Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие ультрафиолетового облучения на РНК-содержащие вирусы

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Действие ультрафиолетового облучения на РНК-содержащие вирусы"



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИНСКИХ НАУК

НИИ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи СМИРНОВ Юрий Александрович

ДЕЙСТВИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ОБЛУЧЕНИЯ НА РНК-СОДЕРЖАЩИЕ ВИРУСЫ

03.00.06 — Вирусология

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук в форме научного доклада

Москва 1993

Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Директор Института — Академик РАМН, профессор Д. К. Львов.

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАЕН, профессор, д. м. н. Т. А. БЕКТЕМИРОВ, профессор, д. м. и. Б. Н. ИЛЬЯШЕНКО, доктор медицинских наук Е. Н. ПРОКУДИНА

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится «

в .Ш. час. на заседании специализированного совета Д.001.20.02 при Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан . . _ г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

А. М. ЖУКОВСКИМ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Современное состояние вопроса инак'-'-вации вирусного генома для получения неинфекционных вирусных препаратов характеризуется отсутствием научного обоснования выбора агентов, а также строгого контроля условий процесса инактивп'-ми. Ладе для ультрафиолетового (УФ) облучения, широко применяемого в медицинской практике для стерилизации и инактивации возбудителей инфекционных заболеваний (в том числе и вирусов), отсутствуют систематические исследования. Изучение фотохимических процессов инактивации интересно и важно по 1- .ду причин: 1) УФ-иалучение -естественный фактор внешней среды и нельзя понять многих вопросов происхождения, эволюции и экологии живых организмов, не зная механизма действия УФ лучей на белки и нуклеиновые кислоты; 2) понимание основных механизмов действия УФ-облучения на биологически важные соединения необходимо, как теоретический фундамент практического использования УФ лучей; 2) методы и результаты фотохимических исследований нашли должное применение в современной молекулярной биологии. Среди всех УФ-индуцированных фотоповреждений, возникающих в нуклеопротеидах, нуклеиново-белковые ме»молекулярные ковалентные сшивки занимают особое место. В настоящее время этот эффект широко используется для исследования взаимного пространственного расположения молекул нуклеиновых кислот и белков в нуклео-протеидных комплексах и изучения механизмов белково-нук^еинового взаимодействия. УФ-облучение является удобным инструментом для изучения структурной организации вирусных частиц. Использование этого подхода позволяет определить белковые структуры, формирующие вирусный нуклеопротеид, и пространственную локализацию отдельных компонентов вириона. В данном докладе будут рассмотрены результаты ряда работ, посвященных изучению роли возникновения РНК-белковых • сшивок в процессе УФ-инактивации нескольких РНК-содержащих вирусов

и идентификации участков белковых молекул, непосредственно вовлеченных в формирование таких сшивок.

Цель и вадачи исследования.

Основная цель настоящей работы состояла в изучении молекулярных основ действия УФ-облучения на РНК-содержащие вирусы человека и животных.

В вадачи исследования входило:

1. Исследовать характер взаимодействие РНК с белком в составе вирусных нуклеокапсидов.

2. Определить количественные соотношения вирусных компонентов, образующих УФ-индуцированные РНК-белковые ковалентные связи и идентифицировать белок сшивающийся с РНК.

3. Изучить феномен частичной защиты макромолекул в составе РНП от действия гидролитических ферментов.

4. Изучить процесс инактивации инфекгионности представителей нескольких вирусных семейств под действие I УФ-облучения и отработать условия данного воздействия, гарантирующие надежность и глубину инактивации инфекционной активности исследуемых вирусов и сохранение антигенных и иммуногенных овойств вирусных белков.

5. Исследовать основные механизмы действия УФ-облучения на РНК-содержащие вирусы и определить для каждого основное летальное фотоповреждение вирионой РНК, приводящее к вирусной инактивации.

Научная новизна и практическое аначение работы.

Впервые с достоверностью показано возникновение ковалентных РНК-белковых связей в РНП вируса гриппа при УФ-облучении. Впервые дано экспериментальное обоснование представлению об участии азотистых оснований в РНК-белковом взаимодействии в РНП вируса гриппа А. Впервые показано, что еьше 802 азотистых оОНбШШ Ь РНК

вируса гриппа либо не контактируют о ИР белками, или ориентированы в таком направлении, что образование сшивки, как результат фотохимической реакции, невозможно. Впервые показано, что достаточное количество ИР белка - не менее, чем 502 - может быть связано с вирионной РНК УФ-облучением. Показана защитная роль белка РНП в процессе гидролиза вирусной РНК панкреатической РНК-ааой и »г^кле-авой 31, которая возрастает после УФ-облучения. РНК в составе РНП не экранирует белки от действия пронааы.

Определены параметры режима инактивации вируса гриппа, кинетика которой была многоударной. УФ-инактивация гетерогенной популяции вируса гриппа показала,что и' *>екционность филаментозных ви-рионов менее чувствительна к действию УФ-света, чем сферических. Различие в юс кинетике УФ-инактивации предполагает, что филамен-тозные вирионы являются мультигеномкыми. Показано, что УФ-инактивация инфекционности вирусов гриппа А связана с образованием РНК-белковых ковалентных связей и соответствует количеству РНК-белковых сливок на геном. УФ-облучени" (в пределах использованных доэ) не влияет на гемагглптинирупцую активность вируса гриппа. Нейра-минидаза при этом частично деградирует. Показана корелляция между УФ-инактивацией инфекционности вируса гриппа А и снижением синтеза вирусной РНК, что связано с изменением условий РНК-пояимеразн-ой функции и с фотоповреждениями.

Иэучено действие УФ-облучения и прогревания иа вирус энцефа-ломиокардита (ВЗЫ) мшей. Показана боль пая стабильное? ВЗУ к этим воздействиям, чем у других пикорнавирусов. Впервые показано при УФ-облучении образование РНК-белковых ковалентных связей для кардиовирусов, в котором принимают очень ограниченная часть молекулы вирионной РНК и не более двух капсидньи субгедквицы (22 всех вирусных белков).

Впервые показано, что УФ-облучение вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЗЛ) приводит к образованию урацидовых фо-тодимеров и ковалентному связыванию нуклеокапсидного бел- '.Ос

вирионной РНК. УФ-инактивация инфекционности ВЭЛ связана с образованием пиримидиновых димеров. Анализ ковалентно-связанных РНК-белковых комплексов показал, что не менее 1Z генома связано с С белком ( в "чличественном отношении не более 25 молекул белка на молекулу РНК), что указывает на интенсивный контакт РНК с белком внутри вирусного нуклеокапсида.

Впервые показано, что при УФ-облучении вируса вал происходит агрегация вирионов, что прямо зависит от доза УФ-света. Образующийся фотопродукт представляет собой прошитый УФ-индуцированными РНК-белковымк и белок-белковыми ковадентными связями агрегат нескольких вирионов.

Впервые изучено действие У0-облучения различной интенсивности (включая, нано- и пикосекундным УФ-лазером) на инфекционность вируса ВЭЛ. Показан экспоненциальный характер зависимости инфекционной активности вируса от дозы УФ-облучения и интенсивности светового потока. Основной летальный фотопродукт образуется по одноквантовому механизму. Определены квантовые выходы инактивации инфекционности, обоазования урациловых димеров и РНК-белковых сшивок.

Впервые изучено действие УФ-облучения на инфекционность ро-тавируса SA11. Инактивация вируса происходила в основном с одно-ударной кинетикой. Показано,что образование урациловых фотодиме-ров является основным механизмом инактивации ротавируса. РНК-белковые сшивки зарегистрированы только при высоких дозах облучена.. и не играют существенной роли в инактивации.

Работа имеет в основном теоретический характер. Однако, полученные результаты . зжны и в практическом применении, поскольку являются теоретическим фундаментом для разработки производственной фотоинактивации РНК-содержащих вирусов человека и животных. Экспериментально отработанные условия и режимы инактивации инфекционности данных вирусов могут служить основой для производства неинфекционных, иммуногешшх вирусных препаратов, необходимых для

дкагкостикм и профилактики определенных вирусных инфекций.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Метод индукции РНК-белковых ковалентных сшивок впервые применен для характеристики РНК-белковых контактов в вирусах гриппа, энцефаломиокардита мышей, венесуэльского энцефаломиелита лошадей и ротавируса SAH, характеризующихся равным типом симметрии и имеющих равный тип укладки РНК в белковом чехле. Впервые выявлено, в различной степени, участие азотистых оснований в этом взаимодействии у выиеобозначенных г -русных моделей. Данные создают основу для понимания процесса специфичности взаимодействия РНК и белка при сборке нуклеокапсида.

2. Определены условия и оптимальные режимы инактивации ин-фекционности изученных вирусов. Для эффективной инактивации необходимы строгий контроль условий процесса УФ-облучения вирусной суспензии относительно интенсивности падающего светового потока и её оптической плотности.

3. Определены механизмы фотоинактивации и основные летальные фотоповреждения вирусных РНК, ответственных ва УФ-инактивацию вирусов: образование пиримиднновых димеров - для пикорнавирусов, альфавирусов и ротавирусов; образование РНК-белковых ковалентных связей - для вирусов гриппа.

Публикация работ. Основные положения диссертации отражены в 20 опубликованных научных работах. Подробное изложение выполнения этапов работы было представлено также в ежегодных отчетах и обзорах по проблеме (1980-1992 гг.).

Апробация работы. Основные экспериментальные материалы и по- -ложения диссертации были доложены и обсуждены на научных сессиях НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского по обшей, молекулярной ие-

- в -

дицинской вирусологии (1080-1992 гг.). Пленумах проблемной комиссии "Химиотерапия и химиопрофилактика вирусных инфекций",Минск,

1981 г., 1932 г., I конференции вирусологов Казахстана, Алма-Ата,

1982 г., Международном семинаре по биотехнологии, Куба, Гавана,

*

1936 г., Международном симпозиуме "Арбовирусы и арбовирусные инфекции", Москва, 1989 г., Всесоюзной конференции "Энтеровирусы. Общетеоретические и медицинские аспекты", Киев, 1991 г.

X X

X

Автор выражает благодарность за продуктивное сотрудничество научным сотрудникам Института вирусологии им. Л.И. Ивановского РАМН А.М.Махосу, Н.Ф.Правдиной.Г.А.Галегову, Е.А.Говорковой, Я.Я. Цилинскому, М.А. Кузнецовой; сотруднику Института спектроскопии РАН Д.Н.Никогосяну; сотрудникам НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов H.H.Амитиной, В.А.Гиневской; сотрудникам Белоруского НИИ эпидемиологии и микробиологии С.П.Капитульцу, В.Л.Колодкиной, сотрудникам Национального центра научных исследований (Гавана,Куба) М.П.Родригес-Мольто.М.Тейхело, сотрудник; ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи Н.В. Клицуновой.Автор выражает глубокую признательность чл.-корр.РАМН, профессору Н.В.Каверину аа_постоянное внимание и консультативную помощь в процессе вылолнения работы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы работы

В работе использовали различные штаммы вируса гриппа А, которые культивировали в аллантоисной полости 10-дневных куриных эмбрионов или в клетках первичной культуры куриных фибробластов, иди в клетках МДСК (Wadln-Darby Canine Kidney); вирус знцефало-циокардита ццшей.рааыноженный в клетках асцитной карциномы КрёОе

... - ..r_ -

II мышей; зирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей, штамм СМ -27, выращенный в роллеркых культура* фибробластов куриного эмбриона; ротавирус SA11, размноженный в перевиваемых культурах к.™-ток почек геленой мартышки. Для получения меченого материала использовали 14С-аминокислоты и ^-нуклеоБиды.В процессе работы использовали различные вирусологические, молекулярно-биолсгиче ие, физико-химические, иммунологические методы исследования: концентрация и очистка вирусов ультрацентрифугированием в градиентах сахарозы, хлорида цевия и тартрата калия, выделение вирусных РНП и РНК, седиментационный и плотностной анализ субвирусных структур и РНК, электрофорез белков в ПАТ, i -гходш^ая хроматография на бумаге, электронная микроскопия и др.

облучение проводили с помощью бактерицидной лампой БУФ-16 ("■80* X - 254 км, I - 1x10 Вт/м2) или нано- (X - 256 км, энергия импульса 7 мДя, длительности 10 не, частота повторения 2 Гц) и пи-косекундного (X - ?б6 ни, энергия импульса 3 ыДя, длительность 23 по, частота повторения 0.5 Гц) У лазеров. Для расчета дозы облучения (падащая доза) определяли интенсивность светового потока с помощью уридинопой актинометрии по Колверт, Питтс (1963):

6.02 х ю20 10Ао - 1

1о - —-г 1г-

ФхЕП 10At - 1

do - интенсивность светового потока; Ф - квантовый выход фотогидратации уридина при облучении X - 254 нм и равный 21.6хи~3 моль/ зйнштейн; t - время облучения,мин.; Е - молярная экстинция уридина разная 8900 м2хмоль ; Ао- исходное поглощение водного р-ра уридина; At- поглощение р-ра через t мин. после начала облучения) и выражали в эрг/им2,исходя из того,что 1 квант - 7.8хю~12 эрг, 1 эрг - 1.28хЮ*1 квантов при X - 254 км.

Дозу поглощения (Д) рассчитывали с учетом оптической плотное-'-ти облучаемого слоя и концентрации вирусного материала в образце по формуле Д - 1погл/п И выражали в квант/нуклеотид. 1Погл. - 1о

х(1 - 10~А), где А - оптическая плотность облучаемой пробы, п -ухсхв.02хЮ17/320, где у-об'ем пробы в мл; с-концентрация РНК (мкг I /мл); 6.02x10*'-число Авагадро; 320 - ср. вес нуклеотидного остат- ! ка.

Отношение количества прореагировавши* молекул (Ы) к количеству поглощенных квантов (1погл.) на единицу об'ема называется квантовым выходом процесса. Величина N для инактивации вируса равна количеству инактивированных вирионов, для РНК-белковых саивок - количеству сшитых молекул РНК, для фотодимериэации - количеству эН-ди меров в РНК УФ-облученного вируса.

РЕЗУАТАТО РАБОТЫ И ИХ ОБСУ1ДКНИ2 I. У«НИНДУЦИРОВАННШ ИЗМЕНЕНИЯ В ВИРУСАХ ГРИППА А.

1.1. Уд-ииак-паицмя инфекционное™ вирусов гриппа А.

Наши исследования по УФ-инактивации инфекционности вируса гриппа (Колодкина с соавт.,1881; Смирнов с соавт., 1984) были выполнены с вирусом гриппа А, штамм А/Ы31/33 (Н1Ш). Для опытов по УФ-инактивации использован вирус, вырацышый в куриных эмбрионах, очищенный с иомоаыо центрифугирования в градиенте сахарозы по седине нтации.

Инактивация очищенного вируса протекала с одноударной кинетики, скорость инактивации была равна 2.251оею на 2.36x10^ эрг/ мм2 (рис.1). При УС-облучении неочищенного вируса ( вируссодержа-идя аллаитоисная жидкость, разведенная в 10 раз) или препарата вируса, частично очищенного адсорбцией-злюцией на куриных эритроцитах ккнзтика инактивации в начале была также од'ноударнн. Дальнейшая инактивация проходила при низкой скорости, что обусловлено,видимо, присутствием клеточного-деОриса, полиплоидных вирусных частиц (короткие нитевидные и ыорфодогически антипичные большие сферические

формы вмриоков) или аггрегациэй вируса. Такое отклслйше от одно-ударной кинетики затрудняет получение инактивированпых препаратов.

Рис.1'. Инактивация инерционности вируса гриппа А/У5М/33. По оси ординат - титр вируса в 1ег ИДэо/мл, по оси абсцисс - время инактивации в сек.

Рис.2. Измэнеш-.э активности л-герхностных белков вируса гриппа А под действием УФ-света. По оси ординат:а - титр генагглюткнина [23 в 1г ГАЕ/О.2 мл; б - тктр ЫАНА С1) в мкг/0.2 мл/ч.

Рис.3. Влияние Уоблучения на активность РНК-полимэрааы В1фуса гриппа А. По оси ординат - включение 3Н-1!МР.

1.2. ДеЯсггпэ Ув-еблучеикя ка струятгри--» багта гофу 1 граяла А.

Изучали действие УФ-облучения на функциональна активность гемагглютинина, нейроминидазы и вирионной РНК-полкмеразы вируса гриппа А. Известно, что У ¿»-облучение вирусов в первую очередь вызывает повреждения, связанные с нуклеиновым компоненте.-« (разрывы куклеотидных нитей,образование урациловых димеров,нуклеиново-бед-ковыэ ковалентные сшивки). Представляется маловероятным,что стру-

ктурныэ вир/оные сежи остаются инертными при таком сил: ли Фото-

химическом воздействии. До сих пор отсутс? /ют данные о возможных УФ-индуцированных повреждениях вирусных Селков, а также неизвестен их вклад в вирусную инактивг. ию. Поэтому проводили определение функциональных свойств некоторых белков вируса гриппа ( гемагглю-тинина.нейраыинидааы и вирионной РНК-полимеразы) при тех же условиях УФ-облучения, что и в экспериментах, описанных выше.

Показано,что использование дозы УФ-света 2,224х102-2,668х103 эрг/мм2не вызывает изменения гемагглютинирующей активности вирус-содердащих препаратов. Активность другого поверхностного белка вириона - нейрамияидазы оказалась более чувствительна к УФ-облуч-ению, и при дозе, равней 2,668х103 эрг/мм2, отмечено её снижение на 17,62 (рис.2).

Показано, что воздействие УФ-света в дозе 2,224х102 эрг/мм2 на вирус приводит к выраженному изменению синтеза РНК в бесклеточной системе (снижение на 55,8Х) при использовании в качестве фермента вирионной РНК-полимерааы облучённого вируса. При дозе УФ-облучения, равной 2,668х103 зрг/мм2, отмечено лишь 8.2Z от первоначальной активности РНК-полимеразы вируса гриппа. Эти результаты • свидетельствуют о снижении уровня синтеза вирусспецифических РНК по мере увеличения доз УФ-облучения (рис.3).

Таким образом, показана корреляция между инактивацией икфек-циоиности вируса гриппа А и снижением синтеза РНК, катализируемого вирусной РНК-полиыеразой. Уменьшение активности вирусной РНК-полимеразы можно объяснить как изменением условий функционирования фермента, так и его фотоповреждением.

Относительно фо повреждений структурных вирусных белков УФ-светом можно предположить, что наружный гликопротеид - нейрамини-даза в процессе УФ-облучения частично деградирует, что выражается в небольшом снижении нейраминидазной активности. Что касается вирионной Р1Ш-полимерами, то результаты экспериментов не позволяют сделать подобное заключение.

1.3. у»-1южт*>аця1 ^кяамеятоати я сферических кярконов ядоса гриппа.

В работе использован реассортант вирусов гриппа АЛБМ/33(НШ) и А/утка/Хошимин/014/78 (ИбЮ) с высоким содержанием филаментозкых вирионов. Проведенное препаративное разделение гетерогенной популяции вируса позволило применить действие УФ-облучения для выяснения вопроса о иультигеномности филаментозных вирусных частиц. В случае иал^ия как в сферических, так и в фил^ентозных формах ливь одного набора геномных сегментов следовало ожидать одинаковой динамики УФ-инактивации, тогда как в случае наличия нескольких геномных наборов следовано бы ожидать многоударной кривой инактивации в обогащенной филаментами фракции. Кривые инактивации популяций вирионов реассортанта К>-1. содержащихся во фракциях, обогащенных сферическими и фидакентозиыми частицами.показаны па рис.4.

Т1М( На ••«.!

Рис.4. УФ-инактивация инфекдаонности филаментозных (&) и сферг-ес-ких (П) вирионов реассор 1нта К-1.

Сферические частицы инактивир, .отся по одноударному типу в интервале снихения ннфокциошюсти гг. 1,8 1г ИДзо. что указывает на отно-

8

сительно низкое содержание мультигеномных частиц, приблизительно соответствующее количеству филаментозных форм, имеющихся в этой фракции (2Z). Дальнейшая инактивация идёт с иным наклоном и обусловлена, ворс-"но, суммированием многоударных кривых инактивации частиц с разным количеством эквивалентов генома.

Инактивация фракции, обогащенной филаыентаыи, с самого начала имеет такой характер,как инактивация остаточной фршсции в препарате сферических частиц. Это подтверждает представление о том, что изменение характера инактивации сферических частиц обусловлено примесью филаментозных частиц. Различие характера инактивации фи-ламентозных и сферических ' стиц говорит в пользу мультигеномного характера последних.

Представленные данные указывают на наличие в филаментозных формах вируса гриппа того же набора сегментов РНК и в тех г.е соотношениях, что и в стандартных вирионах. Данные УФ-инактивации позволяют полагать, что в каждом филаменте содержится несколько таких геномов. Расчет содержания геномных наборо» в филаментозных вирио-нах прозодили, полагая, что стандартные сф ..рические частицы содержат один набор генов (8 сегментов РНК), а филаменты - m геномов. Для одних и тех же УС-доз щ - N®/Nc, где - число инфекционных филаментозных Еирионов после УФ-облучения; Nc - число инфекционных сферических "ирионов после УФ-облучения. Анализ,проведённый на основании кривых инактивации вируса гриппа, содержащегося в разных фракциях, в соответствии с методами расчёта инактивации моно- и му-^тигеномных биологических объектов (Дертингер Г.,Юнг X.,1973), показал, что филаментозные вирионы содержат,в среднем, 5,5 наборов геномов стандартных с,.рических вирусных частиц.

Ыулътигеномность филаментозных вирионов опредзляет их более ьысоку» устойчивость к действию УФ-ивлучения по сравнению со сферическими частицами, что, вероятно, имеет определенное значение при циркуляции вируса гриппа А в естественных условиях,где УФ-свет ньлиется постоянно присутствующим фактором внешней среды. Возмод-

но, наличие в популяции вируса филаыептозных форм способствует более высокой эффективности циркуляции вируса гриппа А среди животных и человека. Это следует иметь в виду и учитывать при использовании УФ-облучения для приготовления неинфекционных иммуногенных препаратов вируса гриппа. В связи с этим для таких целей важен отбор штаммов с минимальным количеством филаментов в в:;русной популяции.

1.4. РНК-баиаааэ взгиыодейсткся в рмбонук: хшротеядэ вируса гриппа А, вдевляекые при УЗ-облучения.

Метод индукции РЖ-белковых ковалентных свивок посредством УФ-облучения рибонуклеопротеидных структур неоднократно был использован для выявления контакта азотистых оснований РНК с белками. При поглощении кванта Уф-света в месте контакта азотистого основания с аминокислотой возникает ковалентная сшивка. Этот подход был использован при изучении ряда объектов, в частности - вируса табачной мозаики (&хМагс! оЪ а1. ,1966; ОоЬгоу еЪ а1.19&4), другг" вирусов растений (ЕЪгезтапп е1 а1., 1980; КаЬаг1г1 еЬ а1.,1967), вируса Сендай (Ка^ю*. КШгзЬигу, 1979). В настоящей работе метод УФ-индукции РНК-белковых сшивок впервые применён для характеристики РНК-белковых контактов в ркбонуклеопротеиде вируса гриппа.

Для получения радио^.ктивномеченного вируса его размножали в «

клетках первичной культуры куриных фибробластов или клетках ВДСК в присутствии 14С-аминокислот или "'Н-нуклеозидов в зависимости от цели эксперимента. Для метки вируса по РНК обычно использовали 3Н -уридин; для специальных целей в отдельных случаях метили ^Н-гуа-нозином, ^-цитис том или ^-аденовином. Меченный вирус был очищен и сконцентрирован путём адссрбции-элюции на куриных эритроцитах, затем центрифугированием последовательно в 40Х сахарозе,черед. 10Х сахарозу и в градиенте плотности Сахаровы 15-40* при 4°с в течении 50 мин. Необ-одимо отметить,что для исследований УФ-облучён-

»

- 14 -

ного вируса гриппа зонакьноскоростное центрифугирование предпочтительнее, чем широко используемое равновесноплотностное центрифугирование. Для выделения вирусного нуклеопротеида очищенный вирус был лизиров 1 0.5Z дезоксихолатоы натрия, наслоен на верхушку 15-407. градиента плотности сахарозы и центрифугирован 14 ч. при 4°С. Материал, меченный любыми из 3Н-нуклеозидов занимал позицию, характерную для рибонуклеопротеида (РНП) вируса гриппа; пик материала, меченного 14С-аминокислотами определялся в той же позиции. Как очищенный вирус, так и собранные фракции градиента, содержащие РНП, были облучены УФ-светом при 0°С и расстоянии до источника 7см. или 20см., что сооть гствует дозам облучения 1,399 х104 или 2,833х103 эрг/мм2/мин.

Характер РНК-белкового взаимодействия в РНП вируса гриппа остается неясным. Основная роль в поддержании структуры РНП приписывается белок-белковому взаимодействии, на что указывает сохранение структуры при гидролизе РНК (Pons et al.,1969; Duesberg, 1969;Kingsbury & Webster,1969). РНК-белковая связь поддерживается преимущественно за счет ионного взаимодействия белка с сахарно-фосфатным остовом РНК (Соколова М.В. с соавт.,1982;X остова Ы.Л. 1990). Оба эти фактора - белок-белковое взаимодействие и ионное взаимодействие сахарно-фосфатного остова с белком - не могут объяснить высокой степени специфичности распознавания вирусной РНК белком при сборке РНП. Очевидно.что для специфичности сборки нужно первоначальное распознавание белком определенной последовательности иуклеотидов, а следовательно взаимодействия с азотистыми основаниями. Тем не менее, какие-либо экспериментальные данные, подт-веридагоцие это представление, до сих пор отсутствовали.

Чтобы зарегистрировать образование РНК-белковых сшивок, ме-г-Н1шх Зн-урндином, очищенный вирус был облучен разними дозами и внрионная РНК была экстрагирована додуцилсульфат(ДОН)-фенольным методом. Количество экстрагируемой РНК резко уменьшалось после облучения ц;ис.5). В необлученных образцах почти 100Х метки перехо-

дило в водную фазу после экстракции, тогда как после 20 сек. облучения её количество в водной фаае падало до 182. Это надёжно свидетельствовало об образовании ковалентных РНК-белковых связей в результате УФ-облучения. Необходимо отметить, что этот эффект наблюдался в том же интервале доз облучения, как и инактивация инфек-ционности: отношение этого факта к проблеме механизма инактивации обсуждается ниже в количественных выражениях. Снижение X РНК, экстрагированной ДСН-фенолом, наблюдалось также, когда облучался изолированный РНП. Нэ было отмечено различия между препаратами, меченными ^-уридином и другими нуклеозндзми.

Рис.5

Рис.6

рис.7 ___

5 ю 20 ™ «о « 10 го <о "

Рис.5. Действие УФ-облучения на экстракцию ^Н-Р1 : вируса гриппа А. Ордината - 7. экстрагированной Зй-РНК; абсцисса - время облучения в сек. (5 сек. соответствует 2.36*102 эрг/мм2). Рис.б. Электрофорез в ПАТ 14С-белков нуклеокапсида вируса гриппа А 1-вирус гриппа А/УБН/ЗЗ; 2-РНП, облученный УФ-дозой 8.034х105 эрг/ мм2; 3-также как 2+обработка РНК-азой А (10 мг/мл при 37°С 30 мин) Рис.7. Седиментация ■'Н-РНК из уф-облученного вируса гриппа в ДСН-сахарозном градиенте 10-307. Центрифугирование 16 ч. при £'.000 об/ мин. .ротор 5У-27. а-необлученный вирус;б-УФ-доза 16.0б8х105эрг/мм2,

Для того, чтобы оценить способкост- белка нукпеокапсида участвовать в образовании РНК-белковых лшвок, мы облучали РНП, меченный 14С-аминокислотами, бс ьшими дозами УФ-света и анализировала материал электрофорезом в ПАТ. Как можно видеть на рис.6, препарат РНП, облучённый 1ч (8,034х105эрг/мм2), содержал больше количество (около половины) молекул белка NP способных войти в гель и занять то жо положение, как и белок NP из контрольного образца; остаток выделялся на верхушке геля. Такой же результат был получен при 2-х часовом УФ-облучении. что является насыщающей дозой облучения в отношении формирования сшивок. С другой стороны, когда 3Н-урвдином меченный вирус бия облучен, лиэирован ДСН-мер-каптоэтанодом и центрифугирован в ДСН-сахарозном градиенте, было показано, что мгчешшй материал имел коэффициент седиментации равный 40-60 S, характерный для РНП (рис.7). Эти результаты в целом указывают, что достаточное количество NP-белка - вероятно нэ менее чем 50Х - может быть связано с вирусной РНК УФ-облучением, но также существует большая фра'сция, устойчивая к облучению и остающаяся несвязанной с РНК.

Дальнейииэ опыты были выполнены с целью определения процента нуклеотидоа геномной РНК, участвующих в образовании сшивок. Рациональность этих опытов основана на следующем: 1) РНК вируса гриппа в составе куклеокапсида чувствительна к действию панкреатической рибонуклзагц (Pons et al., 1969; Duesberg, 1969; Kingsbury, Webster', 1969; Смирнов с соавт., 1981); 2) олигонуклеотиды, сшитые белком, в препаратах, облучённых УФ-светом, должны оставаться в кислотонераствсримом чтериале после рибонуклеааной обработки. По этой причине обширное сшивание по нити РНК должно резко увеличить кислотонерастворимую фракцию. На самом деле, идеальная нуклеаза для этой Цели должна быть ферментом, способным гидролизировать РНК до единичных нуклеотидов; к сожелению, наши попытки использовать нуклеазуЗ! для переваривания РНП вируса гриппа были неудовлетворительна в этом отношении (Смирнов с соавт., 1981). Однако, примене-

аие панкреатической рибонумеады позволило дать, по крайней мере, минимальную сценку фракции, неспособной участвовать в образовании сливок.

Вирус, меченный ^-уридином,разрушали дезоксихолатом натрия; фракции градиента плотности сахарозы, содержащие РШ, объединяли, облучали УФ-светом в те»ении 1 часа или 2 часов (дозы в,(XV ;Ю5 эрг/мм2 и 16,068x105 зрг '^.соответственно) и обрабатывали интенсивно панкреатической РКК-азой. Кислотонерастворимая фрагащя после переваривания содержала 18-22Х исходного количества РНК в обоих УФ-облученных образцах. В контрольных (н&облученных) образцах деградация была значительно глубже: кислотонерастзоримыи остаток составлял 3-41 (таблица 1).

Таблица 1. Действие РНК-азы А на УФ-облученный РНП вируса гриппа

Образцы Радиоактивность (имп/мин) X резистеиции

без РНК-аза с РНК-азой

Необлученный 4203 134, 3.2

УФ-облученные:

(доза 6.034Х105 3344 501 15

зрг/мм2)

(доза 16.068Х105 3268 649 21

эрг/мм-)

Инкубация с РНК-азой А (10 мкг/мл) 30 мин. при 37°С.

Сходные данные получены с препаратами ГНП. меченными другими 'н-нуклеовидами (таблица 2). Результаты предполагают, что сьыае ОХ азотистых оснований в РНК вируса гриппа либо не контактирует с Р-белком, или ориентированы в таком нэ-равлэнии, что образование ГиЬКН, КАК результат фйШШРКС!Ш нево&мйзккс.

Таблица 2. Чувствительность меченной р; ними 3Н-предшественикш.ш РНК вируса грипп'. ассоциированной с нуклеокапсидом после УФ-облучения.

нукдеозид X резистентности к РНК-азе

необлученный 16.069х105 эрг/мм2

аденозин 4.4 18.6

гуанозин 3.8 20.6

уридин 3.2 21.0

цитидин 4.4 19.7

Приведённые в этом разделе работы результаты показывают, чт ь РНК-белковом взаимодействии в вирусе гриппа участвуют авотисть основания (-207. всех оснований вирионной РНК). По предварительш данным, такие контакты азотистых оснований равномерно распределе) по длине РНК, т.е. с белком взаимодействует каждое пятое азотист основание.

. 1.5. О ьзханкзые инантквацни инфекционное-™ - ортомикса&фусав 1 светом.

С целью выяснения соотношения между образованием РНК-белко ковалентных связей и 7Ф-индуцированной инактивации инфекционнс вируса гриппа 3Н-урвдином меченный вирус был облучен ранг УФ-дозами, вирусная РНК была экстрагирована ДСН-фенолом и анал! рована в ПАТ. Показана общая дозовая зависимость уменьшения к чества РНК в водной фазе и снижения инфекционноети вируса.

Теоретически 8 инактивирующих ударов на вирусный геном до вызвать (учитывая относительную длину сегмента) уменьшение ш

ционнрсти е "7>е5 - 4.7бх10~4, тогда как 4 удара должны продуцировать е~0-5x7•65 - 2.2х1СГ2 уменьшение. Если допустить, что 1 удар вывьюает сшивку, то процент "свободной" РНК должен быть равен 40.22 для 8 ударов и 612 для 4 ударов. Экспериментально, облучение 5 сек. снижает инфекционность на 2.25х10~2, а количество экстрагируемой РНК равно 732,тогда как после 10 сек.облучения снижение ин-фекционности было на 4.0х10~4,а экстр-..:ция РНК падала до .-<32.Таким образом, экспериментальные данные были блиэки к теоретическим расчетам, основанным на допущении,что 1 удар УФ-све'. а, вызывающий инактивацию вируса, является тем же самым событием, которое вызывает образование РНК-белковой связи. Относительное количество сегментов РНК в облученных образцах изменялось в соответствии с размером мишени, т.е. длиной сегментов. УФ-инактивация каждого сегмента РНК подчиняется статистике Пуассона. Вероятность инактивации отдельного се.мента РНК определяется числом его нуклеотидов (рис 8).

Рис.8. Снижение содержан"ч РНК-сегментов в экстрагированной ДСН--фенолом РНК вируса гриппа под действием УФ-облучения. 1-8 - РНК-сегменты вируса гриппа. Орду; лта - 2 от содержания РНК-сегмента в необлученной пробе; абсцисса - время облучения (сек.).

Расчет количества ударов на геном, основанный на УФ-инду-цированных изменениях пропорции сегментов, выявленных с помощью электрофореза и фенольнсл экстракцией сегментов РНК, также пред-полагает,что событие,образующее сшивку, является основной причиной мнакгчации. Экстракция РНК с предварительной обработкой протеина-аои К не выявила изменений в относительных количествах сегментов. Это предполагает,что произвольные разрывы сегментов РНК не являются существа„ней причиной уменьшения соотношения сегментов РНК, так как в этом случае изменения должны быть одинаковыми или близкими в препаратах, полученных как ДСН-фенолыюй, так и протеиназа К-ДОН-фенольной экстракцией. Таким образом, по-видимому,то же самое событие ответственно за инакти-ацию вируса и исчезновение сегментов вирусной РНК из экстрагируемого ДСН-фенолом пула -ЛК: наилучшим объяснением такого события может быть образование РНКбелко-взй ковапектной связи.

Ниви результаты позволяют предположить, что часть азотистых основы, .й в РНК вируса гриппа ориентированы в направлении весьма подходящем для образования РНК-белковых УФ-индуцированных сшивок; такие основания являются первичной мишенью в процессе УФ-инактива-ции вируса грип 1, таким образом, в отличии от пикорнавирусов, для вируса гриппа основным инактивирурщим событием является образование РНК-белиовой ковалентной связи.

Использование УФ-облучения для изучения структуры вирусного нуклеопротеипа является мощным инструментом исследования и расп-ростоанекке такого подхода ка различные группы вирусов следует ^.'читать весьма многоибедцгщим. Разъяснение молекулярных основ УФ-ииактавации должно дать в б~чущем хорово оЗоскованные рекомендации относительно условии, обеспечивающих ьффективную чнактивацию вместе с минимальным повреждением вирусной структуры и антигенных свойств.

-Zill. рт-ввттв взляедДОствкя в вирус* ищвйалоыиокардитл,

ВШВЛЯМЖ УННДУЦИР08АЯНШИ RDBAJEHTHttM СИНИШЬ.

Хотя архитектоника пикорнавирусов интенсивно изучалась, до сих пор нет полной ясности в отношении структурной организации пи-корнавирусных РНК и белков. Для изучения РНК-белкового взаимодействия применялось УФ-облучение, как на модели полиовируса (Le Bouvier,1955; Rolzman et al.,1959; Kata&lri et al.,1967; Wetz & Habemiehl, 1982),так и Менговируса (Miller & Plagemann, 1974). Эти работы дают некоторую информацию,однако, они были ограничены быстрой деградацией вирионов в результате высоких доз облучения, приводящей к образованию пустых капсидов (Kataglrl et* al., 1967) или eOS-рибонуклеопротеидов (Miller & Plagemann,1974). Структура вируса энцефаломиокардита (ВЭЫ) оказалась более резистентной к УФ-облучению, о чём свидетельствуют ряд морфологических характеристик, структурная целостность, седиментационное поведение.Высокая струк-. турная стабильность ВЗМ позволила нам применить некоторые дополнительные воздействия и аналитические процедуры к облучённому вирусу.

2.1. Действия физических факторов на струнтурнун организация вируса энцефаломиокардита.

в

Действие прогревания на кнтактные и УФ-облучённые вирионы ВЗМ. В предварительной серии опытов были найдены оптимальные условия для получения пустых капсидов ВЭМ. Прогревание вируса при 54° в течение 2 мин., приводит к частичной конверсии вирионов с плавучей плотностью в хлориде цезия 1,34г/см3 в "пустые" капоццы с плавучей плотностью 1.30 г/см3; после прогревания в течение 20 мин. это превращение было полным (рис.9). Утрата вирусной РНК, сопутствующая изменению плотности, показана исчезновением ''Н-меченной РНК из пика 1,34 г/см3. При более низких температурах образование пус-

тык капеидов Сило менее эффективно (рис.10). Электронномикроскопи-ческое изучение показало, что пустые капсиды являются преобладающей структурой в прогретых препаратах.

¿¡рйствжг У*-облучьния на структуру гг.фуса ВЭН. Показано, что У Ф--облучение приводит к увеличению плавучей плотности вираонов до 1.46 г/см3 (рис.11). Этот эффект объясняется,вероятно,увеличивающимся проникновением ионов цеэич внутрь вирионов.РНК внутри пикор-навирусного капсида недоступна для РНК-азы, однако УФ-облучение делает к&псид проницаемым для РНК-азы. В наших опытах чувствительность вириокной РНК к действию РНК-азы увеличивалась значительно, по мэре увеличения дозы УФ-облучения, и достигала максимального уровня (94-97Х) при УФ-дозе равной 4.221х105 эрг/мм2.

2.2. У*-индукцня образования РНЯ-бакшюх кававдкпшх ставок в вмрноне ВЭЫ.

УФ-облучение образует ковалентные РНК-белковые связи в вирио-не, которые должны были препятствовать высвобождению РНК из вирио-ноь, индуцированному прогреванием. Чтобы убедиться в этом мы прогревали УФ-облученный вирус при 64° в течение 20 минут. Центрифугирование в градиенте хлорида цезия показало, что примерно половина меченной РНК присутствовала в материале с плавучей плотностью 1.40 г/см3; остальная ео часть определялась в верхней части градиента, что, вероятно, свидетельствует о частичном разрушении молекулы РНК: мелкие фрэгменгы отделены от висиона, в то время как около половины молекулы сохраняет связь с капсадом (рис. 12а). Расчёт отношения РНК/Селок с использованием формулы Спирита (Бр1г1п д.3.,1963) подтверждает эту интерпретацию. Изменение плотности с 1.40 у/си? до 1.43 г/см3 после прогревания УФ-облученного вируса наблюдалось в наших опытах регулярно. Результаты аналогичного экс-¡¡йркмгятА о виру сои, меченным 14С-г^икокис:лот£ши, предс-тамгн на

It M M

Гис.». Пютмосткай mu¿ прогриого ЮМ ж iщгоии СИЯ. Р»с.10. Аюю перерасчредаижм радии

ЮМ, мчяаиМ 'VnogyxnaxToa хлорит, rrporper при Б4° «такого ызтфкзм при прогремят ЕС*.

Z т. (В), 20 тм (I). мтплмЯ K3N (А). тчири>я ЦК1ЦЯИ Точи криюя «кт»етст*у»т 1-содармгап

» Прв^ормярощаинт граднеяты СяС1 ( Splnoo 1В0.1, 3D.ООО мгишчго юторних а гаям с <шиучеА

оО/тш. 19 ч., 4°) иопосп* 1.30 я 1.34 r/cu3.

k i,

rac.lt. КяопоспнЯ миа rt-oanywaiiro^» S3« * гращен-ти СчС1. гзи 1кх>в1учтпМ (А) н м-облучини» 1» *** (» я 20 им (С) ииоцкаяш мм умлм » рме.9.

Ряс. IX. ЬотяостяоЯ nun yt-oOirmaora м cporpsroro KM ВЭМ, нечетам 'j-fnun.» (А) к 1 •с-гадраммт» кшуралш (8). УЭ-обдучвикыв 20 um м лрсгретч* лрн Ы° 20 um. ям-»»*ям« • граляюты CsCl.

И |.ll|lll||lllr » *9 '« 99

рис. 126.. Распределение по плавучей плотности показывает, что вирус-количественно превратился в 1.40 г/сиэ форму- Это означает, что все вирионы теряют одинаковое количество РНК. Хотя РНК частично сохранена в составе вириона, седиментационное поведение вируса меняется так, как это характерно для прогретых пикорнавирусов, т.е. коэффициент седиментации уменьшается до 75Б. Не было выявлено каких-либо изменений полипептидного состава вирионов при облучении и последующем прогревании.

С целью выяснения факта образования ковалентных связей между вирусной РНК и белками капсида иэ^-уридином меченного ВЭМ, после облучения, экстрагировали РНК ДСН-фенольным методом (таблица 3).

Таблица 3. Экстракция РНК из УФ-облученного ВЫЫ

Время УФ-облу- Радиоактивность проб (имп/мин) % экстраги-лучения (в мин)- до РНК-азы после РНК-ааы рованной РНК

О 440143 437382

10 352960 203589

20 372220 145566

Показано,что экстрагируемость РНК значительно уменьшалась по мере увеличения доз УФ-облучения. Эти результаты свидетельствовали о возникновении РНК-белковых ковалентных связей.

В случае обиирпой РНК-белковой сшивки, связанные белком нук-леоаиды оставались бы вместе с вирусными белками после обработки РНК-азой, увеличивая количество метки в киелотонерастворимой фракции. Однако, такого увеличения не наблюдалось даже после очень больших доа УФ-облучения. Этот эксперимент был выполнен с вирусом .иечешвм (раздельно) всеми 4 нуклеотидами. Ни в одном случае не наблюдали увеличения киелотонерастворимой фракции (рис.13).

100 57.7 39

I е/ tire**' •О» fl

?мс.14. С«лкм#нтационн»Л анллка нридукта У» обдучеммого I3M. ВЭИ.дечекн!* Ы-ури-дюгам (А) ши 1 Ч^-гмяршватом иореллы (В), обивуч&м 00 юа.обрабатывал! 11 ДСП 2Х МЭ, цвмт^^у^оиия в градмити мо мости С&хароэы 1О-Э0Х о О. Б* J,CH и О 2Т мэ (Spinoo L66, ротор sv гг. 1. го ошкл/ ком, 1бч ,2ЬС) Иаркери - tas л 28S FUK.

РМС.1Э. Эа*исхм«сть чуьспмтвмностм ВЭМ и РНЯ-aae от деч* ЯвРюбдучеюм. Преоара-взц, мечетиго чав*влмго ^U-адвноаяюм (—эн-гуаноаямом (---). -^Н-цнтидмиои (- -). -Vypwpwo* (—)» облучали от J0 до 80 м*м. .княу&фавади с РНЯ ааоЯ А (10 мкг/ш,37°,ЭО wwk) радемяткшюстъ кисло нерастворима* фракции доаяены ■ I и вой-тролаш* ивоблушгмчым препаратам

...Л-

" I ' ■I■■■ м ■ 'I ■ ■

« 9 lt го t4 ft

i г i <, 5.

í ' i'

P4C.Í6 аяеятро+оретнческмЯ янадма в i-pa-дааит» IIW 10-201 струитурма ввжо» вам

1 - У* облучении* вэа (от 1.« г/ск ).

2 - Г*-обдучекп« и щкграп« GJN (1 4flr/ с» ), з - протрвчл вам (1.ЭО г/см ). 4 -структур» <83. Б - шггигмы* «прус.

«» /и ив

\Л

> « /» /« ,о 1, ,, ЩЛСТ19Ч9 мччшта

Обработка УФ-облученного ВЭМ ДСН и 2-меркаптоэтанолом, с последующим ультра^ентрифугироваиием в градиенте плотности Сахаровы содержащей ДСН, позволила выделить 40S структуру (рис.14а,б).

При использовании и таком опыте вируса, меченого по белку, в этой зоне выявляется пик материала,содержащего 2У. тотального белка (рис.146).Эта структура была обработана РНК-азой и проанализирована электрофорезом в ПАТ.Полипептидные образцы дали полосы белков,' соответствующих вирионным белкам в тех же самых соотношениях, как и необлучённый вирус (рис.15).

Представленные результаты,в основном,подтверждают данные о действии УФ-облучения на пикорнавирусный вирион. УФ-облучение действует на ВЭМ также, как и на другие пикорнавирусы: образуются РНКбел-ковые ковалентные связи и увеличивается проницаемость капсида, выявляемая, как увеличение плавучей плотности вируса в градиенте хлорида цезия и чувствительности вйрионной РНК к экзогенной РНКазе (Miller & Plagemann, 1974). Однако, вирионы ВЭМ сохраняют свою целостность даже после значительных доз УФ-света, которые вызывают частичную деградацию вируса Менго. Большая стабильность ВЭМ толе подтверждается меньшей степенью увеличения чувствительности к РНК-азе. Мы комбинировали УФ-облучение с прогреванием вируса,при этом плавучая плотность его уменьшилась (1.46 - 1.40 г/ см3) и часть»но исчезала меченная РНК из Еирионов. Единообразие ответа предполагает, что поломка РНК не случайна. Кажется вероятным, что УФ-индуцированные ковалентные сшивки предохраняют полную эвакуацию РНК из капсида во время температурной обработки, так что освобождённая часть молекулы РНК отламывается; тогда как ее часть вблизи со связями остаётся в составе капсида. Ни одна из обработок B3¿, ни УФ-облучение, ни прогревание,ни комбинация обоих не приводили к каким-либо изменениям поведения вирусных полипептидов в электрофорезе в ПАТ.По крайней мере,три вирусных белка выявлялись как компоненты 40S структуры, ковалентносвязанными с вирусной РНК после УФ-облучения. Пикорнавирусный капсид состоит из 60 еуоъбдиниц, в

- Й7 -

каждой субъединице представлена по одной молекуле каждого вирусного структурного бел'ла (а, т, б). Представляется, чго не более двух капсидных субъединиц достаточно для тесного контакта с РНК. чтобы образовать ковалентные связи. Ограниченные РНК-белковые контакты являются,возможно, ответственными за отсутствие увеличения во фракции РШ , ковалентно связанной с белком после более длительного облучения. На это указывает переход РНК з кислоторастьсримый материал после обработки рибонуклеаэой (рис.13).Эти результаты предполагают, что специфика нуклеотиднобелкового контакта в ВЭМ допускает образование не более, чем в двух местах, ковалентных связей в результате УФ-облучения. Представленные данные впервые показывают образование РНК-белковых ковалентных связей для кардио-вирусов.

Ш. ДЕЙСТВИЕ УФ-ОБЛУагНИЯ НА ВИРУС ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛШШЭТА ЛОИАДЁЙ.

Данный раздел работы сообщает данные экспериментов,характеризующих действие УФ-облучения на альфавирус и сопоставление специфических эффектов с УФ-индуцированной инактивацией вирусной инфекционное™.

3.1.Инактивация кнфекционности вируса ВЭЛ под действием УФ-света.

В опытах по инактивации инфекнионнооти вируса ВЭЛ било изуче -но действие УФ-облучения низкой интенсиЕНОсти (X - 254 нм, I - 10 йт/м21 и высокоинтенсивиого лазерного УФ-налу гения нано- и пикосе-кунднон длительности (Л - 266 нм,I - 10'- 101ЭВт/мй).Использование лазерного УФ-облучения было обусловлено его преимуцес-п^ми перед низкоинтенсиЕным УФ-облученнем. В частности, УФ-лазеры концентрируют высокую ?цергию в коротком импульсе излучения. которое имеет монохромную длину волны и индуцирует ДЕухквантоные фотопоьрежде-

- га -

ния. УФ-облучению подвергали осветленную вируссодержащую культу-ральную жидкость. Инфекционный титр необлученного (So) и облученного (S) вируса определяли по бляшкообразующей активности. Кривые инактивации представляют собой выражение зависимости lg S/So от дозы УФ-облучения. Показано,что использованные дозы УФ-облучения низкой интенсивности давали экспоненциальную кривую снижения ин-фекционности вируса ВЭЛ. Полная вирусная инактивация достигалась (снижение инфекционности на 9,5 lg БОЕ/мл) при дозе равной 1.96х104 эрг/мм2 (рис.16). УФ-доза,дающая 37Z выживания инфекционности, была равна 300 эрг/мм2. Квантовый выход инактивации очищенного вируса составил 2.5х10"4.

■ Кривые инактивации, полученные при облучении высокоинтенсивным лазерным УФ-излучением нано- и пикосекундной длительности, также имеют экспоненциальный характер. С повышением интенсивности обоих типов облучения наблюдалось постоянное уменьшение наклона кривых вирусной инактивации и уменьшение квантового выхода, т.е. замедление процесса инактивации с ростом интенсивности лазерного УФ-излучения. Уменьшение квантового выхода свидетельствует об од-ноквантовом механизме образования летального фотопродукта.

3.2. РЮ-белковие контакты в вирусе ВЭЛ, выявляемые при УФ-о&цучеики.

Было охарактеризовано образование ковалентных, УФ-индуциро-ванных РНК-белковых связей, используя стандартный метод, основанный на ДСН-фенол экстракции РНК из облученного3^ уридином меченного вируса с последующим подсчетом ^-РНК в водной фазе. УФ-облучение приводило к экспоненциальному уменьшению количества экстрагируемой РНК, так что при УФ-дозе равной 7.9х104 эрг/мм2 i водной фазе было только 3.5Х 3Н-РНК (рис.17). В этом опыте падающая

л >1

УФ-доза 1,0x10 эрг/мм2 соответствовала дозе поглощения 3,6 кв/нук-леотид. УФ-доза, при которой экстрагировалась 37Х РНК, была равна

Рис.1 б

- о.»

01 02 о; ОА «ю-4 егд/тт1

Рис.17

10 ¿О 50

(¡идпЫт/тиЛеЫМе

Рис.16. УФ-инактивация инфекционноати вируса ВЭЛ. Ордината - отношение инфекционного титра необлученного (Бо) и УФ-облученного (3; вируса; абсцисса - УФ дозы. Рис.17. Действие УФ-облучения на эффективне ть феноль-ной.экстракции ЭН-РНК иэ вируса ВЭЛ. Ордината - отно-. шение 3Н-РНК иэ необлученного и облученного вируса ВЭЛ абсцисса - дозы УФ-облучения, кв/нукл.

Щ.

С2 -

С 1 -

и» ъ*

й-"::» 'Щ

» 2 3

гис. 18. Электрофорез а ПЛГ белков УФ-облученного вируса ЬЭЛ. IА) 1'1С-меченний необ.чученплл (1-,3) и облученный 14 кв/нукл (2) и Г'О кв/нукл (4) вирус ВйЛ, сработанный РНКазой (0.2 мг/мл, 30 кт <7°С). Электрофорез в 12. К?, акриламиде .чри 10 тА, 1.8ч. , £0СС. СВ) ^К-уридином меченный,сблучеш.чн! 15 кп'иукл '2) и СО кв/нукл (3) нируи

ВЭЛ. МЭДУр (1)

14,

7,2 кв/нукл.. Данные предполагают образование ковалентных РНК-белковых сшивок под действием УФ-облучения, хотя с довольно низкой эффективностью.

Для количественной оценки участия ai гистых оснований в РНК-белковых сшивках препараты Зн-уридином меченого вируса, облученные разными дозами УФ-света (2-100 кв/нукл), обработали РНК-азой А в концентрациях 5, 20, 50, 100 мкг/мл. Контролем служили препараты РНК необлученного вируса. Кислотонерастворимая фракция РНК необлученного вируса после рибонуклеаьного гидролиза составляла 0.3%, тогда как после облучения вируса УФ-дозой 100 кв/лукл эта величина не превышала IX. Можно полагать, что не более IX азотистых оснований вирионной РНК БЭЛ ковалентно связываются с белком при максимальной дозе УФ-облучения.

Чтобы получить количественные данные о белке, включённом в УФ-индуцированное взаимодействие с РНК, использовали седиментаци-онный анализ ДСН-лизированного, очищенного вируса. Препараты вируса, меченные 14С-аминокислотами, были облучены УФ-светом и лизиро-ваны в буфере, содержащим IX ДСН и 0,5Х МЭ. Был обнаружен небольшой пик во фракциях градиента, соответствующей позициям вирионной РНК,тогда как белки необлученного вируса были на вершине градиента. Количество радиоактивности в этом пике увеличилось с УФ интенсивностью, достигая 6Х от всех меченных вирионных белков при наивысшей дозе облучения.(20 кв/нукл).

Для того, чтобы индентифицировать вирусный белок, ковалентно связанный с РНК в облучённом вирусе, проанализировали продукт реакции в ПАТ. Материал, собранный из пика, двигался чуть медленнее, чем белок С (рис.18). Очевидно, это зависит от наличия олигонукле-отидов, связанных с белком. Чтобы проверить эти данные, мы провели подобный опыт с Эн-уридином меченным вирусом. Вирус обличен УФ -дозами 15 и 30 кв/нукл., лизирован 1.0Z ДСН в 0,5% МЭ-содержащем буфере, обработан панкреатической РНК-азой и анализирован ь ПАТ. Гели флюорографированы для выявления 3Н-радиоактивности.В качестве

• - 31 -

¿"»маркеров использовали 14С-меченные вирусные белки. Образцы, содержащие 3Н-уридином меченный УФ-облучённый вирус, в геле дали одну полосу,двигающуюся чуть медленнее, чем полоса маркерного С-белка.

Показано, что по мере увеличения УФ-дозы возрастал процент пришитого к РНК белка, который достигал 10Х при дозе равной 50 кв /нукл (рис.19,а).Отмечено,что этот эффект частично нивелируется МЭ, начиная с дозы 35 кв/нукл (19,6). Механизм действия ИЗ состоит в "гашении" долго.*И:..,щих свободных радикалов, возникающих при УФ-об-лучении и вносящих свой вклад в образование ковалентных связей не-спецйфического характера. Из этого следует, что в исследуемом диапазоне УФ-доз в образовании специфических сшивок РНК с белком С может принимать участие 25 молекул белка С (3,37. тотального вирусного белка) на одну молекулу РНК.

Показано разными методами образование РНК-белковых сня. й у альфавкруса, как указание тесных контактов между полипептидом и азотистым основанием РНК. По-видимому, такие контакты являются характерной особенностью вирусов с однонитчатыми РНК-геномами

Идентификация полипептида, включённого в образование РНК-белковых сшивок, как белок С, белок нуклеокапсида, не является удивительным: скорее, это показывает специфичность действия УФ-облуче-ния. Менее ожидаемой находкой является довольно высокий процент вирионного белка, ассоциированного с РНК. Процентное содержание белка С в вирионе составляет около 20Z. Это значительно больше, чем у пикорнавирусов. Можно ожидать, что РНК альфавируса свернута внутри капсида по другому, чем в вирионах пикорнавирусов, обеспечивая интенсивные контакты азотистых оснований с белковой оболочкой.

3.3. Ковалентносвязанные агрегаты вируса ВЗЛ, индуцированные УФ-облучением.

Показано, что при !>'•!>• облучении вируса ВЭЛ происходит arpera-

«к

го 30 40 50 кв/нукл.

Рис.19. Зависимость образования РНК-белковых сшивок от УФ-дозы. Ордината - дозы УФ-облучения; абсцисса г количество (.%) РНК-белковых сшив* Образование ковалентных РНК-оелковых сшивок в препаратах вируса, не содержащих МЭ (а) и содержащих 10 мМ МЭ (б).

о »

*

Г 4.3 Л [' 1

■7 1» о Л

- »1 /

07 . ю 20 КвсЪоп питЬег

10 го <о ю ю го 10 20

:юмера тгжций

Рис.20. Седимэнтациоиный анализ УФ-обду- .

• •« 2* И «О

ченного вируса ВЭЛ. ^Н-вирус необлученный (а) и ю-^/л™-'

УФ-облученный дозами 40 (б), 60 (в) и 70 (г) кв/нукл, лизировали и ДСП и 0,57, МЭ И анализировали в сахарозных градиентах 10-407.. Рис.21, (а) кинетика образования урациловых димеров. (Ь) хроматог-рамиа продуктов гидролиза необлучекного (•--•) и облученного 3.7

г

кь/нусл —•) урцдином меченного ьируо'а ВЭЛ.

ния вириочов в прямой зависимости от величины УФ-дозы. При дозе 100 кв/нукл почти весь вирусный материал переходит в агрегированное состояние, чему способствует индуцированное нарушение регулярности структуры оболочки вирионов с последующим ее разрушением.

Седиментационный анализ фотопродуктов,образующийся при УФ-облучении цельных вирионов ВЗЛ, показал, что по мере увеличения дозы облучения происходит резкое перераспреде "^ние радиоактивновно меченного материала в ДСН-сахарозном градиенте. На рис.20 представлены результаты такого анализа. Определялся один пик радиоактивной метки кислотонерастворимого материала вируса, необлученного УФ-светом, у вершины градиента (фракции 19-21, рис.20а). Материал в этом пике представлен инт&ктной вирусной РНК и при более жестких условиях центрифугирования определялся в зоне, соответствующей коэффициенту седиментации 423. Седиментационныв профили РНК препаратов вируса, облучённых дозами УФ 40 и 60 кв/нукл, и необлученного вируса идентичны. При увеличении дозы УФ-света до 70 кв/нукл и выше вся радиоактивная метка кислотонерастворимого материала ирус-ной РНК обнаруживается на дне градиента (на "подушке" 602 сахарозы) во фракциях 3-5 (рис.20г). Столь резкое изменение седиментаци-онных свойств РНК УФ-облучённого вируса нельзя объяснить только пришивкой белка С к вирусной РНК, поскольку коэффициент седимента-'ции комплексов значительно превосходил коэффициент седиментации и нуклеокапсида, и вириона.

Сравнение данных седиментационного анализа препаратов вируса, меченного 3Н-уридином или 14С-гидролизатом хлореллы соответственно, облучённых УФ-светом и обработанных 17. ДСН и 0,57 ЧЭ, указывает на образование в результате УФ-света "тяжёлых" структур с коэффициентом седиментации, значительно превышающим таковой у отдельных вирионов. Они содержат вирионные РЖ и белки, по-видксому, ко-валентносвязанные, о чём свидетельствует неэффективность воздействия на них таких агентов, как ДСН и МЭ.

Таким образом, полученные данные указывают на участие бблбк-

белковых сшивок в образовании недиссоциирующих "тяжелых" структур при УФ-облучении вируса вал. Образующийся фотопродукт с коэффициентом седиментации выше, чем у отдельных вирионов, представляет собой прошитый УФ-индуцированными РНК-белковыми и белок-оелковыми ковалентными связями агрегат нескольких вирионов. Вероятный механизм образования белок-белковых сшивок в рекомбинации свободных радикалов, образующиеся при фотолизе - разрушении третичной структуры белка, при разрывах дисульфитных связей. При использовании 10 мЫ МЭ в облучаемых препаратах вируса ковалентно сшитые "тяжелые" комплексы не образуются.

Схематично можно представить процессы, происходящие при УФоб-лучении вируса ВЭЛ. Одним из первых событий является образование РНК-белковых сшивок. Дозы УФ-света до 30 кв/нукл пришивают все молекулы белка С, непосредственно контактирующих с азотистыми основаниями вирионной РНК. С увеличением УФ-дозы индуцируется образование ковалентных сшивок между гликопротеидами Е1-Е2 в гетеродиме-рах. Параллельно нарушается регулярность структуры внешней оболочки ь. ¿ионов и увеличивается количество вирусных агрегатов. Первоначально агрегаты стабилизируются нековалентным взаимодействием вирионов (УФ-дозы до 70 кв/нукл). Более массивные дозы приводят к образованию белок-белковых сшивок между молекулами белков соседних вирионов в агрегате. Заключительным событием, вероятно, являе- я образование сшивок молекул белка С, ковалентносвязанных с азотистыми основаниями вирионной РНК, и белковым остовом внешней оболочки вириона в местах контакта белков С и Е2.

*

3.4. Образование пиримидин свих докеров в РНК У»-облученного вируса ВЭЛ.

Достаточно близкое расположение пиримидиновых оснований в составе нуклеиновой кислоты при УФ-облучении способствует возникновению фотодимеров. У РНК в урацилах и отчасти в цитозинах, в

- с5 -

возбужденном состоянии, наиболее реакционно способной является двойная связь С5-С6 пиримидинового кольца, что обеспечивает фото-димеризацию циклобутанового и нециклобутанового типов. Пуриновые основания практически не участвуют в этой фотореакции (Кочетков, Будовский, 1970).

Чтобы определить количество УФ-индуцированных урациловых ди-меров использовали метод,описанный для вируса Менго МШег и Р1а-ge.nann (1974).''Н-уридином меченный вирус ВЭД был УФ-облучен, гид-ролизоваи в муравьиной !сислоте и хроматографирован. Результаты представлены на рис.21. Хроматограммы гидролизатов вирионной РЖ, необлученного и облученного вируса УФ-дозой 3,7 кв/нукл графически изображены на рис.216. Образование димеров (малый пик радиоактивности, следующий за основным пиком урацилов) протекает очень быстро уже при УФ-дозе 1х104 эрг/мм2 и выше. Содержание 3Н-метки в ди-мерах на плато их образования составляло 8,5%. Так как число урациловых нуклеотидов в РНК геноме вируса ВЭЛ равно 2521 (Kinney et al., 1989), то доза, вызывающая образование одного димера на вири-он, должна быть 400 эрг/мм4-. Максимальный процент урацила, способного перейти в димеры, равен 8,5%, что очень близко совпадает с величиной, определенной для вируса Менго (МШег & Plag'emann, 1974), но значительно меньше, чем теоретически возможная величина, так как число соседних урацилов в молекуле РНК вируса вал, потенциально способных к димеризации, равна 613 или 24,32 (компьютерный расчет проведен по программе Beckman Mlcrobine Micro Genie (IM) Sequence Analysis Program Version 4.0, Serial 4039 copyright (C) 1983 Scl. Soft. Inc.). Очевидно,не каждая пара урацилов мижет образовывать димер, даже под действием высоких доз УФ -облучения.

3.5. Природа легальных фотоповреждений вириоиой РНК вируса ВЭЛ, ответственных аа УФ-инактивации инфекционности вируса.

Кинетика инактивчнии зависит от того,sa счет фотоповреждений

■ - 36 -

какого типа она осуществляется. Инактивация инфекционности РНК-содержащих вирусов при УФ-сблучении полностью обусловлена повреждением вириоиной РНК. Вклад тех или иных повреждений в инактивирую-щее действие УФ-облучения может быть разным ' вирусов разных семейств. Сопоставление квантовых выходов образо! пия различных фотопродуктов с квантовым выходом инактивации инфекционности позволяет определить основные летальные фотоповреждения. Полученные экспериментальные данные и расчеты квантовых выходов (таблица 4) позволяют сделать оценку механизмов фотоинакти-.ации инфекционности вируса ВЭЛ.

Хотя сшивка белка с вирусной РНК детальна для вирусной инфекционности, она не является основной причиной для УФ-инактивации вируса ВЭЛ. УФ-доза, вызывающая одну сшивку на вирион, на нг коль-ко порядков выше, чем УФ-доза, вызывающая одно инактивирующее событие на вирион (371 доза выживания). Эффективность сшивания РНК с белком при переходе от низкоинтенсивного к высокоинтенсивному

Таблица 4. Квантовый выход инактивации инфекционности вируса ВЭЛ,образования пиримидиновых димеров и РНК-белковых сшивок при различных способах Уф-облучения.

Тип Квантовый выход

облучения Финактиваиии Фдимеров Фсшивок

низкоинтенсивный

Х-254 НМ,1-10 V/т2 2.5 х 10' -4 3,.1 х Ю"2 8.6 х 10~6

наносекундный

Х-266 нм.1-109 М/тг 2.9 х 10' -4 3.3 х Ю"2 1.1 х 10"4

пикосекундный

Х-266 нм,1-1012И/т2 4.8 х 10" -4 1.0' х 1(Г2 1.5 х 10~4

Точность определения ~ 15%.

УФ-облучению повышается.Поскольку квантовый выход образования сшивок линейно увеличивается с ростом интенсивности УФ-облучения можно полагать, что это фотоповреждение происходит по двухбайтовому (двухступенчатому) механизму. В пределах используемых УФ-доз не наблюдали разрывов поликуклеотидных цепей РНХ. Скорее всего основной причиной инактивации вируса ВЗД и основным летальным фотопов-реадением РНК в составе облученного вируса является образование фотодимеров. При переходе от низко- к высокоинтенсивному облучению квантовый выход димериэации снижался, что свидетельствует об од-ноквантовси механизме этой фотохимической реакции, который может об'яснить наблюдавшиеся э$фекты на физическом уровне.

Заключение о значительном участии образования урацилоЕых ди-меров и незначительном участии РНК-белковых сшивок в процессе инактивации инфекционности вируса ЕЭЛ сходно с таковым для пикор-нав:;русов (Miller & Plagemann, 1974: Smlrnov et al., 1983). Пови-димому, эта ситуация характерна для РНК-содержащих вирусов с ико-саэдрической симметрией капсида.

IV. ДБЙСТВ:2 УФ-03ДУЧ2НКЛ НА РОТАЕКРУС.

4.1. ДвЯстаж» У>с5^у"оч;'л porarüpyca SAH

Инактивация ¡«¡фекционности ротаЕируса SAH проходила по одно-ударному типу в диапазоне ¿оз, снижающих инфекционность на 1.01.5 lg. Далее обычно следовало короткое плато и затем инактивация продолжалась с прежним наклоном (рис.22). Такой характер кривой указывает на присутствие в препарате примеси компонента, инактиви-руеыого по двухударному типу (возможно, диплоидных иирионов или агрегатов, состоящих из двух индукционных вирусных частиц). Однако основную массу ин^кшгошшх частиц (более ЭД*) составляют единичные вирионы.инактивируемьи» по оцноударному типу. Динамика УФ-инак-

тивации инфекпионности ротавируса близка к динамике, зарегистрированной в исследованиях для реовируса (МсС1а1п М.Е. ,5репс11оуе К. Б., 1906). Это естественно, поскольку эти два рода относятся к одному семейству, их геном представлен сегментированной двухнитевой РНК и имеет близкие размеры и укладку, т.е. мишень УФ-инактивации должна быть у этих групп сходной. Измерения молекулярных эффектов, возникающих при УФ-облучении вирусов этого семейства, ранее не проводилось.

4.г. У#-индукция образования урацкхавых димеров РНК ротавируса.

Для определения количества урациловых фотодимеров очищенный вирус, мечечный по РНК "^Н-уридином, подвергали УФ-облучению, после чего, вирионную РНК экстрагировали, гидролизовали и анализировали методом восходящей хроматографии на бумаге. В необлученных препаратах при этом определялся один пик, соответствующий положению, занимаемому урацилом. В облученных препаратах (по мере увеличения дозы УФ-облучения) появлялся и нарастал второй пик, соответствующий по положению на хроматограмме урациловым димерам (фракции 5 к б, рис.236). Количество димеров вначале увеличивалось с увеличением дозы облучения, затем выходило на плато и оставалось постоянным (рис.23а).

4.3. У »-индуцированные РНК-белковые свивки в ротавирусе.

Для того, чтобы определить образование ковалентных РНК-белковых сшивок при УФ-облучении, из меченного ^-уридином очищенного вируса после облучения экстрагировали РНК фенол-детергентнь'! методом без обработки проназой (Raghow R., Kinpsbury D.W., 1979). В случае возникновения РНК-белковых сшивок. РНК должна перейти из водной фазы в фенольную. На рисунке 24 представлены данные по экс-

РНК ротаЕируса. (Л) абсцисса - •-'Н-урациловые димери в 7. от всей ^Н-метки. Ордината - время УФ-облучения в мин. (В; хроматографиче-окое распределение гидролигата 3Н-1'НК ротавируса, облученного УФ-дозой, равной 4,91*104эрг/мм2. Абсцисса - 3Н-метка в имп/мин* 10 ордината - номера фракций хроматограмми. Рис.24 Экстракция РНК из ^Н-уридинмеченного ротавируса, облученного Уф-сеетом. Лб'ль::са - X ':'|)-Р11К Б ЕОДНОЙ фазе, ордината - время УФ-облучение в мин. (10 мин 9>8£"104 эрг/мм2).

В • - данные двух экспериментов.

тракции РНК из препаратоь вируса, облученных разными дозами УФсве-та,и её распределения в двухфазной системе. Характер кривой уменьшения количества РНК в водной фазе (образование РНК-белковых кова-лентных сливок) резко отличается от кривой образования урадиловых фотодимеров. При дозе УФ-света, равной 5.89х105 эрг/мм2, только 55Х вирусной РНК ковалентно связаны с белком, в то время как максимальное количество фотодимеров образуется уже при дозе равной 4.01х1О4 зрг/мм2.

4.4. О ызханкзыа УФ-ииактивацка ротаагруга SA11.

Сопоставленние зависимости образования урациловых димеров и РНК-белковых сшивок от УФ-облучения позволяют сделать некоторые заключения о вероятно« механизме инактивации ротавируса при обычном ( низкоинтенсивном ) УФ облучении. Доза, соответствующая одному инактивирующску события на геном (37% выживания), была рав'"ч 700 эрг/мм2 (рис.22). Доза, выгавающая диаеризация 2Х эН-урвдина, равна 9.82х103 эрг/мм2 (рис.23). Обе эти Б^"ичиаы совпа зют с аналогичными величинами у пикорнавкрусов (Miller R.L..Plagemann Р. G.W., 1974). При этом у пккорнавируса (вирус Ыенго) количество димеров на одно инактивирующее событие было равно 1,7, Таким об, i-зом, основываясь ка расчетах МШег и PI age mann можно полагать, что образование фотодимеров является важной (всзкогшо, основной) причиной инактивации ротавируса при УФ-облучении. Напротив, РНКСедковые свивки возникают только при очень больших дозах облучения. Расчет количества сшивок на одно инактивирующее событие дает величину порядка 0,001. Иными словами, к моменту образования первой РНК-белковой сшивки вирусный гексм уде инактквирован в результате образования урациловых димеров.

Рачее кгам была продемонстрирована существенная роль ковален-тных РНК-белковых ссивок при УФ-инактивации вируса гриппа и выска-

аано предположение о различном вкладе тех или иных молекулярных событиях в инактивирущий эффект УФ^-облучения у разных вирусов. Представленные в этом разделе данные позволяют полагать, что у ро-тавирусов, в отличие от ортомиксовирусов, РНК-белковые сшивки не играют существенной роли в инактивации. Формирование фотодимеров, очевидно, являются важным инактивирующим фактором, как и для пи-корнавирусов и для альфавирусов. Следует иметь в виду, что факторы ограничивающие образование РНК-белковых сшивок у этих вирусов могут быть различными. У пикорнавирусов, имеющих однонитевую РНК, ограничение должно либо иметь чисто топологический характер, т.е. обуславливается малым числом мест контакта клубка РНК с белковым капсидом, либо, что вероятнее, определяться характером взаимодействия белковых субъединиц с РНК - преимущественно контактом с саха-ро-фосфатным остовом, а не с азотистыми основаниями. У ротавирусов ограничение может Сыть результатом спаривания азотистых оснований в дуплексе, препятствующим их участию в РНК-белковых взаимодействиях. Хотя полученные результаты позволяют считать вероятным активное участие фотодимериаации нуклеотидов у УФ-инактивации ротавируса, они не исключают существенного вклада других эффектов, например, разрывы нитей РНК.

ВЫВОДЫ

1. Впервые дано экспериментальное обоснование представлению об участии азотистых оснований в РНК-белковом взаимодействии в РНП вируса гриппа А. Показано, что свыше 80Х азотистых оснований в РНК вируса гриппа либо не контактируют с ИР белками, или ориентированы в таком направлении, что образование сшивки, как результат фотохимической реакции, невозможно. Показано, что достаточное количество № белка - не менее, чем ¡та - может быть связана с вйрионной РНК УЗ1-облучением.

2. Показана защитная роль белка РШ1 в процессе гидролиза РНК

вируса гриппа панкреатической РНН-азой и нуклеазой 51.которая возрастает после УФ-облучения. РНК в составе РНП не экранирует белки от действия проназы.

3. На основании различия в кинетике УФ-инактивации сферических и филаментозных вирионов выдвинуто предположение о том, что филаментозиые вирионы являются мультигеномными.

4. Показано, что УФ-инактивация инфекционности вирусов гриппа А связана с образованием РНК-белковых ковалентных свявей и соответствует количеству РНК-белковых сшивок на геном.

5. УФ-облучение не влияет на гемагглютинирующую активность вируса гриппа. Нейраыинвдаза при этом частично деградирует. Показана корелляция между УФ-инактивацией инфекционности вируса гриппа А и снижением синтеза вирусной РНК, что связано с изменением условий РНК-полимеразной функции и с фотоповреадениями.

6. Показана большая стабильность вируса энцефаломиокардита к действию УФ-облучения и прогреванию, чем у других пикорнавирусов.

7. Впервые показано при УФ-облучении образование РНК-белков1. ковалентных связей для кардиовирусов, в котором принимают ограниченная часть молекулы вирионной РНК и не более двух капсидных субъединицы (2£ всех вирусных белков).

8. ВперЕыэ показано, что УФ-облучение вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей приводит к образованию урациловых фотодп-меров и ковалентному связыванию нуклеокапсидного белка С с вирионной РНК. УФ-инактивация инфекционности ВЭД связана с образованием пиримидиновых димеров. Показано, что не менее 1* генома связано с С белком (в количественном отношении, не более.25 молекул белка на молекулу РНК), что указывает на интенсивный контакт РНК с белком внутри вирусного нукяеокапсида.

9. Впервые показано, что при УФ-облучении вируса ВЭД происходит агрегация вирионов, что прямо зависит от дозы УФ-света. Образующийся фотопродукт представляет собой прошитый УФ-индуцированными РНК-белковыми и белок-белковыми ковалентными связями агрегат

нескольких вирионов.

10. Впервые изучено действие УФ-облучения различной интенсивности (нано- и пикосекундным УФ-лазером) на инфекционноеть вируса ВЭЛ. Показан экспоненциальный характер зависимости инфекционной активности вируса от дозы УФ-облучения и интенсивности светового потока. Основной летальный фотопродукт образуется по однокгоптовому механизму. Определены квантовые выходы инактивации инфекциои-ности, образования урациловых димеров и РНК-белковых сшивок.

И. Впервые изучено действие УФ-облучения на инфекционность ротавируса SA11. Инактивация вируса происходила в основном с одно-ударной кинетикой. Показано,что образование урациловых фотодимеров является основным механизмом инактивации ротавируса. РНК-белковые сшивки зарегистрированы только при высоких дозах облучения и не играют существенной роли в инактивации.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Смирнов Ю.А., Колодкина В.Л., Каверин Н.В. Изучение действия гидролитических ферментов на рибонуклеопротеид вируса гриппа А. - Вопр. вирусол., 1981, N4, с.477-480.

2. Колодкина В.Л., Смирнов Ю.А., Каверин Н.В. РНК-белковые взаимодействия в РНП вируса гриппа А, выявляемые при УФ-облучении - Вопр. вирусол., 1981, N6, с.688-691.

3. Колодкина В.Л., Смирнов Ю.А., Каверин Н.В. Изучение РНКбелкового взаимодействия в РНП вируса гриппа с применением УФ-облучения. - в сб.: "Нуклеозиды, производные бицикло1 птана и адамантана, другие антивирусные вещества", Минск, 1981, с.145-146.

4. Смирнов Ю.А., Родригес Ы.П..Колодкина В.Л. и др. РНК-белковые контакты, выявляемые методом УФ-сшивки в РНП вируса гриппа и в вирусе энцефаломиокардита.-в сб.:"Молекулярная биология вирусов гриппа и гепатита", М., 1982, с.22-27.

5. Смирнов Ю.А..Родригес М.П., Каверин Н.В. Изучение структу-

рной организации вируса энцефалсмиокардита.Материалы 1 конференции вирусологов Казахстана, 1982, с.19.

6. Смирнов Ю.А., Колодкина В.Л., Каверин Н.В. Изучение действия проназы на рибонуклеопротеид вируса гриппа А. - в сб. ^'Проблемы и перспективы изучения нуклеовидов, биоциклогептана, адаман-тана и других противовирусных соединений в эксперименте в клинике", Минск, 1982, с.98-101".

7. Smlrnov Yu.A., Rodrlguez-Molto М.Р., Teijelo Famada M. Proteln-RNA Interaction In Encephalomyocard111s Virus as Revealed by UV Light-Induced Covalent Linkages. - J.of Virology.,1983, N3, p.1048-1055.

8. Смирнов Ю.А., Колодкина В.Л., Каверин Н.В. Об участии азотистых оснований в РНК-белковом взаимодействии в РНП вируса гриппа А. - Мол. генетика, микробиол. и вирусол., 1984, N8, с.34-37.

9. Смирнов Ю.А., Варич Н.Л., Руднева И.А. и др. Действие УФ--облучения на РНК-содержащие вирусы разных семейств. - в сб.¡"Актуальные вопросы общей и частной вирусологии", М., 1986.,с.22-25.

.0. Капитулец С.П., Смирнов Ю.А., Каверин Н.В. РНК-белковые контакты в вирусе венесуэльского энцефаломиелита лошадей выявляемые при УФ-облучении. - Мол. генетика, микробиол. и вирусол., 1988, N5, с.34-36.

11. Смирнов Ю. А., Капитудец С.П., Цилинский Я.Я. и др. Ина тивация альфавируса VEE при высокоинтенсивном лазерном УФ-облуче-нии. - Биофизика, 1989, с.570-572.

12. Смирнов Ю.А., Капитулец С.П. Использование Уф-облучения для выявления РНК-белковых контактов в рирусе ВЗЛ. - в сб.:"Арбо-вирусы и арбовирусные инфекции", М., 1989, с.47-48.

13. Кузнецова М.А., Смирнов Ю.А., Махов A.M. и др. Сравнительная характеристика сферических и филаментозных вирионов вируса гриппа А. - Вопр. вирусол., 1990, N1, с.20-23.

14. Смирнов Ю.А., Капитулец С.П.. Махов A.M. Ковалентно-свя-занные агрегаты вируса ВЗЛ, индуцированные УФ-облучением. - Мол.

- '5 -

генетика, микробиол. и вирусол., 1990, N6, с.21-24.

15. Смирнов Ю.А., Говоркова Е.А., Правдива Н.Ф. и др. Действие УФ-облучения на репродукцию вируса гриппа А и активность ви-рионной РНК-полимеразы. - Вопр. вирусол., 1991, N2, с.152-154.

16. Smlrnov Yu. А., Kapltulez S.P., Amitina N.N. et al. Effect of UV-radiation on rotavirus. - Acta vlrol., 1991, N35, p.1-6.

17. Smirnov Yu.A., Kuznetsova M.A., Kaverin N.V. The genetic aspects of Influenza virus filamentous particle formation.- Arch. Vlrol., 1991, V.118, p.279-284.

18. Гиневская В.А., Капитулец С.П..Амитина H.H..Смирнов Ю.А. Инактивация ротавируса SA11 ультрафиолетовым облучением. - в сб.: "Энтеровирусы. Общетеоретические и медицинские аспекты",Киев,1991 с.30.

19. Nlkogosyan D.N., Kapltulez S.P..Snlrnov Yu.A. Effects of Ultraviolet Laser Radiation on Venezuelan equine encephalomyelitis virus. - Photochem. Photoblol., 1991, N5, V.54, p.847-849.

20. Smlrnov Yu.A., Kapltulez S.P., Kaverin N.V. Effects of UV-Irradiation upon Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Virus Research,. 1992, V.22, p. 151-158.