и 11К белки ХВШ гомологичны белкам, кодируемым двумя первыми генами тройного блока потеке- и карлавирусов. 27К белок идентифицирован как белок оболочки; 15К белок содержит мотивы, характерные для белков, кодируемых 3'-концевыми ОРС генома карлавирусов. 42К бедок ХВШ не имеет сходства ни с одним из с белков, имеющихся в банке данных.

3. Методом блот гибридаизации РНК, выделенной из растений шалота зараженных ХВШ, обнаруживается только субгеномная РНК дайной около 1.5 кь., с которой экспрессируется белок оболочки.

4. В опытах по in vitro трансляции в лизате ретикулоцитов кролика с использованием в качестве матриц РНК, синтезированных с плазмид, содержащих полные кДНК копии генов 25К, 12К, 42К и 27К белков показана их эффективная трансляция. При трансляции РНК, содержащей гены белка оболочки и 15К белка, обнаруживается только белок оболочки.

5. Гены 42К, 15К белков и белка оболочки были клонированы в шюзмидах pQE и экспрессированы в Е.соИ. К рекомбинантным белкам получены соответствующие антисыворотки. С их помощьыо показано, что в растениях шалота и репчатого лука, в которых обнаруживается белок оболочки ХВШ, методом Вестерн блота выявляется и 42К белок.

7. По структуре генома ХВШ и родственные ему вирусы, обнаруженные позднее в чесноке, выделены в новую группу фатовирусов.

•>г\ С -V

Основное содержание диссертации отражено в следующих работах:

1. Koonln.E.V., Muohegian.A.R., Ryabov.E.V., DolJa.V.V. (1991)

Diverse groups of plant RNA and DMA viruses share related movement proteins that may possess ohaperone-like activity. Journal of General Virology 72, 2895-2903.

2. Kayuka,K.V.,VlBhnlchen)rotV.K., Levay.R.E., Kondrlkov,D.Yu., Ryabov.E.V. and Zavriev.S.K. (1992) Nucleotide' sequence of- shallot virus X reveals a 5'-proximal oistron olosely related to those of potexviiiise3 and a unique arrangement of the 3' -proximal oiatrons. Journal of General Virology 73, 2523-2560.

3. Zavriev S., Ryabov 2., VlahnlcherAo V., Arahava (f. and Ronareva T. (1994) Structural and immunochemical analysis of the 3'-proximal gene produots of shallot virus X. Abstracts of the FEBS Advanced Course: "Fundamental and Applied Problems In Fhytopathlogy". - Ukraine, Crlema, Yalta, 22-27.06.1994 - P. 16.

4. Н.В.Аршава, Т.Н.Кшэрева, Е.В.Рябов и С.К.Завриев (1995) 42К белок X вируса шалота экспрессруется в ин&ицировайных растениях рода Allium. Молекулярная биология, 22, оо-оо.

Подписано в печать 30.00. . Формат 60*84/16 Заказ {¿9

Усл. печ.л. Тираж //5~

Типография Россельхозамдемии 115598, Москва, ул. Ягодная, 12.