Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ВИРУСОВ КОКСАКИ ГРУППЫ В И ИХ СЕЛЕКЦИОНИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ВИРУСОВ КОКСАКИ ГРУППЫ В И ИХ СЕЛЕКЦИОНИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ"

Я-%3632>

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУШ НАРОДОВ ШДЕЫШ НАУК УССР

ОРДЕНА ТРУДСШГУ КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТШУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ им.Д. К. Эаболотного

На правах рукописи ЕГОРОВ АЛЕЯСНЙ АШЕРОБИЧ

гшгпштшруадм актшюсть вирусов коксш группы е

И ЮС СЕЛЕЩИОКдаШШх' ВАРИАНТОВ 03,00.06 - эирусрдагия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биолота ческих наук

Лиев - 1990

0РД2Ш ЛЕНИНА И №ДШ ДРУИШ НАРОДОВ АКАДЕЙН НАУК УССР

- ордена тедовош красного зшшш

Егоров АЖКЙШ Щ!ЩШ

ГШГГШтКУВЦЯ АКЗ'ИШрСТЬ ВИРУСОВ КОКСАКИ пшш в и и СЕЖЭДЮНМРОМНад; ВАРИШЬ

03,00.06 - Шфуоология

Автореферат диссертации на соискание учено* степени К&ндздат биоявгичаскшс наук

Киев - 1990

| ■ .ЦЕНТРАЛЬНАЯ "

¡' -''Л'- '-елвдсхо.! а ;аде\ык

ИШШ'Г ЩИРОШЛОШИ И ШРУСОДОГИИ иы Д.К.Заб олот но го

На правах рукописи

Рчбега выполнена в Киевском ордена Трудового Kg«оното Знамени медицинском институте им» акад. А.А.Бвгемельцэ.

двкто^ мед,иадк, првфессор Ииройвков В.П, дбктвр биол.наук' Дячекао Н.С.. доктор мед.илjк Корчак-Г.И.

Свердловский научно-исследовательский институт вирусных «"Нфекцкй

Защита диссертации состоится " $ " 19Э0 г,

часов на заседании с гтеци ал из нро ваняо гр'^Со вет а Д 016,06.01 по задуйте диссертаций на соясканйе ученой степени доктора биологических наук при Институте микробиологии и вирусологии км. Д.К.Заболотиого АН УССР по адргс^; 25262?, Киеэ-143, ул.Забблотибго, 151, Ш> АН УССР.

С диссертаций можно ознакомиться в библиотеке ]WB All ¿'Ш\

Автореферат разослан *

/X» доор г>'

Научный ру KQ ведите ль; Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

еД.КОШЕШ.О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность псо&гемы. Среди разнообразны* групп вирусов ос&бое место принадлежит энтеровирусам. Максимальная простота организации, устойчивость во внешней среде, доступность для изучения ¿a vivo и in,vitro дедает энтеро вирусы удобной модель» для современной экспериментальной вирусологии. Кроме того известно, что энтеро виру caw принадлежит большая рожь в инфекционной патологии человека*

Особое внимание исследователе« привлекает вирусы Коксаки грунта В. Доказана их выраженная нейротрогаюсть {£.1.в«11 et ai., 19В8), кароиотропкость с участием в патогенезе ревматизма И эндокардита Л.И.Новиков, 1984/» дилятацконной кар-дяомюяатии, ииокаркита, острого некроза миокарда (G,Cambridges et al., 1979t R-L.Стоwell, 1987» J.B.Grua it al., 1908). Велика роль Коксаки В_инфзкции в возникновении инсулин-зависимого сахарного диабета (S.K.CHattetiee et al., 198S1, доказана их паккреатогропность /В.П.Широбоков с соавт., 1968/, а такие связь вирусов Коксаки В с развитием перинатальной инфекции новорожден»** {J.s.Kodiin, igaa) - все это определяет важность и необходимость дальнейшего изучения биологических свойств вируеоя Коксаки В, '

Одним из таких свойств является гемагглютширущая активность вирусов Коксаки'В, открытая J.GoldiJ-eld et al. в 1957 году. Несмотря на более чем тридцатилетние исследования, феномен гемагглютинацин энтеровирусов остается малоизученным, Гемагггаоткнирующие свойства у эктеровирусов проявляются не всегда,, зависят от вида используемых клеточных культур и, возмо1кко, каких-то других, еще на известных причин.

В основном работы да этому вопросу были посвящены ШЮ-ви-руеаы, а изучение гетгглртинирущкх свойств вирусов Коксаки В носит эпкзодичзский характер.

До сих пор остаемся неизвестной природа геыагглотин^ии, чувствитедьше к ентеровивусам рецепт ори на поверхности эритроцитов, не изучена гетерогенность вирусной шцуляции по г ем-агглютинирующим свойствам, корреляция гемаггжгини^ую^Й активности с генетическими маркераыи ви^сной иояуляции»

Одним из таких маркеров является раздшчный аффинитет энте-ровирусов к природному сорбентубектониту, по которому даду-лш^ эШ'врошрусов можш разделить ш двв груплы: вирусы, обладаицие высоким /Абент+/ и низким /Абент"/ сродством к бентониту. Аффинитет к бентониту коррелирует с различтми бколо-. гическими свойствами вирусов Коксаwi В, такими как вирулентность, органстропностъ,'иммуногенностъ и другими /В.Е.Широбо-ков, 1977; 198Г; 19В4; 1966/. ■ 'V

Цель и задачи исследование. Исходя иа выаеиэложенных фактов, цель» £л;сертационной работы явилось изучение гешггд»-ткнируицих свойств культуралькьм штаммов вирусов Кокеакй В, . их отдельных сэлекционираванных генетических вариантов я определение возможней природы гемагглютинирущегофактора.

Главными задачами диссертационной работы явились:

1. Исследование гетерогенности вирусов Коксаки В ш гемаг-гдютинирувцей активности и связь ее с бентонитовым генетическим маркером,

2. Изучите степени адсорбции вирусов Ко к саки Вна поверхности эритроцитов и Тромбоцитов человека и животных.

3. Экспериментальное обоснование условий накопления гемаг-глютининов ¿ярусов Коксаки В в процессе репродукции и юс выявление в кикрометоде реакции гемагглютинации /РГА/.

4. Изучение физико-кимичесюсс свойств гемагглюттшнов вирусов Коксаки 0.

Научная новизна, В диссертационной работе впервые показана гетерогенность вирусов Коксаки В, пассируемых в перевиваемой культуре клеток Vero, по гемагглптинируицей активности. Доказано, vro гемгтлотяниругащие свойства присущи только генетическому бентонитовому варианту Айент".

Установлено, что как гемагглюткнирущие, гак и негемагтля-тикйруадие штаммы вирусов обладает способности) адсорбироваться и» эритроцитах человека и животных» Аффинитет к эритроцитам гемагглш'инирущкх штаммов вирусов Коксаки В, пассируемых в первичной цультурв меток фиброй л а сто в эмбриона человека, более чем в ZOO раз древдаает таковой у вирусов, подученных в перевиваемой клеточной культуре Vero и не обладающих гемаг-гдютяиирувщей активностью. Показана возможность вирусов Кон-сакв В адсорбироваться на поверхности тромбоцитов.

*

. На основании методов ультрацентрифугирования и электронной ки крое копии установлены раэли<мя физических свойств гемагглю-тннируэдих и негемагглюггинирующих вирусных частиц /величина вирйонов» плавучая плотность вирусных частиц/. i. ■

При использовании комплекса молекулярно-биологических не-тодов исследования обосновано заключение о связи гемаггллти-нинов вирусов Коксаки В с капсчдшли белками вирконов.

Определены условия для изучения вирусов Коксаки В методом имнуносорбентной »лектронной микроскопии.

Практическая знатность. На основании полученных данных обоснованы оптимальные условия го лишняя reívia гглютининс в вирусов Коксаки В и их титрацин в РГА, поставленной мпкромето-дои. Экспериментально показана возможность выявления гемаг-глютишфующеЯ активности вирусов Коксаки В nj« культивирова-

нии в диплоидной культуре фибробластов эмбриона человека М-И.

Изучены и адаптированы применительно для Коксаки В вирусов методы шдаунной электронной микроскопии. Эти дацные могут, быть использованы в практической вирусологии дня диагностики Коксаки В тфгкций. Материалы диссертацконной работы используются в курсе лекций по вирусологии в Киевском мединституте.

Ддройагцк работц. Основные результата и положения работы долмекы на конференцни ыолодык ученых Киевского медицинского . института /1586 г./. Диссертационная работа апробирована на 1 заведении кафедры микробиологии Киевского медицинского института /19В9 г./. .''';.■■■■

Публикации* .По материалам диссертации опубликовано 5 тк

,;" . . *' ' ■ — ■ 'т 1 ньк работ. ■' ''■■■.:■.■"

и стцуктур^ работы. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована £1 рисунками и 29 таблицами. Работа состоит иа введения, обзора литературы /I глава/, описания материалов и методов, экспериментальной части /5 главы/, обсуждения, выводов и списка, литературы, со* держащего £49 источников, в тры шсле 85 отечетвенньк и 164 зарубежных авторов. ' .

СОДЕРЖАНИЕ РАИУШ

Матещали и методы исследований. Вирусы. В работе использованы прототипные штамлы вирусов Коксаки 6-1 /шташ Сешдво-■ Л Коксаки В-< /штамм ОЬ1о-1 /, Коксаки В-3 /штйш *

Яаасу/, полученные из Научно-исследовательского института еируенш инфекций /г. Свердловск/ и Научно-исследовательского 'института полиомиелита и Блргуснык энцефалигов /г.Уосквй/; штаммы вирусе/) Коксам В-1 — В-6, выделенные в нашей лаборатории из сточках вод г.Ккепз в 1900-1985 годах.

Бентонитовые генетические варианты Абент+ и Абегсг- вирусов Кокса ил В селекционировали из вируссодеркащего материала в соответствии со схемой получения бентонитовых вариантов эятеро-вирусов /В.П.Широбоков, 1968,1970/. Бентонитовый наркер вирусов определяли по их способности адсорбироваться на бентоните при слабощ&лочйге экачгнмях рН,

Кудьтуем (детоit.В опытах использовались различию культуры Tero - перевиваемая культура клеток почкк африканской зеленой мартьиши;

НЕр~£ - перевивдешя культура клеток карцянорл! гортани человек;

H-I9 - диплоидная клеточная культура фибробластов эмбриона человека; - .

фмбройласты эмбриона человека /ФЭЧ/ - первичная клеточная культура, кото рун получали по общепринятой методике /H.H.Глин схих, 1977/,

В зависимости от метода титрации или цели эксперимента культивирование клеток" производилось в пробирка* f флаконах иэ-под пенициллина или в 96-лу ночиос по ли стироловых плашетах с плоским дном /фцкы Uicr otes, linbro или от ере ст венного про

иэводсгва/ в'атмосфере, содержащей 5 £ СОо или с добавлением

*

среду ШЕЙ 25 ш KEPES буфере /Serva, ФРГ/.

Титрацим вирусов, пассируем;« на перевиваемых клеточных культурах, осуществляли методом бляшек под бентонитовым питательным покрытием /В.П.Шяробоков, 1973/. Вирусы, пассируемые на первичной культуре меток 404, титровали методом конечных разведений по Риду и Ыенчу в ¡¡рэбм ровных культурах /М,Н.Ворошилова, 1?б4/ или микрометодом с применением 9б-луношкх полистирол о вых шганиет С плоским дном.

ГемагглитинируициЯ тигр вируса еыражалй в гемагглвтннируи-

|цих единицах /ГАЕ/, который определяли в реакции гемагглютина-ций /РГЛ/, поставленной иикрометодоч ври помощи микротитратора "Таккачи".

Для сравнительного определения способности вирусов адсорбироваться на эритроцитах к виру с содержащей жидкое та добавляли эритроциты четырех групп крови человека, а также барана и кролика до конечной концентрации 5 55. Смесь инкубировали при 37 °С. Через определенные промежутки времени пробы центрифугировали при 1500 об"1 в течение 5 мину? и в надосадочной »едкости определяли инфекционную активность, да изменению которой судили о степени адсорбции вирусов на эритроцитах с расчетом константы скорости - адсорб^и вирусов /Р.Рюкерт, 1969/, По аналогичной методике определяли адсорбцию вирусов на .тромбоцитах человека*

Определение выхода гемагглвтинидав вирусов а процессе репродукции в клетках изучали используя пробирочные культуры фибробластов эмбриона человека /ФЭЧ/. В каждую пробирку вносили 250 ООО ,кпе?ок в I мл. Через определенные промежутки времени после начала репродукции исследовали геыагглютинирую-щую и инфекционную активность внутри- и внеклеточного вируса.

Для изучения влияния температуры репродукции на ГА-активность было проведено 5 последовательных пассажей ГА-дааммов' вирусов при"температуре 20, 2В, 33, 37 и 40 °С. После каждого пассажа определяли гемагглюгикирущий и инфекционный титр.

Для определения действия ферментов на гемагглзотинирующуюJ активность и.бентонитовый профиль вирусов использовался ряд ферментов с лротеолитической, глюкозедазной и липолйтическоЯ активностью. Действие указанны* ферментов определяли путем добавления ььируссодержащему материалу «о концентрации I «г/мл. pH смеси доводили до указанного вше оптимального

значения, tí чувствительности вирусов к действио ферментов судили по изменению титре гемагглютининов и инфекционной активности после часовой экспозиции при температуре 37 °С,

Изучение чувствительности к перйодату калия проводили путем добавления к вируссодеркащему материалу равного количества 0,04 U раствора перйода'га калия, рН смеси доводили до значений 4,0; 5,0; 6,0; 7,0. Перйодатное окисление осуществляли при 4 °С в течение 4 и Ш часов. О чувствительности вирусшх геиагглютининов к перйодатному реагенту судили по изменению ГА-актиэности вирусов.

Определение действия эфира на ГА-активвость вирусов'проводили по следующей схеме: к 2 мл вируса добавляли X мл эфира и смесь интенсивно встряхивали в течение 20 минут, эатем смесь оставляли при 4 °С в течете 12 часов. Проведали сравнительное титрование гемагглптинирушцей к инфекционной активности, исходного и обработанного вируса,

О влиянии УФ-облучения на вирус судили по изменению инфекционной и геыагтлвтйнирущей активности вирусов после 30-минутного ультрафиолетового облучения. _

Электронно-микроскопические исследования проводили на^эле-кгронном иифэскопе "ЗМВ-ЮСШМ" /Сумское ПО "Электрон"/. Сравнительно исслтоовалй вирусы Коксаки В-3 и их бентонитовые варианты, /Абент+ и Абвнг"/, пассируемые на первичной клеточной культуре ®ЭЧ и перевиваемой культуре клеток Vero с проведением морфометрми вирусных частиц.

В работе использовались 2 группы методов: I/ прямая электронная микроскопия /ЗМ/ вируссодержащих образцов.

2/ Методы ишуноэле ктро нно й микроскопии с использованием прямой иммуноэлектронной и ишуноеорбентиой электронной wik-

росиопии*

Определение плавучей плотности вирусов Коксаки В-3 и юс бентонитовьдс вариантов проводили в градиенте плотности сахарозы /15-50 %/ на ультрацентрифуге "БеоЬшап Ь-ап /40000 об/мин, 22 ч, 4 °С, ротор Sf-SS.T /. После центрифугирования градиент фракционировали'по 0,2 мл, начиная с мениска, ив ал «квотах определяли инфекционную и гемагглюТинируявдо активность» Определение плотности во фракциях сахарозного градиента проводили путем измерения коэффициента преломления на рефрактометре FHI-3, пользуясь для расчетов следующей зависимостью: £ - 2,7329 х ago ~ Й.6425.В этой формуле коэффициент преломления измеряют При 20 °С, а плотность раствор»: сахарозы рассчитывают для температуры О °С /Л.А.Остерыан, 1981/,

Полученный цифровой материал стати стичесм! обработан по созданной программе для расчета стандарткой оаюбки по .формуле Пищи на микрокалькуляторе "Электроника В-3-64" я методов вариационной статистики.

Изучение оптимальных условий выявления генагглютинииов вирусов Коксаки В и их получения в культуре' клеток $04

Установлено, что для выявления гемагглютининов вирусов" ; Коксаки Ö в микрометоде РГА наиболее оптимальньвли условиями являются: pH фосфатной у ферно го раствора 7,2-7,5, применение эритроцитов 0/1/ или ВД1/ группы крови человека в 0,7S % концентрации о. постановкой реакции при комнатной температуре, , Изучая гемагглютикируищую активность вирусов Коксаки В-3 при разных температурах культивирования, было показано, что' максимальнее.титры вирусных гемагглютининов определяются при еубоптга!аль5Юй температуре 33 °С. Понижение температуры раз-

множен«й вирусов, видимо, является селективга* фактором, способ ствущкм отбору мутантов с высокой гемагглютинирущей активно стья, Исследование выхода гемагглютининов вирусов в процессе репродукции показали, что максимальной гемагпютиниру-ющей активкостьп обладает внутриклеточный пул вирусов через 8 часов после начала репродукции /табл.1/.

Таблица I. Гемагглютинируицвя и инфекционная активность вируса Коксаки В-3 на этапах репродукции в клетках 404

Внекяетоодй вирус Внутриклеточный вирус

Т/тс/ га; ГАЕ/1,0 мл ИА, в 1« ТЦДк/1»0 «Л ГА, ГАЕ/1,0 мл ИА, в 1в Тад^Л.О мл

5 0 3,50^0,44 0 4,0010,46

в 0 4,63±0,32 1280 " -5^7010,43

10 160 6,0010,46 330 6,2010,44

12 160 6,2010,31 . 240 7,2010,40

16 ' 160 ,5,002»,43 ,5в0 6,00±0,42

20 ' 640 7,20Ю,33 160 6,7010,34

24 640' в,0010,44 640 7,6310",3б

Таким образен, обоснованы оптимальные условия накопления вирусных гемагглютининов при репродукции вирусов Коксаки груп гш В в первичной клетоадой культуре КЭЧ: температура культиви рования - 33 °С, время репродукции 8-10 часов,

Изучение гемагглютинирующей активности и адсорбции на эритроцитах вирусов Ко ксаки В и их бентонитовых генетических вариантов

На основании получению: результатов удалось показать, что популяция вирусов Коклаки В-3, выращенная в дере^иэаемой куль

- ю -

туре клеток Vero, является гетерогенной по признак ГА ^ахти внести /табл.2/.

Таблица 2. Гемагглютинирующая активность вирусов Коксаки В-Э и их бентонитовых вариантов

Титр вирусов, Титр ГА вирусов, в ГАЕ/нд а БОЕ/мл эритроциты человека

0/1/ : Ш в/ш/ АВ/1У/

Коксаки В-3 0 0 : 0 0

Варианг Абент* /5,810,38/хЮ6 0 ■ 0 0 0

Вариант Абент- /6,9í0,44/xl06 640 40 2560 80

Установлено, что гекагглотикирующие свойства присущи только генетическому бентонитовому вариатеу Абеш**, который обычно присутствует в далуляции вирусов Коксаки В в минимальны* количествах, составляющих 0,02-0,6 % от общего числа инфех- . ционных вирусных дастиц /В.П.Широбоков, 1978/, Подавляющее большинство вирионов, представленных вариантом Абекг+, не обладают ГА-актиеноотьи.

Отметим, что шм впервые удалось установить факт наличия у вирусов Коксаки В, выращенных на перевиваемой культуре клеток, гемагглюгинируюцих свойств. Все авторы, которые пыталась доказать ГА-активность вирусов ШНО и Коксаки В, выршденнъм в перевиваемых клеточных культурах, пришли к отрицательным результатам /ь. Д. Подоплекин, С.Ф.Закирова, Л.Е.Толстокоро на, 1ЭТ5; 0,¿.„Турчанинова, 1977/. Это, видимо, связано с тек, что небольшое количество ГА-чютиц в исходной популяции ьирусов Коксаки 2 не улавливается в РГА при'обычной постановке.

Таким образом, в результате исследований удалось получить приоритетные данные о корреляции между ГА-активностьи и бентонитовым маркером вирусов Коксаки В-Э, выращенных: в перевиваемой культуре клеток. Для того, чтобы распространить это заключение на все типы вирусов Коксаки В, требуется дальнейшее изучение этого вопроса.'

Важно отметить, что ГА-активность селекционированного варианта /бент** вируса Коксаки 3-3, выращенного в культуре клеток тег о, была весьма выраженной: титры ГА имеют значения 640-1260 ГАЕЛм, что не меньше в количественном отношении, чем у ГА штаммов того же вируса, пассируемого в первичной культуре ФЭЧ» Установлен определенные разлишя в ГА-активности вирусов Коксаки В~3, выращенных в первичной к перевиваемой культуре клеток: гекагглютинируацие штаьмы вирусов, пассируемые в культуре ФЭЧ, обладает способностью агглютинировать эритроциты человека, что совпадает с литературными данными /Л.Роэен, 1972; Л,Е.Толстокорова с соает., 1975/, С другой стороны, гемагглютинирущий вариант Абент" вируса Коксаки В-3 из перевиваемой культуры клеток Vero, способен аг-глютииировать не только эритроциты человека, но и эритроциты кролика, причем чувствительность РГА с кроличьими эритроцитами и эритроцитами человека 0/1/ и В/Ш/ группы кров» человека била сопоставима. По-видимому, вирусы Коксаки В-3 /вариант Абент**/ иэ перевиваемой культуры клеток Yero имеют дополнительные рецептерные структуры, обуславливавшие их аффинитет и способность склеивать эритроциты кролика. Этот факт косвен- ■ ным образом доказывает гетерогенность структурных белков вирусов Коксаки В как в пределах одной вирусной популяции, так 'и при пассировании в различна* кдето'вщх культурах.

Изучение геиагглютинируищих сьо,Тетя зирусоо Коксаки В tipil

■ -12-

лереводе с культивирования из первичной культуры клеток в перевиваемую к наоборот« показало, что вирусы обратима теряют ГА-активность при выращивании их в перевиваемых культурах с восстановлением свойств при переходе к пассировании в первичных клеточкой культурах.

Установлено, что ГА-активность вирусов Коксаки В-3 полностью сохраняется при адаптации и выращивании их в диплоидной культуре клеток фибробластов эмбриона человека M-I9. Представ^ ляется, что это может иметь важное практическое значение, поскольку получение первично-трипсинизированных клеточных культур является трудоемким и длительным процессом. Способность диплоидных клеток выдеркквать 30-60 пассажей может значительно облегчить получение гемагглютищфующих штаммов бирсов : Коксаки В и их" применение с целью серологической диагностики 'Коксаки В-вирусных инфекций в РТГА.

Из литератур известно, что ГА-активностью обладают вирусы, способше адсорбироваться на поверхности эритроцитов. С<«та-дось, что адсорбция на эритроцитах вирусов ECHO присуща только гемагглютинирующим вирусным частицам и ее степень и динамика определяют уровень гемагглютинирующей активности /В.Д.Шщоплекин,.1969,1971/, Наши опыты, Проведенные в данном направлении, выявили несколько иную позицию. Оказалось, что' на эрнтроцийх адсорбируются не только гем&гглютинирувцие, но и негемагглютинирующие штаммы вирусов, выращенные в перевива- -емой культуре клеток Vero. Вместе с тем, адсорбция геыагглю--тинирующих вирусов Коксаки В, пассируемых в первичной культуре 494, оыла более, чем в 100 раз выше.. Исследования кинетики данного процесса с определением константы скорости адсорбции вирусов на эр; 1тростах выявили значительную разницу в этих гю-гадателях /тао.ч.З/. Йтст факт.с одной стороны, доказывает, что

Таблица 3. Константа скорости адсорбции вирусов Коксаки' В-3 и их бентонитовых генетических вариантов на эритроцитах 0/1/ группы крови человека

Вирусы

Исходна» концентрация Концентрация вирусов, Время ад- Константа скорости вирусов,.С /ЕОЕ/шг; после адсорбции сорбции, адсорбции вирусов,

1г ТЩ^д/мя/ / * ш К мин"

"эксаки В-3 Вариант Абент+ Вариант Абент" (Vero) Коксаки В-3 Вариант Абент+ Вариант Абент" /4ЭЧ/

/I,5¿Q,2l/xI0^

/¿ííJío,ie/xio6

/1,5±0,24/хЮб

7,5*0,44 7,7i0,36 7,510,46 '

f/5,0±0,I4/xI04 Л.О&.й/хЮ5 /1,0±0,25/хЮ4

3,0Í0,44 3,33¿Q,34 ■3,5Í0,42

30 SO 15

5 5 5

3.8.Ю-10 0,53.1o-9

о.ззло-8

0,32.10-® 0.33.I0-6

4t I

аффинитет вирусов 8 эритроцитам коррелирует с гемагглютикиру-вщиш свойствами. Возможно, при интенсивной адсорбции вирусов на эритроците происходит снижение его мембранного потенциала, и силы притяжения между эритроцитами наадна»т превышать силы отталкивания, что приводит к их а1глютинации. С другой стороны, неге«агглютинирующие вирусы Коксаки В-Э все же достаточно интенсивно адсорбируют сяна эритроцитах /90 % инфекционных вирусных частиц/, хотя при этом не обладают гемагглитинярую-щнми свойствами. Видимо, это связано о раэливдямив поверхностных структурах у вирусов с гемагглютинирующиш к негемаг-глютинирущими свойствами. Возможно, у негеыагглютинирующих вирионов пространственная конфигурация структурных белков вирусного капсида не позволяет создать высокий електро-отрица-тельньЯ заряд поверхности вириона, Это приводит к незначительному снижению дзета-потенциала мембран эритроцитов прк адсорбции вирусов и отсутствии последующей гемаггяотинации.

Впервые экспериментально установлено, что вирусы Коксаки В-3 и вариант Абент~ способны адсорбироваться на тромбоцитах человека на 90-39 % соответственно. Это имеет важное значение для "клинической вирусологии. Адсорбция вирусов на тромбоцит« может по вшать адгезивную я агрегационную активность тромбоцитов, вызывая их склеивание и щ>иводя к гиперкоагуляции Ърови. Этот факт является основнш в патогенезе развития диссеминк-рованного вчутрисосудиетого свертывания крови яги инфекционной патологии /З.С.Баркаган, I960; А.И.Грицок, 1986/, Возникновение тромбогаморрагических осложнений при заболеваниях с возможной этиологической роль» Коксаки В вирусов /ревматизм, дилятационная кардиомиотатия, серозный меиингоэнцефалит/ подтверждает выдвинутое положение (c.Kawai, T.TaKatsu, 1975) Q.Caatoidge et al., 13T9t B.B«11 et al., 198S>.

- 15 -

Изучение некоторых физико-химических свойств гемагглютиданов вирусов Коксаки группы В

Опыты по изучении действия УФ-облучения на гемагглютини-рунду» активность вирусов Коксаки В позволяют прийти к заключению, что гемагглвтинины вирусов связаны с капсвдгами белками, поскольку полная инактивация инфекционное?и вирусов УФ-лучами ке уменьшает их гемагглюткнируяаоад активность. Электронно -микро с копи че с кое подтверждение образования цустых кап-сидов ори УФ-обл учении документально доказывает связь ге«агглютининов Коксаки В вирусов с хапсидными структурами.

Наличие выявленного пика гемагглютинирущей активности на ранних этапах репродукции в клетках ФЭЧ /через 6 часов/, когда в условиях высокой множественности инфицирования клеток образуется большое количество пустых частиц, свидетельствует о способности последних к гембгтлютинации,

Нце одним доказательством связи гемагтлютининов со структурными белками вирус«« кадсндов явилось получение при ульт-рацентрифугированик в градиедае сахарозы вирусов Коксаки В-3 фракции, обладаодей линь ГА-активностью без наличия инфекци- ,„ одаой. В данном сдуве- также удалось доказать при лоыгаци методов электронной микроскопии присутствие в этом материале только пустых вирусных частиц.

В настоящее время накошен ряд сведений о возможной глико-протеидной природе белков капсидов некоторых энтеровирусов и ее связи с гемагглютидаруюцей активностью вирусов. Для изучения этого вопроса мы применяли методы определения чувствительности гемагглютининов вирусов к перйодатному реагенту и глккопитическим ферментам. ¡ЬрЙодаг калия избирательно разрушает углеводше структуры, в том числе углеводные компоненты

гликопротеинов. Известно, что КЮ^ не способен разрушать ри-бозу ШК энгеровирусов (н.н.ниесквгг, 19Т1)! следовательно, йнактИБИрувцее действие реагента направлено на капсидше структуры.

Ошты показали,^ что вирус» Коксаки В-3 теряпт гемагглюти-нирущие свойства после обработки лерйодатом калия только при рН 4,0-4,5, При слабокислых н нейтральных значениях рН не действует на гемагглютинирущую и инфекционную активность /табл., 4,5/. Действие гликолитических ферментов не приводило к изменении геиагглютинируицих свойств вирусов. При изучении свойств вирусов Коксаки & З.П.Широбоковык /1978/ были получены сходные результаты. Вместе с тем, большинство авторов отрицает присутствие в энтеровирусных частицах углеводных компонентов в составе иапсидных структур СН.1>г«вп1о «г а1., 13741 Н.ЦегпИс, 1981),

Приведенные в нашей работе данные о чувствительности гем-агглютининоа вирусов Коксаки В-3 к перйодатному окислении, могут быть рассмотрены я качестве свидетельства в пользу су-(цест вущего предголсження о наличии гликопротеинов в составе калсидшя белков некоторые энтеро виру со».

Однако нельзя трактовать полученные результаты однозначно, не учитывая другие возможности. Во-первых, говоря о механизме действия перйодата калия, нельзя исключить возможность не специфического окксляацего действия на вирусные бедки, так как К1СЦ откосится к галогенидам - моодшм окислителям, особенно актиэнда в кислое среде. Во вторых, не было показано действие да гемагглютинины вирусов Кокса ки В глюкоэидаэ.

Традиционно принято садтать, что в составе энтеровирусов нет лишдов и поэтому они не чувствительны к действию ефира И хлороферча, Вместе с тем в последнее время в литературе

- 17 -

Таблица 4, Действие К104 на геыаггдютиниру ¡ощую активность вирусов Коксаки В* '

Негодный Тигр, вирусов после действия JÍIO^11 . Вирус титр f¿, при рН: '

ГАЕ/мл

4,0 5,0 6,0 7,0

Коксаки В-3 1280 : 0 640 ' 1280 1280 Консави Б-4 '640 О 320 640 640

' * Вирусы пассировались в культуре ЗЭЧ. ** Время окисления.О,014 Ы - 18 часов.

Таблица Действие КД>4 на инфекционную активность вирусов Коксаш» В "

1 , Исходный Титр вирусов после действия КЮ^ Вирус титр, в'1е при jrfJ

, ■ : ЗДкА* .■'.. 4,0 - ' -5,0 -,.. ■ 6.0 ' 7,0

Коксаки В-3 7.7S0.38 2,7¿¡>,36 б,33±0,34 7,60*0,30 7,7*0,32 Коксаки В-4 8,040,44 2,7^,35 6,5 tt>,44 ?,7¿0,39 6,0*0,45

накапливаются сведеши о надигми дишдшх структур в вирионах (1,1Г.Лидав »г »1*, 1984) З.Ж.1ЛОМ1, ЬЛ.ВЗлл, 1933, 19в5).

; В наших исследованиях било установлено, что т эфир, ни ли политические ферменты не влияете на гемаг ивт чнирущую и инфекционную активность вирусов Коксаки В. Несмотря на это, удалось лохаэагь возможное лидадов в структуре вирусного капсида. Доказательством этого факта является установленная потеря свойств вирусов Коксаки В адсорбироваться щ бентоните После обработки липазами. Эти исследования в какой-то мере : раскрывают механизм адсорбции вирусов на бентоните посрйдст—

-18-

вом липидсодершцих структур, что хорошо объясняется способностью бентонита интенсивно сорбировать липиды (E.Ntkkila, В.Окет-ВЮга, 1952). При изучении действия липазы на вирусы Коксаки В-3 в системе вирус-клетка показано, что содержание фермента в среде подчеркни в концентрации 1,5 мг/мл увеличивает гемагглюгкнирушую активность. Этот (факт можно сменить С позиций разрушения липидных структур на поверхности капсида и освобождению рецепторов гемагглйтининов,

В результате дальнейших отлов удалось показать, что про-теазы действуют аналогично липазам, лишая вирусы Коксаки В способности адсорбироваться на бентоните. Одинаковое действие ферментов двух разных классов дает возможность предположить присутствие лилидсодержащих структур в вирусном календе в качестве литопротеинов.

При сравнении плавучей плотности гемагглпти пирующих к ке-гемагглютинирующих вирусных частиц показано, что негемагг®-тинируюв^ие вируса Коксаки В-3, выращенные в перевиваемой культуре клеток Vero, имеют шшв^чую плотность в градиенте сахарозы ниже /= 1,189 г/см3/, чем гемагглстинирующие вирусные частицы, полученные в первичюй оетовдой культуре ®Ч /j? - 1,195 г/см3/. Пригодная во внимание более низкую плавучую плотность неге«агглютинирующих вирусных частиц, можно предположить о возможной связи их с клеточными мембранами и белками.

Для сравнительного электрокномикроскопического изучения ГА+ и ГА" внрионов было необходимо обосновать наиболее аффективные методы ЭМ исследований, что позволило адаптировать некоторое современные методигги прмьгеннтельно к вирусам Коксаки В. Использование техники фильтрации в агар вместо етапа. ультра-центрифугирорания иммунных комплексов в прямой иммунной

ЗМ упростило метод и исклюшло возможность иеспецифичаекой агграгации вирусных частиц в процессе осаждения. В результате дальнейших исследований были разработаны условия проведения иммуносорбентной электронной микроскопии /ИСЭМ/ для изучения Коксаки В вирусов. Подобрана оптимальная концентрация белка А для сенсибилизации плеяок-подлшек /50 шг/мл/. Установлено, что ИСЕМ является высокочувствительным методом выявления Кок саки В видесов и позволяет определить

вирусшх частиц. Эффективность метода в определенной степени зависит от использования пленок-подложек. По нашим данным, формвар-углеродше пленки обладают явным преимуществом перед амилаце?атными» так как более прочно и эффективно связывают белок А, Метод ИСЭИ оказался не только приемлем для успешной идентификации вирусов, но и удобен при определении размеров вирионов.

При изучении размера гешгглютинирарщцих и негемагглютиш-рущих вирусов Коксаки В-3 определена существенная разница в диаметре вирионов. Сказалось", что вирусы, пассируемые в клеточной культуре 434 и обладающие ГА-&ктквтостыэ, .имелт больший размер вирионов в сравнении с негемагглютинкруюцими ви-рионами, Шлученными .-в культуре Vero t Э0,04ЙЗ,1 км и 26.I0Í ±0,15 нм соответственно. По наиему мнению, есть несколько интерпретаций порученных результатов, fioa можно у данных вирусов разная айинностъ капсидньк белков к специфическим антителам, применяемым в HCDM, что может свидетельствовать О различиях в строении капсидных структур вирусов, обладающих и неоолада-ющих ГА-антивность», Может быть, изменение размера вирионов сэязано с процессами адаптации вирусов и редродук-yik в различных клеточных культурах е преимущественной селекцией вирионов определенного диаметра. Это положение подтверждаемся

наличием в исходной популяции гемагглггмнирующих вирусов невольного количества частиц с размером 26 м л наоборот, определение у негемагглвгинирующих. вирусов диаметра вкриотов 30 и* /рис.1/•

Рис.1, Распределение вирусных частиц по размеру в исследуемых популяциях вирусов Коксаки В-3 (п - 100)» По оси абсцисс - диаметр внрионов, ш; по оси орпинаг - количество вирусных частиц А - вирусы, пассируемые, в культуре клеток ©Ч. Б - вирусы, пассируемые в культуре клеток Vero.

Возможно, что разный размер внрионов связан с говертносг-

ными липидсодеркащиш структурами, ассоциироватами е вирус» *

нами частицами, хотя и не выявляемыми ЭН-методами.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о различных биологических и фиэико-кимических свойствах вирусов Кок-саки В,'обладающих и не обладающих ГА-активностью,

ВЫВОДЫ

I, Впервые установлено, что популяция вирусов Коксаки В-3, культивируемая в перевиваемой клето'яюй культуре vero, гете-

... - 21 -

рогенна по гемагглотикируичей активности.

Доказана корреляция ме*ду' гемаг^лютинируюцей активностью и бентонитовым генетическим маркером: гемагглютинирующие свойства присущи только; варианту А&ет".

6 поцуляции гчррсо^.Коксакк В-3,. излученных в первичной культуре^леток ФЭЧ, гемагглютинируюфй активностью обладают в равной стелени оба сел екфони^ ванных генетических бентони товьк варианта - Абент+ и Абент", ' ■

2. Установлена интенсивная адсорбция вирусов Кокса ки груп пы В на поверхности эритроцитов и тромбоцитов человека и ди-' вотных. ' : '■. '<■.".

Аффинитет к эритроцитам вирусов Кок саки В, вцрщцемшх в первичной клртй чной ■.. культуре <К>Ч и. обладающих геиаггдотини-руюцей активностью, белее ;чем В 100 раз' превыпаег таковой у ыегешдтлюткдарукцкх штаммов, полученных в перевиваемой куль туре- клеток Veroi, .■■"';■'■ . "

: 3. Вирусы Коксаки В-3, pas¿иЧающиеся по гемаг платинирующей активности,' ииепт неодинаковь» физико-химические свойства; диаметр вириовов гемагглюткнирующих щташов, подученных в первичной .^Ясьтуре клетон 434, составляет по данным морфо-метрического ана^за ЭЛейгронограмм Э0,04±0|1 m; плавучая пяотность в градиенте ' Сахарова I, 195 г/см3. Соответствующие показатели негеквгглютццирущи итаммов вирусов Коксаки В-3, í^yjútWsHfíesakK в; перевиваемо* клеточной культуре Vero, составляют aû,Xt)iO,I5 нм и 1,188 г/.м3.

,4,' На основании сопоставления гемагглютинируицей активное ти нативгав вирионов н цустых юпоадих структур, изучения ; действмя наРе^гглвтинируюцие свойства ряда ферментов /хл-паэ, протеаэ, глюкозидаз/, химических и физических воздействий /УФ-облучение, обработка вфнроы, лерйодатом калия/ вэдви-

нута гипотеза об ассоциации геыагглютинирующей активности с капсидкыми белками вирионов.

5. Обоснованы оптимальные условия накопления вирусных гем-агглвтиников при репродукции вирусов Коксаки в первичной культуре клеток ФЭЧ: температура культивирования - 33 °С, время репродукции - 8 —"Ю часов. ь

Экспериментально разработгчы условия выявления гемагглв-тикнруицих свойств вирусов Коксаки группы В в микрометоде РГА.

6, Изучены наиболее чу вот вителыше методы иммуноалектрон-ной микроскопии для исследования .вирусов Коксаки В.

Экспериментально обоснованы условия проведения иммуносор-бентной электронной микроскогои: 15-минутная сенсибилизация форм вар-углеродных пленок-подложек белком А в концентрации SO мкг/мл с последующим нанесением акт»сыворотки а низких разведениях /1:5/. Вируса сорбируют на еенснбллизированную пленку-подложку по методу фильтрации в агар.

СПИСОК РАБОТ, 0ГШ1Ш0ВЛШЙ ГО ТШЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Егоров A.A., Амбарцумова Н.В, К методике выявления гемаг-глютинирущей активности энтеровиру со в//Микроби ол. жу рн. -1989, - 51, JM. - С.95-97,

2. Икробоков В.П., Егоров A.A., Амбарцумова Н.В. Изучение гемаггллтинирущих свойств и адсорбции на эритроцитах вирусов коксаки 8-3 и их селекционированных бентонитовых вартаятов/АЫкробиол.журк. - 1989, - öl, У* 4. - С.51-54.

3. Егоров АД, Сравнительное изучение адсорбции вирусов Коксаки группы В на эритроцитах/Леэисы докладов УН съезда Украин;''1>гг »пробно логического общества. — Черновцы, 1909, - C.2Ü0-2Ö1,

4. Егоров A.A. Изучение геиагглютинирущей активности вирусов Коксаки группы В при репродукции в условиях су б-и супероптималъных. темпвратур//Теэисы докладов У! съезда Украинского микробиологического общества. - Чернову, 1969.-0,201-202. ' '

5, Егоров A.A. К проблеме геиагглютинируицих свойств энтеро вирусов//Вирусы й вирусшб заболевания. - Вып.17. - Киев Здорев'я. - 1989. - С.46-51.

ПО Бигревлаиа.абк.Ппв.ТирДЮ Е>Ф 15217