Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гемагглютинирующая активность вирусов Коксаки группы В и их селекционированных вариантов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Гемагглютинирующая активность вирусов Коксаки группы В и их селекционированных вариантов"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРИШ НАРОДОВ акадащ НАУК УССР

" ОРДЕНА ТРУД0В0,Ш 1СРЛСЮГО знамени ШСШГГ ШРОБЙОЛОГИИ.И ВИРУСОЛОГИИ* ;км.Д.К.Заболотного

На правах рукописи ЕГОРОВ МЕКСЕЙ Ш1ЕР0ВИЧ

гемггаетшшщш -Атшрсть вирусов щюаки группы в .

И ЮССШЕЩОНЙРокнЙК ШРИШЩ 03.00.06-- вирусология

: Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кавдедата. биологических наук ■

Наев - 1990

Работа выполнена в Киевском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте им. акад. А.А.Богомольца.

Научный руководитель; дектор мед.наук, профессор

^ Широбо'ков В.П. Официальные оппоненты: доктор биол.наук' Дяченко Н.С. . доктор мед.наук Корчак Г.И.

Ведущее учреждение: Свердловский научно-исследовательский институт вирусных инфекций

Защита диссертации состоится "_" .1990 г.

в ■ ■ часов на заседании специализированного Совета

Д 016.06.01 по защите диссертаций га соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного ,АН УССР по адресу: 252627( Киев-143, ул. За болотного, 164, ИМВ АН УССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЙМВ АН УССР.

Автореферат разослан "_" 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета., кандидат биологических наук

Э.А.КШЛЛЫ1К0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. -Среди разнообразных; групп вирусов осббое место принадлежит энтеровирусам. Максимальная простота организации, устойчивость во внешней среде,, доступность для изучения in vivo и in,vitro делает энтеровируеы удобной моделью для современней экспериментальной вирусологии. Кроме того известно, что энтеровирусам принадлежит большая роль.в инфекционной патологии человека.

Особое внимание исследователей, привлекают вирусы Коксаки группа В. Доказана их выраженная нейротропность (E.T.Eali et al., 1988), карвдотропность с участием в патогенезе резка-тизйз и эндокардита /0.И.Нов ужоз, 1984/, дилятационной кар-диомйопатйи, миокардита, острого некроза миокарда (С. Cambridge® et al., 1979; R.L.Crowell, 1937s J.B.Grun e't al., 1988). Велика роль Коксахш В-инфзкции в возникновении инсулин-зави--симого сахарного диабета (H.K.Chatterjee et al., 1988), доказана их паняреатотропность /В.П.Широбоков с соавт., 1988/, а такке связь вирусов Коксаки В с развитием перинатальной инфекции новорожденных (J.E.Hodlin, 1983) - все это определяет', важность и необходимость дальнейшего изучения биологических свойств вирусов Коксаки В. '

Одним из таких свойств является гемагглютинирушая активность вирусов Коксаки "В, открытая J.Goldfield et al. в J.957 году. Несмотря на более чем тридцатилетние исследования, феномен гемагглятинации энтеровируоов остается малоизученным.

Гемагглютинирущие свойства у энтеровируеоз проявляются не всегда, зависят от вида используемых клеточных культур и, возможно, каких-то других, еще не иявесттта причин.

В основном работы ло этоку вопросу были посвящены ЕСНО-ви-руоам, а изучение гешггдотинируицих свойогз вирусов Коксаки В носит огоцзодичэский характер.

До сих пор остается неизвестной природа гемагглютицкпа, чувствительные к &цтеровирусаы рецепторы на поверхности ориг-роцитов, не Изучена гетерогенность вирусной популяции по геи-агтдаширующим свойствам, корреляция гега1таотинирувг;ей активности с генетическими магжерами вирусной популяции.

Одним из таких маркеров является различный аффинитет эпте-ровирусов к природному сорбенту бентониту, по которому популяции. энтеровирусов можно разделить на две группы: вирусц, обладающие .высоким /Абет*/ и низким /Абенг"/ сродством к бентониту, Аффинитет к бенто-ниту коррелирует с различными биологическими свойствами вирусов Коксаки В, -такими как вирулентность, органотропность, икмуногенность и другими /В.П.Широбо-ков, 1977; 2981; 1984; 1986/.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенных фак-то в, целью диссертационной работы явилось изучение гег/дггла-ткнируюцих свойств культуральных штаммов вирусов Коксагси В, их отдельных селекционированных генетических вариантов и определение воаможной природы гемагглютинирующего фактора.

Главными задачами диссертационной работы явились: :'

1. Исследование гетерогенности вирусов Коксаки В по геыаг-глютинирующей активности и связь ее с бентонитовым генетическим маркером,

2. Изучение степени адсорбции вирусов Коксаки В на поверхности эритроцитов и тромбоцитов человека и животных.

3. Экспериментальное обоснование условий накопления гемаг-глютининов ¿ирусов Коксаки В в процессе репродукции и их выявление в иикрометоде реакции гемагглютинации /РГА/,

- 3 - -

4, Изучение физико-химических свойств гемагглятининоа вирусов Коксаки Б. ■

Наушая Новизна« В диссертационной работе впервые показана гетерогенность вирусов Коксаки В, пассируемшс в пёрэвнвае)жй культуре клеток Vero, по гемагглютинируюцей активности. Доказано, что гемагглототгарукщие свойства присущи только генетическому бентонитовому варианту Абент".

Установлено, что как гемагглготиотрующие, так и негемагглл-тшйруюз^ле штамма вирусов обладают способностью адсорбироваться та эритроцитах человека и животных. Аффинитет к эритроцитам ггнагглютинируюцих Ёяашо.в вирусов Коксаки В, пассируема в героичной вдльтурэ клеток фкбробластов эмбриона человека, более чем в 100 раз.цревышает таковой у вирусов, полученных в перевиваемой клеточной культуре Vero и не обладающих гекаг-глптгеирукщей активность?). Показана возможность вирусов Кок— сакн В адсорбироваться на поверхности тромбоцитов.

,На основании методов ультрацёнтрифугирОвания и электронной микроскопии установлены различия 'физических свойств гемагглэ-тянирукцих и негбмагрлэтинируЕХцях вирусных частиц /величина шртонов, плавучая плотность вирусных частиц/. i..

При использовании комплекса молекулярно-биолог^ческих. методов исследования обосновано заключение о связи гемагглюти-нлнов вирусов Коксаки В с капсиднкми белками вирионов.

Определены условия для изучения вирусов Коксаки В методом имаукосорбентной электронной микроскопии.

Птактнчзекая значимость'. На основании полученных данных обоснованы оптимальные условия получения гемагглютининсв вирусов Коксаки В и их титрации в РГА, поставленной микрометодом. Экспериментально показана возможность выявления гемаг-глютинирукяцей активности вирусов Коксаки В при кулътивирова-

нии в диплоидной культуре фибробластов эмбриона человека Ы-19.

Изучены И адаптированы применительно для Коксаки В вирусов методы иммунной электронной микроскопии. Эти данные могут быть использованы в практической вирусологии для диагностики Коксаки Й инфекций. Материалы диссертационной работы используются в курсе.лекций по вирусологии в Киевском мединституте.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы доложены т конференции ыолоднх ученых Киевского медицинского института /1988 г./. Диссертационная работа апробирована на заседании кафедры микробиологии Киевского медицинского института/1989 г./. .

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печат-них работ. ~

Объем и структура работы. Диссертация изложена на, 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунками и 29 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы . /I глава/, описания материалов и методов, экспериментальной части /3 главы/, обсуждения, выводов и списка, литературы, содержащего 249 источников, в том числе 85 отечественных и ,164 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. Вирусы. В работе использованы прототипные штаммы вирусов Коксаки B-I /штамм Солпео-tiout-5 /, Коксаки В-2 /штамм Ohio-г /, Коксаки В-3 /шташ -Nancy/, полученные из Научно-исследовательского института вирусных инфекций /г. Свердловск/ и Научно-исследовательского 'института полиомиелита и вирусных энцефалитов /г.Москьа/; штаммы лируоо;» Коксаки B-I - В-6, выделенные в нашей лаборатории из сточных вод г.Киева в 1980-1985 годах. ■'.

Бентонитовые генетические варианты Абент+ и Абент" вирусов Коксаки В селекционировали из вируссодертащего материала в соответствии со схемой получения бентонитовых вариантов энтеро-вирусов /В.П.Широбоков, 1568,1978/. Бентонитовый маркер вирусов определяли по их способности адсорбироваться на бентоните при слабощелочных значениях рН.

Культуры клеток.В опытах использовались различные культуры:

Vero - перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки;

НЕр-2 - перевиваемая культура клеток карциномы гортани человека;

H-I9 - диплоидная клеточная культура фибробластов эмбриона 1зэдоЕ9ка; .

фибробластн эмбриона человека /ФЭЧ/ - первичная клеточная культура, которуи получали по общепринятой методике Ai.П.Глинских, 1977/.

г» *

В зависимости, от метода титрации или цели эксперимента культивирование клеток производилось в пробирках, флаконах из-под пзнициллика или в 95-луночных полйстироловых: плакаетах с плоским дном /фирмы Micro'te«, ХАпЪго или отечзстве1шого. производства/ в'атмос<|,ере, содеркащей 5 % COg или с добавлением в среду ШЕЙ 25 Ш HEPES буфера /Serva, ФРГ/.

Титрзцию вирусов, пассируемых на порзвиааемья клеточных культурах, осуществляли методом бляяек под бентонитовым питательным покрытием /В.П.Широбоков, 1973/. Вирусы, пассируемые на первичной культуре меток 394, титровали методом конечных разведений по Риду и Менчу в пробирочных культурах /М,К.Ворошилова, 1964/ или микрометодом с применением 95-луночных поли-стйроловых планяэт с плоским дном.

Гемагглптинирукций титр вируса выражали в гемагглютинирую-

щих единицах /ГАЕ/, который определяли в реакции гемагглютина-ции /РГА/, поставленной шшрометодом при помощи микротитратора "Таккачи".

Для сравнительного определения способности вирусов адсорбироваться на эритроцитах к вирусеодержащей жидкости добавляли эритроциты четырех групп крови человека, а также барана и кролика до конечной концентрации 5 %, Смесь инкубировали при 37 °С. Через определенные промежутки времени пробы центрифугировали при 1500 об"1 в течение 5 минут и в надосадочной жидкости определяли инфекционную активность, по изменению которой судили о степени адсорбции вирусов щ эритроцитах с расчетом константы скорости адсорбции вирусов /Р.йокерт, 1989/. По аналогичной методике определяли,адсорбцию вирусов на тромбоцитах человека.

Определение выхода гекагглютининов вирусов а процессе репродукции в клетках изучали используя пробирочные культуры фибробластов эмбриона человека /ФЭЧ/. В каждую пробирку вносили 250 ООО ,клеток в I мл. Через определенные промежутки времени после на »ала репродукции исследовали гемагглютишрую~ щую и инфекционную активность внутри- и внеклеточного вируса.

Для изучения-влияния температуры репродукции т ГА-акгив-ность было проведено 5 последовательных пассажей ГА-штаммов" вирусов при'температуре 20 , 28 , 33 , 37 и 40 °С. После каждого пассажа определяли гелштлютинирущий и инфекционный титр.

Для определения действия ферментов на гемагглютинирущув * активность и.бентонитовый профиль.вирусов использовался ряд ферментов с иротеолитической, глюкозидазной и липолитической активностью. Действие указанных ферментов определяли путем добавления к. ъируссодержздему материалу до концентрации 1 мг/ил. рН ,с«еси доводили до указанного вше оптимального

значения, tí чувствительности вирусов к действию ферментов судили по изменению титра гемагглвтининов и инфекционной активности после часовой экспозиции при температуре 37 °С.

Изучение чувствительности к перйодату калия проводили путем добавления к виру с сод еря ас, ему материалу равного количества 0,04 М раствора перйода¥а калия, рН смеси доводили до значений 4,0; 5,0; 6,0; 7,0. Перйодатное окисление осуществляли при 4 °С в течение 4. и 18 часов. О чувствительности вирусных гемагглвтининов к перйодатному реагенту судили по изменен:® ГА-активности вирусов.

Определение действия эфира на ГА-активкость вирусов проводили по следующей схеме: к 2 мл вируса добавляли I мл эфира и смесь интенсивно встряхивали в течение 20 минут, затем смесь оставляли при 4 °С в течение 12 тасов. Проводили сравнительное титрование гемагглитинируищей и инфекционной активности, исходного и обработанного вируса.

О влиянии УФ-облучэния на вирус судили по изменению инфекционной и гемагглатйнирупцей активности вирусов после 30-минутного ультрафиолетового облучения.

Электронно-микроскопические исследования проводили на.- электронном микроскопе "ЭМВ-ТООЛМ" /Сумское ПО "Электрон"/. Сра-

t

вго1Тельно исследовали вирусы Коксаки В-3 и их бентонитовые варианты /Абент+ и Абент""/, пассируемые на первичной клеточной культуре ФЭЧ и перевиваемой культуре клеток Vero с проведением морфомётрии вирусных частиц.

В работе использовались 2 группы методов:

I/ прямая электронная микроскопия /ЭМ/ вируссодержащих образцов.

2/ Методы иммунсэлектронной микроскопии с использованием прямой иммуноэлектронной и иммуносорбентной электронной м;;к-

- В -

роскоши.

Определение плавучей плотности вирусов Коксаки В~3 и ю: бентонитовых вариантов проводили в градиенте плотности сахарозы /15-50 %/ на ультрацентрифуге "Вескшая L-8" /-40000 об/мин, 22 ч, 4 °С, ротор sw-SS.T /. После центрифугирования градиент фракционировали по 0,2 мл, начиная с мениска, и в аликвотах определяли инфекционную и гемагглатинирущуэ активность. Определение плотности во фракциях сахарозного градиента проводили путем измерения коэффициента преломления на рефрактометре РШ-З, пользуясь для расчетов следующей зависимостью: jl = 2,7329 х - 2,6425. В этой формуле коэффициент преломления "gQ измеряют при 20 °С, а плотность раствора сахарозы рассчитывают для температуры О °С /Л.А.Остерман, 1981/

Полученный цифровой материал статистически обработан ш созданной программе для расчета стандартной- ошибки по фор.:улс Пицци на микрокалькуляторе "Электроника Б-3-64" и методов вариационной статистики.

Изучение оптимальных условий выявления гелшгглютининов вирусов Коксаки В ' ■ :' .

и их получения в культуре клеток ФЭЧ

- i

Установлено, что для выявления гемагглютининов вирусов' Коксаки В в микрометоде РГА наиболее ога;имальными условиями являются: рН фосфатно-буфершго раствора 7,2-7,5/ применение эритроцитов 0/1/ или В/Ы/ группы 1фови человека в 0,7o 2 кем центрации г. постановкой реакции при комнатной температура.

Изучая геыагглютинируищ'ю активность вирусов Коксаки В-3 при разных температурах культивирования, было показано, чгго максимальнее, титры вирусных гемагглютининов определяются npi-субоптимальмой температуре 33 °С. Понижение температуры раз-

множения вирусов, видимо, является селективным фактором, способствующим отбору мутантов с высокой гемагглютинирующей активностью. Исследование выхода гемагглютининов вирусов в процессе репродукции показали, что максимальной гемагглютиниру-ющей активностью обладает внутриклеточный пул вирусов через 8 часов после начала репродукции /табл.1/.

Таблица I. Гемагглвтинируюцая и инфекционная активность вируса Коксаки В-3 на этапах репродукции в клетках СЭЧ

Внеклеточный вирус

Внутриклеточный вирус

Т/час/ ГА, ГАЕ/1,0 мл ИА, в ТЦ%0/1,0 мл ГА, ГАЕ/1,0 мл ИА, о ТВД^Л.О мл

5 0 3,5010,44 0 4,00±0,46

8 0 4,63±0,32 1280 •-5;702»,43

ю 160 6,00±0,46 320 6,20Ю,44

12 160 6,20£0,31 , 240 7,20^0,48

16 ' 160 5,00±0,43 "80 6,0010,42

20 640 7,2020,33 160 6,70±0,34

24 640 8,00±0,44 640 7,63±0~,36

Таким образом, обоснованы оптимальные условия накопления вирусных гемагглютининов при репродукции вирусов Коксаки группы В в первичной клеточной культуре 504: температура культивирования - 33 °С, время репродукции 8-10 часов.

Изучение гемагглютинирующей активности и адсорбции на эритроцитах вирусов Коксаки В и их бентонитовых генетических вариантов

На основании-полученных результатов удалось показать, что популяция вирусов Коксаки 3-3, выращенная з переливаемой куль-

- 10 - „ туре клеток Vero, является гетерогенной по признаку ГА-активности /табл.2/. .

Таблица 2. Гемагглютинирующая активность вирусов Коксаки В-3 и их бентонитовых вариантов

Вирусы

Титр вирусов * ТитрТА вирусов,.в ГАЕ/мл

в БОЕ/мл эритроциты человека ,

0/1/ А/11/ В/111/ АВ/1У/:

Коксаки В-3 /5,2i0,40/xl0c О О О О Вариант ,

Абент+ /5,8i0,38/xI06 \ О О О О Вариант

Абент" /б,9±0,44/хЮ6 640 40 2560 60

Установлено, что геыагглютинирующие свойства присущи только генетическому бентонитовому варианту Абент", который обычно присутствует в популяции вирусов Коксаки В в минимальных количествах, составляющих 0,02-0,6 % от общего числа 'Инф'ок- . ционных вирусных частиц, /В.П.Широбоков, 1978/. Подавляющее большинство вирионов, представленных вариантом Абект+, не обладают ГА-зктивностыо,

Отметим, что нам впервые удалось установить факт .наличия у вирусов Коксаки В, выраценных на перевиваемой культура кле-тск, гемагглютинирующих свойств. Все авторы, которые шгалйсь доказать ГА-активность вирусов ECHO и Коксаки В, выращенных в перевиваемых клеточных культурах, пришли к отрицательным результатам /ь.Д.Подоплбкин, 1969; С.З.ЗакироЕа, Л.Е.Толстоко-poua, 1995; О.Е.Турчанинова, 1977/. Это, видимосвязано с те»;, что небольшое количество ГА-частиц в исходной популяции ы'.руеов Коксаки В не улавливается в РГА при'обычной по слано в ие. ■

Таким образом, в результате исследований удалось получить приоритетные данные о корреляции между ГА-активностью и бентонитовым маркером вирусов Коксаки В-3, выращенных в перевиваемой культуре клеток. Для того, чтобы распространить это заключение на все типы вирусов Коксаки В, требуется дальнейшее изучение этого вопроса.'

Важно отметить» что ГА—активносте, селекционированного варианта Дбент" вируса Коксаки В-3, выращенного в культуре клеток Vero, была весьма выраженной: титры ГА имеют значения 640-1280 ГАЕ/мл, что не меньше в количественном отношении, чем у ГА штаммов того же вируса, пассируемого в первичной культуре £34. Установлены определенные, различия в ГА-активности вирусов Коксаки В-3, выращенных в первичной и перевиваемой культуре клеток: гетгглптинирукщие штаммы вирусов, пассируемые з культуре ЮЧ, обладает способностью агглютинировать эритроциты человека, чгго совпадает с литературными данными /Л.Розен, 1972; Л.Е.Толйокоррва с соавт., 1975/, С другой стороны, ге агглютинирующий вариант Абент" вируса Коксаки В-3 из перевиваемой культуры клеток Varo, способен аг-платинировать не только эритроциты человека, но и эритроциты " кролика, продём чувствительность РТА с кроличьими эритроцитами и эритроцитами человека 0/3/ и В/Ш/ группы крови человека была сопоставима. По-видимому, вирусы Коксаки В-3 /вариант Абент"/ из перевиваемой культуры клеток Vero имеют догални-тельные рецепторные структуры, обуславливающие их аффинитет и способность склеивать эритроциты кролика. Этот факт косвен- ■ ним образом доказывает гетерогенность структурных белков вирусов Коксаки В как в пределах одной вирусной популяции, так и при пассировании в различных клеточных культурах.

Изучение гемагглмтшглругацчх свойств вирусов Коксаки В при

- 12..-.

переводе с культивирования из первичной культуры клеток в перевиваемую и наоборот, показало, что вирусы обратимо теряют ГА-активность при выращивании их в перевиваемых культурах с восстановлением свойств при переходе к пассированию в первичных клеточных культурах.

Установлено, что ГА-активность вирусов Коксаки В-3 полностью сохраняется при адаптации и выршциванииих в диплоадной культуре клеток фибробластов эмбриона человека M-I9. Представляется, что это может иметь важное практическое значение, поскольку получение первично-трипсинизированных клеточных культур является трудоемким и длительным процессом. Способность диплоидных клеток выдерживать 30-50 пассажей может значительно облегчить получение гемагглвтинирующих штаммов вирусов Коксаки В и их* применение с целью серологической диагностики Коксаки В-вирусных инфекций в PITA. . • :

Из литературы известно, что ГА-активностыо обладают вирусы, способные адсорбироваться на' поверхности эритроцитов. Считалось, что адсорбция на эритроцитах вирусов ECHO присуща только гемагглютинирующим вирусным частицам и ее степень и динамика определяют уровень гемагглютинирукяцей активности /В.Д.Подоплекин, .1969,1971/. »Чаши опыты, проведенные в данном направлении, выявили несколько иную .позицию. Оказалось, дао ' на эритроцитах адсорбируются не только гемагглютинирующие, но и негемагглютинирующие штаммы вирусов, выращенные в перевиваемой культуре клеток Vero. Вместе с тем, адсорбция гемагглю-Этапирующих вирусов Коксаки В, пассируемых в первичной культуре 434, была более, чем в 100 раз выше. Исследования кинетики данного процесса с определением константы скорости адсорбции вирусов на эритроцитах выявили значительную разницу в этих показателях /табл.3/. Этот факт,с одной стороны, доказывает, что

Таблица 3. Константа скорости адсорбции вирусов Коксаки В-3 и их бентонитовых ^генетических вариантов на эритроцитах 0/1/ группы крови человека

Исходная концентрация Концентрация вирусов, Время ад- Константа скорости

Вирусы вирусов, С /БОЕ/мл; ct после адсорбции сорбции, адсорбции вирусов,

le ЩД^/мл/ . t мик К мин"

"эксаки В-3 • /I,5Í0,2I/xI06 у: ./5,0±0,14/хЮ4 30 I.8.I0-10

Вариант Абент+ /2¿0±0,I8/xI06 . /7,0±0,19/хЮ5 30 6,1.ЮЛ1

Вариант Абент" /1,5±0,24/хЮ6 /1,0Ю,2а/хЮ4 15 0,53.10~9

(Vero) |

Коксаки В-3 7,5±0,44 3,0±0,44 " 5 О.ЗЗЛО-8 G

Вариант Абент+ 7,7±0,36 3,33±0,34 5 О.Зг.Ю"8 '

Вариант Абент" 7,5±0,46 3,5±0,42 5 О.ЗЗ.Ю*8

/534/

аффинитет вирусов к эритроцитам коррелирует с гемагглатиниру-ве;ими свойствами. Возможно, при интенсивной адсорбции вирусов на эритроците происходит снижение его мембранного потенциала, и силы притяжения между эритроцитами начинают превышать силы отталкивания, что приводит к их агглютинации.'С другой стороны, негемагглютинирукцие вирусы КоксаКи В-3 все же достаточно интенсивно адсорбируются на эритроцитах /90 % инфекционных вирусных частиц/, хотя при этом не обладают гемагглютинирую-щими свойствами. Видимо, это связано с различиями'в поверхностных структурах у вирусов с гемагглютинируидивд и негемаг-глвтинирующими свойствами. Возможно, у негемагглютинирутацих вирионов пространственная конфигурация структурных белков вирусного капсида не позволяет создать высоки!! электро-отрйца-тельный заряд поверхности вириона. Это приводит к незначительному снижению дзета-потенциала мембран эритроцитов при адсорбции вирусов и отсутствия последующей гемагглатинации.

Впервые экспериментально установлено, что вирусы Коксаки и вариант Абент" способны адсорбироваться на тромбоцитах человека на 90-99 % соответственно. Это имеет важное значение для клинической вирусологии. Адсорбция вирусов на тромбоцит&х может повышать адгезивную и агрегационную активность тромбоцитов, вызывая кх склеивание и приводя к гиперкоагуляции йрови. Этот факт является основным в патогенезе развития диссемини-рованного внутрисосудистого свертывания крови при инфекционной патологии /З.С.Баркаган, 1980; А.И.Грицюк, 1988/, Возникновение тромбогеморрагических осложнений при заболеваниях с возможной отиологияеской ролью Коксаки В вирусов /ревматизм, дилятационная кардиомиопатия, серозный менингоэнцефалит/ под, тверкдает ввдвинутое положение (С.Каиа1, Т.ТвкаЪви, 1975; О.СатЬг1<1ее а!., 1979; В.ВеИ et а1., 1988).

Изучение некоторых физико-химичзских свойств гемагглютининов вирусов Коксаки группы В

Опыты по изучению действия УФ-облучения на гемагглютини-рующую активность вирусов Коксаки В позволяют прийти к заключению, что гемагглютиниш вирусов связаны с капсидными белками, поскольку полная инактивация инфекционности вирусов УФ-лучами не уменьшает их гемагглютинируащую активность. Электронно-микроскопическое подтверждение образования пустых капсидов при УФ-облучении документально доказывает связь гемагглютининов Коксаки В вирусов с капсидными структурами.

Наличие выявленного пика гемагтлютишруюцей активности на ранних этапах репродукции в клетках ФЭЧ /через 8 часов/, когда в условиях высокой множественности инфицирования клеток образуется большое количество пустых, частиц, свидетельствует о способности последних к генагглатинации.

Оде одним доказательством связи гемагглютининов со струк-турндаи белками вирусных капсидов явилось получение при ультрацентрифугировании в градиенте сахарозы вирусов Коксаки В-3 фракции, обладающей лишь ГА-активностыо без наличия инфекци» онной. В данном случае- также удалось доказать при помощи методов электронной микроскопии присутствие в этом материале только пустых вирусных частиц.

В настоящее время накоплен ряд сведений о возможной глико-протеидной природе белков капсидов некоторых энтеровирусов и ее связи с гешгглютинирующей активностью вирусов. Для изучения этого вопроса мы применяли методы определения чувствительности гемагглютининов вирусов к лерйодатному реагенту и г.теколитическим ферментам. Перйодат калия избирательно разрушает углеводные структуры, в том числе углеводные компоненты

гликолротеинов. Известно, что КЮ^ не способен разрушать ри-бозу РНК энтеровирусов (11.Н.Еиэокег1;, 1371 )| следовательно, инактивирусщее действие реагента направлено на капсидные структуры.

Опыты показали,^что вирусы Коксаки В-3 терявт гемагглюти-кирующие свойства после обработки перйодатом калия только при рН 4,0-4,5. При слабокислых и нейтральных значениях рН К104 не действует на гемагглятинирующую и инфекционную активность /табл.4,5/. Действие гликолитических ферментов не приводило к изменению гемагглютинирувщих свойств вирусов. При изучении свойств вирусов Коксаки В З.П.Широбоковым /1978/ были получены сходные результаты, Вместе с тем, большинство авторов отрицает присутствие в энтеровирусных частицах углеводных компонентов в составе капседных структу𠹫Вггеп1о

а!., 1974! Н.ВеэтШс, 1981).

Приведенные в нашей работе данные о чувствительности гем-агглютининов вирусов Коксаки В-3 к перйодатному окислению, могут быть рассмотрены в качестве свидетельства в пользу существующего предположения о на ли щи гликопротеиков в составе капсидных белков некоторых энтеро вирусов.

Однако нельзя трактовать полученные результаты однозначно, не учитывая другие возможности. Во-первых, говоря о механизме действия перйодата калия, нельзя исключить возможность неспецифического окисляющего действия на вирусные белки, так как К10^ относится к галогекидам - мощным окислителям, особенно активнда в кислой среде. Во вторых, не было показано действие на гемагглютинины вирусов Коксаки В глюкозидаз.

Традиционно принято считать, что в составе энтеровирусов нет липидов и поэтому они не чувствительны к действию эфира и хлороформа. Вместе с тем в последнее время в литературе

- 17 -

Таблица 4. Действие К10^ на гемагглэтинирующую активность вирусов Коксаки В-*

. Вирус Исходный титр ТА, ГАЕ/мл Титр вирусов после при рН: действия К104>я'

4,0 ' 5,0 6,0 7,0

Коксаки В-3 1260 0 640 1280 1280

Коксави В-4 640 0 320 640 640

й Вирусы пассировались в культуре ДЭЧ. Враад окислешш .0,014 М КЮ^ - 18 часов.

Таблица 5. Действие НЮ^ на шйекционную активность вирусов Консакн, В

: ; Исходный Титр вирусов после действия КЮ^ Вирус титр, в:1в при рН

Т1%/мл . 4,0 ' 5,0 " 6,0 7,0

Коксаки В--3 7,710,38 2,713,36 6,ЗЗЮ,34 7,6610,36. 7,?Ю,32 Коксаки В-4 8,010,4.4. 2,7Ю;,35 6,5 ¿0,44 7,710,39 8,0Ю,45

накапливаются сведения о наличии лйпидных структур в варионах (Х.У.Ки/*аз еЪ а1., 1934; З.М.Ьвтэп, Ь.Ы.ВЗлзп, 1983, 19В5).

В наших исследованиях было установлено, что ни эфир, ни липолитические ферменты не влияит на гемагглютвдирующуа и инфекционную активность вирусов Коксаки В. Несмотря на это, удалось показать возможное наличие липмдов в структура вирусного капсида. Доказательством этого факта является установленная потеря, свойств вирусов Коксаки В адсорбироваться на бентоните после обработки липазами. Эти исследования в какой-то мере раскрывают механизм адсорбции вирусов на бентоните посредст-

вом липидсодеркацих структур, что хорошо объясняется способностью бентонита интенсивно сорбировать липиды (E.Nikkila, H.OJcer-Biom, 1952).При изучении действия липазы на вирусы Коксаки В-3 в системе вирус-клетка показано, что содераание фермента в среде поддержки в концентрации 1,5 мг/мл увеличивает гемагглютинирующую активность. Этот факт можно объяснить с позиций разрушения липидных структур на поверхности капсида и освобождению рецепторов гемаггл»ткшшов.

В результате дальнейших опытов удалось показать, что про-теазы действуют аналогично липазам, лишая,вирусы Коксаки В способности адсорбироваться на бентоните. Одинаковое действие ферментов двух разных классов дает ■ возможность предположить присутствие липидсодержащих структур в вирусном капсиде в качестве липопротеинов.

При сравнении плавучей плотности гемагглютинирующих и ке-гемагглютинирующих вирусных частиц показано, что негемагглю-типирующие вирусы Коксаки В-3, выращенные в перевиваемой культуре клеток Vero, имеют плавучую плотность в градиенте сахарозы ниже / р = 1,168 г/см3/, чем гемагглютинирующие вирусные частицы, полученные в первичной клеточной культуре ФЭЧ /j3= 1,195 г/с:.!3/. Принимая во внимание более низкую плавучую плотность негемагглютинирукщих вирусных частиц, можно предположить о возможной связи их с клеточными мембранами и белками.

Для сравнительного элекгронношкроскогмчвского изучения ГА+ и ГА" вирионов было необходимо обосновать наиболее аффективные методы ЭМ исследований, что позволило адаптировать некоторые современные методики применительно к вирусам Коксаки В. Использование техники фильтрации в агар вместо этапа ультрацентрифугирования иммунных комплексов в прямой иммунной

ЭМ упростило метод и исключило возможность неслецифичзской аггрегации вирусных частиц в процессе осаждения. В результате дальнейших исследований были разработаны условия проведения иммуносорбентной электронной микроскопии /ИСЭМ/ для изучения Коксаки В вирусов. Подобраш оптимальная концентрация белка А для сенсибилизации шенок-подлояек /50 ыкг/мл/. Установлено, что ИСЗМ является высокочувствительным методом выявления Коксаки В виру сов'и позволяет определить

вирусных частиц. Эффективность метода в определенной степени зависит от использования пленок-подло-кек. По нашим данным, формвар-углеродные пленки обладают явным преимуществом перед амилаце^атными, так как более прочно и эффективно связывают белок А. Метод ИСЭМ оказался не только приемлем для успешной идентификации вирусов, но и удобен при определении размеров вирионов.

При изучении размера гемагглюгинирующнх и негемагглютиш-рувщих вирусов Коксаки В-3 определена существеюая разница в диаметре вирионов. Оказалось, то вирусы, пассируемые в клеточной культуре ФЭЧ и обладающие ГА-активностью, .имеют боль-аий размер вирионоз в сравнении с негемагглютинирующими ви-рионами, полученными -в культуре Vero: 30,04^0,1 ш и 26.I0Í ¿0,15 нм соответственно. По нашему мнению, есть несколько интерпретаций полученных результатов. Возможно у данных вирусов разная аффинность калсидных белков к специфическим антителам, применяемым в ИСЭМ, что может свидетельствовать о различиях в строении капсвдных структур вирусов, обладающих и неоо'лада-Ю1щх ГА-активностью. Модет быть, изменение размера вирионов связано с процессами адаптации вирусов и .репродукции в различных клеточных культурах с преимущественной селекцией вирионов определенного диаметра. Это положение подтверждается

— cu —

наличием в исходной популяции гемагглатинкрующих вирусов небольшого количества частиц с размером 26 ш и наоборот, опре-

- 20 -

деление у негемагглатишрующих. вирусов диаметра вирионов 30 нм /рис.1/.

Рис.1. Распределение вирусных частиц по размеру в исследуемых популяциях вирусов Коксаки В-3 (п « 100). По оси абсцисс - диаметр вирионов, нм; по оси ординат - количество вирусных частиц . А - вирусы, пассируемые,в культуре клеток 8ЭЧ. Б - вирусы, пассируемые в культуре клеток Vero.

Возможно, что разный размер вирионов связан с поверхностными липидсодертащиыи структурами, ассоциирован;;:гми с вирус* *

ными частицами, хотя и не выявляемыми ЭМ-методами,

Таким образом, получзнше данные свидетельствуют о различных биологических и физико-химических свойствах вирусов Коксаки В,•обладающих и не обладающих ГА-активностью.

тс

"cj "23

выводы

I. Впорвые установлено, что популяция вирусов Коксаки В-3, культивируемая в перевиваемой клеточной культуре Vero, гете-

- 21 -

рогенна по гемагглютишрующей активности, ■/

Доказана корреляция между гекагтданирующей активностью и бентонитовым генетическим маркером: гемагглютинирующие свойства присущи только, варианту Абент". '

В популяции мру со в Коксаки В-3, полученных в первичной культуре клеток ФОЧ, гемагглютишрувщей активностью обладают в равной степени оба'селекционированных генетических бентонитовых варианта - Абент+ и Абент", ■

2. Установлена интенсивная.адсорбция вирусов Коксаки группы В на поверхности эритроцитов и.тромбоцитов человека и животных. ' ' . ' .

Аффинитет-к эритроцитам вирусов. Коксаки В, выращенных в первичной клеточной культуре ЮЧ и. обладающих гемагглютини-руищей активностью, более чем в 100 раз превышает таковой у. негемагглютинир^ющих штаммов, полученных в перевиваемой культуре-клеток Vero. ' ; ..

3. Вирусы Коксаки В-3, различающиеся по гемагглютинирую-щей активности,'имеат неодинаковые физико-химические свойства: диаметр вирионов гемагЬяютинирующих штаммов, полученных в: первичной ,к$1ьтурё клеток ФЭЧ, составляет по данным морфо-метрического анализа йл.ёйтронограмм 30,04ÍQ,I нм; плавучая плотность в градиенте сахарозы 1,195 г/см. Соответствующие показатели негемагглюТщтрующих штаммов вирусов Коксаки В-3, культивируемых в перевиваемой клеточной культуре-Vero, сос-т4влтот 26,.IÓiO,I5 нм и 1,188 гЛм3. ;

4. На основании сопоставления гемагглютинирующей активности нативных вирионов и пустых капсидных структур, изучения действш на тшгг^ютикируюи^е свойства ряда ферментов /липаз, протеаз, гликозидаз/, химических и физических воздействий /УФ-сбзучение, обработка эфиром, перйодатом калия/ вцдви-

- 22 -

нута гипотеза об ассоциация гекзгглютинируюцей активности с капсиднымп белками вирионов.

5. Обоснованы оптимальные условия накопления вирусных гем-агглютининов при репродукций вирусов Коксаки в первичной культуре клеток 5ЭЧ: температура культивирования - 33 °С, время репродукции - 8 -~10 часов. v •

Экспериментально раэработг :-ы условия выявления гемзггл»-тинирующих свойств вирусов Коксаки группы В в микрометоде РГА. , •

6. Изучены наиболее чувствительные методы иммуноэлектрон-ной микроскопии для исследования вирусов Коксаки В.

Экспериментально обоснованы условия 'проведения икмуносор-бентной электронной микроскопии: 15-мйнутная сенсибилизации формБар-углеродньк пленок-подложек белком А в концентрации 50 мкг/мл с последующим ¿шюсетеи антисйворотки в низких разведениях /1:5/, Вирусы сорбируют на сенсибилизированную пленку-подложку по методу фильтрации в агар*

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО Т&Е ДИССЕРТАЦИИ

1. Егоров A.A., Амбарцуыова Н.В. К методике выявления гемаг-глвтинирущей активности энтеровирусов//Микробиол.журн. -IS89. - 51, » 4. - С.95-97.

2. Широбоков Р.П., Егоров A.A., Амбарцумова Н.В. Изучение гемагглютинируючих свойств и адсорбции на эритроцитах вирусов Йоксаки В-3 и их селекционированных бентонитовых вар!антов/Д1икробиол.журн. - 1989. - 51, К' 4, - С.51-54.

3. Егоров A.A. Сравнительное изучение адсорбции вирусов Коксаки группы В на эритроцитах//Тезисы докладов УП съезда Украшзкогт «тробиологичеокого общества. — Черновцы, 1989. - с.гоо-гси.

4. Егоров Л.А. Изучение гемагглэтикируоней активности вирусов Коксака грулш В репродукция а условиях суб-и супероптшла^ыви. темшрзтур/УТезнсн докладов УБ съезда Украинского микробиологического общества. - Черновцы, I2S9. - С.201-202. ' '

5. Егоров A.A. К проблема гемагглютииирующих свойств энтеро-и;русов//Вирусы и вирусные заболевания. - ВылД7. - Киев: Здоров"я. - 2989. - С.45-51.